FI112378B - Uusi uuttomenetelmä luonnossa esiintyvien makrolidien talteenottamiseksi - Google Patents

Description

112378

Uusi uu11omenetelmä luonnossa esiintyvien makrolidien talteen ottamiseksi

Keksintö koskee uuttomenetelmää luonnossa esiinty-5 vien makrolidien talteen ottamiseksi, ja erityisesti menetelmää luonnossa esiintyvän neutraalin makrolidin, edullisesti trisyklisen makrolidin, kuten rapamysiinin, 32-des-metyylirapamysiinin, 15-deoksorapamysiinin tai FK-506:n, erottamiseksi muista luonnossa esiintyvistä komponenteis-10 ta, joita saadaan fermentointiprosessien yhteydessä. Keksintö koskee edelleen erityisesti menetelmää trisyklisen makrolidin, so. rapamysiinin, talteen ottamiseksi fermen-tointiliemiuutoksen konsentraatista ja emäliuoksen kon-sentraatista.

15 Trisyklisillä makrolideilla, joista esimerkkeinä mainitaan rapamysiini ja FK-506, on immunosuppressoivaa aktiivisuutta sekä antibioottista ja muuta farmakologista aktiivisuutta ja ne ovat hyödyllisiä hoidettaessa siirrännäisten hylkimisiä, inflammatorisia sairauksia sekä au-20 toimmuunisairauksia, kuten lupusta, nivelreumaa, sokeri tautia ja multippelia skleroosia.

, ,·. Trisyklisiä makrolideja, rapamysiiniä, 32-desmetyy- * > · lirapamysiiniä, 15-deoksorapamysiiniä ja FK-506:ta, val- \ mistetaan fermentoimalla erilaisia Streptoznyces-kantoja . . 25 asianmukaisissa olosuhteissa, ja ne ovat neutraaleja, sil- • * · ··* · lä niissä ei ole mitään emäksisiä aminoryhmiä, fenolisia ryhmiä tai karboksyylihapporyhmiä. Rapamysiiniä valmiste-·.’ ' taan viljelemällä S. hygroscoplcus NRRL 5491 :tä vesipitoi sessa väliaineessa. Trisyklistä makrolidia sisältävä my-: * : 30 seeli otetaan talteen kasvatusväliaineesta ja sitä uute- taan orgaanisella liuottimena, kuten metanolilla, jolloin I · t saadaan seosta, joka koostuu halutusta trisyklisestä mak-rolidista, läheisistä yhdisteistä, happamista yhdisteistä, kuten rasvahapoista, emäksisistä yhdisteistä, kuten alka-: : : 35 lordeista ja peptideistä, sekä neutraaleista lipofiilisis- 2 112378 tä yhdisteistä, kuten rasvoista. Tyypillisesti, fermen-tointiliemiuutos konsentroidaan makrolidin eristämistä e-deltävän kuljetuksen ja/tai varastoinnin helpottamiseksi. Trisyklisten makrolidien eristys ja puhdistus fermentoin-5 tiliemiuutoksesta on ennen tätä keksintöä ollut työläs ja kallis prosessi, jossa on käytetty erilaisia kemiallisia ja kromatografisia menetelmiä puhdistetun materiaalin saamiseksi [US-julkaisu nro 5 091 389; US-julkaisu nro 3 993 749; W0-julkaisu nro 93/11130; julkaisu, Sehgal, J. of 10 Antibiotics 28(10)727(1975)]. Raparaysiinin fermentointi-liemiuutoksen konsentraatti sisältää ainoastaan 5 - 15 % rapamysiiniä ja esim. aina n. 50 %:iin saakka happamia komponentteja, lisäksi rapamysiini täytyy erottaa muista komponenteista. Trisyklisten makrolidien talteenotto fer-15 mentointiliemiuutoksista käsittää tavallisesti adsorption ja desorption aktivoidusta hiilestä, selektiiviseen liukoisuuteen perustuvia menetelmiä ja yhden tai useampia aikaa kuluttavia ja kalliita kromatografisia menetelmiä, joissa käytetään pylväskromatografiaa ja/tai korkeapai-20 neista nestekromatografiaa. Aikaisemmin on vältetty happamia tai emäksisiä olosuhteita, sillä trisyklisiä makroli-deja, kuten rapamysiiniä, on pidetty epästabiileina happa- *t missä tai emäksisissä olosuhteissa. Rapamysiini hajoaa ► · veteen sekoittuvissa liuoksissa, so. metanolissa tai tet-25 rahydrofuraanissa, epäorgaanisten emäksien, kuten natrium- ’· * hydroksidin vesiliuoksen, orgaanisten happojen, kuten ·.: 4-dimetyyliaminopyridiinin (DMAP) tai 1,8-diatsobisyk- V ; lo[5.4.0]undek-7-eenin (DBU), tai mineraalihappojen, kuten suolahapon, vesiliuosten, ja Lewis-happojen, kuten sinkki-:*·*: 30 kloridin, vaikutuksesta [Steffan et ai., Tetrahedron Let- ters (painossa), D. Yohanes ja S.J. Danishefsky, Tetrahedron Letters 33(49), 7469-7472 (1992); Luengo et ai., Tetrahedron Letters 34(6), 991-994 (1993) ja D. Yohannes et ai., Tetrahedron Letters 34(13), 2075-2078 (1993)].

112378 3

Esillä oleva keksintö tuo esiin suhteellisen nopean ja tehokkaan menetelmän makrolidin, erityisesti trisykli-sen makrolidin, talteen ottamiseksi epäpuhtauksia sisältävästä liuoksesta ja aivan erityisesti rapamysiinin talteen 5 ottamiseksi fermentointiliemiuutosten konsentraateista ja emäliuoksista tai niiden konsentraateista, jotka on saatu uudelleenkoteytysliuottimista, trituroinneista ja tuotteen pesuista, ja sillä vältetään aikaa kuluttavat ja kalliit kromatografiset erotukset, joista on esitetty esimerkke-10 jä US-julkaisussa nro 5 091 389; US-julkaisussa nro 3 993 749; W0-julkaisussa nro 93/11130 ja julkaisussa,

Sehgal, J. of Antibiotics 28(10)727(1975).

Keksintö tuo siten esiin menetelmän makrolidin erottamiseksi happamista, emäksisistä ja ei-polaarisista 15 neutraaleista epäpuhtauksista, joita on läsnä makrolidia sisältävässä liuoksessa, jolloin menetelmään kuuluu yksi tai useampia menetelmiä, jotka valitaan seuraavista menetelmistä missä tahansa järjestyksessä: (a) liuosta, joka sisältää mainittua makrolidia ve- 20 teen sekoittumattomassa liuottimessa, uutetaan emäksen vesiliuoksella kaikkien happamien epäpuhtauksien poistamiseksi oleellisesti; (b) liuosta, joka sisältää mainittua makrolidia ve-teen sekoittumattomassa liuottimessa, uutetaan hapon vesi- 25 liuoksella kaikkien emäksisten epäpuhtauksien poistamisek- ·* ’ si oleellisesti; t · ·. : (c) mainittuun makrolidin liuokseen kohdistetaan v · yksi tai useampia seuraavista toimenpiteistä ei-polaaris- ten neutraalien epäpuhtauksien poistamiseksi: : 30 (i) sitä uutetaan ei-aromaattisella hiilivetyliuot- timella, johon makrolidi on liukenematon, (ii) sitä käsitellään riittävällä määrällä sekoit-tuvaa makrolidin ei-liuotinta makrolidin saattamiseksi liukenemattomaksi saatavaan liuotinseokseen ja siten erot- * » » 4 112378 tuvaksi liuoksesta, jolloin makrolidi voidaan erottaa liuotinseoksesta, (iii) sitä trituroidaan makrolidia kiteyttävän liuottimen kanssa.

5 Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan siten erottaa happamat ja/tai emäksiset komponentit neutraaleista komponenteista liuottamalla makrolidia sisältävä konsentraatti sopivaan veteen sekoittumattomaan liuotti-meen ja uuttamalla happamat ja/tai emäksiset komponentit 10 emäksen tai vast, hapon vesiliuokseen, ja käyttää selektiiviseen liukoisuuteen perustuvia menetelmiä tai uutto-menetelmiä neutraalin ei-polaarisen trisyklisen makrolidin erottamiseksi konsentraatissa läsnä olevista ei-polaari-sista neutraaleista aineista. Vaikka tässä kuvattu mene-15 telmä soveltuu erityisen hyvin fermentointiliemiuutosten tai emäliuosten konsentraateille, esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan kuitenkin käyttää uutos- liuosta kokonaisuudessaan tai emäliuoksia kokonaisuudes saan, edellyttäen, että fermentointiliemen uuttoon tai uu-20 delleenkiteytykseen, triturointiin tai pesuihin käytetty liuotin tai liuotinseos on sovitettavissa tähän menetelmään ja että liuottimen tilavuus ei tuota hankaluuksia. Liuottimen tilavuutta voidaan pienentää osittaisella kon-sentroinnilla. Jokaista liuosta, johon esillä olevan kek-25 sinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa, voidaan kut-• sua makrolidia sisältäväksi liuokseksi tai konsentraatik- ., : ’ si.

v : Mainitulla menetelmällä saatu tuote voidaan puhdis taa hyväksyttävään puhtauteen standardimenetelmillä, jotka i ' : 30 ovat tunnettuja alan ammattilaisille.

Tässä yhteydessä käytetyn mukaisesti, ei-polaarinen liuotin on ei-aromaattinen hiilivetyliuotin, kuten syklo- ’ heksaani, syklohekseeni, heksaani, heptaani, pentaani tai * · vastaava. Liuottimiin, jotka ovat sekoittumattomia ei-aro- • 35 maattiseen hiilivetyliuottimeen, kuuluu, näihin rajoittu- * » 112378 5 matta, asetonitriili ja dimetyyliformamidi. Termillä uut-to tarkoitetaan toimenpidettä, jossa yhtä liuosta sekoitetaan perusteellisesti toisen sekoittumattoman liuoksen kanssa, annetaan näiden sekoittumattomien liuosten erottua 5 toisistaan ja toinen kerros tai faasi otetaan fysikaalisesti erilleen toisesta, ja toimenpide toistetaan tarvittaessa. Termillä pesu tarkoitetaan liuokseen viitattaessa uuttotoimenpidettä ja kiintoaineeseen viitattaessa kiintoaineen huuhtelemista liuottimena, johon kiintoaine on 10 oleellisesti liukenematon. Termillä emäliuos tarkoitetaan orgaanisten liuottimen liuoksia, jotka on saatu kiteytyksissä suodoksista, pesuista ja vesiuutosten takaisinuu-toista sekä talteen otetun kiintoaineen pesuista ja tritu-roinneista. Makrolidin liuotin on liuotin tai liuotinseos, 15 joka liuottaa makrolidin ja mukana olevat epäpuhtaudet, kuten happamat tai emäksiset komponentit. Makrolidin ei-liuotin on liuotin tai liuotinseos, johon makrolidi on olennaisesti liukenematon mutta johon neutraalit komponentit, kuten rasvat, liukenevat. Makrolidia kitetyttävä li-20 uotin on liuotin tai liuotinseos, josta makrolidi voidaan uudelleenkiteyttää tai jossa se kiteytyy amorfisesta tilasta trituroinnin aikana. Kun menetelmä vaatii liuoksen konsentroimista, niin on edullista, että liuotin tai liuo-tinseos on riittävän haihtuvaa tislautuakseen ei-hajoitta-, , 25 vissa lämpötila- ja paineolosuhteissa.

· · Edelleen, esillä oleva keksintö tuo esiin menetel- • * · ··- män, jossa makrolidia sisältävän fermentointiliemiuutoksen v · konsentraatin tai emäliuoksen konsentraatin ei-polaariset neutraalit komponentit poistetaan uuttamalla liuosta, joka 5 * : 30 sisältää mainittua konsentraattia ensimmäisessä liuotti- :*“: messa (esim. asetonitriilissä, DMF:ssä), toisella, ei-aro- .1. maattisella hiilivetyliuottimella, joka on sekoittumaton ensimmäisen liuottimen kanssa ja johon makrolidi on liu-·;*’ kenematon (esim. sykloheksaani, syklohekseeni, heksaani, : Ϊ ; 35 heptaani tai pentaani).

‘ I

6 112378

Edelleen tuodaan esiin menetelmä, jossa makrolidia sisältävää, veteen sekoittumatonta liuosta, happamien ja/ tai emäksisten komponenttien uuton jälkeen, joko (i) käsitellään riittävällä määrällä sekoittuvaa 5 makrolidin ei-liuotinta makrolidin saattamiseksi liukenemattomaksi saatavaan liuotinseokseen ja siten erottuvaksi liuoksesta, jolloin makrolidi voidaan erottaa liuotinseok-sesta, tai (ii) se konsentroidaan ja jäännös kiteytetään seos-10 tamalla kiteyttävän liuottimen tai liuotinseoksen kanssa.

Veteen sekoittumaton liuos, joka sisältää makrolidia, voidaan happo- ja/tai emäskomponenttien uuton jälkeen edelleen konsentroida ja jäännös voidaan liuottaa ensimmäiseen liuottimeen sekä suorittaa uutto toisella ei-15 aromaattisella hiilivetyliuottimella, joka on ensimmäiseen liuottimeen sekoittumaton ja johon makrolidi on liukenematon, neutraalien ei-polaaristen epäpuhtauksien poistamiseksi .

Keksinnön mukainen eräs edullinen menetelmä on esi-20 tetty kaaviossa 1 alla:

Kaavio 1 ’ * * * · ‘ * 2g Happamat > komponentit . Trisyklisen makro- X .-- ··· lidin raakakonsen- / nlinc Trisyklmen

• * · -I I I.lf in . _J

* traatti, ηoka on V , . \ . , makrolidi

η . . ’ J . \ hapon vesi-\ ei-polaa- UJ--LU-L

liuotettu veteen se- \ \ ri^en Xi.

koittumattomaan liu- \ \ pofiilji——......

on ottimeen. ' \ liuotin • .* - Emäksiset \ .“*. komponentit \ »*!’. --- Ei-polaariset ' neutraalit aineet » 1 » » » » » 7 112378

Menetelmän mukaisesti, konsentraatti, joka sisältää makrolidia ja on saatu joko fermentointiliemiuutoksen konsentraatista tai uudelleenkiteytys- ja/tai pesuliuos-ten konsentraatista, liuotetaan veteen sekoittumattomaan 5 liuottimeen tai liuotinseokseen, joka valitaan konsentraatin liuotuskyvyn ja helpon poistettavuuden perusteella ja joihin kuuluu, näihin rajoittumatta, dikloorimetaani, t-butyylimetyylieetteri, etyyliasetaatti, tolueeni, 1-bu-tanoli, etyyliasetaatti/tolueeniseos, heptaani/etyyliase-10 taattiseos tai heksaani/metyleenikloridiseos. Emästen vesiliuokset, joihin kuuluu natriumhydroksidin, natriumbikarbonaatin, natriumkarbonaatin, ammoniumhydroksidin ja vastaavat vesiliuokset, edullisesti natriumhydroksidin vesiliuos, pitoisuuksiltaan alueella 0,1 - 5 N, edullises-15 ti noin 0,1 - 1,0 N ja edullisimmin noin 0,1 - 0,5 N, ovat erityisen käyttökelpoisia happamien komponenttien uuttamiseen. Orgaaniset emäkset, kuten trimetyyliamiini, eivät poista yhtä tehokkaasti happamia komponentteja kuin vahvemmat epäorgaanisten emästen vesiliuokset. Mineraalihap-20 pojen vesiliuokset, joihin kuuluu suolahapon, monokaliumfosfaatin, mononatriumsulfaatin ja vastaavat vesiliuokset, edullisesti suolahapon vesiliuos, pitoisuuksiltaan alueella 0,1 - 5 N, edullisesti noin 0,1 - 1,0 N ja edullisimmin noin 0,1 - 0,5 N, ovat erityisen käyttökelpoisia emäksis- t , , 25 ten komponenttien uuttamiseen. Orgaaniset hapot, kuten · · trifluorietikkahappo, eivät poista yhtä tehokkaasti emäk- * » · ·**.* sisiä komponentteja kuin mineraalihapot. Happamien ja/tai * emäksisten komponenttien uutot makrolidia sisältävästä liuoksesta suoritetaan sopivasti lämpötila-alueella 30 -5 °C - 45 °C, edullisesti alueella -5 °C - 30 °C ja edul- lisimmin alueella -5 °C - 10 °C. Makrolidin mahdollisen hajoamisen happojen tai emästen vaikutuksesta välttämisek- t I » si, uuttoprosessi tulisi suorittaa loppuun viipymättä. Läsnä olevien happamien ja/tai emäksisten komponenttien : :35 määristä riippuen molemmilla, sekä hapoilla että emäksil- t « » 8 112378 lä, uutto ei ole välttämättä tarpeellista, ja pelkästään happamien komponenttien tai pelkästään emäksisten komponenttien uutto voi olla riittävä poistamaan tarpeeksi epäpuhtauksia makrolidia sisältävästä liuoksesta trisyklisen 5 makrolidin eristämisen mahdollistamiseksi.

Happamien (tai emäksisten) komponenttien poisto makrolidia sisältävän konsentraatin liuoksesta suoritetaan edullisesti yhtenä, aikaa säästävänä uuttovaiheena. Emäksen (tai hapon) vesiliuosmäärä, joka tarvitaan tuottamaan 10 uuttoprosessiin ylimäärin emästä (tai happoa), voidaan määrittää uuttamalla liuosnäytettä, joka on otettu makrolidia sisältävän konsentraatin liuoksesta, emäksen (tai hapon) vesiliuoksella ja määrittämällä emäksen (tai hapon) tilavuus, joka tarvitaan näyteliuosuutosten pH:n saamisek-15 si sellaiseksi, että saatavilla on stökiometrinen ylimäärä emästä (tai happoa). Hapon tai emäksen ylimäärä määritetään käyttäen pH-mittaria tai muuta pH:n määrittämiseen sopivaa välinettä. Liuoksen, josta näyte oli otettu, uuttamiseen tarvittava emäksen (tai hapon) vesiliuoksen tila-20 vuus on tällöin verrannollinen uutettavan, neutraalia makrolidia sisältävän liuoksen ja siitä otetun näyteliuoksen tilavuuksien suhteeseen. Näin ollen happamien (tai emäk- > I · sisten) komponenttien uutto voidaan suorittaa yhtenä toimenpiteenä sen sijasta, että uutettaisiin lukuisia kertoja 25 emäksen (tai hapon) vesiliuoksen riittävää määrää vähem-’· · millä määrillä. On selvää, että kun makrolidia sisältävän

• I I

konsentraatin liuoksesta on poistettava sekä happamat että V · emäksiset komponentit, niin täytyy suorittaa erilliset uutot emäksen vesiliuoksella ja vast, hapon vesiliuoksel-; 30 la. Esimerkiksi rapamysiiniä sisältävän konsentraatin liuosten tapauksessa yksi uutto natriumhydroksidin vesili-uosmäärällä, jolla tuotetaan lopullinen pH-arvo 12, riit-

> I I

tää oleellisesti kaikkien happamien komponenttien poista-miseen.

»

» I

* » 1 » I I !<· · i t » » » t 9 112378

Makrolidi, joka on otettu talteen käyttämällä edellä esitettyjä menetelmiä, voidaan puhdistaa haluttuun puhtausasteeseen käyttämällä alan ammattilaiselle tunnettuja konventionaalisia menetelmiä. Haluttaessa suodokset ja 5 pesuliuokset voidaan työstää uudelleen makrolidin edelleen talteen ottamiseksi.

Sen jälkeen, kun on suoritettu toimenpiteet happamien ja/tai emäksisten komponenttien poistamiseksi veteen sekoittumattomasta liuotinliuoksesta, joka sisältää makro-10 lidia, makrolidi voidaan erottaa ei-polaarisista neutraaleista komponenteista jollakin seuraavista menetelmistä: (1) Makrolidin ei-liuotinta (tai -liuotinseosta), joka sekoittuu mainittuun makrolidia sisältävään, veteen sekoittumattomaan liuotinliuokseen, josta happamat ja/tai 15 emäksiset komponentit on uutettu, lisätään makrolidia sisältävään liuokseen sellaisena määränä, että makrolidista ja mahdollisesti makrolidille läheisistä yhdisteistä tulee liukenemattomia saatavaan liuokseen ja muodostuu erillinen faasi, joka voi olla joko öljy- tai kiintoainefaasi ja 20 voidaan erottaa alan ammattilaisen tuntemilla tavanomaisella erotusmenetelmillä.

(2) Veteen sekoittumaton liuotinliuos, joka sisäl- » /.* tää neutraalia makrolidia ja josta happamat ja/tai polaa- < · riset komponentit on uutettu, konsentroidaan ja saatu mak-25 rolidia sisältävä materiaali liuotetaan makrolidia liuot- > « ·* tavaan liuottimeen, kuten asetonitriiliin tai dimetyyli- < · · formamidiin, ja suoritetaan uutto ei-aromaattisella hii- v ’ livetyliuottimella, kuten sykloheksaanilla, heksaanilla, heptaanilla tai syklohekseenillä. Makrolidia liuottava ; ’30 liuotinkerros otetaan erilleen ja konsentroidaan. Makro-lidia sisältävää jäännöstä trituroidaan sitten kiteyttävän liuottimen kanssa makrolidin saamiseksi, mikäli makrolidi on kiinteää ainetta, tai puhdistetaan alan ammattilaisen tuntemilla menetelmillä, kuten kromatografoinnilla, mikäli ; 35 makrolidi on öljyä. Vaihtoehtoisesti, makrolidia liuotta- « » 112378 10 vaa liuotinta voidaan käsitellä ei-aromaattisella hiilive-tyliuottimella uuton jälkeen sekoittuvalla, makrolidia ei-liuottavalla liuottimena edellä toimenpiteessä (1) esitetyn mukaisesti.

5 (3) Makrolidia sisältävä, veteen sekoittumaton liuotinliuos, josta happamat ja/tai emäksiset komponentit on uutettu, konsentroidaan ja jäännösmateriaalia trituroi-daan makrolidia kiteyttävällä liuottimena, kuten dietyy-lieetterillä, di-isopropyylieetterillä tai t-butyylimetyy-10 lieetterillä.

Vaihtoehtoisesti, makrolidia sisältävää konsent-raattia voidaan ensin uuttaa jonkin edellä esitetyistä (1) - (3) toimenpiteistä mukaisesti ei-polaaristen komponenttien poistamiseksi, ja sitten makrolidia sisältävä 15 jäännös voidaan liuottaa veteen sekoittumattomaan liuotti- meen, ellei se jo ole tällaisessa liuottimessa, ja suorittaa uutto emäksen ja/tai hapon vesiliuoksella happamien ja/tai emäksisten komponenttien poistamiseksi.

Edellä esitetty menetelmä hyödyntää tehtyä yllättä-20 vää havaintoa, että makrolidit, kuten trisyklinen makroli-di, rapamysiini, eivät hajoa, kun makrolidia sisältävien konsentraattien veteen sekoittumattomia liuotinliuoksia ! uutetaan happamilla tai emäksisillä vesiliuoksilla asia nmukaisissa lämpötilaolosuhteissa. Aikaisemmin on ajatel- * * 25 tu, perustuen tehtyyn havaintoon, jonka mukaan rapamysiini < · hajoaa hapolle tai emäkselle liuoksessa altistamisen seu- ; rauksena, että tapahtuisi hajoaminen.

: Esillä oleva uuttomenetelmä lyhentää merkittävästi aikaa, joka tarvitaan makrolidien talteen ottamiseksi mai-·'; 30 nituista konsentraateista, ja sillä vältetään aikaa kulut- tavat ja kalliit kromatografiset menetelmät.

Trisyklinen makrolidi, rapamysiini, on kiteinen ;t’ kiintoaine, joka liukenee metanoliin, asetoniin, dimetyy- liformamidiin, liukenee kohtalaisesti dietyylieetteriin ja 35 liukenee huonosti heksaaniin tai petrolieetteriin ja on 11 112378 liukenematon veteen. Rapamysiinillä on alla esitetty rakenne. Atomien numeroinnissa on käytetty Chemical Abstracts: in käyttämää järjestelmää.

5 A.oh 42j 38r ^ 47., J 37 26 ,46 10 19^5^1 21 |' 29

18 \ 0 24 O

V IP 49 3i| o VJ15 ^ CH30 33f 0 13 OCH3 SO^^S 35 ^ 7>f^5 ^ 3 ^ 1>T36 10 8 4 2 * *5 51 20 32-desmetyylirapamysiinin ja 15-deoksorapamysiinin ,·, rakenteet voidaan päätellä helposti edellä esitetystä ra- pamysiinin rakenteesta. Neutraalin trisyklisen makrolidin, FK-506:n, rakenne on esitetty alla: '" i kN-\-5 Ηό Λα

T: °vX0o X

HoU I

: 35 s / 12 112378

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu ainoastaan havainnollistamaan esillä olevan keksinnön mukaista keksintöä rapamysiinin eristämiseksi fermentointiliemen ja emä-liuoksen konsentraateista ja niitä ei ole tarkoitettu mil-5 lään tavoin rajoittamaan esillä olevan keksinnön suoja-piiriä. Seuraavissa esimerkeissä eristetty tuote varmistettiin rapamysiiniksi vertaamalla fysikaalisia, spekri-ja kromatografisia ominaisuuksia rapamysiinille vahvistettuihin vastaaviin ominaisuuksiin. Tuotteen puhtaus määri-10 tettiin korkeapaineisella nestekromatografia-analyysillä (high pressure liquid chromatographic analysis).

Esimerkki 1

Liuosta, joka sisälsi konsentroitua fermentointi-liemiuutosta (157,0 g, rapamysiinipitoisuus 10,4 %) liuo-15 tettuna metyleenikloridiin (600 ml), pestiin kolmella 150 ml:n erällä 0,5 N NaOH-liuosta 0-5 eC:ssa, sitten vedellä, kunnes pesuliuos oli neutraalia, jonka jälkeen pestiin suolavedellä. Metyleenikloridiliuos konsentroitiin ja jäännöstä (70,5 g) trituroitiin dietyylieetterin 20 (140 ml) kanssa. Kiteinen kiintoaine kerättiin, sitä pes tiin dietyylieetterillä ja se kuivattiin, jolloin saatiin rapamysiiniä (6,3 g, puhtaus 91,7 %, saanto 35,4 %). Di-etyylieetterisuodosten konsentrointi tuotti 63,5 g öljyä, I > · ' *, jonka rapamysiinipitoisuus oli 13,1 %.

f * · 25 Esimerkki 2 ’> Liuos, joka sisälsi konsentroitua fermentointilie- i miuutosta (206,0 g, rapamysiinipitoisuus 11,8 %), liuotet- V ·’ tiin t-butyylimetyylieetteriin (800 ml) ja sitä pestiin kolmella 400 ml:n erällä 0,5 N NaOH-liuosta 0-5 °C:ssa, 30 jonka jälkeen sitä pestiin vedellä, kunnes pesuliuos oli neutraalia, t-butyylimetyylieetteriliuos konsentroitiin ja jäännöstä (75,0 g) trituroitiin dietyylieetterin (150 ml) « i t ‘ kanssa. Kiteinen kiintoaine kerättiin, sitä pestiin die- tyylieetterillä ja kuivattiin, jolloin saatiin rapamysii- ; 35 niä (11,4 g, puhtaus 92,2 %, saanto 43,3 %). Dietyylieet- 13 112378 terisuodosten konsentrointi tuotti 58,7 g öljyä, jonka rapamysiinipitoisuus oli 11,3 %.

Esimerkki 3

Liuosta, joka sisälsi konsentroitua fermentointi-5 liemiuutosta (10,58 g, rapamysiinipitoisuus 10,4 %) liuotettuna asetonitriiliin (23 ml), pestiin kahdella 23 ml:n erällä sykloheksaania ja sitten se konsentroitiin. Jäännös liuotettiin dikloorimetaaniin ja sitä pestiin peräkkäisesti kolmella 23 ml:n erällä 0,5 N NaOH-liuosta 0 -10 5 °C:ssa, kahdella 23 ml:n erällä 0,5 N HCl:ää 0 - 5 °C:ssa ja sitten vedellä, kunnes pesuliuos oli neutraalia. Dikloorimetaaniliuos konsentroitiin ja jäännöstä (4,07 g) trituroitiin dietyylieetterin kanssa. Kiteinen kiintoaine kerättiin, sitä pestiin dietyylieetterillä ja 15 kuivattiin, jolloin saatiin rapamysiiniä (0,64 g, puhtaus 89,5 %, saanto 58,2 %). Dietyylieetterisuodokset konsentroitiin, jolloin saatiin 3,36 g öljyä, jonka rapamysiinipitoisuus oli 9,8 %.

Esimerkki 4 20 Liuosta, joka sisälsi konsentroitua fermentointi- liemiuutosta (100,0 g, rapamysiinipitoisuus 11,8 %) ja liuotettuna etyyliasetaattiin (400 ml), pestiin yhdellä 200 ml:n erällä ja kahdella 100 ml:n erällä 0,5 N NaOH- » t » ‘ i liuosta 0-5 °C:ssa ja sitten pestiin kahdella 200 ml:n • 9 I | 25 erällä 0,5 N suolahappoliuosta 0-5 °C:ssa sekä lopuksi > · : ·' pestiin vedellä, kunnes pesuliuos oli neutraalia. Vesipi- t toisia pesuliuoksia uutettiin takaisin etyyliasetaatilla V : (100 ml) ja etyyliasetaattiliuokset yhdistettiin. Etyy- liasetaattiliuos konsentroitiin ja jäännöstä (43,2 g) tri- !*·': 30 turoitiin di-isopropyylieetterin (45 ml) kanssa. Kiteinen • > kiintoaine kerättiin, sitä pestiin di-isopropyylieetteril-

I t I

lä ja se kuivattiin, jolloin saatiin 9,5 g rapamysiiniä ';[/ (puhtaus 85,3 %, saanto 68,7 %). Di-isopropyylieetterisuo- i » dokset konsentroitiin, jolloin saatiin öljyä (31,6 g), : 35 jonka rapamysiinipitoisuus oli 6,6 %.

I I

i I

* I

14 1 12378

Esimerkki 5

Liuosta, joka sisälsi konsentroitua fermentointili-emiuutosta (25,2 g, rapamysiinipitoisuus 10,4 %) liuotettuna tolueenin (120 ml) ja etyyliasetaatin (25 ml) seok-5 seen, pestiin peräkkäisesti kolmella 50 ml:n erällä 0,5 N NaOH-liuosta 0-5 °C:ssa, kahdesti kahdella 50 ml:n erällä 0,5 N suolahappoa 0-5 °C:ssa ja sitten vedellä, kunnes pesuliuos oli neutraalia. Tolueeni/etyyliasetaattili-uos (128 ml) jaettiin kahteen yhtä suureen osaan seuraa-10 villa menetelmillä suoritettavia käsittelyjä varten:

Menetelmä A. Tolueeni/etyyliasetaattiliuos (64 ml) konsentroitiin ja jäännöstä (5,7 g) trituroitiin dietyyli-eetterin (11 ml) kanssa. Kiteinen kiintoaine kerättiin, sitä pestiin dietyylieetterilisällä ja kuivattiin, jol-15 loin saatiin 0,84 g rapamysiiniä (puhtaus 92,7 %, saanto 64,1 %). Dietyylieetterisuodosten konsentrointi tuotti 4,3 g öljyä, jonka rapamysiinipitoisuus oli 6,8 %.

Menetelmä B. Tolueeni/etyyliasetaattiliuos (64 ml) konsentroitiin ja jäännös (9,0 g) liuotettiin asetonitrii-20 liin (50 ml). Asetonitriililiuosta pestiin kahdella 25 ml:n erällä sykloheksaania. Tämän jälkeen asetonitriilili-.·. uos konsentroitiin ja jäännöstä (4,3 g) trituroitiin die- tyylieetterin kanssa (11 ml). Kiteinen kiintoaine kerät- « ♦ tiin, sitä pestiin dietyylieetterillä ja kuivattiin, joi- : M t | , 25 loin saatiin 0,81 g rapamysiiniä (puhtaus 94,6 %, saanto 61,8 %). Dietyylieetterisuodosten konsentroinnit tuottivat 3,0 g öljyä, jonka rapamysiinipitoisuus oli 5,9 %.

·.· ’ Esimerkki 6

Emäliuoskonsentraattia (996,0 g, rapamysiinipi-: * : 30 toisuus 21,6 %) trituroitiin t-butyylimetyylieetterin ; **; (4000 ml) kanssa. Kiteinen kiintoaine kerättiin, sitä pes- tiin t-butyylimetyylieetterillä (500 ml) ja kuivattiin, jolloin saatiin 36,2 g rapamysiiniä (puhtaus 95,1 %, saan-to 13,8 %). Suodoksia pestiin yhdellä 2000 ml:n erällä ja : : : 35 kahdella 1000 ml:n erällä 0,5 N natriumhydroksidiliuosta 112378 15 0-5 °C:ssa. Yhdistettyä emäsuutosta pestiin kerran t-bu-tyylimetyylieetterillä (500 ml), t-butyylimetyylieetteri-suodos ja uutos yhdistettiin ja pestiin vedellä, kunnes pesuliuos oli neutraalia. Vesiuutokset yhdistettiin ja 5 niitä uutettiin t-butyylimetyylieetterillä (500 ml), t-bu-tyy1imetyylieetteriliuokset yhdistettiin, konsentroitiin ja jäännöstä (377,1 g) trituroitiin di-isopropyylieetterin (350 ml) kanssa. Kiteinen kiintoaine kerättiin, sitä pestiin di-isopropyylieetterillä ja kuivattiin, jolloin saa-10 tiin 126,7 g rapamysiiniä (puhtaus 82,4 %, saanto 58,9 %). Siten emäliuoskonsentraatista talteen otettu rapamysiinin kokonaismäärä oli 162.9 g (72.7 %). Di-isopropyylieette-risuodosten konsentrointi tuotti 157,9 g öljyä, jonka ra-pamysiinipitoisuus oli 20,9 %.

15 Esimerkki 7

Liuosta, joka sisälsi emäliuoksen konsentraattia (562,1 g, rapamysiinipitoisuus 21,6 %) liuotettuna dikloo-rimetaaniin (2000 ml), pestiin komella 500 ml:n erällä 0,5 N natriumhydroksidiliuosta 0-5 °C:ssa ja yhdistettyjä 20 emäksisiä vesiuutoksia uutettiin yhdellä 200 ml:n erällä dikloorimetaania. Orgaaniset liuokset yhdistettiin ja niitä pestiin kahdella 500 ml:n erällä 0,5 N suolavetyhappo-liuosta 0-5 °C:ssa. Yhdistettyjä happamia vesiuutoksia *, uutettiin yhdellä 200 ml:n erällä dikloorimetaania. Yhdis- , . 25 tettyjä orgaanisia uutoksia pestiin vedellä, kunnes pesu- • vesi oli neutraalia. Orgaaninen liuos konsentroitiin ja -· jäännöstä (255,0 g) trituroitiin di-isopropyylieetterin v · (250 ml) kanssa. Kiteinen kiintoaine kerättiin, sitä pes tiin di-isopropyylieetterillä ja kuivattiin, jolloin saa- • * % • '· 30 tiin 108,6 g rapamysiiniä (puhtaus 86,6 %, saanto 77,4 %).

: Di-isopropyylieetterisuodosten konsentrointi tuotti 100,2 g öljyä, jonka rapamysiinipitoisuus oli 23,1 %.

Esimerkki 8 0,5 N natriumhydroksidin vesiliuosta (400 ml) li- : 35 sättiin 0-5 °C:ssa voimakkaassa sekoituksessa jäähdytet-

» I

16 112378 tyyn (O - 5 °C) liuokseen, joka sisälsi konsentroitua fer-mentointiliemiuutosta (198,5 g, rapamysiinipitoisuus 8,3 %) liuotettuna 800 ml t-butyylimetyylieetteriin, sellaisella nopeudella, että lämpötila pysyi 0-5 °C:ssa. 5 Viiden minuutin voimakkaan sekoituksen jälkeen alempi emäksinen vesikerros poistettiin ja sitä säilytettiin 0 -5 °C:ssa. Orgaanista kerrosta uutettiin uudelleen kahdella 200 ml:n erällä 0,5 N natriumhydorksidiliuosta 0 -5 °C:ssa. Emäksiset vesiuutokset yhdistettiin ja niitä uu-10 tettiin uudelleen t-butyylimetyylieetterillä (200 ml), t-butyylimetyylieetteriliuokset yhdistettiin ja niitä pestiin vedellä, kunnes pesuliuos oli neutraalia (pH = 7). Vesipitoiset pesuliuokset yhdistettiin ja niitä uutettiin t-butyylimetyylieetterillä (100 ml), t-butyylimetyylieet-15 teriliuokset yhdistettiin, niitä pestiin kyllästetyllä natriumkloridin vesiliuoksella ja konsentroitiin vakuumis-sa 40 eC:ssa. Jäännöstä trituroitiin di-isopropyylieette-rin (85 ml) kanssa 20 - 25 °C:ssa vähintään yhden tunnin ajan ja seos jäähdytettiin 0-5 °C:seen yön yli. Kiteinen 20 kiintoaine kerättiin käyttäen sintteröityä Buchner-lasi-suppiloa, ja kiintoainetta pestiin di-isopropyylieetteri-·, t-butyylimetyylieetterin 4:1-seoksella 20 - 25 °C:ssa (5 x ’ 20 ml tai kunnes suodos oli väritön). Kiteinen kiintoaine kuivattiin vaikiopainoon, jolloin saatiin 12,0 g rapamy-25 siiniä (puhtaus 91,2 %, saanto 66,4 %). t-butyylimetyy-·· : lieetterisuodosten ja pesuliuosten konsentrointi tuotti . : 63,9 g kumia, jonka rapamysiinipitoisuus oli 3,63 %.

·. · Esimerkki 9

Emäliuoksen konsentraattia (200 g, rapamysiinipi-j 1 : 30 toisuus 25 %) liuotettiin huoneenlämpötilassa sekoittaen i"’; t-butyylimetyylieetteriin (800 ml). Sekoitettu liuos jääh- » I » dytettiin 0-5 °C:seen ja sitä uutettiin viipymättä « 1 · 270 ml 0,65 N natriumhydroksidiliuoksella, joka oli esi-jäähdytetty 0-5 °C:seen, samalla kun seoksen lämpötila : ; : 35 pidettiin 0-5 °C:ssa. (Natriumhydroksidivesiliuoksen 112378 17 määrä, joka tarvittiin uutoksen lopullisen pH:n saamiseksi arvoon 12, määritettiin konsentroidusta emäliuoksesta otetulla näyteliuoksella.)

Emäksistä vesikerrosta säilytettiin 0-5 °C:ssa, 5 sillä aikaa kun orgaanista kerrosta pestiin 5-%:isella natriumkloridiliuoksella pitäen seos 0-5 °C:ssa. Emäksistä vesiuutosta uutettiin takaisin t-butyylimetyylieet-terillä (100 ml). Orgaaniset kerrokset yhdistettiin ja niitä pestiin kolmella 200 ml:n erällä 5-%:ista natrium-10 kloridiliuosta (lopullisen pesuliuoksen pH oli 7,4). Orgaaninen liuos konsentroitiin alipaineessa (60 - 130 mmHg), lämpötilassa 25 - 40 °C. Syklohekseeni (80 ml) lisättiin jäännökseen hitaasti 30 minuutin kuluessa, sekoituksessa, huoneenlämpötilassa, ja sekoitettiin, kunnes ki-15 teytyminen oli mennyt loppuun (3 tuntia). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa vielä yhden tunnin ajan ja seos jäähdytettiin 0-5 °C:seen ja sitä sekoitettiin yön yli. Harmahtava kiteinen kiintoaine sitten kerättiin huokoisella Buchner-lasisuppilolla. Kiintoainetta pestiin 20 viisi kertaa 40 ml:n erällä t-butyylimetyylieetterin ja syklohekseenin 2:3-seosta. Kiintoaine kuivattiin vakio-painoon vakuumiuunissa 35 - 40 °C:ssa, jolloin saatiin . ! 22,7 g rapamysiiniä (puhtaus 90,6 %, saanto 41,4 %). Suo- dosten ja pesuliuosten (t-butyylimetyylieetteri ja syklo-25 hekseeni) konsentrointi tuotti 60,1 g öljyä, jonka rapa-· mysiinipitoisuus oli 37,5 %.

• · · 1 » · · >

Claims (12)

112378 18

1. Menetelmä neutraalin makrolidin erottamiseksi, joka on rapamysiini tai sen luonnossa esiintyvä homologi 5 tai analogi, happamista, emäksisistä ja ei-polaarisista neutraaleista epäpuhtauksista, joita on läsnä neutraalia makrolidia sisältävässä fermentointiliemiuutosten tai emä-liuosten konsentraatissa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraava uutevaihe (a) ja valinnaisesti 10 toinen tai molemmat vaiheista (b) ja (c) missä tahansa jär-j estyksessä: (a) liuosta, joka sisältää mainittua konsentraattia veteen sekoittamattomassa liuottimessa, uutetaan lämpötilassa noin -5 °C - noin 45 °C emäksen vesiliuoksella kaik- 15 kien happamien epäpuhtauksien poistamiseksi oleellisesti,- (b) liuosta, joka sisältää mainittua konsentraattia veteen sekoittamattomassa liuottimessa, uutetaan lämpötilassa noin -5 °C - noin 45 °C hapon vesiliuoksella kaikkien emäksisten epäpuhtauksien poistamiseksi oleellisesti; 20 (c) mainitun konsentraatin liuokseen kohdistetaan yksi tai useampia seuraavista toimenpiteistä ei-polaaristen neutraalien epäpuhtauksien poistamiseksi: (i) sitä uutetaan ei-aromaattisella hiilivetyliuot-:'*ϊ timella, johon makrolidi on liukenematon, : : : 25 (ii) sitä käsitellään riittävällä määrällä sekoit- ··· tuvaa makrolidin ei-liuotinta makrolidin saattamiseksi liu- • * · * • kenemattomaksi saatavaan liuotinseokseen ja siten erottu-vaksi liuoksesta, jolloin makrolidi voidaan erottaa liuo-tinseoksesta, • » 30 (iii) sitä trituroidaan makrolidia kiteyttävän liu- ottimen kanssa. ·,· ·' 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (c) mainitun makro-: lidin liuos on liuosta, joka on veteen sekoittumattomassa 35 liuottimessa. 112378 19

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happamien ja/tai emäksisten epäpuhtauksien uutto suoritetaan lämpötila-alueella noin -5 °C - noin 10 °C.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että neutraalia makroli-dia sisältävän fermentointiliemiuutoksen konsentraatin tai emäliuoksen konsentraatin ei-polaariset neutraalit komponentit poistetaan uuttamalla liuosta, joka sisältää mai-10 nittua konsentraattia ensimmäisessä liuottimessa, toisella, ei-aromaattisella hiilivetyliuottimellä, joka on ensimmäiseen liuottimeen sekoittumaton ja johon neutraali makrolidi on liukenematon.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että veteen sekoittumatonta liuosta, joka sisältää neutraalia makrolidia, käsitellään happamien ja haluttaessa emäksisten komponenttien uuton jälkeen riittävällä määrällä sekoittuvaa makrolidin ei-liuotinta makrolidin saattamiseksi liukenemattomaksi saatavaan liuo- 20 tinseokseen ja siten erottuvaksi liuoksesta, jolloin neut-, raali makrolidi voidaan erottaa liuotinseoksesta.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, >· tunnettu siitä, että veteen sekoittumaton liuos, ' · joka sisältää neutraalia makrolidia, konsentroidaan happa- , · 25 mien ja haluttaessa emäksisten komponenttien uuton jälkeen i ._ k ja jäännös kiteytetään seostamalla kiteyttävän liuottimen ; tai liuotinseoksen kanssa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointiliemiuutoksen kon- ··, 30 sentraatti tai emäliuoksen konsentraatti liuotetaan ensin ” ensimmäiseen liuottimeen ja suoritetaan uutto toisella, ei- f t t s I I · aromaattisella hiilivetyliuottimella, joka on ensimmäiseen liuottimeen sekoittumaton, ei-polaaristen neutraalien epä-puhtauksien poistamiseksi, jonka jälkeen ensimmäisessä liu- * * * · 35 ottimessa oleva liuos konsentroidaan ja jäännös liuotetaan veteen sekoittumattomaan liuottimeen sekä suoritetaan uutto 20 112378 emäksen tai hapon ja emäksen vesiliuoksella kummassa tahansa järjestyksessä happamien tai happamien ja emäksisten epäpuhtauksien poistamiseksi.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen mene-5 telmä, tunnettu siitä, että ei-aromaattinen hiili- vetyliuotin on sykloheksaani, syklohekseeni, heksaani, hep-taani tai pentaani, tai näiden seos.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veteen sekoittumaton 10 liuotin on dikloorimetaani, t-butyylimetyylieetteri, etyyliasetaatti, tolueeni, 1-butanoli, etyyliasetaatti/toluee-niseos, heptaani/etyyliasetaattiseos tai heksaani/metylee-nikloridiseos.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen me-15 netelmä, tunnettu siitä, että emäksen vesiliuos on natriumhydroksidin, natriumbikarbonaatin, natriumkarbonaatin tai ammoniumhydroksidin vesiliuos.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapon vesiliuos on 20 suolahapon, monokaliumfosfaatin tai mononatriumsulfaatin . vesiliuos. » · * ·

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen * 1 1 menetelmä, tunnettu siitä, että makrolidi on rapa- <1 I » mysiini, 32-desmetyylirapamysiini tai 15-deoksorapamysiini. * 1 · * 1 · 1 > · · * « · MM * 1 · * 1 · * 1 · • · *· * I | » 1 • t · 21 112378