CN115721689B - 龟鹿补肾丸在制备防治支气管疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提供一种龟鹿补肾丸在制备防治支气管疾病药物中的应用。龟鹿补肾丸可以采用相同配方的其他剂型替代,也可以与其他药物一起共同制成复方制剂。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及龟鹿补肾丸在制备防治支气管疾病药物中的应用。
背景技术
支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)是常见的呼吸道疾病之一,据统计显示,全球共有3.34亿哮喘患者,发病率在1%~18%,现代医学表明,支气管哮喘发生与下丘脑-垂体-肾上腺轴(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA orHTPA axis)的功能下降有关。现代医学对支气管哮喘主要的治疗方法有避免接触过敏源、脱敏和抗炎治疗等。针对哮喘慢性炎症的病理特征,抗炎治疗是哮喘最主要的治疗方法。糖皮质激素(ICS)作为最有效的抗炎药物,已被用于哮喘的一线治疗,但是长期应用全身和局部毒副作用明显。
支气管哮喘表现为喘息、气促、胸闷及咳嗽等多变的呼吸道症状伴可逆的呼气气流受限,属中医“哮证”、“喘证”范畴。
龟鹿补肾丸(缩写:GLBSW),由龟甲胶(炒)、鹿角胶(炒)、熟地黄、淫羊藿(蒸)、菟丝子(炒)、锁阳(蒸)、续断(蒸)、狗脊(蒸)、制何首乌、金樱子(蒸)、覆盆子(蒸)、炙黄芪、酸枣仁(炒)、炙甘草、陈皮(蒸)、山药(炒)等十六味中药材为原料制成的纯中药制剂,具有壮筋骨,益气血,补肾的作用。临床主要用于治疗身体虚弱,精神疲乏,腰腿酸软,头晕目眩,夜多小便,健忘失眠。
但迄今为止,未见有龟鹿补肾丸在制备防治哮喘疾病药物中的应用的研究与报导。
发明内容
基于此,本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种龟鹿补肾丸在制备防治支气管疾病药物中的应用,无明显副作用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
龟鹿补肾丸在制备延长哮喘动物体的引哮潜伏期的药物中的应用。
龟鹿补肾丸在制备降低哮喘动物体的外周血和肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数的药物中的应用。
龟鹿补肾丸在制备降低哮喘动物体的外周血淋巴细胞百分比或嗜酸性粒细胞百分比的药物中的应用。
龟鹿补肾丸在制备改善哮喘动物体的肺组织支气管、或血管周围炎性细胞浸润、或气道狭窄病理变化的药物中的应用。
龟鹿补肾丸在制备降低哮喘动物体的肺泡灌洗液炎症因子IL-4、IL-5、IL-13以及升高IFN-γ水平的药物中的应用。
龟鹿补肾丸在制备降低哮喘动物体的的血清IgE水平的药物中的应用。
龟鹿补肾丸可以用相同处方(组合物)的其他龟鹿补肾制剂替换,例如龟鹿补肾口服液、或龟鹿补肾胶囊、或龟鹿补肾颗粒、或龟鹿补肾片。或者,上述任一相同配方剂型与其他药物一起共同制成复方制剂。
优选的,所述哮喘是支气管哮喘。
优选的,所述哮喘是过敏性哮喘。
本发明的有益效果在于:
龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠支气管及血管周围炎性细胞浸润逐渐减少,支气管粘膜上皮基本完整,上皮细胞排列整齐,平滑肌轻度增厚,未见明显管腔缩窄。龟鹿补肾丸具有抑制Th2分化从而抑制过敏反应的作用,龟鹿补肾丸还有一定的抗炎作用。
实验表明,龟鹿补肾丸灌胃给药后可明显延长哮喘模型大鼠的引喘潜伏期,显著降低哮喘症状评分,明显改善哮喘症状;明显降低外周血和肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数,还能显著降低外周血淋巴细胞百分比和嗜酸性粒细胞百分比,而中性粒细胞百分比和单核细胞百分比显著上升;明显改善哮喘模型大鼠肺组织支气管及血管周围炎性细胞浸润和气道狭窄病理变化;显著降低哮喘模型大鼠肺泡灌洗液炎症因子IL-4、IL-5、IL-13以及升高IFN-γ水平,减轻大鼠哮喘模型的气道炎症反应,还能显著降低血清IgE水平。
附图说明
图1为龟鹿补肾丸对肺组织病理变化影响(*100倍,光镜下观察,HE);其中,A:正常对照组,B:哮喘模型组,C:地塞米松组,D:龟鹿补肾丸低剂量组,E:龟鹿补肾丸中剂量组,F:龟鹿补肾丸高剂量组;
图2为龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中总白细胞数的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
图3为鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中T细胞生长因子IL-4含量的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
图4为龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞催化因子IL-5含量的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
图5为龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-13含量的影响(n=8,);与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
图6为龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中抑炎因子IFN-γ含量的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
图7为龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠外周血总白细胞数的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
图8为龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠外周血IgE含量的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
图9为龟鹿补肾丸和淫羊藿对肺组织病理形态学的影响(*100倍,光镜下观察,HE);其中,A1.正常对照组支气管,A2.正常对照组肺泡壁,B1.模型组支气管,B2.模型组肺泡壁,C1.淫羊藿组支气壁,C2.淫羊藿组肺泡壁,D1.龟鹿补肾丸组支气管,D2.龟鹿补肾丸组肺泡壁;
图10为单味药淫羊藿及其复方龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中总白细胞数的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;与淫羊藿组比较,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图11为单味药淫羊藿及其复方龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠外周血中总白细胞的影响(n=8,);其中,与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详细说明,但本发明的实施方式不限于此。
龟鹿补肾丸采取中国药典的制法制备:盐菟丝子51g、淫羊藿(蒸)43g、续断(盐蒸)43g、锁阳(蒸)51g、狗脊(盐蒸)64g、酸枣仁(炒)43g、制何首乌64g、炙甘草21g、陈皮(蒸)21g、鹿角胶(炒)9g、熟地黄64g、龟甲胶(炒)13g、金樱子(蒸)51g、炙黄芪43g、山药(炒)43g、覆盆子(蒸)85g,以上十六味,粉碎成细粉,过筛,混匀。每100g粉末用炼蜜40g加适量的水泛丸,干燥,制成水蜜丸;或加炼蜜100~110g制成大蜜丸,即得。
与龟鹿补肾丸相同配方的其他剂型的制法:
龟鹿补肾胶囊采取取中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂(第十七册)WS3-B-3230-98的制法制备:菟丝子(炒)128g、淫羊藿(蒸)106g、续断(蒸)106g、锁阳(蒸)128g、狗脊(蒸)160g、酸枣仁(炒)106g、制何首乌160g、炙甘草53g、陈皮(蒸)53g、鹿角胶(炒)23g、熟地黄160g、龟甲胶(炒)34g、金樱子(蒸)128g、蜜黄芪106g、山药(炒)106g、覆盆子(蒸)213g,以上十六味,陈皮、山药、炙甘草、鹿角胶、龟甲胶,粉碎成细粉,混匀;其余菟丝子等十一味,加水煎煮二次,第一次2小时,第二次1小时,滤过,合并滤液,浓缩成稠膏状,干燥,研成细粉,与上述细粉混研,过筛,混匀,制成1000粒,即得。
龟鹿补肾片采取取国家食品药品监督管理局标准YBZ05732008的制法制备:菟丝子(炒)128g、淫羊藿(蒸)106g、续断(蒸)106g、锁阳(蒸)128g、狗脊(蒸)160g、酸枣仁(炒)106g、制何首乌160g、炙甘草53g、陈皮(蒸)53g、鹿角胶(炒)23g、熟地黄160g、龟甲胶(炒)34g、金樱子(蒸)128g、蜜黄芪106g、山药(炒)106g、覆盆子(蒸)213g,以上十六味,陈皮、山药、炙甘草、鹿角胶、龟甲胶,粉碎成细粉,混匀;其余菟丝子等十一味,加水煎煮二次,第一次2小时,第二次1小时,滤过,合并滤液,浓缩成稠膏状,干燥,研成细粉,与上述细粉混研,过筛,混匀,制成颗粒,干燥,圧制成1000片,包薄膜衣片,即得。
或龟鹿补肾颗粒的制备方法为:菟丝子(炒)128g、淫羊藿(蒸)106g、续断(蒸)106g、锁阳(蒸)128g、狗脊(蒸)160g、酸枣仁(炒)106g、制何首乌160g、炙甘草53g、陈皮(蒸)53g、鹿角胶(炒)23g、熟地黄160g、龟甲胶(炒)34g、金樱子(蒸)128g、蜜黄芪106g、山药(炒)106g、覆盆子(蒸)213g,以上十六味,陈皮、山药、炙甘草、鹿角胶、龟甲胶,粉碎成细粉,混匀;其余菟丝子等十一味,加水煎煮二次,第一次2小时,第二次1小时,滤过,合并滤液,浓缩成稠膏状,干燥,研成细粉,与上述细粉混研,过筛,混匀,按每包5-10克制成颗粒剂。
龟鹿补肾口服液采取菟丝子(炒)128g、淫羊藿(蒸)106g、续断(蒸)106g、锁阳(蒸)128g、狗脊(蒸)160g、酸枣仁(炒)106g、制何首乌160g、炙甘草53g、陈皮(蒸)53g、鹿角胶(炒)23g、熟地黄160g、龟甲胶(炒)34g、金樱子(蒸)128g、蜜黄芪106g、山药(炒)106g、覆盆子(蒸)213g,以上十六味,陈皮、山药、炙甘草、鹿角胶、龟甲胶,粉碎成细粉,混匀,加20-80%乙醇提取二次,滤过;其余菟丝子等十一味,加水煎煮二次,第一次2小时,第二次1小时,滤过,合并滤液,加水稀释至10000ML,分装为10ml每瓶。
实施例一
龟鹿补肾丸对OVA诱导的支气管哮喘模型大鼠的防治作用
(一)动物分组与给药
取雄性SD大鼠48只,体重180±20g,由广东省医学实验动物中心提供,适应性喂养7d后,按体重随机分为6组,每组8只,分别为正常对照组、模型组、地塞米松组、龟鹿补肾丸低、中、高剂量组。本次实验采用卵清蛋白(OVA)诱导大鼠哮喘模型。从造模(卵蛋白初次致敏)第15天开始,各受试药物组按照10ml/kg灌胃给药。龟鹿补肾丸高、中、低组均在每次雾化吸入激发前1h分别灌胃给药7.2g/kg、3.6g/kg、1.8g/kg,每天一次,地塞米松组在每次雾化吸入激发前1h给予地塞米松溶液灌胃给药,剂量为0.5mg/kg,每天一次。正常对照组和模型组在每次雾化吸入激发前1h给予等量生理盐水,每天一次。
(二)哮喘模型制备方法
1、致敏阶段
除正常对照组以外,其余各组于第1、8天腹腔注射1ml 10%卵蛋白抗原液(现配现用),使大鼠处于致敏状态。正常对照组腹腔注射等量生理盐水。
2、激发阶段
除了正常对照组以外,其余各组从第15天开始,超声雾化1%卵蛋白,每天1次,雾化器输出速度0.2ml/min,每次30min,以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等症状为模型建立成功的标志;采用1%卵蛋白连续激发3周后,再以2%卵蛋白持续雾化1周。正常对照组超声雾化等量生理盐水。
(三)样本采集与检测
1、行为学观察和引喘潜伏期测定
第43天雾化激发时,观察10min内大鼠抓鼻、挠痒以及哮喘发作症状等哮喘行为学特征并评分:无抓鼻或挠痒动作做0分,抓鼻或挠痒出现1-2次计1分,3-4次计2分,5次及以上的计3分。此外,观察并记录引喘潜伏期,即从卵蛋白开始激发到出现抓耳挠腮、腹式呼吸等特征较明显过敏性哮喘症状的时间。
2、HE染色观察大鼠肺组织病理形态学变化
实验结束后,麻醉处死大鼠。取右肺中叶组织于4%多聚甲醛固定24小时后,取出组织,流水冲洗1h。再放入脱水机中,从低浓度到高浓度酒精直至无水乙醇脱水(70%-80%-90%-95%-95%-100%-100%),再将组织置于透明剂二甲苯中透明,石蜡浸润包埋。然后切成4μm薄片,放入二甲苯中脱錯,再放入无水乙醇直至低浓度酒精(100%-95%-95%-90%-80%)洗净脱蜡液,用流水冲洗后,然后用苏木精染色,之后盐酸酒精分化,再用自来水冲洗及稀氨水返蓝后,伊红染色。流水冲洗后再放入低浓度到高浓度酒精直至无水乙醇脱水。分别放入二甲苯两次后,中性树脂封片,显微镜下观察肺组织的病理组织学变化。
(四)实验结果
1、龟鹿补肾丸改善哮喘模型大鼠的症状评分和延长引喘潜伏期
与正常对照组相比,哮喘模型组大鼠的症状评分明显升高,哮喘潜伏期显著缩短,表明大鼠哮喘模型建模成功。与哮喘模型组比较,地塞米松组和龟鹿补肾丸组大鼠的症状评分明显降低,哮喘潜伏期显著延长(见表1)。
表1龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠的症状评分及潜伏期的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01。
2、龟鹿补肾丸改善OVA诱导哮喘大鼠肺组织病理态学的变化(HE染色)
由图1所示,正常对照组细支气管管壁光滑,支气管平滑肌细胞未见增生,支气管黏膜皱壁无增生,管腔通畅,管内无炎性渗出物,肺泡壁厚薄均匀一致,肺泡大小均匀一致。模型组气管管壁周围有大量炎性细胞浸润,支气管黏膜皱折增多延长,支气管平滑肌增厚,管腔缩窄,内有黏液栓,部分肺泡壁变薄或断裂。地塞米松组气管管壁周围有少量炎性细胞浸润,支气管黏膜皱折少许增多延长,少量肺泡壁变薄或断裂。龟鹿补肾丸低、中、高剂量组支气管支气管及血管周围炎性细胞浸润逐渐减少,支气管粘膜上皮基本完整,上皮细胞排列整齐,平滑肌轻度增厚,未见明显管腔缩窄。
实施例二
龟鹿补肾丸缓解或/防治大鼠支气管哮喘的作用机制
(一)动物分组与给药
取雄性SD大鼠48只,体重180±20g,由广东省医学实验动物中心提供,适应性喂养7d后,按体重随机分为6组,每组8只,分别为正常对照组、模型组、地塞米松组、龟鹿补肾丸低、中、高剂量组。本实验采用卵清蛋白(OVA)诱导大鼠哮喘模型。从造模第15天开始,龟鹿补肾丸高、中、低组均在每次雾化吸入激发前1h分别灌胃给药7.2g/kg、3.6g/kg、1.8g/kg,每天一次,地塞米松组在每次雾化吸入激发前1h给予地塞米松溶液灌胃给药,剂量为0.5mg/kg,每天一次。正常对照组和模型组在每次雾化吸入激发前1h给予等量生理盐水,每天一次。
(二)哮喘模型制备方法
1、致敏阶段
除正常对照组以外,第1、8天腹腔注射1ml 10%卵蛋白抗原液(现配现用),使大鼠处于致敏状态。正常对照组腹腔注射等量生理盐水。
2、激发阶段
除了正常对照组以外,从第15天开始,超声雾化1%卵蛋白,每天1次,雾化器输出速度0.2ml/min,每次30min,以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为模型建立成功的标志;连续3周后,以2%卵蛋白持续雾化1周,以保持大鼠的哮喘症状。正常对照组超声雾化等量生理盐水。
(三)样本采集与检测
1、肺泡灌洗液(BALF)收集
末次雾化激发1h后,麻醉大鼠,颈部皮肤切开分离气管后插入留置管并固定,结扎右侧主气管,先拿2ml注射器将4℃生盐打入左肺中,然后再用1ml注射器反复抽吸3次,可收集到1mlBALF液之后,4℃下3000rpm冷冻离心10min。收集上清液,放在-80℃备用。细胞沉渣进行镜检。
(1)BALF总白细胞计数
离心后,将余下细胞碎片和少量生盐(大概尖头处)混匀,取其中20μL加入到细胞计数板,室温静置2-3分钟。待白细胞完全下沉,在低倍镜下计数4个大方格内的白细胞总数。
(2)肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13以及IFN-γ含量检测
将BALF上清液从冷藏环境中取出,于室温下平衡15-30min,按照ELISA试剂盒说明书,将抗原与相应单克隆抗体结合经温育后加入生物素标记的抗体,再与链霉亲和素-HRP结合变色,形成最终黄色产物在450nm处有最大吸收峰。以空白孔调零,450nm波长依序测定各孔的吸光度(OD值),根据标准品的浓度及相应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出相应的样品浓度。
2、外周血收集
各组大鼠在末次雾化激发1h后,用75%的酒精消毒后剪开大鼠腹部皮肤,打开腹腔,将肠管拨向一侧,然后用手指轻轻分开脊柱前的脂肪,充分暴露大鼠腹主动脉,先用一次性采血针在其中下1/3处与血管平行穿刺进针,取出抗凝采血管取血0.5mL,上下轻轻与EDTA混匀,避免出现凝血块。然后再用一次性真空采血管取血约5ml,静置30-60min后,2-8℃下冷冻离心15min(3500r/min),收集上清,放入-80℃保存备用。
(1)外周血的总白细胞计数
采用全自动血细胞分析仪,对抗凝的全血检测白细胞总数。
(2)外周血白细胞分类计数
吸取抗凝管5-7UL血,滴在载玻片的一端,然后用左手持载玻片,用右手持玻片,匀速将血液向载玻片的另一端快速推动,待血涂片自然晾干后进行瑞氏姬姆萨染色,镜下计数100个白细胞中淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、单核细胞数、中性粒细胞数,并计算其百分比。
(3)血清总IgE含量检测
将血清从-80℃中取出,室温放置15-20min,采用ELISA法测定IgE浓度,按试剂盒说明书操作。
(四)实验结果
1、龟鹿补肾丸显著降低哮喘模型大鼠肺泡灌洗液的总白细胞数
如图2、表2所示,与正常对照组相比,模型组大鼠BALF的总白细胞数非常显著增高(p<0.01);与模型组相比,地塞米组、龟鹿补肾丸低、中、高剂量组均能非常显著降低支气管哮喘大鼠BALF的总白细胞数(p<0.05)。
表2龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中总白细胞数的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
2、龟鹿补肾丸显著降低哮喘模型大鼠BALF中趋化因子、细胞因子水平
与正常对照组相比,模型组大鼠BALF中的IL-4水平显著升高(p<0.01);与模型组相比,地塞米松、龟鹿补肾丸低、中、高剂量组大鼠BALF中IL-4水平均非常显著下降(p<0.01)。(如表3、图3所示)
表3龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中T细胞生长因子IL4含量的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
与正常对照组相比,模型组大鼠BALF中的IL-5水平显著升高(p<0.01);与模型组相比,地塞米松给药后可明显降低大鼠BALF中IL-5水平(p<0.01);龟鹿补肾丸低、中、高剂量组可显著降低BALF中的IL-5水平(p<0.01),并呈剂量依赖性。(如表4、图4所示)
表4龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞催化因子IL5含量的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01.
与正常对照组相比,模型组大鼠BALF中的IL-13水平显著升高(p<0.01);与模型组相比,低剂量的龟鹿补肾丸给药后可降低大鼠BALF中IL-13水平(p<0.05);地塞米松组、龟鹿补肾丸中、高剂量组的BALF中IL4水平均极显著下降(p<0.01)。(如表5、图5所示)
表5龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL13含量的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
与正常对照组相比,模型组大鼠BALF的IFN-γ水平非常显著降低(p<0.01);与模型组相比,地塞米松给药后可使大鼠BALF中IFN-γ水平有升高趋势,但不具有统计意义;龟鹿补肾丸低、中组均能使BALF中的IFN-γ水平有升高趋势,其中龟鹿补肾丸高剂量组明显升高BALF中IFN-γ水平(p<0.01)。(如表6、图6所示)
表6龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中抑炎因子IFN-γ含量的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
以上实验结果提示龟鹿补肾丸具有抑制Th2分化从而抑制过敏反应的作用,表明龟鹿补肾丸对过敏性哮喘具有治疗的作用。
3、龟鹿补肾丸显著减少哮喘模型大鼠外周血总白细胞数
如表7、图7所示,与正常对照组相比,模型组的外周血总白细胞数显著升高(p<0.05);与模型组相比,地塞米松组、龟鹿补肾丸低、中剂量组能使外周血总白细胞数非常显著降低(p<0.01),龟鹿补肾丸高剂量组的外周血总白细胞数显著减少(p<0.05),提示龟鹿补肾丸对支气管哮喘模型大鼠具有一定的抑炎作用。
表7龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠外周血总白细胞数的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
4、龟鹿补肾丸改善哮喘模型大鼠外周血白细胞分类百分比
如表8所示,与正常对照组相比,模型组的外周血淋巴细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比以及中性粒细胞百分比升高十分显著(p<0.01),单核细胞百分比显著降低(p<0.01)表明大鼠嗜酸性粒细胞的气道炎症表型造模成功。与模型组相比,地塞米松组的淋巴细胞百分比和嗜酸性粒细胞百分比明显降低(p<0.01),而中性粒细胞百分比显著增大(p<0.01);龟鹿补肾丸低剂量组的淋巴细胞所占比、嗜酸性粒细胞所占比显著降低(p<0.01),中性粒细胞百分比则显著增大(p<0.01);龟鹿补肾丸中、高剂量组的外周血淋巴细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比均极显著减少(p<0.01),而中性粒细胞百分比、单核细胞所占比则显著增大(p<0.01)。
表8龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠的外周血白细胞分类百分比影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01。
5、龟鹿补肾丸显著降低哮喘模型大鼠外周血IgE含量
如表9、图8所示,外周血IgE的产生增加是过敏性哮喘的一个显著特征,IgE水平同嗜酸粒细胞常作为诊断、治疗哮喘的参考指标。与正常对照组相比,模型组大鼠外周血IgE水平显著增高(p<0.05);与模型组相比,地塞米组、龟鹿补肾丸低、中、高剂量组均能非常显著降低支气管哮喘大鼠外周血IgE水平(p<0.01)。
表9龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠外周血IgE含量的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
实施例三
单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸对卵清蛋白(OVA)诱导大鼠哮喘模型治疗作用比较
单味药淫羊藿切制、淫羊藿置蒸煮锅蒸一小时,后干燥。粉碎成细粉,过筛,即得。
龟鹿补肾丸采取中国药典的制法制备:盐菟丝子51g、淫羊藿(蒸)43g、续断(盐蒸)43g、锁阳(蒸)51g、狗脊(盐蒸)64g、酸枣仁(炒)43g、制何首乌64g、炙甘草21g、陈皮(蒸)21g、鹿角胶(炒)9g、熟地黄64g、龟甲胶(炒)13g、金樱子(蒸)51g、炙黄芪43g、山药(炒)43g、覆盆子(蒸)85g,以上十六味,粉碎成细粉,过筛,混匀。每100g粉末用炼蜜40g加适量的水泛丸,干燥,制成水蜜丸即得。
(一)动物分组与给药
健康雄性SD大鼠32只,体重180±20g,由广东省医学实验动物中心提供,适应性喂养7d后,按随机分为4组,每组8只,分别为正常对照组、模型组、淫羊藿组、以及龟鹿补肾丸组。本实验采用卵清蛋白(OVA)诱导大鼠哮喘模型。从造模第15天开始,淫羊藿组和龟鹿补肾丸组在每次雾化吸入激发前1h分别灌胃给予相应药物,每天一次。正常对照组和模型组在每次雾化吸入激发前1h给予等量生理盐水,每天一次。根据动物与人之间的药物剂量换算关系计算给药剂量,大鼠与人的每1kg体质量剂量的折算系数为6.25(成人体质量按60kg计算)。2020年版《中国药典》收载的龟鹿补肾丸临床用量为18g/d,本实验的龟鹿补肾丸组采用中剂量折算大鼠的给药剂量为3.6g/kg;淫羊藿组采用龟鹿补肾丸组中相等剂量的淫羊藿,折算大鼠的给药剂量为0.16g/kg。
(二)哮喘模型制备方法
1、致敏阶段
除正常对照组以外,第1、8天腹腔注射1ml 10%卵蛋白抗原液(现配现用),使大鼠处于致敏状态。正常对照组腹腔注射等量生理盐水。
2、激发阶段
除了正常对照组以外,从第15天开始,其他各组超声雾化1%卵蛋白,每天1次,雾化器输出速度0.2ml/min,每次30min,以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为模型建立成功的标志;连续3周后,以2%卵蛋白持续雾化1周,以保持大鼠的哮喘症状。生理盐水对照组超声雾化等量生理盐水。
(三)行为学观察
第43天雾化激发时,观察10min内大鼠大鼠抓鼻、挠痒以及哮喘发作症状等哮喘行为学特征并评分:无抓鼻或挠痒动作做0分,抓鼻或挠痒出现1-2次计1分,3-4次计2分,5次及以上的计3分。此外,观察并记录哮喘潜伏期,即从卵蛋白或生理盐水开始激发到出现抓耳挠腮、腹式呼吸等特征较强过敏性哮喘症状的时间。
(四)样本采集与检测
1、HE染色观察大鼠肺组织病理改变
取右肺中叶于4%多聚甲醛固定12-24小时后,取出组织,流水冲洗1h。再放入脱水机中,从低浓度到高浓度酒精直至无水乙醇脱水(70%-80%-90%-95%-95%-100%-100%),二甲苯透明,石蜡浸润包埋。然后切成4μm薄片,放入二甲苯中脱錯,再放入无水乙醇直至低浓度酒精(100%-95%-95%-90%-80%),用自来水冲洗后苏木精染色,之后盐酸酒精分化,再用自来水冲洗及稀氨水反蓝后,伊红染色。自来水冲洗后再放入低浓度到高浓度酒精直至无水乙醇脱水。分别放入二甲苯两次后,中性树脂封片,贴标签。
2、肺泡灌洗液(BALF)总白细胞计数
末次雾化激发1h后,麻醉大鼠,颈部皮肤切开分离气管后插入留置管并固定,结扎右侧主气管,先拿2ml注射器将4℃生盐打入左肺中,然后再用1ml注射器反复抽吸3次,可收集到1mlBALF液之后,4℃下3000rpm冷冻离心10min。弃上清,将余下细胞碎片和少量生盐(大概尖头处)混匀,取其中20μL加入到细胞计数板,室温静置2-3分钟。待白细胞完全下沉,在低倍镜下计数4个大方格内的白细胞总数。
3、外周血收集
各组大鼠在末次雾化激发1h后,用75%的酒精消毒后剪开大鼠腹部皮肤,打开腹腔,将肠管拨向一侧,然后用手指轻轻分开脊柱前的脂肪,充分暴露大鼠腹主动脉,先用一次性采血针在其中下1/3处与血管平行穿刺进针,取出抗凝采血管取血0.5mL,上下轻轻与EDTA混匀,避免出现凝血块。然后再用一次性真空采血管取血约5ml,静置30-60min后,2-8℃下冷冻离心15min(3500r/min),收集上清,放入-80℃保存备用。
(1)外周血的总白细胞计数
采用全自动血细胞分析仪,对抗凝的全血检测白细胞总数。
(2)外周血白细胞分类计数
吸取抗凝管5-7UL血,滴在载玻片的一端,然后用左手持载玻片,用右手持玻片,匀速将血液向载玻片的另一端快速推动,待血涂片自然晾干后进行瑞氏姬姆萨染色,镜下计数100个白细胞中淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、单核细胞数、中性粒细胞数,并计算其百分比。
(五)实验结果
1、单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸对支气管哮喘模型大鼠的症状评分和潜伏期的影响
由表10结果可知,与正常对照组相比,模型组大鼠的潜伏期明显缩短,出现抓耳挠腮、腹式呼吸等哮喘症状的次数较多,症状评分明显升高,表明大鼠哮喘模型建模成功;与模型组相比,淫羊藿组和龟鹿补肾丸组的潜伏期明显延长(P<0.01),淫羊藿组症状评分显著降低(P<0.05),龟鹿补肾丸组症状评分非常显著降低(P<0.01);与相同剂量的淫羊藿组比较,龟鹿补肾丸组的症状评分显著低于淫羊藿组,龟鹿补肾丸组的潜伏期明显比淫羊藿组延长,具有统计学意义(P<0.05)。表明龟鹿补肾丸及其主要药物淫羊藿均能缓解哮喘症状,其中与单味药淫羊藿相比,龟鹿补肾丸改善哮喘症状作用更优。
表10单味药淫羊藿及其复方龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠的症状评分和潜伏期的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
与淫羊藿组比较,Δp<0.05,ΔΔp<0.01.
2、单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸对支气管哮喘模型大鼠的肺组织病理形态影响
正常对照组的大鼠支气管及其周围肺组织无明显炎性细胞浸润,支气管管壁完整,平滑肌厚度正常,支气管粘膜规整,管腔无明显狭窄,无脱落上皮细胞;肺泡壁厚薄均匀,肺泡大小一致。模型组的支气管内及其周围肺组织中有大量炎性细胞浸润,平滑肌明显增厚,细胞排列紊乱,支气管粘膜水肿增厚,上皮脱落,官腔狭窄,分泌物增多;肺泡壁明显增厚,缩小甚至塌陷,提示卵蛋白致支气管哮喘模型大鼠造模成功。淫羊藿组的支气管及其周围肺组织有少量的炎性细胞浸润,平滑肌轻度增厚,支气管官腔内未见明显狭窄,肺泡壁厚度降低。龟鹿补肾丸的支气管及其周围肺组织的炎性细胞减少,平滑肌厚度降低,支气管粘膜规整,支气管官腔未见狭窄,无分泌物,肺泡壁轻度增厚,说明单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸对支气管哮喘模型大鼠肺组织病理形态学有明显改善作用。(图9)
3、单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸对支气管哮喘模型大鼠的BALF总白细胞数影响
与正常对照组相比,模型组的BALF总白细胞数均显著升高(P<0.01),表明哮喘模型大鼠能诱导炎症产生;与模型组相比,淫羊藿组和龟鹿补肾丸组能使BALF总白细胞数降低(P<0.01);与相同剂量的淫羊藿组相比,龟鹿补肾丸组的BALF总白细胞数显著降低(P<0.01),表明龟鹿补肾丸及淫羊藿均能减轻卵蛋白致哮喘模型大鼠的炎症反应,并且龟鹿补肾丸的抗炎作用更强。(表11、图10)。
表11淫羊藿及龟鹿补肾丸对哮喘模型大鼠肺泡灌洗液中总白细胞数的影响(n=8,)/>
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;
与淫羊藿组比较,Δp<0.05,ΔΔp<0.01.
4、单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸对支气管哮喘模型大鼠的外周血总白细胞数影响
与正常对照组相比,模型组的血液总白细胞数显著升高(P<0.01);与模型组相比,龟鹿补肾丸组能使血液总白细胞数降低(P<0.05),淫羊藿组血液白细胞未见明显降低(P>0.05),表明龟鹿补肾丸对卵蛋白致哮喘模型大鼠具有明显的抗炎作用。(表12、图11)
表12单味主药淫羊藿及其复药对哮喘模型大鼠外周血中总白细胞的影响(n=8,)
注:与正常对照组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
5、单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸对支气管哮喘模型大鼠的外周血白细胞分类的影响
由表13可知,与正常对照组相比,模型组的嗜酸性粒细胞百分比和淋巴细胞百分比明显增大,中性粒细胞百分比和单核细胞百分比显著减小(P<0.01)。与模型组相比,龟鹿补肾丸组和淫羊藿组非常明显降低淋巴细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比(p<0.01),而中性粒细胞百分比和单核细胞百分比非常显著上升(p<0.01)。与相同剂量淫羊藿组比较,龟鹿补肾丸组的淋巴细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比显著降低(P<0.05),而中性粒细胞百分比非常显著上升(P<0.05)。表明单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸都能减轻支气管哮喘的气道炎症,但龟鹿补肾丸减轻支气管哮喘的气道炎症疗效更优。
表13单味药淫羊藿及其复方龟鹿补肾丸对外周血中各类白细胞百分比的影响(n=8,)
/>
注:与正常对照组比较,##p<0.01;与模型组比较,**p<0.01;与淫羊藿组比较,Δp<0.05,ΔΔp<0.01.
(六)龟鹿补肾丸对卵清蛋白(OVA)诱导大鼠哮喘模型治疗作用优于单味淫羊藿
1、淫羊藿组和龟鹿补肾丸组能使卵清蛋白(OVA)诱导哮喘模型大鼠潜伏期明显延长,症状评分显著降低,龟鹿补肾丸及其主要药物淫羊藿均能缓解哮喘症状,而且龟鹿补肾丸改善哮喘症状作用更明显。
2、龟鹿补肾丸组能使卵清蛋白(OVA)诱导哮喘模型大鼠外周血和BALF中总白细胞数降低,淫羊藿组仅能明显降低卵清蛋白(OVA)诱导哮喘模型大鼠BALF中总白细胞数,表明龟鹿补肾丸及淫羊藿均能减轻大鼠哮喘模型的炎症反应,并且龟鹿补肾丸的抑炎作用更强。
3、龟鹿补肾丸组和淫羊藿组非常明显降低淋巴细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比而中性粒细胞百分比和单核细胞百分比非常显著上升。表明单味药淫羊藿及龟鹿补肾丸都能减轻支气管哮喘的气道炎症,但龟鹿补肾丸的疗效更优。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.龟鹿补肾丸在制备抗炎药物中的应用,其中炎症是指过敏性哮喘引起的炎症。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述龟鹿补肾丸替换为龟鹿补肾口服液、或龟鹿补肾胶囊、或龟鹿补肾颗粒、或龟鹿补肾片。
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俞长芳.《中成药实用手册》.人民卫生出版社,2000,(第3版),第432页. * |
吴承玉.《现代中医内科诊断治疗学》.人民卫生出版社,2001,(第1版),第692,696页. * |
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