KR20210078251A - 유산균에서 분리한 항균 펩타이드 플랜타리신 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플랜타넘에서 분리된 항균 펩타이드 플랜타리신 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주에서 분리된 신규한 5종의 플랜타리신 펩타이드는 병원성 세균에 대한 강력한 항균 활성을 나타내며, 다양한 세균 감염증에 적용이 가능하며, 본 발명의 조성물은 의약, 식품 또는 사료 첨가제 조성물 등의 다양한 분야에서 항균 목적으로 유용하게 이용가능하다.

Description

유산균에서 분리한 항균 펩타이드 플랜타리신 및 이의 용도{Anti-Microbial Peptide Plantaricin, Isolated from Lactobacillus Plantarum and Uses thereof}

본 발명은 유산균에서 분리한 신규 항균 펩타이드 플랜타리신 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 락토바실러스 플랜타넘에서 분리된 항균 펩타이드 플랜타리신 및 이의 용도에 관한 것이다.

생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 항균 및 항진균 물질에 관한 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다.

모든 생명체는 생존을 위하여 항균 및 항진균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 항균 및 항진균 물질을 생산하는 미생물에 대해서 많은 연구가 이루어지고 있으며, 항균 및 항진균 물질을 생산하는 미생물 또는 이들에게서 분리된 물질을 이용해 항균제를 개발하려는 연구들이 오래전부터 시도되고 있다.

모든 생명체는 생존을 위하여 항균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이와 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있고, 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 생물은 항균 펩타이드를 자체적으로 생산하는데(Bevins et al., Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), 대략 10 내지 40 개의 아미노산으로 이루어진 작은 펩타이드를 형성하며, 구조에 따라 크게 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-시트(sheet) 펩타이드 분자이고, 두 번째는 α-헬릭스 구조의 양친화성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드 분자이다.

이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀(cecropin)과 같이 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다. 이처럼 생물체에서 분리된 펩타이드의 항균 활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며, 생물체에서 분리된 펩타이드를 이용해 항균제를 개발하려는 연구들이 많이 시도되고 있다.

한편, 김치는 여러 발효생성물과 재료성분인 식이성분, 비타민, 카로틴, 젖산, 젖산균, 아세틸콜린, 덱스트란(dextran), 아세테이트(acetate) 등이 풍부하여 인체 내에서 면역증강, 항산화, 항균, 항콜레스테롤, 발암 및 변이 물질의 생성을 방지하는 기능을 갖는 기능성 식품으로 알려져 있다. 특히 채소에 풍부한 식이섬유는 변비를 예방하며 풍부한 젖산균은 장내의 유해 미생물의 생육을 억제하여 장내 균총을 개선하는 프로바이오틱(probiotic) 효과를 갖는다.

김치에는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 바이셀라(Weissella) 속 등에 속하는 주요 균주가 있고, 이들 균주가 김치 발효에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기와 같이 김치에 함유되어 있는 유산균의 일종인 락토바실러스 플란타룸 균주는 동형 또는 이형발효를 하는 젖산 간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스 속 미생물은 여러 단백질성 항균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있고, 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균(E.coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하며, 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 비타민 합성, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다[Michael and Philippe, Probiotics and prebiotics: Effects on diarrhea, The journal of nutrition, Volume 137, March 2007, pages 803S-811S; Roberfroid, Prebiotics and probiotics: Are they functional foods?, American journal of clinical nutrition, Volume 71, June 2000, pages 1682S-1687S].

그러나, 이러한 연구결과에도 불구하고 아직까지 산업적으로 활용할 수 있을 정도로 항균력이 높은 락토바실러스 균주의 발굴과 관련된 연구성과는 미미한 상태이며, 특히 락토바실러스 속 균주 등 유산균에서 분리되어 항균 효과가 뛰어난 항균 펩타이드는 찾아보기 힘든 실정이다.

이러한 배경 아래에서, 본 발명자들은 유산균에서 분리되어 우수한 항균 활성을 갖는 신규 항균 펩타이드를 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 김치에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 균주에서 분리된 신규한 항균 펩타이드인 5종의 플랜타리신 펩타이드가 우수한 항균 활성이 있어 항균 용도로 유용하게 활용할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

대한민국 특허등록공보 제10-1772870호 대한민국 특허등록공보 제10-1757623호 대한민국 특허등록공보 제10-1750468호 대한민국 특허등록공보 제10-1658377호

따라서, 본 발명의 주된 목적은 락토바실러스 플란타룸 균주에서 분리된 신규 항균 펩타이드인 5종의 플랜타리신 항균 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 플랜타리신 항균 펩타이드를 이용한 항균 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 플랜타리신 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 용어 "플랜타리신 펩타이드(Plantaricin peptide)"는 본 발명자들에 의해 김치에서 분리 동정된 "락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주"에서 본 발명자들에 의해 새롭게 분리된 신규한 항균 펩타이드(antimicrobial peptides, AMPs)로서, "플랜타리신", "Plantaricin" 또는 "pln"과 혼용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 용어 "플랜타리신 펩타이드 1"은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, "플랜타리신 펩타이드 2"는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며, "플랜타리신 펩타이드 3"은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되고, "플랜타리신 펩타이드 4"는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되며, "플랜타리신 펩타이드 5"는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시된다.

본 발명에서 용어, “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 유해 세균에 대해 높은 항균 효과를 나타내는 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1 내지 5로 표시되는 플랜타리신 펩타이드이다.

본 발명자들은 신규 항균제의 개발을 위해 유산균의 항균 효과에 대해 수년간 조사 분석하였고, 그 결과 김치에서 유래한 락토바실러스 플란타룸의 강력한 항균 효과를 선행연구에서 검증하였고, 추가적으로 상기 락토바실러스 플란타룸 균주의 유전체 및 전사체 분석을 통해 신규한 항균 펩타이드인 5종의 플랜타리신 펩타이드(Plantaricin peptide)의 항균 활성을 검증하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서, 상기 플랜타리신 펩타이드는 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주에서 유래한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 상기 플랜타리신 펩타이드는 병원성 세균에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는데, 상기 병원성 세균은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 플랜타리신 펩타이드는 추가적으로 세포 내재화 서열 혹은 단백질 변환 도메인에 연결될 수 있다.

최근의 연구 보고에 의하면 다양한 세포 내재화 서열, 예를 들어, HIV 바이러스의 TAT 전이활성 도메인, 안테나페디아(antennapedia) 등을 원형질막을 가로질러 수송할 수 있는 트랜스포탄(transportan)이 알려져 있다. 또한, 폴리아르기닌은 원형질막을 가로질러 펩타이드와 단백질을 훨씬 더 효율적으로 수송함으로써 펩타이드를 세포 내로 수송하는 매력적인 도구로 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 세포 내재화 수송물질 또는 서열을 포함할 수 있다. 세포 내재화 서열은 공지되어 있거나 새롭게 당해 기술 분야에서 발견된 임의의 내재화 서열, 또는 그것의 보존성 변이체일 수 있다. 세포 내재화 수송물질 및 서열의 비-제한적인 예로는 폴리아르기닌(예컨대 R9), 안테나페디아 서열, TAT, HIVTat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이체), Buforin II, 트랜스포탄, MAP(모델 양친매성 펩티드), KFGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC(비스-구아니디니움-스퍼미딘-콜레스테롤) 및 BGTC(비스-구아니디니움-트렌-콜레스테롤)가 포함된다.

추가로, 본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 표적화 서열, 캡핑 모티브(capping motif), 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 이펙터(effectors), 약물, 프로드럭, 독소, 펩타이드, 전달 분자 등의 커플링 파트너와 연결될 수 있다.

또한, 본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로 산을 첨가함으로써 염을 형성할 수 있고, 예를 들어 무기산(예: 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 설페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄, 술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.

본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 상세하게는 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등과 같은 화학적 합성 또는 단백질 발현 시스템을 이용한 유전공학적 방법 등으로 제조될 수 있고, 펩타이드의 제조방법과 관련된 통상적인 화학적 합성 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 발현벡터, 및 숙주세포를 이용하여 유전공학적 방법을 통해 생산될 수 있다.

본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in-frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 따라 증가될 수 있다.

발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 이러한 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

또한, 본 발명에서 용어, "형질전환"은 상기 뉴클레오타이드 절편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 목적하는 펩타이드를 발현할 수 있도록, 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 환원물질로 사용한 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

숙주는 본 발명의 펩타이드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 균주, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스(Bacillus) 속 균주, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모, 동물 세포, 및 곤충 세포 등이 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 본 발명의 플랜타리신 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 활성을 나타내므로 항균용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 구체적으로 그람 양성균, 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항균 활성을 갖는다. 구체적으로는 살모넬라 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주, 바실러스 속 균주, 및 에스체리치아 속 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대해 항균 활성이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다만, 본 발명의 플랜타리신 펩타이드가 미생물의 막에 부착되어 미생물 막의 붕괴를 일으키는 작용이 거의 모든 병원성 세균의 성장 억제에 작용할 수 있음을 고려하면, 상기 나열된 병원성 세균에 한정되는 것은 아니다.

상기 살모넬라 속 균주로는 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium)을 들 수 있으며, 상기 바실러스 속 균주로는 바실러스 세레우스(B. cereus)를 들 수 있고, 상기 에스체리치아 속 균주는 에스체리치아 콜라이(E. coli)를 들 수 있으며, 상기 스트렙토코커스 속 균주로는 스트렙토코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 신규한 플랜타리신 1 내지 플랜타리신 5의 펩타이드는 임상 투여시 비경구로 투여할 수 있으며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 신규한 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규한 플랜타리신 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로오스 또는 덱스트란과 같은 탄화수소, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신규한 플랜타리신 펩타이드의 유효 용량은 0.01 내지 10㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 1㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 플랜타리신 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 플랜타리신 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 활성을 나타내므로 항균용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로 상기 신규한 플랜타리신 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세히는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크 로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아마이드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 다이메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아마이드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 플랜타리신 펩타이드는 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 활성을 나타내므로 식품 보존용 또는 사료 보존용 항균 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

식품이나 사료의 보존제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며, 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품, 사료, 화장품, 의약품 등에서 부패 미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항균제도 포함된다. 이러한 식품이나 사료의 방부제 및 화장품, 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다. 농작물의 병충해를 박멸하기 위한 농약 역시 해로운 미생물의 증식을 억제하고 인체에 해가 없어야 사람이 농약을 살포한 농작물을 안전하게 섭취할 수 있다. 본 발명의 신규한 5종의 플랜타리신 펩타이드는 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 활성을 나타내므로 상기의 식품이나 사료의 보존제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제 등에 폭넓게 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 플랜타리신 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 병원성 세균을 사멸시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 세균감염 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 치료방법은 비록 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 치료방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여로 증상이 호전될 수 있는 세균 또는 진균 감염에 의한 질환을 갖는 것을 고려할 때, 인간의 치료에서도 충분히 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "인간을 제외한 동물"은 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여로 증상이 호전될 수 있는 세균 또는 진균의 감염으로 유발되는 질환을 갖는 인간만을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여함으로써, 세균 및 진균성 감염에 의한 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 치료 대상 동물의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항균 조성물은 1일 0.01 내지 10㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.1 내지 5 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 김치에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 균주에서 분리된 신규한 5종의 플랜타리신 펩타이드, 및 이를 유효성분으로 하는 항균용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주에서 분리된 신규한 5종의 플랜타리신 펩타이드는 병원성 세균에 대한 강력한 항균 활성을 나타내며, 다양한 세균 감염증에 적용이 가능하다.

(c) 또한, 본 발명의 조성물은 의약, 식품 또는 사료 첨가제 조성물 등의 다양한 분야에서 항균 목적으로 유용하게 이용가능하다.

도 1은 김치에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 균주의 게놈 분석 결과를 정리하여 나타낸 표이다.
도 2는 김치에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 균주의 전사체 분석 결과를 정리하여 나타낸 표이다.
도 3은 플랜타리신 1 펩타이드의 특성을 정리하여 나타낸 그림이다.
도 4는 플랜타리신 1 유전자의 인접하는 유전자 배열을 정리하여 나타낸 모식도이다.
도 5는 플랜타리신 2 펩타이드의 특성을 정리하여 나타낸 그림이다.
도 6은 플랜타리신 2 유전자의 인접하는 유전자 배열을 정리하여 나타낸 모식도이다.
도 7은 플랜타리신 3 펩타이드의 특성을 정리하여 나타낸 그림이다.
도 8은 합성 플랜타리신 3 펩타이드와, 플랜타리신 3 유전자를 대장균에 클로닝하여 발현시킨 플랜타리신 3 펩타이드의 항균 활성을 비교하여 나타낸 그림이다.
도 9는 합성 플랜타리신 3 펩타이드의 B. cereus, E. coli, S. aureus 균주, 및 C. albicans 균주의 4종 병원성 균주에 대한 항균 활성을 측정하여 나타낸 그림이다.
도 10은 플랜타리신 3 유전자의 인접하는 유전자 배열을 정리하여 나타낸 모식도이다.
도 11은 플랜타리신 4 펩타이드의 특성을 정리하여 나타낸 그림이다.
도 12는 플랜타리신 4 유전자의 인접하는 유전자 배열을 정리하여 나타낸 모식도이다.
도 13은 플랜타리신 5 펩타이드의 특성을 정리하여 나타낸 그림이다.
도 14는 플랜타리신 5 펩타이드의 B. cereus, E. coli, S. aureus 균주, 및 C. albicans 균주의 4종 병원성 균주에 대한 항균 활성을 측정하여 나타낸 그림이다.
도 15는 플랜타리신 5 유전자를 대장균에 클로닝하여 발현시킨 플랜타리신 5 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 그림이다.
도 16은 플랜타리신 5 유전자의 인접하는 유전자 배열을 정리하여 나타낸 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)% 이다.

실시예 1. 항균력이 우수한 김치 유래 균주의 분리 및 동정

1-1. 균주 분리

김치에서 항균 활성이 우수한 신규 균주를 분리하기 위해, 잘 숙성된 김치를 경남 인근 지역에서 무작위로 수거하고 10배 농도로 희석한 후, MRS 고체 배지에 도말하여 성장하는 균주들을 확보하였다.

먼저, MRS 고체 배지에서 성장한 균주 중에 성장력이 우수한 균주 1,000 여종을 1차 선발하였고, 선발된 각 균주를 5ml MRS 배지에 액체 배양하였다.

선발된 1,000 여종의 균주에 대한 항균력 분석을 위해, 7mm cork borer로 LB 평판배지에 펀칭한 후, 고병원성 균주인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) χ 3339 균주와 병원성 대장균(E. coli ATCC 11775)을 LB 평판배지에 도말하였다. 상기 고병원성 병원균이 도말된 LB 평판배지에 김치에서 분리된 각각의 균주 배양액을 50 또는 100ul의 농도로 첨가한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하면서 1시간 내지 2시간 간격으로 관찰하였다.

그 결과, 총 12종의 균주가 선발되었고, 12종의 균주 중에서 항균력이 가장 우수한 6번 균주를 선발하여 16S rDNA 서열 분석을 실시하였다.

1-2. 균주 동정

16S rDNA 유전자 염기서열 분석은 균주의 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 DNA 분리 키트(GenElute Bacterial Genomic DNA Kit, Sigmaaldrich, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였으며, 서열분석 프라이머785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3') 및 907R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3')과 PCR 프라이머 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 분리 균주의 16S rDNA 유전자 단편을 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후, 염기서열을 분석하였다. 그 결과를 NCBI GenBank database(http://ncbi.nlm.nih.gov)의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 확인하였다.

그 결과, 실시예 1-1에서 분리된 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)과 99% 이상 상동성을 갖는 신균주로 분석되었다.

실시예 2. 오믹스(유전체 및 전사체) 분석

2-1. 유전체 분석

a) 유산균 시료에서 게놈 DNA 분리 및 서열 분석 준비

Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa Korea, Seoul, Republic of Korea)을 사용하여 실시예 1에서 분리동정한 락토바실러스 플란타룸에서 게놈 DNA를 분리하였고, 이 DNA를 DNA-Seq (DNA sequencing)에 사용하였다.

b) DNA sequencing

분리된 DNA는 Covaris S2 ultra sonicator 시스템을 이용하여 단리(fragmentation) 단계를 거친 후, Truseq Nano DNA sample prep kit(Illumina, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 350bp의 DNA 단편으로 구성된 라이브러리를 구축하였다. 이러한 최종 산물은 2100 BioAnalyzer 기기를 이용하여 확인하였고, Illumina HiSeq platform(Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 서열해독을 진행하였다.

c) 유전체 정보확보를 위한 생물정보학 분석

확보된 서열 리드(sequence reads)는 sickle(v1.33) 프로그램과 BWA(ver. 0.7.12.) 프로그램을 사용하여 고품질의 리드(reads)만 필터링하여 얻었고, 이것을 락토바실러스 플란타룸 균주에 대하여 맵핑 및 게놈 어셈블리(genome assembly)를 하는 데 사용하였다. 맵핑 이후, GATK 프로그램(ver. 3.1-1)을 사용하여 로컬 리얼라인먼트(local realignment)를 수행하였고, 중합체(duplicates)는 Picard 프로그램(ver. 1.98)(http://picard.sourceforge.net)을 사용하여 맵핑하였다. 서열상의 변이들은 GATK 프로그램(ver 3.1-1)을 통해 콜링(calling)이 이루어졌으며, 변이에 대한 어노테이션(annotation)은 SnpEff(v.4.1) 프로그램에 의해서 수행되었다.

항균 펩타이드(AMPs)의 확인을 위해 CAMP (http://www.camp.bicnirrh.res.in/campHelp.php) 데이터베이스에서 기존에 확보된 항균 펩타이드(AMPs)와 서열을 비교하여 유사도(similarity)가 50% 이상이 되는 펩타이드(peptide)들을 잠재적 항균 펩타이드(AMPs)로 분류하고, 인공 펩타이드(artificial peptide)의 합성 및 유전자 클로닝의 대상으로 하였다.

유전체 분석결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 기존에 잘 알려진 4종의 항균 펩타이드(AMPs)가 탐색되었다. 이들은 플랜타리신(plantaricin) N, 플랜타리신(plantaricin) E/F complex, 라이소자임(lysozyme), MazF, 박테리오파지 홀린(bacteriophage holin) 등 이었다.

또한, 상동성 분석결과, 신규로 발견된 7종의 펩타이드들이 항균 펩타이드(AMPs)일 가능성이 크게 나타났다.

특히, 상기 7종의 펩타이드 중에서 5종의 신규 펩타이드들은 항균 활성을 나타낼 가능성이 큰 것으로 예측되었고, 이들에 대해 각각 플랜타리신(plantaricin) 1 내지 플랜타리신(plantaricin) 5로 명명하였다.

2-2. 전사체 분석

a) Total RNA로부터 mRNA 확보

total RNA로부터 RNA-Seq sample preparation kit(Illumina, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 mRNA는 분리하였고, 이 mRNA를 RNA-Seq(RNA sequencing)에 사용하였다.

b) RNA sequencing

분리된 mRNA는 단리(fragmentation) 단계를 거치고, 랜덤 헥사머 프라이밍(random hexamer priming)을 통해 단일가닥(single-stranded) cDNA로 합성하였고, 이를 주형으로 하여 상보 가닥(second strand)을 합성하였다. 또한, 블런트 엔드(Blunt-end)를 만들기 위한 엔드 리페어(end repair) 및 어뎁터(adapter)를 붙이기 위한 A-tailing 및 어뎁터 라이게이션(adapter ligation) 과정을 순차적으로 거친 후, PCR(Polymerase Chain Reaction) 기기를 이용하여 증폭하였고, 최종 산물은 2100 BioAnalyzer 기기를 이용하여 확인하였다. 만들어진 라이브러리(library)는 KAPA library quantification kit를 이용하여 정량하였고, 클러스터 제너레이션(cluster generation)은 Hiseq 2500 기기를 이용하여 서열해독을 진행하였다.

c) 전사체 정보확보를 위한 생물정보학 분석

본 발명에서는 낮은 품질의 서열을 제거하기 위해서 먼저 서열 정보 중 N으로 나타난 염기의 비율이 전체 서열의 10% 이상 포함되어 있거나, Q20 미만의 염기가 40% 이상인 리드(read)는 제거되었으며, 평균 품질이 Q20 이하인 리드 역시 제거하였다. 필터링 전 과정은 내부에서 제작된 프로그램으로 수행되었다.

서열 정렬 및 분석에 사용된 참조 유전체는 Ensembl(Flicek et al., 2013)에서 제공된 정보를 이용하였고, 72버전이 사용되었다. 필터링한 서열은 STAR 2.3.0e (Dobin et al., 2013) 툴(tool)을 이용하여 유전체 서열에 정렬되었으며, 서열 정렬과정에서 Ensembl 72버전의 유전자 정보가 사용되었다.

발현량 측정은 Cufflinks v2.1.1(Trapnell et al., 2010) 툴(tool)을 이용하여 계산되었으며, 이를 위해 Ensembl 72 버전의 유전자 정보가 사용되었고, non-coding 유전자 영역은 마스크(mask) 옵션을 이용하여 발현량 측정에서 제외하였다. 그리고 측정의 정확성을 높이기 위하여 멀티 리드 코랙션(multi-read-correction)과 프랙 바이어스 코랙션(frag-bias-correct) 옵션이 추가로 사용되었으며, 다른 옵션들은 기본값으로 사용되었다.

특이 발현 유전자 분석을 위해서 HTSeq-count v0.5.4p3(Anders et al., 2015) 프로그램을 이용하여 각 유전자의 리드 숫자가 계산되었으며, 인터섹션 논 엠티(intersection-non empty) 규칙과 페어드 엔드(paired-end) 서열을 고려한 계산이 이루어졌다. 계산된 각 유전자의 리드 숫자를 이용하여 TCC(Sun et al., 2013) 프로그램을 이용한 특이 발현 유전자 분석을 수행하였다. TCC 옵션은 반복을 고려한 iDEGES/edgeR 방법을 이용하였고, 특이발현 유전자 선택은 멀티플 테스팅(multiple-testing) 과정에서 생기는 오류를 보정한 Q-value를 기준으로 하였으며 0.05 미만을 기준값으로 설정하여 사용하였다.

전사체 분석결과, 상기 실시예 2-1에서 발굴한 플랜타리신(plantaricin) 1 내지 5를 포함하는 신규한 항균 펩타이드(AMPs)들은 모두 발현이 유발되는 것으로 나타났다(도 2).

실시예 3. 펩타이드 합성

코스모진텍(주)에 의뢰하여 플랜타리신(plantaricin) 1 내지 플랜타리신 5의 펩타이드를 합성하였다.

상기 합성된 항균 펩타이드들은 10mg/ml의 농도로 물에 용해하여 -20℃에 보관하였다. 건조 분말을 녹이기 위해 고순도 정제수((Ultrapure grade H₂O)를 사용하였고, 재현탁된 시료를 항균 활성 측정에 사용하였다.

실시예 4. 항균 활성 분석

4-1. 병원균 등 시료 확보

항균 활성 테스트에 사용한 병원성 미생물은 실제 가축 방역 현장에서 고병원성으로 알려진 살모넬라 병원균을 대상으로 항균 실험을 수행하였다. 고위험성 병원균으로는 Salmonella Typhimurium(ST, KCTC12401) 균주를 선정하였다.

4-2. 항균 활성 분석 실험과정

항균활성 분석을 위해 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 방법으로 최소저해농도(minimal inhibitory concentration, MIC) 분석을 수행하였다. 분석 샘플은 스톡(stock)을 제조한 후 적절한 농도로 희석하여 사용하였고, 선발된 균주는 100mL 삼각 플라스크에 overnight(O/N) 배양한 후, 원심 분리 후 상등액을 취하여 0.25μm 시린지 필터(syringe filter)로 필트레이션(filtration) 한 후, 항균 활성 분석을 위해 사용하였다.

MIC 분석을 위해 overnight(O/N) 전 배양된 균주는 10⁶ CFU/ml로 희석한 후 실험에 사용되었다.

MIC 분석에 사용된 펩타이드의 농도는 0, 25, 50, 100, 250, 500, 및 1,000μg/ml 농도를 사용하였다. 반응액을 마이크로타이터 플레이트(Microtiter plate)에 첨가한 후, 37℃에서 O/N 배양하면서 반응 성상을 관찰하였고, 각 반응액의 흡광도를 측정하였다.

실험결과의 유의성 테스트는 SPSS 통계 프로그램(IBM, Armonk, NY)에서 ANOVA(one-way analysis of variance) 및 Duncan 방법을 사용하여 수행하였다. 실험결과에서 각 그래프의 막대는 최소 3번의 반복실험을 통해 얻은 결과의 평균과 표준오차를 의미하고, 서로 다른 문자들은 비교 대상 간의 유의한 차이 (p<0.05)를 나타낸다.

4-3. Plantaricin 1

플랜타리신 1(Plantaricin 1; pln 1)은 152개의 아미노산으로 구성되며, 그람민스틴 Pp3(Gramminstin Pp3) 유전자와 상동성이 높은 것으로 나타났다(도 3 참조). 상동성 영역은 50% 소수성, +2 네트 차지(net charge), 및 2.161 kDa 분자량의 특성을 보유하였다.

펩타이드의 이차구조는 알파 헬릭스(alpha-helix) 구조를 구축할 것으로 예견되었다. 합성된 펩타이드에 의해 항균 활성을 분석한 결과, MIC₅₀(50% minimal inhibitory concentration)이 5.5mg/ml로 측정되어 우수한 항균 활성을 나타내는 것으로 측정되었다(도 3 참조).

플랜타리신 1의 이웃한 유전자는 cspLA(cold shock-like protein), Yjjp (inner membrane protein), 및 LytR (transcriptional regulator) 등으로 실제 플랜타리신 1의 발현이나 활성과는 연관성이 낮은 것으로 추정된다(도 4 참조).

4-4. Plantaricin 2

플랜타리신 2(Plantaricin 2; pln 2)는 총 58개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 인돌리시딘(indolicidin) 유전자와 상동성을 보였다(도 5 참조). 게놈 분석 과정에서 플랜타리신 2 유전자는 인돌리시딘 유전자와 상동성 영역이 C-말단(terminus)에 존재한다. 따라서, 본 플랜타리신 2 펩타이드는 시그널 펩타이드(signal peptide)가 절단된 후에 항균 펩타이드(AMPs)의 기능을 수행할 가능성이 높을 것으로 예측되었다. 상동성(homology) 영역은 15% 소수성, 0 네트 차지(net charge), 1.641kDa 분자량을 보유하였고, 알파 헬릭스(alpha-helix) 구조가 예측되었다.

항균 활성 분석결과, MIC₅₀(50% minimal inhibitory concentration)이 4.8 mg/ml로 측정되어 우수한 항균 활성을 나타내는 것으로 측정되었다.

이러한 수치는 측정된 5종의 플랜타리신(plntaricin) 펩타이드 중에서 두 번째로 강력한 항균 활성 값으로, 동 플랜타리신 2 펩타이드는 가장 우수한 항균 활성을 나타내었다. 플랜타리신 2의 이웃한 유전자는 가상 단백질(hypothetical protein)이 존재했고, ICDP(integrase core domain protein)와 PinR_1(putative DNA invertase from lambdoid prophage Ra)이 위치한 것으로 나타났다(도 6 참조).

4-5. Plantaricin 3

플랜타리신 3(Plantaricin 3; pln 3)은 총 46개의 아미노산으로 구성되며, 박테리오펙신 A(bactofencin A) 유전자와 상동성을 보였다. 또한, L. allivarius cp400 펩타이드와 높은 상동성을 보유하는 것으로 나타났다(도 7 참조).

특히, 기존에 알려진 ‘ABC transporter signal sequence cutting site’로 잘 알려진 ‘GG site’가 존재하였다. 그러나, 시그널 시퀀스(signal sequence) 서열은 박테리오펙신 A(bactofencin A) 유전자와 완전히 다른 것으로 나타났다.

이러한 결과는 도 7의 아래쪽 판넬에서도 확인할 수 있다. 게놈 분석 결과, 본 플랜타리신 3 펩타이드는 발현 후 항균 활성을 나타낼 것으로 예측되었기 때문에 펩타이드 합성뿐만 아니라 해당 유전자를 E. coli DH5α 균주에 클로닝하여 E. coli 균주의 상등액에 대한 항균 활성을 추가로 분석하였다. 합성 펩타이드에 대한 항균 활성은 Salmonella Typhimurium(ST, KCTC12401) 균주 이외에 한국생명공학연구원에서 분양받은 고병원성으로 알려진 균주 4종을 추가로 실험하였다.

그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이, Salmonella Typhimurium 균주에 대한 플랜타리신 3 합성 펩타이드의 항균 활성은 MIC₅₀ 값이 5.2mg/ml로 우수한 항균 활성을 나타내는 것으로 측정되었고(도 8 왼쪽 아래 그림), B. cereus, E. coli, 및 S. aureus 균주에 대한 항균 활성도 우수한 것으로 확인되었다(도 9 및 표 1 참조).

[표 1]

또한, 대장균에 클로닝되어 발현된 플랜타리신 3 단백질의 항균 활성은 B. creus 균주에 대해 MIC₅₀ 값이 730ug peptide/ml로 우수한 활성이 있는 것으로 나타났다(도 8 오른쪽).

플랜타리신 3의 이웃한 유전자는 lagD_2(lactococcin G-processing and transport ATP-binding protein L)와 가상 단백질(hypothetical protein)로 lagD_2가 ABC transporter의 수송 과정에 일부 연관성이 있을 것으로 추정된다(도 10).

4-6. Plantaricin 4

플랜타리신 4(Plantaricin 4; pln 4)는 총 65개의 아미노산으로 구성되며, 하이메노키린(hymenochirin)-5B 유전자와 상동성이 있는 것으로 나타났다(도 11 가운데 패널). 플랜타리신 4 펩타이드는 ABC transporter의 시그널 시퀀스(signal sequence) 특이적인 절단 장소인 Gly 아미노산들이 27번 및 28번 아미노산에서 존재하는 것으로 나타났다.

합성된 펩타이드는 하이메노키린(hymenochirin)-5B 펩타이드와 상동성을 보이는 Gene_01599의 펩타이드 서열 38 내지 62번의 아미노산에 대해 인공적으로 합성되었다. 이들 아미노산의 소수성은 64%였고, +1 네트 차지(net charge), 2.6263kDa 분자량 및 알파 헬릭스(alpha-helix)의 구조를 가질 것으로 예견되었다.

항균 활성 값(MIC₅₀)은 5.7 mg/ml로 측정된 5종의 플랜타리신 AMPs 중에서 비교적 낮은 것으로 나타났다.

그러나, 본 플랜타리신 4 펩타이드는 ABC transporter 시그널 시퀀스의 전형적인 인식서열과 C-말단(terminus)에 하이메노키린(hymenochirin)-5B 펩타이드와 일치되는 서열에 기인하여 분비된 항균 펩타이드(AMPs)로써 역할을 수행할 가능성이 높은 것으로 예견되었다.

이웃한 유전자는 Abetr(anaerobi benzoate catabolism transcriptional regulator)와 pglH(; alNAc-alpha-(1->4)-GalNAc-alpha-(1->3)- diNAcBac-PP-undecaprenol alpha-1,4-N-acetyl-D-galactosaminyltransferase) 유전자로, 이들 유전자들은 본 플랜타리신 4 펩타이드의 발현에 직접적인 연관성이 낮은 것으로 추정되었다(도 12).

4-7. Plantaricin 5

플랜타리신 5(Plantaricin 5; pln 5)는 총 54개의 아미노산으로 구성되며, M-zodatoxin-Lt2a 유전자와 상동성을 보였다. 본 유전자는 시그널 시퀀스(signal sequence)에 대한 특이적인 경향성을 보이지 않았다(도 13 참조). 상동성을 보이는 영역에서 소수성은 28%였고, +10 네트 차지(net charge)로 매우 높은 양성 아미노산의 비율을 나타내었다. 분자량은 2.5851kDa 이고, 알파 헬릭스(alpha-helix)의 구조를 가질 것으로 예견되었다.

그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이, Salmonella Typhimurium 균주에 대한 플랜타리신 3 합성 펩타이드의 항균 활성은 측정된 5종의 플랜타리신 펩타이드 중에서 가장 강력한 항균 활성 값인 4.4mg/ml MIC₅₀ 값이 측정되었다. 또한, B. cereus, E. coli, 및 S. aureus 균주에 대한 항균 활성도 우수한 것으로 확인되었다(도 14 및 표 2 참조).

[표 2]

또한, 본 유전자를 포함하는 DNA 서열을 E. coli DH5α에 클로닝한 결과, 강력한 항균 활성을 나타내었기 때문에 본 플랜타리신 5 유전자는 발현되어 분비될 가능성이 높은 것으로 추정되었다(도 15).

플랜타리신 5 펩타이드의 이웃한 유전자는 XerC(site-specific tyrosine recombinase) 유전자와 가상 단백질(hypothetical protein)이었다(도 16). 특히 플랜타리신 5 펩타이드의 상부 또는 하부 스트림(up/down-stream region)에 발현되는 유전자가 존재하지 않았기 때문에 이 부분이 플랜타리신 5 펩타이드의 발현이나 기능성에 연관성이 존재할 가능성이 있는 것으로 추정된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> National Institute of Biological Resources <120> Anti-Microbial Peptide Plantaricin, Isolated from Lactobacillus Plantarum and Uses thereof <130> PN190099AN <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Microbial Peptide Plantaricin 1 <400> 1 Val Leu Gly Ser Leu Ile Gly Ser Val Gly Ile Gly Val Leu Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Tyr Lys 20 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Microbial Peptide Plantaricin 2 <400> 2 Ile Tyr Pro Glu Lys Gln Pro Glu Glu Pro Val Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Microbial Peptide Plantaricin 3 <400> 3 Lys Lys Ser Arg Arg Cys Gln Val Tyr Asn Asn Gly Met Pro Thr Gly 1 5 10 15 Met Tyr Thr Ser Cys 20 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Microbial Peptide Plantaricin 4 <400> 4 Pro Ile Val Arg Glu Pro Phe Lys Ala Met Ala Val Gly Ile Ile Leu 1 5 10 15 Ala Val Met Ser Gly Leu Leu Val Thr 20 25 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Microbial Peptide Plantaricin 5 <400> 5 Lys Ala Lys Lys Arg Phe Leu Arg Asn Arg Leu Ser Gln Gln Ala Arg 1 5 10 15 Lys Ala Arg Thr Lys 20

Claims (6)

1. 서열번호 1 내지 5로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 플랜타리신(Plantaricin) 펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 플랜타리신(Plantaricin) 펩타이드.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 항균 활성은 살모넬라 속 균주, 바실러스 속 균주, 에스체리치아 속 균주, 및 스트렙토코커스 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 병원균에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 플랜타리신(Plantaricin) 펩타이드.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 살모넬라 속 균주는 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum) 또는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium)이고, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 세레우스(B. cereus)이며, 상기 에스체리치아 속 균주는 에스체리치아 콜라이(E. coli)이고, 상기 스트렙토코커스 속 균주로는 스트렙토코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 플랜타리신(Plantaricin) 펩타이드.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 펩타이드는 추가적으로 세포 내재화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 플랜타리신(Plantaricin) 펩타이드.
   
6. 서열번호 1 내지 5로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 플랜타리신 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물.

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