CN110642872B - 一种星孢菌素提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种星孢菌素的提取方法，包含以下步骤：1)板框过滤；2)丙酮提取；3)萃取；4)结晶及真空干燥。本发明所揭示的星孢菌素提取方法生产成本低，提取周期短，操作简单，方法稳定，易于放大，在工业化生产中具有极高的实用价值。

Description

一种星孢菌素提取方法

技术领域

本发明属于化学品的分离纯化领域，具体涉及一种星孢菌素提取方法。

背景技术

星孢菌素(staurosporine,STA，结构式如下式(1))是一种具有较好药学和生物活性的天然产物。该化合物于1997年由Omura最早是从土壤放线菌中分离得到的吲哚咔唑类生物碱。X单晶衍射实验分析表明，其中央为吲哚咔唑环，环下方的N上连接小分子糖，上面连接的是内酰胺环。STA为强PKC抑制剂(IC50＝2.7nM)，主要作用于细胞信号转导通路中各种激酶、拓扑异构酶以及细胞周期调控因子。

结构修饰得到的星孢菌素衍生物米哚妥林(结构式如下式(2))，于2017年批准用于治疗最新确诊的FLT3突变(以一种FDA批准的检测方法进行检测)呈阳性及适合标准诱导和巩固化疗的急性髓性白血病成年患者。

星孢菌素是作为米哚妥林的关键中间体，其生产工艺直接影响米哚妥林的生产成本和质量。因此，开发星孢菌素的提取纯化方法具有重要意义。

US4107297，公开了一种星孢菌素的提取纯化方法。该方法是在发酵完成后，用氨水将培养基的pH值调整为10，在室温下加入乙酸正丁酯进行提取；加入HCl水溶液，将产品转移到水溶液中；用氨水将PH值调节到10，用乙酸乙酯萃取，浓缩得到褐色混凝剂；用乙醚洗涤，除去脂肪；硅胶层析，洗脱剂氯仿-甲醇，采用薄层控制，浓缩，干燥得纯品。纯度达99％以上。

US 4973552，公开了一种星孢菌素提取方法，该方法先将发酵菌液过滤，再用四氢呋喃对菌渣进行搅拌提取1小时，过滤，菌丝层用丙酮冲洗，滤液浓缩成水溶液，用氯仿萃取得粗提物；粗提物用硅胶层析，洗脱剂正己烷-四氢呋喃梯度；再次用葡聚糖凝胶LH-20制备，得成品。

US7608420，公开的方法是采用甲醇、丙酮和四氢呋喃(优先四氢呋喃)将产品从发酵液中提取出来，让后用陶瓷膜、聚合物膜或金属膜等方式超滤，分子量截止值10kDa或更小；溶液调节PH值10至13，离心或过滤；再采用四氢呋喃-甲醇结晶得到星孢菌素，含量为89％，总收率达64％。

上述专利公开的方法中，US4107297和US 4973552的提取方法都采用了硅胶柱层析，因此产品质量较好，纯度达到99％以上，但生产成本高、收率低。US7608420的方法需要使用超滤技术除去生物大分子杂质，提取收率较高，达到64％，但所得的星孢菌素质量较差，含量只有89％。

星孢菌素发酵液的获得方法在CN 201810572019.1、US4107297、US4973552、US7608420、US20060194294等专利文献中均有提及。

因此，需要提供一种工艺过程简单，成本低，易于放大，生产周期短，收率较高(总达48％以上)，所得的星孢菌素质量好(含量达99.5％以上，最大单个杂质不高于0.10％)。因此，本发明所公开的星孢菌素纯化方法具有重大的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种星孢菌素的提取纯化方法。本方法包括板框过滤、提取、萃取、浓缩、结晶等工序，本方法成本低、生产周期短、效率高且产品质量好，更适于实际生产应用。具体步骤如下：

步骤1：向星孢菌素发酵液加入助滤剂，通过板框过滤，得到星孢菌素菌渣；

步骤2：将步骤1中的星孢菌素菌渣用溶剂提取，得到提取浓缩液；

步骤3：将步骤2中的提取浓缩液中加入有机溶剂A、水溶液、萃取助剂，萃取分层，有机相经干燥、过滤后，浓缩，加入有机溶剂B析晶，过滤，得到星孢菌素粗品；

步骤4：将步骤3中的星孢菌素粗品用适量的混合溶剂溶解，通过滤膜过滤，减压浓缩，加入有机溶剂B析晶，过滤得星孢菌素结晶品；

步骤5：将步骤4中的星孢菌素结晶品进行干燥，得星孢菌素成品。

而且，所述步骤1的星孢菌素发酵液为海洋链霉菌发酵液。

而且，所述步骤2的溶剂为异丙醇、乙醇、丙酮、甲醇中的一种。

而且，所述步骤3的有机溶剂A为乙酸丁酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种。

而且，所述步骤3的水溶液为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨中的一种形成的水溶液，质量百分比浓度为0.1％～3.0％。

而且，所述步骤3的萃取助剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

而且，所述步骤3和步骤4的有机溶剂B为甲醇、丙酮、乙醚、异丙醚中的一种。

而且，所述步骤4的混合溶剂分别为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷三者之一和丙酮、甲醇、乙醇三者之一，两种溶剂的体积比为88:12～94:6，减压浓缩温度为25～35℃。

而且，所述步骤4的滤膜为0.22μm滤膜。

而且，所述步骤5的星孢菌素结晶品进行干燥条件为60±5℃真空干燥16±2h。

本发明所公开的星孢菌素提取纯化方法不需要使用硅胶柱层析，只需在发酵菌丝体尚未开始自溶时，将菌丝体过滤出来，采用适当的溶剂将星孢菌素提取出来，避免发生溶菌而导致大量胞内杂质释放出来。提取液经浓缩后进行萃取，采用碱水溶液将提取液中含有的蛋白质、核酸的生物大分子杂质去除。最后通过结晶，去除其余的有机杂质。本发明的纯化方法，工艺过程简单，易于放大，生产周期短，收率较高(总达48％以上)，所得的星孢菌素质量好(含量达99.5％以上，最大单个杂质不高于0.10％)。因此，本发明所公开的星孢菌素纯化方法具有重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明制备的星孢菌素¹H-NMR图；

图2为本发明制备的星孢菌素¹³C-NMR图；

图3为本发明制备的星孢菌素质谱图；

图4为本发明制备的星孢菌素红外光谱图；

图5为本发明所述的星孢菌素发酵液典型HPLC图；

图6为本发明制备的星孢菌素结晶品典型HPLC图；

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行说明。

实施例1

(1)向星孢菌素发酵液中加入3％珍珠岩(按发酵液体积计，Kg/L)，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，收集菌渣；

(2)将菌渣用有机溶剂提取3次，每次加入4倍体积(L/Kg菌渣)的溶剂，过滤，合并滤液；

(3)滤液在一定温度下减压浓缩至原体积的1/30，加入等体积的溶剂、等体积的水溶液，1/3体积的萃取助剂，搅拌30±10min，静置60±10min，分液，水相再用原体积溶剂萃取一次，合并有机层，加入5％(Kg/L)无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至原体积的1/20～1/16，加入2倍体积的解析溶剂，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品；

(5)将星孢菌素粗品用溶剂A与溶剂B体积比为88:12～94:6的混合溶剂溶解，混合溶剂体积(L)为星孢菌素质量(Kg)的15倍，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在一定温度下减压浓缩至原体积的1/6，加入等体积的溶剂B，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥16±2h，粉碎，得星孢菌素成品。

实施例2

(1)向300L含星孢菌素451mg/L的发酵液中加入9Kg珍珠岩，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，得菌渣62Kg；

(2)将菌渣投入500L搅拌罐中，加入无水乙醇250L，搅拌5±1h，将提取液滤出，菌渣保留在罐内，再加无水乙醇提取2次，每次250L，合并滤液；

(3)滤液在50±5℃下减压浓缩至25～30L，加入30L三氯甲烷，30L 2％氨水，10L无水甲醇，搅拌30±10min，静置60±10min，分液，水相再用30L三氯甲烷萃取一次，合并有机层，加入3Kg无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至3L，加入6L无水甲醇，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品122g；

(5)将120g星孢菌素粗品用1800ml三氯甲烷与无水乙醇体积比为92:8的混合溶剂溶解，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在40±5℃，-0.02～-0.06MPa下浓缩至300ml，加入300ml的无水乙醇，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品87.2g；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥16±2h，粉碎，得星孢菌素成品65.1g，含量99.8％，最大单个杂质0.06％，总收率48.1％。

实施例3

(1)向300L含星孢菌素408mg/L的发酵液中加入9Kg珍珠岩，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，得菌渣65Kg；

(2)将菌渣投入500L搅拌罐中，加入丙酮250L，搅拌5±1h，将提取液滤出，菌渣保留在罐内，再加丙酮提取2次，每次250L，合并滤液；

(3)滤液在50±5℃下减压浓缩至25～30L，加入30L二氯甲烷，30L 3％碳酸钠，10L无水甲醇，搅拌30±10min，静置60±10min，分液，水相再用30L二氯甲烷萃取一次，合并有机层，加入3Kg无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至3L，加入6L丙酮，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品119g；

(5)将110g星孢菌素粗品用1650ml二氯甲烷与丙酮体积比为90:10的混合溶剂溶解，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在40±5℃，-0.02～-0.06MPa下浓缩至300ml，加入300ml的丙酮，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品83.2g；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥16±2h，粉碎，得星孢菌素成品57.5g，含量99.8％，最大单个杂质0.05％，总收率47.0％。

实施例4

(1)向32m³含星孢菌素415mg/L的发酵液中加入960Kg珍珠岩，搅拌30±5min，板框过滤，滤液排放至污水处理站，滤饼用压缩空气吹干2±0.5h，得菌渣6770Kg；

(2)将菌渣等分成两份，分别投入到两个20m³搅拌罐中，各加入无水乙醇13500L，搅拌5±1h，将提取液滤出，菌渣保留在罐内，再加无水乙醇提取2次，每次各加13500L，合并滤液；

(3)滤液在50±5℃下减压浓缩至2500～3000L，加入3000L二氯甲烷，3000L 2％碳酸钾，1000L无水甲醇，搅拌60±10min，静置2±0.5h，分液，水相再用3000L二氯甲烷萃取一次，合并有机层，加入300Kg无水硫酸钠，搅拌干燥60±10min，过滤；

(4)滤液在35±5℃下减压浓缩至300L，加入600L无水甲醇，常温搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素粗品14.2Kg；

(5)将14.15Kg星孢菌素粗品用200L三氯甲烷与无水乙醇体积比为92:8的混合溶剂溶解，溶解后用0.22μm的滤膜过滤。滤液在40±5℃，-0.02～-0.06MPa下浓缩至35L，加入35L的无水乙醇，搅拌60±10min，过滤，得星孢菌素一次结晶品，按照此方法再结晶一次，得二次结晶品8.96Kg；

(6)星孢菌素二次结晶品在60±5℃真空干燥30±2h，粉碎，得星孢菌素成品6.62Kg，含量99.8％，最大单个杂质0.06％，总收率49.8％。

本发明中所述的星孢菌素发酵液，就是通过发酵方式获得的细胞内含有星孢菌素的菌液，至少包括按CN 201810572019.1、US4107297、US4973552、US7608420、US20060194294等公开方法获得的发酵液。本发明所述的菌渣，就是通过过滤、离心等方式除去发酵液中液体成分后所获得的固体成分。

对上述实施例所得到的星孢菌素成品通过以下实验进行验证，用以证实所得产品确认为星孢菌素：

图1为本发明制备的星孢菌素¹H-NMR图；

图2为本发明制备的星孢菌素¹³C-NMR图；

图3为本发明制备的星孢菌素质谱图；

图4为本发明制备的星孢菌素红外光谱图；

图5为本发明所述的星孢菌素发酵液典型HPLC图；

图6为本发明制备的星孢菌素结晶品典型HPLC图。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种星孢菌素提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：向星孢菌素发酵液加入助滤剂，通过板框过滤，得到星孢菌素菌渣；

步骤2：将步骤1中的星孢菌素菌渣用溶剂提取，得到提取浓缩液，所述溶剂为乙醇或丙酮；

步骤3：将步骤2中的提取浓缩液中加入有机溶剂A、水溶液、萃取助剂，萃取分层，有机相经干燥、过滤后，浓缩，加入有机溶剂B析晶，过滤，得到星孢菌素粗品，所述有机溶剂A为二氯甲烷或三氯甲烷，所述水溶液为碳酸钾、碳酸钠或氨中的一种形成的水溶液，所述有机溶剂B为无水甲醇或丙酮；

步骤4：将步骤3中的星孢菌素粗品用适量的混合溶剂溶解，通过滤膜过滤，减压浓缩，加入有机溶剂B析晶，过滤得星孢菌素结晶品，所述混合溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷和无水乙醇或丙酮，所述有机溶剂B为无水甲醇或丙酮；

步骤5：将步骤4中的星孢菌素结晶品进行干燥，得星孢菌素成品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3的水溶液质量百分比浓度为0.1％～3.0％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3的萃取助剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4的混合溶剂分别为三氯甲烷、二氯甲烷二者之一和无水乙醇、丙酮二者之一，两种溶剂的体积比为88:12～94:6，减压浓缩温度为25～35℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4的滤膜为0.22μm滤膜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5的星孢菌素结晶品进行干燥条件为60±5℃真空干燥16±2h。

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