UA116835C2 - Рекомбінантний мікроорганізм streptomyces avermitilis, який експресує тенвермектини, його застосування, спосіб конструювання та спосіб отримання тенвермектинів - Google Patents
Рекомбінантний мікроорганізм streptomyces avermitilis, який експресує тенвермектини, його застосування, спосіб конструювання та спосіб отримання тенвермектинів Download PDFInfo
- Publication number
- UA116835C2 UA116835C2 UAA201609907A UAA201609907A UA116835C2 UA 116835 C2 UA116835 C2 UA 116835C2 UA A201609907 A UAA201609907 A UA A201609907A UA A201609907 A UAA201609907 A UA A201609907A UA 116835 C2 UA116835 C2 UA 116835C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- gene
- tenvermectin
- avermectin
- plasmid
- fragment
- Prior art date
Links
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical class C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 title abstract description 53
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 86
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 43
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 14
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims 2
- 101150060184 ACHE gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 claims 1
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 claims 1
- 241000764773 Inna Species 0.000 claims 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 claims 1
- 241000014937 Nesophrosyne milu Species 0.000 claims 1
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 claims 1
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 claims 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 claims 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 claims 1
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 claims 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 claims 1
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 abstract description 94
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 abstract description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 36
- FXWHFKOXMBTCMP-WMEDONTMSA-N milbemycin Natural products COC1C2OCC3=C/C=C/C(C)CC(=CCC4CC(CC5(O4)OC(C)C(C)C(OC(=O)C(C)CC(C)C)C5O)OC(=O)C(C=C1C)C23O)C FXWHFKOXMBTCMP-WMEDONTMSA-N 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 23
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 20
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 20
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 19
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 19
- AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 22,23-dihydroavermectin B1a Natural products C1CC(C)C(C(C)CC)OC21OC(CC=C(C)C(OC1OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C1)C(C)C=CC=C1C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(O)C3OC1)O)CC4C2 AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 229960002418 ivermectin Drugs 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 12
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 11
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 11
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 9
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- ZLBGSRMUSVULIE-GSMJGMFJSA-N milbemycin A3 Chemical class O1[C@H](C)[C@@H](C)CC[C@@]11O[C@H](C\C=C(C)\C[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 ZLBGSRMUSVULIE-GSMJGMFJSA-N 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 8
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- RNMDNPCBIKJCQP-UHFFFAOYSA-N 5-nonyl-7-oxabicyclo[4.1.0]hepta-1,3,5-trien-2-ol Chemical compound C(CCCCCCCC)C1=C2C(=C(C=C1)O)O2 RNMDNPCBIKJCQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 7
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 7
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- CXEGAUYXQAKHKJ-NSBHKLITSA-N emamectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](NC)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 CXEGAUYXQAKHKJ-NSBHKLITSA-N 0.000 description 6
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 4
- 239000005894 Emamectin Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 4
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 4
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 4
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 4
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 1-dodecoxydodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCCCCCCCCCCC CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 3
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 3
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000289453 Parkinsonia aculeata Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012675 alcoholic extract Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229940051841 polyoxyethylene ether Drugs 0.000 description 2
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000008537 Brassica juncea var. integrifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000243770 Bursaphelenchus Species 0.000 description 1
- 229910019001 CoSi Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000243827 Nereis Species 0.000 description 1
- IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N Nonylphenol Natural products CCCCCCCCCC1=CC=C(O)C=C1 IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 description 1
- 102000012210 Proprotein Convertase 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000034526 bruise Diseases 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000720 eyelash Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N nonylphenol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=CC=C1O SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 244000117494 takana Species 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Винахід стосується рекомбінантного Streptomyces avermitilis, який має інактивований або зі зниженою активністю ген aveD, інактивований або зі зниженою активністю ген aveAI і функціональний ген mіlАІ і експресує тенвермектин А або тенвермектин В; застосування вказаного рекомбінантного Streptomyces avermitilis для продукування тенвермектину А або тенвермектину В; спосіб отримання тенвермектину А або тенвермектину В, який включає культивування вказаного рекомбінантного Streptomyces avermitilis, і способу конструювання вказаного рекомбінантного Streptomyces avermitilis.
Description
(54) РЕКОМБІНАНТНИЙ МІКРООРГАНІЗМ 5ТВЕРТОМУСЕ5 АМЕНМІТІІ5, ЯКИЙ ЕКСПРЕСУЄ
ТЕНВЕРМЕКТИНИ, ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ, СПОСІБ КОНСТРУЮВАННЯ ТА СПОСІБ ОТРИМАННЯ
ТЕНВЕРМЕКТИНІВ
(57) Реферат:
Винахід стосується рекомбінантного бгеріотусев ауептіййіх, який має інактивований або зі зниженою активністю ген амер, інактивований або зі зниженою активністю ген амед)/ і функціональний ген лтіЇА/ і експресує тенвермектин А або тенвермектин В; застосування вказаного рекомбінантного бігеріотусез амептійіз для продукування тенвермектину А або тенвермектину В; спосіб отримання тенвермектину А або тенвермектину В, який включає культивування вказаного рекомбінантного бЄтгеріотусев амептійів, і способу конструювання вказаного рекомбінантного бігеріотусез амегтіців. тд пт тйді-о й ниж и геном 5, пудгобсорісив дикого типу раритети плазміда тТЙАІ- ауаді- ух тИАТ-Ю да тил ячФгАТО тіИдт-о вувати. аАтт 5таї
Твоє оп тА АТ ОС Оті амеді-и тд амеАт-О тнАТО Й т-шеі як - - Елена пес) шишен--- й. геном мутанта 5. вудго5сорісиє звкаї бнаї
Ї зних
Ат рисСогі амеді-й тд амеді-О чииаилтлшшаиаилтшииииааааннннинн витягнутий фрагмент аї аї самолігування амейт.и пійдТ ачоАО аї риє огі Атт
Фіг. 1
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Винахід стосується галузі генетичної інженерії і бактеріальної ферментації, зокрема, рекомбінантного мікроорганізму, який експресує авермектин або його аналоги, і способу отримання авермектину або його аналогів з використанням рекомбінантного мікроорганізму.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Авермектини й івермектин є відмінними пестицидами і ветеринарними лікарськими засобами, які знайшли широке застосування в останні три десятиріччя. Серед них, авермектини стосуються класу похідних макролідів, які мають інсектицидну активність, які отримують в результаті ферментації 5ігеріотусев амегтійії5. Авермектини, виділені з продуктів ферментації зігеріотусев5 амегтійі5, включають серію структурно схожих сполук, які існують в парах, що включають компонент А і компонент В, при цьому активність компонента В перевищує активність компонента А. Структурно, компонент А має метокси-групу в положенні С5 макроциклічного лактонного кільця авермектинів, в той час як компонент В у тому ж положенні має гідроксильну групу. Що стосується компонента В авермектинів, він включає дві сполуки, які існують в парі, які відповідно називаються Ва і В1Б і мають наступні структури:
Си ій | я ій От
Би иа вав Б то т - і їі я ки
КЗ наве «ГТ
Авермектин Вії: В - СНоСНУ ше я
Авермектин Вів: В - СНу і
Комерційно доступний пестицид на основі авермектинів, як правило, містить активний інгредієнт авермектинів, який в основному складається з авермектинів В'а і В1Бб. Івермектин отримують в результаті структурної модифікації авермектину. Однак після майже трьох десятиріч використання він в найближчому майбутньому буде вилучений з обігу через проблеми з лікарською стійкістю. Мілбеміцин належить до нового покоління аналогів авермектину, що отримуються при ферментації Бігеріотусе5 Пудгоз5соріси5. Інсектицидна активність мілбеміцину вища, ніж активність авермектинів й івермектину, однак токсичність мілбеміцину набагато нижча, ніж у обох з них.
У патенті США Мо 5 4134973 розкрите вуглеводневе похідне мілбеміцину і 13- гідроксимілбеміцин, а також способи їх отримання за допомогою серії хімічних реакцій, і підтверджено, що ці вуглеводневі похідні мають інсектицидну активність. Однак ці хімічні реакції включають цілу серію складних процесів, вимагають певних реакційноздатних вихідних матеріалів і в процесі утворюється ряд побічних продуктів через недостатньо сильну
Зо специфічність, що приводить до екологічних проблем, а також збільшує виробничі витрати.
Таким чином, існує потреба в альтернативному способі отримання авермектину або його аналогів біосинтетичними методами.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Один аспект винаходу стосується рекомбінантних 5ігеріотусев, які експресують авермектин або його аналоги, при цьому рекомбінантні Зігерю тусев5 (1) мають інактивований або зі зниженою активністю ген амер; і/або (2) мають інактивований або зі зниженою активністю ген амеАї! і мають функціональний ген тіїАї.
В одному варіанті здійснення рекомбінантні Зігеріотусе5 за даним винаходом являють собою бБігеріотусе5 амептіййі5, переважно Зігеріотусе5 амегтіййй5 АОБ28 або Зігеріотусе5 амегтіййї5 МА220, більш переважно 5ігеріотусе5 амегтійі5 МА220.
В іншому варіанті здійснення ген амеО інактивований або має знижену активність за рахунок використання технології ПЛ;-опосередкованої направленої модифікації.
В іншому варіанті здійснення ген амеАї в геномі 5ігеріотусе5 замінений на функціональний ген птійА! так, що ген амеА!| інактивується або його активність знижується і бБігеріотусев5 набувають функціональний ген тіїАІ. У конкретному варіанті здійснення цю заміну проводять шляхом внутрішньоклітинної генетичної рекомбінації.
Інший аспект даного винаходу стосується застосування рекомбінантних бігеріотусе5 за даним винаходом для продукування авермектину або його аналогів.
В одному варіанті здійснення авермектин або його аналоги являють собою авермектин Віа ї авермектин ВІ1Б. В іншому варіанті здійснення авермектин або його аналоги являють собою тенвермектини, зокрема, тенвермектин А і тенвермектин В.
Третій аспект даного винаходу стосується способу отримання авермектину або його аналогів, що включає: культивування рекомбінантних бігеріотусез за п. 1 або 2 і витягування авермектину або його аналогів з бактеріальної культури.
В одному варіанті здійснення авермектин або його аналоги являють собою компоненти Віа їі
В1р авермектину. В іншому варіанті здійснення авермектин або його аналоги являють собою тенвермектини, зокрема, тенвермектин А і тенвермектин В.
Четвертий аспект даного винаходу стосується способу конструювання рекомбінантних зігеріотусез за п. 1 або 2, що включає: (1) отримання 5ігеріотусев, призначених для модифікування; і спосіб додатково включає щонайменше один з наступних етапів: (2) інактивування гена амеО в 5ігеріотусе5, призначених для модифікування, або зниження його активності; і (3) інактивування гена амеАї в 5ігеріотусе5, призначених для модифікування, або зниження його активності; і введення функціонального гена тій! в Зігеріотусе5, призначені для модифікування.
В одному варіанті здійснення 5бігеріотусе5, призначені для модифікування, являють собою зігеріотусев амегтійі5, переважно Зігеріотусев амегтійі5 МА-4680.
В іншому варіанті здійснення на етапі (2) ген амеО інактивують або знижують його активність за рахунок використання технології ПЛ;-опосередкованої направленої модифікації.
В іншому варіанті здійснення на етапі (3) ген амеА! в геномі Бігеріотусе5 замінюють функціональним геном тій! таким чином, що ген амеА! інактивується або його активність знижується, і 5ігеріотусе5 набувають функціональний ген піїАЇ.
Зо П'ятий аспект даного винаходу також стосується застосування авермектину або його аналогів, отриманих способом за даним винаходом, як інсектициди.
Даний опис є усього лише ілюстрацією деяких із заявлених варіантів здійснення, при цьому одну або більше технічних характеристик, описаних в одному або більше з варіантів здійснення, можна комбінувати з будь-яким одним або більше іншими варіантами здійснення, і ті технічні рішення, які отримані внаслідок комбінування, входять в об'єм винаходу, заявленого в цьому документі, як якби ці технічні рішення, отримані в результаті комбінування, були б спеціально розкриті в цьому документі.
Згідно з щонайменше одним з вищезгаданих аспектів, рекомбінантні Зігеріотусе5 за даним винаходом можуть ефективно продукувати авермектин або його аналоги. Використовувані для продукування авермектину бактерії можуть специфічно продукувати авермектини Віа і ВІБ, які практично не містять компонент А авермектину або містять значно знижену кількість компонента А авермектину. У випадку продукування аналогів авермектину, аналоги авермектину можуть являти собою тенвермектини, при цьому тенвермектини включають тенвермектин А і тенвермектин В. Слід також зазначити, що відповідно до даного винаходу, при конструюванні рекомбінантних 5ігеріотусе5 здійснюють ефективну інактивацію гена амеО за рахунок використання технології ПЛР-опосередкованої направленої модифікації. Спосіб отримання авермектину або його аналогів шляхом ферментації з використанням рекомбінантних 5ігеріотусезх за даним винаходом відрізняється хорошою стабільністю, високим виходом продукту, є більш екологічно чистим і простим в порівнянні з хімічними методами синтезу і, крім того, дозволяє значно скорочувати виробничі витрати. Крім того, авермектин або його аналоги, отримані способом за даним винаходом, мають значно сильнішу інсектицидну активність.
Даний опис є усього лише ілюстрацією деяких із заявлених варіантів здійснення, при цьому одну або більше технічних характеристик, описаних в одному або більше з варіантів здійснення, можна комбінувати з будь-яким одним або більше іншими варіантами здійснення, і ті технічні рішення, які отримані внаслідок комбінування, входять в об'єм винаходу, заявленого в цьому документі, як якби ці технічні рішення, отримані внаслідок комбінування, були б спеціально розкриті в цьому документі.
ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Даний винахід проілюстрований супроводжуючими його фігурами в поєднанні з додатковим докладним описом, який йде далі. Потрібно зазначити, що опис, який йде далі, є усього лише ілюстрацією технічних рішень, заявлених в даному винаході, і він не накладає ніяких обмежень на дані технічні рішення. Об'єм даного винаходу визначений вмістом, розкритим в прикладеній формулі винаходу.
Фігура 1: Схематична діаграма конструювання рекомбінантної плазміди з використанням іп мімо системи рекомбінації 5ігеріотусех пудгозсорісив;
Фігура 2: Фізична карта рекомбінантної плазміди рОоАтт 14;
Фігура 3: Фізична карта рекомбінантної плазміди рОАттТ-КамеО;
Фігура 4: Схематична діаграма процесу інактивації гена амеО у вихідному штамі зігеріотусев амептіййв МА-4680;
Фігура 5: Хроматограма ВЕРХ ферментаційного бульйону. А являє собою хроматограму ферментаційного бульйону вихідного штаму МА-4680, В являє собою хроматограму ферментаційного бульйону генетично модифікованого штаму АО28;
Фігура 6: Блок-схема конструювання рекомбінантної плазміди РМАТтЗаайамАр;
Фігура 7: Схематична діаграма зміни генома з вихідного штаму 5ігеріотусе5 Пудгозсорісив5
НБЗОг23 в штам Мо 3-22;
Фігура 8: Блок-схема конструювання рекомбінантної плазміди рРОАтТ-МАТ5ААТИи;
Фігура 9: Схематична діаграма вставляння вищерозташованого фрагмента гена амеАЇ в геном штаму Мо 3-22;
Фігура 10: Блок-схема конструювання рекомбінантної плазміди рОодДтТтТ-АМА;
Фігура 11: Діаграма процесу зміни генома з генетично модифікованого штаму А028 в
МА220;
Фігура 12: Порівняння між продуктами ферментації генетично модифікованих штамів А028 і
МА220. А являє собою хроматограму ВЕРХ ферментаційного зразка генетично модифікованого штаму МА220, В являє собою хроматограму ВЕРХ ферментаційного зразка генетично модифікованого штаму АО28;
Фігура 13: Мас-спектр тенвермектину А;
Фігура 14: "Н-ЯМР спектр тенвермектину А, розчиненого в СОС»;
Фігура 15: "ЗС-ЯМР спектр тенвермектину А, розчиненого в СОСІз;
Фігура 16: ОЕРТ135 спектр тенвермектину А, розчиненого в СОСІз;
Фігура 17: Мас-спектр тенвермектину В;
Фігура 18: "Н-ЯМР спектр тенвермектину В, розчиненого в СОС»;
Фігура 19: "ЗС-ЯМР спектр тенвермектину В, розчиненого в СОС»;
Фігура 20: ОЕРТ135 спектр тенвермектину В, розчиненого в СОСІ».
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ
Терміни, які використовуються в даній заявці мають те ж значення, що і терміни попереднього рівня техніки. Для чіткого роз'яснення значень використовуваних термінів нижче наведене конкретне значення деяких термінів в даній заявці. У випадку конфлікту наведеного далі визначення із загальноприйнятим значенням терміну, наведене далі визначення повинно мати переважну силу.
Використовуваний в даному документі термін "функціональний ген" означає ген, здатний виконувати свою функцію в організмі-хазяїні. Наприклад, якщо ген кодує один або більше ферментів, тоді організм-хазяїн здатний експресувати вказані один або більше ферментів, при цьому активність вказаних одного або більше ферментів можуть бути виявлені, і дані ферменти виконують свої функції в організмі-хазяїні. Відповідно, "ген, який має функціональність" означає, що організм-хазяїн містить ген, і ген виконує свою функцію в організмі-хазяїні. У цій ситуації організм-хазяїн може містити лише необхідну частину функціонального гена, за умови, що необхідна частина дозволяє організму-хазяїну експресувати функцію функціонального гена.
Використовуваний в даному документі термін "інактивація або зниження активності гена" означає, що в порівнянні з еталоном, не підданим визначеному впливу, ген, підданий визначеному впливу, втрачає свою функцію або його функція знижується, тобто, активність гена не може бути експресована в організмі-хазяїні або експресована активність гена знижена. Ця інактивація або зниження активності можуть бути викликані рядом причин. Наприклад, інактивація або зниження активності гена можуть бути наслідком делеції гена, мутації гена, антисмислового інгібування, вимкнення гена, додавання інгібітора і так далі.
Використовуваний в даному документі термін "авермектин або його аналоги" стосується авермектину або інсектицидних макролідних сполук, які мають схожі структури. Вони включають, але не обмежуються ними, авермектини, івермектин, мілбеміцин, тенвермектини і так далі. Зокрема, авермектин або його аналоги можуть являти собою авермектини Віа і ВІ1Б, тенвермектин або тенвермектини А і В.
Авермектини і івермектин є відмінними пестицидами і ветеринарними лікарськими засобами, які знайшли широке застосування в останні три десятиріччя. Івермектин отримують внаслідок структурної модифікації авермектину. Однак після майже трьох десятиріч використання він в найближчому майбутньому буде вилучений із обігу через проблеми з лікарською стійкістю. Таким чином, існує потреба у відповідних альтернативних продуктах.
Мілбеміцин належить до нового покоління інсектицидних сполук, які отримуються при ферментації Бігеріотусе5 Пудгозсоріси5. Інсектицидна активність мілбеміцину сильніша, ніж активність авермектинів і івермектину, однак токсичність мілбеміцину набагато нижча, ніж в обох з них. При розгляді структур авермектинів Ва і В16, і відповідних структур івермектину і мілбеміцину як приклад видно, що структурна відмінність між мілбеміцином, авермектинами й івермектином дуже мала і стосується тільки трьох положень, як показано далі: їла
І хх «й , най в лялллячояя на з ре | | ек а | ки я дове, і І «Щі кт с де ГА т І шо и
Е КО ра Г К. авермектин Є т--о В
Ви: ВесСВ» ву
БВішї ВеСБоСНа т и ай їх Е і | ;
Х Е
ГЕ с С
ІЙ
І т 5 ЗИ я Хо ось нан ан нь ну З ї екв я й шу ама ше ню й СЯ: - а кі дн чини е І їх Н ва в й чі х 7 ше івермектин ; в ї
Вів: ВеСЯЗ | з в.ш: Весно Шах пи
І с ай о щ 7
З ше ой і, 2
З пе, Й су е
Я со о о їх міпбеміцин х За
Вз: ВеСЕ» шк
Асі ВОНО со я я
ЯН
Таким чином, відмінність між івермектином і авермектинами полягає лише в наявності одинарного зв'язку і подвійного зв'язку в положеннях С22-23 (показано цифрою 2 в структурній формулі), однак інсектицидна активність івермектину вища, ніж активність авермектинів.
Структурні відмінності між мілбеміцином і авермектинами зумовлені групою в положенні С25 (показано цифрою 1 в структурній формулі), положеннях С22-23 і положенні С13 (показано цифрою З в структурній формулі). Як описано вище, оскільки мілбеміцин має переваги в порівнянні з авермектинами, вважається, що структуру авермектинів можна модифікувати, щоб зробити її більш схожою на структуру мілбеміцину, при цьому зберігаючи деякі з її властивостей, наприклад, дисахарид в положенні С13, з тим, щоб поліпшити показники активності і токсичності авермектинів.
Зокрема, вуглеводневе похідне 13-гідроксимілбеміцин, що має представлену нижче структуру, можна отримувати шляхом приєднання дисахаридної структури до положення С13 макролідного кільця мілбеміцину:
Кк ї3. зи ет | з Я дну
Шо щ Фев бе
Кз 3 дк і Я Ж шкк Ше
Ж | ж а Я шк с
СТ тенвермектин А: К-СНУ3 тенвермектин ВІ: ВК-СоНе у
У цьому документі дане вуглеводневе похідне називають тенвермектином, і його два компоненти називають тенвермектинами А і В, відповідно.
Внаслідок інтенсивних досліджень автори винаходу виявили, що в геномі 5ігеріотусе5 заміна відповідної частини шляху біосинтез авермектинів (тобто, гена амеАЇ) на ген тіїАї, який відповідає за структуру положень С22-С25 в шляху біосинтезу мілбеміцину, може приводити до створення аналогів авермектину, що є метою даного винаходу (тобто, тенвермектину, включаючи тенвермектини А і В).
Без прив'язки до якої-небудь теорії, автори винаходу вважають, що технічні рішення за даним винаходом дозволяють створити новий шлях біосинтезу, в якому спільно використовуються як шлях біосинтезу авермектинів, так і шлях біосинтезу мілбеміцину; за допомогою заміни гена амеАІ, який відповідає за синтез структур в положеннях С22-С25 макролідного кільця в процесі біосинтезу авермектинів в штамі, який продукує авермектини, геном тіїЇА!І, який відповідає за синтез відповідних положень в шляху біосинтезу мілбеміцину, аналоги авермектину за даним винаходом (тобто, тенвермектин) отримують повністю біосинтетичним шляхом.
Як авермектини, так і мілбеміцин, стосуються макролідних сполук, і в обох випадках їх основні структури утворюються через полікетидсинтазний шлях (РК5 шлях) іп мімо. Ці дві сполуки мають схожі основні структури, і їх РК5 структури також є схожими. Наприклад, створення положень С22-25 в авермектинах визначається геном амеАї! (СепВапк: АВО32367.1), який включає завантажувальну область (10), модуль 1 (ЗОЇ) і модуль 2 (5012).
Завантажувальна область відповідає за структуру груп в положенні С25, модуль 1 відповідає за структури положень С23-24, модуль 2 відповідає за ступінь відновного стану положення С23.
Відповідно, структури положень С22-25 в мілбеміцині визначаються геном піїА! (СепВапк:
МС 0165821 (1146684...1159715)), що включає завантажувальну область (І 0), модуль 1 (З!Ц1) і модуль 2 (52).
Однак при спеціальному конструюванні нових біосинтетичних шляхів для здійснення заміни генів необхідно сконструювати рекомбінантну плазміду, призначену для заміни генів. Оскільки розмір гена амеАЇ, який потрібно замінювати, становить приблизно 12 т.п.н., розмір замінюючого гена тА! становить приблизно 13 т.п.н. У випадку такого великого фрагмента складно сконструювати рекомбінантну плазміду загальноприйнятими методами, такими як ферментативне розщеплення, ПЛР і так далі: оскільки фрагмент дуже великий, складно знайти придатний функціональний одиночний сайт рестрикції; і при використанні ПЛР для ампліфікації такого великого фрагмента ефективність ампліфікації є низькою, з одного боку, й існує висока імовірність внесення мутації, з іншого боку. Автори винаходу виявили, що заміну такого великого фрагмента можна здійснювати з використанням технології внутрішньоклітинної рекомбінації генів, і при цьому ген піїАї! після заміни здатний нормально функціонувати.
Крім того, авермектини мають два види компонентів, тобто, А і В, активність компонента В вища, ніж активність компонента А. Це відбувається внаслідок того, що в положенні С5 компонента В знаходиться гідроксильна група, в той час як в положенні С5 компонента А
Зо знаходиться оксиметил. Бажано отримувати авермектини зі зниженою кількістю компонента А або такі, що практично не містять компонент А. Наприклад, отримані авермектини в основному складаються з авермектинів Ва і В1б.
Внаслідок інтенсивних досліджень автори винаходу виявили, що шляхом інактивації гена амеб в штамі-продуценті авермектинів або зниження його активності можна значно зменшувати вихід компонента А авермектину або навіть домагатися практично повної відсутності продукування компонента А авермектину. Без прив'язки до якої-небудь теорії, автори винаходу вважають, що це відбувається тому, що С5-оксиметилтрансфераза, яка кодується геном амер (СепКапк: АВО32524.1), здатна перенести метил на С5-гідроксил компонента В, таким чином перетворюючи компонент В авермектину в компонент А. Шляхом інактивації гена амеО або значного зниження його активності цей метаболічний процес можна придушувати або навіть інактивувати, тим самим придушуючи утворення компонента А авермектину і, відповідно, отримуючи продукт ферментації - авермектин, який складається в основному з компонента В авермектину (Ва і В1б). Відповідно, за даним винаходом запропоноване технічне рішення, яке полягає в тому, що утворення компонента А блоковане за рахунок інактивації гена амеб, в результаті чого додатково підвищується активність авермектинів і знижується їх токсичність.
Приклад 1 Конструювання рекомбінантного штаму 5ігеріотусе5 амегтійй5 МА220. 1. Екстрагування геномної ДНК з 5ігеріотусез амептійії5 і Зігеріотусез Ппудгозсорісив: а) Спори 5ігеріотусе5 амепгтіййй5 МА-4680 (Бігеріотусев амептіййв МА-4680. АТСС Мо 31267) і Бігеріотусе5 Пудгозсоріси5 НБЗО23 (5ігеріотусе5 Пудгозсоріси5 НБЗО23. СОМСС Мо 7677) відповідно інокулювали в 30 мл середовища Т5В (триптичний соєвий бульйон, ВО Сотрапу, артикульний номер 211822), 30 "С, 220 об/хв, культивували протягом 30-48 год. р) Міцелій збирали центрифугуванням. Після двократного промивання стерильною водою міцелій суспендували в розчині лізоциму (10,3 96 сахарози, 10 мМ Ттгі5-НСІ, рН 8,0, 4 мг/мл лізоциму), що 4-кратно перевищує за об'ємом об'єм міцелію, інкубували у водяній бані при температурі 37 "С протягом 1-2 год. с) Додавали 1/10 об'єму 10 95 розчину 505, додавали розчин протеази К в концентрації 20 мг/мл до кінцевої концентрації 100 мкг/мл й інкубували у водяній бані при температурі 37 "С протягом 30 хв - 1 год. а) Додавали рівний об'єм розчину фенолу-хлороформу (фенол: хлороформ: ізоаміловий бо спирт-:25:24:1, рН 8,0) і двічі проводили екстракцію.
е) До супернатанту додавали 1/10 об'єму З М розчину МаАс-НАс (рН 5,3) і рівний об'єм ізоамілового спирту, центрифугували при 12000 об/хв протягом 5 хв для осадження геномної
ДНК.
І) Осад двічі промивали 70 95 етанолом і після висушування при кімнатній температурі розчиняли в 10 мМ розчині Тгіз-НСІ (рН 8,0), який містить 20 мкг/мл РНКази, отримуючи розчин геномної ДНК. 2. Конструювання вектора рОоАтт 14:
Плазміду рідО773 (отриману від компанії Ріапі Віозсіепсе І ітйейа, Могмісп, ОК; дивись сиві В, еї аі., РСВ-іагдебей бігеріотусе5 депе геріасетепі ідепійев а ргоївіп дотаіїп пеедей ог ріозупіпевзів ої ШТе зездийегрепе 5о0їЇ одог део5тіп. (2003) Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 100 (4): 1541- 1546; ії Сбиві В, еї аі., КЕСІКЕСТ ТесппоІоду: РСК-їагдеїйпуд 5убієт іп 5ігеріотусев5 соеїїсоог.
Могулісп: допп Іппе5 Сепіге. (2002)) піддавали подвійному рестрикційному розщепленню Хваї (ТаКака) і В5ІВІ (ТаКакКа) відповідно до інструкцій. Фрагмент розміром 1271 п.н., який містить ген аас(3З)М і огії, виділяли електрофорезом, і "затупляли кінці" за допомогою набору ВКІ. (ТаКака) відповідно до інструкцій, отримуючи фрагмент 1. Вектор рОС19 піддавали подвійному рестрикційному розщепленню Огаї (ТаКака) і 55рі (ТаКакКа) відповідно до інструкцій. Фрагмент вектора розміром 1748 п.н. виділяли електрофорезом, отримуючи фрагмент 2. Фрагменти 1 і 2 лігували (з використанням розчину ЗоїЇшіоп І від компанії ТаКаКа відповідно до інструкцій, далі так само), отримуючи рекомбінантну плазміду рРОАтт 14. Фізична карта рОАттТ14 представлена на фігурі 2.
З. Конструювання рекомбінантної плазміди рОАттТ-КамеО для інактивації гена амер зігеріотусев амептійіїв:
Фрагмент ДНК, присутній на косміді 6-9 (дивись посилання 4: Наїуапод Хіа, дип Ниапо, Міпііе
Ни, евїс., Сопвігисійоп ої апа огаетейд созтіа Іїбгагу ої 5. амептійій5 ог депеїїс тоаїїісайоп ої Ше іпаивійа! вігайпє, СПіпезе дуоцтпа! ої Апіїбіоїїс5, 2009, 34 (7): 403-405), знаходиться в нуклеотидному положенні Мо 1124992-1167304 в геномі Зігеріотусе5 амептйй5 МА-4680.
Виконували нокаут фрагмента в положеннях 442-521 гена амер (5ЕО ІО МО: 1) з використанням технології ПЛР-опосередкованої направленої модифікації. Видаляючи касету гена стійкості за допомогою РІ Р рекомбінази, отримували рекомбінантну плазміду 6-9Камеб, в якій послідовність
З0 довжиною 81 п.н. замінена новою послідовністю (5ЕО ІЮ МО: 2). ПЛ;-опосредовану направлену модифікацію виконували в основному відповідно до методу, описаного в літературі (дивись сив5і
В., еї аІ., РСК-іагдеїєй 5ігеріотусе5 депе геріасетепі ідепійев5 а ргоївіп дотаїп пеедесй ог ріозупіпевзів ої ШТе зездийегрепе 5о0їЇ одог део5тіп. (2003) Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 100 (4): 1541- 1546; ії Сиві В., еї аі.,, КЕСІКЕСТ Тесппоіоду: РСК-їагдеїйпуд 5зубієт іп 5ігеріютусев совіісоог.
Могмісп: Уопп Іппез Сепіге. (2002)). Конкретний метод полягає в наступному: а) Конструювання праймера для ПЛР: був сконструйований праймер амер59 (ЗЕО ІО МО: 3), в якому 39 п.н. на 5'-кінці є тими ж, що і нуклеотиди в положеннях 403-441 гена амеб, і 20 п.н. на 3-кінці являють собою "ліве плече" матриці касети гена стійкості; був сконструйований праймер амеЮр58 (5ЕО ІО МО: 4), в якому 39 п.н. на 5-кінці зворотно комплементарні нуклеотидам в положеннях 522-560 гена амеб і 20 п.н. на 3'-кінці являють собою "праве плече" матриці касети гена стійкості ("ліве плече" і "праве плече" є фіксованими послідовностями, дивись си5ії В.,
Кізег Т., Спаїег К. Є. КЕСІКЕСТ Тесппоіоду: РСОК-агодеїйпуд 5узієт іп 5ігеріотусев совіісоїог.
Могуісп: Чоп Іппе5 Сепіге. 2002, р. 6). р) ПЛР-ампліфікація касети гена стійкості: ПЛР-ампліфікацію виконували з використанням плазміди рі)У773 як матриці, яка використовується в ПЛР ДНК-полімераза РгітезтАК була від компанії ТаКака.
Готували наступні реакційні розчини:
Праймер амеО59 (25 мкМ) 0,5 мкл
Праймер амеО58 (25 мкМ) 0,5 мкл
Плазміда ріду77З3 0,2 мкл (приблизно 10 нг) 5х буфер Ргітез ТАК 10 мкл дДНТФ (кожний 2,5 мМ) 4 мкл
ДНК-полімераза РгітезтАК (2,5 Од/мкл) 0,5 мкл
Двічі дистильована вода 34 мкл
Процедура ПЛР 940,2 хв, (9872 х 10 сек, 50 "С х 45 сек, 72 "С х 1 хв 30 сек) х 10 циклів, (9872 х 10 сек, 68 "С х 1 хв 30 сек) х 15 циклів, 72"Сх2 хв, 16 "С х 1 хв.
Продукт ПЛР піддавали електрофорезу в агарозному гелі. Гель розрізали і витягували цільовий фрагмент розміром приблизно 1,4 т.п.н. Витягування фрагмента виконували, використовуючи набір для витягування з гелю (ТаКакКа) відповідно до інструкцій. с) Введення трансформацією бібліотечної плазміди в Е. соїї ВМУ25113/ріЩШ790: Одиночну колонію Е. соїї ВУМ25113/рІЩ.Щ790 інокулювали в 10 мл культурального середовища ІВ, яке містить 25 мкг/мл хлорамфеніколу (триптон 1,0 956, дріжджовий порошок 0,5 95, Масі 0,5 Об, глюкоза 0,1 95), і культивували при температурі 30 "С зі струшуванням при 250 об/хв протягом ночі (14-18 год., далі так само). 100 мкл нічної бактеріальної культури переносили в 10 мл середовища 5ОВ, що містить 25 мкг/мл хлорамфеніколу (триптон 2,0 956, дріжджовий порошок 0,5 Зо, Масі 0,05 95, 10 мл розчину КСІ в концентрації 250 моль/л додавали на літр, і 5 мл стерильного розчину МоСі2г в концентрації 2 моль/л додавали на літр перед використанням), культивували при температурі 30 С зі струшуванням при 250 об/хв протягом 3-4 год. до досягнення значення ОЮвоо приблизно 0,4. Проводили центрифугування при температурі 4 "С з швидкістю 4000 об/хв протягом 5 хв для збору бактеріальних клітин. Бактеріальні клітини двічі промивали 10 мл крижаного 10 95 гліцерину, суспендували в 100 мкл крижаного 10 95 гліцерину, тобто, перетворювали їх в компетентні для електротрансформації клітини. До 50 мкл компетентних клітин додавали приблизно 100 нг (2-3 мкл) косміди 6-9 з плазмідної бібліотеки і виконували електротрансформацію в 0,2-см охолодженої до температури льоду електрошокової чашки. Параметри електрошоку були наступними: 200 0, 25 мкФ, 2,5 кВ.
Тривалість електрошоку становила 4,5-4,9 мс. Відразу після електрошоку додавали 1 мл крижаного середовища ІВ, і клітини культивували при температурі 30 "С зі струшуванням протягом 1 год. 50 мкл трансформаційного розчину наносили на чашки з ІВ-агаром (культуральне середовище ЇВ, яке містить 1,595 порошку агару), що містить 100 мкг/мл карбеніциліну, 50 мкг/мл канаміцину і 25 мкг/мл хлорамфеніколу, культивували при температурі "С протягом ночі таким чином, що виростали окремі колонії. а) ПЛР-опосередкована направлена модифікація бібліотечної плазміди: Одиночну колонію
Е. соїї ВУМУ25113/рІ)790, що містить косміду 6-9 з бібліотеки плазмід, довільно відбирали й інокулювали в 10 мл середовища І В, що містить 100 мкг/мл карбеніциліну, 50 мкг/мл канаміцину
Зо і 25 мкг/мл хлорамфеніколу, проводили культивування при температурі 30 "С зі струшуванням при 250 об/хв протягом ночі. 100 мкл нічної бактеріальної культури переносили в 10 мл середовища 5ОВ, що містить 100 мкг/мл карбеніциліну, 50 мкг/мл канаміцину, 25 мкг/мл хлорамфеніколу і 10 мМ І -арабінози, культивували при температурі 30 "С зі струшуванням при 250 об/хв. Компетентні для електротрансформації клітини отримували методом, описаним для етапу с). До 50 мкл компетентних клітин додавали приблизно 100 нг (2-3 мкл) розчину витягнутого продукту ПЛР, отриманого на етапі Б), і виконували електротрансформацію в 0,2-см охолодженої до температури льоду електрошокової чашки. Параметри електрошоку були наступними: 200 0, 25 мкФ, 2,5 кВ. Тривалість електрошоку становила 4,5-4,9 мс. Відразу додавали один мілілітр крижаного середовища І В, і клітини культивували при температурі 37 "С зі струшуванням протягом 1 год. Після недовгого центрифугування велику частину супернатанту видаляли, осад суспендували в супернатанті, який залишився, наносили на чашки з | В-агаром, що містить 100 мкг/мл карбеніциліну, 50 мкг/мл канаміцину і 50 мкг/мл апраміцину, і культивували при температурі 37 "С протягом ночі. Одиночну колонію відбирали, суспендували в З мл середовища ІВ, що містить 100 мкг/мл карбеніциліну, 50 мкг/мл канаміцину і 50 мкг/мл апраміцину, і культивували при температурі 37 "С зі струшуванням при 250 об/хв протягом приблизно 6 год. Плазміду екстрагували з використанням набору для очищення плазмідної ДНК
Ахудеп Ріазтій ОМА Ритгійсайоп Міпіргер Кий відповідно до інструкцій і проводили тест з рестрикційним розщепленням для відбору правильної плазміди. Була отримана рекомбінантна плазміда 6-9аамео. е) Видалення гена стійкості і огіт з використанням РІ Р: Е. соїї Он5а/ВТ340 інокулювали в 10 мл середовища І В, що містить 25 мкг/мл хлорамфеніколу, і культивували при температурі 30 С зі струшуванням при 250 об/хв протягом ночі. Компетентні для електротрансформації клітини отримували методом, описаним для етапу с). До 50 мкл компетентних клітин додавали приблизно 100 нг (2-3 мкл) рекомбінантної плазміди 6-9аамеЮ, отриманої на етапі 4), і виконували електротрансформацію в 0,2-см охолодженої до температури льоду електрошокової чашки. Параметри електрошоку були наступними: 200 0, 25 мкФ, 2,5 кВ.
Тривалість електрошоку становила 4,5-4,9 мс. Відразу додавали один мілілітр крижаного середовища ІВ, і клітини культивували при температурі 30 "С зі струшуванням протягом 1 год. 50 мкл трансформаційного розчину наносили на чашки з І В-агаром, що містить 50 мкг/мл бо апраміцину ї 25 мкг/мл хлорамфеніколу, культивували при температурі 30 "С протягом 48 год.
Зростали одиночні колонії. Одиночну колонію довільно відбирали, наносили штрихом на чашку з | В-агаром без антибіотиків, культивували при температурі 42 "С протягом ночі так, що вона експресувала РІ Р-рекомбіназу і згодом втрачала плазміду ВТ340. Відбирали 20-30 одиночних колоній і відповідно наносили штрихом на чашки з І В-агаром, що містить 50 мкг/мл апраміцину, і чашки з І В-агаром, що містить 50 мкг/мл канаміцину, культивували при температурі 37 7 протягом ночі. Клони, які були чутливі до апраміцину і нечутливі до канаміцину, були цільовими клонами, у яких касета гена стійкості була видалена. Цільові клони відбирали для екстрагування плазмід, і плазміди піддавали рестрикційному розщепленню для відбору правильної плазміди.
Була отримана рекомбінантна плазміда 6-Заамео.
Конструювання рекомбінантної плазміди рОАтт-Камер: Рекомбінантну плазміду 6-УКахер піддавали подвійному ферментативному розщепленню СіаІ (ТаКаКа) і В5іІВІ (ТаКаНа) відповідно до інструкцій, з витягуванням фрагмента розміром 6984 п.н., яким лігували у вектор рОАтт14, підданий ферментативному розщеплення В5їВІ і дефосфорилюванню (тобто, безпосередньо в реакційний розчин для розщеплення додавали 1 мкл РавзіАР (Еептепіав), культивували при температурі 37 "С у водяній бані протягом 5-10 хв, далі так само), отримуючи рекомбінантну плазміду родттТ-Камеб. Її фізична карта представлена на фігурі 3. 4. Інактивація гена амеО 5ігеріотусез амегтійй5 МА-4680: а) Перенесення рекомбінантної плазміди рОАттТ-КамеЮ в клітини Зігеріотусев5 амегтійів
МА-4680 з міжродовою кон'югацією: клітини Е. соїї ЕТ12567 (ри28002) робили компетентними для електротрансформації з використанням методу, описаного для етапу 3-с) (температура культивування становила 37 "С, кінцева концентрація антибіотиків в культуральному середовищі: хлорамфенікол 25 мкг/мл, канаміцин 25 мкг/мл): до 50 мкл компетентних клітин додавали приблизно 100 нг (1-2 мкл) рекомбінантної плазміди рОАттТ-КамеЮ і виконували електротрансформацію в 0,2-см охолодженої до температури льоду електрошокової чашки.
Параметри електрошоку були наступними: 200 0, 25 мкФ, 2,5 кВ. Після завершення електрошоку відразу додавали 1 мл крижаного культурального середовища ІВ, і клітини культивували при температурі 37 "С зі струшуванням протягом 1 год. 50 мкл трансформаційного розчину наносили на чашки з І В-агаром, що містить 50 мкг/мл апраміцину, 100 мкг/мл карбеніциліну, 50 мкг/мл канаміцину і 25 мкг/мл хлорамфеніколу, культивували при температурі
Зо 37 "С протягом ночі. Трансформант довільно відбирали й інокулювали в 10 мл культурального середовища ІВ, що містить 25 мкг/мл хлорамфеніколу, 100 мкг/мл карбеніциліну, 50 мкг/мл канаміцину і 50 мкг/мл апраміцину, культивували при температурі 37 "С зі струшуванням при 250 об/хв протягом ночі. 100 мкл нічної бактеріальної культури переносили в 10 мл свіжого культурального середовища І В, що містить 25 мкг/мл хлорамфеніколу, 50 мкг/мл канаміцину і 50 мкг/мл апраміцину, культивували при температурі 37 "С зі струшуванням при 250 об/хв до досягнення значення ОЮвоо приблизно 0,4. Клітини двічі промивали 10 мл середовища ІВ і суспендували в 1! мл середовища ІВ. 500 мкл бактеріальної культури змішували зі спорами приблизно 108 клітин Зігеріотусе5 амептййй5 МА-4680, які попередньо суспендували в 500 мкл середовища 2хХУТ (триптон 1,695, дріжджовий порошок 1,095, Мас! 0,595), і виконували тепловий шок при температурі приблизно 50С протягом 10 хв. Після недовгого центрифугування велику частину супернатанту відкидали, клітини суспендували в супернатанті, що залишився, наносили на чашки з М5-агаром (соєве борошно 2 95, маніт 2 95, порошок агару 2 Чо), що містить 10 мМ Масі», і культивували при температурі 30 "С протягом 16-20 год. На чашки наносили стерильну воду, що містить 0,5 мг налідіксової кислоти і 1,25 мг апраміцину, безперервно культивували при температурі 30 "С протягом приблизно 5 д для вирощування трансформантів.
Юр) Скринінг мутантів з інактивованим геном амер: після одного пасажу на чашках з УМ5- агаром (дріжджовий екстракт 0,495, розчинний крохмаль 0,495, солодовий екстракт 1,0 95, порошок агару 1,8 95), який містить 20 мкг/мл налідиксової кислоти і 25 мкг/мл апраміцину, трансформанти додатково двічі підтримували на чашках з УМ5-агаром без антибіотиків для виділення одиночних колоній. Одиночні колонії відповідно культивували на середовищі УМ5, що містить 25 мкг/мл апраміцину, і культурального середовища УМ5, що не містить антибіотик, для відбору апраміцин-селективних штамів. Для відібраних апраміцин-селективних штамів проводили екстрагування геномної ДНК відповідно до методу етапу 1 даного прикладу.
Виконували ПЛР тест з гТад ДНК-полімеразою (ТакКака, далі так само) відповідно до інструкцій, використовуючи праймери ахереЕ (ЗЕО ІЮ МО: 5у7амерк (ЗЕО ІЮО МО: 6) і амер (ЗЕО ІЮО МО: 5УамеОМ (ЗЕО І МО: 7). Цільовими штамами були ті, у яких: послідовність 1094 п.н. може бути ампліфікована за допомогою перших, в той час як цільова послідовність не може бути ампліфікована за допомогою останніх. Штам Мо А0Б28, отриманий після скринінгу, вважали цільовим штамом для проведення в ньому подальшої генетичної модифікації. Процес інактивації гена амеО у вихідному штамі зігеріотусез5 амегтіййй5 МА-4680 показаний на фігурі 4. 5. Ферментативна валідація генетично модифікованого штаму А0Б28: Одиночну колонію
АБ28 інокулювали в середовище для посіву (кукурудзяний крохмаль 2,595, соєве борошно 0,8 95, арахісове борошно 1 95, дріжджовий порошок 0,9595, СоСіг 0,003 95, рН 72-74), культивували при температурі 28 С зі струшуванням при 250 об/хв протягом 40 год., переносили в ферментаційне середовище (кукурудзяний крохмаль 14 95, амілаза 0,003 95, соєве борошно 2,095, дріжджовий порошок 1 95, порошок цеоліту 0,295, МипибО4 0,0024 95,
Маг?МоО. 0,0024 95, СоСі»бНг2О 0,00295, рН 7,2-7,4) при інокуляційній кількості 695 і культивували при температурі 28 "С зі струшуванням при 250 об/хв протягом 8 д. Один мілілітр ферментаційного бульйону додавали в 4 мл безводного метанолу для вбирання води, обробляли ультразвуком протягом 1 год. і фільтрували. Фільтрат використовували безпосередньо для аналізу методом ВЕРХ. Умови для ВЕРХ-аналізу були наступними: хроматографічна колонка: С18 Нурегхії 0052 4,6 х 250 х 5 (Оаїїап ЕїІйе); рухома фаза: суміш метанол: етанол: вода-81:7:12; швидкість потоку: 1 мл/хв; довжина хвилі поглинання: 240 нм.
Результати представлені на фігурі 5: А являє собою хроматограму ВЕРХ ферментаційного бульйону вихідного штаму МА-4680, В являє собою хроматограму ВЕРХ ферментаційного бульйону генетично модифікованого штаму АЮБ28. Результати показують, що генетично модифікований штам АО28 більше не продукує компонент А авермектину при ферментації. 6. Конструювання рекомбінантної плазміди РМАТЗааамА0О для заміни нижчерозташованого фрагмента гена тій! 5ігеріотусе5 ПпПудгозсорісибє: Використовуючи як матриця геномну ДНК зігеріотусе5з ПпПудгозсорісиє НеО23, проводили реакцію ПЛР з ДНК-полімеразою РгітезтТАкК (ТаКака, далі так само) відповідно до інструкцій, використовуючи праймери МА1ТЗЕ1 (5ЕО І
МО: 8) ії МА1Т3К2 (ЗЕО ІО МО: 9). Був отриманий цільовий фрагмент З розміром 3212 п.н.
Рекомбінантну плазміду рОАтт14 піддавали ферментативному розщепленню 5іІтаї, потім дефосфорилювали РабзіАР і лігували з фрагментом 3, який раніше обробляли з використанням набору ВКІ,, таким чином отримували рекомбінантну плазміду РОаАтТ-МА13!. Використовуючи як матриця геномну ДНК 5ігеріотусез Ппудгозсоріси5 і використовуючи праймери МАТОЕЗ (5ЕО
ІО МО: 10) і МАТОКА (5ЕО ІЮ МО: 11), проводили реакцію ПЛР з ДНК-полімеразою Ргіте5ТАК,
Зо отримуючи фрагмент 4 розміром 3268 п.н. Рекомбінантну плазміду рОАттТ-МА13' піддавали рестрикційному розщепленню ЕсоКМ (ТаКака), потім дефосфорилюванню РавзіАР, проводили лігування з фрагментом 4, раніше обробленим з використанням набору ВКІ, отримуючи рекомбінантну плазміду рМО-МА1О. Рекомбінантну плазміду рОАтт-МА13 піддавали подвійному ферментативному розщепленню НіпапПчеМ»5іїЇ відповідно до інструкцій (ТаКака) і гель розрізали для витягування фрагмента розміром 6199 п.н., тобто, фрагмента 5; рекомбінантну плазміду РМО-МАТ1О піддавали подвійному ферментативному розщепленню
Ніпапі--Мвії! і гель розрізали для витягування фрагмента розміром 3258 п.н., тобто, фрагмента 6.
Фрагменти 5 і 6 лігували, отримуючи рекомбінантну плазміду РО;аАтТ-МА130. Використовуючи як матрицю геномну ДНК 5ігеріотусе5 амептійі5 МА-4680, проводили реакцію ПЛР з ДНК- полімеразою РгітевТАК, використовуючи праймери ААТОРО (ЗЕО ІЮ МО: 12) і ААТОК10 (ЗЕО
ІО МО: 13), внаслідок чого був отриманий фрагмент 7. Рекомбінантну плазміду РОаАтТ-МА1Т3О піддавали рестрикційному розщепленню М5іЇ (ТаКаКа) відповідно до інструкцій, а потім витягували і обробляли з використанням набору ВКІ; продукт реакції дефосфорилювали за допомогою ГРабвіАР, а потім лігували з фрагментом 7, обробленим з використанням набору ВКІ., отримуючи рекомбінантну плазміду РМАТЗаайаМАб для заміни нижчерозташованого фрагмента гена тііА! зігеріотусев пудго5соріси5. Метод конструювання плазміди представлений на фігурі б. 7. Заміна нижчерозташованого фрагмента гена тА! Зігеріотусев5 Пудгоз5сорісив5:
Рекомбінантну плазміду РМАТЗааамАО вводили трансформацією в Зігеріотусе5 пудгозсорісив
НБЗО23 методом кон'югаційного перенесення, описаним для етапу 4-а). Трансформанти два рази піддавали скринінгу без антибіотиків і підтримували, потім одиночні колонії відбирали за допомогою зубочисток, відповідно культивували на чашках з УМ5-агаром, що містить 25 мкг/мл апраміцину, і чашках з ММ5-агаром без антибіотиків при температурі 28 "С протягом 5-6 д.
Одиночні колонії, які не росли на культуральному середовищі УМ5, що містить апраміцин, але росли на культуральному середовищі УМ5 без апраміцину, відбирали для культивування в збільшеному масштабі на середовищі УМ5, в той же час геномну ДНК екстрагували методом етапу 1 і виконували ПЛР тест з гТад ДНК-полімеразою, використовуючи праймери тіЕ11 (ЗЕО ІО МО: 14) і тірК12 (ЗЕО ІЮ МО: 15). Цільовим штамом був штам, в якому продукт ПЛР мав розмір 3825 п.н., і ревертантним штамом був штам, в якому продукт ПЛР мав розмір 1467 бо п.н. На основі результатів скринінгу було визначено, що штам Мо 3-22 являє собою штам
Зігеріотусе5 Пудгозсоріси5, в якому нижчерозташований фрагмент гена тії! був успішно замінений, і його вважали цільовим штамом для подальшої роботи. Схематична діаграма зміни генома їх вихідного штаму НЗО23 в штам Мо 3-22 представлена на фігурі 7. 8. Конструювання рекомбінантної плазміди рОАттТ-МАТ5ААТО для вставляння вищерозташованого фрагмента гена амеА! Зігеріотусе5 амегптіййй5 АО28 в ген птійА! у вищерозташованому положенні в Зігеріотусе5 Пудго5сорісиє: Використовуючи як матриці геномну ДНК бЗігеріотусе5 Пудгозсоріси5 НБЗО23, виконували ПЛР-ампліфікацію з ДНК- полімеразою РгітезтАК, використовуючи праймери МА15РЕ13 (ЗЕО ІЮ МО: 16) і МАТ5К14 (5ЕО
І МО: 17), з отриманням внаслідок фрагмента розміром 3097 п.н.; отриманий фрагмент піддавали подвійному ферментативному розщепленню РзЗїї ї Ніпаїї відповідно до інструкцій (ТаКака), лігували з плазмідою рОоАтт14, підданої такому ж ферментативному розщепленню, отримуючи рекомбінантну плазміду рШАттТ-МА15. Використовуючи як матриця геномну ДНК зігеріотусез5 амептійі5 Ар2г8 (метод екстрагування геномної ДНК такий же, як на етапі 1 даного прикладу), виконували ПЛР-ампліфікацію з ДНК-полімеразою РгітевзтАК, використовуючи праймери ААТОЕ15 (ЗЕО ІО МО: 18) і ААТОК16 (ЗЕО ІО МО: 19), з отриманням внаслідок фрагмента розміром 3103 п.н.; отриманий фрагмент піддавали подвійному ферментативному розщепленню ЕсоКі і Крпі відповідно до інструкцій (ТаКаКа), лігували з рекомбінантною плазмідою рОоАттТ-МА15, підданої такому ж ферментативному розщепленню, отримуючи в результаті рекомбінантну плазміду рОАттТ-МА1Т5ААТО. Метод конструювання плазміди наведений на фігурі 8.
Вставка вищерозташованого фрагмента гена амед! Бігеріотусе5 амептййй5 в ген тіїА! у вищерозташованому положенні в Зігеріотусе5 пудгозсоріси5: Методом, описаним для етапу 4- а), рекомбінантну плазміду РОаАтТ-МА1Т5ААТИ, отриману на етапі 8, вводили трансформацією в штам Мо 3-22, отриманий на етапі 7, шляхом кон'югації і вирощували трансформант, тобто, цільовий штам. Схематична діаграма вставки вищерозташованого фрагмента гена амеАЇ в геном штаму Мо 3-22 наведена на фігурі 9. 10. Конструювання рекомбінантної плазміди рОАттТ-АМА для заміни гена амеАЇ зігеріотусе5 амегтійй5 геном тіїА! Бігеріотусев5 ПпПудгоз5сорісиб5: Одиночну колонію відбирали з трансформантів, отриманих на етапі 9, інокулювали в культуральне середовище Т5В, що
Зо містить 20 мкг/мл налідіксової кислоти і 25 мкг/мл апраміцину, і геномну ДНК з неї екстрагували методом етапу 1. Екстраговану геномну ДНК піддавали реакції рестрикційного розщеплення за допомогою зЗула! (ТаКаКа) відповідно до інструкцій. Після завершення реакції додавали 1/10 об'єму 3 М розчину МаАс-НАс (рН 5,3) і рівний об'єм ізоамілового спирту, проводили центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 5 хв для осадження ДНК. Осад двічі промивали 70 965 етанолом; після висушування при кімнатній температурі його розчиняли в 20 мкл 10 мМ розчину Тіг5-НСІ (рн 8,0), отримуючи витягнуту рідину. Три мікролітри витягнутої рідини використовували для трансформації компетентних клітин Е. соїї ОН5а (метод отримання і метод електротрансформації компетентних клітин ОН5а були такими ж, як методи на етапі 3-с), але в культуральне середовище не додавали антибіотики, і температура культивування становила 37 "С). Трансформаційну рідину центрифугували для видалення більшої частини супернатанту, осад суспендували в рідині, що залишилася, наносили на чашки з І В-агаром, що містить 25 мкг/мл апраміцину в загальній складності, культивували протягом 16 год. при температурі 37 "С і вирощували трансформанти. З трансформантів екстрагували плазміду, тобто, рекомбінантну плазміду ЛВЮШАттТ-АМА для заміни гена амеАї! 5ігеріотусе5 амегтійй5 геном тіїА! зігеріотусев5 пудгозсорісиз. Метод конструювання рОоАттТ-АМА представлений на фігурі 10. 11. Заміна гена амеАЇ 5ігеріотусев амепгтійй5: Рекомбінантну плазміду РОаАтТ-АМА вводили трансформацією в штам АО28, отриманий на етапі 4, методом кон'югації, описаним для етапу 4- а). Трансформанти два рази піддавали скринінгу без антибіотиків і підтримували, потім одиночні колонії відбирали за допомогою зубочисток, відповідно культивували на чашках з УМ5-агаром, що містить 25 мкг/мл апраміцину, і чашках з УМ5-агаром без антибіотиків при температурі 287 протягом 5-6 днів. Одиночні колонії, які не росли на культуральному середовищі УМ5, що містить апраміцин, але росли на культуральному середовищі УМ5 без антибіотиків, відбирали для культивування в збільшеному масштабі на середовищі УМ5, в той же час геномну ДНК екстрагували методом етапу 1 даного прикладу і виконували ПЛР тест з гТад ДНК-полімеразою, використовуючи пари праймерів 025А1ЕРЕ (5ЕО ІЮ МО: 20)/026АТЕК (5ЕО ІО МО: 21) і 027МІЕЕ (ЗЕБЕО І МО: 22)/028М1ЕК (ЗЕО ІЮ МО: 23). Генетично модифікованим штамом з успішною заміною був штам, в якому пара праймерів 025АТЕРЕ (5ЕО ІЮ МО: 20)/026А1ЕК (5ЕО ІО МО: 21) була здатна ампліфікувати цільовий фрагмент розміром 2005 п.н., в той час як пара праймерів 027МІЕР (5БО ОО МО: 22)у028М1ЕК (5ЕБО ІЮО МО: 23) не дозволяла отримувати цільовий бо фрагмент. Генетично модифікований штам МА220 з успішною заміною вибирали як цільовий штам для проведення на ньому подальших експериментів. Процес зміни генома з генетично модифікованого штаму АО28 в МА220 представлений на фігурі 11. 12. Ферментація і аналіз методом ВЕРХ генетично зміненого штаму МА220: Метод був таким же, що і метод етапу 5 даного прикладу. Результати ВЕРХ наведені на фігурі 12: А являє собою хроматограму ВЕРХ ферментаційного зразка генетично модифікованого штаму МА220, В являє собою хроматограму ВЕРХ ферментаційного зразка генетично модифікованого штаму
АО28. Результати показують, що продукт ферментації генетично модифікованого штаму МА220 містить дві явно нових сполук (час утримування яких на фігурі становить 8,773 і 11,066, відповідно).
Приклад 2. Екстрагування й ідентифікація продукту ферментації генетично модифікованого штаму МА220.
Ферментаційний бульйон фільтрували через тканину для фільтрування, отримуючи відфільтрований осад, який двічі екстрагували етанолом, отримуючи спиртовий екстракт.
Спиртовий екстракт концентрували до сухого стану у вакуумі, отримуючи екстракт, який містить тенвермектин А і В. Після змішування екстракту з силікагелем екстракт наносили на колонку з силікагелю і проводили градієнтне елюювання сумішшю петролійний ефір/ацетон в співвідношенні 90:10, 80:20, 70:30, 60:40. Елюйований матеріал збирали по фракціях, проводили детектування методом ТСХ, отримуючи елюент, що містить два цільових компоненти, які концентрували до сухого стану у вакуумі. Вищезгадані компоненти розділяли хроматографією із зворотною фазою за наступних умов:
Система рідкої фази: Напівпрепаративна рідинна хроматографія високого тиску Адіїепі 1100
Хроматографічна колонка: гОКВАХ.Есіїрхе ХОВ-С18 (250 мм х 9,4 мм)
Елюент: суміш метанол/ацетонітрил/вода-46:46:8
Швидкість потоку: 1,5 мл/хв
Довжина хвилі детектування: А-240 нм.
Збирали пік з часом утримування 17,1 хв, отримуючи сполуку 1; збирали пік з часом утримування 21,5 хв, отримуючи сполуку 2.
Результати Мас-спектрометричного аналізу, а також результати ЯМР-спектроскопічного аналізу сполуки 1 і сполуки 2 представлені на фігурах 13-20. Результати демонструють, що:
Зо молекулярна маса становить 832 і 846, відповідно. Результати структурного аналізу показують, що сполуки мають структури, наведені вище для тенвермектину, і два компоненти являють собою тенвермектин А (ТЕМА) і тенвермектин В (ТЕМВ).
Приклад 3. Показники виходу і стабільності для генетично модифікованого штаму МА220.
Спори генетично модифікованого штаму МА220 градієнтно розбавляли і наносили на культуральне середовище УМ5, культивували при температурі 28 "С протягом 6-8 д таким чином, що зростали одиночні колонії. П'ятнадцять одиночних колоній з відносно придатною морфологією (тобто, одиночні колонії, які були здатні продукувати спори, які були швидше сірого, ніж білого, кольору або частково чорні, і розміри колоній були відносно одноманітними) були довільно вибрані, їм були привласнені номери від МА220-1 до МА220-15, їх точково висівали на чашки з УМ5-агаром, культивували при температурі 28 "С протягом 6-8 д. Колонії були приблизно одного розміру, тобто, приблизно 0,7-0,8 см. Проводили ферментацію цих одиночних колоній відповідно до методу прикладу 1, етапу 5, і рідини для посіву, відповідні кожною з одиночних колоній, інокулювали в З пляшки з ферментаційним середовищем для проведення на них паралельних тестів; в той же час утворювали контроль, тобто, МА220-СК, тобто, проводили ферментацію з газоном МА220 на чашках з УМ5-агаром. Результати ферментації тестували методом ВЕРХ, і титри розраховували, приймаючи зразок, отриманий в прикладі 2, за еталонний стандарт. Результати наведені в таблиці 1.
Таблиця 1
Номер й одиниця ТЕХМВ одиниця синця одиниця штаму рН ферментації ферментації ферментації ферментації ферментації (мкг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл)
МА220-1 1322
МА220-2 1421
МА220-3 1386
МА2г20-4 1307
МА220-5 1412
МА220-6 1454
МА2г20-7 1436
МА220-8 1459
МА220-9 1412
МА2г20-10 1545
МА220-11 1527
МА220-12 1531
МА220-13 1136
МА220-14 1113
МА220-15 1479
МА220-СК 1437
Результати показують, що ферментація генетично модифікованого штаму МА220 є відносно стабільною: кінцеві значення рН ферментації знаходяться в межах 7,0-7,3, співвідношення
ТЕМА/ТЕМВ становить приблизно 3/1 і загальний титр ферментації, загалом, перевищує 1300 мкг/мл.
Приклад 4. Біологічна активність тенвермектинів проти комах-шкідників і шкідливих кліщів. 1. Аналіз активності тенвермектинів проти Теїгапуспи5 сіппабрагіпи5 в приміщенні:
Аналізували активність тенвермектинів в приміщенні, при цьому Теїгапуспи5 сіппабрагіпи5 використовували як тестовану комаху, авермектини використовували як контрольний препарат і порівнювали активність тенвермектинів і авермектинів.
Тестований організм: Теїгапуспиє5 сіппарагіпиє: був нанесений на сіянець паркінсонії колючої, з культивуванням в умовах кімнати з штучним кліматом (26--)20, ВН (70--5)965, Г/Д 141.
Тестовані препарати: 9695 авермектини (Нереі Меуопд Віо-Спетіса! Со., Ца.), 98 95 тенвермектини (ТЕМА:ТЕМВ-8:2 (масове відношення)) (отримані способом прикладу 2 за даним винаходом): по 1 г 96 95 авермектинів і 98 956 тенвермектинів зважували в хімічній склянці і додавали 93 г метанолу і 6 г емульгатора ОР10, отримуючи препарат з концентрацією 10000 мг/л, який розбавляли водою, отримуючи рідкий препарат для тестування з концентрацією 0,005, 0,01, 0,025, 0,05 мг/л.
Експериментальні методи: використовували метод з нанесенням комах на листові диски і зануренням в препарат: відбирали дорослих кліщів, які містилися в приміщенні і мали відповідний фізіологічний стан. Вибирали стійко зростаюче листя паркінсоніїї колючої, з листя вирізали диски діаметром 2 см за допомогою перфоратора. Листові диски вміщували зворотною стороною вгору на абсорбуючу бавовняну тканину в центрі пластикових чашок, при цьому в кожній з чашок було по З листові диски. Дорослих кліщів наносили на листові диски за допомогою невеликої щітки, при цьому на кожний листовий диск наносили по 30 дорослих кліщів. Додавали відповідну кількість води, і пластикові чашки вміщували в камеру для культивування при температурі (26--1)20 з інтенсивністю світла 3000-4500 люкс, 14 год./д і ЕН -50 90-75 90. Через дві години кількість дорослих кліщів перевіряли під стереоскопічним мікроскопом: кількість кліщів на листових дисках в кожній з чашок була не менше 20.
Приготовані препарати з масовою концентрацією 0,005, 0,01, 0,025, 0,05 мг/л вміщували в хімічні склянки, і листя, захоплене пінцетом, послідовно занурювали в препарат, починаючи з низької концентрації до високої концентрації (час занурення становив 5 с). Як контроль
Зо використовували наступне: дорослих самиць кліщів обробляли дистильованою водою, при цьому кожну масову концентрацію використовували для однієї обробки, і кожну обробку повторювали три рази. Після висушування на повітрі препарату, що знаходиться на листі, оброблені листові диски вміщували в кімнату зі штучним кліматом при температурі (26-4-1)С і з фотоперіодом 14 год., і культивували протягом 24 год. Для підтримки вологості додавала чашки
Петрі з невеликою кількістю води.
Після занурення в препарат кліщі були дуже активні, але їх активність починала знижуватися через 5-8 год. після обробки, і через 12-24 год. вони ставали нерухомі.
Критерії загибелі: Під час інспекції до тулуба кліщів обережно доторкалися щіткою, і повністю нерухомих кліщів вважали мертвими.
Результати наведені в таблиці 2:
Таблиця 2
Активність тенвермектинів і авермектинів проти Теїгапуспиз5 сіппабагіпив. токсичності (ух) (мол кореляції межа/(мг:л-! (тенвермектини | 12,324843,1721х | 00049 | 09304 | 0
Результати показують, що ЇС50 тенвермектинів проти Теїгапуспи5 сіппарагіпиє становить 0,0049 мг/л і ЇС50 авермектинів проти Теїгапуспив5 сіппабагіпиє становить 0,0083 мг/л, тобто, активність тенвермектинів проти Теїгапуспиз5 сіппабвагіпи5 вища, ніж активність авермектинів. 2. Аналіз активності тенвермектинів проти коробкових черв'яків і "похідних черв'яків":
Аналізували активність тенвермектинів, при цьому коробкових черв'яків і "похідних черв'яків" використовували як тестовані комахи, а мілбеміцини і авермектини використовували як контрольні препарати.
Тестований організм: коробкові черв'яки (Неїїсомегра агтідега Нибпег), личинки З вікової стадії; "похідні черв'яки" (Муїпітпа зерагаїе УмаїКег), личинки З вікової стадії.
Тестовані препарати: 0,5 95 емульгований концентрат тенвермектинів, 2 96 емульгований концентрат мілбеміцинів, 0,5 95 емульгований концентрат авермектинів.
Препарати Активні інгредієнти Розчинники Емульгатори 0,5 95 емульгований тенвермектини: метанол: нонілфеноловий ефір концентрат тенвермектинів) 0,5 г 94,5 г поліоксіетилену: 5,0 г 2 У емульгований мілбеміцини: метанол: нонілфеноловий ефір концентрат мілбеміцинів |2,0 г 93,0 г поліоксіетилену: 5,0 г 0,5 95 емульгований авермектини: етилацетат: лауриловий ефір концентрат авермектинів |0,5 г 91,5 г поліоксіетилену: 8,0 г
Препарати розбавляли водою до певної тестованої концентрації.
Методи тестування: Шлункову токсичність тестованих препаратів, відносно тестованих комах аналізували шляхом годування комах поживною сумішшю з препаратом.
Результати тесту: Показники активності тестованих препаратів проти личинок З вікової стадії коробкових черв'яків і личинок З вікової стадії "похідних черв'яків" наведені в таблиці З і таблиці 4.
Таблиця З
Активність тестованих препаратів проти личинок З вікової стадії коробкових черв'яків й 24-год. смертність й
Препарат Концентрація мг/л о, Примітка о 0,5 95 емульгований концентрат тенвермектинів Метод з годуванням комах 771725... | ..ЮюЮюЮю60 |харчовоюсумішшюз 2000 препаратом 2 96 емульгований 77400. | юю. 80 |застосовували двічі, концентрат мілбеміцинів кожен раз використовуючи
З повтори на кожен : т0о7771717711180. |варіант препарату бю р емультований концентрат авермектинів пеНТР й
Таблиця З
Активність тестованих препаратів проти личинок З вікової стадії "похідних черв'яків"
Концентра-ція | 24-год. смертність .
Препарат центра"ц д о Р Примітка мг/л /о 0,5 95 емульгований концентраттенвермектинів | 50 2 '/ 74г/ 90 що
Метод с додаванням невеликих дисків 2000 стосу ли один раз 296емульгованийконцентратї 400 1777/9071 | у ; й ние кожен раз використовуючи мілбеміцинів 7.200... | .Ю.ЮЙ2ЛБв0 С варіант препарату варіант препарату о - бо еемульований Г7750001031...80 сонцентратавермектинв Ов 177777760
Результати експериментів показали, що при одній і тій же концентрації препарату активність тенвермектинів проти коробкових черв'яків і "похідних черв'яків" була вищою, ніж активність мілбеміцинів, і була схожою з активністю авермектинів. 3. Аналіз активності тенвермектинів проти соснових деревних нематод: Аналізували активність в приміщенні шістнадцятичленних макролідних сполук, таких як тенвермектини,
авермектини, івермектин, мілбеміцини, емамектину бензоат, при цьому соснових деревних нематод використовували як тестовані комахи. Метою було визначення відмінностей в активності таких препаратів відносно соснових деревних нематод.
Тестовані препарати: п'ять видів препаратів, тобто, 0,595 емульгований концентрат авермектинів, 0,5 96 емульгований концентрат тенвермектинів, 0,5 9о емульгований концентрат івермектину, 295 емульгований концентрат мілбеміцинів, 2,595 мікроемульсія емамектину бензоату.
Препарати Активні інгредієнти Розчинники Емульгатори 0,5 96 емульгований . - . й нонілфеноловий ефі концентрат тенвермектини: 0,5 г) метанол: 94,5 г й фе й фір й поліоксіетилену: 5,0 г тенвермектинів 2 У емульгований . - . . . й й нонілфеноловий ефір концентрат мілбеміцини: 2,0 г | метанол: 93,0 г пи й й й й поліоксіетилену: 5,0 г мілбеміцинів 0,5 95 емульгований - . й й лауриловий ефір концентрат авермектини: 0,5 г |етилацетат: 91,5 г о. ! й поліоксіетилену: 8,0 г авермектинів 0,5 96 емульгований . - . о ю ему . | | нонілфеноловий ефір концентрат івермектин: 0,5 г метанол: 94,5 г пи й й поліоксіетилену: 5,0 г івермектину 2,5 95 мікроемульсія н-бутиловий спирт: . ж 5 мікр У емамектину УТ Р фосфат алкілфенолового емамектину й 5,0 г; й т, й бензоат: 2,5 г й ефіру поліоксіетилену: 5 г бензоату вода: 87,5 г
Методи тестування: Використовували метод занурення в препарат. Кожний препарат готували в п'яти масових концентраціях 2, 5, 10, 20, 50 мг/л, і для кожної концентрації використовували три повтори. Результати експерименту статистично обробляли через 24 год. (дивись таблицю 5).
Таблиця 5
Аналіз токсичності декількох шістнадцятичленних макролідних сполук відносно соснових деревних нематод.
Препарати Активні інгредієнти Розчинники Емульгатори 0,5 96 емульгований . - . ж 5 ему | | нонілфеноловий ефір концентрат тенвермектини: 0,5 г) метанол: 94,5 г пи й й поліоксіетилену: 5,0 г тенвермектинів 2 У емульгований . - . . . й й нонілфеноловий ефір концентрат мілбеміцини: 2,0 г | метанол: 93,0 г по й й й й поліоксіетилену: 5,0 г мілбеміцинів 0,5 96 емульгований - . й й лауриловий ефір концентрат авермектини: 0,5 г |етилацетат: 91,5 г о. ! й поліоксіетилену: 8,0 г авермектинів 0,5 96 емульгований . - . о ю ему . | | нонілфеноловий ефір концентрат івермектин: 0,5 г метанол: 94,5 г пи й й поліоксіетилену: 5,0 г івермектину 2,5 95 мікроемульсія н-бутиловий спирт: . ж 5 мікр У емамектину УТ Р фосфат алкілфенолового емамектину й 5,0 г; й с, й бензоат: 2,5 г й ефіру поліоксіетилену: 5 г бензоату вода: 87,5 г
Результати експерименту показали, що серед тестованих шістнадцятичленних макролідних сполук тенвермектини мають найвищу активність проти соснових деревних нематод.
Джерела інформації: 1. затрьгоок )., Егпй5п Е., Мапіаїі5 Т. МоїІесшіаг сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї. Зга ей, Мемж/ Могк:
Со 5ргіпа Натог І арогаюгу Ргезв, 2002. 2. сиві В., Кізег Т., Спаїег К. Є. КЕСІКЕСТ Тесппоіоду: РСОК-Тагдеїйпу зузієт іп вігеріотусев5 соеїїсоЇог. Могмісп: донп Іппе5 Сепіге. 2002.
З. Кіезег Т., ВІБЬ М.У., Вицлег М... еї аїЇ. Ргасіїса! Зігеріотусе5 Сепеїіс5. Могмісй: Тпе допп
Іппе5 Рошипааїйоп, 2000. 4. Наїіуапд Хіа, дип Ниапао, Міпіє Ни, еїс., Сопвігисіп ої ап огдегед совзтіа Ійргагу ої 5. амептіййв Тог депеїїс тодаіїсайоп ої Ше іпдивійаї! вігаіїн5, Спіпезе Чоштаї ої Апіїбіоїіс5, 2009, 34 (7): 403-405.
МІ 12505. розі. їх
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 7пе)їїапд Нібип Ріагтасецтіса? со., Іа, «120» РЕКОМБІНАНТНИЙ МІКРООРГАНІЗМ, ЯКИЙ ЕКСПРЕСУЄ АНАЛОГ АВЕРМЕКТИНУ, І ЙОГ.
ЗАСТОСУВАННЯ
«1305 О0Р1614-57-0057 «1605 23 «170» рРатепсІп мегзіоп 3.3 «2105 1 «211» 81 «2122 ДНК «213» Замінені нуклеотиди в положеннях 442-522 гена амер «4005 1 аєдсссадсс ссодсасадує даєссодоад ассосссдду кудстссоссс содсаассоа 60 стддссдєса соддасодєсоса 81 «210» 2 «2115 81 «212» ДНК «213» Нуклеотиди в положеннях 442-522 гена амер для заміни «4005 2 ассссдддада хссассдасс хосадсссда адсссстаті стстадагад хатадодзасиь 60 тсдазаосадс сссадсстас а ві «210» з «211» 59 «212» ДНК «213» амер59 «4005 З тсстссдаса сддсотадас сстодадтає сесстдсаса тсссоддудає ссдхсдасс 59 «2105» 4 «2115 58 «212» ДНК «2132» амеор58 «400» 4 стІсСсссусЯс тхсасдссоо єссудсссдаа досасоасаді дсадасстода дстостсс 58 «210» 5 «2115 727 «2122» днк «213» амере «4005 5 . аадетссстї сссатусссо дссаєт9 27 «210» 6 «9211» 30 «212» ДНК «213» амер
МІ. 12505. розі. їх «400» 6 ассссодсоє асесаєсдаї дсосассада 30 «2105 7 «211» 25 «212» ДНК «2135 амерм «400» 7 содасдаєст сссодаєсасє стота 25 «2105 8 «2115 27 «212» ДНК «213» МА13вг1 «40025 8 садассатає дасссосода ас 22 «2105» 9 «2115 27 «2122» ДНК «213» МА1382 «400» 9 атодасаєсада ададдссдад дЕсятс 27 «2105 10 «2115» 30 «2125» ДНК «213» МА10ЕЗ «400» 10 акоасаєсасо ддесатссдо соатсдаадсо 30 «2105 11 «2115 31 «2125 днк «213» МА1ОКА «40025 11 задсссадада дасогоааада астоадссода с 31 «210» 12 «211» 28 «212» ДНК «2132 АА1ОЕ9 «4005 12 ассодасасс кассастссяа сссотаєс 28 «210» 13 «211» 33 «212» ДНК «213» дА1оКк10 «4005 13 астстааатуас стдкукссас хссдасудате дес 33
МІ 12505 ро51.їхЕ «210» 14 «2115 26 «212» ДНК «213» ті10511 «400» 14 тсдассассс сасосссдас даастс 26 «210» 15 «211» 27 «2125 ДНК «213» ті1ок12 «400» 15 сдассасаєс адсдсстсса ссдасас 27 «2105 16 «211» 727 «212» ДНК «213» МА15єг13 «400» 16 аасстасаца асатсодстсс содсссса 27 «210» 17 «2115 37 «92122 ДНК «213» МмА15814 «1400» 17 аасаадастта сссазаєсса асоддсттаєс сасасас 37 «210» 18 «211» 28 «212» ДНК «213» ААШЕ15 «400» 18 аасаааєєст осодадссосо асассдос 28 «210» 19 «211» 7279 «212» ДНК «213» АА1оК16 «400» 19 засдатассї сассостада саасоастса 29 «2105» 20 «2115 26 «212» ДНК «213» 025А1ЕЕ «-4002 20 доададаадєт остодадсто стодад 26 «2105 21 «211» 26 «2122» ДНК «213» 026А1ЕВ
МІ. 12505. роз1. їхЄ «400» 21 дсоассаасі сододсєаасає дадкса 26 «210» 22 «2115 26 «212» ДНК «213» 027М1ЕЕ «4005 22 тдсаєстдас сасстасудсс саассод 26 «210» 23 «211» 25 «2125 ДНК «213» 028М1єВ «А0О0» 23 дсоассдасаа ассддссдта часссс 26
Claims (5)
1. Рекомбінантний сгеріотусез амегтіів, який експресує тенвермектин А або тенвермектин В, при цьому рекомбінантний Єперіотусев амептійіє має інактивований або зі зниженою активністю ген амеб, інактивований або зі зниженою активністю ген ауеА/ і функціональний ген тіїдА!.
2. Застосування рекомбінантного бтперіотусев амептійййв за п. 1 для продукування тенвермектину А або тенвермектину В.
3. Спосіб отримання тенвермектину А або тенвермектину В, який включає культивування рекомбінантного бігеріотусев амептійів за п. 1 і витягування тенвермектину А або тенвермектину В з культури.
4. Спосіб конструювання рекомбінантного бігеріотусев ауегтішів за п. 1, який включає: (1) отримання бігеріотусев амегтійів; (2) інактивування гена ауер в бгеріотусев ауегтійів; і (3) інактивування гена амейА/ в бгеріотусев ауептійіів; і введення функціонального гена ті/А/ в огеріотусез амегтійіів.
5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що на етапі (2) ген амеО інактивують або знижують його активність за рахунок використання технології ПЛР-опосередкованої направленої модифікації.
тцинпд1 ІН тйАзО НН геном 5. пудговсорісия / дикого типу рр рт ие плазміда ТОйЙАІ-З аувдт- ух тпАТ-Ю тіді жуФАТ-О тнАТ-о з -Пчний тсст пщнть-уй геюм мутанта 5. пудго5сорісих вувати. Атт бтаї плазміда рос ог тд Б Ат ВУС ог амегді-о тидії ймоАї- тА пев слині ни ---- ПЕКИ ин піо «ни---й- геном мутанта 5. Вудгозсорісив Яткаї Знчаї зЗщаї АттТрисогі пуегді-) тнинді акеді-2 витягнутий фрагмент учи Ма І самолігування амед3-й тбниАт ахеАмО аї рис огі АттТ
Фіг. 1 В5ІВІ (1) -й огіт «5 у /- «ее (328) рис огі--4». чу й рРОАттТ14 Ніваш (1904). М 5рії (19023Х, | З021 п.н. ШІ звсом БП (1896) У РИ (1896) ' т Же. МІШ (997) зап (188677 Хної (1010) Баюні (1874) /7 рий та (1871) Кри (18569) Ааш (13923 ЕсоВіІ (1853) іасга РУШ (1736) масі (1641)
Фіг. 2 рис ої ВЯВІ (1) Ніпаш (8888) ! ЕсовіІ (8837) де Іасга Масі(8625) у ХНОЇ (7994) нижчерозташований засізим роАтт-Ккатеї) ахе) 10005 п,н. огіт ввіВІ/Сіаї (6985) замінені 81 п.н. ВС (6208) вищерозташований ауер мутантний ахе
Фіг. 3 нижчерозташований ауеЇ) у вИщерозташований ахер н-і ІННИ Чи. геномна ДНК 5. ауептіййх МА-А680 ! нижчерозташ. мутантний вищерозташ плазміда РАтТ-Кахер ак ахер амеб ВОСо ійса(о) пас нНи у --ча7апинииін---у:-геномна ДНК 5. ауегттігйіх АРІВ нижчерозташований мутантний вищерозташований ахер ахей) ахе
Фіг. 4
- мк в а з - в БАЗЯ В до З з й пи | 1 100 ? 5 5 А
0. сіл А Я З /х ИН 00 25 504 75 190 125 хв 150 5 100 5 Є В й І І : 0 я Ла х Д 00 25 50 15 10.0 125 хв
Фіг. 5 МА1З3Е1 / МА1ЗН2 МА1ОЕЗ / МАТОКа
5З.пПудгогсорісца 5.пустозсорісна ПЛР ПЛР гмент З гмент 4 РА, 3 п.н. рмМО195 уд п.н. вера вену вн рОдтт-МА13! РМО-МАТО АДІ1рЕ9 / ААЗ1ОК10
5 .аувттіа ніпа пі; ме Ї 6199 ин в Шо ПЛ фрагмент 7 вриАттТ-МА130 3266 п.н. милу р рМА1Зааамдо
Фіг. 6 ті т тйдІО . нн ат геном 5. пудюовсорісив НОО2З рн ПИВ ИЙ понагахувя ; МД ЗазамМАо ПІНАТ-3" ауодІ- о», пйдІо плазміда р ба тИдІ ау. тій пен па КЕ иАня--у геном 5. лудговсорісив Ме3-22 та
Фіг. 7
МА15Е13 / МА15К14
5.пудгозсорісив ПЛР роАтт14 фрагмент 3097 п.н. ААЗШЕ15 / ДА1ОК16 РЕ невтст Г/ Ніпа Ш | З.ахегтіціїв Аров ПЛР риАтт-МА15 фрагмент 3103 п,н. ЕсОК І прірви Крпі роАттТ-МА15АА1у
Фіг. 8 тиді луалі-о тідт-о б мини ниаииті нити геном 5. пудговсорісив Ме3-22 текти дтт зна плазміда РУТ МАЇ5ААТу рис сп МАТ Ат ро зувдт и тд аходІ-ю тиді-о , бі В-во линии, чине---25- ГУНОМ мутанта 5, пудговсорісив Ятаї б
Фіг. 9 тйАТ-в АТ РОС о вуедт-у пд аодІ-Ю ТАТО пчбж-киикі в-во вний чаї ие-х й -. Теном мутанта 5. нудгозсорісив зткаї зтаї зм АТ ро амеу оі віцівідні витягнутий фрагмент Зиаї й сяк самолігування зуедт-у тд? зувАО ктаї рибоп ат т
Фіг. 10 ад тд ачуеді.й , грн На кнлот пиття дю и геномна ДНК 5, амелтійі АВ НА «щаї ши і плазміда РІАтТТАМА РОСой одят НА ауедо : а пр чити теномна ДНК 5, амогтінії МА220
Фіг. 11 МВО105 ТЕУА в А 100 За є ТЕУВ 7ь |в ю а В : д х їі. Я з х що 00 25 5 75 106 125 150 175 В хв тво АЕ Віа В ші І 0 ДЕ т с -3 ся А вів 82 В З 00 25 50 75 100 125 150 175 хв
Фіг. 12
Тек о ЕВ Ей та (40000-1200.005 1 855.35 в а що З»
а. Е Б : 858.35 оє- ГІ з М т вБІ.з 1 932.95 . З 540.26 вою овала ЮТВОГ ОБ яЄ 110347 800 700 воб 800 1000 1400 120 т/іг
Фіг. 13 пайажиттуву пайки нилкненіасаесяняннссаснизя Чи? ва іі і ранні еле ее ек ее Ме ря ЕЕ 9 7 б 5 4 З 2 1 0 ррт тававови.о 0. Фіг. 14 8 ЕБЕЕЕЕНН НК ше щи в нні півні Манна, пінні іній нні дднві мані пав вав лини інтим пн вв півні інн, пив 210 200 190 180 179 160 150 140 130 420 410 100 90 80 70 60 50 49 30 20 НІ) 0 врт
Фіг. 15
І чию сна "т Га Мой а чаю р Ж Фу Шо «бу кв оо я Сея ся У я ши ЕЕ ЗОЛИ ча У КУ дани Гвілніній іннннініі вівнвавнні іннйвнн ннйнвннн пніавита миваннані манвьних мннавйй нвньнвіві мавіання вав зодвв ни чівнінвав зініватнні ііі нива налввьнні педййіінва мивоввви. мезо пні 200 190 180 170 460 150 140 130 120 0 100 90 80 70 60 50 45 0 10 ррт
Фіг. 16 т: ж оЕВІ Еш те (400.00-1200.00) й вво.32 : 8 Ге Шк; 5, во Е вто о щ Гі щ З Я Ше 2 вт 1 86405 2021 бля 100492 1080.12 63278 089.30 70309 796,23 883.37 987,22 | 1018.36 113378 119563 800 лю 800 в00 1000 мо 1200 те .
Фіг. 17 ин ин ее ПП ння сива вс ній пр е сів ВКМ КЕ є КК сі 8 8 7 6 5 й З 2 1 0 ррт
Фіг. 18 А ВЕДЕ ЕВНН ЕН ЕЕНЕ ЕЕ СЕБЕ ННЕНЕ В ЯВНАЛЕВЕчсхсвввессоктивовосо весна вея КЕ Фев З и ВН син 200 190 180 370 160 150 440 130 120 410 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Фіг. 19 е БЕЗЕ БОЕСЕЕсЕЕОсесЕсВЕВнЕВ ВЕ ЕшЕ БЕЗ ло БЕБЖКЕНЕЕЕО ЧЕНКО вно ВВЕ ваня А УК фран нн п п в 290 1930 іо ї70 со 158 1їі0 132 120 зі 105 зо ва та ва во йо зо «а іо ррт
Фіг. 20
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410085431 | 2014-03-10 | ||
| PCT/CN2014/076372 WO2015135242A1 (zh) | 2014-03-10 | 2014-04-28 | 表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA116835C2 true UA116835C2 (uk) | 2018-05-10 |
Family
ID=54070849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201609907A UA116835C2 (uk) | 2014-03-10 | 2014-04-28 | Рекомбінантний мікроорганізм streptomyces avermitilis, який експресує тенвермектини, його застосування, спосіб конструювання та спосіб отримання тенвермектинів |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10334850B2 (uk) |
| EP (1) | EP3118305B1 (uk) |
| JP (1) | JP6346673B2 (uk) |
| CN (2) | CN106459885B (uk) |
| AU (1) | AU2014386509B2 (uk) |
| CA (1) | CA2940016A1 (uk) |
| CL (1) | CL2016002223A1 (uk) |
| EA (1) | EA033293B1 (uk) |
| IL (1) | IL247596B (uk) |
| MX (1) | MX2016011367A (uk) |
| UA (1) | UA116835C2 (uk) |
| WO (1) | WO2015135242A1 (uk) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017052232A1 (ko) * | 2015-09-22 | 2017-03-30 | 주식회사 팜한농 | 밀베마이신을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 밀베마이신 생산 |
| US20200131552A1 (en) | 2017-03-13 | 2020-04-30 | Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd. | Ivermectin b1b producing strain and use thereof |
| CN108660101B (zh) * | 2017-04-01 | 2021-07-09 | 浙江海正药业股份有限公司 | 表达天维菌素b的重组微生物、制备方法及其用途 |
| CN107509735B (zh) * | 2017-08-29 | 2020-09-11 | 浙江农林大学 | 增效杀螨组合物及其用途 |
| CN107494559B (zh) * | 2017-08-29 | 2020-09-29 | 浙江农林大学 | 防治柑桔潜叶蛾的杀虫组合物及其用途 |
| CN110540944B (zh) * | 2018-05-28 | 2022-08-02 | 深圳市天维生物药业有限公司 | 一种天维菌素产生菌及其应用 |
| CN110540556B (zh) * | 2018-05-28 | 2023-04-28 | 深圳市天维生物药业有限公司 | 一种分离和提纯天维菌素的方法 |
| CN110540567A (zh) | 2018-05-28 | 2019-12-06 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种天维菌素b的晶型及其制备方法和用途 |
| CN110305818A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-10-08 | 齐鲁制药（内蒙古）有限公司 | 一种阿维菌素菌种选育方法 |
| CN114931144A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-08-23 | 台州科技职业学院 | 一种大环内酯类化合物及其在防治农林害虫和害螨中的应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4134973A (en) * | 1977-04-11 | 1979-01-16 | Merck & Co., Inc. | Carbohydrate derivatives of milbemycin and processes therefor |
| EP0235085A1 (de) * | 1986-02-20 | 1987-09-02 | Ciba-Geigy Ag | 13-Beta-Zuckerderivate von Milbemycinen, deren Herstellung und Verwendung gegen Ekto-und Endoparasiten am Nutztier oder an der Nutzpflanze |
| US5234831A (en) | 1987-01-23 | 1993-08-10 | Pfizer Inc | Cultures for production of B avermectins |
| DE4031039A1 (de) * | 1989-10-03 | 1991-04-11 | Ciba Geigy Ag | 13(alpha)-zuckerderivate von milbemycinen, deren herstellung und verwendung gegen ekto- und endoparasiten am nutztier |
| JP2888586B2 (ja) | 1990-03-05 | 1999-05-10 | 社団法人北里研究所 | エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法 |
| US8796230B2 (en) | 2010-01-22 | 2014-08-05 | University Of Southern California | Ivermectin antagonizes ethanol inhibition in P2X4 receptors |
| CN103834605B (zh) * | 2012-11-21 | 2018-09-21 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用 |
| CN104910228B (zh) * | 2014-03-10 | 2018-12-07 | 浙江农林大学 | 十六元大环内酯类化合物及其应用 |
-
2014
- 2014-04-28 WO PCT/CN2014/076372 patent/WO2015135242A1/zh active Application Filing
- 2014-04-28 UA UAA201609907A patent/UA116835C2/uk unknown
- 2014-04-28 MX MX2016011367A patent/MX2016011367A/es unknown
- 2014-04-28 US US15/123,827 patent/US10334850B2/en active Active
- 2014-04-28 EP EP14885605.7A patent/EP3118305B1/en active Active
- 2014-04-28 CA CA2940016A patent/CA2940016A1/en not_active Abandoned
- 2014-04-28 AU AU2014386509A patent/AU2014386509B2/en active Active
- 2014-04-28 JP JP2016555820A patent/JP6346673B2/ja active Active
- 2014-04-28 CN CN201480077055.0A patent/CN106459885B/zh active Active
- 2014-04-28 EA EA201691754A patent/EA033293B1/ru unknown
-
2015
- 2015-03-10 CN CN201580013257.3A patent/CN106795196A/zh active Pending
-
2016
- 2016-09-01 IL IL247596A patent/IL247596B/en not_active IP Right Cessation
- 2016-09-02 CL CL2016002223A patent/CL2016002223A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106795196A (zh) | 2017-05-31 |
| CA2940016A1 (en) | 2015-09-17 |
| EP3118305A4 (en) | 2018-03-21 |
| IL247596A0 (en) | 2016-11-30 |
| EA033293B1 (ru) | 2019-09-30 |
| EA201691754A1 (ru) | 2016-12-30 |
| AU2014386509A1 (en) | 2016-09-22 |
| US20170013837A1 (en) | 2017-01-19 |
| AU2014386509B2 (en) | 2018-07-05 |
| IL247596B (en) | 2019-05-30 |
| JP6346673B2 (ja) | 2018-06-20 |
| CN106459885B (zh) | 2019-07-23 |
| MX2016011367A (es) | 2017-02-02 |
| JP2017512465A (ja) | 2017-05-25 |
| EP3118305B1 (en) | 2019-08-14 |
| US10334850B2 (en) | 2019-07-02 |
| CN106459885A (zh) | 2017-02-22 |
| CL2016002223A1 (es) | 2017-04-07 |
| WO2015135242A1 (zh) | 2015-09-17 |
| EP3118305A1 (en) | 2017-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA116835C2 (uk) | Рекомбінантний мікроорганізм streptomyces avermitilis, який експресує тенвермектини, його застосування, спосіб конструювання та спосіб отримання тенвермектинів | |
| CA2941862C (en) | Sixteen-membered macrolide compound and applications thereof | |
| Worsley et al. | Streptomyces endophytes promote host health and enhance growth across plant species | |
| Zhang et al. | Designed biosynthesis of 25-methyl and 25-ethyl ivermectin with enhanced insecticidal activity by domain swap of avermectin polyketide synthase | |
| Tuli et al. | Optimization of extraction conditions and antimicrobial potential of a bioactive metabolite, cordycepin from Cordyceps militaris 3936 | |
| US20140105862A1 (en) | Streptomyces microflavus strains and methods of their use to control plant diseases and pests | |
| CN104974942B (zh) | 一株须糖多孢菌丁烯基多杀菌素高产突变株 | |
| Iutynska et al. | Development strategy for the new environmentally friendly multifunctional bioformulations based on soil streptomycetes | |
| KR101877932B1 (ko) | 그람미신 화합물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이의 용도 | |
| CN101386829A (zh) | 一种阿维链霉菌基因工程菌及其应用 | |
| Gupta et al. | New and future developments in Microbial Biotechnology and bioengineering: Microbial secondary metabolites biochemistry and applications | |
| Chen et al. | Enhancement and selective production of avermectin B by recombinants of Streptomyces avermitilis via intraspecific protoplast fusion | |
| Sanjotha et al. | An in vitro approach for evaluating antimicrobial activity and production of kojic acid by aspergillus flavus isolated from Karwar region | |
| CN110832066B (zh) | 一种伊维菌素B1b产生菌及其应用 | |
| CN107722032B (zh) | 一种具有斜纹夜蛾毒杀活性的酸酐类化合物及其制备方法和应用 | |
| Worsley et al. | Streptomyces endophytes promote the growth of Arabidopsis thaliana | |
| Pun et al. | Frontiers in Fungal Endophytes Associated with Medicinal Orchids | |
| CN117986326A (zh) | 一种钩状木霉t21抗菌肽bⅱ及其制备方法、用途 | |
| KR101400997B1 (ko) | 스트렙토마이세스 크로모푸스코스를 이용한 허브옥시디엔의 제조방법 |