CN104262251B - 一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，包括以下步骤：（1）前处理；（2）超声逆流提取：超声逆流提取千层塔，过滤，得浸提液；（3）膜分离纯化：离心，超滤，纳滤浸提液，得截留液；（4）浓缩：浓缩截留液至膏状物；（5）酸溶：用酸液溶解膏状物，过滤，调节pH至碱性；（6）萃取：用氯仿萃取，收集萃取液；（7）浓缩：浓缩萃取液，得干粉；（8）结晶与重结晶：溶解所得干粉，结晶与重结晶，得白色晶体；（9）干燥：干燥该白色晶体，得石杉碱甲产品。采用本发明方法从千层塔中提取的石杉碱甲纯度≥99%，产品得率≥0.026%，最终收率为50～55%，产品得率、收率和纯度高，提取时间短，成本低，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取石杉碱甲的方法，具体涉及一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法。
背景技术
千层塔（Huperzia serrata
Trev.），别名蛇足石杉，蛇足草，为石杉科石杉属多年生草本植物蛇足石杉的全草，是我国特有植物之一，广泛分布在全国各地，主产东北、长江流域，全草可入药，民间常用于治疗跌打损伤、内伤出血、瘀血肿痛、毒蛇咬伤等。现代对千层塔中生物碱类物质研究较多，其中石杉碱甲最受关注，被认为是一种高效、低毒、选择性高并可逆的乙酰酯酶的抑制剂，对良性记忆障碍、早老性痴呆以及重症肌无力的治疗效果明显，其治疗指数高于同类产品，如塔克林、毒扁豆碱以及加兰他敏等。在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一，也是目前治疗良性记忆障碍和早老性痴呆症最为安全的药物之一。
石杉碱甲，分子量为242.32，分子式C15H18N2O（其结构式如下所示），是一种生物碱类物质，具有生物碱类物质的基本性质，其易溶于氯仿，能够溶于甲醇、乙醇，微溶于水。
国内对从千层塔中提取分离石杉碱甲的研究较多。CN 102617469A公开了一种千层塔石杉碱甲的提取方法，该方法是将千层塔药材粉碎、酸液超声提取、浓缩、氨水调节pH、氯仿萃取、酸液再次溶解、活性炭除杂过滤、二次氨水调节pH值、氯仿再次萃取、结晶与重结晶，最后经干燥得产品，产品中石杉碱甲纯度达到99%，石杉碱甲得率约为0.016%，由于过程经多次萃取，损失大、得率低、成本高。CN 101693689A公开了一种从千层塔中提取分离高纯度石杉碱甲的新方法，该方法是将千层塔药材适当粉碎、酸水浸提、氨水调节pH、大孔树脂吸附分离、高速逆流色谱纯化、经浓缩干燥得成品，成品中石杉碱甲的纯度可达98%以上，但该方法过程中高速逆流色谱设备投入大、处理量受限，很难适应工业生产。CN 101747275B公开了一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法，该方法是将含一定纯度石杉碱甲的千层塔提取物使用乙醇溶解、表面活性剂起泡、离心、碱水溶解、过滤、结晶与重结晶，干燥获得产品，产品纯度65%以上，虽然该方法生产成本较低，但产品纯度相对较低。CN 101602727A公开了一种石杉碱甲的制备方法，该方法是使用酸液对千层塔粗粉进行提取，经离子交换、大孔树脂吸附分离、结晶与重结晶制备出石杉碱甲纯度90%以上的产品，虽然该方法的工艺简单、可操作性强，但收率不理想。CN 102491946 A公开了一种分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，该方法对千层塔药材进行超声逆流萃取，经浓缩、脱色，然后分子烙印聚合、结晶与重结晶可制备出纯度99%以上产品，该发明方法直接对药材进行超声逆流萃取，由于千层塔中活性成分含量极低，萃取的杂质较多，一定程度阻碍活性物质在溶剂中传递，影响石杉碱甲的萃取收率，对后续工艺纯化不利；此外，该方法使用的分子烙印技术，操作性要求较高，控制复杂，工艺不成熟，仅适用于小批量的生产，不利于放大与工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服所述现有技术存在的收率低、成本高、可操作性不强等缺陷，提供一种产品得率、纯度高，提取时间短，成本低并适于工业化生产的从千层塔中提取石杉碱甲的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，包括以下步骤：
（1）前处理：将千层塔药材除杂，粉碎，过20～40目筛；
（2）超声逆流提取：向过筛后的药材中加入相当于药材干重5～6倍的水浸泡，弃去浸泡液；将浸泡后的药材送入超声逆流提取装置中，加入相当于过筛药材干重10～15倍的碱性乙醇进行超声浸提，超声频率范围为20～60 kHz，浸提温度为50～60℃，浸提时间为30～40min，过滤，得浸提液；
（3）膜分离纯化：将步骤（2）中所得浸提液进行离心，超滤，纳滤，得截留液；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得截留液浓缩至浸膏状，得膏状物；
（5）酸溶：向步骤（4）中所得膏状物中加入相当于其质量10～12倍的酸性溶液进行溶解，过滤，调节滤液的pH值至8～9，得碱性溶液；
（6）萃取：用相当于步骤（5）中所得碱性溶液3.0～4.2倍体积的氯仿进行萃取，收集氯仿萃取液；
（7）浓缩：将步骤（6）中所得氯仿萃取液进行浓缩，直至蒸干，得干粉；
（8）结晶与重结晶：用有机溶剂溶解步骤（7）中所得干粉，进行结晶与重结晶，得白色晶体；
（9）干燥：将步骤（8）中所得白色晶体进行干燥，得石杉碱甲产品。
进一步，步骤（2）中，所述浸泡的次数为2～3次，每次30～40min，浸泡的温度为40～50℃。
进一步，步骤（2）中，所述碱性乙醇中，乙醇的体积分数为70～90%，pH为9.0±0.5。
进一步，步骤（3）中，所述离心为蝶式离心；所述超滤采用截留分子量为3～5 wD的超滤膜，操作压力为0.5～1.0 bar；所述纳滤采用截留分子量为150～200D的纳滤膜，操作压力为5.0～15.0 bar。
进一步，步骤（4）中，所述浓缩采用真空浓缩，浓缩的温度为50～60℃，真空度为-0.08～-0.04MPa。
进一步，步骤（5）中，所述酸性溶液为体积分数0.5～0.8%的盐酸或硫酸溶液；所述pH值采用质量分数为5～8%的氢氧化钠溶液或体积分数为10～15%的氨水溶液进行调节。
进一步，步骤（6）中，所述萃取的次数为3～4次，每次20～30min。
进一步，步骤（7）中，所述浓缩采用真空浓缩，浓缩的温度为40～60℃，真空度为-0.08～-0.04MPa。
进一步，步骤（8）中，所述有机溶剂为丙酮，每次结晶用量为45～55mL丙酮/g干粉；所述结晶的温度为2～8℃，结晶次数为2～3次。
进一步，步骤（9）中，所述干燥采用真空干燥，干燥的温度为60～70℃，真空度为-0.09～-0.06MPa。
本发明方法步骤（2）中，超声逆流提取前先对千层塔药材采用了水浸泡处理，去除了大部分水溶性杂质，减少了后续工艺处理的压力和困难，同时更有利于目标成分的纯化。
本发明方法步骤（2）中，采用超声逆流提取进行浸提，具有浸提时间短、浸提溶剂少、浸提效率高的特点。相对于普通的逆流提取，超声逆流提取增加了超声装置，由于超声波具有机械效应、空化效应以及一定的热效应，更能够使得药材的细胞壁瞬时破裂，活性物质快速释放和溶出，大大提高浸提的效率（参见表1）。
表1 不同提取方式的浸提效果
| 提取方式 | 浸提时间（min） | 石杉碱甲浸提率（%） | 溶剂使用量（倍） |
| 传统提取 | 90～120 | 85～90 | 24～30 |
| 逆流提取 | 40～50 | 93～95 | 10～15 |
| 超声逆流提取 | 30～40 | 95～98 | 10～15 |
本发明方法步骤（2）中，超声逆流提取采用碱性乙醇作为浸提的溶剂，由于乙醇中加入了碱性物质，使得整个提取系统呈碱性。在碱性条件下，一方面能够增加细胞壁的渗透性，协同超声破坏细胞壁，提高有效物质溶出效率；另一方面石杉碱甲主要以游离状态存在，更有利于其在乙醇中的溶解，增加其溶解性，提高浸出率。
本发明方法步骤（3）中，将高速离心和膜技术很好的结合在一起，高速离心去除了大颗粒以及部分大分子物质，然后超滤又去除了大部分的蛋白质、糖苷类、色素等大分子物质，最后纳滤在去除水、乙醇、小分子有机酸、盐类等物质的同时，截留了目标成分，实现了目标成分与杂质的梯度分离，进一步纯化了目标成分。
本发明方法步骤（5）中，先酸溶膏状物再调节pH至碱性，是因为目标成分石杉碱甲是一种生物碱类物质，其能够与酸反应生成易溶于水的盐类物质，而在碱性环境中又能主要以游离态形式析出，能够更好的被氯仿萃取出来，以实现其与其他物质的分离。
本发明方法步骤（8）中，选责石杉碱甲在有机溶剂丙酮中的溶解性随温度影响敏感的性质，进行结晶与重结晶，实现了石杉碱甲与其他物质的进一步分离。
本发明方法所得的千层塔提取物产品中，经高效液相色谱仪检测，产品中的石杉碱甲含量≥99%，石杉碱甲产品得率≥0.026%（石杉碱甲产品得率=最终所得石杉碱甲产品质量/千层塔药材质量），石杉碱甲最终收率为50～55%（石杉碱甲最终收率=最终所得石杉碱甲产品质量/千层塔中实际所含石杉碱甲质量）。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明方法工艺过程易于操作，适于工业化生产；
（2）本发明方法提取前进行了水浸提除杂处理，去除了大部分水溶性物质，更有利于超声逆流提取的浸出以及后续工艺的纯化；
（3）本发明方法采用超声逆流提取方式，可以使得石杉碱甲的浸提效率明显提高，浸提率达到95%以上（浸提率=浸提液中所得石杉碱甲质量/千层塔中实际所含石杉碱甲质量），相对于传统热回流提取方法提取时间缩短为原来的1/3，提取溶剂使用量为原来的40～60%，大大降低了生产成本；
（4）本发明方法采用碱性乙醇作为超声逆流浸提溶剂，充分利用了石杉碱甲在碱性条件下，主要以游离状态存在，有利于其在乙醇中溶解的特性，其与超声逆流技术的结合增加了石杉碱甲的溶解性，提高了浸出率；
（5）本发明方法使用膜分离纯化代替传统工艺中的层析纯化，减少了过程损失，同时也减少了溶剂的使用，节约了生产成本；
（6）由于石杉碱甲在千层塔中的含量很低，一般仅为0.03%～0.06%，所以即使经过超声逆流提取后采用了超滤膜、纳滤膜过滤，浓缩后的膏状产物中仍含有诸如大量的有机酸、色素类的杂质，本发明方法中创造性的在进一步萃取之前将膏状物进行酸溶再调至碱性，使得作为生物碱类物质的石杉碱甲能先与酸反应生成易溶于水的盐类物质，然后在碱性环境中又主要以游离态形式析出，进而能更好的被氯仿萃取出来，以实现石杉碱甲与其他物质的分离；
（7）最终产品石杉碱甲的纯度、得率和收率高，纯度≥99%，石杉碱甲产品最终得率≥0.026%，石杉碱甲最终收率为50～55%，相对于现有技术中石杉碱甲产品最终得率和石杉碱甲最终收率40～45%具有显著的进步。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例
1
（1）前处理：取干燥千层塔药材（石杉碱甲含量0.053%），除杂，粉碎过20目筛，取10kg粉碎药材备用；
（2）超声逆流提取：向粉碎药材中加入60kg的水浸泡2次，每次40min，浸泡温度为50℃，弃去浸泡液；将浸泡后的药材送入超声逆流提取装置中，加入150kg体积分数为90%且pH值为8.98的碱性乙醇进行浸提，超声频率为60 kHz，浸提温度为60℃，浸提时间为40min，提取后过滤，得浸提液147kg；
（3）膜分离纯化：将步骤（2）中所得浸提液采用蝶式离心机（DRY400，辽阳晟峰制药机械有限公司）进行离心，离心后，用截留分子量为5wD的超滤膜进行超滤，操作压力为0.5～0.8 bar，然后用截留分子量为200D的纳滤膜进行纳滤，操作压力为5.0～15.0 bar，得截留液；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得截留液进行真空浓缩，浓缩的温度为60℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，浓缩至浸膏状，得膏状物792 g；
（5）酸溶：向膏状物中加入9.5kg体积分数为0.8%的盐酸水溶液进行溶解，溶解后过滤，然后，用质量分数为5%的氢氧化钠水溶液调节滤液的pH至8.87，得9.73L的碱性溶液；
（6）萃取：用氯仿对步骤（5）中所得碱性溶液萃取4次，每次30min，每次氯仿使用量为30L，取氯仿相，合并收集，得4次氯仿萃取液117.5L；
（7）浓缩：将步骤（6）中所得117.5 L氯仿萃取液进行真空浓缩，浓缩温度为60℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，直至蒸干，得干重4.12g的干粉；
（8）结晶与重结晶：加入188mL丙酮溶剂溶解步骤（7）中所得干粉，降温至4℃下结晶3次，得白色晶体；
（9）干燥：将步骤（8）中所得白色晶体进行真空干燥，干燥的温度为70℃，真空度为-0.09～-0.06MPa，得石杉碱甲产品2.93 g，纯度为99.14%，产品得率为0.0293%，石杉碱甲最终收率为54.80%。
实施例
2
（1）前处理：取干燥千层塔药材（石杉碱甲含量0.053%），除杂，粉碎过40目筛，取10kg粉碎药材备用；
（2）超声逆流提取：向粉碎药材中加入50kg的水浸泡2次，每次30min，浸泡温度为40℃，弃去浸泡液；将浸泡后的药材送入超声逆流提取装置中，加入100kg体积分数为70%且pH值为9.05的碱性乙醇进行浸提，超声频率为20 kHz，浸提温度为50℃，浸提为30min，提取后过滤，得浸提液97.5kg；
（3）膜分离纯化：将步骤（2）中所得浸提液采用蝶式离心机（DRY400，辽阳晟峰制药机械有限公司）进行离心，离心后，用截留分子量为3wD的超滤膜进行超滤，操作压力为0.7～1.0 bar；然后用截留分子量为150D的纳滤膜进行纳滤，操作压力为5.0～15.0 bar，得截留液；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得截留液进行真空浓缩，浓缩的温度为50℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，浓缩至浸膏状，得膏状物728 g；
（5）酸溶：向膏状物中加入7.3kg体积分数为0.5%的硫酸水溶液进行溶解，溶解后过滤，然后，使用质量分数为10%的氨水溶液调节滤液的pH至8.46，得7.45L碱性溶液；
（6）萃取：用氯仿对步骤（5）中所得碱性溶液萃取3次，每次20min，每次氯仿使用量为31L，取氯仿相，合并收集，得3次氯仿萃取液90.5L；
（7）浓缩：将步骤（6）中所得90.5L氯仿萃取液进行真空浓缩，浓缩温度为42℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，直至蒸干，得3.79g的干粉；
（8）结晶与重结晶：加入205mL丙酮溶剂溶解步骤（7）中所得干粉，降温至8℃下结晶2次，得白色晶体；
（9）干燥：将步骤（8）中所得白色晶体进行真空干燥，干燥的温度为60℃，真空度为-0.09～-0.06MPa，得石杉碱甲产品2.68 g，纯度为99.57%，产品的得率为0.0268%，石杉碱甲最终收率为50.34%。
实施例
3
（1）前处理：取干燥千层塔药材（石杉碱甲含量0.053%），除杂，粉碎过24目筛，取100kg粉碎药材备用；
（2）超声逆流提取：向粉碎药材中加入540kg的水浸泡2次，每次33min，浸泡温度为45℃，弃去浸泡液；将浸泡后药材送入超声逆流提取装置中，加入1260kg体积分数为85%且pH值为8.96的碱性乙醇进行浸提，超声频率为40 kHz，浸提温度为55℃，浸提为35min，提取后过滤，得浸提液1227kg；
（3）膜分离纯化：将步骤（2）中所得浸提液采用蝶式离心机（DRY400，辽阳晟峰制药机械有限公司）进行离心，离心后，用截留分子量为4wD的超滤膜进行超滤，操作压力为0.5～1.0 bar；然后用截留分子量为150D的纳滤膜进行纳滤，操作压力为5.0～15.0 bar，得截留液；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得截留液进行真空浓缩，浓缩的温度为50℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，浓缩至浸膏状，得膏状物7.68kg；
（5）酸溶：向膏状物中加入85kg体积分数为0.65%盐酸水溶液进行溶解，溶解后过滤，然后，使用质量分数为14%的氨水溶液调节滤液的pH至8.78，得87.03L碱性溶液；
（6）萃取：用氯仿对步骤（5）中所得碱性溶液萃取4次，每次25min，每次氯仿使用量为305L，取氯仿相，合并收集，得4次氯仿萃取液1190.5L；
（7）浓缩：将步骤（6）中所得1190.5L氯仿萃取液进行真空浓缩，浓缩温度为55℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，直至蒸干，得34.53g的干粉；
（8）结晶与重结晶：加入1815mL丙酮溶剂溶解步骤（7）中所得干物，降温至4℃下结晶3次，得白色晶体；
（9）干燥：将步骤（8）中所得白色晶体进行真空干燥，干燥的温度为65℃，真空度为-0.09～-0.06MPa，得石杉碱甲产品27.62 g，纯度为99.43%，产品的得率为0.0276%，石杉碱甲最终收率为51.77%。
实施例
4
（1）前处理：取干燥千层塔药材（石杉碱甲含量0.053%），除杂，粉碎过24目筛，取100kg粉碎药材备用；
（2）超声逆流提取：向粉碎药材中加入575kg的水浸泡2次，每次37min，浸泡温度为43℃，弃去浸泡液；将浸泡后药材送入超声逆流提取装置中，加入1375kg体积分数为78%且pH值为9.04的碱性乙醇进行浸提，超声频率为50 kHz，浸提温度为56℃，浸提为32min，提取后过滤，得浸提液1336kg；
（3）膜分离纯化：将步骤（2）中所得浸提液采用蝶式离心机（DRY400，辽阳晟峰制药机械有限公司）进行离心，离心后，用截留分子量为3wD的超滤膜进行超滤，操作压力为0.5～1.0 bar；然后用截留分子量为200D的纳滤膜进行纳滤，操作压力为5.0～15.0 bar，得截留液；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得截留液进行真空浓缩，浓缩的温度为56℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，浓缩至浸膏状，得膏状物7.73kg；
（5）酸溶：向膏状物中加入88.5kg体积分数为0.75%盐酸水溶液进行溶解，溶解后过滤，然后，使用质量分数为7.5%的氢氧化钠溶液调节滤液的pH至8.52，得90.32L碱性溶液；
（6）萃取：用氯仿对步骤（5）中所得碱性溶液萃取3次，每次27min，每次氯仿使用量为340L，取氯仿相，合并收集，得3次氯仿萃取液995.2L；
（7）浓缩：将步骤（6）中所得995.2L氯仿萃取液进行真空浓缩，浓缩温度为47℃，真空度为-0.08～-0.04MPa，直至蒸干，得35.97g的干粉；
（8）结晶与重结晶：加入1780mL丙酮溶剂溶解步骤（7）中所得干粉，降温至5℃下结晶3次，得白色晶体；
（9）干燥：将步骤（8）中所得白色晶体进行真空干燥，干燥的温度为67℃，真空度为-0.09～-0.06MPa，得石杉碱甲产品28.02 g，纯度为99.38%，产品得率为0.0280%，石杉碱甲收率最终为52.50%。
Claims (7)
1.一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）前处理：将千层塔药材除杂，粉碎，过20～40目筛；
（2）超声逆流提取：向过筛后的药材中加入相当于药材干重5～6倍的水浸泡，弃去浸泡液；将浸泡后的药材送入超声逆流提取装置中，加入相当于过筛药材干重10～15倍的碱性乙醇进行超声浸提，超声频率范围为20～60 kHz，浸提温度为50～60℃，浸提时间为30～40min，过滤，得浸提液；所述碱性乙醇中，乙醇的体积分数为70～90%，pH为9.0±0.5；
（3）膜分离纯化：将步骤（2）中所得浸提液进行离心，超滤，纳滤，得截留液；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得截留液浓缩至浸膏状，得膏状物；
（5）酸溶：向步骤（4）中所得膏状物中加入相当于其质量10～12倍的酸性溶液进行溶解，过滤，调节滤液的pH值至8～9，得碱性溶液；所述酸性溶液为体积分数0.5～0.8%的盐酸或硫酸溶液；所述pH值采用质量分数为5～8%的氢氧化钠溶液或体积分数为10～15%的氨水溶液进行调节；
（6）萃取：用相当于步骤（5）中所得碱性溶液3.0～4.2倍体积的氯仿进行萃取，收集氯仿萃取液；
（7）浓缩：将步骤（6）中所得氯仿萃取液进行浓缩，直至蒸干，得干粉；
（8）结晶与重结晶：用有机溶剂溶解步骤（7）中所得干粉，进行结晶与重结晶，得白色晶体；所述有机溶剂为丙酮，每次结晶用量为45～55mL丙酮/g干粉；所述结晶的温度为2～8℃，结晶次数为2～3次；
（9）干燥：将步骤（8）中所得白色晶体进行干燥，得石杉碱甲产品。
2.根据权利要求1所述从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述浸泡的次数为2～3次，每次30～40min，浸泡的温度为40～50℃。
3.根据权利要求1或2所述从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述离心为蝶式离心；所述超滤采用截留分子量为3～5 wD的超滤膜，操作压力为0.5～1.0 bar；所述纳滤采用截留分子量为150～200D的纳滤膜，操作压力为5.0～15.0 bar。
4.根据权利要求1或2所述从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述浓缩采用真空浓缩，浓缩的温度为50～60℃，真空度为-0.08～-0.04MPa。
5.根据权利要求1或2所述从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述萃取的次数为3～4次，每次20～30min。
6.根据权利要求1或2所述从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述浓缩采用真空浓缩，浓缩的温度为40～60℃，真空度为-0.08～-0.04MPa。
7.根据权利要求1或2所述从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（9）中，所述干燥采用真空干燥，干燥的温度为60～70℃，真空度为-0.09～-0.06MPa。
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