CN107502574A - 一株降解氨基甲酸乙酯及其前体的地衣芽孢杆菌 - Google Patents

一株降解氨基甲酸乙酯及其前体的地衣芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株降解氨基甲酸乙酯及其前体的地衣芽孢杆菌，属于微生物技术领域。本发明的地衣芽孢杆菌已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017300，保藏地址为中国武汉武汉大学。该菌具有同时产酸性脲酶与EC水解酶的特性，脲酶的产量为0.23U/mL，EC水解酶产量为0.27U/mL，并且在酒醅固态发酵过程中能减少10％的瓜氨酸。该菌能有效减少氨基甲酸乙酯前体的生成，并可直接降解发酵食品中的氨基甲酸乙酯，具有预防癌症的效果。

Description

一株降解氨基甲酸乙酯及其前体的地衣芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及一株降解氨基甲酸乙酯及其前体的地衣芽孢杆菌，属于微生物技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种致癌物质，广泛存在于发酵食品和酿造酒中，具有致癌性。2007年4月10日，世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物，与丙烯酰胺同等危险。氨基甲酸乙酯的存在，给发酵食品和酿造酒带来了安全隐患。
目前降低EC的方法主要有：1、控制EC生产条件，2、控制前体物质的生成，3、使用EC水解酶直接去除。而由于白酒这个特殊体系以及特殊工艺，还没有商品化的EC水解酶可供使用，并且在生产条件上进入瓶颈期。研究发现，白酒中EC主要由乙醇与尿素、瓜氨酸等氨甲酰基化合物在加热条件下反应形成。所以可通过控制前体物质的生成达到减少EC的目的。通过生物干扰降低酒中氨基甲酸乙酯及其前体是降低白酒中氨基甲酸乙酯的有效措施。
目前用于降低白酒中氨基甲酸乙酯的菌株，只能降解其中一种或两种物质，不能全面降低氨基甲酸乙酯的含量。
本发明所涉及的菌株，来源于酒醅，并且能够减少EC的前体物质，同时还产EC水解酶，这与之前的菌株只能降解其中一种或两种物质相比，有比较好的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一株降解氨基甲酸乙酯及其前体物质瓜氨酸和尿素的地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)DX530，已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017300，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明的第二个目的是提供所述地衣芽孢杆菌DX530生产的酸性脲酶。
本发明的第三个目的是提供所述酸性脲酶的制备方法。
在本发明的一种实施方式中，所述酸性脲酶的制备方法是将地衣芽孢杆菌DX530接种至MRS培养基中，35-38℃培养20-30h，取培养液洗涤离心重悬，破壁后得到。
本发明的第四个目的是提供所述地衣芽孢杆菌DX530在白酒发酵中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将地衣芽孢杆菌DX530加入到入窖酒醅中进行厌氧发酵。
本发明的第五个目的是提供所述地衣芽孢杆菌DX530在发酵食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括：降解发酵食品中存在的氨基甲酸乙酯和其前体物质。
本发明的第六个目的是提供一种包含所述地衣芽孢杆菌DX530的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
本发明有益效果
本发明提供的地衣芽孢杆菌DX530，具有产EC水解酶且产酸性脲酶的特性，脲酶的产量为0.23U/mL，氨基甲酸乙酯水解酶产量为0.27U/mL，在酒醅固态发酵过程中减少10％的瓜氨酸，其能有效减少氨基甲酸乙酯前体的生成，并可直接降解发酵食品中的氨基甲酸乙酯。生物材料保藏
一株地衣芽孢杆菌，其分类学命名为地衣芽孢杆菌DX530BacillusLicheniformis DX530已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017300，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1为氨浓度和OD578的标准曲线；
图2为地衣芽孢杆菌DX530在ADI途径中三个关键基因的验证；
图3为酒醅中瓜氨酸含量检测；
图4为酒醅中尿素含量检测；
图5为酒醅中EC含量检测。
具体实施方式
脲酶的测定：
(1)标准曲线的绘制：以水为空白对照，以0.1mol/L的氯化铵为母液，分别稀释制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L的标准溶液，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应。终止反应后加入1mL显色剂I和1mL显色剂II，混匀后在37℃保温20min，反应结束后用超纯水定容10mL，测定625nm吸光值。制备标准曲线如图1所示。
(2)发酵液检测：取1mL酶液加入1mL 3％的尿素于37℃反应15min后，加入1mL10％三氯乙酸终止反应。终止反应后加入1mL显色剂I和1mL显色剂II，混匀后在37℃保温20min，反应结束后用超纯水定容至10mL，紫外分光光度计测定625nm吸收值，并通过标准曲线计算菌株的酶活。
显色剂I：苯酚15g和15g亚硝基铁氰化钠15g，超纯水定容至250mL，4℃备用。
显色剂II：NaOH 13.125g和7.5mL次氯酸钠，超纯水定容至250mL，4℃备用。
氨基甲酸乙酯水解酶的测定：
取1mL酶液加入1mL3％的尿素于37℃反应15min后，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应。终止反应后加入1mL显色剂I和1mL显色剂II，混匀后在37℃保温20min，反应结束后用超纯水定容至10mL，紫外分光光度计测定578nm吸收值，并通过标准曲线计算菌株的酶活。
酶活计算方法：
公式
A：紫外分光光度值；n：稀释倍数；k：标准曲线斜率
实施例1：地衣芽孢杆菌DX530的筛选
酒醅中微生物的分离：将新鲜的酒醅与无菌生理盐水以适当比例混合，混合液梯度稀释并涂布于MRS平板上。MRS平板置于37℃/30℃培养24h直至有单菌落出现；
瓜氨酸利用菌株的分离：将MRS平板上所分离得到的菌株，分别均匀的转接点种到含有瓜氨酸利用培养基的96深孔板，置于37℃培养24h。
具有瓜氨酸利用能力菌株的筛选：离心并收集200μL上清液于96孔板中，用排枪分别加入300μL含Fe3+离子混酸和50μL的二乙酰一肟-硫氨脲溶液，二乙酰一肟在酸性条件下转化为丁二酮(双乙酰)，丁二酮与尿素在强酸条件下缩合成红色二嗪化合物，由于瓜氨酸分子中含有一个脲基，故和尿素一样可以发生以上颜色反应，根据颜色变化来判断菌株是否利用瓜氨酸。
将初筛菌株划线得单菌，在MRS液体培养基中于37℃摇床培养24h，收集菌体，提取基因组，采用通用引物进行16s rDNA扩增，在NCBI数据库中进行序列比对。该菌已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017300，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2：地衣芽孢杆菌DX530产酶能力分析
将初筛菌株在MRS培养基中进行液体培养，37℃静置培养24h，取50mL菌液4000rpm/min，10min，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液清洗两遍，最后用50mL缓冲液重悬浮，冰浴30min，机械破壁120s，得粗酶液。
对粗酶液中的脲酶酶活和氨基甲酸乙酯水解酶的酶活进行测定，结果显示，脲酶酶活为0.23U/mL，氨基甲酸乙酯水解酶活为0.27U/mL。
实施例3：地衣芽孢杆菌DX530精氨酸脱亚氨酶途径关键基因验证
以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，用表1引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系为：基因组DNA 1μL，2×Primer star 25μL，上下游通用引物各1μL，最后补充双蒸水至50μL。反应条件为：反应前95℃预变性3min，后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，共34个循环，72℃延伸10min。验证结果如图2所示。
表1.本发明中验证ADI途径所用引物
实施例4：地衣芽孢杆菌特性分析
将地衣芽孢杆菌在MRS培养基进行液体培养，37℃静置培养24h。
(1)取10mL菌液，离心，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液清洗两遍，最后用5mL缓冲液重悬浮，加入到含有80mg/L的瓜氨酸MRS培养基中，以添加等体积的生理盐水的MRS液体培养基为对照，培养过夜。取发酵液，取1mL上清液，用0.22μm水系滤膜过滤后HPLC测定。
(2)取10mL菌液，离心，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液清洗两遍，最后用5mL缓冲液重悬浮，加入到含有2g/L的尿素MRS培养基中，以添加等体积的生理盐水的MRS液体培养基为对照，培养过夜。取发酵液待测样品400μL，加600μL占顿醇溶液，加100μL盐酸溶液，混匀后，暗反应30min。反应后溶液过0.22μm有机滤膜，HPLC进样测定。
(3)取10mL菌液，离心，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液清洗两遍，最后用5mL缓冲液重悬浮，加入到含有1mg/L的氨基甲酸乙酯的MRS培养基中，以添加等体积的生理盐水的MRS液体培养基为对照，培养过夜。取发酵液待测样品2mL，加入100μL氨基甲酸乙酯-d5(EC-d5)稀释液，混合均匀后转移到氨基甲酸乙酯萃取小柱，浸润10min。用20mL二氯甲烷分多次冲洗柱子，使二氯甲烷缓慢流出，用底部带有刻度的收集瓶收集萃取柱中流出的二氯甲烷萃取液。将萃取液氮吹至剩余0.5mL溶液。再加入1.5mL甲醇混匀，将混合液移入液相瓶，GC/MS测定。发酵前后各物质检测结果如表2所示。
表2发酵前后各物质检测结果
实施例5：地衣芽孢杆菌在发酵食品中的应用
模拟发酵：将菌株培养至对数后期，9000r/min离心，并用生理盐水洗涤两次后重悬，分别以1×107CFU/g、1×108CFU/g和1×109CFU/g的接种量加入入窖酒醅中，充分搅拌混匀，以添加等体积的生理盐水的酒醅为对照，每个实验组三个平行，放置恒温培养箱中，30℃厌氧条件下培养，分别于5d，10d，20d，30d，45d，60d，70d取样。
瓜氨酸的测定：称取不同天数的窖内发酵酒醅10g，加入10mL超纯水，并于超声震荡器中超声均质15min，将混合液于8000r/min离心10min，取1mL上清液，用0.22μm水系滤膜过滤后HPLC测定。实验结果见图3，结果显示，在发酵结束时，酒醅中瓜氨酸含量与发酵起始点相比，减少了11％。
尿素的测定：称取不同天数的窖内发酵酒醅10g，加入10mL超纯水，并于超声震荡器中超声均质15min，将混合液于8000r/min离心10min，取待测样品400μL，加600μL占顿醇溶液，加100μL盐酸溶液，混匀后，暗反应30min。反应后溶液过0.22μm有机滤膜，HPLC进样测定。实验结果见图4，结果显示，在发酵结束时，酒醅中尿素含量与发酵起始点相比，减少了10％。
EC的测定：称取不同天数的窖内发酵酒醅10g，加入10mL超纯水，并于超声震荡器中超声均质15min，将混合液于8000r/min离心10min，取待测样品2mL，加入100μL氨基甲酸乙酯-d5(EC-d5)稀释液，混合均匀后转移到氨基甲酸乙酯萃取小柱，浸润10min。用20mL二氯甲烷分多次冲洗柱子，使二氯甲烷缓慢流出，用底部带有刻度的收集瓶收集萃取柱中流出的二氯甲烷萃取液。将萃取液氮吹至剩余0.5mL溶液。再加入1.5mL甲醇混匀，将混合液移入液相瓶，GC/MS测定。实验结果见图5，结果显示，在发酵结束时，酒醅中EC含量与发酵起始点相比，减少了16％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株降解氨基甲酸乙酯及其前体的地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)DX530，已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017300，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.一种酸性脲酶，其特征在于，所述脲酶是由权利要求1所述地衣芽孢杆菌DX530制备得到。
3.一种权利要求2所述酸性脲酶的制备方法。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述脲酶的制备方法是将地衣芽孢杆菌DX530接种至MRS培养基中，35-38℃培养20-30h，取培养液洗涤离心重悬，破壁后得到。
5.权利要求1所述地衣芽孢杆菌DX530在白酒发酵中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述应用是将地衣芽孢杆菌DX530加入到入窖酒醅中进行厌氧发酵。
7.权利要求1所述地衣芽孢杆菌DX530在发酵食品中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用包括：降解发酵食品中存在的氨基甲酸乙酯和其前体物质。
9.一种包含权利要求1所述地衣芽孢杆菌DX530的微生物菌剂。
10.权利要求9所述微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
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