CN117050909A - 一种醒酒解毒的益生菌发酵物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品药品加工技术领域，具体涉及一种醒酒解毒的益生菌发酵物及其应用。为寻找持续性好、高效的醒酒解毒产品，本发明通过多次筛选，得到一株具有醒酒解毒作用的益生菌—植物乳植杆菌Fd‑01，再利用该菌对人参进行发酵，通过植物乳植杆菌对人参进行深度发酵酶解成小分子肽，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，极大地提升了多肽含量，人体食用此发酵物后，能快速被人体吸收，高效解酒醒酒、防止毒素积累，预防酒后宿醉。本发明为开发持续性好、高效的醒酒解毒产品提供了新的思路，具有重要的潜在应用价值。

Description

一种醒酒解毒的益生菌发酵物及其应用
技术领域
本发明属于食品药品加工技术领域，具体涉及一种醒酒解毒的益生菌发酵物及其应用。
背景技术
研究表明，酒在人体内80％是由十二指肠及空肠吸收，其余被胃吸收，被吸收的酒精在5min作用后会出现在血液中，由血液迅速传递到各脏器及组织中进行代谢及累积。酒精对人体的脏器会造成不同程度的损伤：(1)酒精在肝脏会代谢产生乙醛，乙醛会损伤肝脏细胞的微结构，损伤线粒体，导致肝间质的纤维组织增生。肝内微粒体氧化酶对酒精的代谢干扰了细胞内的氧化还原反应，导致肝细胞内的蛋白质、脂肪、碳水化合物发生代谢紊乱，诱发酒精中毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化等疾病；(2)酒精具有脂溶性，能破坏黏膜的防御系统，诱发胃溃疡、慢性胃炎、消化不良、胃癌等疾病；(3)由于酒精本身及其代谢物乙醛的细胞毒性作用，容易导致胰腺实质性损伤及纤维化，胰液粘稠，蛋白沉淀，诱发急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺结石等疾病；(4)酒精是中枢神经系统的抑制剂，容易诱发酒精中毒性神经病，导致大脑萎缩和脑室扩大，对人体的记忆力、注意力、判断力、机能及情绪反应都有严重影响；(5)酒精会延缓血液脂肪的清除，诱发动脉粥样硬化、脑出血、心肌梗死等疾病。
随着社会的发展，人们由于工作和生活的需要，会频繁摄入酒精，再搭配食用解酒产品，加速酒精的吸收，减少酒精在身体内的累积。目前，市面上的解酒产品虽然具有解酒醒酒效果，但是在食用后能保持的醒酒时间较短，需要频繁食用，醒酒的效率低，且没有解毒的效果。因此，积极寻找持续性好、高效的醒酒解毒产品至关重要。
益生菌的菌体内含有多种多样的酶类，能够通过体外发酵酶解物中的蛋白质，产生相对分子质量更小的小分子肽，这些小分子肽经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，这些多肽浓缩物因其分子量小于蛋白质而具有较高的生物利用度。同时，部分益生菌的多肽浓缩物具有独特的生物活性，在食用后能快速被人体利用，促进酒精的吸收，抑制酒精代谢产生乙醛等有毒物质，有利于清理血液的毒素。因此，挖掘具有醒酒解毒作用的益生菌及其多肽浓缩物，有利于开发新的高效解酒产品。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明筛选得到一株具有醒酒解毒作用的益生菌—植物乳植杆菌Fd-01，再利用该菌对人参进行发酵，进而极大地提升了其多肽含量，使其能快速被人体吸收，从而达到高效持久的解酒醒酒效果，具有广阔的应用前景。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种醒酒解毒的益生菌，所述益生菌为植物乳植杆菌Fd-01，保藏编号为CGMCC No.27643。
植物乳植杆菌Fd-01能高效、有效地促进酒精的吸收，抑制酒精代谢产生乙醛，减少酒精累积，有利于降低人体血液、组织、器官中的酒精含量，起到醒酒解毒的作用。同时，本发明提供的植物乳植杆菌Fd-01能对人参进行深度发酵酶解成小分子肽，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，极大地提升了多肽含量，人体食用此发酵物后，能快速被人体吸收，高效解酒醒酒、防止毒素积累，预防酒后宿醉，疗效显著，健康安全。
本发明第二方面提供了一种醒酒解毒的益生菌发酵物，由第一方面所述的植物乳植杆菌Fd-01对人参进行发酵后制得，所述人参为有3-5年生长期的新鲜人参及茎叶组织。
人参根部和茎叶样品中分别含有2732和3608个不同功能活性的蛋白质。人参蛋白具有调节机体免疫功能、抗疲劳、解毒等作用，通过植物乳植杆菌发酵酶解成小分子肽后，能快速被人体吸收，高效解酒醒酒、防止毒素积累，预防酒后宿醉，从而实现快速且持久地实现醒酒解毒的效果。
本发明第三方面提供了第二方面所述的醒酒解毒的益生菌发酵物的制备方法，包括以下步骤：
S1、菌种培养：将植物乳植杆菌Fd-01接种于液体种子培养基中，37-38℃培养2-3d，得菌液，记为基料A；
S2、破壁：将人参破壁至80-120目，得基料B；
S3、粗蛋白提取：用不同梯度pH的NaOH溶液对基料B进行浸提，收集沉淀后经干燥即得人参粗蛋白，记为基料C；
S4、溶解：将基料C用水溶解、调匀后得基料D；
S5、接种及发酵：将基料A接种于基料D中，分批次进行发酵后得到基料H；
S6、提纯、干燥及粉碎：将基料H用膜透析法提纯后，经干燥、粉碎即得益生菌发酵物—人参肽。
优选地，S1中，所述液体种子培养基包括葡萄糖30g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 0.1g/L，KH2PO4 0.5g/L，CaCO3 25g/L，pH 5.8。
优选地，S3粗蛋白提取的具体操作为：以基料B与NaOH的质量体积比为(1～2)：(8～12)的比例将基料B溶于0.1～0.2mol/L NaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于1000×g～3000×g的条件下离心15～25min，再用0.1～0.2mol/L HCl调节pH至4～5，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3～4次，于40～50℃的条件下干燥1～2h，得人参粗蛋白，记为基料C。
优选地，S5接种及发酵的具体操作为：按基料A与基料D的质量比为(1～2)：(20～30)的比例称取基料A，先将1/3份基料A接种于基料D中，37～38℃的条件下恒温培养1～2d，分离上清液F1及沉淀物F2(一次发酵)；再将F2用10～30份水溶解，并加入另1/3份基料A，于37～38℃的条件下恒温培养1～2d，分离上清液E1及沉淀物E2；最后将E2用10～30份水溶解，并加入其余1/3份基料A，于37～38℃的条件下恒温培养1～2d，分离上清液G1及沉淀物G2(三次发酵)；将F1、E1、G1、G2合并，调匀后得基料H。
优选地，S6的提纯为：将基料H用1kD透析袋于3-4℃下透析24-36h，期间换液3次，得基料I，再将基料I加入到10kD超滤管内，5000-6000r/min离心1-2h，最后收集管底液，得到基料J。
优选地，S6的干燥为冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻2-3h，抽真空至0.1-0.3MPa，加热升华干燥24-36h，至水分升华完全，得基料K。
优选地，S6的粉碎为将基料K用粉碎机粉碎至90-120目。
优选地，还包括菌种活化步骤：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体种子培养基的试管中培养约18-36h。
本发明第四方面提供了第一方面所述的醒酒解毒的益生菌和/或第二方面所述的醒酒解毒的益生菌发酵物在制备醒酒解毒产品中的应用。
优选地，所述醒酒解毒产品包括醒酒解毒食品、醒酒解毒保健品、醒酒解毒药品和醒酒解毒营养补充剂。
所述醒酒解毒产品可以包括保健品、药品，产品形态可以为液态或固态，可以为粉剂、口服液、悬浮液、膏状物、片剂、颗粒剂等。
优选地，所述益生菌为活菌体或灭活型菌体。
本发明第五方面提供了一种人参肽口服液，所述人参肽口服液包括第二方面所述的醒酒解毒的益生菌发酵物、低聚果糖和水，所述益生菌发酵物的添加量为口服液总重量的1.0％-1.5％。
优选地，水与低聚果糖的质量比为70-90：15-30。
本发明第六方面提供了一种醒酒解毒益生菌粉，包括活菌型植物乳植杆菌Fd-01菌粉或灭活型植物乳植杆菌1-5份，低聚果糖50-99份。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明筛选得到一株具有醒酒解毒作用的益生菌—植物乳植杆菌Fd-01，再利用该菌对人参进行发酵，通过植物乳植杆菌对人参进行深度发酵酶解成小分子肽，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，极大地提升了多肽含量，人体食用此发酵物后，能快速被人体吸收，高效解酒醒酒、防止毒素积累，预防酒后宿醉。本发明为开发持续性好、高效的醒酒解毒产品提供了新的思路，具有重要的潜在应用价值。
一方面，本发明所提供的醒酒解毒益生菌—植物乳植杆菌Fd-01，能高效、有效地促进酒精的吸收，抑制酒精代谢产生乙醛，减少酒精累积，有利于降低人体血液、组织、器官中的酒精含量，起到醒酒解毒的作用。特别地，在饮酒前0.5h-1h食用本品，仍能保持较好的解酒效果。
另一方面，本发明所提供的益生菌发酵物具有醒酒解毒的功效，通过植物乳植杆菌对人参进行深度发酵酶解成小分子肽，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，极大地提升了多肽含量，人体食用此发酵物后，能快速被人体吸收，高效解酒醒酒、防止毒素积累，预防酒后宿醉。特别地，无论是在饮酒前2h还是饮酒后任何时间段食用本品，仍能保持显著的解酒效果，高效性和持久性得到显著提升，有效避免酒精对机体的毒害作用，有效减少人体频繁食用解酒产品。
另外，本发明所提供的益生菌发酵物采用了创新的工艺，首先经过多次筛选获得能够定向醒酒解毒的益生菌菌株，再将其接种到人参粗蛋白中进行密集分批次发酵酶解，进而获得丰富的小分肽，再经过膜分离技术进行提纯，整个工艺非常高效，且节能环保。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下述实施方式涉及的益生菌中，植物乳植杆菌Fd-01为自己保藏的菌株，其他菌株均购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体保藏信息如下：
植物乳植杆菌Fd-01，保藏编号为CGMCC No.27643，分类命名为：植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2023年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
植物乳植杆菌JYLP-326，保藏编号为CGMCC No.18038，分类命名为：植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
植物乳植杆菌JYLP-375，保藏编号为CGMCC No.18039，分类命名为：植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
动物双歧杆菌乳亚种JYBR-390，保藏编号为CGMCC No.18093，分类命名为：动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
干酪乳酪杆菌JYLC-374，保藏编号为CGMCC No.18096，分类命名为：干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
唾液链球菌嗜热亚种JYST-26，保藏编号为CGMCC No.18045，分类命名为：唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
罗伊氏粘液乳杆菌JYLB-291，保藏编号为CGMCC No.18041，分类命名为：罗伊氏粘液乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
长双歧杆菌长亚种JBLC-141，保藏编号为CGMCC No.18094，分类命名为：长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
唾液联合乳杆菌JYLS-372，保藏编号为CGMCC No.18044，分类命名为：唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus Salivarius)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
嗜酸乳杆菌JYLA-191，保藏编号为CGMCC No.21371，分类命名为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，于2020年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
实施例1醒酒解毒益生菌的筛选
一、醒酒益生菌菌种的筛选：
1、实验菌株
动物双歧杆菌乳亚种JYBR-390、干酪乳酪杆菌JYLC-374、唾液链球菌嗜热亚种JYST-26、罗伊氏粘液乳杆菌JYLB-291、植物乳植杆菌Fd-01、长双歧杆菌长亚种JBLC-141、唾液联合乳杆菌JYLS-372、嗜酸乳杆菌JYLA-191，分别编号为A-H。
2、培养基及溶液制备：
(1)培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 0.1g/L，KH2PO4 0.5g/L，CaCO3 25g/L，pH 5.8，于121℃灭菌20min；
(2)酒精培养液：将酒精加入培养基中，调整体积浓度为10％、20％、40％，待用；
(3)酒精溶液：称取适量酒精于容量瓶中，用蒸馏水调整体积浓度为20％、40％、80％，待用。
3、菌液制备：将菌株于38℃厌氧培养48h，调整菌液浓度为107CFU/mL，待用。
4、具体筛选方法包括以下步骤：
(1)分别量取A-H的菌液各5mL，置于离心管中，在3000r/min的条件下离心15min，过滤，得到菌体，再将菌体与5mL酒精培养液充分混匀，于38℃厌氧培养箱中进行培养，分别在0min、15min、30min、45min、60min时测定乙醇浓度，其中，以不加菌体的酒精培养液作为空白对照，采用气相色谱法测定，结果如表1所示。
(2)A组：分别量取A-H的菌液各5mL，与5mL酒精溶液充分混匀，使乙醇最终浓度为10％、20％、40％；B组：分别量取5mL培养基，与5mL酒精溶液充分混匀，使乙醇最终浓度为10％、20％、40％，将A组与B组分别于38℃厌氧培养箱中进行培养，分别在0min、15min、30min、45min、60min时测定乙醇浓度，其中，以不加菌液的酒精培养液作为空白对照，采用气相色谱法测定，结果如表2所示。
其中，气相色谱法测定乙醇浓度的操作步骤如下：
1)色谱条件：以6％氰丙基苯基-94％二甲基硅氧烷为固定相；先以40℃的起始温度维持5分钟，并以每分钟10℃速率升至90℃，维持3分钟，再以20℃/min升至160℃，维持2min；进样口温度为150℃；检测器温度为250℃。流速为5.0mL/min，顶空瓶平衡温度为85℃，平衡时间为25min。
2)将待测样品在3000r/min的条件下离心15min，过滤得上清液，用聚偏氟乙烯微孔滤膜(0.45μm)过滤后，精密称取400mg置于10mL量瓶中，加DMA(二甲基乙酰胺)混匀并稀释至刻度线，取1.0mL置于10mL顶空瓶中，密封，作为供试品溶液，通过气相色谱法测定其成分及含量。
(3)精密称取无水乙醇20mg，置于已有10mL DMA的100mL量瓶中，加DMA稀释至刻度，取1.0mL置于20mL顶空瓶中，密封，作为对照品溶液；
(4)取供试品溶液和对照品溶液1.0mL分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
(5)案子同样的方法，同样的条件，通过自动进样法测定分析纯的乙醛、乙酸，得到其色谱峰，并记录各色谱峰的保留时间。
6、实验结果
(1)向乙醇培养液加入菌体的实验结果
由表1可知，加入菌体后，随着时间的变化，培养液中的酒精都能不同程度地被消耗，酒精浓度降低，且不同的菌种表现出来的解酒能力不同，其中，E组菌体表现最佳，在15min时，能够使10％酒精浓度的培养液的酒精浓度降低至1.7％；在30min时，能够使10％酒精浓度的培养液的酒精浓度降低至0.2％，即植物乳植杆菌Fd-01能高效、有效地消耗酒精，有利于降低人体血液、组织、器官中的酒精含量，起到醒酒的作用。
表1加入菌体后培养液中的乙醇浓度
(2)向培养好的菌液加入乙醇溶液的实验结果
由表2可得知，随着时间的变化，在含有菌液的溶液中，乙醇浓度有不同程度地降低，且不同菌种表现出来的解酒能力不同，其中，E组菌液表现最佳，在15min时，能够使10％酒精浓度的菌液的酒精浓度降低至1.4％；在30min时，能够使10％酒精浓度的菌液的酒精浓度降低至0.0％，即植物乳植杆菌Fd-01的菌液能快速减少酒精浓度，有利于降低人体血液、组织、器官中的酒精含量，起到醒酒的作用。结合表1的数据，对比其他菌种，植物乳植杆菌的解酒能力表现最好，且已培养好的菌液醒酒能力比菌体更好。因此，选择乳植杆菌属进行下一步研究。
表2菌液中的乙醇浓度
二、醒酒解毒的乳植杆菌属菌株筛选
1、实验菌株
植物乳植杆菌JYLP-326，植物乳植杆菌JYLP-375，植物乳植杆菌Fd-01，分别编号为I-K。
2、菌液制备：将菌株于38℃厌氧培养48h，调整菌液浓度为107CFU/mL，待用。
3、筛选操作具备包括以下步骤：
(1)取10mL菌液置于离心管中，在3000r/min的条件下离心15min，分别得到发酵上清液和菌体；
(2)将菌体与浓度为20％的乙醇溶液充分混匀后于38℃厌氧培养箱中进行培养；将发酵上清液5mL与5mL 40％浓度的乙醇溶液于38℃厌氧培养箱中进行培养；
(3)分别在0min、5min、10min、15min、20min后采用气相色谱法测定乙醇、乙醛、乙酸的浓度，结果如表3所示。
4、实验结果
由表3可知，随着时间的变化，溶液中乙醇和乙醛的浓度都有不同程度的降低，乙酸浓度无显著性变化，且发酵上清液降低乙醇和乙醛浓度的能力优于菌体，说明菌株的代谢产物含有丰富的小分子肽，能很好地吸附和消耗酒精，并抑制酒精转化成乙醛和乙酸，减少毒素累积。其中植物乳植杆菌Fd-01醒酒解毒的能力优于其他植物乳植杆菌，在5min时，菌体和发酵上清液均能把乙醛浓度降至0％，菌体在20min时能够把酒精浓度将至0％，其发酵上清液在15min时能够把酒精浓度将至0％，因此，初步筛选出植物乳植杆菌Fd-01作为醒酒解毒的益生菌株进行下一步研究。
表3添加酒精的菌体及发酵上清液中各指标的浓度
实施例2醒酒解毒益生菌发酵物及口服液的制备
一、植物乳植杆菌Fd-01发酵制备人参肽
1、植物乳植杆菌Fd-01添加量对发酵效果的影响
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入5％(体积分数)活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为0.0：100、2.0：100、4.0：100、6.0：100、8.0：100、10.0：100，取1/3份基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E，此处基料A的添加比例分别记为基料A1～6；
(7)发酵：一次发酵，即将基料E于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液F1及沉淀物F2；二次发酵，将F2用30重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤(6)中的另外1/3份基料A，于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液E1及沉淀物E2；三次发酵，将E2用20重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤(6)中的最后1/3份基料A，于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液G1及沉淀物G2。将F1、E1、G1、G2合并，调匀后得基料H；
(8)提取：将基料H用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽(人参肽1～6)。
根据中华人民共和国国家标准QB/T 5298-2018(低聚肽含量测定方法)对益生菌发酵制品的低聚肽进行含量检测，结果如表4。
根据中华人民共和国国家标准QB/T 5298-2018(相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物所占比例的测定方法)对益生菌发酵制品的蛋白质水解物(相对分子质量小于1000u)进行含量检测，结果如表5。
由表4可知，随着植物乳植杆菌Fd-01接种量的增加，人参肽中的低聚肽和蛋白质水解物的含量也在不断增加，说明Fd-01能将人参蛋白酶解成小分子肽，当接种量为4％时，蛋白质酶解成低聚肽的量达到平稳状态，当接种量为8％时，蛋白质水解物的量达到平稳状态。因此，选择人参肽5的添加量作为益生菌发酵人参的最佳添加量。
表4人参肽的相关指标
指标含量/％ 人参肽1 人参肽2 人参肽3 人参肽4 人参肽5 人参肽6
低聚肽 58.12％ 67.01％ 79.20％ 95.35％ 95.37％ 95.38％
蛋白质水解物 26.00％ 38.40％ 50.82％ 68.47％ 82.51％ 83.14％
2、发酵次数对发酵效果的影响
A、人参肽7的制备(一次发酵工艺)：
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为8.0：100，取基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E；
(7)发酵：将基料E于38℃的条件下恒温培养2d，得基料F1；
(8)提取：将基料F1用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽7。
B、人参肽8的制备(二次发酵工艺)：
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为8.0：100，取1/2份基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E；
(7)发酵：一次发酵，即将基料E于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液F1及沉淀物F2；二次发酵，将F2用30重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的另外1/2份基料A，于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液E1及沉淀物E2。将F1、E1、E2合并，调匀后得基料H；
(8)提取：将基料H用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽8。
C、人参肽9的制备(四次发酵工艺)：
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为8.0：100，取1/4份基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E；
(7)发酵：一次发酵，即将基料E于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液F1及沉淀物F2；二次发酵，将F2用30重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的另外1/4份基料A，于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液E1及沉淀物E2；三次发酵，将E2用20重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的另外1/4份基料A，于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液G1及沉淀物G2；四次发酵，将G2用20重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的最后1/4份基料A，于38℃的条件下恒温培养2d，分离上清液Z1及沉淀物Z2。将F1、E1、G1、Z1、Z2合并，调匀后得基料H；
(8)提取：将基料H用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽9。
根据中华人民共和国国家标准QB/T 5298-2018(低聚肽含量测定方法)对益生菌发酵制品的低聚肽进行含量检测，结果如表5。
根据中华人民共和国国家标准QB/T5298-2018(相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物所占比例的测定方法)对益生菌发酵制品的蛋白质水解物(相对分子质量小于1000u)进行含量检测，结果如表5。
表5人参肽的相关指标
指标含量/％ 人参肽7 人参肽8 人参肽9
低聚肽 45.70％ 73.24％ 96.23％
蛋白质水解物 18.92％ 39.83％ 81.48％
结合表5和人参肽5的制备工艺可知，随着发酵次数的增加，人参肽的低聚肽含量、蛋白质水解物含量逐渐增加，当到达发酵次数到达一定次数时，人参肽的低聚肽含量、蛋白质水解物含量趋于稳定。实验结果显示，人参肽5和人参肽9的低聚肽含量、蛋白质水解物含量显著高于人参肽7和人参肽8，人参肽5与人参肽9的低聚肽含量、蛋白质水解物含量无显著性差异，因此，选择人参肽的发酵次数作为最佳发酵次数，即最佳发酵次数为3次。
3、发酵温度对发酵效果的影响
A、人参肽10的制备：
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为8.0：100，取1/3份基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E；
(7)发酵：一次发酵，即将基料E于32℃的条件下恒温培养2d，分离上清液F1及沉淀物F2；二次发酵，将F2用30重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的另外1/3份基料A，于32℃的条件下恒温培养2d，分离上清液E1及沉淀物E2；三次发酵，将E2用20重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的最后1/3份基料A，于32℃的条件下恒温培养2d，分离上清液G1及沉淀物G2。将F1、E1、G1、G2合并，调匀后得基料H；
(8)提取：将基料H用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽10。
B、人参肽11的制备：
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为8.0：100，取1/3份基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E；
(7)发酵：一次发酵，即将基料E于35℃的条件下恒温培养2d，分离上清液F1及沉淀物F2；二次发酵，将F2用30重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的另外1/3份基料A，于35℃的条件下恒温培养2d，分离上清液E1及沉淀物E2；三次发酵，将E2用20重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的最后1/3份基料A，于35℃的条件下恒温培养2d，分离上清液G1及沉淀物G2。将F1、E1、G1、G2合并，调匀后得基料H；
(8)提取：将基料H用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽11。
C、人参肽12的制备：
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为8.0：100，取1/3份基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E；
(7)发酵：一次发酵，即将基料E于41℃的条件下恒温培养2d，分离上清液F1及沉淀物F2；二次发酵，将F2用30重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的另外1/3份基料A，于41℃的条件下恒温培养2d，分离上清液E1及沉淀物E2；三次发酵，将E2用20重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的最后1/3份基料A，于41℃的条件下恒温培养2d，分离上清液G1及沉淀物G2。将F1、E1、G1、G2合并，调匀后得基料H；
(8)提取：将基料H用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽12。
D、人参肽13的制备：
(1)菌种活化：将冻干管低温保藏的植物乳植杆菌Fd-01接种至装有液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】的试管中培养约24h，得活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液；
(2)摇瓶种子培养：取1支试管，加入100mL液体培养基【(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO40.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO325，pH5.8，于121℃灭菌20min】中，接入活化后的植物乳植杆菌Fd-01菌液，38℃摇瓶震荡培养2d，得菌液，将菌液于8000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，沉淀即为菌泥，记为基料A；
(3)破壁：将人参(有5年生长期的新鲜人参及茎叶组织)用破壁机打浆至100目，细腻无颗粒，得基料B；
(4)粗蛋白提取：以基料B：NaOH的质量体积比为1：10的比例将基料B溶于0.1mol/LNaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于2000xg的条件下离心15min，用0.1mol/L HCl调节pH至4.7，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3次，于50℃的条件下干燥1h，得人参粗蛋白，记为基料C；
(5)溶解：将基料C用50重量份无菌水(基料C：无菌水＝1:50)溶解、调匀得基料D；
(6)接种：按一定配比称取植物乳植杆菌Fd-01(基料A)和人参粗蛋白水溶液(基料D)，植物乳植杆菌Fd-01与基料D的质量比为8.0：100，取1/3份基料A接种于基料D中，搅匀，得基料E；
(7)发酵：一次发酵，即将基料E于44℃的条件下恒温培养2d，分离上清液F1及沉淀物F2；二次发酵，将F2用30重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的另外1/3份基料A，于44℃的条件下恒温培养2d，分离上清液E1及沉淀物E2；三次发酵，将E2用20重量份无菌水溶解，调匀后加入步骤6中的最后1/3份基料A，于44℃的条件下恒温培养2d，分离上清液G1及沉淀物G2。将F1、E1、G1、G2合并，调匀后得基料H；
(8)提取：将基料H用1kD透析袋于4℃下透析24h，期间换液3次，得基料I。将基料I加入到10kD超滤管内，5000r/min离心1h，收集管底液，得基料J；
(9)冻干：将基料J于-40℃的条件下预冻3h，抽真空至0.19MPa，加热升华干燥28h，至水分升华完全，得基料K；
(10)将基料K用粉碎机粉碎至100目，即得醒酒解毒的益生菌发酵制品——人参肽13。
根据中华人民共和国国家标准QB/T5298-2018(低聚肽含量测定方法)对益生菌发酵制品的低聚肽进行含量检测，结果如表6。
根据中华人民共和国国家标准QB/T5298-2018(相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物所占比例的测定方法)对益生菌发酵制品的蛋白质水解物(相对分子质量小于1000u)进行含量检测，结果如表6。
结合表6和人参肽5可知，发酵温度偏低和发酵温度偏高都不利于植物乳植杆菌Fd-01对人参进行充分发酵酶解，随着温度的升高，人参肽的低聚肽含量、蛋白质水解物含量逐渐增加，但是当温度升高到一定数值时，反而不利于植物乳植杆菌Fd-01发酵酶解人参，导致发酵不充分，人参肽的低聚肽含量、蛋白质水解物含量逐渐降低。实验结果显示，人参肽5的低聚肽含量、蛋白质水解物含量显著高于其他人参肽，因此，以人参肽5的发酵温度作为最佳发酵温度，即最佳发酵温度为38℃。
表6人参肽的相关指标
二、人参肽口服液的制备
(1)将70重量份纯化水和20重量份低聚果糖混合，再加入步骤一中制备的人参肽(人参肽5)，人参肽的添加量为混合液总重量的0.0％、0.3％、0.6％、0.9％、1.2％、1.5％，搅匀溶解后即得基料L；
(2)将基料L在135℃的条件下灭菌2s，即得人参肽口服液，分别即为1-6号人参肽口服液。
另外，将70重量份纯化水和20重量份低聚果糖混合，再加入混合液总重量1.5％的人参(基料B)，搅匀溶解后，在135℃的条件下灭菌2s，制得7号人参肽口服液，作为对照。实验例1人参肽口服液的小鼠解酒实验
1、实验动物
健康的ICR雄性小鼠，体重25-30g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲喂标准配方饲料(购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司)，自由饮水。
2、主要试剂
(1)培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO4 0.5，NaCl 0.1，KH2PO40.5，CaCO3 25，pH 5.8，于121℃灭菌20min。
(2)无水乙醇。
(3)0.9％生理盐水，121℃灭菌20min。
3、实验步骤
选择健康的ICR雄性小鼠85只，随机分成9组，阴性对照组5只，除阴性对照组之外的实验组每组10只，包括：
第1组：生理盐水对照组(阴性对照组)；
第2组：生理盐水+60％乙醇浓度处理组；
第3组：1号人参肽口服液+60％乙醇浓度处理组；
第4组：2号人参肽口服液+60％乙醇浓度处理组；
第5组：3号人参肽口服液+60％乙醇浓度处理组；
第6组：4号人参肽口服液+60％乙醇浓度处理组；
第7组：5号人参肽口服液+60％乙醇浓度处理组；
第8组：6号人参肽口服液+60％乙醇浓度处理组；
第9组：7号人参肽口服液+60％乙醇浓度处理组；
适应性饲养1周后开始正式实验，每只小鼠每天灌胃2次(每次灌胃生理盐水或人参肽口服液后，间隔6小时后用等量的60％乙醇浓度灌胃)，剂量以0.25mL/25g BW进行，分别在乙醇灌胃后30min和2h的时候眼球取血2次，取血后，血液室温放置120min，2500rpm离心15min，获得血清，采用气相色谱法测定乙醇浓度，结果如表7所示。连续5天，观察小鼠反应，记录未醉只数、死亡只数、醉酒时间和醒酒时间，结果如表8所示。
4、实验结果
通过测定小鼠灌乙醇后30min和2h时的血清乙醇浓度来测定胃和小肠吸收乙醇速率的影响以及对肝脏代谢乙醇的影响。由表7可知，未进行发酵的人参的醒酒解毒效果较慢，经过植物乳植杆菌Fd-01发酵后，人参肽解酒效果得到显著提升。随着人参肽用量的增加，血清中乙醇含量降得越快，说明人参肽可减缓胃肠对乙醇的吸收，进而缓解肝脏及其他器官的代谢压力。其中，第7组的血清中乙醇浓度在30min时就已经降至0了，即当人参肽的添加量为≥1.2％时，具有非常好的醒酒解毒作用。
表7血清中乙醇浓度(mg/dl)
时间 第1组 第2组 第3组 第4组 第5组 第6组 第7组 第8组 第9组
30min 0 360 359 247 102 23 0 0 333
2h 0 153 150 13 0 0 0 0 126
由表8可知，随着酒精浓度的增加，醉酒和醒酒时间越长，说明乙醇浓度越大，机体代谢的负荷越大，甚至还出现小鼠死亡，如第2组和第3组。经人参肽干预后，小鼠的醉酒和醒酒时间缩短，也进一步说明了人参肽有明显的防醉效果，醒酒解毒能力好，且没有出现小鼠死亡，也说明了人参肽的安全性好。其中，第7组和第8组的醉酒和醒酒时间均为0，即当人参肽的添加量为≥1.2％时，具有非常好的醒酒解毒作用。结合表9的数据，选择5号人参肽口服液作为人参肽口服液的组方。
表8不同处理组对小鼠醉酒醒酒时间的影响
实验例2植物乳植杆菌Fd-01、人参肽及其口服液的人群醒酒解毒功效验证
1、样品制备
(1)益生菌粉：取植物乳植杆菌Fd-01菌粉(委托河北弗蒙特生物科技有限公司生产)5重量份，低聚果糖95重量份，混匀后分装成2g/袋，即得益生菌粉；
(2)灭活型乳酸菌粉：取热灭活(先65℃保持45min，再85℃保持15min)的植物乳植杆菌Fd-01菌粉5重量份，低聚果糖95重量份，混匀后分装成2g/袋，即得灭活型乳酸菌粉；
(3)人参肽口服液：5号人参肽口服液，分装成50mL/瓶；
(4)市售姜黄解酒丸，购自FANCL HealthScience。
2、食用方法
(1)益生菌粉：用150mL、37℃温水调匀后饮用，每次1袋；
(2)灭活型乳酸菌粉：用150mL水调匀后饮用，每次1袋；
(3)人参肽口服液：直接饮用，每次1瓶；
(4)市售某姜黄解酒丸：用饮用水送服，每次1粒。
3、食用时间
(1)A组：在饮用300mL白酒前2h食用；
(2)B组：在饮用300mL白酒前1h食用；
(3)C组：在饮用300mL白酒前0.5h食用；
(4)D组：在饮用300mL白酒前食用，随后饮酒；
(5)E组：在饮用300mL白酒后0.5h食用；
(6)F组：在饮用300mL白酒后1h食用；
(7)G组：在饮用300mL白酒后2h食用。
4、人群招募
招募140名志愿者(公司内部招募)，志愿者均身体健康，能饮用300mL白酒，年龄范围22～60岁。
5、实验步骤
将志愿者随机分成4大组，每个大组35人，第一组人员食用益生菌粉，第二组人员食用灭活型乳酸菌粉，第三组人员食用人参肽口服液，第四组人员食用市售某姜黄解酒丸。再将每个大组人员分成7个小组，每个小组5人，每个小组的样品食用时间按照A组～G组进行。志愿者饮酒及食用试验样品后，在5min、10min、15min、20min时，用吹气式酒精测试仪检测酒精含量，记录志愿者的酒精含量变化，结果如表9所示。
由表9可知，相比于第四组(市售解酒产品)，第一组(益生菌组)、第二组(灭活型乳酸菌粉)、第三组(人参肽口服液)都能高效地降低人体内酒精浓度，有利于减少酒精对人体细胞、血管、内脏等器官的毒素累积及毒害作用。在不同的食用时间，产品的解酒能力也有所不同，第一组(益生菌组)、第二组(灭活型乳酸菌粉)在饮酒前半小时，或饮酒后1小时及以上食用时，醒酒解毒效果较好，第三组(人参肽口服液)在饮酒前、饮酒时、饮酒后食用均可醒酒解毒，效果非常显著。可见，本发明利用植物乳植杆菌Fd-01发酵制备的人参肽富含小分子肽，人体食用后能被快速吸收利用，且醒酒解毒效果持续性好，在食用后2h，仍能使机体快速吸收摄入的酒精，减少酒精、乙醛等物质的毒害作用，有效预防宿醉、头晕等不适症状，有利于保持人体健康。
表9志愿者的酒精浓度(mg/100mL)
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种醒酒解毒的益生菌，其特征在于，所述益生菌为植物乳植杆菌Fd-01，保藏编号为CGMCC No.27643。
2.一种醒酒解毒的益生菌发酵物，其特征在于，由权利要求1所述的植物乳植杆菌Fd-01对人参进行发酵后制得，所述人参为有3-5年生长期的新鲜人参及茎叶组织。
3.权利要求2所述的醒酒解毒的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌种培养：将植物乳植杆菌Fd-01接种于液体种子培养基中，37-38℃培养2-3d，得菌液，记为基料A；
S2、破壁：将人参破壁至80-120目，得基料B；
S3、粗蛋白提取：用不同梯度pH的NaOH溶液对基料B进行浸提，收集沉淀后经干燥即得人参粗蛋白，记为基料C；
S4、溶解：将基料C用水溶解、调匀后得基料D；
S5、接种及发酵：将基料A接种于基料D中，分批次进行发酵后得到基料H；
S6、提纯、干燥及粉碎：将基料H用膜透析法提纯后，经干燥、粉碎即得益生菌发酵物—人参肽。
4.根据权利要求3所述的醒酒解毒的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，S1中，所述液体种子培养基包括葡萄糖30g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 0.1g/L，KH2PO4 0.5g/L，CaCO3 25g/L，pH 5.8。
5.根据权利要求3所述的醒酒解毒的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，S3粗蛋白提取的具体操作为：以基料B与NaOH的质量体积比为(1～2)：(8～12)的比例将基料B溶于0.1～0.2mol/L NaOH溶液中，依次调节pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0，然后震荡摇匀，于1000×g～3000×g的条件下离心15～25min，再用0.1～0.2mol/L HCl调节pH至4～5，将上层液与沉淀分离，过滤，收集沉淀物，并将沉淀物反复冲洗3～4次，于40～50℃的条件下干燥1～2h，得人参粗蛋白，记为基料C。
6.根据权利要求3所述的醒酒解毒的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，S5接种及发酵的具体操作为：按基料A与基料D的质量比为(1～2)：(20～30)的比例称取基料A，先将1/3份基料A接种于基料D中，37～38℃的条件下恒温培养1～2d，分离上清液F1及沉淀物F2(一次发酵)；再将F2用10～30份水溶解，并加入另1/3份基料A，于37～38℃的条件下恒温培养1～2d，分离上清液E1及沉淀物E2；最后将E2用10～30份水溶解，并加入其余1/3份基料A，于37～38℃的条件下恒温培养1～2d，分离上清液G1及沉淀物G2(三次发酵)；将F1、E1、G1、G2合并，调匀后得基料H。
7.权利要求1所述的醒酒解毒的益生菌和/或权利要求2所述的醒酒解毒的益生菌发酵物在制备醒酒解毒产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述醒酒解毒产品包括醒酒解毒食品、醒酒解毒保健品、醒酒解毒药品和醒酒解毒营养补充剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述益生菌为活菌体或灭活型菌体。
10.一种人参肽口服液，其特征在于，所述人参肽口服液包括权利要求2所述的醒酒解毒的益生菌发酵物、低聚果糖和水，所述益生菌发酵物的添加量为口服液总重量的1.0％-1.5％。
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