KR20190060720A

KR20190060720A - 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법

Info

Publication number: KR20190060720A
Application number: KR1020180147145A
Authority: KR
Inventors: 이창진
Original assignee: ㈜로제타엑소좀
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2019-06-03
Also published as: KR102161280B1

Abstract

본 발명은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 반건식 크기 배제 크로마토그래피 고정상에 세포밖 소포체가 비특이적으로 결합되어 손실되는 것을 방지함으로써 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체 분리 방법의 단점을 보완하고, 다양한 시료에서 세포밖 소포체를 신속하고 효율적으로 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포밖 소포체의 분리 방법은 초원심분리기와 같은 고가의 장비가 필요하지 않고, 세포밖 소포체의 형태나 성질을 보존하면서 효율적으로 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 반건식 크기 배제 크로마토그래피에서 세포밖 소포체가 손실되는 점을 크게 개선함으로써 통상의 세포밖 소포체 분리법과 결합하여 높은 순도의 세포밖 소포체를 분리하는데 적극적으로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법은 소량의 시료에 전처리 및 후처리 단계에 적용함으로써 신속하게 임상 진단에 활용할 수 있다.

Description

반건식 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법{Method of isolating extracellular vesicles using semi-dry size-exclusion chromatography}

본 발명은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 반건식 크기 배제 크로마토그래피 고정상에 세포밖 소포체가 흡착(adsorption) 또는 비특이적으로 결합되어 손실되는 것을 방지함으로써 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체 분리 방법에서 단점을 보완하고, 다양한 시료로부터 세포밖 소포체를 신속하고 효율적으로 분리하는 방법에 관한 것이다.

세포밖 소포체는 생체 내 또는 시험관 내의 여러 종류의 세포로부터 분비되는 생체 나노입자로서, 혈액, 소변, 침, 눈물 등과 같은 체액에 존재하고 세포에서 유래한 지질이중층을 포함하며, 20 ~ 10,000 nm 범위의 다양한 크기를 갖는 막 구조의 소포체이다.

세포밖 소포체는 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA 등의 세포 내 물질을 전달하는 운송체 역할을 하기 때문에 세포밖 소포체를 분비한 원래 세포(모세포)의 단백질, 지질, 아미노산, RNA 등을 그대로 포함하고 있어, 모세포의 생리적·병리적 특성을 알 수 있는 중요한 근거가 된다. 또한 세포밖 소포체에 포함되어 있는 핵산, 성장호르몬, 단백질 등은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 가용성 형태의 성장인자 및 사이토카인보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다는 점이 알려지면서, 세포밖 소포체의 중요성이 점차 증대되고 있으며, 세포밖 소포체에 포함된 물질을 분석하여 질병의 진단, 치료를 포함한 다양한 용도로의 활용 가능성이 기대되고 있다.

세포밖 소포체는 크기가 나노 미터 수준으로 작고, 체액 내 세포 배양액 등에는 세포밖 소포체 이외에도 수 많은 물질이 존재한다. 따라서 세포밖 소포체의 분석을 위해서는 체액 내 및 세포 배양액 등의 시료로부터 세포밖 소포체를 분리하는 것이 중요하며, 세포밖 소포체의 분리는 이를 활용하는 모든 분야에서 가장 핵심적인 기술이다.

종래의 보편적인 세포밖 소포체 분리 기술로는 초원심분리(ultra- centrifugation), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation), 미세유체칩(microfluidics chip) 또는 폴리머를 이용한 방법 등이 있으며, 이중 초원심분리법이 가장 널리 사용되고 있었다. 그러나 초원심분리를 이용하는 경우, 분리 단계가 복잡하여 노동력과 시간이 많이 소요되며, 고가의 장비를 필요로 할 뿐만 아니라 수율과 순도가 현저히 낮아, 소량의 시료만 이용하여 신속하게 결과를 얻어야 하는 임상 진단 및 다량의 세포밖 소포체가 필요한 치료 방법으로 적용하는 데는 적합하지 않다.

이에 세포밖 소포체는 이들을 포함하는 생물학적 시료에 존재하는 다양한 물질들에 비하여 상대적으로 분자량이 크다는 물리적 특징을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 정제 방법이 점차 보편화되고 있다. 한편, 크기 배제 크로마토그래피 방법은 세포밖 소포체의 순도를 높일 수 있다는 장점이 있으나, 크기 배제 크로마토그래피의 원리상 최종 정제한 물질이 크게 희석된다는 단점이 있고, 세포밖 소포체의 순도를 높이기 위한 전개 시간이 상대적으로 길어 후속 분석 또는 응용에 어려움이 많다는 문제점이 있다.

이러한 크기 배제 크로마토그래피의 단점을 보완한 기법으로 반건식(semi-dry) 크기 배제 크로마토그래피가 점차적으로 이용되고 있다. 반건식 크기 배제 크로마토그래피는 시료 로딩 전 주사식 또는 회전식 방법으로 컬럼내 고정상을 반건식으로 평형시켜 컬럼에 존재하는 이동상의 부피를 최소화시키는 것을 특징으로 한다. 평형시킨 컬럼에 시료를 로딩한 후 세포밖 소포체를 용출함으로써 분리된 세포밖 소포체의 희석률을 크게 감소시킬 뿐 아니라 시료의 신속한 분리가 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 세포밖 소포체를 정제하는 경우 반건식 고정상에 쉽게 흡착되기 때문에 분리 수율이 떨어진다는 한계가 있다. 따라서 세포밖 소포체의 구조와 기능을 온전히 유지함과 동시에 상기 크기 배제 크로마토그래피 기술의 약점을 보완할 수 있는 효율적인 분리, 정제 기술의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명의 목적은 (a) 컬럼에 충전된 고정상을 반건식으로 평형시키는 단계, (b) 블로킹 물질 및 세포밖 소포체가 포함된 시료의 혼합물을 상기 고정상에 로딩하는 단계 및 (c) 상기 컬럼에서 세포밖 소포체를 용출시키는 단계를 포함하는 세포밖 소포체 분리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 컬럼에 충전된 고정상을 블로킹 물질을 포함하는 용액을 이용하여 반건식으로 평형시키는 단계, (b) 상기 컬럼에 세포밖 소포체가 포함된 시료를 로딩하는 단계 및 (c) 상기 컬럼에서 세포밖 소포체를 용출시키는 단계를 포함하는 세포밖 소포체 분리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 통상의 세포밖 소포체 분리 방법인 반건식 크기 배제 크로마토그래피의 단점을 개선하고 분리 효율을 향상시킬 수 있는 분리 방법을 제공한다.

본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법은 통상의 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 방법에 있어서, 고정상과 비특이적으로 결합하는 블로킹 물질을 투입함으로써 시료 중의 세포밖 소포체가 고정상에 흡착되거나 비특이적으로 결합하여 손실되는 것을 방지함으로써 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포체의 분리 효율을 높일 수 있다.

본 발명의 용어 "세포밖 소포체"는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포로부터 유래한 생체 나노입자를 통칭하며, 세포밖 소포체(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 미세소포(microvesicle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 세포밖 소포체-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법은 세포밖 소포체를 포함하는 시료에 세포밖 소포체의 크기보다 작은 블로킹 물질을 혼합한 후 반건식으로 평형된 크기 배제 컬럼에 로딩함으로써 컬럼 내 고정상과 세포밖 소포체 간의 흡착 및 비특이적 결합을 블로킹 물질이 방해하여 시료로부터 효과적으로 세포밖 소포체를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일구현예는 (a) 컬럼에 충전된 고정상을 반건식으로 평형시키는 단계, (b) 블로킹 물질 및 세포밖 소포체가 포함된 시료의 혼합물을 상기 고정상에 로딩하는 단계 및 (c) 상기 컬럼에서 세포밖 소포체를 용출시키는 단계; 를 포함하는 세포밖 소포체 분리 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 세포밖 소포체의 분리 방법을 도 1에 모식적으로 나타내었다.

본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법은 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 고정상을 충전한 후 컬럼에 충전된 고정상을 반건식으로 평형시키는 단계[(a) 단계]를 포함한다.

본 발명의 용어 "컬럼"은 크기 배제 크로마토그래피에 사용되는 다공성 고정상이 채워진 단위이며, 상기 "고정상"은 분자량에 따라 물질을 분획하기 위한 다양한 크기의 구멍이 있는 입자를 의미한다. 상기 고정상에 존재하는 구멍의 크기에 따라 시료 내 존재하는 분자들의 분자 크기에 따른 분리 해상능이 변하게 된다. 예로, 고정상에 존재하는 구멍이 큰 경우는 상대적으로 큰 분자들의 분리에 효율적이고 상대적으로 작은 분자는 분리되지 않고 용출된다. 반면, 고정상에 존재하는 구멍의 크기가 작은 경우 큰 분자들의 분리 정도는 낮게 용출되지만, 일정 크기 이상과 이하의 분자를 분리하는 데는 효율적일 수 있다. 따라서 통상적으로는 분리하고자 하는 분자의 크기와 시료 내 오염물질의 크기를 고려하여 최적의 분리 효율을 제공하는 크기의 구멍을 가진 고정상을 선택하게 된다. 크기 배제 크로마토그래피에서 가장 널리 사용되는 고정상은 세파로즈(Sepharose; GE Healthcare), 수퍼로즈(Superose; GE Healthcare), 세파덱스(Sephadex;　Pharmacia),　Bio-Gel　P(Bio-Rad)와 TSKgel® (silica-based; Sigma) 등의 계열이며, 본 발명의 일실시예에서는 나노 입자인 세포밖 소포체를 다양한 크기의 단백질과 분리할 수 있는 크기의 구멍을 가진 세파크릴(Sephacryl) S500 고정상을 사용하였지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 반건식 크기 배제 크로마토그래피 전개 방식은 회전식을 이용하였지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어 "평형(equilibration)"이란, 컬럼에 분리하고자 하는 시료를 로딩하기 전에 수행하는 과정으로, 컬럼 내 고정상을 채운 후 완충용액을 로딩하고 회전식으로 고정상을 세척함으로써 컬럼을 반건식 상태로 이동상의 부피를 최소화시키는 단계이다.

본 발명의 고정상 평형 단계는 통상적인 크기 배제 크로마토그래피에서 사용되는 완충용액을 사용할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법은 상기 평형시킨 고정상에 블로킹 물질 및 세포밖 소포체가 포함된 시료의 혼합물을 로딩하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

본 발명의 용어 "시료"는 세포밖 소포체를 포함하는 생체 시료 또는 세포 배양액, 조직 시료 등을 포함하는 것으로서, 구체적으로 포유동물 세포 배양 배지, 박테리아 세포 배양 배지, 효모 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk), 먼지, 담수, 해수, 토양 및 발효식품으로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어 "블로킹 물질"은 크기 배제 크로마토그래피의 고정상에 흡착 또는 비특이적으로 결합하는 물질을 의미하며, 특히 세포밖 소포체와 경쟁적으로 작용하여 세포밖 소포체가 고정상과 결합하는 것을 막을 수 있는 물질이다. 바람직하게, 상기 블로킹 물질은 분리하고자 하는 세포밖 소포체보다 크기가 작은 단백질 물질을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법에 사용될 수 있는 블로킹 물질은 상기 성질을 갖는 하나의 물질일 수 있고, 둘 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 상기 블로킹 물질은 크기 배제 크로마토그래피에 이용되는 통상의 고정상과 흡착 또는 비특이적 결합을 이룰 수 있는 단일 물질 또는 다양한 물질의 조합으로, 고정상과 흡착 또는 복잡한 비특이적 결합을 형성할 수 있는 물질을 말한다. 바람직하게 본 발명의 블로킹 물질은 세포밖 소포체보다 크기가 작은 물질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 블로킹 물질은 우혈청(Fetal bovine serum, FBS), 또는 우혈청 알부민(Fetal bovine albumin, BSA)과 같은 단일 단백질 또는 단백질 복합물이 개시되고 있으나, 상기와 같은 블로킹 역할을 할 수 있는 물질이라면 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 용어 "비특이적 결합"은 다양한 형태의 분자 간 비공유 결합을 의미하며, 구체적으로 수소결합(hydrogen bonds), 이온결합(ion interactions), 소수성 결합(hydrophobic interaction), 반데르발스의 힘(van der Waals force) 등을 포함할 수 있다. 분자 간의 비특이적 결합은 한 가지 종류의 결합에 의한 것일 수도 있고, 2종 이상의 결합이 동시에 작용한 것일 수도 있다. 본 발명에서 크기 배제 크로마토그래피의 고정상은 세포밖 소포체 또는 블로킹 물질과 흡착에 의한 결합 또는 비특이적 결합을 할 수 있으며, 세포밖 소포체와 블로킹 물질은 경쟁적으로 고정상과 비공유 결합을 할 수 있다.

상기 단계를 통해 블로킹 물질이 고정상에 흡착되거나, 비특이적 결합을 형성함으로써 시료 내에 포함된 세포밖 소포체가 상기 고정상에 결합되는 것을 저해하고, 결과적으로 세포밖 소포체의 분리 효율을 극대화하는 역할을 한다.

본 발명의 일실시예에서는 블로킹 물질과 시료의 혼합물을 로딩한 경우 세포밖 소포체 분리 수율이 향상된다는 것을 확인하였고, 특히 우혈청(FBS) 또는 우혈청 알부민(BSA)을 블로킹 물질로 포함시켰을 때 수율이 극대화 된다는 것을 알 수 있었다(도 3). 또한, 블로킹 물질의 농도에 비례하여 분리된 세포밖 소포체의 수율이 증가(도 4)하였으며, 상기 우혈청 알부민의 블로킹 효과는 통상적으로 사용되는 소금(NaCl)의 농도에 영향을 받지 않았다(도 5).

다음으로, 본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법은 상기 컬럼에서 세포밖 소포체를 용출시키는 단계[(c) 단계]를 포함한다.

반건식 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 로딩하고 회전식으로 이동상을 전개시키면 시료 중 세포밖 소포체와 같이 큰 분자가 선택적으로 용출되고 나머지 크기가 작은 물질은 컬럼 내부에 머무르게 되어 크기가 큰 세포밖 소포체를 시료로부터 분리할 수 있다. 일반적으로 세포밖 소포체는 분자의 크기가 1,000 kDa 이상으로 다른 불순물에 비해 크기가 큰 입자에 속하기 때문에 회전식 이동상 전개에서 우선적으로 이동상과 함께 용출된다. 용출되는 물질의 분자량은 다공성 정지상의 크기 및 구멍 크기, 컬럼의 길이, 이동상의 유속 등에 따라 상이하며, 동일한 조건에서는 용출되는 분자의 크기가 일정하다. 본 발명의 일실시예에서는 세파크릴 S500으로 채워진 컬럼(8 x 20 mm)에 HBS 완충 용액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)을 첨가한 후 회전식(300 xg, 5 분)으로 세척하여 평형시킨 반건식 고정상에, 2 mg의 표본 세포밖 소포체와 다양한 농도의 블로킹 물질을 혼합하여 로딩하고 해당 컬럼을 700 xg, 5 분 간 회전식으로 전개한 후 용출물을 분석하였다.

본 발명의 또 다른 일구현예는 (a) 컬럼에 충전된 고정상을 블로킹 물질을 포함하는 용액을 이용하여 반건식으로 평형시키는 단계, (b) 상기 컬럼에 세포밖 소포체가 포함된 시료를 로딩하는 단계 및 (c) 상기 컬럼에서 세포밖 소포체를 용출시키는 단계를 포함하는 세포밖 소포체 분리 방법을 제공한다.

상기 구현예에서는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 고정상을 충전한 후 컬럼에 충전된 고정상을 블로킹 물질을 포함하는 용액을 이용하여 반건식으로 평형시키는 단계[(a) 단계]를 포함하는 것을 특징으로 한다.

고정상의 평형 단계에서 블로킹 물질을 포함하는 완충 용액을 이용함으로써 고정상을 먼저 블로킹시킬 수 있으며, 이로 인해 시료에 별도의 블로킹 물질을 혼합하지 않더라도, 분리 효율을 높일 수 있다는 점을 확인하였다(도 6).

또한, 본 발명의 분리 방법에 있어서 상기 블로킹 단계[(a) 단계]와 시료 로딩 단계[(b) 단계] 모두에서 블로킹 물질을 혼합하여 사용할 수도 있다. 이 경우, 2 단계로 고정상을 블로킹할 수 있으므로, 세포밖 소포체 분리 효율을 극대화할 수 있다는 점을 하기 실시예를 통해 확인하였다(도 7).

본 발명의 분리 방법에 있어서, 블로킹 물질의 종류, 농도 및 평형 완충 용액 또는 시료에 대한 혼합 비율 등은 분리 대상이 되는 시료 또는 세포밖 소포체의 성질 및 분리 목적에 따라 최적화하여 당업자에 의해 변형될 수 있다.

본 발명에 따른 세포밖 소포체의 분리 방법은 초원심분리기와 같은 고가의 장비가 필요하지 않고, 분리 과정에서 시료가 극한의 환경에 노출되지 않기 때문에 세포밖 소포체의 형태나 성질을 보존하면서 효율적으로 분리할 수 있다는 장점이 있다. 이 뿐만 아니라 본 발명의 방법은 종래의 반건식 크기 배제 크로마토그래피에서 세포밖 소포체가 손실되는 점을 크게 개선함으로써 통상의 세포밖 소포체 분리법과 결합하여 높은 순도의 세포밖 소포체를 분리하는데 적극적으로 활용될 수 있으며, 종래 방법의 수행 전 단계 또는 후 단계에 적용함으로써 분리 효율을 극대화할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포밖 소포체 분리 방법은 효과적으로 세포밖 소포체를 분리할 수 있어, 소량의 시료에 전처리 및 후처리 단계에 적용함으로써 신속하게 임상 진단에 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포밖 소포체 분리 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 대장암 세포주(SW480) 유래 표본 세포밖 소포체의 분리 결과이다.
도 3은 다양한 블로킹 물질이 혼합된 시료에서, 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포체의 분리 결과이다.
도 4는 다양한 농도의 우혈청 알부민이 혼합된 시료에서, 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포체의 분리 결과이다.
도 5는 10% 우혈청 알부민과 다양한 농도의 소금이 혼합된 시료에서, 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포체의 분리 결과이다.
도 6은 다양한 농도의 우혈청 알부민으로 고정상이 블로킹된 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포체의 분리 결과이다.
도 7은 블로킹 물질을 포함하는 시료에서 고정상이 블로킹된 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포체의 분리 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 표본 세포밖 소포체의 정제 및 분석

대장암 세포주 SW480 배양액을 500 xg에서 10분, 2,000 xg에서 20분 간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상기 상층액에 존재하는 세포밖 소포체를 1차 정제 및 침전하기 위하여, 세포밖 소포체를 폴리에틸렌글리콜 용액(8.4% Polyethylene Glycol 6000, 250 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH7.4)을 첨가하여 16시간 동안 냉장 보관한 후, 12,000 xg에서 30분간 원심분리하여 침전된 세포밖 소포체를 수확한 후 HEPES 완충용액(HBS, HEPES-buffered saline, 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)에 침전물을 녹였다.

밀도 및 부력을 이용하여 세포밖 소포체를 2차 정제하기 위하여, 상기 시료에 대하여 30% - 20% - 5% 옵티프랩(Optiprep) 부력 밀도 구배 초원심분리를 200,000 xg에서 2 시간 동안 수행하였다. 초원심분리 후 세포밖 소포체와 상등 밀도(1.08 ~ 1.12 g/ml) 밴드를 수확하였다. 수확한 밴드를 세파크릴(Sephacryl) S500으로 충전된 컬럼(10 x 100 mm)에 로딩하고 분자 크기 배제 크로마토그래피를 통해 최종적으로 세포밖 소포체를 정제하였다.

상기 세포밖 소포체의 정제 방법에 따라 최종 분리한 표본 세포밖 소포체의 순도를 분석하기 위해 HPLC 분석 및 웨스턴 블럿을 수행하였다(도 2(a) 및 2(b)). HPLC 분석에서는, HPLC용 TSKgel6000 컬럼(7.5 x 600 mm)에 상기 방법에 따라 정제한 표본 세포밖 소포체를 로딩한 후 HEPES 완충용액을 유동상으로 하여 0.5 ml/min 로 흘려주면서 280 nm 흡광도를 추적하여 정제한 시료의 순도를 검증하였다. 웨스턴 블럿에서는 세포밖 소포체 마커 단백질(Alix, CD63, CD9) 및 비 세포밖 소포체 단백질들(calnexin, Histone H2B)을 이용하여 정제 결과를 분석하였다. 또한, 분리된 세포밖 소포체의 크기를 DLS(dynamic light scattering)으로 확인하였고(도 2 (c)), 투과전자현미경으로 모양을 확인하였다(도 2(d)).

그 결과, 상기 대장암 세포주로부터 분리한 표본 세포밖 소포체는 순도가 매우 높으며, 평균 크기는 지름 약 160 nm의 온전한 이중막을 가진 나노입자임을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 블로킹 물질 종류에 따른 세포밖 소포체 분리 효율

본 발명의 방법에 따라 반건식 크기 배제 크로마토그래피의 고정상에 세포밖 소포체의 비특이적 결합을 차단할 수 있는 인자를 탐색하고자 세포밖 소포체 시료와 다양한 블로킹 물질의 혼합물을 이용하여 분리 효율을 비교하였다.

상기 대장암 유래 표본 세포밖 소포체 2 μg을 동일한 양의 다양한 저분자 물질(Trehalose, Glycerol, DMSO), 나노 입자가 제거된 10%(v/v) 우혈청(Fetal bovine serum), 또는 10%(v/v) 우혈청 알부민(Fetal bovine albumin)과 혼합한 후 반건식으로 평형시킨 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 각각 로딩하였다. 컬럼을 700 xg에서 5분 간 원심분리하면서 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다(도 3(a)).

상기 용출물 내 세포밖 소포체의 수확률을 확인하기 위하여 세포밖 소포체의 마커인 CD9 단백질에 대한 웨스턴 블럿을 수행하였고(도 3(b)), 추가로 나노입자 분석(NPA, Nanoparticle Analysis)을 수행하여 세포밖 소포체의 용출률을 확인하였다(도 3(c)).

그 결과, 우혈청 또는 우혈청 알부민과 같이 단백질 등을 포함하여 복잡한 성질을 가지는 블로킹 물질은 반건식 크기 배제 크로마토그래피의 고정상과 세포밖 소포체와의 결합을 효과적으로 방해함으로써 세포밖 소포체의 수율을 현저히 향상시킨 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 블로킹 물질 농도에 따른 세포밖 소포체 분리 효율

우혈청 알부민의 농도에 따른 세포밖 소포체의 분리 효율을 확인하고자, 상기 반건식 크기 배제 크로마토그래피의 고정상에 다양한 농도의 우혈청 알부민을 혼합시킨 시료를 로딩하였다. 구체적으로, 정제된 대장암 유래 표본 세포밖 소포체 2 μg과 다양한 농도의 우혈청 알부민(0%, 5%, 10%) 2 μg을 혼합한 후 반건식으로 평형시킨 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 각각 로딩하고, 700 xg에서 5 분 간 원심분리하여 회전식 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다(도 4(a)).

상기 용출물 내 세포밖 소포체의 수확률을 확인하기 위하여 세포밖 소포체의 마커인 CD9 단백질에 대한 웨스턴 블럿을 수행하여 세포밖 소포체의 용출률을 확인하였다(도 4(b)). 그 결과, 우혈청 알부민을 포함하지 않은 시료(0% BSA)에 비해 5% 또는 10% BSA를 포함한 경우 세포밖 소포체 분리 효율이 현저히 증가하였다. 또한, 우혈청 알부민의 농도에 비례하여 건식 크기 배제 크로마토그래피의 고정상과 세포밖 소포체와의 결합을 효과적으로 방해함으로써 세포밖 소포체의 수확률이 더욱 향상되는 것 알 수 있었다.

아울러, 통상적으로 크기 배제 크로마토그래피에서 수소결합 및 이온결합을 저해하는 목적으로 첨가되는 소금(NaCl)의 농도에 따라 우혈청 알부민에 의한 블로킹 효과에 영향을 미치는지 확인하였다. 상기와 같은 방법에서 대장암 유래 세포밖 소포체 시료 및 10% BSA 혼합물에 다양한 농도(0.15M, 0.5M, 1.0M)의 소금을 혼합하여 세포밖 소포체를 분리하였다. 용출물 내 세포밖 소포체를 웨스턴 블럿 및 나노 입자 분석으로 확인한 결과, 우혈청 알부민에 의한 블로킹 효과는 소금의 농도에 영향을 받지 않음을 알 수 있었다(도 5).

실시예 4. 블로킹 물질을 이용한 고정상의 평형 후 세포밖 소포체 분리 효율 확인

본 발명의 다른 구현예로서, 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 로딩하기 전에 먼저 컬럼을 블로킹하였다. 구체적으로, 준비된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 고정상을 담고, 원심분리를 통하여 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 고정상을 반건식으로 평형시킨 후, 우혈청 알부민이 없는 HBS 완충용액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4) 700 μl, 1% 우혈청 알부민이 포함된 완충용액 700 μl, 또는 2% 우혈청 알부민이 포함된 완충용액 700 μl을 로딩한 후 원심분리하면서 컬럼을 블로킹하였다. 상기 블로킹된 컬럼에 추가로 완충용액을 로딩하고 원심분리하기를 6회 반복하여 잉여의 알부민을 세척하였다. 최종 세척된 컬럼에 2 μg의 대장암 유래 표본 세포밖 소포체를 로딩한 후 원심분리를 통하여 세포밖 소포체를 용출시켰다(도 6(a)).

각 컬럼의 세포밖 소포체의 수득률을 웨스턴 블럿(도 6(b))을 통하여 비교한 결과, 우혈청 알부민을 이용하여 건식 크기 배제 크로마토그래피의 고정상을 먼저 블로킹한 경우, 세포밖 소포체 수율이 현저히 향상되었다. 이로부터 시료에 블로킹 물질을 혼합하지 않더라도 효과적으로 세포밖 소포체와 고정상의 비특이적 결합을 저해함으로써 세포밖 소포체의 분리 효율을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. 블로킹 물질을 이용한 고정상의 평형 및 시료 로딩 시 세포밖 소포체의 분리 효율 확인

본 발명의 또 다른 구현예로서, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 블로킹시킨 후, 시료와 블로킹 물질의 혼합물을 로딩하여 세포밖 소포체 분리 효율을 확인하였다. 구체적으로, 준비된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 고정상을 담고, 원심분리를 통하여 크기 배체 크로마토그래피 컬럼의 고정상을 반건식으로 평형시켰다. 다음으로, 700 μl의 완충용액, 또는 700 μl의 2% 우혈청 알부민을 첨가한 완충용액을 로딩하고 원심분리하면서 컬럼을 블로킹하였다. 상기 블로킹된 컬럼은 추가로완충용액을 로딩하고 원심분리하기를 6회 반복하여 잉여의 알부민을 제거하였다. 최종 세척된 컬럼에 세포밖 소포체 시료와 10%의 우혈청 알부민 혼합 시료, 또는 우혈청 알부민이 첨가되지 않은 세포밖 소포체 시료를 각각 로딩한 후 원심분리를 통하여 세포밖 소포체를 용출시키고(도 7(a)), 최종 정제된 세포밖 소포체의 수득율을 웨스턴 블럿(도 7(b))으로 비교하였다. 그 결과, 우혈청 알부민을 이용하여 건식 크기 배제 크로마토그래피의 고정상을 먼저 블로킹한 후, 10% 알부민을 포함하는 세포밖 소포체 시료를 로딩하여 용출하는 경우, 세포밖 소포체 분리 효율이 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 이로부터 시료 로딩 전에 컬럼을 블로킹하고, 시료에 추가로 블로킹 물질을 혼합하여 로딩함으로써 세포밖 소포체와 반건식 크기 배제 크로마토그래피의 고정상과의 비특이적 결합을 가장 효과적으로 저해할 수 있으며, 세포밖 소포체의 용출률을 현저히 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

(a) 컬럼에 충전된 고정상을 반건식으로 평형시키는 단계;
(b) 블로킹 물질 및 세포밖 소포체가 포함된 시료의 혼합물을 상기 고정상에 로딩하는 단계; 및
(c) 상기 컬럼에서 세포밖 소포체를 용출시키는 단계;
를 포함하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 블로킹 물질은 상기 고정상의 흡착 자리 또는 비특이적 결합 자리에 세포밖 소포체와 경쟁적으로 작용하는 물질인 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 블로킹 물질은 분리하고자 하는 세포밖 소포체보다 크기가 작은 단백질 물질을 포함하는 것인 세포밖 소포체 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 블로킹 물질은 우혈청(Fetal bovine serum), 또는 우혈청 알부민(Fetal bovine albumin)인 세포밖 소포체 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 시료는 포유동물 세포 배양 배지, 박테리아 세포 배양 배지, 효모 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk), 먼지, 담수, 해수, 토양 및 발효식품으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 시료를 로딩하기 전에 시료의 전처리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제6항에 있어서,
상기 시료의 전처리 단계는 원심분리, 초원심분리, 여과, 한외여과, 음파처리, 밀도 구배 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 폴리머 기반 침전 및 유기 용매 침전으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하는 것인 세포밖 소포체 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 용출 단계 후에 용출물의 후처리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제8항에 있어서,
상기 용출물의 후처리 단계는 원심분리, 초원심분리, 여과, 한외여과, 음파처리, 밀도 구배 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 폴리머 기반 침전 및 유기 용매 침전으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하는 것인 세포밖 소포체 분리 방법.
(a) 컬럼에 충전된 고정상을 블로킹 물질을 포함하는 용액을 이용하여 반건식으로 평형시키는 단계;
(b) 상기 컬럼에 세포밖 소포체가 포함된 시료를 로딩하는 단계; 및
(c) 상기 컬럼에서 세포밖 소포체를 용출시키는 단계;
를 포함하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제10항에 있어서,
상기 블로킹 물질은 상기 고정상의 흡착 자리 또는 비특이적 결합 자리에 세포밖 소포체와 경쟁적으로 작용하는 물질인 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제10항에 있어서,
상기 블로킹 물질은 분리하고자 하는 세포밖 소포체보다 크기가 작은 단백질 물질을 포함하는 것인 세포밖 소포체 분리 방법.
제10항에 있어서,
상기 블로킹 물질은 우혈청(Fetal bovine serum), 또는 우혈청 알부민(Fetal bovine albumin)인 세포밖 소포체 분리 방법.
제10항에 있어서,
상기 (a) 단계 이후에 상기 평형시킨 고정상을 블로킹 물질을 포함하지 않는 용액으로 추가로 평형시키는 단계를 더 포함하는 세포밖 소포체 분리 방법.
제10항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 상기 시료는 세포밖 소포체가 포함된 시료와 블로킹 물질의 혼합물인 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체 분리 방법.