KR101183573B1

KR101183573B1 - 구절초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101183573B1
Application number: KR1020110023199A
Authority: KR
Inventors: 최완수; 김영미
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2012-09-17

Abstract

본 발명은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var . latilobum Kitamura) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 관절의 염증을 감소시키며, 염증성 매개체(MMP-1, MMP-3, RANTES 등)들과 사이토카인(TNF-α, IL-1β 등)의 생성을 억제하고, 골관절질환의 원인이 되는 파골세포의 분화 및 골재흡수를 억제하는 효과가 뛰어난 구절초 또는 동속 근연식물의 전초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

구절초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절질환 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising Chrysanthemum zawadskii var. latilobum Kitamura extract for preventing and treating bone diseases including rheumatoid arthritis and osteoporosis}

관절염(arthritis)은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증이 생기고 관절이 손상되는 질환으로 주요 증상은 관절부위에서의 염증에 의한 관절의 손상과 이에 수반되는 통증이다. 그러나 관절에 통증이 있다고 해서 모두 관절염이라고 할 수는 없으며, 붓거나 열감이 동반되어야 관절염이라고 할 수 있다. 관절염은 적어도 100가지 이상의 형태로 분류될 수 있으나 가장 빈번히 발명하는 것은 퇴행성 관절염(osteoarthritis, OA)과 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)이다.

퇴행성관절염은 윤활 관절에서 연골과 주위골에 퇴행성 변화가 나타나서 생기는 관절염으로 주로 체중을 많이 받는 관절 즉, 무릎(슬)관절, 엉덩이(고)관절 등에 심한 통증과 운동 장애를 나타내며, 장기간 방치할 경우에는 관절의 변형까지 초래하는 가장 흔한 관절질환이다. 특히 퇴행성관절염은 신진대사 및 세포 재생 능력이 저하되어 있는 고 연령층에서 일어나는 퇴행성 질환으로, 그 근본적 치료가 거의 불가능하며, 외과적 수술, 약물 요법 및 물리 치료 등이 시행되고 있으나, 일부 보조요법을 제외하면 많은 부작용이 동반되어 새로운 치료제의 개발이 절실하다.

류마티스관절염은 전신성 염증질환으로 활막에 비세균성 염증 반응이 만성적으로 나타나는 자가면역질환으로, 이로 인해 활막이 증식되고 활액의 양이 증가하여 관절의 부종과 동통을 초래하는 질환을 특징으로 한다. 또한, 류마티스 관절염은 관절뿐만 아니라 몸의 여러 부분에 영향을 미치므로 류마티스성 질환으로 불리기도 한다. 원인으로는 면역 반응을 일으키는 정확한 요인에 대해서는 아직 알려지지 않았으나 자가면역반응이 이 질환의 만성화와 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 염증성 매개체들과 사이토카인의 국소적인 방출과 함께 T 세포가 중요한 역할을 하여 결과적으로 관절을 파괴하는 지속적인 자가면역반응으로, 나타나는 주용 증상은 피로, 무력감, 동통 등이며, 관절염이 진행되면서 발열 및 체력쇠약을 동반한다. 조사에 의하면 전 인구의 1%정도가 이 질환을 앓고 있으며 다양한 연령에서 나타날 수 있지만 특히 30-40대가 일반적이다.

골다공증(Osteoporosis)은 뼈 미세구조의 질적인 변화로 인해 뼈의 통합성과 강도가 약화되어 척추와 대퇴, 요골 등의 골절 위험도가 증가되는 대사성 질환이며 생활 수준이 향상하고 의학이 발전하여 평균 수명이 길어지면서, 노인 인구가 증가함에 따라 골다공증은 계속 증가하고 있다. 정상적인 뼈는 파골세포에 의한 골 재흡수와 그에 따른 조골세포에 의한 새로운 골기질 형성, 그 이후의 무기질화 과정이 끊임없이 반복적으로 일어나는 활발한 대사 기관으로, 평균적인 뼈의 대사과정은 3~4개월의 주기를 가진다. 출생하고 성장기를 지나 성인이 될 때까지 뼈 생성이 뼈 재흡수보다 많아서 골량은 점점 증가하게 되며, 30대에 최대의 골량을 형성하게 된다. 그 이후 연령이 증가하면서 뼈의 형성보다는 재흡수가 늘면서 해마다 0.4~2%의 골밀도가 줄어들게 된다. 특히, 여성의 경우, 폐경 후 에스트로겐이 감소하면서 파골세포에 의한 뼈 재흡수가 폐경 전에 비해 매우 많아져 해마다 1~5%의 빠른 뼈 손실을 겪게 된다.

현대에 와서 관절염은 식습관 변화와 교통의 발달로 인한 비만 환자의 급증으로 그 연령층이 낮고 광범위해진 일반적인 질환인데 반해, 아직까지 관절염 발병 기전이 명확치 않아 선택적인 치료 약물 또한 부족한 실정이다. 따라서, 관절염의 치료목적은 관절의 염증 과 통증을 감소시키고, 관절의 변형을 방지하는데 있다. 관절염에 대한 근본적인 치료법이 없으므로 기초 치료법으로 물리 운동 요법을 행하고, 적당한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)을 사용하여 염증을 완화시키며, 염증이 심하면 금염(gold salt) 요법 또는 페니실라민(penicillamine) 요법을 실시하고 있다. 상기의 방법이 효능이 없으면 스테로이드(steroid) 제제를 사용하며, 난치성인 경우 면역 억제제를 사용하고, 변형 관절염으로 이행되면 수술요법을 실시한다. 관절염에 대한 소염?진통 작용을 위해 사용되는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)은 주로 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타내며, 그 중 인도메타신(indomethacin)과 페닐부타존 (phenylbutazone)의 경우 다른 NSAIDs에 비해 강력한 항염증 효과를 가지고 있다. 인도메타신은 염증을 유발하는 프로스타글란딘의 생성을 가장 강력하게 억제하는 약물 중에 하나로 경구 투여로 잘 흡수되나, 이러한 약물은 NSAIDs에서 나타나는 일반적인 위장관에 대한 부작용 이외에 현기증, 정신 착란, 드물게는 환각증을 동반한 정신병이 보고되어 있을 만큼 심한 독성을 갖고 있어, 고용량에서 환자의 33%가 투약을 중지해야 하는 등 많은 부작용을 갖고 있다. 페닐부타존 역시 사용 초기 다른 NSAIDs에 비해 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 급성 통풍성 관절염 치료에 효과적으로 사용되어 왔으나, 과립구 감소증이나 재생 불량성 빈혈 등을 일으키는 혈액학적 이상을 포함하는 심한 독성 때문에 현재 사용되지 않고 있다.

이런 NSAIDs에 비해 스테로이드 제제는 환자에게 사용할 수 있는 가장 빠른 방법으로, 항염증 효과가 빠르고 극적으로 나타나며 환자에게 쾌감을 주는 약물로 알려져 있다. 그러나 널리 알려진 것처럼 이 약물은 세균 감염에 대한 저항력을 약하게 하고, 당뇨병의 악화, 쿠싱(Cushing) 증후군, 부신 부전증, 정신 기능장애 등을 일으키는 것으로 독성이 매우 심각할 뿐만 아니라 치료를 시작하면 중지하기가 어렵기 때문에 사용상 주의를 요하며, 가능하면 금해야 하는 것으로 알려져 있다. 이처럼 합성 항 염증제는 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 앞서 언급한 바와 같이, 효력이 강하면서도 비교적 부작용이 적은 항염증제의 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다. 특히 효능 및 부작용 측면에서 볼 때 오래전부터 민간에서 오래 동안 사용되어 임상적 경험이 풍부하고 안전성 측면에서 우수한 평가를 받고 있는 한방제제와 천연물제제의 경우, 관절염 치료 소재로의 개발 가능성이 한층 더 풍부할 것으로 생각된다.

구절초(Chrysanthemum zawadskii var . latilobum Kitamura)는 국화과에 속하며 우리나라 전역에 야생하고 있으며 동속으로는 바위구절초, 산구절초, 포천구절초, 및 서홍 구절초 등이 있다. 민간에서는 주로 부인병의 냉증, 월경통, 월경불순 등에 치료효과가 있는 것으로 사용되어져 왔으나 구절초 추출물에 대한 골다공증 및 관절염을 포함한 골관절질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 보고나 연구는 전무하다.

이에 본 발명자들은 한국에 자생하는 자생식물 추출물들을 선택하여 실험해오던 중, 그 중 구절초 추출물이 관절의 염증을 감소시키고 염증성 매개체들과 사이토카인(cytokine)의 발현을 억제한다는 것을 발견하였으며, 더 나아가 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 우수한 관절염의 예방 또는 치료효과가 있음을 발견하였으며, 관절염 뿐 아니라 골다공증에 중요한 역할을 하는 파골세포의 분화 및 골다공증에서 문제가 되는 파골세포에 의한 골 재흡수가 구절초 추출물에 의해 억제되는 것을 확인함으로써, 관절염 및 골다공증을 포함한 골관절질환 예방 및 치료에 상기 추출물을 적용시킴으로 본 발명을 완성하였다.

결국 본 발명의 목적은, 골관절질환에서의 만성적인 염증반응으로 인한 활막의 증식, 활액 양의 증가에 의한 관절의 부종과 동통을 예방하고 파골세포의 분화 및 골재흡수를 억제함으로써 치료 할 수 있는 자생식물인 구절초 추출물을 유효성분으로 함유하여 부작용은 적고, 근본적인 치료가 가능한 골관절질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 골관절질환 유발원인인 염증성 매개체들과 사이토카인의 발현 및 파골세포 분화를 억제하는 구절초(Chrysanthemum zawadskii var . latilobum Kitamura) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 관절염 및 골다공증을 포함하는 골관절질환을 유발하는 염증성 매개체들과 사이토카인의 발현 및 파골세포 분화 억제, 골재흡수를 억제함으로써 기존의 증상 회복 위주의 개선제와는 달리 근본적인 치료를 하는 효과가 있다.

또한, 구절초 추출물은 예로부터 민간요법으로 다른 질환에 빈용되어져 온 자생식물로서 골관절질환의 발병을 부작용 없이 차단할 수 있는 천연 추출물로 식품 및 의약품으로의 선택적 개발이 용이하다.

따라서, 기존의 증상 회복 위주의 치료와는 달리 골관절질환 유발 물질의 분비를 원천적으로 차단함으로써 다양한 부작용이 없는 식품 뿐 아니라 의약품 등의 선택적 기능성 첨가제로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 구절초 추출물의 관절염 치료 효과를 나타낸 것으로 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 치료 효능을 측정하기 위한 발의 이미지(A) 및 관절염 유발 정도를 점수(B)로 나타낸 것이다(용매는 5% 아라비아 검 용액을 나타낸다).
도 2는 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델의 정상군, 용매투여군을 포함한 구절초 추출물 처리군의 조직학적 이미지(A) 및 조직학적 손상정도를 지수(B)로 나타낸 결과이다(용매는 5% 아라비아 검 용액을 나타낸다).
도 3은 RT-PCR에 의해 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 MMP-1/3, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 케모카인(MIP-1, MCP-1, RANTES, VEGF, GM-CSF) 발현에 대한 구절초 전초 추출물의 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델의 발목 조직에서 파골세포(osteoclast)의 이미지(A)와 수를 확인한 실험(B) 결과이다.
도 5는 마우스 골수유래 대식세포에서 RANKL과 M-CSF에 의한 파골세포로의 분화를 구절초추출물이 억제하는 효능을 실험한 이미지(A) 및 분화된 파골세포의 수(B)를 표시한 것이다.
도 6은 마우스 골수유래 대식세포에서 RANKL과 M-CSF에 의해 분화된 파골세포에 의한 골재흡수를 구절초 추출물에 의해 억제되는 효능을 보여주는 이미지 (A)와 골재흡수 면적(B)을 나타낸 것이다.
도 7은 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델 관절조직에서 EMSA 기법을 활용하여 NF-κB의 DNA 결합 활성에 대한 구절초 전초 추출물의 효능을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 구절초는 한국에서 자생하는 자원식물로서 국화과 구절초(Chrysanthemum zawadskii var . latilobum Kitamura)를 의미하며, 구체적으로는 구절초(Chrysanthemu zawadskii ( or sibirium) var . latilobum), 또는 동속 근연식물인 포천구절초(Chrysanthemum zawadskii var . tenuisectum), 한라구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp . coreanum), 낙동구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp . Naktongense) 및 바위구절초(Chrysanthemum zawadskii var . alpinum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하고, 상기 구절초는 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리 중 어느 부위를 사용하여도 무관하다.

본 발명에서 추출물이란 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 제조되며, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매의 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출액을 분획한 것도 포함된다.

또한, 추출물의 용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 구체적으로는 물, 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저가 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물 또는 물과 에탄올의 혼합용매이나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 구절초 추출물은 열탕 추출법 또는 용매 추출법에 의하여 추출된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 열탕 추출방법은 1) 구절초를 증류수로 세척하여 분쇄기로 잘게 분쇄하는 단계; 2) 상기 잘게 분쇄된 구절초를 열탕에서 가열하여 구절초 추출물을 얻는 단계; 3) 상기 구절초 추출물을 여과하여 상등액을 얻고 농축하는 단계; 및 4) 상기 구절초 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 엑기스 분말을 얻는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이 때, 상기 1) 단계는 구절초 100g에 대하여 물 1.0ℓ를 첨가하는 것이 바람직하며, 2) 단계에서는 구절초를 100 - 120℃의 열탕에서 2 - 3시간 동안 가열하여 추출하는 것이 바람직하고 이때, 일정한 온도를 유지하고 증기로의 손실을 막기 위하여 냉각기를 설치하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 유기용매 추출방법은 1) 구절초를 저급 알코올에 침지시켜 초음파 추출기로 추출하여 알콜 추출물을 얻는 단계; 2) 상기 구절초 추출물을 농축하는 단계; 및 3) 상기 구절초 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 엑기스 분말을 얻는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이 때, 구절초를 저급 알코올에 침지시켜 반복 추출함으로써 관절염 및 골다공증의 예방 및 치료 효과를 나타내는 구절초의 알코올 추출물을 얻는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 1) 단계에서 저급알코올은 10 내지 95% 농도의 에탄올을 사용하는 것이 바람직하며, 초음파 추출기를 2 - 3주 동안 처리하여 추출물을 얻는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 골관절질환이란 모든 종류의 골질환을 의미하고, 그 중 특히 관절염 및 골다공증을 포함한 것을 의미한다. 관절염의 염증반응 및 파골세포의 분화 및 골재흡수를 억제하는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 구절초 추출물을 함유하는 관절염 질환 예방 및 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 제조 될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 추출물 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 셀룰로스, 스테아르산 마스네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 골관절 질환 예방 및 치료용 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 통상적으로 첨가되는 성분을 포함 할 수 있는데, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제이다.

본 발명의 조성물의 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 구절초 및 동속식물의 전초 추출물의 제조

관절염 및 골다공증의 우수한 예방 및 치료 효과를 나타내는 구절초 (Chrysanthemu zawadskii var . latilobum ) 및 동속식물 전초 추출물을 얻기 위하여 열탕 및 유기용매 추출방법을 이용하여 구절초 추출물을 제조하였다.

(1) 열탕 추출방법

구절초 및 동속식물 전초의 열탕 추출물을 제조하기 위하여, 구절초 및 동속식물 전초를 증류수로 세척하여 분쇄기로 잘게 분쇄한 후, 열탕에서 가열하여 구절초 추출물을 얻었다.

이 때, 구절초 및 동속식물 전초 원료 각 100g에 대하여 물 1.0ℓ를 첨가한 후 100-120℃의 열탕에서 대략 2 내지 3시간 동안 가열하여 추출하였고, 일정한 온도를 유지하고 증기로 손실을 막기 위하여 냉각기를 설치하였다.

이로부터 얻은 구절초 추출물을 여과하여 상등액을 얻고 이를 농축기를 이용하여 농축하였다. 상기 구절초 농축액을 냉동시켜 -80℃에서 동결건조하여 구절초 추출물의 엑기스 분말을 제조하였다.

(2) 유기용매 추출방법

구절초 및 동속식물 전초의 유기용매 추출물을 제조하기 위하여, 구절초를 10~95% 에탄올에 침지시켜 초음파 추출기로 약 2~3주 동안 추출하여 추출물을 얻은 후 상층액만을 분리하여 이를 거즈에 걸러 이물질을 제거하였다.

상기 공정에 의해 얻은 알코올 추출물을 농축기를 이용하여 농축한 후 냉동시키고 -80℃에서 동결건조하여 구절초 및 동속식물 전초 추출물의 엑기스 분말을 제조하였다.

실시예 2. 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 구절초 추출물의 영향

상기 실시예 1로부터 추출한 구절초 및 동속식물 전초추출물이 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서의 관절염 유발 억제 효과를 검색하였다.

일반적으로 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델로 알려진 DBA1/J mice에 type II collagen으로 주입 시키고, 23일 후에 type II collagen을 반복투여(boosting) 시켰다. 구절초 추출물의 억제효과를 확인하기 위해 구절초 추출물, 인도메타신(양성대조군) 또는 음성대조군(용매)의 각 군에 하루에 한 번 약 18일간 경구투여를 실시하였다.

(1) 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 관절염 유발 정도에 대한 구절초 추출물의 영향

23일 후에 type II collagen을 반복투여(boosting) 시점부터 하루 한번 양성, 음성대조군을 포함하여 구절초 추출물의 경구 투여를 실시하며, 격일로 마우스 네 발에 관절염 유발 정도에 따라 다음 기준에 따라 평가하였다.

0점 : 부종이나 종창이 없다.

1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적

2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적

3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적

4점 : 발목에서 다리전체에 걸펴 부종과 발적있는 경우

그 결과, 도 1에서 보는바와 같이 정상군, 음성 대조군(용매), 양성 대조군으로 사용되어진 인도메타신을 기준으로 하여 구절초 추출물이 관절염 유발을 억제하는 우수한 효능을 지님을 알 수 있었다. 1mg/kg에서 구절초를 투여하지 않은 대조군에 배해 약50%정도의 억제를 보였으며 10mg/kg이상에서 85%이상의 억제 효능을 보여 아주 우수한 관절염 억게 효능을 보였다.

(2) 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 조직학적인 변화에 대한 구절초 추출물의 영향

콜라겐 유도 관절염 질환 마우스의 뒷발을 3일간 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시킨 후 30일간 4℃, 10% 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)에 탈회 시켰다. 조직을 파라핀화 시킨 후, 절단하여 hematoxylin & eosin 염색을 시켰다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 음성대조군(용매)과 비교하여 구절초 추출물 (100mg/kg)을 경구투여한 마우스의 조직에서 면역세포의 침투, 연골조직의 파괴, 뼈의 부식이 통계학적으로 유의성있게 감소한 것 (*p < 0.05)을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 구절초 추출물의 관절염 유발 매개체들의 생성에 대한 작용기전 연구

콜라겐 유도 관절염 질환 동물에서 연골조직파괴인자(MMP-1/3), 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)과 케모카인(MIP-1, MCP-1, RANTES)의 조직내 생성을 확인하고자 각각에 특이적인 프라이머(표 1)를 활용하여 RT-PCR을 실시하였다. 우선 콜라겐 유도 관절염 질환 마우스의 조직을 갈아 trizol reagent (Invitrogen)로 용해시켰다. 용해된 시료를 1.5ml E-tube에 옮긴 후, 클로로포름(chloroform)을 200㎕ 넣어 섞고, 12,000g에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상층액과 이소프로판올(isopropanol)을 1:1로 섞은 후 -20℃에서 RNA를 한 시간 이상 침전시켰다. 그 후 12,000g에서 20분간 원심분리하여 RNA를 완전히 침전시킨 뒤, 에탄올로 씻어주고 DEPC-water 50㎕에 녹여서 total RNA를 얻어 PCR을 수행하였다.

그 결과, 구절초 전초 추출물에 의한 MMP-1/3의 발현 및 사이토카인, 케모카인 생산에 대한 억제정도는 유의적이고 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 구절초 추출물은 관절 조직 내에 다양한 관절염 유발 인자 생산의 억제를 통해 관절염 치료 효능을 나타냄을 알 수 있었다(도 3참조).

실시예 4. 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 파골세포의 형성에 대한 구절초 추출물의 영향

콜라겐 유도 관절염 질환 마우스의 발목 조직에서 관절염 및 골다공증 유발에 중요한 인자인 파골세포의 분화를 확인하였다. 상기 실시예 2의 실험방법과 같이 콜라겐에 의해 관절염이 유발된 마우스의 관절을 TRAP염색(파골세포 특이염색법)하여 파골세포의 분화정도를 관절조직에서 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 보여지는 바와 같이 콜라겐으로 유도된 관절염 관절조직에서 파골세포의 숫자는 현저히 증가하였으며, 이 증가는 구절초 추출물에 의해 유의성있게 (**p<0.01) 억제됨을 확인할 수 있었다. 이는 구절초 추출물이 골다공증 등의 원인이 되는 골조직에서 파골세포의 분화도 유의하게 억제함을 알 수 있었다.

실시예 5. 마우스의 골수세포에 M- CSF (사이토카인)과 RANKL ( 골분화인자 )를 처리하여 여러 핵을 가진 파골세포 형성에 구절초 추출물의 농도별 영향.

DBA/1J male, 5-6-weeks-old mice 를 구입하여, 약 1주간 적응기간을 가진 후, 대퇴골에서 bone marrow macrophage(BMM)을 얻어서 10% FBS와 M-CSF (10ng/ml) + RANKL (100 ng/ml)가 포함된 α-MEM 배양액에서 배양하였다. 구절초 추출물은 1 - 100 μg/ml 농도로 처리하였으며, 3일후에 새로운 배지로 교체해 주고 5일간 배양하였다. 5일 후 TRAP stain kit을 이용하여 염색하여, 염색된 세포 중 핵이 3개 이상인 것만 파골세포로 판단하여 숫자를 계산하였다.

그 결과, 도 5에서 보는바와 같이 음성대조군(용매투여군)과 비교하여 구절초 추출물(10 μg/ml)을 처리한 시험군에서 파골세포의 수가 유의성 있게 (*p<0.05) 감소한 결과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 구절초추출물은 농도의존적으로 골조직에서 파골세포의 형성을 억제하여 실시예 4(도면 4)와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 구절초 추출물이 우수한 골다공증에 중요한 파골세포 분화 억제능을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 6. 구절초 추출물의 골재흡수 억제 효능

골조직이 코팅된 배양기에 마우스유래 대식세포를 1 x 10⁵cells/well로 분주 한 후, M-CSF (30ng/ml)과 sRANKL(100ng/ml)를 첨가한 α-MEM에서 배양했다. 3일 배양 후에 배지를 교체해주고 5일후에 배양기 표면에 골재흡수를 확인하였다. 또한, 이미지분석기(Multigauge S/W, Fugifilm, Japan)를 이용하여 전체 면적 중 골재흡수가 일어난 면적을 측정하여 %로 표시 하였다.

그 결과, 구절초 추출물은 골조직이 코팅된 배양기에서 골재흡수를 추출물을 투여하지 않은 음성대조군에 비해 유의성있게 억제하였다 (도 6참조). 이러한 결과는 구절초추출물이 파골세포에 의한 골재흡수를 유의하게 억제함을 알 수 있었다.

실시예 7. 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 NF - kB 의 DNA 결합 활성화에 있어 구절초 추출물의 영향

관절염 및 파골세포 분화 등 골관절질환의 발병에 있어 중요한 역할을 하는 전사 인자로 알려진 NF-kB의 DNA 결합 활성화를 마우스의 발목 조직으로부터 추출하여 단백질 양을 정량한 후, Electrophoresis mobility-shift assay(EMSA)를 통해 NF-kB의 활성화를 실험하였다. 관절조직에서 추출한 핵을 NF-kB는 5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3와 일치하는 binding sequence을 포함한 biotin-labeled oligonucleotide와 배양 후, 6%의 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)을 사용하여 15℃에서 30분간 반응시키고 나서 300mA로 30분간 biodyne B membrane으로 전환(transfer)시켰다. horseradish peroxidase-based chemi-luminescence를 사용하여 DNA와 비오틴결합(부착)을 확인하였다.

그 결과, 도 7에서 보는바와 같이 음성 대조군(용매)은 정상군과 비교하여 NF-kB의 활성화가 현저하게 억제된 결과를 확인 할 수 있었다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

연골조직파괴인자(MMP-1, MMP-3), 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 케모카인(MIP-1, MCP-1, RANTES)의 발현 및 파골세포의 분화를 억제하는 효과를 갖는 구절초 추출물을 포함하는 관절염 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
단, 상기 구절초 추출물은 열탕 추출법 또는 용매 추출법에 의해 추출된 것을 특징으로 한다.
제 1 항에 있어서,
상기 구절초 추출물은 국화과 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum Kitamura), 포천구절초(Chrysanthemum zawadskii var. tenuisectum), 한라구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp. coreanum), 낙동구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp. Naktongense) 및 바위구절초(Chrysanthemum zawadskii var. alpinum)의 추출물인 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 관절염 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 열탕 추출법은
(1) 구절초를 증류수로 세척하여 분쇄기로 분쇄하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 구절초를 100 내지 120℃의 열탕에서 2 내지 3시간 동안 가열하여 구절초 추출물을 수득하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 구절초 추출물을 여과하여 상등액을 얻고 농축하는 단계; 및
(4) 상기 (3)단계에 의한 구절초 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 엑기스 분말을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 관절염 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 (2)단계에서 구절초 100g에 대해 물 1.0ℓ를 첨가하는 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 관절염 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 용매 추출법은
(1) 구절초를 10 내지 95% 농도의 에탄올에 침지시켜 초음파 추출기로 추출하여 알콜 추출물을 얻는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 얻은 구절초 추출물을 농축하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계에 의해 제조된 구절초 추출물 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 엑기스 분말을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 관절염 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
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연골조직파괴인자(MMP-1, MMP-3), 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 케모카인(MIP-1, MCP-1, RANTES)의 발현 및 파골세포의 분화를 억제하는 효과를 갖는 구절초 추출물을 포함하는 관절염 예방 및 개선용 건강기능식품.
단, 상기 구절초 추출물은 열탕 추출법 또는 용매 추출법에 의해 추출된 것을 특징으로 한다.
연골조직파괴인자(MMP-1, MMP-3), 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 케모카인(MIP-1, MCP-1, RANTES)의 발현 및 파골세포의 분화를 억제하는 효과를 갖는 구절초 추출물을 포함하는 골다공증 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
단, 상기 구절초 추출물은 열탕 추출법 또는 용매 추출법에 의해 추출된 것을 특징으로 한다.
제 13 항에 있어서,
상기 구절초 추출물은 국화과 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum Kitamura), 포천구절초(Chrysanthemum zawadskii var. tenuisectum), 한라구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp. coreanum), 낙동구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp. Naktongense) 및 바위구절초(Chrysanthemum zawadskii var. alpinum)의 추출물인 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 골다공증 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 열탕 추출법은
(1) 구절초를 증류수로 세척하여 분쇄기로 분쇄하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 분쇄된 구절초를 100 내지 120℃의 열탕에서 2 내지 3시간 동안 가열하여 구절초 추출물을 수득하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에 의해 수득된 구절초 추출물을 여과하여 상등액을 얻고 농축하는 단계; 및
(4) 상기 (3)단계에 의한 구절초 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 엑기스 분말을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 골다공증 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
제 15 항에 있어서,
상기 (2)단계에서 구절초 100g에 대해 물 1.0ℓ를 첨가하는 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 골다공증 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 용매 추출법은
(1) 구절초를 10 내지 95% 농도의 에탄올에 침지시켜 초음파 추출기로 추출하여 알콜 추출물을 얻는 단계;
(2) 상기 (1)단계에 의해 얻은 구절초 추출물을 농축하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계에 의해 제조된 구절초 추출물 농축액을 냉동시킨 후 -80℃에서 동결건조하여 엑기스 분말을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구절초 추출물을 포함하는 골다공증 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
연골조직파괴인자(MMP-1, MMP-3), 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 케모카인(MIP-1, MCP-1, RANTES)의 발현 및 파골세포의 분화를 억제하는 효과를 갖는 구절초 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품.
단, 상기 구절초 추출물은 열탕 추출법 또는 용매 추출법에 의해 추출된 것을 특징으로 한다.