SK130494A3 - Separating method of macrolide from acid, basic and unpolar neutral impurities - Google Patents

Description

Tento vynález poskytuje relatívne rýchly a účinný spôsob získania makrolidu, najmä tricyklického makrolidu, konkrétnejšie potom rapamycínu, z koncentrátov kvasných živných extraktov a materských výluhov alebo koncentrátov, získaných z rekryštalizačných rozpúšťadiel, rozmeľovaním a premývaním produktu a vyhýba sa časovo a finančne náročnému chromatografickému deleniu, opísanému v US 5 091 389, US 3

993 749, VO 93/11130 a Sehgalom v J. of Antibiotics 28 (10, 727, 1975. Spôsob zahrňuje separovanie kyslých a/alebo bázických zložiek od neutrálnych zložiek rozpustením koncentrátu, obsahujúceho makrolid, vo vhodnom rozpúšťadle, ktoré je miešatelné s vodou a extrahovanie kyslých a/alebo bázických zložiek do vodnej bázy alebo kyseliny a ďalej používa postupy, založené na princípe selektívnej rozpustnosti alebo extrakčné postupy na oddelenie neutrálneho polárneho tricyklického makrolidu od nepolárnych látok, prítomných v koncentráte. Zatiaľ čo tu opísaný spôsob sa týka koncentrátov kvasných živných extraktov alebo roztokov materských výluhov, roztok celkového extraktu alebo roztoky materského výluhu môžu byť v postupe, predkladanom týmto vynálezom, použité za predpokladu, že rozpúšťadlo alebo zmes rozpúšťadiel, použité na extrakciu kvasnej živnej pôdy alebo na rekryštalizáciu, rozmeľovanie alebo na premývanie, sú pre tento spôsob použiteľné a nejedná sa o nevhodný objem rozpúšťadla. Objem rozpúšťadla môže byť redukovaný jeho čiastočným zahustením. Ktorýkoľvek z roztokov, na ktorom je možné aplikovať spôsob podľa tohto vynálezu, môže byť označený ako koncentrát, obsahujúci makrolid.

Produkt, získaný uvedeným spôsobom, môže byť čistený až do vyhovujúcej úrovne čistoty zvyčajnými metódami, používanými v danej oblasti techniky.

Podstata vynálezu

Spôsob podľa vynálezu je znázornený ďalej na schéme 1. V nasledujúcom opise spôsobu podľa vynálezu je nepolárnym rozpúšťadlom nearomatické uhľovodíkové rozpúšťadlo ako cyklohexán, cyklohexén, hexán, heptán, pentán a podobne. Rozpúšťadlá, nemiešateľné s nearomatickým uhľovodíkovým rozpúšťadlom sú taktiež zahrnuté, ale nie sú obmedzené len na acetonitril a dimetylformamid. Výraz extrakcia sa vzťahuje k postupu dôkladného premiešania jedného roztoku s iným, vzájomne miešatelným roztokom, ktorý umožňuje v prípade nemiešateľných roztokov oddelenie jedného od druhého a fyzické odstránenie jednej vrstvy alebo fázy. Výraz premytie, vzťahujúci sa k tuhej látke a k roztoku, ktorý súvisí s extrakčným postupom, označuje vypláchnutie tuhej látky rozpúšťadlom, v ktorom je tuhá látka v podstate nerozpustná. Výraz materský výluh sa vzťahuje k roztokom organických rozpúšťadiel, získaným z kryštalizačných filtrátov, premývacích roztokov a spätných extrakcií vodných extraktov a z premývania a rozmeľovania zhromaždených tuhých látok.

Rozpúšťadlo makrolidu je rozpúšťadlo alebo zmes rozpúšťadiel, schopná rozpúšťať makrolid a sprievodné nečistoty, ako sú kyslé alebo bázické zložky. Rozpúšťadlo, nerozpúšťajúce makrolid je také rozpúšťadlo (alebo zmes rozpúšťadiel), v ktorom je makrolid v podstate nerozpustný, ale jediné, v ktorom sú rozpustné neutrálne zložky, ako sú tuky. Kryštalizačné rozpúšťadlo makrolidu je rozpúšťadlo (alebo zmes rozpúšťadiel), z ktorého môže byť makrolid rekryštalizovaný alebo kryštalizovaný z amorfného stavu pri rozmeľovaní. Pokiaľ postup vyžaduje zahustenie roztoku, dáva sa prednosť dostatočne prchavému rozpúšťadlu alebo zmesi rozpúšťadiel, aby bolo možné vykonávať destiláciu za nedegradujúcich podmienok, týkajúcich sa teploty a tlaku.

Schéma 1:

Podlá spôsobu, opísaného vo vynáleze, je koncentrát obsahujúci makrolid, či už získaný z koncentrátu kvasného živného extraktu alebo z rekryštalizačných koncentrátov a/alebo z premývacích rozpúšťadiel, rozpustený v rozpúšťadle (alebo v zmesi rozpúšťadiel) nemiešateľnom s vodou, zvolenom pre schopnosť rozpúšťať koncentrát a ľahkú oddeliteľnosť, ktorým môže byť, nie však výhradne, dichlórmetán, t-butylmetyléter, etylacetát, toluén, l-butanol, zmes etylacetátu a toluénu, zmes heptánu a etylacetátu alebo zmes hexánu a chloridu metylnatého. Na extrahovanie kyslých zložiek sú zvlášť vhodné vodné roztoky báz, včítane hydroxidu sodného, hydrouhličitanu sodného, uhličitanu sodného, hydroxidu amónneho a podobne, najlepšie potom hydroxidu sodného, v rozmedzí koncentrácie od 0,1 do 5 M, lepšie od asi 0,1 do 1,0 Ma najlepšie od asi 0,1 do 0,5 M. Organické bázy ako je trietylamín nie sú v porovnaní so silnejšími vodnými anorganickými bázami tak účinné v odstraňovaní kyslých zložiek. Na extrahovanie bázických zložiek sú zvlášť vhodné vodné roztoky minerálnych kyselín, včítane kyseliny chlorovodíkovej, primárneho fosforečnanu draselného, primárneho síranu sodného a podobne, najmä potom kyseliny chlorovodíkovej, v rozmedzí koncentrácie od 0,1 do 5 M, lepšie od asi 0,1 do 1,0 M a najvýhodnejšie od asi 0,1 do 0,5 M. Organické kyseliny, ako je kyselina trifluóroctová, nie sú v porovnaní s minerálnymi kyselinami také účinné v odstraňovaní bázických zložiek. Extrakcie kyslých alebo bázických zložiek z roztokov, obsahujúcich makrolid, sa zvyčajne vykonávajú pri teplote v rozmedzí od asi -5 °C do asi 45 °C, s výhodou v rozmedzí od asi -5 °C do približne 30 °C a najlepšie v rozmedzí od asi -5 °C do približne 10 °C. Aby sa zamedzilo prípadnej degradácii makrolidu kyselinou alebo bázou, mal by byť extrakčný proces dokončený bez prestávky. V závislosti na množstve prítomných kyslých alebo bázických zložiek nemusí byť extrakcia oboch týchto zložiek nevyhnutná a extrakcia samotnej kyslej alebo samotnej bázickej zložky môže stačiť na odstránenie dostatočného množstva nečistoty z roztoku, obsahujúceho makrolid, takže je možné tricyklický makrolid izolovať .

Kyslé (alebo bázické) zložky je výhodné odstrániť z roztoku koncentrátu, obsahujúceho makrolid, v jednom extrakčnom kroku, šetriacom čas. Množstvo vodnej bázy (alebo kyseliny), potrebné na to, aby bol v extrakčnom procese dostupný prebytok bázy (alebo kyseliny), je možné stanoviť extrakciou alikvotnej časti, odobratej z roztoku koncentrátu, obsahujúceho makrolid s vodnou bázou (alebo kyselinou) a stanovením objemu vodnej bázy (alebo kyseliny), ktorý je potrebný na získanie extraktu alikvotnej časti s takým pH, že stechiometrický prebytok bázy (alebo kyseliny) je dostupný za použitia pH-metra alebo iného prostriedku na meranie hodnoty pH. Objem vodnej fázy (alebo kyseliny), potrebný na extrakciu roztoku, z ktorého bola odobratá alikvotná časť, je teda úmerný pomeru objemov roztoku na extrahovanie a z neho odobratej alikvotnej časti. Extrakcia kyslých (alebo bázických zložiek teda môže byť uskutočnená jednou operáciou skôr než vykonávaním niekoľkonásobných extrakcií vodnou bázou (alebo kyselinou). Pokiaľ majú byť z roztoku koncentrátu, obsahujúceho makrolid, odstránené tak zložky kyslé, ako aj bázické, samozrejme budú musieť byť vykonané oddelené extrakcie vodnou bázou a vodnou kyselinou. V prípade roztokov koncentrátu, obsahujúceho rapamycín, postačuje na odstránenie v zásade všetkých kyslých zložiek jedna extrakcia vodným roztokom hydroxidu sodného, ktorý zaisťuje vytvorenie výsledného pH = 12.

Makrolid, získaný z roztoku pomocou vyššie uvedených postupov, môže byť vyčistený na požadovaný stupeň čistoty bežnými purifikačnými metódami, používanými v danej oblasti techniky. Filtráty a premývacie roztoky môžu byť, pokiaľ je to žiaduce, znova spracované na izoláciu ďalšieho makrolidu.

Po vykonaní extrakčných pochodov, slúžiacich na odstránenie kyslých a/alebo bázických zložiek z roztoku s vodou nemiešateľného rozpúšťadla obsahujúceho makrolid, je možné makrolid oddeliť od nepolárnych neutrálnych zložiek jednou z nasledujúcich metód:

1) Rozpúšťadlo nerozpúšťajúce makrolid (alebo zmes rozpúšťadiel) , miešateľné s uvedeným s vodou nemiešateľným roztokom rozpúšťadla s obsahom makrolidu, z ktorého boli extrahované kyslé a/alebo bázické zložky, sa pridá k roztoku, obsahujúcemu makrolid v dostatočnom množstve na to, aby makrolid a prípadne aj makrolidu podobné produkty urobilo nerozpustnými vo výslednom roztoku a vytvorilo oddelenú fázu, buď oleja alebo tuhej látky, ktorú potom je možné oddeliť bežnými separačnými postupmi, používanými v danej oblasti techniky.

2) S vodou nemiešateľný roztok rozpúšťadla s obsahom makrolidu, z ktorého boli extrahované kyslé a/alebo polárne zložky, sa zahustí a zvyšný materiál, obsahujúci makrolid, sa rozpustí v rozpúšťadle makrolidu ako je acetonitril alebo dimetylformamid a extrahuje nearomatickým uhľovodíkovým rozpúšťadlom, ako je cyklohexán, hexán, heptán alebo cyklohexén. Vrstva rozpúšťadla, rozpúšťajúceho makrolid, je oddelená a zahustená. Zvyšok s obsahom makrolidu je potom rozmelený s kryštalizačným rozpúšťadlom na získanie makrolidu, pokiaľ je tento tuhou látkou alebo je čistený postupmi, známymi odborníkom v danej oblasti techniky ako je chromatografia, pokiaľ sa jedná o olej. Eventuálne môže byť rozpúšťadlo, rozpúšťajúce makrolid, po extrakcii nearomatickým uhľovodíkovým rozpúšťadlom uvedené do styku s miešateľným rozpúšťadlom, ktoré nerozpustí makrolid, ako v predchádzajúcom postupe 1).

3) S vodou nemiešateľný roztok rozpúšťadla, ktoré obsahuje makrolid a z ktorého boli extrahované kyslé a/alebo bázické zložky, sa zahustí a zvyšný materiál je rozmelený s kryštalizačným rozpúšťadlom makrolidu ako je dietyléter, diizopropyléter alebo t-butylmetyléter.

Makrolid obsahujúci koncentrát môže byť prípadne najskôr extrahovaný podľa jednej z vyššie uvedených metód 1 až 3 na odstránenie nepolárnych zložiek a potom môže byť zvyšok obsahujúci makrolid rozpustený v rozpúšťadle nemiešateľnom s vodou (pokial v ňom už nie je rozpustený) a extrahovaný vodnou bázou a/alebo kyselinou na odstránenie kyslých a/alebo bázických zložiek.

Vyššie uvedený postup zvýhodňuje neočakávané zistenie, že sa makrolidy ako je rapamycin nerozkladajú, ak sú extrahované vodnou kyselinou alebo bázou z roztokov, tvorených rozpúšťadlami nemiešateľnými s vodou a koncentrátmi, obsahujúcimi makrolid. Predtým sa degradácia predpokladala na základe pozorovanej degradácie rapamycinu, nastávajúcej po prídavku kyseliny alebo bázy do roztoku.

Tento extrakčný postup veľmi skracuje čas, nevyhnutný na získanie makrolidu z uvedených koncentrátov a vyhýba sa časovo aj finančne náročným chromatografickým metódam.

Tricyklický makrolid rapamycin je kryštalická tuhá látka, rozpustná v metanole, acetóne a dimetylformamide, slabo rozpustná v dietyléteri, obmedzene rozpustná v hexáne alebo petroléteri a nerozpustná vo vode. Rapamycin má nižšie uvedenú štruktúru. Systém číslovania atómov zodpovedá spôsobu, používanému v Chemical Abstracts.

'.0

Nasledujúce príklady sú len dokreslením spôsobu podľa vynálezu na izoláciu rapamycínu z koncentrátov kvasnej živnej pôdy a materských výluhov a nemajú žiadnym spôsobom rozsah tohto vynálezu obmedzovať. V nasledujúcich príkladoch bola totožnosť izolovaného produktu ako rapamycínu potvrdená porovnaním fyzikálnych, spektrálnych a chromatografických vlastností s tými istými vlastnosťami autentického rapamycínu. Čistota produktu (nie rekryštalizovaného) bola stanovená analýzou pomocou HPLC (vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Roztok koncentrovaného kvasného živného extraktu (157,0 g, obsah rapamycínu 10,4 %) v chloride metylnatom (600 ml) bol premytý 3 x 150 ml 0,5 M roztoku NaOH pri teplote 0 až 5 °C, potom bol premývaný vodou až do dosiahnutia neutrálneho pH vymývacieho roztoku a následne bol premytý soľným roztokom. Roztok chloridu metylnatého bol zahustený a zvyšok (70,5 g) bol rozmelený s dietyléterom (140 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá dietyléterom a vysušená za získania rapamycínu (6,3 g, 91,7% čistota, 34,5% výťažok). Zahustenie dietyléterových filtrátov poskytlo 63,5 g oleja, obsahujúceho 13,1 % rapamycínu.

Príklad 2

Roztok koncentrovaného kvasného živného extraktu (206,0 g, s obsahom rapamycínu 11,8 %) v t-butylmetyléteri (800 ml) bol premytý 3 x 400 ml 0,5 M roztoku NaOH pri teplote 0 až 5 °C a potom bol premývaný vodou až do dosiahnutia neutrálneho pH premývacieho roztoku. Roztok t-butylmetyléteru bol zahustený a zvyšok (75,0 g) bol rozmelený s dietyléterom (150 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá dietyléterom a vysušená za získania rapamycínu (11,4 g,

92,2% čistota, 43,3% výťažok). Zahustenie dietyléterových filtrátov poskytlo 58,7 g oleja, obsahujúceho 11,3 % rapamycínu.

Príklad 3

Roztok koncentrovaného kvasného živného extraktu (10,58 g, obsah rapamycínu 10,4 %) v acetonitrile (23 ml) bol premytý 2 x 23 ml cyklohexánu a potom zahustený. Zvyšok bol rozpustený v dichlórmetáne a premytý postupne 3 x 23 ml 0,5 M roztoku NaOH pri teplote 0 až 5 ’C, 2 x 23 ml 0,5 M HCI pri teplote 0 až 5 ’C a potom bol premývaný vodou až do dosiahnutia neutrálneho pH vymývacieho roztoku. Roztok dichlórmetánu bol zahustený a zvyšok (4,07 g) bol rozmelený s dietyléterom. Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá dietyléterom a vysušená za vzniku rapamycínu (0,64 g, 89,5% čistota, 58,2% výťažok). Zahustenie dietyléterových filtrátov poskytlo 3,36 g oleja, obsahujúceho 9,8 % rapamycínu.

Príklad 4

Roztok koncentrovaného kvasného živného extraktu (100,0 g, obsah rapamycínu 11,8 %) v etylacetáte (400 ml) bol premytý 1 x 200 ml a 2 x 100 ml 0,5 M roztoku NaOH pri teplote 0 až 5 ’C, potom bol premytý 2 x 200 ml roztoku 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 0 až 5 ’C a nakoniec bol premývaný vodou až do dosiahnutia neutrálneho pH premývacieho roztoku. Vodné premývacie roztoky boli spätne extrahované etylacetátom (100 ml) a potom boli etylacetátové roztoky spojené. Roztok etylacetátu bol zahustený a zvyšok (43,2 g) bol rozmelený s diizopropyléterom (45 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá diizopropyléterom a vysušená za vzniku rapamycínu (9,5 g, 85,3% čistota, 68,7% výťažok). Zahustenie diizopropyléterových filtrátov poskytlo 31,6 g oleja, obsahujúceho 6,6 % rapamycínu.

Príklad 5

Roztok koncentrovaného kvasného živného extraktu (25,2 g, obsah rapamycínu 10,4 %) v zmesi toluénu (120 ml) a etylacetátu (25 ml) bol postupne premytý 3 x 50 ml 0,5 M roztoku NaOH pri teplote 0 až 5 ’C, 2 x 50 ml 0,5 M roztoku kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 0 až 5 ‘C a nakoniec bol premývaný vodou až do dosiahnutia neutrálneho pH premývacieho roztoku. Roztok toluénu a etylacetátu (128 ml) bol rozdelený na dve rovnaké časti na spracovanie nasledujúcimi metódami:

Metóda A. Roztok toluénu a etylacetátu (64 ml) bol zahustený a zvyšok (5,7 g) bol rozmelený s dietyléterom (11 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá ďalším dietyléterom a vysušená za získania 0,84 g rapamycínu (92,7% čistota, 64,1% výťažok). Zahustením dietyléterových filtrátov sa získalo 4,3 g oleja, obsahujúceho 6,8 % rapamycínu .

Metóda B. Roztok toluénu a etylacetátu (64 ml) bol zahustený a zvyšok (9,0 g) bol rozpustený v acetonitrile (50 ml) . Roztok acetonitrilu bol premytý 2 x 25 ml cyklohexánu, potom bol zahustený a zvyšok (4,3 g) bol rozmelený s dietyléterom (11 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá dietyléterom a vysušená za vzniku 0,81 g rapamycínu (94,6% čistota, 61,8% výťažok). Zahustením dietyléterových filtrátov sa získalo 3,0 g oleja, obsahujúceho 5,9 % rapamycínu.

Príklad 6

Koncentrát materského výluhu (996,0 g, obsah rapamycínu

21,6 %) bol rozmelený s t-butylmetyléterom (4000 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá t-butylmetyléterom (500 ml) a vysušená za vzniku 36,2 g rapamycínu (95,1% čistota, 13,8% výťažok). Filtráty boli premyté 1 x 2000 ml a 2 x 1000 ml 0,5 M roztoku hydroxidu sodného pri teplote

O až 5 ’C. Spojené bázické extrakty boli premyté 1 x 500 ml t-butylmetyléteru. Potom bol t-butylmetyléterový filtrát s extraktom spojený a premývaný vodou tak dlho, dokiaľ nebol premývací roztok neutrálny. Vodné extrakty boli spojené a extrahované t-butylmetyléterom (500 ml). Roztoky t-butylmetyléteru boli spojené, zahustené a zvyšok (377,1 g) bol rozmelený s diizopropyléterom (350 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá diizopropyléterom a vysušená za vzniku 126,7 g rapamycínu (82,4% čistota, 58,9% výťažok). Celkový výťažok rapamycínu z koncentrátu materského výluhu bol teda 162,9 g (72,7%). Zahustením diizopropyléterových filtrátov sa získalo 157,9 g oleja, obsahujúceho 20,9 % rapamycínu .

Príklad 7

Koncentrát materského výluhu (562,1 g, obsah rapamycínu

21,6 %) v dichlórmetáne (2000 ml) bol premytý 3 x 500 ml 0,5 M roztoku NaOH, pri teplote 0 až 5 ’C a spojené vodné bázické extrakty boli extrahované 1 x 200 ml dichlórmetánu. Organické roztoky boli spojené a premyté 2 x 500 ml 0,5 M roztoku HCI pri teplote 0 až 5 ’C. Spojené vodné kyslé extrakty boli extrahované 1 x 200 ml dichlórmetánu. Spojené organické extrakty boli premývané vodou tak dlho, dokiaľ nebola premyvacia voda neutrálna. Organický roztok bol zahustený a zvyšok (255,0 g) bol rozmelený s diizopropyléterom (250 ml). Kryštalická tuhá látka bola odobratá, premytá dietyléterom a vysušená za vzniku 108,6 g rapamycínu (86,6% čistota, 77,4% výťažok). Zahustením diizopropyléterových filtrátov sa získalo 100,2 g oleja, obsahujúceho 23,1 % rapamycínu.

Príklad 8

Vodný 0,5 M hydroxid sodný (400 ml) bol pri teplote 0 až 5 ’C pridaný k energicky miešanému a chladenému (0 až 5 ’C) roztoku koncentrovaného kvasného živného extraktu (198,5 g, obsah rapamycínu 8,3 %) v t-butylmetyléteri (800 ml) tak rýchlo, aby mohla byť teplota stále udržiavaná v rozmedzí 0 až 5 ’C. Po silnom miešaní po dobu 5 minút bola odstránená spodná vodná bázická vrstva a uschovaná pri teplote 0 až 5 °C. Organická vrstva bola znova extrahovaná 2 x 200 ml 0,5 M roztoku NaOH pri teplote 0 až 5 ’C. Vodné bázické extrakty boli spojené a znova extrahované t-butylmetyléterom (200 ml). Roztoky t-butylmetyléteru boli spojené a premývané vodou tak dlho, dokiaľ premývacia voda nebola neutrálna (pH = 7). Vodné premývacie roztoky boli spojené a extrahované t-butylmetyléterom (100 ml). Roztoky t-butylmetyléteru boli spojené, premyté nasýteným vodným roztokom chloridu sodného a vákuovo zahustené pri 40 ’C. Zvyšok bol pri teplote 20 až 25 “C najmenej 1 hodinu rozmeľovaný s diizopropyléterom (85 ml) a zmes bola cez noc ochladzovaná na 0 až 5 ’C. Kryštalická tuhá látka bola získaná pomocou Buchnerovho lievika s fritou a pri teplote 20 až 25 ’C bola premytá zmesou diizopropyléter/t-butylmetyléter v pomere 4:1 (5 x 20 ml alebo až do odfarbenia filtrátu). Kryštalická tuhá látka bola vysušená na konštantnú hmotnosť za vzniku 12,0 g rapamycínu (91,2% čistota, 66,4% výťažok). Zahustením t-butylmetyléterových filtrátov a premývacích roztokov sa získalo

63,9 g živice, obsahujúcej 3,63 % rapamycínu.

Príklad 9

Koncentrát materského výluhu (200 g, obsah rapamycínu 25 %) bol za miešania a pri laboratórnej teplote rozpustený v t -butylmetyléteri (800 ml). Roztok bol za miešania ochladený na 0 až 5 ’C a hneď extrahovaný 270 ml 0,65 M roztoku hydroxidu sodného, vopred ochladeného na 0 až 5 ’C za udržovania teploty zmesi taktiež na teplote 0 až 5 ’C. (Množstvo vodného hydroxidu sodného, nevyhnutné na to, aby konečné pH extraktu malo hodnotu 12, bolo stanovené v alikvotnej časti koncentrovaného materského výluhu).

Vrstva vodnej fázy bola uchovávaná pri teplote 0 až 5 “C, zatiaľ čo organická fáza bola za udržiavania teploty v rozmedzí medzi 0 až 5 ’C premytá 5% roztokom chloridu sod14 neho. Bázický vodný extrakt bol spätne extrahovaný t-butylmetyléterom (100 ml). Organické fázy boli spojené a premyté 3 x 200 ml 5% roztoku chloridu sodného (pH konečného premývacieho roztoku bolo 7,4). Organický roztok bol zahustený za zníženého tlaku (60 až 130 mm Hg) a teploty 25 až 40 “C. K zvyšku bol v priebehu 30 minút, za miešania a pri laboratórnej teplote pomaly pridaný cyklohexén (80 ml) a miešanie pokračovalo až do úplného dokončenia kryštalizácie (3 hodiny). Zmes bola pri laboratórnej teplote miešaná ešte ďalšiu hodinu, potom bola ochladená na 0 až 5 °C a miešaná cez noc. Šedobiela kryštalická tuhá látka potom bola prefiltrovaná pomocou Buchnerovho lievika s fritou. Tuhá látka bola premytá 5 x 40 ml zmesi t-butylmetyléteru a cyklohexénu (v pomere 2:3) a potom bola vo vákuovej piecke pri teplote 35 až 40 “C vysušená do konštantnej hmotnosti, čím sa získalo 22,7 g rapamycínu (90,6% čistota, 41,4% výťažok). Zahustením filtrátov a premývacích roztokov (t-butylmetyléteru a cyklohexénu) sa získalo 60,1 g oleja, obsahujúceho

37,5 % rapamycínu.

Claims (11)

1. Spôsob separácie makrolidu od kyslých, bázických a nepolárnych neutrálnych nečistôt, prítomných v koncentráte kvasných živných extraktov alebo materských výluhov, obsahujúcich uvedený makrolid, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje v akomkoľvek poradí jeden alebo viac z nasledujúcich postupov:

a) roztok uvedeného koncentrátu v rozpúšťadle, ktoré je nemiešatelné s vodou, sa extrahuje vodnou bázou na odstránenie v podstate všetkých kyslých nečistôt;

b) roztok uvedeného koncentrátu v rozpúšťadle, ktoré je nemiešatelné s vodou, sa extrahuje vodnou kyselinou na odstránenie v podstate všetkých bázických nečistôt;

c) roztok uvedeného koncentrátu sa podrobí reakcii s nearomatickým uhľovodíkovým rozpúšťadlom na odstránenie nepolárnych neutrálnych nečistôt.

2. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že sa nepoláme neutrálne zložky koncentrátu kvasného živného extraktu alebo materského výluhu odstránia extrahovaním roztoku uvedeného koncentrátu v prvom rozpúšťadle pomocou druhého rozpúšťadla, tvoreného nearomatickým uhľovodíkom, ktoré je nemiešateľné s prvým rozpúšťadlom a nerozpúšťa makrolid.

3. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že sa s vodou nemiešateľný roztok, obsahujúci makrolid po extrakcii kyslých a/alebo bázických zložiek, podrobí reakcii s dostatočným množstvom miešateľného rozpúšťadla, v ktorom sa makrolid nerozpúšťa tak, aby sa makrolid stal vo výslednej zmesi rozpúšťadla nerozpustným a oddelil sa tak z roztoku, čo umožní separáciu makrolidu zo zmesi rozpúšťadla.

4. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že sa s vodou nemiešateľný roztok, obsahujúci makrolid po extrakcii kyslých a/alebo bázických zložiek zahustí a zvyšok je kryštalizovaný zo zmesi s kryštalizačným rozpúšťadlom alebo zmesou rozpúšťadiel.

5. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa s vodou nemiešateľný roztok, obsahujúci makrolid po extrakcii kyslých a/alebo bázických zložiek, zahustí, zvyšok sa rozpustí v prvom rozpúšťadle a na odstránenie neutrálnych nepolárnych nečistôt sa extrahuje druhým rozpúšťadlom, ktorým je nearomatický uhľovodík, nemiešateľný s prvým rozpúšťadlom a nerozpúšťajúci makrolid.

6. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že sa koncentrát kvasného živného extraktu alebo koncentrát materského výluhu najskôr rozpustí v prvom rozpúšťadle a na odstránenie neutrálnych nepolárnych nečistôt sa extrahuje druhým rozpúšťadlom, ktorým je nearomatický uhľovodík nemiešateľný s uvedeným prvým rozpúšťadlom; potom sa roztok v prvom rozpúšťadle zahustí, zvyšok sa rozpustí v rozpúšťadle nemiešateľnom s vodou a extrahuje sa vodnou bázou a/alebo kyselinou na odstránenie kyslých alebo bázických nečistôt.

7. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že makrolidom je tricyklický makrolid.

8. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 7, v y značujúci sa tým, že tricyklickým makrolidom je rapamycin alebo jeho v prírode sa vyskytujúci homológ, analóg alebo FK-506 alebo jeho v prírode sa vyskytujúci homológ alebo analóg.

9. Spôsob separácie makrolidu podľa nároku 8, v y 17 značujúci sa tým, že tricyklickým makrolidom je rapamycín, 32-desmetylrapamycín alebo 15-deoxorapamycín.

10. Spôsob značuj úc rapamycín.

separácie makrolidu podľa nároku 8, v y i sa t ý m, že tricyklickým makrolidom je

11. Spôsob značuj úc separácie makrolidu podľa nároku 8, v y i sa t ý m, že tricyklickým makrolidom je