KR102107194B1

KR102107194B1 - 우방자 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102107194B1
Application number: KR1020180133071A
Authority: KR
Inventors: 김태양; 황성진; 이춘몽; 이광식; 이건국; 강희경
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-05-06
Also published as: KR20200029323A

Abstract

본 발명은 우방자 추출물로서 악틴, 악티게닌, 라파올 및 라파올 C를 일정비율로 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 비듬균인 말레세지아 퍼퍼(Malassezia furfur) 억제, 5a-리덕테이즈의 활성 억제, 모유두세포 증식 효과, 세포의 모발 증식 신호전달(

-catenin level, TGF-

Description

우방자 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지용 화장료 조성물 {Cosmetic Composition For Preventing Hair Loss Containing Arctium Lappa Seed Extract}

본 발명은 우방자(Arctium lappa)의 추출물인 악틴(arctiin), 악티게닌(arctigenin) 및 라파올(lappaol) 또는 우방자의 추출물인 라파올 C(lappaol C)를 유효성분으로 함유하는 탈모 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 탈모란 정상적으로 모발이 존재해야 하는 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 두피의 성모가 빠지는 것을 의미한다. 정상인의 경우 하루 약 50~70개의 모발의 탈락이 발생하며, 100개 이상의 모발이 빠지는 경우에 탈모 증상을 의심할 수 있다.

임상학적으로 탈모는 흉터가 형성되는 탈모와 흉터가 형성되지 않는 탈모로 분류되며, 다양한 원인에 의해 발생되지만 유전적인 원인과 남성 호르몬인 테스토스테론이 중요한 인자로 여겨진다.

테스토스테론은 골격근증가, 남성외부생식기, 음낭 성장, 정자 형성 등에 관여하며, 테스토스테론은 환원효소에 의해 디하이드로테스토스테론으로 환원되어 탈모, 여드름, 전립성 비대증에 관여하는 것으로 알려져 있다.(Diane et al; JID 775-778, 1995. Bruchovsky, Net al; JBC 243,2112~2121, 1968).

보다 자세하게는 디하이드로테스토스테론은 모낭 주변의 단백질 합성을 저하함으로써 모낭세포의 증식을 감소시켜 탈모를 유발하는 것으로 알려져 있다.

기존의 탈모 완화 및 발모 촉진에 사용되는 치료제는 피나스테리드(finasteride)나 미녹시딜(minoxidil)로서, 크게 두 가지 제제가 널리 이용되고 있다. 이들 치료제들의 주요 기전으로는 5a-리덕테이즈 선택적 저해, 모유두세포 증식 촉진, ATP-sensitive K+-channel opening, Wnt/

-catenin 신호 전달 조절, TGF-

신호전달 조절의 효능을 가지고 있다.

대한민국 등록특허 제10-131097호는 탈모방지용 한방추출물 및 이를 포함하는 헤어용품 조성물에 대해 개시하고 있다. 대한민국 등록특허 제10-121834호는 우방자 등의 식물 추출물 또는 분획물을 함유하는 조성물, 그의 용도 및 상기 추출물의 제조방법에 대해 개시하고 있다.

하지만, 상기 공지된 치료제는 그 효능이 일시적이며, 개개인에 따라 효과가 다르게 나타나는 경우가 있어 전세계적으로 탈모 완화 및 발모와 관련하여 새로운 소재에 대한 필요성이 증가하고 있다.

본 발명의 목적은 탈모완화 및 발모 촉진을 위해 천연 식물 및 이의 추출물에 대한 다양한 피부 생리활성을 검색한 결과, 천연 식물 추출물 중에서 우방자(Arctium lappa) 추출물로부터 효능을 확인하여, 이의 유효 성분인 악틴, 악티게닌, 라파올 및 라파올 C를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

우방자(Arctium lappa) 추출물 유래 악틴, 악티게닌 및 라파올을 유효성분으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 악틴, 악티게닌 및 라파올을 일정비율로 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물이다.

바람직하게는, 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 비듬균인 말레세지아 퍼퍼를 억제하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물이다.

바람직하게는, 상기 탈모 방지용 화장물 조성물은 5a-리덕테이즈의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물이다.

바람직하게는, 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 모유두세포 증식 효과 및 세포의 모발 증식 신호전달(β-catenin level, TGF-β level)을 조절하는 탈모 방지용 화장료 조성물이다.

바람직하게는, 상기 우방자 추출물은 전체 화장료 조성물 중량대비 0.01 내지 30.0중량% 함유하는 탈모 방지용 화장료 조성물이다.

바람직하게는, 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 우방자로부터 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물이다.

바람직하게는, 상기 라파올의 종류는 라파올 C인 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물이다.

바람직하게는, 라파올 C인 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물은 비듬균인 말레세지아 퍼퍼를 억제하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 라파올 C인 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물 전체 중량에 대해 라파올 C를 0.01 내지 0.1중량% 함유한다.

바람직하게는, 라파올 C인 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물은 5a-리덕테이즈의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 라파올 C인 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물은 모유두세포 증식 효과 및 세포의 모발 증식 신호전달(β-catenin level, TGF-β level)을 조절한다.

본 발명은 우방자의 추출물인 악틴, 악티게닌 또는 라파올 및 라파올 C를 포함하는 화장료 조성물에 의해 탈모를 방지 하는 것을 특징으로 한다. 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 비듬균인 말레세지아 퍼퍼 억제, 5a-리덕테이즈의 활성 억제, 모유두세포 증식 효과, 세포의 모발 증식 신호전달(β-catenin level, TGF-β level)을 조절하는 효과를 가진다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 우방자의 추출물에서 얻은 악틴, 악티게닌, 라파올 및 라파올 C를 유효 성분으로 포함하는 탈모 방지용 화장료 조성물에 대한 것이다.

본 발명에 사용된 우방자는 국화과의 두해살이풀인 우엉의 열매로써, 대도자, 우채자, 흑풍자 등의 이명으로도 알려져 있다. 우방자는 9월에 수과가 달려 회갈색으로 익는데 갈색의 갓털이 붙어 있고 속에서 검은씨가 나온다. 우방자의 주요 효능으로는 풍열에 의한 해수, 객담, 인후종통 등의 증상을 완화하는데 효과적이다.

본 발명의 우방자 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) , 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다. 본 발명에서는 바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용 하였다. 본 발명에서 우방자 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) , 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다.

한편, 본 발명의 우방자 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 본 발명의 우방자 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명에 따른 우방자 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함하는 데 우방자의 발효추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 우방자를 100~500메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모 균주 또는 유산균등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5 내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 우방자 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 우방자 발효 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 탈모완화 및 발모 촉진 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량% 를 초과하는 경우에는 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다

본 발명에 있어서, 우방자 추출물로부터 분리되어진 유효성분인 악틴, 악티게닌 및 라파올은 하기의 화학식에 나타내었다.

[화학식 1] 악틴

[화학식 2] 악티게닌

[화학식 3] 라파올

[화학식 4] 라파올 C

바람직하게는 악틴, 악티게닌, 라파올 및 라파올 C의 혼합물에 있어서, 화장료 조성물 총 중량 대비 악틴의 함량은 0.01~0.1중량%, 악티게닌의 함량은 0.01~0.1중량%, 라파올의 함량은 0.01~0.1중량%, 라파올 C의 함량은 0.01~0.1중량%이다.

본 발명에 있어서 "발효 추출물"은 우방자 추출물의 발효를 통하여 얻어지는 추출액으로써, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 이를 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물 등, 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 의미한다.

제조예 1: 우방자 추출물 제조

우방자 20kg을 깨끗한 물로 씻어 건조시킨 다음 일정한 크기(100mesh)로 분쇄하여 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하여 농축기를 이용하여 우방자 추출물 1.2kg을 제조하였다.

제조예 2: 우방자 발효추출물 제조

제조예 1로부터 획득한 우방자 추출물을 20g/1L가 되게 유산균 배양액에 첨가하였으며, 탄소영양원으로는 글루코스, pH 조절제로 디포타슘 포스페이트를 첨가하였다. 배양액 당 Lactobacillus acidophilus(KTCT 3140)와 Bifidobacterium lactis(5854)을 동일 비율로 50,000cfu/L 첨가 한 후, pH 6의 조건으로 37℃에서 7일간 배양하였다. 배양 후 배양액은 0.25μM 필터를 이용하여 여과한 후 여과액을 농축하여 발효 추출물을 1.0kg을 제조하였다.

제조예 3: 악틴, 악티게닌 제조

상기 제조예 2을 통해서 획득한, 우방자 발효 추출물 1.0kg에 10L의 10% 에탄올을 넣어 분산시킨 후 n-헥산(hexane) 1L를 이용하여 비극성 성분을 제거하였으며(3회 반복), 이후 물층에 메틸렌클로라이드 10L를 넣어 분획한 층을 감압 농축하여 50g의 분획물을 얻었다. 이를 실리카겔(60 ~ 120mesh) 컬럼을 이용하여 유효성분 분리를 진행하였으며, 이동상으로는 메탄올, 메틸렌 클로라이드 혼합액(1:20 -> 1:5)을 이용하여 분리 정제 하여 전체 9개의 분획물을 회수하였으며, 모유두세포 증식효과를 가지는 2개의 분획물로부터 2.14g, 1.84g을 회수 하였으며 NMR을 이용하여 분리 동정하였다. NMR 결과를 문헌자료와 비교하여 분리 동정된 성분이 악틴과 악티게닌임을 확인하였다( Lu, H., Sun, Z., Shan, H., & Song, J. (2015). Microwave-assisted extraction and purification of arctiin and arctigenin from fructus arctii by high-speed countercurrent chromatography. Journal of chromatographic science, 54(3), 472-478.) 제조예 3로부터 악틴, 악티게닌을 분리하였으며, 이의 구체적인 화학식은 위의 화학식 1과 2에 나타내었다.

제조예 4: 라파올 제조

상기 제조예 2을 통해서 획득한, 우방자 발효 추출물 1.0kg에 10L의 10% 에탄올을 넣어 분산시킨 후 n-헥산(hexane) 1L의 비극성 성분을 제거하였으며(3회 반복), 이후 물 층에 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트의 순으로 용매분획을 실시하였다. 에틸아세테이트 분획층을 여과 및 농축과정을 통하여 340g의 에틸아세테이트 분획물을 획득하였으며, 유효성분 분리를 위하여 실리카겔(200-400mesh) 컬럼을 이용하여 유효성분 분리를 진행하였다. 이동상으로는 클로로포름아세톤 혼합액을 이용하여 전체 15개의 분획물을 회수하였으며, 모유두세포 증식효과를 가지는 분획물을 농축하여 10.99g 회수 하였다. 회수한 분획물은 sephadex-LH20를 이용한 컬럼 크로마토크래피(이동상 메탄올)을 수행하여 분리 정제하여, 1.02g을 획득하였으며, NMR을 이용하여 구조 동정을 실시 하였다. NMR 결과를 문헌자료와 비교하여 분리 동정된 성분이 라파올임을 확인하였다. (Ichihara, A., Numata, Y., Kanai, S., & Sakamura, S. (1977). New sesquilignans from Arctium lappa L. The structure of lappaol C, D and E. Agricultural and Biological Chemistry, 41(9), 1813-1814.)

제조예 5: 라파올 C 제조

상기 제조예 2을 통해서 획득한, 우방자 발효 추출물 1.5kg에 10L의 10% 에탄올을 넣어 분산시킨 후 n-헥산(hexane) 1L의 비극성 성분을 제거하였으며(3회 반복), 이후 물 층에 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트의 순으로 용매분획을 실시하였다. 에틸아세테이트 분획층을 여과 및 농축과정을 통하여 340g의 에틸아세테이트 분획물을 획득하였으며, 유효성분 분리를 위하여 실리카겔(200-400mesh) 컬럼을 이용하여 유효성분 분리를 진행하였다. 이동상으로는 클로로포름메탄올 혼합액을 이용하여 전체 5개의 분획물을 회수하였으며, 모유두세포 증식효과를 가지는 분획물을 농축하여 67.24g 회수 하였다. 회수한 분획물은 sephadex-LH20를 이용한 컬럼 크로마토크래피(이동상: 클로로포름 아세톤혼합액)을 수행하여 4개의 분획물을 회수 하였으며, 모유두세포 증식효과를 가지는 분획물, 10.02g을 획득하였으며, NMR을 이용하여 구조 동정을 실시하였다. NMR 결과를 문헌자료와 비교하여 분리 동정된 성분이 라파올 C임을 확인하였다(Umehara K., Sugawa A., Kuroyanagi M., Ueno A., Taki T., Chem. Pharm. Bull., 41, 1774―1779 (1993). , Ichihara A., Numata Y., Kanai S., Sakamura S., Agric. Biol. Chem., 41, 1813―1814 (1977).

제조예 6: 악틴, 악티게닌, 라파올 혼합물 제조

상기 제조예 3과 제조예 4를 1:1의 비율로 혼합하여 혼합물을 제조하였다.

실험예 1: 5a-리덕테이즈 활성 저해 효과 시험

24시간 절식한 성숙한 스트레그 돌리 랫드(Sprogue-Dawley rat)(생후 7~8주)을 디에틸이서로 치사시키고 나서, 간장을 빙냉한 크랩스-링거 포스페이트 완충액(Krebs-Ringer phosphate buffer)(pH 7.2)로 관류하였다. 여기에 5배량의 빙냉한 트리스 HCL 완충액(Tri-HCL buffer, pH7.2)를 가하여 호모게나이즈하고, 900Xg, 10분간 원심 분리하였다. 상층을 5000Xg, 10분간 원심분리하고, 그 상층을 9000Xg, 10분간 원심분리할 때 얻은 상층을 효소액으로 사용했다. 효소액은 80℃에서 동결보존하였다. 트리스 HCL 완충액(Tris-Hcl buffer, pH 7.2) 1.0ml에 테스토스테론(500ug/ml) 0.3ml, 제조예를 통하여 준비된 시료를 일정 농도로 0.2ml 및 효소액 1.0ml을 혼화하고, NADPH(0.77mg/ml) 0.5ml을 가하여 반응을 개시하고, 37℃ 에서 30분간 반응시켰다. 디클로로메탄(Dichloromethane) 5ml을 가하여 반응을 정지시켜, 내부 표준물질(p-hydroxybenzoic acid n-hexyl ester, 0.1mg/ml) 0.5ml을 가하여 10분간 진탕하고, 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층을 제거한 후, 디클로로메탄층을 남기고, 여기에 메탄올 5ml을 가하여 고속 액체크로마토그래피(HPLC)용 시료를 만들었다. 5a-리덕테이즈 저해율은 HPLC 방법을 이용하여 각 실험군의 테스토스테론의 양을 측정한 뒤 하기 수학식 1의 계산식에 따라 산출하였으며, 그 결과를 표 1에는 단독 사용시 결과를, 표 2에는 제조예 4와 제조예 3과의 시너지 효과에 대한 결과를 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	5a-리덕테이즈 저해율(%)
우방자 추출물	1000	27.44 ± 1.35
	100	15.12 % ± 2.04
	10	8.08 % ± 1.84
우방자 발효 추출물	1000	45.49 % ± 2.11
	100	29.72 % ± 1.47
	10	14.84% ± 1.91
악틴	100	23.24 % ± 2.31
	10	12.91 % ± 1.74
	1	9.11 % ± 2.01
악티게닌	100	36.14 % ± 1.69
	10	20.67 % ± 1.53
	1	8.58% ± 2.28
라파올	100	39.27 % ± 1.78
	50	30.39 % ± 1.87
	10	16.70 % ± 1.09
	1	9.84 % ± 2.37
악틴, 악티게닌, 라파올	100	57.70 % ± 2.93
	10	41.84 % ± 2.71
	1	14.75 % ± 1.85
라파올 C	100	45.21 % ± 1.22
	50	32.19 % ± 1.07
	10	18.74 % ± 1.59
	1	12.44 % ± 2.31

시료명	농도(ppm)	시료명	농도(ppm)	5a-리덕테이즈 저해율(%)
라파올	10	악틴	10	27.36 % ± 1.15
			1	22.74 % ± 1.27
	1	악틴	10	12.08 % ± 1.08
			1	9.91 % ± 0.94
	10	악티게닌	10	35.44 % ± 1.73
			1	20.49 % ± 1.51
	1	악티게닌	10	19.47 % ± 1.37
			1	10.02 % ± 2.13

실험예 2: 활성 비듬균인 말레세지아 퍼퍼에 대한 살균력 시험

활성 비듬균인 말레세지아 퍼퍼(Malassezia furfur. KCTC 7743)에 대한 살균력 시험을 하기와 같이 실시하였다. 비듬균을 패트리디쉬(박테리아 배양용 접시)에 접종한 후 3일간 호기성 배양조에서 배양하고 비듬균의 집락수를 측정하였다. 제조예를 통해 획득한 추출물 및 유효성분은 일정 농도의 수용액으로 용해하여 패트리디쉬에 떨어뜨리고 3일 이상 호기성 배양조에서 배양시킨 후 집락수를 다시 측정하고, 하기 수학식 2에 따라 비듬균에 대한 살균율(%)을 계산하였다.

시료명(각 100 ppm)	초기 비듬 균수	3일 후 비듬 균수	비듬균에 대한 살균력(%)
우방자 추출물	1.59*10⁶	1.31*10⁶	17.61%
우방자 발효 추출물		1.24*10⁶	22.01%
악틴		1.18*10⁶	25.78%
악티게닌		1.08*10⁶	32.07%
라파올		1.11*10⁶	30.18%
악틴, 악티게닌, 라파올		9.81*10⁵	38.30%
라파올 C		9.83*10⁵	39.10%

실험예 3: 모유두세포의 세포 증식 효과(cell proliferation)

인간 유래 모유두세포를 10% FBS 및 1% antibiotics(100 units/ml penicillin 및 100 ug/ml streptomycin)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한다. 3-4번째 세대의 모유두세포를 실험에 사용하여 MTT assay로 모유두세포의 성장 증식 효능을 확인하였다. 96-웰 마이크로플레이트에 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 모유두세포(1×04 cells/㎖)를 넣고 24시간 전배양하고 제조예로부터 획득한 시료를 여러 농도로 처리한 다음 4일간 배양하였다. 3-[4,5-다이메틸티아졸-2-일]-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT))를 50㎕ 첨가하고 4시간 더 배양한 다음, 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 다이메틸설폭사이드를 가하여 침전물을 용해시킨 다음 540nm에서 흡광도를 측정하여, MTT의 환원에 따른 포르마잔 침전물의 생성 정도로 인간유래 모유두세포의 증식 효과를 확인하였다. 표 4에는 단독 사용시 결과를, 표 5에는 제조예 4와 제조예 3과의 시너지 효과에 대한 결과를 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	세포 증식 효과(%)(control 대비)
우방자 추출물	10	101.82 % ± 3.51
우방자 발효 추출물	100	115.40 % ± 2.43
우방자 발효 추출물	10	102.18 % ± 2.11
악틴	100	129.85 % ± 2.41
	10	121.11 % ± 3.37
	1	109.47 % ± 1.41
악티게닌	100	120.04 % ± 2.09
	10	113.76 % ± 2.68
	1	105.57 % ± 2.70
라파올	100	139.52 % ± 2.96
	10	116.12 % ± 2.83
	1	107.09 % ± 1.25
악틴, 악티게닌, 라파올(제조예 6)	100	147.25 % ± 2.44
	10	132.49 % ± 1.94
	1	113.27 % ± 1.07
라파올 C	100	147.29 % ± 3.07
	10	126.57 % ± 3.17
	1	118.47 % ± 1.55

시료명	농도(ppm)	시료명	농도(ppm)	세포 증식 효과(%)(control 대비)
라파올	10	악틴	10	132.54 % ± 2.45
			1	109.27 % ± 1.07
	1	악틴	10	120.41 % ± 2.10
			1	104.70 % ± 1.03
	10	악티게닌	10	126.29 % ± 1.91
			1	114.79 % ± 1.67
	1	악티게닌	10	120.03 % ± 1.43
			1	111.49 % ± 0.96

실험예 4: 인간 유래 모유두세포의 모발주기 조절 신호 전달

인간 유래 모유두세포에 시료를 단독 처리하거나, 시료를 전처리한 다음에 DHT를 처리하여 일정 시간 배양하여 준비하였다. 세포를 수확하여 PBS로 3회 세척하고, 500㎕의 용해 버퍼를 첨가한 다음, 1시간 동안 용해(lysis)시킨 후 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었으며, 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 Protein Assay Kit(BIO-RAD, HC, USA)를 사용하여 정량하였다. 20~30㎍의 lysate를 12% mini gel SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 변성분리하여 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride membrane)(BIO-RAD, HC, USA)로 200mA에서 2시간 동안 transfer를 실시하였다. 멤브레인의 블로킹은 5% skim milk가 함유된 TTBS(TBS+0.1% Tween 20) 용액에서 하룻밤 실시하였다. 1차 항체를 TTBS 용액에서 희석하여 사용하며, 반응은 상온에서 2시간 동안 진행하였다. 2차 항체로는 HPR(Horse Radish Peroxidase)이 결합된 anti-rabbit IgG(Amersham Prarmacia Biotech, NY, USA)와 anti-mouse IgG(Amersham Prarmacia Biotech, NY, USA)를 희석(1:5000)하여 이용하여, 반응은 상온에서 30분 동안 진행하였다. 그 후 멤브레인을 TTBS로 3회 세척하여 ECL 기질과 1~3분간 반응 후 X-ray 필름에 감광시켜

-카테닌 수준(

-catenin level), TGF-

수준(TGF-

level)을 확인하였다.

표 6에는 단독 사용시 결과를, 표 7에는 제조예 3과 제조예 4와의 시너지 효과에 대한 결과를 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	-catenin level (control 대비)	TGF- level (control 대비)	Flk-1 level (control 대비)
우방자 추출물	10	5.71 %	2.17 %	4.02%
우방자 발효 추출물	100	13.45 %	3.91 %	2.47%
	10	2.09 %	-	-
	1	-	-	-
악틴	100	15.11 %	16.07 %	7.18%
	10	9.54 %	12.13 %	-
	1	6.47 %	5.70 %	-
악티게닌	100	20.09 %	15.71 %	6.09%
	10	13.31 %	9.94 %	-
	1	4.97 %	6.10 %	-
라파올	100	31.07 %	24.29 %	10.84%
	10	13.07 %	8.97 %	5.15%
	1	5.73 %	2.47 %	-
악틴, 악티게닌, 라파올	100	37.03 %	35.13 %	9.45%
	10	32.76 %	30.99 %	4.66%
	1	8.44 %	7.91 %	-
라파올 C	100	45.13 %	38.83 %	27.44%
	10	33.46 %	29.44 %	17.18%
	1	12.84 %	14.41 %	10.75%

시료명	농도(ppm)	시료명	농도(ppm)	β-catenin level (control 대비)	TGF-β level (control 대비)
라파올	10	악틴	10	26.05 %	27.46 %
	10	악틴	1	15.97 %	16.09 %
	1	악틴	10	14.75 %	13.18 %
	1	악틴	1	5.10 %	6.73 %
	10	악티게닌	10	20.44 %	14.49 %
	10	악티게닌	1	12.88 %	10.72 %
	1	악티게닌	10	10.11 %	11.14 %
	1	악티게닌	1	6.05 %	5.46 %

처방예 1: 두피 에센스

상기의 제조예를 통하여 만들어진 우방자 발효 추출물 및 이의 유효성분을 함유하는 제조예를 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 다음 표 5와 같으며 본 처방예에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 샴푸, 트리트먼트, 두피 앰플, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

성분						중량%
제형예1	제형예2	제형예3	제형예4	제형예5	제형예6	중량%
제조예1 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스-16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	제조예2 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	제조예3 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	제조예4 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	제조예5 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	제조예6 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	2% 3.0 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계						100

실시예 1: 화장료의 탈모 방지 효과

실시예 1은 제조예를 통해 획득한 우방자 추출물 및 이의 분리 화합물을 함유하는 제조예를 일정농도 함유하는 두피 에센스 처방예 1을 이용하여 실험 하였으며, 각 그룹당 20~30대 피험자 20명을 모집하여 A 그룹에는 추출물이 함유되지 않는 제형, B 그룹에는 제형예 1(우방자 추출물), C 그룹에는 제형예 2(우방자 발효 추출물), D 그룹에는 제형예 3(악틴, 악티게닌), E 그룹에는 제형예 4(라파올), F 그룹에는 제형예 5(라파올 C), G 그룹에는 제형예 6(악틴, 악티게닌, 라파올)을 이용하였다. 1일 2회, 아침 저녁 두피 세정 후 8주간 사용하도록 하였다. 사용 후 피험자들의 관능평가를 설문조사 하였다.

	그룹 A	그룹 B	그룹 C	그룹 D	그룹 E	그룹 F	그룹 G
탈모 개선	2	4	7	7	8	9	12
조금 개선	5	7	5	5	8	8	6
효과없음	13	9	8	8	4	3	2

실시예 2: 화장료의 탈모 방지 효과 2

실시예 1은 제조예를 통해 획득한 우방자 발효 추출물 및 이의 분리 화합물을 함유하는 제조예를 일정농도 함유하는 두피 샴푸를 이용하여 실험 하였으며, 각 그룹당 20~30대 피험자 20명을 모집하였으며, 포토트리코그램을 수행하여 평가하고자 하는 두피 부분에 1mm 직경의 작은 점을 문신하였다. A 그룹에는 추출물이 함유되지 않는 제형, B 그룹에는 제형예 1(우방자 추출물), C 그룹에는 제형예 2(우방자 발효 추출물), D그룹에는 제형예 3(악틴, 악티게닌), E 그룹에는 제형예 4(라파올), F 그룹에는 제형예 5(라파올 C), G 그룹에는 제형예 6(악틴, 악티게닌, 라파올)을 이용하였다. 1일 2회, 아침 저녁 두피 세정 목적으로 8주간 사용하도록 하였다. 사용 전, 사용 4주 후, 사용 8주 후의 모발진단기 IS-3000C (Besutopia, korea)를 이용하여 해당 포토트리코그램 내 모발 수 및 모발 직경의 변화를 측정하였다.

	포토트리코그램 내 모발 수 변화
	0주	4주	8주
그룹 A	2.954	2.988	2.976
그룹 B	2.771	2.841	2.774
그룹 C	3.011	3.269	3.454
그룹 D	3.198	3.751	4.912
그룹 E	3.374	4.108	5.097
그룹 F	3.207	3.788	4.107
그룹 G	3.207	4.387	5.178

	포토트리코그램 내 모발 직경 변화
	0주	4주	8주
그룹 A	0.0772	0.0798	0.0803
그룹 B	0.0811	0.0818	0.0822
그룹 C	0.0864	0.0891	0.0941
그룹 D	0.0862	0.0890	0.929
그룹 E	0.0772	0.0829	0.0894
그룹 F	0.0742	0.0809	0.0884
그룹 G	0.0827	0.0910	0.0932

본 발명의 제조예는 실험예를 통하여 탈모 증상과 관련하여 세포 단위에서 유효성을 확인하였으며, 제조예를 함유하는 제형의 실시예를 통하여 포토트리코그램 내 모발 수의 증가와 모발의 굵기 개선에 도움됨을 확인 할 수 있었으며, 이를 통하여 탈모 증상 완화에 도움됨을 확인하였다.

Claims

유효성분으로서, 우방자(Arctium lappa) 추출물 유래 악틴, 악티게닌 및 라파올을 1~10 : 1~10 : 1~10의 중량비로 혼합하여 포함하고, 전체 화장료 조성물 중량 대비 0.01 내지 30.0 중량% 포함하는, 탈모 방지용 화장료 조성물.
유효성분으로서, 우방자 추출물 유래 라파올 C를 화장료 조성물 전체 중량에 대해 0.01 내지 0.1 중량%로 포함하는, 탈모 방지용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 비듬균인 말레세지아 퍼퍼를 억제하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈모 방지용 화장물 조성물은 5a-리덕테이즈의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 모유두세포 증식 효과 및 세포의 모발 증식 신호전달(β-catenin level, TGF-β level)을 조절하는 탈모 방지용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈모 방지용 화장료 조성물은 우방자로부터 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 화장료 조성물.
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