CN114555114A - 组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及用于治疗B细胞恶性肿瘤的方法和组合物。具体地，本披露涉及一种B细胞恶性肿瘤药物或组合物，其包含：(a)抗体‑药物缀合物(ADC)，其包含与缀合至核酸交联剂的B细胞成熟抗原(BCMA)结合的抗体或其抗原结合片段；以及(b)蛋白酶体抑制剂。

Description

组合疗法
对以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的ASCII文本文件的以电子方式提交的序列表内容(名称：BCMA-150-US-PSP-SequenceListing.txt；大小：11,279字节；以及创建日期：2019年5月28日)通过引用以其全文并入本文。
背景技术
血癌是一个术语，用于描述影响血细胞、骨髓或淋巴系统的许多不同类型的癌症。据报道，血癌几乎占美国每年新发癌症病例的10％，仅在美国就有超过120万人患有血癌或从血癌缓解。它是英国第五大最常见的癌症，英国每年有超过240,000人患有血癌，并且有40,000人被诊断出患有血癌。三大类血癌是白血病、淋巴瘤、和骨髓瘤，每一种都代表B细胞恶性肿瘤。
例如，B细胞恶性肿瘤骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))是一种克隆性浆细胞(例如B细胞)的恶性肿瘤，其持续的DNA损伤与从意义不明的恶性前单克隆丙种球蛋白病(MGUS)进展到活跃MM相关。目前骨髓瘤的治疗方案包括常规皮质类固醇、烷化剂、蛋白酶体抑制剂(PI)和免疫调节药物(IMiD)，这些都有助于提高骨髓瘤患者的总体生存率。近年来已经探索的一个特别令人感兴趣的治疗途径是免疫疗法(例如使用单克隆抗体)。例如，WO 2010/104949和WO 2019/025983描述了与称为B细胞成熟抗原(BCMA)的抗原结合的抗体，已经显示BCMA对B细胞恶性肿瘤(特别是骨髓瘤细胞)具有良好的选择性，其中所描述的抗体显示出抗B细胞恶性肿瘤活性。
尽管不同治疗的可用性增加，但是药物抗性的发展是疾病复发的基础(特别是在骨髓瘤中)，并且任何治疗的有效性都受到可耐受剂量可达到的最大功效的限制。
因此，需要具有抗B细胞恶性肿瘤活性的改进药物。本发明解决了上述问题中的一个或多个。
发明内容
本发明涉及B细胞恶性肿瘤的组合疗法。
本发明基于以下令人惊讶的发现：蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)可以用于与抗BCMA抗体-药物缀合物协同作用(反之亦然)，这增加了与这些药剂组合接触后B细胞恶性肿瘤的细胞的细胞毒性。因此，本发明的开创性发现是蛋白酶体抑制剂可以用于增强抗体-药物缀合物的抗B细胞恶性肿瘤活性(反之亦然)，更特别地，在药物(或所述抗体-药物缀合物)是核酸交联剂的情况下。
在一方面，本文提供了一种B细胞恶性肿瘤药物，包含：
a.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与缀合至核酸交联剂的B细胞成熟抗原(BCMA)结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的药物相比时，所述药物提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的药物相比时，所述药物提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
在另一方面，本文提供了用于治疗B细胞恶性肿瘤的治疗组合，所述治疗组合包含：
a.ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
在另一方面，本文提供了一种用于治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗组合，所述组合包含：
a.ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
在另一方面，本文提供了一种用于增强恶性B细胞的ADC抑制的体外方法，所述方法包括使恶性B细胞与以下接触：(a)ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段，与(b)蛋白酶体抑制剂组合。
在另一方面，本文提供了一种用于增强蛋白酶体抑制剂抑制的体外方法，所述方法包括使恶性B细胞与以下接触：(a)蛋白酶体抑制剂，与(b)ADC组合，该ADC包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段。
附图说明
图1显示了M2针对MM细胞的细胞毒性比其MMAF ADC同系物(M3)更强。A将M2或M3的连续稀释物添加到MM细胞培养物中，持续3d，随后进行CCK8细胞活力测定。显示的是M2(黑色圆圈)和M3(空心圆圈)的ED50值，这些值是从一个代表性实验中确定的，其中重复三次，每个剂量一式三份。分别源自MM1S和H929的MM1S(R)和H929(R)细胞对来那度胺和泊马度胺具有抗性。RPMI-BCMA，过表达BCMA的RPMI8226细胞；RPMI，RPMI8226细胞。B添加M2(黑色圆圈)或M3(空心圆圈)，持续3d，随后是使用[H3]胸苷掺入(左)的细胞增殖测定，以及基于以下的活力测定：RPMI8226的CCK8，和配对的ANBL6和ANBL6-BR(硼替佐米(btz)抗性)细胞的基于发光的细胞滴度生长(CTG)。C用M2或M3处理地塞米松(Dex)和btz抗性MM细胞对2d，随后进行流式细胞术(FCM)分析，从而确定凋亡细胞的百分比(膜联蛋白V+/Aqua-和膜联蛋白V+/Aqua+)。***，p＜0.0005；**，p＜0.005。
图2显示了M2比M3更有效地阻断BMSC诱导的MM细胞活力并且对原代患者来源的MM细胞具有细胞毒性。A将MM1Sluc细胞，单独地或与BMSC一起用M2或M3处理4d，并且通过BLI确定细胞活力。B CFSE标记的IMiD抗性MM1S(R)或H929(R)细胞在有或没有BMSC的情况下与指定的药物一起孵育2d，随后使用膜联蛋白V和活的/死的Aqua染色进行FCM分析。显示的是来自三个实验之一的膜联蛋白V-/Aqua-(活的)CFSE+MM细胞的百分比，每个剂量一式三份。C将H929细胞，单独地或与IL-6(5ng/ml)一起，用M2处理2d，并且测量膜联蛋白V-/Aqua-(活的)细胞的百分比。D将来自代表性RRMM患者的CD138+细胞与M2或M3一起孵育3d，并且测量活的/死的细胞分数。E来自RRMM患者(n＝3)的CD138+细胞与M2一起孵育3d，随后进行CTG测定。F将MM患者(NDMM＝4，RRMM＝2)的BMMC用M2(10μg/ml)处理5d。通过FCM分析确定活的CD38高CD138+细胞的百分比。
图3显示了M2比M3更有效地阻断细胞增殖并且诱导MM细胞系中的细胞凋亡，而不论药物敏感性如何。A将M1(同种型-PBD)、M2(抗BCMA-PBD)、M3(抗BCMA-MMAF同系物)和M4(同种型-MMAF)添加到MM细胞中，一式三份，持续3d，随后进行CCK8活力测定。B添加M2或M3持续3d，随后使用[H3]-胸苷掺入进行增殖测定。C在用btz进行2d处理后，使用基于CTG的生存期测定(左)，和使用膜联蛋白V和活的/死的Aqua染色的基于FCM的细胞凋亡测定(右)，确认ANBL6(btz敏感性)和ANBL6-BR(btz抗性)细胞，D用指定的药物处理MM1S(上小图)和MM1R(下小图)细胞。显示了膜联蛋白V+MM细胞的百分比。
图4显示了M2诱导针对受BMSC和IL-6保护的MM细胞的特异性细胞毒性，并且进一步耗尽CD38高CD138+患者MM细胞。A各种药物敏感性和抗性MM细胞系(n＝6)，单独地或与BMSC一起，用M2处理3d，随后进行CTG测定。B用M2处理BCMA阴性BMSC、PBMC和NK细胞5d。CH929细胞，单独地或与IL-6(5ng/ml)一起，用M2处理3d。D将代表性NDMM患者的BMMC与M2一起孵育5d。M2以剂量依赖性方式减少CD38高CD138+MM细胞。
图5显示了M2与硼替佐米一起协同诱导MM细胞死亡。A-B用指定的药物处理MM细胞2d，随后使用PI和膜联蛋白V染色进行FCM分析。显示了每个细胞系的一个代表性样品的结果(A)，和来自三个重复的膜联蛋白V+细胞的百分比的总结(B)。*，p＜0.01；**，p＜0.005，***，p＜0.002，C将来自基于CTG的细胞活力测定的数据用于确定组合指数(CI)。“效果”意指通过M2和btz对细胞活力的降低程度。CI＜1表明两种药物具有协同作用。从另外的3个重复中获得了类似的结果。
图6显示了低剂量的M2和btz的组合触发协同的MM细胞死亡。将指定的MM细胞系单独地或与M2和btz一起孵育3d，随后进行基于CTG的活力测定。“效果”代表在M2加btz处理的组合处理下，显示活力降低的细胞分数。组合指数(CI)＜1表明协同作用。所有实验一式三份进行，并且显示平均值。
图7显示，当与单独的单个药物相比时，M2与硼替佐米组合在小鼠中诱导更有效的体内抗MM活性和延长的生存期。A将具有可触知的MM1S肿瘤植入物的CB17 SCID小鼠(每组n＝7)随机化，并且用对照媒介物、单剂量的M2(0.4mg/kg)、六个剂量的btz(0.4mg/kg)、或M2和btz的组合(M2+btz)治疗2周。与对照组(cnt)相比，组合治疗组的肿瘤生长受到显著抑制。(M2比对M2+btz，p＝0.035；btz比对M2+btz，p＜0.005；cnt比对M2+btz；p＝0.0012；btz比对cnt，p＜0.005；M2比对cnt，p＜0.005)。*，p＜0.04，**，p＜0.005，B跟踪动物的体重。C使用Kaplan-Meier和对数秩分析，用组合疗法治疗的动物的中位总体生存期显著延长。(cnt，22d；M2，40.5d；btz，35d；M2+btz，57d)(M2比对M2+btz，p＜0.045；btz比对M2+btz，p＜0.023；cnt比对M2+btz，p＜0.002)。D对来自每组的肿瘤组织切片进行针对Ki-67的免疫组织化学分析(原始放大倍数，x400)。
图8显示了用M2和btz的组合治疗显著降低了MM1S异种移植物的体内生长，证明了M2和btz在治疗骨髓瘤中的体内协同作用。在同一治疗日从代表性小鼠中去除肿瘤。
图9显示了无论p53状态和药物抗性如何，M2显著诱导MM细胞中DNA损伤反应(DDR)信号传导通路的磷酸化。具有野生型(MM1S、MM1R、H929)和突变p53(*)的MM细胞用指定剂量的M2(a-d)处理指定时间段(a)、过夜(b、d)或2d(c)。制备细胞裂解物，并且使用针对指定分子的特异性抗体，通过免疫印迹进行分析。cPARP，裂解的PARP；cCas3，裂解的半胱天冬酶3。将实验重复三次。
图10显示了M2以BCMA依赖性方式显著诱导DDR信号传导级联，随后是细胞凋亡。用指定剂量的M2(A-B，D-F)或M3(A，F，G)处理指定的MM细胞过夜(A，D，G)或2d(B，E-F)。制备细胞裂解物，并且使用针对指定分子的特异性抗体，通过免疫印迹进行分析。M2，而不是M3，诱导DDR信号传导通路。cPARP，裂解的PARP；cCas3，裂解的半胱天冬酶3。(C)使用qRT-PCR测量BCMA水平。BCMA中、BCMA低和BCMA高源自亲本RPMI8226。
图11 M2处理诱导DDR相关基因表达，包括RAD51。在亚致死条件下，使用
Figure BDA0003376841640000071
人类DNA修复途径阵列分析来自用M2处理的活的H929 MM细胞的RNA(a)。将转录物通过内部对照的几何平均值标准化，并且显示了M2处理相对于对照(cnt)组的变化倍数。细胞裂解物由各种M2处理的MM细胞系制成，用于免疫印迹，从而确定RAD51的蛋白水平(b-c)。
具体实施方式
在一方面，本文提供了一种B细胞恶性肿瘤药物，包含：
a.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与缀合至核酸交联剂的B细胞成熟抗原(BCMA)结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的药物相比时，所述药物提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的药物相比时，所述药物提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
另一方面提供了用于治疗B细胞恶性肿瘤的治疗组合，所述治疗组合包含：
a.ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
在相关方面，提供了一种用于治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗组合，所述组合包含：
a.ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
所述对B细胞恶性肿瘤的增强抑制可以包括选自以下项的一个或多个：增加的肿瘤生长延迟、增加的肿瘤大小减小、增加的肿瘤转移减少、提高的包含B细胞恶性肿瘤的受试者的生存率、或其组合。
术语“B细胞恶性肿瘤”包括B细胞癌变和不受控制地分裂(例如在骨髓和血液中)并且可以侵入其他部位(例如组织和淋巴系统)的任何疾病。在一个实施例中，所述B细胞恶性肿瘤是选自以下项中的一个或多个：B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤和/或骨髓瘤祖细胞)、或其组合。术语“B细胞”包括成熟(分化的)B细胞及其前体(例如干细胞)二者。例如，包括骨髓瘤干细胞和骨髓瘤祖细胞。
在一个实施例中，B细胞恶性肿瘤的特征在于包含表达BCMA的恶性B细胞。在一个实施例中，所述恶性B细胞表达高水平的BCMA抗原(相对于参考非恶性B细胞)。当与非恶性的(例如健康的)B细胞中的BCMA表达的水平相比，恶性B细胞中的BCMA抗原表达水平增加到统计学显著水平时，恶性B细胞被认为表达“高水平的BCMA”。
B细胞淋巴瘤的实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、和原发性眼内淋巴瘤。B细胞白血病的实例包括B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、前体B淋巴细胞白血病和毛细胞白血病。
在一个实施例中，所述B细胞恶性肿瘤是骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)。
多发性骨髓瘤(MM)，也称为浆细胞骨髓瘤或卡勒氏病，是一种B细胞(浆细胞)的癌症，浆细胞是一种通常负责产生抗体的白细胞。MM的当前疗法包括化学疗法、放射疗法、手术、生物膦酸盐和自体干细胞移植(ASCT)。尽管这些疗法通常会导致缓解，但是几乎所有患者最终都会复发并且死亡。多发性骨髓瘤每年影响每100,000人中的1-4人。该病在男性中更为常见，并且由于仍未知的原因，其在非裔美国人中的发病率是高加索美国人的两倍。
B细胞成熟抗原(BCMA)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)，是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员。BCMA表达在终末分化的B细胞上最高。BCMA参与介导浆细胞的生存，用于维持长期的体液免疫。BCMA的表达与多种癌症、自身免疫性障碍和传染性疾病有关。BCMA RNA已经在多发性骨髓瘤细胞中普遍检测到，并且一些研究人员已经在来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞的表面上检测到BCMA蛋白。因此，BCMA代表了B细胞恶性肿瘤，特别是多发性骨髓瘤的治疗靶标。
人类BCMA(TNFRSF17)的核苷酸序列在Ensembl(参见登录号ENSG 00000048462)中描述，将其通过引用并入本文。BCMA(TNFRSF17)的氨基酸序列在UniProt(参见登录号Q02223，将其通过引用并入本文)中描述。人类BCMA的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：13中。
BCMA还在多发性骨髓瘤干细胞上表达。因此，术语“骨髓瘤”包括多发性骨髓瘤“干”细胞和骨髓瘤“祖”细胞。此外，本发明的方法和用途包括治疗包含多发性骨髓瘤干细胞(例如表达BCMA的)的恶性肿瘤。多发性骨髓瘤干细胞(和/或骨髓瘤祖细胞)可以在多发性骨髓瘤患者的骨髓中通过其表面表达CD19和缺少CD138表达来鉴定。这些细胞是独特的克隆生成和移植免疫缺陷的小鼠，而定义为CD138+CD19-的骨髓瘤浆细胞则不是。
术语“抗体-药物缀合物”意指抗体(或其抗原结合片段)，该抗体(或其抗原结合片)经由化学接头附接至细胞毒性剂(通常是具有高全身毒性的小分子药物)。该术语在本文中用于描述与核酸交联剂缀合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，ADC可以包含已经被化学修饰以含有接头的核酸交联剂(例如，小分子细胞毒素)。然后可以使用该接头从而将核酸交联剂(细胞毒素)与抗体或其抗原结合片段缀合。在与细胞表面上的靶抗原(BCMA)结合之后，ADC被内化并运送到溶酶体，在溶酶体中核酸交联剂(细胞毒素)通过可切割的接头的蛋白质水解(例如，通过溶酶体中发现的组织蛋白酶B)或通过抗体的蛋白质降解(例如如果经由不可切割的接头附接至细胞毒素)释放。细胞毒素然后从溶酶体中转移出并且转移到细胞溶质或细胞核中，在细胞溶质或细胞核中然后它可以根据其作用机制结合至其靶标上。
在一个实施例中，所述核酸交联剂是细胞毒性核酸交联剂。
已经发现蛋白酶体抑制剂可用于多种癌症疗法。诸位发明人惊讶地发现，蛋白酶体抑制剂可以用于增强(例如协同增强)本发明的ADC的抗B细胞恶性肿瘤活性，并且相反，本发明的ADC可以用于增强(例如协同增强)蛋白酶体抑制剂的抗B细胞恶性肿瘤活性。不希望受理论束缚，本发明的诸位发明人认为，蛋白酶体抑制剂的活性可以通过引起下游(分子)效应导致一种或多种分子的抑制来增强本发明的ADC的活性，例如，其可以通常抑制ADC的核酸交联剂(例如PBD细胞毒素)的活性，并且甚至可能导致对核酸交联剂的抗性。这种活性可能与其作为直接蛋白酶体抑制剂的“正常”活性有关或与其分开。这种理论得到以下观察结果的支持，即本发明的治疗组合甚至针对对作为单一疗法的蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)具有抗性的恶性B细胞显示出增强的活性。
相反地，不希望受理论束缚，本发明的ADC的活性可以通过引起下游(分子)效应导致一种或多种分子的抑制来增强蛋白酶体抑制剂的活性，例如，其可以通常抑制蛋白酶体抑制剂的活性，并且甚至可能导致对蛋白酶体抑制剂的抗性。
蛋白酶体抑制剂会产生若干种后果。例如，它们可能会导致生物活性蛋白(例如IκB，它是核因子-κB(一种参与细胞生存的蛋白)的抑制剂)的水平升高。此外，错误折叠的蛋白和其他废弃的蛋白也会积聚，并且引发未折叠蛋白反应(UPR)，这会导致内质网(ER)应激。
在一个实施例中，蛋白酶体抑制剂是基于硼酸的蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)。
在一个实施例中，蛋白酶体抑制剂是选自以下项中的一个或多个：硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、马里佐米、奥普佐米、德兰佐米，或其组合。在一个实施例中，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。
硼替佐米(例如万珂)，以前称为PS-341(千禧制药公司(MillenniumPharmaceuticals)，坎布里奇，马萨诸塞州，美国)，作为26S蛋白酶体(它是一种多亚基蛋白复合物，负责泛素化蛋白的降解)的抑制剂起作用。硼替佐米是一种肽硼酸盐，分子式为C19H25BN4O：
Figure BDA0003376841640000121
卡非佐米
Figure BDA0003376841640000122
是一种环氧酮蛋白酶体抑制剂，与β5亚基(PSMB5)不可逆地结合。其式为：
Figure BDA0003376841640000123
伊沙佐米
Figure BDA0003376841640000124
选择性且可逆地抑制蛋白质蛋白酶体亚基5型(PSMB5)。其式为：
Figure BDA0003376841640000125
马里佐米(盐孢菌素A)通过共价修饰20S蛋白酶体的活性位点苏氨酸残基来抑制蛋白酶体活性。它与蛋白质蛋白酶体亚基β5、β1和β2上的3个主要催化位点不可逆地结合。其式为：
Figure BDA0003376841640000131
奥普佐米(称为ONX 0912)，具有下式：
Figure BDA0003376841640000132
德兰佐米(称为CEP-18770)，具有下式：
Figure BDA0003376841640000133
在一个实施例中，药物和/或治疗组合物包含在药物组合物中。术语“药物组合物”是指如下制剂，该制剂处于允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有另外的、对组合物将要施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。这样的组合物可以是无菌的。药物和/或治疗组合物可以包含药学上可接受的载体。示例性载体是生理盐水。适合的药物组合物可以包含一种或多种缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、稳定剂(例如，人白蛋白)、防腐剂(例如，苄醇)、以及增强生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规的增溶剂或分散剂。
在一个实施例中，本发明的药物、治疗组合或药物组合物可以包含药学上可接受的无毒的无菌载体，如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等。在本文披露的治疗方法中使用的适合的配制品描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第22版，Lloyd V.Allen，Jr.编辑(2012)中。在一个实施例中，本发明的药物、治疗组合或药物组合物可以包含在一种或多种配制品中，该配制品选自胶囊、片剂、水性悬浮液、溶液、鼻气雾剂、或其组合。在一个实施例中，药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、任选的稳定剂试剂(例如，人白蛋白)等。
具有“细胞毒性”的药剂(本文称为“细胞毒素”或“细胞毒性剂”)是抑制或阻止细胞的功能和/或造成细胞破坏(细胞死亡)、和/或施加抗增生作用的药剂。应当理解的是，ADC的细胞毒素或细胞毒性剂在本领域中也被称为ADC的“有效载荷”。
术语“核酸交联剂”意指与核酸的两个核苷酸反应，在它们之间形成共价连接的分子。这种交联可以发生在同一个链内(链内)或双链DNA的相反链之间(链间)。这些链接物(link)(加合物)干扰细胞代谢，例如DNA复制和转录，通常会引发细胞死亡。在一个实施例中，核酸是DNA。
在一个实施例中，核酸交联剂是通过诱导DNA链断裂(单链断裂和/或双链断裂)来破坏DNA并且通常随后导致细胞凋亡的药剂。在一个实施例中，核酸交联剂是细胞毒性核酸交联剂。
在一个实施例中，核酸交联剂是选自以下项中的一个或多个：吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003376841640000141
(PBD)、氮芥(nitrogen mustard)、顺铂、氯乙基亚硝基脲(CENU)、补骨脂素、丝裂霉素C(MMC)抗生素、或其组合。所述氮芥可以选自以下项中的一个或多个：环磷酰胺、氮芥(chlormethine、mechlorethamine或mustine)、乌拉莫司汀、尿嘧啶氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀或其组合。在一个实施例中，所述CENU是卡莫司汀。
在一个实施例中，核酸交联剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003376841640000142
(PBD)。
术语“吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003376841640000152
”包括吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003376841640000153
及其功能衍生物二者。
PBD是一类细胞毒性剂，在交联DNA之前转移到细胞核，阻止有丝分裂期间的复制，通过诱导DNA链断裂(单链断裂和/或双链断裂)破坏DNA，并且随后导致细胞凋亡。一些PBD还具有识别和结合至DNA特定序列的能力。在一个实施例中，PBD包含一般结构：
Figure BDA0003376841640000151
PBD在取代基的数目、类型和位置方面，在它们的芳香族A环和吡咯并C环二者方面，以及在C环的饱和度方面不同。在B环中，在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))、或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其是负责使DNA烷基化的亲电中心。所有已知的天然产物具有在手性C11a位置处的(S)-构型，当从C环向A环观察时，该构型向其提供了右旋扭曲。该特征也赋予PBD适合的三维形状以与B型DNA的小沟具有等螺旋性(isohelicity)，从而在结合位点处紧密配合。PBD可以在小沟中形成加合物，从而干扰DNA加工。
第一种PBD抗肿瘤抗生素，即氨茴霉素，于1965年被发现。从那时起，已经报道了许多种天然存在的PBD，并且已经针对多种类似物开发了10多种合成路线。家族成员包括阿比霉素(abbeymycin)、奇卡霉素(chicamycin)、DC-81、甲基氨茴霉素(mazethramycin)、新氨茴霉素(neothramycin)A和B、波罗斯拉霉素(porothramycin)、prothracarcin、西班米星(sibanomicin)(DC-102)、西伯利亚霉素和托马霉素。包含它们的PBD和ADC还被描述于WO2015/155345和WO 2015/157592中，将其通过引用以其全文并入本文。
在一个实施例中，PBD是PBD 3249，其在本文中又称为“SG3249”(例如更详细地描述于WO 2014/057074(将其通过引用并入本文)中)。PBD 3249(SG3249)包括以下结构：
Figure BDA0003376841640000161
在一个实施例中，PBD是PBD 3315，其在本文中又称为“SG3315”(例如更详细地描述于WO 2015/052322(将其通过引用并入本文)中)。PBD 3315(SG3315)包括以下结构：
Figure BDA0003376841640000162
在一个实施例中，PBD(例如详细地描述于WO 2017/137553中，将其通过引用并入本文)包括下式：
Figure BDA0003376841640000163
其中：
(a)R10和R11在它们所结合的氮和碳原子之间形成氮-碳双键；或
(b)R10是OH并且R11是：
Figure BDA0003376841640000171
在另一个实施例中，PBD是SG3400，还被称为化合物23(例如详细地描述于WO2017/137553中，将其通过引用并入本文)，并且具有以下结构：
Figure BDA0003376841640000172
在一个实施例中，PBD是包含至少两个PBD单体的PBD二聚体。例如，该至少两个PBD单体通过它们的芳香族A环酚类C8位经由柔性丙二氧基系链进行连接。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以使用位点特异性或非位点特异性缀合方法缀合至细胞毒素(异源药剂，例如PBD)。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含一个、两个、三个、四个或更多个PBD部分。在一个实施例中，所有PBD部分(与抗体或其抗原片段缀合)包含相同的结构。
本发明的核酸交联剂(细胞毒素)可以通过间隔物(例如，至少一个间隔物)连接(例如缀合)至该抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，该间隔物是肽间隔物。在一个实施例中，该间隔物是非肽(例如，化学的)间隔物。
用于抗体或其抗原结合片段的常规的缀合策略依赖于通过赖氨酸或半胱氨酸将有效载荷(细胞毒素)随机缀合至抗体或抗原结合片段。在一个实施例中，将该抗体或其抗原结合片段随机缀合至药剂(例如细胞毒素)，例如，通过对该抗体或片段进行部分还原，随后与所希望的药剂反应，其中接头部分被附接或不被附接。使用DTT或相似的还原剂可以还原该抗体或抗原结合片段。然后可以在DMSO的存在下，将接头部分附接或未附接的药剂以摩尔过量添加至经还原的抗体或片段中。缀合后，可以添加过量的游离半胱氨酸以淬灭未反应的药剂。然后可以将反应混合物进行纯化，并且缓冲液更换为PBS。
在一个实施例中，核酸交联剂(例如，细胞毒素)通过位点特异性缀合与抗体或其抗原结合片段缀合。在一个实施例中，使用在具体位置处的反应性氨基酸残基进行核酸交联剂(例如细胞毒素)与抗体或其抗原结合片段的位点特异性缀合产生了具有一致化学计量的均质ADC制剂。
该位点特异性缀合可以通过半胱氨酸、残基或非天然氨基酸进行。在一个实施例中，核酸交联剂(例如细胞毒素)通过至少一个半胱氨酸残基缀合至抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，核酸交联剂(例如细胞毒素)以化学方式缀合至氨基酸的侧链上(例如在抗体或抗原结合片段的Fc区中的特定Kabat位置处)。在一个实施例中，通过位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、440、441、442、443以及446中至少一处的半胱氨酸，通过在Fc区的任何适合位置处的半胱氨酸取代，将核酸交联剂(例如细胞毒素)缀合至抗体或其抗原结合片段，其中编号对应于Kabat中的EU索引。在一个实施例中，具体位置是239、442或二者，其中编号对应于Kabat中的EU索引。在一个实施例中，特定位置是位置442、在位置239和240之间的氨基酸(半胱氨酸)插入、或二者，其中编号对应于Kabat中的EU索引。在一个实施例中，核酸交联剂(细胞毒素)通过硫醇-马来酰亚胺连接缀合至该抗体或其抗原结合片段。在一些方面，氨基酸侧链是巯基侧链，例如位于抗体或其抗原结合片段的铰链和重轻链处的巯基反应性基团。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链恒定区。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的人κ恒定区。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含：
i.含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HCDR1，或其功能变体；
ii含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HCDR2，或其功能变体；
iii.含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HCDR3，或其功能变体；
iv.含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的LCDR1，或其功能变体；
v.含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的LCDR2，或其功能变体；以及
vi.含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的LCDR3，或其功能变体。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含：
i.含有与SEQ ID NO：7的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列的可变重链(VH)，或其功能变体；和/或
ii含有与SEQ ID NO：8的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列的可变轻链(VL)，或其功能变体；
在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含，含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含，含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含：
i.含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及
ii含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8是VH和VL的种系化形式。可替代地，抗体或其抗原结合片段可以包含非种系化VH和/或VL(例如SEQ ID NO：9的VH和SEQ ID NO：10的VL)。
本发明涵盖本文定义的具有所述CDR序列或可变重链和可变轻链序列的抗体(参考抗体)(例如，抗体或抗原结合片段)及其功能变体。功能变体结合至与参考抗体(例如BCMA)相同的靶抗原，并且可以表现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。当与参考抗体相比时，这些功能变体对于靶抗原可以具有不同的亲和力。在一个实施例中，功能变体具有基本相同的亲和力。
在一个实施例中，当与相应的参考CDR序列相比时，参考抗体的功能变体在一个或多个CDR处显示序列变异。因此，功能抗体变体可以包含CDR的功能变体。在CDR序列的背景下使用术语“功能变体”时，这意味着当与相应的参考CDR序列相比时，该CDR具有最多2个、或最多1个氨基酸差异，并且当与其余5个CDR(或其变体)组合时，使该变体抗体能够结合与参考抗体相同的靶抗原(例如BCMA)。在一个实施例中，功能变体表现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
在一个实施例中，功能变体抗体或其抗原结合片段包含：
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR1；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR2；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR3；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR1；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR2；以及
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR3；
其中功能变体与参考抗体结合相同的靶抗原。在一个实施例中，功能变体表现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
在一个实施例中，功能变体抗体或其抗原结合片段包含：
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR1；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR2；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR3；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR1；
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR2；以及
当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR3；
其中功能变体与参考抗体结合相同的靶抗原。在一个实施例中，功能变体表现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
例如，该抗体或抗原结合片段的功能变体可以包含：
当与SEQ ID NO：1相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR1；
当与SEQ ID NO：2相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR2；以及
当与SEQ ID NO：3相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR3；
当与SEQ ID NO：4相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR1；
当与SEQ ID NO：5相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR2；
当与SEQ ID NO：6相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR3；
其中该变体抗体结合BCMA(例如，BCMA多肽表位)，和/或其中该变体抗体可以表现出与参考抗体或抗原结合片段相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
在一个实施例中，该抗体或抗原结合片段的功能变体可以包含：
当与SEQ ID NO：1相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR1；
当与SEQ ID NO：2相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR2；以及
当与SEQ ID NO：3相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR3；
当与SEQ ID NO：4相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR1；
当与SEQ ID NO：5相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR2；
当与SEQ ID NO：6相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR3；
其中该变体抗体结合BCMA(例如，BCMA多肽表位)，和/或其中该变体抗体可以表现出与参考抗体或抗原结合片段相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
前述内容可以类似地应用于本文所述的其他抗体的变体，其中氨基酸差异是相对于其CDR序列定义的，并且其中该变体抗体结合与所述抗体相同的靶抗原，和/或其中该变体抗体可以表现出相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
在一个实施例中，当与相应的参考抗体相比时，功能变体抗体可以在其CDR中具有总计最多5、4或3个氨基酸差异，条件是每个CDR存在最多2个(例如最多1个)氨基酸差异。在一个实施例中，当与相应的参考抗体相比时，功能变体抗体在其CDR中具有总计最多2个(例如最多1个)氨基酸差异，条件是每个CDR存在最多2个氨基酸差异。在一个实施例中，当与相应的参考抗体相比时，功能变体抗体在其CDR中具有总计最多2个(例如最多1个)氨基酸差异，条件是每个CDR存在最多1个氨基酸差异。
该氨基酸差异可以是氨基酸取代、插入或缺失。在一个实施例中，该氨基酸差异是如本文所述的保守氨基酸取代。
在一个实施例中，功能变体抗体具有与本文所述的示例性抗体相同的框架序列。在另一个实施例中，功能变体抗体可包含具有最多2个、或最多1个氨基酸差异的框架区(当与相应的参考框架序列相比时)。因此，每个框架区可具有最多2个、或最多1个氨基酸差异(当与相应的参考框架序列相比时)。
在一个实施例中，当与相应的参考抗体相比时，功能变体抗体可以在其框架区中具有总计最多5、4或3个氨基酸差异，条件是每个框架区存在最多2个(例如最多1个)氨基酸差异。在一个实施例中，当与相应的参考抗体相比时，功能变体抗体在其框架区中具有总计最多2个(例如最多1个)氨基酸差异，条件是每个框架区存在最多2个氨基酸差异。在一个实施例中，当与相应的参考抗体相比时，功能变体抗体在其框架区中具有总计最多2个(例如最多1个)氨基酸差异，条件是每个框架区存在最多1个氨基酸差异。
因此，功能变体抗体可包含如本文所述的可变重链和可变轻链，其中：
当与本文所述的重链序列(例如SEQ ID NO.：7)相比时，该重链具有最多14个氨基酸差异(每个CDR中最多2个氨基酸差异，并且每个框架区中最多2个氨基酸差异)；以及
当与本文所述的轻链序列(例如SEQ ID NO.：8)相比时，该轻链具有最多14个氨基酸差异(每个CDR中最多2个氨基酸差异，并且每个框架区中最多2个氨基酸差异)；
其中该功能变体抗体结合至与参考抗体相同的靶抗原，和/或其中该功能变体抗体表现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
所述变体重链或轻链可以被称为参考重链或轻链的“功能等效物”。
在一个实施例中，功能变体抗体可以包含如本文所述的可变重链和可变轻链，其中：
当与本文的重链序列(例如SEQ ID NO.：7)相比时，该重链具有最多7个氨基酸差异(每个CDR中最多1个氨基酸差异，并且每个框架区中最多1个氨基酸差异)；以及
当与本文的轻链序列(例如SEQ ID NO.：8)相比时，该轻链具有最多7个氨基酸差异(每个CDR中最多1个氨基酸差异，并且每个框架区中最多1个氨基酸差异)；
其中该功能变体抗体结合至与参考抗体相同的靶抗原，和/或其中该功能变体抗体表现出与参考抗体相同的抗原交叉反应性(或缺少抗原交叉反应性)。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段以如下解离常数(KD)结合BCMA((例如人BCMA)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤10pM、≤1pM、或≤0.1pM。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段以如下KD结合BCMA(例如人BCMA)：约0.1nM至约40nM之间、约0.5nM至约30nM之间、1nM至约20nM之间、或约1.5nM至约20nM之间。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段以约23nM至约27nM之间的KD结合BCMA(例如人BMCA)。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段以约1nM至约1.5nM之间的KD结合BCMA(例如人BCMA)。KD测量(结合亲和力)可以通过本领域已知的任何适合的测定法进行。此类方法包括，例如，荧光激活细胞分选(FACS)、表面等离子体共振(例如，Biacore，ProteOn)、生物膜层干涉技术(BLI，例如Octet)、动力学排斥测定(例如，KinExA)、可分离的珠(例如，磁珠)、抗原淘选、ELISA、和/或ForteBio Octet系统。适合的动力学排斥测定包括KinExA系统(例如，KinExA 3100、KinExA 3200或KinExA 4000)(赛必因仪器公司(Sapidyne Instruments)，爱达荷州(Idaho))。
有利地，该治疗组合提供了此类蛋白酶体抑制剂用于靶向将通常对此类蛋白酶体抑制剂无反应性(例如具有抗性)的细胞的有目的的用途。例如，本发明的诸位发明人已经证明蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)即使在B细胞恶性肿瘤对蛋白酶体抑制剂具有抗性时也能增强ADC的抗B细胞恶性肿瘤活性(参见实例3)。
因此，本发明包括以蛋白酶体抑制剂的剂量组合施用ADC与蛋白酶体抑制剂(否则仅对B细胞恶性肿瘤提供低/差的抑制)，使得在所述添加之后，该组合现在能够证明具有改进的对B细胞恶性肿瘤的抑制。因此，本发明提供了蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)的“再利用”，用作ADC的增强剂，而不是使用(独立的)单一疗法(否则将无法有效对抗耐药性恶性肿瘤)。
类似地，本发明包括以ADC的剂量组合施用蛋白酶体抑制剂与ADC(否则仅对B细胞恶性肿瘤提供低/差的抑制)，使得在所述添加之后，该组合现在能够证明具有改进的对B细胞恶性肿瘤的抑制。因此，本发明提供了ADC的“再利用”，用作蛋白酶体抑制剂的增强剂，而不是使用(独立的)单一疗法(否则将无法有效对抗表达低水平的BCMA抗原的B细胞恶性肿瘤)。
因此，在一个实施例中，B细胞恶性肿瘤对蛋白酶体抑制剂(例如在不存在本发明的ADC的情况下包含蛋白酶体抑制剂的药物)具有抗性。在一个实施例中，所述蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。
在一个实施例中，B细胞恶性肿瘤对本发明的ADC(例如在不存在本发明的蛋白酶体抑制剂的情况下包含ADC的药物)具有抗性。在一个实施例中，对本发明的ADC具有抗性的B细胞恶性肿瘤的特征在于相对于参考非恶性B细胞而言，包含BCMA抗原的表达水平没有增加或降低的恶性B细胞。
该治疗组合还已经显示出对B细胞恶性肿瘤具有增强的活性，该B细胞恶性肿瘤对许多其他常见抗癌药物具有抗性(参见实例3)。因此，在一个实施例中，B细胞恶性肿瘤对一种或多种选自以下项的药物具有抗性：地塞米松、来那度胺、泊马度胺、硼替佐米、或其组合。
此外，由于组合的协同性质，可以使用更低剂量的组成部分，从而降低由于过度使用而对任一组成部分发展抗性(一种基本的公共健康威胁)的风险。事实上，本发明减少了对慢性治疗方案的处方的需要。例如，本发明的诸位发明人已经表明，当与蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)组合施用时，ADC的次优剂量的体内功效仍然增强。
因此，在一个实施例中，ADC和/或蛋白酶体抑制剂以次优剂量施用。
治疗组合的组成部分的应用/施用顺序可以变化。ADC和蛋白酶体抑制剂可以作为单一组合物的一部分或在分开的组合物中同时施用(例如，二者均按其自身的具体最佳剂量，用于实现协同作用)。例如，ADC可以存在于第一组合物中(例如适用于对受试者进行静脉内施用)，并且蛋白酶体抑制剂可以存在于第二组合物中(例如适用于对受试者进行静脉内、皮下或口服施用)。例如，当蛋白酶体抑制剂是硼替佐米时，所述第二组合物可以适用于静脉内或皮下注射。在其中蛋白酶体抑制剂是伊沙佐米的实施例中，所述第二组合物可以另外地或可替代地适于口服施用。
此外，可以在不同时间施用ADC和蛋白酶体抑制剂(例如可以预先施用蛋白酶体抑制剂，从而使恶性B细胞对ADC敏感)。因此，在另一个实施例中，将ADC和蛋白酶体抑制剂在不同时间、在单独的组合物中施用于受试者。
在一个实施例中，在ADC之前施用蛋白酶体抑制剂。在一个实施例中，与ADC同时施用蛋白酶体抑制剂。在一个实施例中，在ADC之后施用蛋白酶体抑制剂。
如本文所用，术语“治疗(treat或treating)”包括预防性治疗(例如预防B细胞恶性肿瘤的发作)，以及矫正性治疗(治疗已经患有B细胞恶性肿瘤的受试者)。在一个实施例中，本文所用的术语“治疗(treat或treating)”意指矫正性治疗。术语“治疗(treat或treating)”包括治疗B细胞恶性肿瘤及其症状二者。在一些实施例中，“治疗(treat或treating)”是指B细胞恶性肿瘤的症状。
因此，可以将治疗有效量或预防有效量的药物和/或治疗组合施用于受试者。
“治疗有效量”是药物和/或治疗组合的任何量，当单独地或组合向受试者施用以治疗B细胞恶性肿瘤(或其症状)时足以实现B细胞恶性肿瘤、或其症状的此类治疗。
“预防有效量”是药物和/或治疗组合的任何量，当单独地或组合向受试者施用时，抑制或延迟B细胞恶性肿瘤(或其症状)的发作或复发。在一些实施例中，预防有效量完全防止B细胞恶性肿瘤的发作或复发。“抑制”发作意指降低B细胞恶性肿瘤发作(或其症状)的可能性，或完全防止发作。
本发明的另外的方面提供了用于增强恶性B细胞的ADC抑制的体外方法，所述方法包括使恶性B细胞与以下接触：(a)ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段，与(b)蛋白酶体抑制剂组合。
在另一方面，提供了一种用于增强蛋白酶体抑制剂抑制的体外方法，所述方法包括使恶性B细胞与以下接触：(a)蛋白酶体抑制剂，与(b)ADC组合，该ADC包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段。
在上下文或本文所述的任何药物、方法、或用途中的术语“抑制(suppresses或suppressing)”包括“抑制”恶性B细胞的“生长”、“抑制其增殖”或将其“杀死”。提及“恶性B细胞”包括“包含恶性B细胞的肿瘤”。
术语“抑制(inhibits或inhibiting)”与术语“延缓”恶性B细胞的生长或“制止”其增殖、或“延缓”包含恶性B细胞的肿瘤的生长同义。在一个实施例中，本发明的治疗组合可以“杀死”恶性B细胞或“用于杀死”恶性B细胞、或包含恶性B细胞的肿瘤。术语“抑制”还包括阻止恶性B细胞、或包含恶性B细胞的肿瘤的生长(例如增殖)。
在一个实施例中，对B细胞恶性肿瘤的增强抑制可以包括选自以下项的一个或多个：增加的肿瘤生长延迟、增加的肿瘤大小减小、增加的肿瘤转移减少、提高的包含B细胞恶性肿瘤的受试者的生存率、或其组合。在一个实施例中，对B细胞恶性肿瘤的增强抑制包括选自以下项的一个或多个：增加的肿瘤生长延迟、增加的肿瘤大小减小、或其组合。
在一个实施例中，与除了缺少蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的药物和/或组合物相比，本发明的药物和/或治疗组合对B细胞恶性肿瘤的抑制增强了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％，或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或约100％。在一个实施例中，与除了缺少本发明的ADC之外其他方面均相同的药物和/或组合物相比，本发明的药物和/或治疗组合对B细胞恶性肿瘤的抑制增强了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％，或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或约100％。
可以通过测量细胞增殖来测量抑制，细胞增殖可以使用本领域公认的技术测定，其测量的细胞分裂速率，和/或经历细胞分裂的细胞群中细胞的分数、和/或由于终末分化或细胞死亡(例如，胸苷掺入)自细胞群的细胞损失的速率。
所述“B细胞恶性肿瘤的增强抑制”的评估通过参考所附实例来证明，并且可以使用实例(例如实例3)中描述的方法进行评估。例如，实例3描述了一种包括基于膜联蛋白V/PI的FMC分析的方法，该分析测量了与测试样品接触后，恶性B细胞的体外培养物中的“观察到的％凋亡细胞”值。这允许直接比较本发明的药物与除了缺少蛋白酶体抑制剂或ADC之外其他方面均相同药物之间的B细胞恶性肿瘤抑制。
在一个实施例中，当与不存在本发明的ADC、或蛋白酶体抑制剂(适合地蛋白酶体抑制剂)(但在其他方面相同的条件下)时获得的“观察到的％凋亡细胞”值相比，两种主要活性化合物(例如本发明的ADC、和蛋白酶体抑制剂)的组合获得的“观察到的％凋亡细胞”值更大时，B细胞恶性肿瘤的抑制被认为是增强了。
因此，在一个实施例中，可以通过在相同条件下，比较本发明的ADC和蛋白酶抑制剂的组合获得的“观察到的％凋亡细胞”值，与不存在本发明的ADC或蛋白酶体抑制剂(适合地缺少蛋白酶体抑制剂)的相同配制品(例如药物)获得的“观察到的％凋亡细胞”值，确定对B细胞恶性肿瘤的抑制增强了。
在一个实施例中，与在相同条件下，不存在本发明的ADC或蛋白酶体抑制剂(适合地缺少蛋白酶体抑制剂)时，相同配制品(例如药物)提供的观察到的％凋亡细胞相比，本发明提供了对B细胞恶性肿瘤的抑制增强了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(观察到的％凋亡细胞)。在一个实施例中，与在相同条件下，不存在本发明的ADC或蛋白酶体抑制剂(适合地缺少蛋白酶体抑制剂)时，相同配制品(例如药物)提供的观察到的％凋亡细胞相比，本发明提供了对B细胞恶性肿瘤的抑制增强了至少约65％(观察到的％凋亡细胞)。
在一个实施例中，本发明的ADC和蛋白酶体抑制剂的组合可以表现出对B细胞恶性肿瘤的协同抑制。
如本文所用，术语“协同”意指表现出的对B细胞恶性肿瘤的抑制大于其各部分的总和。换言之，对B细胞恶性肿瘤的抑制大于简单相加。
可以通过使用分析工具(例如CompuSyn(ComboSyn，Inc.公司))确定“组合指数”(CI)来测量协同作用，其中CI＜1表明本发明的主要活性组分的组合具有协同作用，CI＞1表明拮抗作用，并且CI为1表明作用是相加的。可以在本领域已知的任何细胞活力测定(例如相对于实施1-3的方法，替代性的或另外的方法，例如实例3中描述的“基于CellTiter-Glo的细胞活力”测定)中，通过比较以下的性能来测量所述CI：包含本发明的药物/治疗组合的组合物，与除了缺少本发明的ADC或蛋白酶体抑制剂(适合地缺少蛋白酶体抑制剂)之外其他方面均相同的组合物。
参考实例(例如实例3)，当CI小于约0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1或0.05时，可以认为存在B细胞恶性肿瘤的协同抑制。在一个实施例中，所述CI可以小于约0.7。在一个实施例中，所述CI可以小于约0.6。
在一个实施例中，“细胞活力测定”包括：在一定量的包含治疗组合(本发明的ADC和蛋白酶体抑制剂)的组合物的存在下，孵育包含恶性B细胞的测试样品；将孵育后(例如孵育至少0.5、1、1.5或2天后)的测试样品中的非存活细胞(例如凋亡细胞)的数量，与在除了缺少以下项之外其他方面均相同的组合物存在下孵育的对照样品中的非存活细胞的数量进行比较：(a)所述蛋白酶体抑制剂，或(b)所述ADC(适合地缺少所述蛋白酶体抑制剂)。
在一个实施例中，将治疗组合施用于受试者。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指哺乳动物受试者。在一个实施例中，“受试者”是人类、伴侣动物(例如宠物，例如狗、猫和/或兔)、家畜(例如猪、绵羊、牛和/或山羊)和/或马。在一个实施例中，该受试者是人类。
在本发明的方法中，受试者之前可能未被诊断为患有B细胞恶性肿瘤。可替代地，受试者之前可能已被诊断为患有B细胞恶性肿瘤。受试者也可以是表现出疾病风险因素的人，或对B细胞恶性肿瘤无症状的人。受试者也可以是患有B细胞恶性肿瘤的人，或具有发展B细胞恶性肿瘤的风险的人。在一个实施例中，受试者之前已被施用了针对B细胞恶性肿瘤的疗法。
在一个实施例中，本发明的方法和用途包括一个或多个施用步骤，该一个或多个施用步骤选自口服、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道、吸入、局部、或其组合。在一个实施例中，施用是选自以下项中的一个或多个：静脉内、动脉内(例如，通过注射或滴注)、皮下、或其组合。
抗体制备
本发明的抗体可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且它们的效用通过常规结合研究来证实-示例性方法描述于实例2中。举例来说，简单的结合测定是用抗体孵育表达抗原的细胞。如果将抗体用荧光团标记，则可以通过FACS分析来检测抗体与抗原的结合。
用于产生本发明的BCMA抗体及其抗体片段的方法描述于WO 2010/104949和WO2019/025983(特别是WO 2019/025983)中，二者都通过引用并入本文。
本发明的抗体可以在多种动物中产生，包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猴或马。可以在用单个英膜多糖或用多种英膜多糖进行免疫后产生抗体。从这些动物中分离出的血液含有多克隆抗体-与同一抗原结合的多种抗体。也可以将抗原注射到鸡中以在蛋黄中产生多克隆抗体。为了获得对抗原的单个表位具有特异性的单克隆抗体，从动物中分离出分泌抗体的淋巴细胞，并通过将它们与癌细胞系融合而使其永生化。融合的细胞被称为杂交瘤，并且在培养中会不断生长并分泌抗体。通过稀释克隆法分离单个杂交瘤细胞以生成均产生同一抗体的细胞克隆；这些抗体被称为单克隆抗体。用于生产单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的常规技术(参见例如，Making and Using Antibodies：A PracticalHandbook.[制备和使用抗体：实用手册]GC Howard.CRC Books.2006.ISBN 0849335280)。通常使用蛋白A/G或抗原亲和色谱法纯化多克隆和单克隆抗体。
本发明的抗体或其抗原结合片段可制备为单克隆抗体，其可使用杂交瘤方法制备，如Kohler和Milstein，Nature[自然]256：495(1975)描述的那些方法。使用杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生会特异性地结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并利用例如聚乙二醇与适合骨髓瘤细胞系融合，以形成可随后从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后产生特异性针对选定的抗原的单克隆抗体的杂交瘤(这是如通过免疫沉淀法、免疫印迹法、或通过体外结合测定(例如，放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))所确定的)可在体外培养物中使用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice[单克隆抗体：原理和实践]，学术出版社，1986)或在体内作为动物的腹水肿瘤繁殖。然后可以使用已知的方法从培养基或腹水中纯化单克隆抗体。
可替代地，该抗体或其抗原结合片段(例如，单克隆抗体)还可以使用如在美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法制备。从成熟B细胞或杂交瘤细胞、例如通过使用寡核苷酸引物(其特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因)的RT-PCR分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并且使用常规程序测定它们的序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，这些表达载体在转染到不产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞)中时，由这些宿主细胞生产单克隆抗体。此外，所希望物种的重组单克隆抗体或其抗原结合片段可从表达所希望物种的CDR的噬菌体展示文库中分离，如以下文献所述：McCafferty等人，Nature[自然]348：552-554(1990)；Clackson等人，Nature[自然]，352：624-628(1991)；和Marks等人，J.Mol.Biol[分子生物学杂志]222：581-597(1991)。
编码本发明的抗体或其抗原结合片段的一种或多种多核苷酸可进一步使用重组DNA技术以多种不同的方式被修饰以产生替代性抗体。在一些实施例中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被(1)例如人抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体，或被(2)非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施例中，截短或去除这些恒定区以产生所希望的单克隆抗体的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段。可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞。参见例如，Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法]，AlanR.Liss，第77页(1985)；Boemer等人，J.Immunol.[免疫学杂志]147(1)：86-95(1991)；美国专利5,750,373。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段可选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体，如以下文献所述：例如，Vaughan等人，Nat.Biotech.[自然生物技术]14：309-314(1996)；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，95：6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227：381(1991)；以及Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222：581(1991)。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963；以及Rothe等人，J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]376：1182-1200(2008)中，将这些专利各自通过引用以其全文并入。
亲和力成熟策略和链改组策略是本领域已知的，并且可用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。参见Marks等人，BioTechnology[生物技术]10：779-783(1992)，将其通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段(例如，单克隆抗体)可以是人源化抗体。用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法也可以使用并且是本领域熟知的。人源化、表面重修或类似工程化的抗体可以具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物。这些非人氨基酸残基被通常称为“输入”残基的残基替换，这些残基典型地取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。此类输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他适合的特征。适合地，CDR残基可直接且最实质性地参与影响抗原(例如BCMA)结合。因此，可以保持部分或全部非人或人CDR序列，同时可变区和恒定区的非人序列可以被人氨基酸或其他氨基酸替换。
抗体还可以任选地被人源化、表面重修、工程化或人抗体工程化，其中保留针对抗原(例如BCMA)的高亲和力以及其他有利生物性质。为实现这个目标，人源化(或人)或工程化的抗体以及表面重修的抗体可任选地通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化和工程化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。说明并展示所选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原(例如BCMA)的能力的残基。按照此方式，可以从共有序列和输入的序列中选择并且组合FW残基，这样使得所希望的抗体特征(如增加对一种或多种靶抗原的亲和力)得以实现。
本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化、表面重修或工程化可使用任何已知方法进行，例如但不限于描述于以下文献中的那些：Jones等人，Nature[自然]321：522(1986)；Riechmann等人，Nature[自然]332：323(1988)；Verhoeyen等人，Science[科学]239：1534(1988)；Sims等人，J.Immunol.[免疫学杂志]151：2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.[免疫学杂志]151：2623(1993)；美国专利号5,639,641、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567、7,557,189、7,538,195和7,342,110；国际申请号PCT/US 98/16280、PCT/US 96/18978、PCT/US 91/09630、PCT/US 91/05939、PCT/US 94/01234、PCT/GB 89/01334、PCT/GB 91/01134、PCT/GB 92/01755；国际专利申请公开号WO90/14443、WO 90/14424、WO 90/14430；以及欧洲专利公开号EP 229246；将其各自通过引用全部并入本文，包括其中引用的参考文献。
抗体或其抗原结合片段也可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，这些基因座在免疫时能够在内源性免疫球蛋白产生不存在时产生全套的人类抗体。这种方法描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、以及5,661,016中。
在一个实施例中，提供了本发明的抗体的片段(例如抗体片段)。已知各种用于生产抗体片段的技术。术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗体的功能片段”和“抗原结合部分”在本文中可互换使用，并且是指抗体的一个或多个片段或部分，该一个或多个片段或部分保留与抗体(例如“完整的”或“亲本”抗体)结合的抗原(例如BCMA)特异性结合的能力。因此，提及“其抗原结合片段”意指结合BCMA的抗原结合片段(例如抗体的BCMA-抗原结合片段)。
传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解衍生，例如由Morimoto等人，J.Biochem.Biophys.Meth.[生物化学和生物物理方法杂志]24：107-117(1993)以及Brennan等人，Science[科学]229：81(1985)所描述的。在一个实施例中，重组产生抗BCMA抗体片段。所有Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并且从其分泌，因而允许产生大量的这些片段。此类抗BCMA抗体片段也可以从以上论述的抗体噬菌体文库分离。这些抗BCMA抗体片段还可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。
如本文所提供的经修饰的抗体或其抗原结合片段可以包含任何类型的提供该抗体或多肽与BCMA的缔合的可变区。在这点上，可变区可构成或衍生自可诱导增加体液应答并生成针对所希望抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。正因如此，抗BCMA抗体或其抗原结合片段的可变区可以是例如人、鼠、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴等)或狼来源的。在一个实施例中，经修饰的抗体或其抗原结合片段的可变区和恒定区二者均是人的。在一个实施例中，相容性抗体的可变区(通常衍生自非人来源)可经工程化或专门定制来改进结合性质或减少分子的免疫原性。在这点上，在本发明中有用的可变区可经人源化或另外通过纳入输入的氨基酸序列改变。
在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段的重链和轻链二者中的可变结构域通过至少部分替换一个或多个CDR和/或通过部分框架区替换和序列改变而被改变。虽然CDR可以衍生自与框架区所衍生自的抗体相同的类别或甚至子类别的抗体，但是设想CDR将衍生自不同类别的抗体并且在某些实施例中衍生自不同物种的抗体。不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR以将一个可变域的抗原结合能力转移至另一个。而是，只需要转移维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在美国专利号5,585,089、5,693,761、和5,693,762中所阐明的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验获得具有减少的免疫原性的功能抗体。
尽管对可变区进行改变，本领域技术人员将理解，本发明的经修饰的抗体或其抗原结合片段将包含抗体(例如，全长抗体或其抗原结合片段)，其中至少一个或多个恒定区结构域的一部分已被缺失或以其他方式改变，以便提供所希望的生物化学特征，如当与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体相比时增加的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一个实施例中，经修饰的抗体的恒定区将包含人恒定区。对与本发明兼容的恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文披露的经修饰的抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一个实施例中，考虑了经修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失。在一个实施例中，经修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域被去除(ΔCH2构建体)。在一个实施例中，省略的恒定区结构域可被短氨基酸间隔子(例如，10个残基)替换，该间隔子提供通常由不存在的恒定区所赋予的一定分子柔性。
除了缺失整个恒定区结构域之外，本文提供的抗体或其抗原结合片段可通过恒定区中的几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来修饰。例如，CH2结构域中的选定区域中的单个氨基酸的突变可足以实质性地减少Fc结合，并且从而增加肿瘤定位。类似地，控制效应子功能(例如，补体C1Q结合)的一个或多个恒定区结构域可以完全或部分缺失。恒定区的这类部分缺失可以改进该抗体或其抗原结合片段的选定特征(例如，血清半衰期)，同时使与受试者恒定区结构域相关的其他所希望的功能保持完整。此外，该抗体及其抗原结合片段的恒定区可通过增强所得构建体特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰。在这个方面，可以干扰保守结合位点所提供的活性(例如，Fc结合)，同时基本上维持经修饰的抗体或其抗原结合片段的构型和免疫原性特性。在一个实施例中，可以向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强期望特征，如减少或增加效应子功能，或提供更多细胞毒素或碳水化合物附接。在一个实施例中，可以希望插入或复制衍生自选定的恒定区结构域的特定序列。
本发明进一步包括与本发明的抗体或抗原结合片段(例如，鼠、嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段)基本同源的变体和等效物。这些可以含有例如保守取代突变，即通过相似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指用相同通用类别内的另一个氨基酸取代一个氨基酸，例如像，用另一个酸性氨基酸取代一个酸性氨基酸、用另一个碱性氨基酸取代一个碱性氨基酸或用另一个中性氨基酸取代一个中性氨基酸。保守氨基酸取代所指的内容在本领域是熟知的。
在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段可以被进一步修饰为含有通常不是蛋白质的一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以改进蛋白质的溶解性、生物半衰期、或吸收。这些部分还可以减少或消除蛋白质的任何所希望的副作用等。对那些部分的综述可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第22版，LloydV.Allen，Jr.编辑，(2012)中发现。
序列同源性
可以使用多种序列比对方法中的任一种来确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如像区段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开头到结尾比对序列，并通过将单个残基对的评分相加以及施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等人，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment ThroughSequence Weighting，Position-Specific GapPenalties and Weight Matrix Choice[CLUSTAL W：通过序列加权、位置特定空位罚分和权重矩阵选择来提高渐进式多序列比对的灵敏度]，22(22)Nucleic Acids Research[核酸研究]4673-4680(1994)；以及迭代细化，参见例如Osamu Gotoh，Significant Improvementin Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinementas Assessed by Reference to Structural Alignments[通过利用参考结构比对而评估的迭代细化，多种蛋白质序列比对的准确度显著提高]，264(4)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入的序列共享的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如Match-box，参见例如Eric Depiereux和Ernest Feytmans，Match-Box：A Fundamentally New Algorithmfor the Simultaneous Alignment ofSeveral Protein Sequences[Match-Box：一种用于同时比对多个蛋白质序列的全新算法]，8(5)CABIOS 501-509(1992)；吉布斯采样，参见例如，C.E.Lawrence等人，DetectingSubtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling Strategyfor Multiple Alignment[检测细微序列信号：用于多重比对的吉布斯采样策略]，262(5131)Science[科学]208-214(1993)；Align-M，参见例如，Ivo Van WaIIe等人，Align-M-A New Algorithm forMultiple Alignment of Highly Divergent Sequences[Align-M-高度发散序列的多重比对的新算法]，20(9)Bioinformatics[生物信息学]：1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见例如，Altschul等人，Bull.Math.Bio.[数学生物学通报]48：603-16，1986，以及Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：10915-19，1992。简而言之，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1、以及如下所示的Henikoff和Henikoff(如前所述)的“blosum62”评分矩阵比对两个氨基酸序列以优化比对评分(氨基酸由标准的单字母代码表示)。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共有的相同位置数目的函数。因此，％同一性可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数量除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算还可以考虑空位的数量，以及需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个空位的长度。可以使用技术人员熟悉的特定数学算法(如BLAST)进行两个或更多个序列之间的序列比较和同一性百分比确定。
基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选地具有微小的性质，即，保守氨基酸取代(参见下文)和不显著影响多肽的折叠或活性的其他取代；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基、最多约20-25个残基的小接头肽、或亲和标签。
保守氨基酸取代
碱性：精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性：谷氨酸
天冬氨酸
极性：谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的：甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可包含非天然存在的氨基酸残基。
有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以替代本发明多肽的氨基酸残基。
本发明多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science[科学]244：1081-5，1989)。生物学相互作用位点还可通过对结构的物理分析来确定，如通过以下技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人，Science[科学]255：306-12，1992；Smith等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309：59-64，1992。必需氨基酸的同一性还可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位组分或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出来。
可以使用已知的诱变和筛选方法来制造和测试多个氨基酸取代，这些方法如Reidhaar-Olson和Sauer(Science[科学]241：53-7，1988)或者Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86：2152-6，1989)所披露的那些。简而言之，这些作者披露了用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置、选择功能性多肽、然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许的取代的范围的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人，Biochem.[生物化学]30：10832-7，1991；Ladner等人，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，Gene[基因]46：145，1986；Ner等人，DNA 7：127，1988)。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第20版，John Wiley and Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本披露内容中所使用的许多术语的通用词典。
本披露内容并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露内容的实施例的实践或测试。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5′至3′方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
本文提供的标题不是对本披露内容的各个方面或实施例的限制。
在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本披露内容和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission onBiochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性实施例之前，应理解本披露内容并不限于所描述的具体实施例，因而这些实施例可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本披露内容的范围仅由所附权利要求限定。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体披露。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本披露内容内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本披露内容中，但依据所陈述的范围中的任何被具体排除的极限值而定。在所陈述的范围包含极限值的一个或两个的情况下，将那些所包含的极限值的一个或两个排除在外的范围也包含在本披露内容中。
必须注意的是，如本文和所附权利要求所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“细胞毒素”包括多种这样的细胞毒素并且提及“该细胞毒素”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种细胞毒素及其等效物，等等。
本文所论述的出版物只是针对它们在本申请的提交日之前的披露内容而提供。本文中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
实例
现在将参考以下实例，仅以举例的方式描述本发明。
材料与方法
抗BCMA抗体的产生
如WO 2010/104949和WO 2019/025983中所述产生抗体，二者都通过引用并入本文。适合的抗体如Kinneer等人(2018)，Leukemia 33，766-771和WO 2019/025983中所述产生。
抗BCMA ADC的产生
抗BCMA ADC(与PBD缀合的抗BCMA抗体在本文中称为“M2”)是通过使用如前所述(参见例如Kinneer等人(2018)；将其通过引用并入本文)的蛋白酶可切割的接头，将PBD二聚体替西林(SG3249)位点特异性缀合至以下文献中描述的BCMA-Abl抗体制备的：Kinneer等人(2018)，Leukemia[白血病]33，766-771(“Kinneer等人(2018)”)。BCMA抗体的一个实例是BCMA-Ab2，也在Kinneer等人(2018)中描述。所述抗体在WO 2019/025983(将其通过引用并入本文)中分别进一步描述为15B2GL和J6M0-mc。通过将一甲基瑞奥西汀F(MMAF)有效载荷附接至抗体BCMA-Ab1，类似地产生了ADC“M3”。如前所述，两种有效载荷都与插入在BCMA抗体的CH2结构域中的位置239(C239i)之后的工程化半胱氨酸进行位点特异性缀合。简言之，BCMA-Ab1在37℃下用40摩尔过量的TCEP还原三小时，随后连续透析三次来去除TCEP。然后在室温下用20摩尔过量的DHAA氧化抗体四小时，并且使用八摩尔当量的有效载荷进行缀合。缀合后，通过陶瓷羟磷灰石纯化去除游离的有效载荷和蛋白聚集体。
人MM的鼠异种移植物模型
所有动物实验都通过丹娜-法伯癌症研究所(Dana-Farber Cancer Institute)的研究机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准并符合相关监管标准。将CB-17SCID小鼠皮下接种在100μl无血清RPMI 1640培养基中的5.0×106MM.1S细胞。当在MM细胞注射后大约3周可测量肿瘤时，将小鼠(8个小鼠/组)随机化并且用单独的媒介物、M2、btz或M2与btz进行治疗。使用卡尺每三天测量一次肿瘤2维大小，并且使用以下公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b2，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长径和短径。当动物的肿瘤达到2cm3时处死它们。
使用免疫印迹和免疫染色分析从小鼠收获的肿瘤
在3d治疗后，收获来自每组的肿瘤并且制备细胞裂解物用于免疫印迹。从小鼠收集的肿瘤切片通过Ki67(BCR CRM325)，针对增殖进行免疫组织化学染色。在蔡司倒置荧光显微镜上针对Ki67拍摄免疫组织化学图像。使用Plan-Apochromat 63X/1.40Oil DIC M27物镜。
细胞和细胞培养
MM细胞系在含有10％胎牛血清(GIBCO，10437028)、2mM/LL-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素(GIBCO，15140122)的RPMI中培养。通过人类STR分析细胞身份验证(Human STR Profiling Cell Authentication)，定期检查它们的真实性和支原体污染。根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)并且在丹娜-法伯癌症研究所机构审查委员会(Dana-Farber Cancer Institute Institutional Review Board)批准的方案的支持下，在提供知情同意后获得患者MM和正常供体样品。使用抗CD138微珠(梅旖旎生物技术公司(Miltenyi Biotech)，奥本(Auburn)，加利福尼亚州)，从来自MM患者BM抽吸物的骨髓单核细胞(BMMC)中纯化原代CD138+浆细胞(＞95％纯度)。进一步培养残留的CD138阴性BMMC以衍生BMSC。使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度从PB样品中分离外周血单核细胞(PBMC)。硼替佐米购自Selleckchem公司(Selleck Chemicals公司)。
细胞活力与细胞凋亡测定
通过CCK8(艾博抗公司(Abcam)，剑桥(Cambridge)，马萨诸塞州)、CellTiter-Glo(CTG)(普洛麦格公司(Promega))和BLI测量分析细胞活力。根据制造商的说明，在FITC膜联蛋白-V(BD生物科学公司(BD Bioscience))、PE-膜联蛋白-V(生物传奇公司(BioLegend))和/或LIVE/DEADTM可固定Aqua(英杰公司(Invitrogen)，L34957)染色后，通过流式细胞术分析评估细胞凋亡。MM细胞用CFSE(英杰公司(Invitrogen))标记，并且随后单独地或与BMSC一起培养2天，随后进行膜联蛋白V/Aqua染色和流式细胞术分析。
萤光素酶增殖测定
将BMSC接种在96孔板中并且孵育24小时以允许细胞粘附。将MM1Sluc细胞以100∶1的比率在BMSC的汇合层上在RPMI培养基中培养4d。根据制造商的方案(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)，使用萤光素酶测定测量增殖。
统计学分析
每个实验至少进行三次，并且数据以平均值±SD表示。使用用于2组比较的学生t检验或使用Graphpad软件(GraphPad软件公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)进行多重比较的单因素方差分析(ANOVA)，分析数据。P值＜0.05具有统计学显著性。通过CompuSyn软件评估药物相互作用来确定组合指数(CI)。CI＜1表明协同作用，而CI＞1表明拮抗作用以及CI＝1表明相加作用。
实例1
此实例中反映的实验的结果证明，抗BCMA抗体-PBD缀合物(M2)与其MMAF ADC同系物(M3)相比，针对药物抗性MM细胞诱导更有效的细胞毒性。
针对一组具有不同水平的BCMA表达和对当前抗MM药物的反应的MM细胞系，将由与PBD(M2)缀合的抗BCMA抗体组成的ADC的细胞毒性与其MMAF ADC同系物(M3)的细胞毒性进行比较。两种ADC都由相同的抗BCMA mAb(BCMA-Ab1/15B2GL，如上所述)组成，但与不同的有效载荷缀合：对于M2(例如替西林)与DNA交联PBD，对于M3与微管结合的MMAF。使用持续3d的基于CCK8的活力测定，在所有测试的MM细胞系(n＝10)中，M2的ED50值低于M3的那些值，无论对包括地塞米松和IMiD在内的抗MM疗法的敏感性如何(图1A，图3A)。在8MM细胞系中，不包括RPMI8226(RPMI)及其衍生的BCMA过表达RPMI-BCMA，M2和M3的ED50值范围分别为从11.85至3499ng/ml和从21.28至271431ng/ml。所有MM细胞都携带各种p53突变，除了MM1S和H929细胞之外，分别从这二者中衍生出两种IMiD抗性的MM1S(R)和H929(R)细胞。M2，而不是M3，对表达最低BCMA水平和对IMiD具有抗性的RPMI8226细胞具有细胞毒性(图1A-1B)。使用DNA合成测定，M2在阻断所有MM细胞的增殖方面显示出比M3更大(＞1-2-log)的效力(图1B，图3B)。例如，在RPMI8226细胞中，M2比对M3的ED50为189.7比对21427ng/ml。此外，M2而不是M3降低了与IL-6一起培养的ANBL6及其衍生的硼替佐米(btz)抗性ANBL6-BR细胞二者的活力(图3C)。这些配对的IL-6依赖性ANBL6细胞对M3不敏感，并且表达与RPMI8226细胞相当的细胞膜BCMA蛋白(数据未示出)。因此，具有相对更低的BCMA表达的MM细胞也显著更容易受到M2与M3的影响。
用膜联蛋白V和活的/死的Aqua染色后使用流式细胞术(FCM)分析，显示了当与M3相比时，在对地塞米松(dex)或硼替佐米(btz)具有敏感性或抗性的配对的MM细胞系中，M2以剂量和时间依赖性方式诱导更早和增加的细胞凋亡(图1C，图3D)。这些体外结果表明，无论BCMA水平和p53状态如何，在MM细胞中，M2比M3在更大程度上克服了对当前抗MM药物(地塞米松、来那度胺、泊马度胺、硼替佐米)的抗性。
实例2
此实例中反映的实验的结果证明，在骨髓微环境中的MM细胞和患者MM细胞中，在诱导针对MM细胞的细胞毒性方面，M2比M3更有效。
接下来，评估了M2和M3对与骨髓基质细胞(BMSC)和IL-6(这二者促进了MM细胞的生长、生存和药物抗性)共培养的MM细胞的影响。使用BLI测量，BMSC显示出显著增加MM1Sluc细胞的生长和生存(图4A)。在基于BLI和CTG的测定中，M2比M3更有效地抑制了与BMSC共培养的MM1Sluc和所有其他测试的MM细胞系(n＝6)的活力(图2A，图4A)，且最小程度地影响BCMA阴性非MM细胞亚群，包括BMSC、PBMC和NK细胞(图4B)。使用FCM分析来鉴定存活的MM细胞，M2比M3更有效地减少了IMiD抗性MM1S(R)和H929(R)细胞的生存，即使在BMSC存在下也是如此(图2B)。在定量的基于FCM(图2C)和CTG(图4C)的分析中，在存在或不存在IL-6的情况下，M2降低了H929 MM细胞的生长和生存。
3d治疗后，来自RRMM患者的活的和死的BM CD138+细胞级分通过FCM分析进行定量。重要的是，与M3相比，M2以剂量依赖性方式增加(＞2倍)凋亡的CD138+患者MM细胞(图4D)。在基于CTG的测定中，在来自另外3个RRMM患者的CD138纯化的BM细胞中，M2还显示出剂量依赖性毒性(图2E)，以及显著消耗来自4个新诊断的MM(NDMM)患者(图2F，左，图4D)和2个RRMM患者(图2F，右)的活的CD38高CD138+BM细胞。这些数据表明，无论疾病状态如何，M2都会消耗患者MM细胞，并且对BM微环境中的MM细胞的细胞毒性明显高于M3。
实例3
此实例中反映的实验的结果证明，M2与硼替佐米组合使用，在体外和体内诱导针对MM细胞的协同细胞毒性。
硼替佐米(btz)被选为M2的候选共同疗法，因为btz是一种现有的骨髓瘤疗法。基于膜联蛋白V/PI的FMC分析，与单独的任一药剂相比时，低剂量的M2和btz组合2d进一步增强了JJN3和RPMI8226细胞中的凋亡(图5A-B，p＜0.01)。在IL-6中培养的btz抗性ANBL6-BR细胞中，也看出组合治疗后，细胞死亡显著增加(支持以下观察结果，添加btz提供的作用不仅仅是相加作用)。接下来，分析来自基于CTG的活力测定的结果，从而计算组合指数(CI)。在超过6种代表性MM细胞中获得CI＜1，表明M2加btz具有协同效应(图5C，图6)。
接下来在MM1S异种移植物小鼠模型中评估了亚最佳剂量M2与btz的体内功效。具有可触知的MM1S肿瘤的小鼠被随机分为4组，接受媒介物对照、M2的单一治疗或6次btz(0.4mg/kg)(单独地或与M2一起的)治疗。在治疗后第24d，与媒介物对照相比，单剂量的M2或总共6个剂量的btz显著延迟了小鼠中的MM1S肿瘤生长(图7A，p＜0.005)。与单独地使用单一药剂相比，组合治疗显著减小了肿瘤体积(p＜0.04)。M2加btz的治疗耐受性良好，因为所有动物的体重不受影响(图7B)。持续177d的随访显示，组合治疗组与单独地使用任一药剂治疗的队列相比，中位总体生存期显著延长(cnt，22d；M2，40.5d；btz，35d；M2+btz，57d)(p＜0.045)(图7C)。在第177d，组合治疗组中，15％的小鼠仍然活着，没有任何肿瘤生长。
Ki67(增殖的细胞标记物)的免疫组织化学(IHC)进一步证实了组合治疗后比单一药剂治疗更有效地抑制增殖(图7D)-注意M2+btz治疗中染色细胞(深色)的数量减少。
用M2和btz的组合治疗显著降低了MM1S异种移植物的体内生长(图8)，证明了M2和btz在治疗骨髓瘤方面具有体内协同作用。
总之，在体外细胞水平观察到的M2与btz的协同活性被转化为在MM的浆细胞瘤模型中的优越体内功效。
实例1-3的讨论
由于药物抗性导致的疾病复发仍然是更长的MM的生存期的主要障碍。因此，在RRMM中，需要信新颖的疗法来克药物抗性并且解决未满足的医疗需求。在此，本发明的诸位发明人首先表明，针对所有测试的MM细胞系和患者MM细胞，ADC(M2；与PBD缀合的抗BCMA抗体)与其MMAF ADC同系物相比，具有更好的细胞毒性。PBD二聚体导致快速分裂的细胞和更多的休眠细胞二者中的细胞死亡，这与MMAF不同，MMAF主要与微管蛋白结合来靶向增殖的肿瘤细胞。M2对MM细胞增殖产生比其MMAF ADC同系物更有效的影响，包括具有低水平的BCMA表达和对当前疗法具有抗性的细胞，即使在BMSC和IL-6存在的情况下也是如此。这些数据表明，在治疗侵袭性MM方面，M2可能比其MMAF ADC同系物更有效。
重要的是，在所有测试的MM细胞中，M2和btz的组合治疗在体外诱导协同死亡，由CI＜1证明。值得注意的是，即使在btz抗性ANBL6-BR细胞中，M2也与btz协同作用，表明其他未定义的分子也负责增强细胞毒性。
在携带MM1S肿瘤的小鼠中，M2作为单一药剂疗法比btz显著更有效。重要的是，当M2与btz组合时，体内肿瘤生长的抑制作用进一步增强。在小鼠中，接受两种药物比单独地使用任何一种药剂，更早观察到显著的肿瘤坏死，并且在第177d，组合治疗组中15％的小鼠仍然活着并且没有肿瘤。重要的是，所有组均未发现体重减轻，表明M2在体内具有良好的安全性曲线，表明M2和btz的组合治疗可以在体内安全地施用。
总之，M2特异性地触发有效的生长抑制和死亡，即使在对当前MM疗法具有抗性并受到BM微环境保护的MM细胞中也是如此。在体内，M2比btz更有效，并且M2与btz组合进一步增强疗效并且延长宿主生存期。
实例4
此实例中反映的实验的结果证明，在药物敏感性和药物抗性MM细胞中，M2显著激活了DNA损伤应答和修复信号传导级联放大，随后是细胞凋亡。
在MM细胞系中，将免疫印迹分析用于确定由M2以时间和剂量依赖性方式触发的DNA损伤应答(DDR)信号传导级联放大的诱导。M2，而不是M3，包括ATM、细胞周期检查点激酶1(CHK1)和CHK2(CHK1/2)、以及组蛋白2AX(H2AX)的磷酸化，这是DNA双链断裂(DSB)应答的早期事件(图9A和10A)。在4h时检测到M2刺激的ATM和CHK1/2的磷酸化，并且在处理后持续＞1d。在H929细胞(其表达的BCMA水平显著高于MM1S细胞)中观察到由M2触发的ATM和CHK1/2的更早和更明显的激活(图10A、10C)。M2诱导的ATM和CHK1/2磷酸化的强度也与源自亲本RPMI8226MM细胞的BCMA水平相关(图10D)。在测试的MM细胞中，M2诱导的ATM和CHK1/2磷酸化发生的程度明显高于ATR的磷酸化。在用M2进行2d处理后，以BCMA依赖性方式诱导PARP裂解(cPARP)和半胱天冬酶3裂解(cCas3)(图10B，10E-10F)，其与磷酸化H2AX(γH2AX)增加相关(图10B)，表明M2在MM细胞中诱导DNA损伤，随后是细胞凋亡。重要的是，在所有MM细胞(包括具有p53突变的6个细胞系)中，M2以剂量依赖性方式诱导ATM和CHK1/2的磷酸化(图9b-9c)。在与M2相同的处理条件下，M3既不诱导ATM/ATR，也不诱导CHK1/2(图10A)。在诱导cPARP和cCas3方面，M2比M3更有效(图10F)，与其在触发MM细胞凋亡方面的效力高于M3一致。显著地，在ANBL6和配对的btz抗性ANBL6-BR细胞中，M2触发了ATM/ATR和下游CHK1/2信号传导通路、γH2AX和PARP裂解(图9c)。M2对ATM和CHK1/2的突出激活也见于IMiD抗性H929(R)细胞中，其程度与亲本H929MM细胞类似(图9d)。因此，在btz和len抗性的MM细胞中，M2仍然经由激活ATR/ATM-CHK1/2信号传导级联放大，诱导BCMA依赖性DDR信号传导通路，随后是细胞凋亡。
DNA修复机制
Figure BDA0003376841640000521
阵列的分析显示，在H929 MM细胞中，M2改变了DNA损伤修复相关基因(72个中的51个)的表达(图11a)。在各种药物敏感性和抗性MM细胞(n＞6)中，M2以剂量依赖性方式诱导RAD51，其在产生DSB之前与DNA ICL结合(图11b-11c)，而M3不是这样(图10G)。因此，在MM细胞中，M2特异性地激活ATM/ATR-CHK1/2介导的DDR信号传导级联放大，并且诱导与增加的γH2AX和RAD51相关的下游DDR相关分子，随后是细胞凋亡。
上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定实施例描述了本发明，但应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限于这类特定实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的、用于执行本发明的所描述的实施例的各种修改旨在落入如下权利要求书的范围内。
序列
Figure BDA0003376841640000531
Figure IDA0003376841690000011
Figure IDA0003376841690000021
Figure IDA0003376841690000031
Figure IDA0003376841690000041
Figure IDA0003376841690000051
Figure IDA0003376841690000061
Figure IDA0003376841690000071
Figure IDA0003376841690000081

Claims (25)

1.一种B细胞恶性肿瘤药物，包含：
a.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与缀合至核酸交联剂的B细胞成熟抗原(BCMA)结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的药物相比时，所述药物提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的药物相比时，所述药物提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
2.一种用于治疗B细胞恶性肿瘤的治疗组合，所述治疗组合包含：
a.ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
3.一种用于治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗组合，所述组合包含：
a.ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段；以及
b.蛋白酶体抑制剂；
其中当与除了缺少所述蛋白酶体抑制剂之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制；或
其中当与除了缺少所述ADC之外其他方面均相同的组合物相比时，所述治疗组合提供了对B细胞恶性肿瘤的增强的抑制。
4.一种用于增强恶性B细胞的ADC抑制的体外方法，所述方法包括使恶性B细胞与以下接触：(a)ADC，其包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段，与(b)蛋白酶体抑制剂组合。
5.一种用于增强蛋白酶体抑制剂抑制的体外方法，所述方法包括使恶性B细胞与以下接触：(a)蛋白酶体抑制剂，与(b)ADC组合，该ADC包含与缀合至核酸交联剂的BCMA结合的抗体或其抗原结合片段。
6.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或体外方法：
a.其中所述蛋白酶体抑制剂在所述ADC之前、与其同时或之后施用；或
b.其中所述ADC在所述蛋白酶体抑制剂之前、与其同时或之后施用。
7.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或体外方法，其中所述B细胞恶性肿瘤的特征在于相对于参考非恶性B细胞而言，包含BCMA抗原的表达水平增加的恶性B细胞。
8.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述B细胞恶性肿瘤是选自以下项中的一个或多个：B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、骨髓瘤、多发性骨髓瘤或其组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述B细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
10.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下六个CDR：
a.含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链CDR1，或其功能变体；
b.含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链CDR2，或其功能变体；
c.含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR3，或其功能变体；
d.含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的轻链CDR1，或其功能变体；
e.含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链CDR2，或其功能变体；以及
f.含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR3，或其功能变体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a.含有SEQ ID：NO 7的氨基酸序列的重链可变区，或其功能等效物；和/或
b.含有SEQ ID：NO 8的氨基酸序列的轻链可变区，或其功能等效物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区包含在位置239处的丝氨酸(S)和位置240处的缬氨酸(V)之间的半胱氨酸(C)插入，其中编号对应于Kabat中的EU索引。
13.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链恒定区。
14.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的人κ恒定区。
15.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该蛋白酶体抑制剂是选自以下项中的一个或多个：硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、马里佐米、奥普佐米、德兰佐米，或其组合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。
17.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述核酸交联剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0003376841630000043
(PBD)。
18.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述核酸交联剂是选自以下项中的一个或多个的PBD：(a)SG3249，(b)SG3315或(c)SG3400，分别包含下式：
(a)
Figure FDA0003376841630000041
(b)
Figure FDA0003376841630000042
以及
(c)
Figure FDA0003376841630000051
或其组合。
19.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述核酸交联剂是PBD SG3249，包含下式：
Figure FDA0003376841630000052
20.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
21.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该药物或治疗组合包含药学上可接受的载体。
22.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该B细胞恶性肿瘤对选自以下项的一个或多个具有抗性：地塞米松、来那度胺、泊马度胺、硼替佐米、或其组合。
23.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该B细胞恶性肿瘤对硼替佐米具有抗性。
24.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中所述对B细胞恶性肿瘤的增强抑制包括选自以下项的一个或多个：增加的肿瘤生长延迟、增加的肿瘤大小减小、增加的肿瘤转移减少、提高的包含B细胞恶性肿瘤的受试者的生存率、或其组合。
25.根据前述权利要求中任一项所述的药物、用于使用的治疗组合、方法或用途，其中该药物或治疗组合是通过静脉内输注施用的。
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