CN110078667A

CN110078667A - 一种提取石杉碱甲的方法

Info

Publication number: CN110078667A
Application number: CN201910348497.9A
Authority: CN
Inventors: 马回民; 杨青春; 胡倩; 赵泽熙
Original assignee: HANDE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd YUNNAN
Current assignee: HANDE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd YUNNAN
Priority date: 2019-04-28
Filing date: 2019-04-28
Publication date: 2019-08-02

Abstract

本发明公开了一种提取石杉碱甲的方法，该方法用酸性有机溶剂浸泡千层塔提取石杉总碱，浓缩后调pH值，再经过萃取、脱色絮泥、重结晶、正相柱层析、重结晶获得石杉碱甲；本发明方法简单易操作，污染小、生产周期短，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广。

Description

一种提取石杉碱甲的方法

技术领域

本发明涉及一种从干燥的千层塔中提取石杉碱甲的工业化生产方法。

背景技术

千层塔（Huperzia serrata Trev.）别名蛇足石杉、蛇足草，为石杉科石杉属多年生草本植物蛇足石杉的全草，是我国特有植物之一，广泛分布在全国各地，主产东北、长江流域，全草可入药，民间常用于治疗跌打损伤、内伤出血、瘀血肿痛、毒蛇咬伤等。

石杉碱甲是从石杉属蛇足杉（千层塔）中分离得到的一种天然生物碱，具有生物碱类物质的基本性质，其易溶于氯仿，能够溶于甲醇、乙醇，微溶于水。石杉碱甲分子量为242.32，分子式C₁₅H₁₈N₂O。

石杉碱甲对早年痴呆症，单纯记忆障碍以及重症肌无力症治疗有显著疗效，且药效持续时间较长，无严重不良反应，是目前国内外上述病症最有效的药物，深受国内外学者关注；由于它的治疗指数高，且作用时间长，在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一。

石杉碱甲作为一种可逆性胆碱酯酶抑制剂，对真性胆碱酯酶具有选择性抑制作用。生物活性高，有较高的脂溶性，分子小，易透过血脑屏障，进入中枢后较多地分布于大脑的额叶、颞叶、海马等与学习和记忆有密切联系的脑区，在低剂量下对乙酰胆碱酯酶（AChE）有强大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙的乙酰胆碱（Ach）含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆力保持和促进记忆再现的作用；动物实验表明，石杉碱甲口服吸收迅速而完全，生物利用度高达96%，10-30分钟可达血药峰浓度，分布亦快，易通过血脑屏障。

由于石杉碱甲显著疗效，越来越受到关注和亲睐。随着医药技术的发展，市场前景也将越来越大。

现有技术或传统方法中石杉碱甲提取存在如下问题：

（1）石杉碱甲在自然界中存在量极低，且含大量杂质，提取复杂、提取难度大、收率低；（2）目前，千层塔石杉碱甲的提取方法很多，部分方法虽然提取成品纯度高，但收率很低，生产量较小，无法推广工业化生产；即有部分提取方法能提高收率，却也因为操作性要求高、控制复杂、工艺不成熟等原因，不利于放大与工业化生产；

（3）石杉碱甲因为生产周期长，提取效率低，难以推广应用和规模化生产，而人工合成品难以获得理想的疗效；

（4）目前，有提取工艺采用酸水提取的方法，环境污染较严重，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从千层塔中提取石杉碱甲的方法；该方法用酸性有机溶剂浸泡千层塔提取石杉总碱，浓缩后调pH值，再经过萃取、脱色絮泥、重结晶、正相柱层析、重结晶获得石杉碱甲；本发明方法简单易操作，污染小、生产周期短，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

（1）以干燥粉碎的千层塔为原料，用酸性有机溶剂在35～45℃下浸泡原料6～8h，过滤，滤渣再用酸性有机溶剂重复浸泡1～2次，收集合并滤液，旋蒸浓缩得石杉碱甲粗提物；

所述粉碎的千层塔为10～20目；

所述酸性有机溶剂是甲酸-甲醇混合溶液或甲酸-乙醇混合溶液，其中甲酸与甲醇或乙醇的体积比为1:450～600；

（2）石杉碱甲粗提物用甲醇在55～65℃下溶解，然后调节pH至6～7，用氯仿或二氯甲烷萃取2～3次，收集氯仿或二氯甲烷层，浓缩干燥得石杉碱甲粗品；

用质量浓度20～25%碳酸氢钠溶液或质量浓度10～12%碳酸钠溶液调节pH值；

（3）石杉碱甲粗品用氯仿溶解，待其溶清后，添加脱色剂，搅拌，静置脱色10～12h，过滤，滤液在50～60℃下减压浓缩，得到石杉碱甲浓缩物；

所述脱色剂为活性炭和硅藻土按质量比1:2～3的比例混合制得；脱色剂与石杉碱甲粗品的质量比为1:3～4；

（4）石杉碱甲浓缩物用二氯甲烷溶解，溶液在-5～0℃下冷冻结晶一次，结晶6～8h，过滤得石杉碱甲晶体粗品；

（5）用二氯甲烷溶解石杉碱甲晶体粗品，并加入硅胶拌料胶，干法上样至硅胶柱中进行柱层析，用乙酸乙酯-正戊烷混合液或丙酮-正戊烷混合液洗脱，收集合并含有石杉碱甲的洗脱液，于50～60℃下减压浓缩，得到石杉碱甲半成品；

所述料胶质量比为1:20～25；乙酸乙酯-正戊烷混合液中乙酸乙酯和正戊烷体积比为2:4～5；丙酮-正戊烷混合液中丙酮和正戊烷体积比为1:5～6；

（6）将石杉碱甲半成品用氯仿或二氯甲烷溶解后，添加正戊烷结晶，过滤，晶体用重蒸氯仿溶解，在-2～2℃下结晶，过滤干燥即得石杉碱甲成品。

本发明相对于现有技术的优点和技术效果：

（1）本发明选择酸性有机溶剂作为提取溶剂，提取溶剂用量小，提取率高，提取液经过脱色、絮泥等物理方法处理后，除杂质效果明显，含量富集较快；另外、提取过程中不存在水污染的特点，非常适合于工业化生产；

（2）本发明对石杉碱甲粗品进行一次二氯甲烷单相溶剂结晶处理后，含量从1-2%迅速提高10以上，方法简单易操作，生产周期短，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广；

（3）本发明用乙酸乙酯-正戊烷混合液或丙酮-正戊烷混合液作为流动相进行一次柱层析，能有效除大量杂质并提高含量至60%以上；方法简单易操作，生产周期短，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广；

（4）本发明石杉碱甲半成品经过氯仿（或二氯甲烷）和正戊烷结晶和纯氯仿单相溶剂冷冻结晶后，含量迅速提高至少90%和98%以上，单一杂质控制在0.2-0.1%以内；此方法溶剂用量小、方法简单可控、生产周期短，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。

实施例1：本提取石杉碱甲的方法如下：

（1）以500kg、20目的干燥千层塔为原料，石杉碱甲含量0.018%，用1500L甲酸-甲醇混合溶液（甲酸与甲醇的体积比为1:500）在35℃下浸泡原料8h，过滤，滤渣再用1500L甲酸-甲醇混合溶液重复浸泡6h，过滤，收集合并滤液，旋蒸浓缩得石杉碱甲粗提物31.5kg，含量0.27%；

（2）石杉碱甲粗提物用甲醇在55℃下溶解，然后用质量浓度20%的碳酸氢钠溶液调节pH至6～7，用氯仿萃取2 次，收集氯仿层，浓缩干燥得石杉碱甲粗品，含量2.53%；

（3）石杉碱甲粗品用氯仿溶解，待其溶清后，添加脱色剂（活性炭和硅藻土按质量比1:2的比例混合制得），其中脱色剂与石杉碱甲粗品的质量比为1:3，搅拌，静置脱色10h，过滤，滤液在50℃下减压浓缩，得到石杉碱甲浓缩物，含量12.1%；

（4）石杉碱甲浓缩物用二氯甲烷溶解，溶液在0℃下冷冻结晶6h，过滤得石杉碱甲晶体粗品；含量62.3%

（5）用二氯甲烷溶解石杉碱甲晶体粗品，并加入硅胶拌料胶，干法上样至硅胶柱中进行柱层析，料胶质量比为1:20，用乙酸乙酯-正戊烷混合液（乙酸乙酯和正戊烷体积比为2:4）洗脱，收集合并含有石杉碱甲的洗脱液，于50℃下减压浓缩，得到石杉碱甲半成品，含量89.4%；

（6）将石杉碱甲半成品用氯仿溶解后，添加正戊烷结晶，过滤，晶体用重蒸氯仿溶解，在-2℃下结晶，过滤干燥即得石杉碱甲成品，含量98.6%，单一杂质0.1%。

实施例2：本提取石杉碱甲的方法如下：

（1）以500kg、10目的干燥千层塔为原料，石杉碱甲含量0.018%，用2000L甲酸-甲醇混合溶液（甲酸与甲醇的体积比为1:600）在35℃下浸泡原料8h，过滤，滤渣再用1500L甲酸-甲醇混合溶液重复浸泡6h，过滤，收集合并滤液，旋蒸浓缩得石杉碱甲粗提物32.4kg；含量0.26%；

（2）石杉碱甲粗提物用甲醇在60℃下溶解，然后用质量浓度25%的碳酸氢钠溶液调节pH至6～7，用氯仿萃取3 次，收集氯仿层，浓缩干燥得石杉碱甲粗品；含量2.61%；

（3）石杉碱甲粗品用氯仿溶解，待其溶清后，添加脱色剂（活性炭和硅藻土按质量比1:3的比例混合制得），其中脱色剂与石杉碱甲粗品的质量比为1:4，搅拌，静置脱色12h，过滤，滤液在60℃下减压浓缩，得到石杉碱甲浓缩物，含量11.8%；

（4）石杉碱甲浓缩物用二氯甲烷溶解，溶液在-2℃下冷冻结晶7h，过滤得石杉碱甲晶体粗品，含量61.1%；

（5）用二氯甲烷溶解石杉碱甲晶体粗品，并加入硅胶拌料胶，干法上样至硅胶柱中进行柱层析，料胶质量比为1:25，用乙酸乙酯-正戊烷混合液（乙酸乙酯和正戊烷体积比为2:5）洗脱，收集合并含有石杉碱甲的洗脱液，于55℃下减压浓缩，得到石杉碱甲半成品，含量90.1% ；

（6）将石杉碱甲半成品用氯仿溶解后，添加正戊烷结晶，过滤，晶体用重蒸氯仿溶解，在0℃下结晶，过滤干燥即得石杉碱甲成品，含量98.5%，单一杂质0.12%。

实施例3：本提取石杉碱甲的方法如下：

（1）以500kg、10-20目的干燥千层塔为原料，用1700L甲酸-乙醇混合溶液（甲酸与乙醇的体积比为1:450）在45℃下浸泡原料8h，过滤，滤渣再用1500L甲酸-甲醇混合溶液重复浸泡7h，过滤，收集合并滤液，旋蒸浓缩得石杉碱甲粗提物32.1kg，含量0.25%；

（2）石杉碱甲粗提物用甲醇在65℃下溶解，然后用质量浓度10%碳酸钠溶液调节pH至6～7，用二氯甲烷萃取2次，收集二氯甲烷层，浓缩干燥得石杉碱甲粗品，含量2.58%；

（3）石杉碱甲粗品用氯仿溶解，待其溶清后，添加脱色剂（活性炭和硅藻土按质量比1:2.5的比例混合制得），搅拌，静置脱色11h，过滤，滤液在55℃下减压浓缩，得到石杉碱甲浓缩物，其中脱色剂与石杉碱甲粗品的质量比为1:3.5，含量11.7%；

（4）石杉碱甲浓缩物用二氯甲烷溶解，溶液在-5℃下冷冻结晶6h，过滤得石杉碱甲晶体粗品，含量61.8%；

（5）用二氯甲烷溶解石杉碱甲晶体粗品，并加入硅胶拌料胶，干法上样至硅胶柱中进行柱层析，料胶质量比为1:22，用丙酮-正戊烷混合液（乙酸乙酯和丙酮体积比为1:5）洗脱，收集合并含有石杉碱甲的洗脱液，于60℃下减压浓缩，得到石杉碱甲半成品，含量89.8%；

（6）将石杉碱甲半成品用二氯甲烷溶解后，添加正戊烷结晶，过滤，晶体用重蒸氯仿溶解，在2℃下结晶，过滤干燥即得石杉碱甲成品，含量98.4%，单一杂质0.15%。

Claims

1.一种提取石杉碱甲的方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）以干燥粉碎的千层塔为原料，用酸性有机溶剂在35～45℃下浸泡原料，过滤，滤渣再用酸性有机溶剂重复浸泡1～2次，收集合并滤液，旋蒸浓缩得石杉碱甲粗提物；

（2）石杉碱甲粗提物用甲醇在55～65℃下溶解，然后调节pH至6～7，用氯仿或二氯甲烷萃取2～3次，收集氯仿层或二氯甲烷层，浓缩干燥得石杉碱甲粗品；

2.根据权利要求1所述的提取石杉碱甲的方法，其特征在于：酸性有机溶剂是甲酸-甲醇混合溶液或甲酸-乙醇混合溶液，其中甲酸与甲醇或乙醇的体积比为1:450～600。

3.根据权利要求1所述的提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（2）中用质量浓度20～25%碳酸氢钠溶液或质量浓度10～12%碳酸钠溶液调节pH值。

4.根据权利要求1所述的提取石杉碱甲的方法，其特征在于：脱色剂为活性炭和硅藻土按质量比1:2～3的比例混合制得。

5.根据权利要求1所述的从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（3）中脱色剂与石杉碱甲粗品的质量比为1:3～4。

6.根据权利要求1所述的从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：步骤（5）中料胶质量比为1:20～25。

7.根据权利要求1所述的从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：乙酸乙酯-正戊烷混合液中乙酸乙酯和正戊烷体积比为2:4～5。

8.根据权利要求1所述的从千层塔中提取石杉碱甲的方法，其特征在于：丙酮-正戊烷混合液中丙酮和正戊烷体积比为1:5～6。