KR101203777B1

KR101203777B1 - 항-ｔｙｒｐ１ 항체

Info

Publication number: KR101203777B1
Application number: KR1020107020296A
Authority: KR
Inventors: 시아오키앙 캉; 폴 제이 발더레스
Original assignee: 임클론 엘엘씨
Priority date: 2008-03-12
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2012-11-21
Also published as: CN101970500B; AU2009222998B2; TW200944232A; MX2010010021A; CN101970500A; NZ587305A; ZA201006099B; CA2718289A1; US7951370B2; WO2009114585A1; JP2011516041A; UA99339C2; AR070821A1; KR20100113631A; IL207581A0; EP2268672A1; PE20091679A1; CL2009000567A1; BRPI0909633A2; AU2009222998A1

Abstract

본 발명은 TA99 (TYRP1에 특이적인 쥐 항체)에 상당하거나 그보다 더 높은 친화도로 인간 TYRP1 항원에 결합하는 완전 인간 항체 및 키메라 (chimera) 항체를 제공한다. 본 발명은 이들 항체를 코딩하고 발현하는 폴리핵산 및 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 유효량의 항체를 단독으로, 또는 항암제 또는 치료와 조합으로 투여함으로써, 포유동물에서 TYRP1의 활성을 조정하고, 암 세포의 성장을 치료하고, 악성 흑색종을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

항-ＴＹＲＰ１ 항체{ANTI-TYRP1 ANTIBODIES}

교차 참조

본원은 2008년 3월 12일 출원된 미국 특허 가출원 61/069199를 기초로 한 우선권을 주장한다.

본 발명은 인간 티로시나제-관련 단백질-1 (TYRP1)에 특이적인, 그의 단편 또는 일부를 포함하는 인간 및 키메라 (chimera) 항체에 관한 것이다. 항체는 암 세포의 성장을 치료하기 위해 사용되고, 단독으로 또는 항-신생물제 또는 치료와 함께 사용될 수 있다.

인간 티로시나제-관련 단백질-1 (TYRP1) (gp75로서도 공지됨) (WO 91/14775) (서열 28)은 멜라닌 생합성에 관여되는 멜라닌소체 막 당단백질이다. 이는 대부분 멜라닌세포의 멜라닌소체 내에서 발견되고, 또한 멜라닌세포 및 인간 흑색종의 세포 표면 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.

TYRP1 항원은 고도로 면역원성이다. TYRP1에 대한 항체 및 T-세포가 흑색종 환자에서 확인되었다. 세포성 및 체액성 반응 모두가 생체 내에서 흑색종을 제거하는데 효과적인 것으로 보인다. 흑색종 반응성 T-세포의 입양 전달 (adoptive transfer)은 또한 종양 회귀를 일으킨다. TYRP1 백신에 의해 유도된 항체 반응은 또한 동물에서 흑색종 성장 및 전이를 억제할 수 있었다.

현재 소분자 억제제, 화학치료, 백신을 포함한 면역치료 (예를 들어 미국 특허 6,168,946), 유전자 치료/면역자극, 및 항-혈관형성제를 포함한, 흑색종에 대한 다양한 치료 방법이 연구되었지만, 흑색종의 환자에 대한 효과적인 치료법은 없다. 상기 충족되지 않은 의학적 필요성 때문에 새로운 치료법의 개발이 크게 요구되고 있다.

동물 연구에서 항체 TA99가 발견되었다. 인간 및 쥐 TYRP1에 특이적인 쥐 모노클로날 항체 (MAb)인 TA99 (IgG2a)는 생체 내에서 피하 인간 흑색종에 국재화한다 (문헌 [Welt et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 4200-4204 (1987)] 및 미국 특허 4,798,790 참조). TA99 처리는 마우스에서 종양 성장 및 전이를 억제하였다 (문헌 [Takechi et al., Clin Cancer Res. 2:1837-42 (1996)] 참조).

TA99로 처리된 마우스는 종종 모발 색상을 잃고 (탈색), 이는 피부에서 멜라닌세포의 파괴를 시사한다. Fc 수용체-매개 효과기 활성화는 TA99에 의해 표적화된 세포의 제거에서 중대한 역할을 하는 것으로 보인다. TA99의 항종양 효과는 FcR 낙아웃 마우스에서 극적으로 감소된다 (문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)] 참조). 그러나, TA99의 쥐 특성은 잠재적인 면역원성 문제로 인해 인간에서 치료제로서 사용하지 못할 것임을 의미하고, 추가로 하류 면역 효과기 기능을 활성화시키는 그의 능력이 제한될 것이다.

따라서, 흑색종 치료에 효과적인 별도의 항-TYRP1 항체를 제공할 필요가 있다. 본 발명은 흑색종의 치료에 효과적인 별도의 항-TYRP1 항체를 제공한다.

추가로, 당업계에 공지된 항체에 비해 TYRP1에 대한 개선된 결합 친화도를 갖는 별도의 항-TYRP1 항체를 제공할 필요가 있다. 본 발명은 당업계에 공지된 항체에 비해 TYRP1에 대한 개선된 결합 친화도를 갖는 별도의 항-TYRP1 항체를 제공한다.

또한, 인간에서 감소된 면역원성을 갖고, 하류 면역 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 활성화시키는 능력이 개선된 별도의 항-TYRP1 항체를 제공할 필요가 있다. 본 발명은 당업계에 공지된 항체에 비해 인간에서 감소된 면역원성을 갖고, 하류 면역 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 활성화시키는 능력이 개선된 키메라 및 인간 항-TYRP1 항체를 제공한다.

단백질 미스폴딩 (misfolding) 및 부정확한 프로세싱 (processing)의 감소를 통해 개선된 안정성을 갖는 별도의 항-TYRP1 항체를 제공할 필요가 또한 존재한다. 단백질 미스폴딩 및 부정확한 프로세싱의 감소를 통해 본 발명의 바람직한 항체는 개선된 안정성을 갖는다.

<발명의 개요>

본 발명은 흑색종 항원 TYRP1 (서열 28)에 결합하는 인간 및 키메라 모노클로날 항체, 및 그의 단편에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시태양은 주변 실험실 온도 (20℃ - 25℃)에서 0.1 x 10^-9 M 내지 1.6 x 10^-9 M의 해리 상수 (K_D)로 인간 TYRP1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이고, 여기서 상기 K_D 값은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 키메라 또는 인간 항체이다. 인간 TYRP1에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 상기 항체의 단편은, 그 단편에 대한 해리 상수가 특정된 범위 내에 있지 않더라도 본 발명의 일부이다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 약 0.1 x 10^-9 M 내지 약 1.2 x 10^-9 M, 약 0.1 x 10^-9 M 내지 약 0.8 x 10^-9 M, 약 0.1 x 10^-9 M 내지 약 0.4 x 10^-9 M, 약 0.2 x 10^-9 M 내지 약 1.2 x 10^-9 M, 약 0.2 x 10^-9 M 내지 약 0.8 x 10^-9 M, 약 0.2 x 10^-9 M 내지 약 0.4 x 10^-9 M, 약 0.2 x 10^-9 M 내지 약 0.3 x 10^-9 M, 또는 약 0.28 x 10^-9 M의 K_D로 인간 TYRP1에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 한 실시태양은 서열

(서열 1)을 갖는 CDRH1, 서열

(서열 2)를 갖는 CDRH2, 서열

(서열 3)을 갖는 CDRH3, 서열

(서열 4)를 갖는 CDRL1, 서열

(서열 5)를 갖는 CDRL2, 및 서열

(서열 6)을 갖는 CDRL3을 포함하는, TYRP1에 결합하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 항체는 상기 CDR 서열 중 하나에 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 언급된 CDR은 CDR 서열 중 하나에 아미노산 치환을 갖지 않는다. 또다른 실시태양에서, 상기 언급된 CDR을 갖는 항체는 0.1 x 10^-9 M 내지 1.6 x 10^-9 M의 해리 상수 K_D로 인간 TYRP1에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 서열

(서열 7)을 갖는 CDRH1, 서열

(서열 8)을 갖는 CDRH2, 서열

(서열 9)를 갖는 CDRH3, 서열

(서열 10)을 갖는 CDRL1, 서열

(서열 11)을 갖는 CDRL2, 및 서열

(서열 12)를 갖는 CDRL3을 포함하는, TYRP1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 상기 CDR 서열 중 하나에 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 언급된 CDR (서열 7-12)은 임의의 아미노산 치환을 갖지 않는다.

본 발명의 다른 실시태양은 TYRP1에 결합하고, 하기 서열 16을 갖는 VL 및 하기 서열 13 또는 서열 14의 VH 서열을 포함하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다:

본 발명의 다른 실시태양은 서열 29의 중쇄 및 서열 32의 경쇄; 또는 서열 30의 중쇄 및 서열 32의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 29의 2개의 중쇄 및 서열 32의 2개의 경쇄를 포함하거나, 서열 30의 2개의 중쇄 및 서열 32의 2개의 경쇄를 포함한다. 상기 항체의 TYRP1-결합 단편은 본 발명의 일부이다.

본 발명은 또한 상기 항체 및 그의 일부를 코딩하는 단리된 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 다른 실시태양은 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리핵산; 발현 서열에 연결된 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 재조합 숙주 세포 또는 그의 자손체를 포함하고, 여기서 상기 세포는 항체 또는 그의 단편을 발현한다. 본 발명의 또다른 실시태양은 상기 세포를 항체 또는 그의 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 단편을 생산 또는 정제하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 유효량의 항체를 투여함으로써, 모두 포유동물에서 암 세포의 성장을 억제하는 방법, 및 흑색종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시태양은 상기한 항체 또는 그의 단편을 의약으로서 사용하는 것이다. 또다른 실시태양에서, 상기한 항체 또는 그의 단편은 악성 흑색종을 포함하고 이로 제한되지 않는 암에 사용될 것이다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 암 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 암은 악성 흑색종이다.

항체는 단독으로 또는 항-신생물제 또는 치료와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양은 상기한 항체를 추가의 항암제 또는 치료와 함께 사용하는 것이다. 또다른 실시태양에서, 항암제는 다카르바진이다.

<본 발명의 상세한 설명>

본 발명은 TYRP1 항원에 특이적인 인간 및 키메라 항체 및 그의 단편, 및 항체를 코딩하는 단리된 또는 정제된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명의 항체는 고형 및 비-고형 종양을 포함한 신생물성 질병을 치료하기 위해, 및 과다증식성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 용어 항체는 달리 지시하지 않으면 TYRP-1에 결합하는 단편을 포함한다. 본원에서 결합 파라미터는 전장 항체에 대한 것이고, 단편에 대한 것은 아니며, 단편들은 그들의 상이한 크기로 인해 반드시 상이한 결합 파라미터를 가질 것이다.

일반적으로, 자연 발생하는 항체 분자는 2개의 동일한 중쇄와 2개의 경쇄를 갖고, 여기서 각각의 경쇄는 사슬간 디술피드 결합에 의해 중쇄에 공유 연결된다. 다수의 디술피드 결합은 2개의 중쇄를 서로 추가로 연결시킨다. 본원에서 사용될 때, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉, 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 개개의 사슬은 유사한 크기 (110-125개 아미노산) 및 구조를 갖지만 기능이 상이한 도메인으로 폴딩될 수 있다.

경쇄는 하나의 가변 도메인 (본원에서 VL로 약칭함) 및/또는 하나의 불변 도메인 (본원에서 CL로 약칭함)을 포함할 수 있다. 항체 (면역글로불린)의 경쇄는 카파 (K) 경쇄 또는 람다 (λ) 경쇄이다. 표현 VL은 본원에서 사용될 때 카파형 경쇄 (VK)로부터 및 람다형 경쇄 (Vλ)로부터의 가변 구역을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 경쇄 불변 구역은 하나의 도메인, 즉 CL로 이루어진다.

또한, 중쇄는 하나의 가변 도메인 (본원에서 VH로 약칭함), 및/또는 항체의 클래스 또는 이소형에 따라 3 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4) (본원에서 CH로 총칭함)을 포함할 수 있다. 인간에서, 이소형은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이고, 여기서 IgA 및 IgG는 하위클래스 또는 하위형 (IgA₁ _-2 및 IgG₁ _-4)으로 더욱 세분된다. 본 발명은 임의의 상기 언급된 클래스 또는 하위클래스 (이소형)의 항체를 포함한다. 인간 IgG₁이 본 발명의 항체에 대해 바람직한 이소형이다.

일반적으로, 가변 도메인은 특히 항원-결합 부위의 위치에서, 항체마다 상당한 아미노산 서열 변이성을 보인다. 초가변 또는 상보성-결정 구역 (CDR)으로 불리는 3개의 구역이 각각 VL 및 VH에서 발견되고, 이는 프레임워크 구역 (FR)으로 불리는 덜 가변적인 구역에 의해 지지된다. 아미노산은 카바트 (Kabat) 방식에 따라 특정 CDR 구역 또는 도메인에 배정된다 ([Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]). 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 항체의 일부는 Fv (가변 단편)으로 명명되고, 항원-결합 부위를 구성한다. 단일쇄 Fv (scFv)는 하나의 폴리펩티드 사슬 상에 VL 도메인 및 VH 도메인을 함유하는 항체 단편이고, 여기서 하나의 도메인의 N 말단 및 다른 도메인의 C 말단은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 미국 특허 4,946,778 (Ladner et al.); WO 88/09344 (Huston et al.); WO 92/01047 (McCafferty et al.)를 참조하고, 여기서는 박테리오파지와 같은 가용형 재조합 유전자 디스플레이 패키지의 표면 상에서 scFv 단편의 디스플레이를 설명한다).

단일쇄 항체를 생산하기 위해 사용된 펩티드 링커는 VL 및 VH 도메인의 적합한 3차원 폴딩 (folding)이 일어나도록 선택되는 가요성 펩티드일 수 있다. 링커는 일반적으로 10 내지 50개 아미노산의 잔기이다. 바람직하게는, 링커는 10 내지 30개 아미노산의 잔기이다. 보다 바람직하게는, 링커는 12 내지 30개 아미노산의 잔기이다. 가장 바람직한 링커는 15 내지 25개 아미노산의 잔기이다. 그러한 링커 펩티드의 한 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃을 포함한다.

"단리된 항체"는 (1) 성분들의 혼합물로부터 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 정제되었거나; (2) 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리되고/되거나 회수되었거나; (3) 모노클로날이거나; (4) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 존재하지 않거나; (5) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나; (6) 자연에서 발생하지 않는 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 저해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 항체의 예는 친화도 정제된 항체, 시험관 내에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 제조된 항체, 및 트랜스제닉 (transgenic) 마우스로부터 유래된 인간 항체를 포함한다.

용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용될 때, 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하고, 예를 들어 집단을 구성하는 개별 항체들은 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이 또는 작은 번역후 변이를 제외하고는 실질적으로 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위 (결정자 또는 에피토프로서도 공지됨)에 대해 작용하여 고도로 특이적이다. 또한, 일반적으로 상이한 결정자에 대해 작용하는 상이한 항체들을 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 변경 표현 "모노클로날"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 것으로서 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.

용어 "항체"는 본원에서 사용될 때, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 그에 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 다른 종 (예를 들어, 마우스 또는 래트)으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 그에 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편을 또한 포함한다 (예를 들어, [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 따라서, 본 발명은 예를 들어 키메라 중쇄 및/또는 키메라 경쇄를 포함하는 키메라 항체를 포함한다. 키메라 중쇄는 비-인간 항체의 중쇄 불변 구역에 융합된, 본원에서 설명되는 임의의 중쇄 가변 (VH) 구역 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다. 키메라 경쇄는 비-인간 항체의 경쇄 불변 구역에 융합된, 본원에서 설명되는 임의의 경쇄 가변 (VL) 구역 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다.

용어 "인간 항체"는 본원에서 사용될 때, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 구역을 갖는 항체를 포함한다 (문헌 [Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기재된 바와 같은). 본 발명의 인간 항체는 예를 들어, CDR에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들어 활성 향상 아미노산 잔기로 교체된 적어도 하나의 위치를 가질 수 있다. 그러나, 용어 "인간 항체"는 본원에서 사용될 때, 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

어구 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 인간 항체, 예를 들어 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합의 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 구역을 갖는다 ([Kabat, et al, 상기 문헌] 참조).

Fc (결정화 단편)는 짝을 이룬 중쇄 불변 도메인들을 포함하는 항체의 일부 또는 단편에 대한 명칭이다. IgG 항체에서, 예를 들어, Fc는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. IgA 또는 IgM 항체의 Fc는 CH4 도메인을 추가로 포함한다. Fc는 Fc 수용체 결합, 보체-매개 세포독성 및 ADCC의 활성화와 연관된다. 다수의 IgG 유사 단백질의 복합체인, IgA 및 IgM과 같은 항체의 경우, 복합체 형성에는 Fc 불변 도메인을 요구한다.

따라서, 본 발명의 항체는 각각 적어도 하나의 CDR을 함유하는 자연 발생하는 항체, 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 재조합 인간 항체, 모노클로날 항체, 항체 모방체 (mimetic)를 포함하거나 항체 또는 그의 특정 단편 또는 일부의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 일부를 포함한 그의 소화 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 기능적 단편은 TYRP1 항원에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, TYRP1 또는 그의 일부에 결합할 수 있고 본 발명에 포함되는 항체 단편은 2가 단편, 예를 들어 무손상인 사슬간 디술피드 결합을 갖는 (Fab')₂, 1가 단편, 예를 들어 Fab (단편, 항원 결합) (이는 VL CL VL CH1 도메인으로 이루어지고 중쇄 힌지 구역을 보유하지 않는 (예를 들어 파파인 소화에 의해) 항체의 단편을 칭함), 중쇄 힌지 구역을 보유하는 fab, facb (예를 들어 플라스민 소화에 의해), F(ab')₂, 디술피드 결합이 결여되는 Fab', pFc' (예를 들어 펩신 또는 플라스민 소화에 의해), Fd (예를 들어 펩신 소화, 부분적인 환원 및 재-응집에 의해), 및 Fv 또는 scFv (예를 들어 분자 생물학 기술에 의해)를 포함한다. 또한, 항체 단편은 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는, 도메인 결실 항체, 선형 항체, 단일쇄 항체, scFv, 단일 도메인 항체, 다가 단일쇄 항체, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 예를 들어 디아바디 (diabody) 및 트리아바디 (triabody) 등을 포함하는 것으로 의도된다.

힌지 구역은 항체의 Fab 및 Fc 부분을 분리하여, 서로에 관한 및 Fc에 관한 Fab의 이동성을 제공하고, 또한 2개의 중쇄의 공유 연결을 위한 다수의 디술피드 결합을 포함한다.

본 발명의 항체 또는 그의 단편은 TYRP1에 특이적이다. 항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적인 인식을 의미한다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 이중특이적 항체 (BsAb)는 2개의 상이한 항원-결합 특이성 또는 부위를 갖는 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 초과의 상이한 항원-결합 특이성 또는 부위를 갖는다. 항체가 1 초과의 특이성을 갖는 경우에, 인식되는 에피토프는 단일 항원 또는 1 초과의 항원과 연관될 수 있다. 따라서, 본 발명은 TYRP1에 대한 적어도 하나의 특이성을 갖는, 2개의 상이한 항원에 결합하는 이중특이적 항체 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명은 TYRP1에 특이적인 단리된 항체 또는 그의 단편을 제공한다. TYRP1 단백질은 포유동물 단백질이고, 바람직하게는 인간 단백질이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 TYRP1 및 쥐 TYRP1 모두에 결합할 수 있고 [Shibahara et al., Nucleic Acids Res. 14(6) 2413-2427 (1986)], 따라서 전-임상 및 임상 생체내 연구 모두에 유용하다. 본 발명의 항체는 1) TYRP1에 대해서만 결합하는 높은 친화도를 보이고; 2) 시험관 내에서 및 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 활성을 하나 이상 가질 수 있다.

TYRP1에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 특이성은 친화도 및/또는 결합력에 기초하여 결정할 수 있다. 항원과 항체의 해리에 대한 평형 상수 (K_D)로 표시되는 친화도는 항원성 결정자와 항체-결합 부위 사이의 결합 강도를 측정한다.

본 발명의 항체 또는 그의 단편은 또한 직접적 돌연변이, 친화도 증진 (maturation), 파지 디스플레이, 또는 사슬 셔플링 (shuffling)의 방법에 의해 그에 대해 결합 특성이 변형되거나 개선된 것을 포함한다. 친화도 및 특이성은 CDR을 돌연변이시키고 요구되는 특성을 갖는 항원 결합 부위에 대해 스크리닝함으로써 변형되거나 개선될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., J. Mol. Biol., (1995) 254: 392-403] 참조). CDR은 다양한 방식으로 돌연변이된다. 한가지 방식은 개별 잔기 또는 잔기들의 조합을, 그렇지 않으면 동일한 항원 결합 부위들의 집단 내에서, 20개의 모든 아미노산이 특정 위치에서 발견되도록 랜덤화하는 것이다. 별법으로, 돌연변이는 오류 경향 (error prone) PCR 방법에 의해 광범위한 CDR 잔기에 걸쳐 유도된다 (예를 들어, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., (1992) 226: 889-896] 참조). 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 가변 구역 유전자를 함유하는 파지 디스플레이 벡터가 이. 콜라이 (E. coli)의 돌연변이자 균주 내에서 전파될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Low et al., J. Mol. Biol., (1996) 250: 359-368] 참조). 이들 돌연변이 유발 방법은 당업자에게 공지된 많은 방법의 예이다.

치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 증진이다. 간단히 설명하면, 몇몇 CDR 구역 부위를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 필라멘트성 파지 입자로부터, 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도, 특이성, IC50, EC50, K_D)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 CDR 구역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 CDR 구역 잔기를 확인할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, CDR이 가변 구역에 작동가능하게 연결되어 있는 동안 또는 CDR이 다른 가변 구역 서열에 무관하게 존재하는 동안 하나 이상의 CDR 서열 상에서 하나 이상의 잔기 위치에서 랜덤 돌연변이 유발을 수행할 수 있고, 이어서 변경된 CDR은 재조합 DNA 기술을 이용하여 가변 구역으로 다시 보내진다. 일단 그러한 변이체 항체가 생성되고 발현된 후에는, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 우월한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.

본원에서 설명되는 바와 같이, 본원에서 구체적으로 설명된 항체 이외에, 다른 "실질적으로 상동성인" 변형된 항체가 당업자에게 잘 알려진 다양한 재조합 DNA 기술을 이용하여 쉽게 설계되고 제조될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 구역은 몇몇 아미노산 치환, 말단 및 중간에서의 부가 및 결실 등에 의해 천연 서열로부터 1차 구조 수준에서 변할 수 있다. 또한, 다양한 상이한 인간 프레임워크 구역은 단독으로 본 발명의 인간화 면역글로불린에 대한 기초로서 조합으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 다양한 공지의 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

본 발명은 설명된 전장 항-TYRP1 항체의 가변 또는 초가변 구역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 TYRP1-결합 폴리펩티드를 포함한다. 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 본원에서 문헌 [Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:2444-8)]에 따라 FASTA 탐색 방법에 의해 결정할 때 다른 아미노산 서열에 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 약 80％, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 상동성을 갖는 서열로서 규정된다.

본 발명의 항체 또는 그의 단편은 표 1에 제시된 CDR의 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 상보성 결정 구역 (CDR)을 갖는 인간 항체를 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 아래 개략된 20D7 또는 20D7S의 중쇄 가변 구역 및/또는 20D7 또는 20D7S의 경쇄 가변 구역을 가질 수 있다. 20D7 및 20D7S가 본 발명의 특히 바람직한 항체이다. 이들 항체는 인간 VH 및 VL 프레임워크 구역 (FR)과 인간 CDR을 또한 갖는다.

본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 그의 임의의 변이체를 포함한, 임의의 하나의 VH 구역 또는 그의 일부, 또는 임의의 하나의 VH CDR을 포함하는 항-TYRP1 항체 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같이 그의 임의의 변이체를 포함한, 임의의 하나의 VL 구역 또는 그의 일부 또는 임의의 하나의 VL CDR을 포함하는 항-TYRP1 항체 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 항체의 각각의 도메인은 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 갖는 완전 항체일 수 있거나, 자연 발생하는 도메인, 또는 예를 들어 WO 93/11236 (Griffiths et al.)에서 설명된 기술을 이용하여, 예를 들어 시험관 내에서 구성된 합성 도메인의 기능적 동등물 또는 돌연변이체 또는 유도체일 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산이 결여되는, 항체 가변 도메인에 상응하는 도메인들을 함께 연결하는 것이 가능하다. 하나의 CDR 서열 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 돌연변이 또는 결실을 갖는 항체가 또한 포함된다. 중요한 특성결정 특징은 상보성 도메인과 회합하여 항원-결합 부위를 형성하는 각각의 도메인의 능력이다. 따라서, 용어 가변 중쇄 및 경쇄 단편은 특이성에 대해 주목할 만한 효과를 갖지 않는, CDR에 대한 변이체를 포함하는 변이체를 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이들 방법은 문헌 ([Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)] 및 [Campbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas, Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)])에 기재된 면역학적 방법; 및 문헌 [Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)]에 기재된 재조합 DNA 방법을 포함한다.

항체 단편은 전체 항체를 절단함으로써, 또는 단편을 코딩하는 DNA를 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 항체의 단편은 문헌 ([Lamoyi et al., J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983)] 및 [Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983)])에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')₂ 단편 중 하나 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 또한, 그러한 단편은 단일쇄 단편 가변 구역 항체, 즉 scFv, 디아바디, 또는 다른 항체 단편을 함유할 수 있다. 그러한 기능적 동등물의 생산 방법은 PCT 출원 WO 93/21319, 유럽 특허 출원 239,400; PCT 출원 WO 89/09622; 유럽 특허 출원 338,745; 및 유럽 특허 출원 EP 332,424에 개시되어 있다.

벡터의 형질전환 및 본 발명의 항체의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, NSO 세포 (비-분비 (0) 마우스 골수종 세포), 293 및 CHO 세포, 및 림프종, 골수종 또는 하이브리도마 세포와 같은 림프구 기원의 다른 세포주이다. 별법으로, 다른 진핵생물 숙주, 예를 들어 효모가 사용될 수 있다.

형질전환된 숙주 세포를 당업계에 공지된 방법에 의해 탄소 (탄수화물, 예를 들어 글루코스 또는 락토스), 질소 (아미노산, 펩티드, 단백질 또는 그들의 분해 산물, 예를 들어 펩톤, 암모늄염 등) 및 무기염 (나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 황산염, 인산염 및/또는 탄산염)의 동화가능한 공급원을 함유하는 액체 배지 내에서 배양한다. 배지는 또한 예를 들어 성장-촉진 물질, 예를 들어 미량 원소, 예를 들어 철, 아연, 망간 등을 함유한다.

유전자 구성체를 효모 내에서 발현하는 것이 요구되는 경우에, 효모에서 사용하기 위해 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7 내에 존재하는 trp1 유전자이다 ([Stinchcomb et al. Nature, 282: 39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979)]). trp1 유전자는 트립토판 내에서 성장 능력이 결핍되는 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내에서 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.

본 발명의 항체는 황산암모늄 또는 황산나트륨에 의한 침전에 이은 염수에 대한 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 또는 면역-친화도 크로마토그래피, 및 겔 여과 또는 대역 전기영동을 포함한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 단리되거나 정제될 수 있다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 정제 방법은 단백질-A 친화도 크로마토그래피이다.

인간 항체를 코딩하는 DNA는 실질적으로 또는 독점적으로 상응하는 인간 항체 구역으로부터 유래된, CDR 이외의 다른 인간 불변 구역 및 가변 구역을 코딩하는 DNA, 및 인간으로부터 유래된 CDR을 코딩하는 DNA를 재조합함으로써 제조할 수 있다.

항체의 단편을 코딩하는 DNA의 적합한 공급원은 전장 항체를 발현하는 임의의 세포, 예를 들어 하이브리도마 및 비장 세포를 포함한다. 단편은 항체 동등물로서 단독으로 사용될 수 있거나, 상기 설명된 바와 같이 동등물로 재조합될 수 있다. 본 섹션에서 설명되는 DNA 결실 및 재조합은 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다. DNA의 다른 공급원은 당업계에 공지된 바와 같이 항체의 파지 디스플레이 라이브러리이다. 본 발명의 예시적인 항체는 하이브리도마 기술을 통해 면역화시킨 마우스로부터 제조하였다.

추가로, 본 발명은 발현 서열, 프로모터 및 인핸서 서열에 작동가능하게 연결된, 앞서 설명된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 원핵생물계, 예를 들어 세균, 및 진핵생물계, 비제한적으로 예를 들어 효모 및 포유동물 세포 배양 시스템 내에서 항체 폴리펩티드의 효율적인 합성을 위한 다양한 발현 벡터가 개발되었다. 본 발명의 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열의 세그먼트들을 포함할 수 있다.

임의의 적합한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 클로닝 벡터는 이. 콜라이로부터의 플라스미드, 예를 들어 colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM 및 RP4를 포함한다. 원핵생물 벡터는 또한 파지 DNA, 예를 들어 M13 및 다른 필라멘트성 단일-가닥 DNA 파지의 유도체를 포함한다. 효모에서 유용한 벡터의 예는 2μ 플라스미드이다. 포유동물 세포에서 발현을 위해 적합한 벡터는 SV-40, 아데노바이러스, 레트로바이러스-유도 DNA 서열의 잘 공지된 유도체, 및 상기 설명한 것과 같은 기능적 포유동물 벡터와 기능적 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 셔틀 (shuttle) 벡터를 포함한다.

추가의 진핵생물 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341 (1982)]; [Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864 (1981)]; [Kaufmann and Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-664 (1982)]; [Scahill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4654-4659 (1983)]; 및 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980)] 참조).

본 발명에 유용한 발현 벡터는 발현시킬 DNA 서열 또는 단편에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 제어 서열을 함유한다. 제어 서열은 클로닝된 DNA 서열의 발현을 제어하고 조절하기 위해 벡터 내로 삽입된다. 유용한 발현 제어 서열의 예는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파지 람다의 주요 작동유전자 (operator) 및 프로모터 구역, fd 코트 단백질의 제어 구역, 효모의 해당 (glycolytic) 프로모터, 예를 들어, 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-접합 인자의 프로모터, 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 및 원숭이 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예를 들어, 조기 및 후기 프로모터 또는 SV40, 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 및 그들의 바이러스 또는 이들의 조합물의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열이다.

본 발명은 또한 앞서 설명된 발현 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 항체는 하이브리도마 이외의 다른 세포주 내에서 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 적합한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다.

특히 바람직한 세포주는 높은 수준의 발현, 목적하는 단백질의 구성적 발현, 및 숙주 단백질로부터의 최소 오염을 기초로 하여 선택된다. 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 불사 세포주, 예를 들어 NSO 세포 (비-분비 (0) 마우스 골수종 세포), 마우스 골수종 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 많은 다른 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 추가의 진핵 세포는 효모 및 다른 진균을 포함한다. 유용한 원핵생물 숙주는 예를 들어 이. 콜라이, 예를 들어 이. 콜라이 SG-936, 이. 콜라이 HB 101, 이. 콜라이 W3110, 이. 콜라이 X1776, 이. 콜라이 X2282, 이. 콜라이 DHI 및 이. 콜라이 MRC1, 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 바실러스 섭틸리스 (B. subtilis) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다.

이들 본 발명의 재조합 숙주 세포는 항체 또는 그의 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 세포를 배양하고, 숙주 세포 또는 숙주 세포를 둘러싸는 배지로부터 항체 또는 그의 단편을 정제함으로써, 항체 또는 그의 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 숙주 세포에서 분비를 위한 발현된 항체 또는 단편의 표적화는 목적하는 항체-코딩 유전자의 5' 단부에 신호 또는 분비 리더 (leader) 펩티드-코딩 서열을 삽입함으로써 용이해질 수 있다 ([Shokri et al., (2003) Appl Microbiol Biotechnol. 60(6):654-64], [Nielsen et al., Prot. Eng. (1997) 10:1-6] 및 [von Heinje et al., (1986) Nucl. Acids Res. 14:4683-4690] 참조). 이들 분비 리더 펩티드 요소는 원핵생물 또는 진핵생물 서열로부터 유래될 수 있다. 따라서 적합하게는, 숙주 세포 시토졸 외부로 폴리펩티드의 운동 및 배지 내로의 분비를 지시하도록 폴리펩티드의 N-말단 단부에 연결된 아미노산인 분비 리더 펩티드가 사용된다.

본 발명의 항체는 추가의 아미노산 잔기에 융합될 수 있다. 상기 아미노산 잔기는 아마도 단리를 용이하게 하기 위해 펩티드 태그일 수 있다. 항체를 특이적인 장기 또는 조직에 두기 위한 다른 아미노산 잔기가 또한 고려된다.

본 발명에서 항체 제조를 위한 다른 실시태양은 인간 항체 생산 게놈의 실질적인 부분이 삽입되고 내인성 항체의 생산이 결여되도록 만든 트랜스제닉 동물에서 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 핵산의 발현이다. 트랜스제닉 동물은 마우스, 염소 및 토끼를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 추가의 한 실시태양은 예를 들어, 수유 동안 폴리펩티드 분비를 위해 동물의 유선에서 항체-코딩 유전자의 발현을 포함한다.

포유동물에게 유효량의 항체를 투여함으로써 포유동물에서 종양 성장을 치료하는 방법을 또한 본 발명에서 제공한다. 본 발명에 따라 치료할 적합한 종양은 바람직하게는 TYRP1을 발현한다. 임의의 특정 메카니즘에 매이도록 의도되지 않지만, 본 발명의 방법은 악성 흑색종을 포함한 암 세포의 성장의 치료를 제공한다. 본 발명의 문맥에서 "치료" 또는 "치료하다"는 근원적인 병태 또는 질병 또는 질환과 연관된 바람직하지 않은 생리학적 변화의 진행을 억제하거나, 느리게 하거나, 감소시키거나 역전시키거나, 병태의 임상 증상을 개선하거나, 병태의 임상 증상 발현을 방지하는 것을 포함한 치료적 처치를 나타낸다. 유익하거나 요구되는 임상 결과는 검출가능하든 비검출가능하지 않든 증상의 경감, 질병 또는 질환 정도의 축소, 질병 또는 질환의 안정화 (즉, 질병 또는 질환이 악화되지 않는 경우), 질병 또는 질환 진행의 지연 또는 저속화, 질병 또는 질환의 개선 또는 완화, 및 질병 또는 질환의 관해 (부분적이든 전체적이든)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않는 경우의 예상 생존에 비해 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자는 이미 질병이 있는 자를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 의약으로서 사용될 수 있다.

용어 "흑색종"은 흑색종, 전이성 흑색종, 멜라닌세포 또는 멜라닌세포 관련 신경 세포로부터 유도된 흑색종, 멜라닌암종, 멜라닌상피종, 멜라닌육종, 상피내 흑색종, 표재 확장성 (superficial spreading) 흑색종, 결절성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 침습성 흑색종, 및 가족성 비정형성 모반 및 흑색종 (FAM-M) 증후군을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 한 실시태양에서, 흑색종은 암의 특정 형태이다. 다른 실시태양에서, 흑색종은 악성일 수 있다. 본 발명의 한 실시태양은 아래에 설명되는 바와 같이, 제1선 흑색종을 치료하기 위해서 본원에서 설명되는 항-TYRP1 항체를 이용할 것이다. 다른 실시태양에서, 본원에서 설명되는 항-TYRP1 항체는 전이성 흑색종을 위한 제1선 치료일 수 있고, 즉, 이들은 새로 진단된 전이성 흑색종의 제1 라운드의 치료에서 사용될 것이다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 항체의 치료 유효량은 그를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다. 본원에 기재된 바와 같은 질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 의약, 및 처치가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함한 많은 상이한 인자에 따라 변한다. 용어 투여하는은 본원에서 사용될 때 본 발명의 항체를 목적하는 결과를 달성할 수 있는 임의의 방법에 의해 포유동물에게 전달하는 것을 의미한다. 이들은 예를 들어 정맥내 또는 근육내 투여될 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 인간에 투여하기 위해 특히 유용하지만, 다른 포유동물에도 또한 투여될 수 있다. 용어 포유동물은 본원에서 사용될 때, 인간, 실험 동물, 애완동물 및 농장 동물을 포함하고 이로 제한되지 않는 것으로 의도된다. 치료 유효량은 포유동물에게 투여될 때 요구되는 치료 효과를 생성하는데, 예를 들어 종양 성장을 억제하는데 효과적인 본 발명의 항체의 양을 의미한다. 치료 투여량은 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 항-TYRP1 항체의 "치료 유효량"을 포함할 수 있다. "치료 유효량"은 요구되는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 항체의 치료 유효량은 예를 들어 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 끌어내는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한, 치료 유효량은 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료상 유익한 효과가 더 큰 양이다. 투약 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다.

그러한 질병은 당업자의 능력 및 지식 내에서 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, 악성 흑색종으로 고통받거나 임상학상 유의한 증상을 발병할 위험이 있는 인간 개체가 본 발명의 항-TYRP1 항체의 투여에 적합하다.

본 발명의 항-TYRP1 항체는 종양 또는 병리학적 상태의 진행을 억제하거나 감소시키기 위해 충분한 양으로 악성 흑색종으로 고통받는 환자에게 치료적 처치를 위해 투여된다. 진행은 예를 들어, 종양 또는 병리학적 상태의 성장, 침습, 전이 및/또는 재발을 포함한다. 이를 달성하기 위해 적합한 양은 치료 유효 용량으로서 규정된다. 상기 용도에 효과적인 양은 질병의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 전반적인 상태에 따라 결정될 것이다. 또한, 투여 계획은 질병 상태 및 환자의 상태에 따라 변할 것이고, 일반적으로 단일 볼러스 (bolus) 투여량 또는 연속 주입 내지 매일 다수 투여 (예를 들어, 4-6시간마다) 범위, 또는 치료의 및 환자의 상태에 의해 지시되는 바와 같을 것이다. 본 발명의 항체의 치료 유효량의 예시적인 비-제한적인 범위는 0.1-50 mg/kg, 보다 바람직하게는 3-35 mg/kg, 보다 바람직하게는 5-20 mg/kg이다. 투여량 및 투여 빈도는 환자를 치료하는 의사가 결정할 것이고, 매일, 매주 3회, 매주, 2주마다 1회 또는 이보다 적은 빈도로 제공되는 1 mg/kg 미만으로부터 100 mg/kg 초과까지의 용량을 포함할 수 있다. 투여 당 용량은 1-100, 2-75, 또는 5-60 mg/kg 범위일 수 있다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 용량에 제한되지 않음에 주목해야 한다.

본 발명의 한 실시태양에서, 항-TYRP1 항체는 하나 이상의 다른 항-신생물제와 함께 투여될 수 있다. 임의의 적합한 항-신생물제, 예를 들어 화학치료제, 방사선 또는 그의 조합이 사용될 수 있다. 항-신생물제는 알킬화제 또는 항-대사물질일 수 있다. 알킬화제의 예는 시스플라틴, 시클로포스파미드, 멜팔란, 및 다카르바진 (DTIC)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 생체내 연구에서는 20D7을 다카르바진 (DTIC)과 함께 투여하는 것이 인간 624mel 이종이식편에 대해 단제요법에 비해 더 강한 항-종양 활성을 나타냄을 보여준다. 본 발명의 한 실시태양에서, 본원에서 설명되는 항-TYRP1 항체는 다카르바진과 함께 투여된다. 항-대사물질의 예는 독소루비신, 다우노루비신, 파클리탁셀, 이리노테칸 (CPT-11) 및 토포테칸을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항-신생물제가 방사선인 경우에, 방사선 공급원은 치료되는 환자에 대해 외부 (외부 빔 방사선 요법 - EBRT) 또는 내부 (근접 치료 - BT)일 수 있다. 투여되는 항-신생물제의 용량은 예를 들어, 물질의 종류, 치료되는 종양의 종류 및 중증도, 및 물질의 투여 경로를 포함한 많은 인자에 의해 결정된다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 용량으로 제한되지 않음이 강조되어야 한다.

본 발명에서, 본 발명의 항-TYRP1 항체를 투여하기 위해, 및 임의로 항-신생물제 및/또는 다른 수용체의 길항제를 투여하기 위해 임의의 적합한 방법 또는 경로가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 항-신생물제 요법은 환자의 신생물성 병태의 치료를 위해 최적으로 적합한 것으로 생각되는 임의의 요법을 포함한다. 상이한 악성종양은 특이적 항-종양 항체 및 특이적 항-신생물제의 사용을 요구할 수 있고, 이는 환자 대 환자 기초로 결정될 것이다. 투여 경로는 예를 들어 경구, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한다. 비경구 경로가 바람직하다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 투여 방법 또는 투여 경로로 제한되지 않음이 강조되어야 한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항-TYRP1 항체는 하나 이상의 항-신생물제 또는 항-혈관형성제에 화학적으로 또는 생합성에 의해 연결될 수 있다.

또한, 본 발명은 검출가능한 신호 생성제가 항체에 접합되는 진단 시스템에서, 단지 예로서 항-신생물제, 다른 항체 또는 리포터, 예를 들어 방사성 표지된 동위원소를 포함하는 표적 또는 리포터 모이어티에 연결된 항-TYRP1 항체를 추가로 고려한다.

본 발명의 항-TYRP1 항체는 예방 또는 치료 목적으로 포유동물에서 사용되는 경우에, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물 형태로 투여될 것임이 이해된다. 적합한 제약상 허용되는 담체는 예를 들어 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 향상시키는, 미량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 버퍼를 추가로 포함할 수 있다. 주사용 조성물은 포유동물에게 투여한 후에 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하기 위해 당업계에 잘 알려진 바와 같이 제형화될 수 있다.

또한, 생체 내 및 시험관 내에서 당업계에 잘 알려져 있는 조사 또는 진단 방법을 위한 본 발명의 항체의 용도가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 진단 방법은 본 발명의 항체를 함유하는 키트를 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 TYRP1에 특이적인 인간 모노클로날 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 TYRP1에 특이적인 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 다른 실시태양에서, 항체의 CDR 구역은 CTA99의 CDR 구역과 동일하다. 상이한 실시태양에서, 항체의 CDR 구역은 20D7 또는 20D7S의 CDR 구역과 동일하다.

한 실시태양에서, 항체는 주변 실험실 온도 (20℃ - 25℃)에서 본원에서 설명되는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정할 때 1.7 x 10^-4 1/s (sec^-1, 1/초) 내지 5 x 10^-4 1/s의 해리 속도 상수 (K_d 또는 k_off)로 TYRP1에 결합한다. 다른 실시태양에서, 항체는 1.7 x 10^-4 1/s 내지 3.5 x 10^-4 1/s의 K_d 또는 k_off로 TYRP1에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 항체는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 동일한 조건 하에서 20D7, 20D7S, 또는 CTA99에 대해 결정된 해리 속도 상수의 10％ 내의 해리 속도 상수로 TYRP1에 결합한다.

본 발명의 한 실시태양은 표 1 및 2 내의 상보성 결정 구역 (CDR)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 TYRP1에 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열

(서열 4)가 존재하는 경쇄 CDR1 구역을 갖는, TYRP1에 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열

(서열 3)이 존재하는 중쇄 CDR3을 갖는, TYRP1에 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 상이한 실시태양에서, 본 발명은 (i) 20D7, 20D7S 및 CTA99로 이루어진 군 중에서 선택되는 경쇄 가변 구역, 및 (ii) 20D7, 20D7S 및 CTA99로 이루어진 군 중에서 선택되는 중쇄 가변 구역을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 (i) CTA99의 경쇄 가변 구역, (ii) CTA99의 중쇄 가변 구역, 및 (iii) 인간 면역글로불린 G₁ (hIgG₁) 불변 구역을 포함하는, TYRP1에 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시태양은 포유동물에게 이미 설명한 임의의 실시태양의 항체 또는 그의 단편 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 악성 흑색종의 치료 방법을 또한 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 다른 치료 방법은 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 사용을 추가의 항암제 또는 치료의 투여와 조합한 것이다. 한 치료 방법에서, 항암제는 다카르바진 (DTIC)이다.

본원에 개시되는 발명의 원리에서 변이가 당업자에 의해 이루어질 수 있고 그러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 의도됨을 이해하고 예상해야 한다.

본원에 언급된 모든 참조문은 그 전문이 포함된다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 더욱 예시하지만, 어떠한 방식으로도 그 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 그러나, 실시예는 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 벡터 및 플라스미드의 제조, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 상기 벡터 및 플라스미드 내로의 삽입, 플라스미드의 숙주 세포 내로의 도입, 및 유전자의 발현 및 유전자 및 유전자 산물의 결정과 같은 통상적인 방법에 대한 상세한 설명은 문헌 [Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 포함한 수많은 공개문으로부터 얻을 수 있다.

동물 및 세포주

SKmel28, SKmel23, 624mel, 1102mel 및 A375를 10％ 열-불활성화된 태아 소 혈청 (하이클론 래보라토리즈 (HyClone Laboratories, 미국 유타주 로간))이 존재하는 RPMI 1640 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스 (Invitrogen Life Technologies)) 내에 유지하고, 미코플라스마 (Mycoplasma) 오염에 대해 통상적인 방식으로 시험한다. SKmel23 및 SKmel28은 알란 휴튼 박사 (Dr. Alan Houghton; 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 미국 뉴욕주 뉴욕))로부터 제공받았다. 624mel 및 1102mel은 스티브 로젠버그 박사 (Dr. Steve Rosenberg; 내셔널 캔서 인스티튜트 (National Cancer Institute, 미국 메릴랜드주 베데스다))로부터 입수하였다. A375는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나사스)로부터 구입하였다. 6 내지 8주령의 암컷 Nu/Nu 마우스는 타코닉 팜즈 (Taconic Farms, 미국 뉴욕주 저먼타운)으로부터 구입하였다.

인간 및 키메라 항- TYRP1 항체의 발현 및 정제

각각의 항체에 대해, PCR 클로닝과 같은 적합한 방법에 의해, 적합한 중쇄 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열 21, 22 또는 23 (각각 20D7, 20D7S 및 CTA99에 대한)을 적합한 발현 플라스미드, 예를 들어 pGSHC 내로 조작하고, 적합한 경쇄 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열 26 또는 27 (각각 20D7/20D7S 및 CTA99에 대한)을 적합한 발현 플라스미드, 예를 들어 pGSLC 내로 조작한다. 안정한 세포주를 확립하기 위해, 적합한 숙주 세포주, 예를 들어 NSO 세포를 선형화된 중쇄 및 경쇄 플라스미드로 전기천공에 의해 동시-형질감염시키고, 적합한 배지, 예를 들어 투석된 태아 소 혈청 및 글루타민 합성효소 보충물을 함유하는, 글루타민 미함유 둘베코 (Dulbecco) 변형 이글 (Eagle) 배지 내에서 배양한다. 클론을 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 항체 발현에 대해 스크리닝하고, 스피너 (spinner) 플라스크 내에서 배양을 위한 최고 생산주를 선택한다. 항체를 적합한 방법, 예를 들어 단백질-A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한다.

본 발명의 한 실시태양은 세포 표면 발현된 티로시나제-관련 단백질-1 (TYRP1 또는 TRP1)을 표적화하는 전장 IgG1κ인 재조합 인간 모노클로날 항체 20D7이다. 상기 항체는 인간 감마-1 중쇄 (HC) (하위군 I) 및 인간 카파 경쇄 (하위군 III)로 구성된다. 20D7은 인간 TYRP1에 고친화도로 선택적으로 결합하는 것으로 나타났고, 면역 효과기 기능의 활성화를 수반한 메카니즘에 의해 이종이식편 모델에서 강력한 항-종양 활성을 매개하였다.

본 발명의 한 실시태양은 세포 표면 발현된 티로시나제-관련 단백질-1 (TYRP1 또는 TRP1)을 표적화하는 전장 IgG1κ인 재조합 인간 모노클로날 항체 20D7S이다. 상기 항체는 인간 감마-1 중쇄 (HC) (하위군 I) 및 인간 카파 경쇄 (하위군 III)로 구성된다. 20D7S는 훨씬 더 안정한 분자를 생성하려는 노력에서 생성되었고; 중쇄 가변 구역 내의 유리 시스테인 잔기 (C47)가 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 세린 잔기로 전환되었다. 상기 짝을 이루지 않은 또는 유리 시스테인은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 사슬내 및 사슬간 디술피드 다리에 참여하는 다른 시스테인과 미스페어링 (mis-pairing)될 가능성이 있다. 미스페어링은 잠재적으로 부적절한 폴딩 및 프로세싱을 일으켜, 생성물의 불균일성 및 잠재적으로 그의 안정성을 증가시킬 수 있다. 본원에서 설명되는 SDS PAGE 겔 분석에서는 20D7의 제제 내에서 유리 경쇄 및 유리 중쇄의 존재가 확인되지만, 20D7S의 제제에서는 유리 경쇄 및 유리 중쇄의 존재가 감소되거나 제거된다.

본 발명의 다른 실시태양은 인간 불변 구역 IgG1을 갖는 키메라 항체인 CTA99이다. 쥐 항체 TA99 (미국 특허 4,798,790)는 2개의 경쇄를 함유하고; 1개의 TA99 경쇄는 TYRP1에 특이적이고, 다른 1개는 모 마우스 골수종 세포로부터 유도된 것이다. 오염된 경쇄는 TYRP1에 결합할 수 없기 때문에 활성이 감소한다. CTA99는 이러한 단점을 개선하여 활성을 개선하기 위해 구성되었다. 본 발명의 한 실시태양에서, 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 갖는 CTA99가 설계되었다. 여기서 설명되는 연구는 CTA99의 증가된 활성 및 결합 친화도, 및 인간에 보다 적합한 효과기 기능을 분명히 보여준다.

표 1 및 2는 본 발명의 다양한 CDR의 아미노산 서열 및 서열 번호를 제시한다. 표 3은 본 발명에 관련된 다양한 서열의 서열 번호를 제시한다. 아래에서 개시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리핵산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

실험에 사용된 항체는 표 3에 제시된 바와 같이 신호 미보유 전장 중쇄 및 경쇄를 포함하였다.

경쟁 효소-결합 면역흡착 분석 ( ELISA )

Falcon 가요성 96-웰 평저 플레이트를 재조합 인간 TYRP (0.5 ㎍/mL x 50 ㎕)로 4℃에서 철야 코팅한다. 다음날, 플레이트를 0.1％ Tween-20을 함유하는 PBS 중의 5％ FBS로 2 h 동안 실온에서 차단한다. 다양한 양의 항체를 100 ㎕ 샘플에 첨가한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 3x 세척하고, 100 ㎕에 1:5000으로 희석된 100 ㎕의 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 항체 (바이오소스 (Biosource, 미국 캘리포니아주 카마릴로))를 플레이트에 첨가하고, 실온 (20 - 25℃)에서 1시간 동안 인큐베이팅한다. 플레이트를 3x 세척하고, 50 ㎕/웰의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB; KPL, 미국 메릴랜드주 게이터스버그) 기질을 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기 (예를 들어, 몰레큘라 디바이시스 (Molecular Devices))를 사용하여 450 nm에서 판독한다.

50％ 최소 유효 농도 (EC₅₀)는 몰 농도 (M)로 측정한다. 인간 20D7, 인간 20D7S 및 CTA99를 포함하는 항체는 ELISA 분석에서 인간 TYRP1에 대한 특이적 결합을 보인다.

유동 세포 분석

624mel 세포를 1시간 동안 얼음 상에서 1％ BSA/PBS 내에서 5 ㎍/mL 인간 IgG, 또는 항-TYRP1 MAb로 처리한다. 세포를 1％ BSA/PBS 내에 3x 세척하고, 1시간 동안 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지된 염소 항-인간 IgG와 함께 인큐베이팅한다. 세포를 세척하고, 적합한 유동 세포 측정기, 예를 들어 Epics XL 유동 세포 측정기 (코울터 (Coulter))에 의해 분석한다. 유동 세포 분석은 본원에서 예시되는 바와 같은 20D7S 항체가 대조 인간 IgG₁에 비해, 천연 TYRP1을 발현하는 인간 세포주 SKmel28 및 SKmel23에 대한 결합을 나타냄을 보여준다. 유사하게, 유동 세포 분석은 본원에서 예시되는 CTA99 및 20D7 항체가 대조 인간 IgG₁에 비해, 천연 TYRP1을 발현하는 인간 세포주 624mel에 대한 결합을 나타냄을 보여준다.

표면 플라즈몬 공명/ Biacore 분석

재조합 인간 TYRP1에 대한 항체의 결합 속도를 주변 실험실 온도 (20℃ - 25℃)에서 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 Biacore 바이오센서 (파마시아 (Pharmacia))를 사용하여 측정한다. TYRP1 단백질을 CM5 연구 등급 센서 칩 상에 고정시키고, 항체를 0.5 nM 내지 100 nM의 농도에서 주입한다. 각각의 농도에 대한 감지그래프 (sensorgram)를 얻고, BIA Evaluations 3.2 프로그램을 사용하여 평가하여 속도 상수 k_on 및 k_off를 결정한다. k_off로도 칭해지는 K_d는 해리 반응의 속도 상수이다. k_on으로도 칭해지는 K_a는 결합 반응의 속도 상수이다. K_D는 결합 친화도의 척도이고; 몰 농도 (M)로 측정되는, 속도 상수의 비 k_off/k_on로부터 K_D를 계산한다. 본원에서 예시된 항체 TA99, CTA99, 20D7, 및 20D7S에 대한 K_a, K_d, 및 K_D를 하기 표 6에 요약한다.

인간 TYRP1에 대한 20D7 및 20D7S 결합의 Biacore 분석은 실질적인 특이적 결합 친화도를 보여주었고; 따라서, 20D7 및 20D7S는 치료 항체에 대한 확실한 후보이다.

보체 의존성 세포독성 ( CDC ) 분석

인간 흑색종 세포주 624mel을 3회 세척하고, 적합한 배지, 예를 들어 AIM V 배지 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스) 내에 10⁶개의 생육성 세포/mL의 농도로 첨가한다. 100 마이크로리터의 세포를 96-웰 환저 Falcon 플레이트에 플레이팅하고, 3.7 ㎍/mL에서 시작하여 1:3로 희석된 MAb 20D7 또는 hIgG (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson Immunoresearch, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브))와 함께 1 hr 동안 37℃에서 인큐베이팅한다. AIM V 내에 1:5로 희석한 low-Tox-M 토끼 보체 (세다레인 랩스 (Cedarlane Labs, 미국 뉴욕주 웨스트베리))를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 1 hr 동안 37℃에서 인큐베이팅한다. 트리판 블루 (Trypan Blue, 인비트로겐 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 생육성에 대해 세포를 계수한다.

표 7은 CDC 분석에서 다양한 항체 농도에서의 세포독성 비율을 보여준다. 데이타는 20D7 및 CTA99 항체가 시험관 내에서 TYRP1 (+) 인간 624mel 세포에 대한 CDC를 유도함을 입증한다. 20D7은 624mel 세포의 용량-의존 보체-매개 세포 용해를 촉발시켜, 3.7 ㎍/mL의 항체 농도를 사용하는 상기 분석에서 완전 세포 용해를 유도하였다. 따라서, 20D7 및 CTA99에서 CDC에 대한 강한 면역 효과기 반응이 존재한다. 비 용해 ％ = 시험 세포독성 ％ - 음성 대조군 세포독성 ％

시험관 내에서 인간 흑색종에 대한 항체 의존성 세포성 세포독성 ( ADCC )

624mel 세포를 수거하여 적합한 배지, 예를 들어 AIM V 배지 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스)로 세척하고, 세포를 96-웰 Falcon U자형 바닥 플레이트 내에 100 ㎕의 부피로 10,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅한다. 항체를 50 ㎕ 부피로 5 ㎍/mL로 첨가하고, 37℃에서 0.5 hr 동안 표적 세포와 함께 인큐베이팅한다. 효과기 세포를 50 ㎕의 부피로 다양한 E:T (효과기:표적) 비율로 첨가하였다. 플레이트를 추가로 4 hr 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후에, 플레이트를 800 g에서 원심분리하고, 100 ㎕의 상등액을 96 웰 평저 플레이트에 부드럽게 이송하였다. 락테이트 데히드로게나제 분석 시약을 제조자 (로슈 (Roche))가 특정한 바와 같이 첨가하고, 플레이트를 490 nm에서 판독하였다. 분석 대조군: 표적_자발적 및 표적_최대 (50 ㎕의 4％ 트리톤 첨가에 의해).

용해는 효과기 대 표적 농도에 의존적이고, 50％의 표적 세포의 용해가 100:1의 E:T 비율에서 발생한다. 고정된 농도 (5 ㎍/mL)에서, 20D7 및 CTA99는 624mel 세포의 용해를 활성화시킨다. 표 8은 ADCC 분석에서 다양한 효과기 세포 대 종양 세포 비율 (E:T 비율)의 존재 하에서의 세포성 세포독성의 비율을 보여준다. 20D7S, 20D7 및 CTA99 항체는 시험관 내에서 TYRP1 (+) 인간 624mel 세포에 대해 ADCC를 유발한다. 20D7S, 20D7 및 CTA99에서 ADCC에 대한 강한 면역 효과기 반응이 존재한다.

％ 세포독성 = (실험 - 표적_자발적) / (표적_최대 - 표적_자발적) X 100

20 D7S 및 20 D7 안정성 분석

20D7 및 20D7S를 SDS-PAGE 겔 (나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 내로 로딩한다. 브로모페놀 청색 염료가 완전히 진행될 때까지 BioRad 장치를 사용하여 겔을 이동시킨다. 쿠마시 염료 (Coomassie Dye)를 사용하여 분리된 단백질을 가시화한다.

SDS PAGE 분석에서, 보다 안정한 분자가 단일 밴드로서 관찰되고, 임의의 유리 경쇄 및/또는 중쇄가 존재하더라도 그 양은 극히 적고; 유리 경쇄 및 유리 중쇄의 존재는 분자가 덜 안정하다는 증거이다. 20D7의 SDS PAGE 겔은 명백한 유리 경쇄 및 중쇄의 존재를 보였다. 20D7S의 SDS PAGE 겔은 유리 경쇄 및 중쇄를 거의 보이지 않았다. 따라서, 20D7S는 20D7보다 안정한 IgG1 분자이다.

CTA99 및 20 D7 은 인간 흑색종 이종이식편을 효과적으로 치료한다.

다음 피하 연구를 위해, 종양 부피는 식 [π/6(W1xW2xW2)]에 의해 계산하고, 여기서 W1은 최대 종양 직경을 나타내고, W2는 최소 종양 직경을 나타낸다. ％T/C = 100 x (처리 부피/초기 부피)/(대조 부피/초기 부피). 통계학적 분석은 전통적인 p-값 기술을 이용하여 이루어진다. 피하 연구를 위해, p 값은 항-TYPR 항체를 투여받는 동물의 종양 부피 대 대조 동물의 종양 부피에 기초하여 계산한다. 다음 전이 연구를 위해, 종양 억제는 폐 표면 결절을 계수함으로써 측정한다. ％ 억제 = 100 x (대조 결절# - 처리 결절#)/(대조 결절#). 통계학적 분석은 전통적인 p-값 기술을 이용하여 이루어진다. 전이 연구를 위해, p-값은 항-TYPR 항체를 투여받는 동물에서 관찰된 결절 대 대조 동물에서 관찰된 결절에 기초하여 계산한다.

인간 흑색종의 이종이식편 모델에 대한 항- TYRP1 항체의 생체내 단일제 활성

Matrigel 및 RPMI 1640 배지 (10％ FBS 열 불활성화된)의 50/50 용액 내에서 624mel 배양된 세포를 수거, 세척 및 재현탁한다. 피하 종양 모델에 대해, 2 x 10⁶개의 세포를 누드 마우스의 좌측 옆구리 내로 피하 주사한다. 종양이 200 mm³에 도달했을 때, 마우스를 항-TYRP1 항체 또는 대조 인간 IgG로 처리하고; 항체 1 mg/마우스를 매주 3회 투여한다. 종양을 캘리퍼스 (calipers)로 매주 2회 측정하고, ％ T/C를 계산한다. 인간 흑색종의 이종이식편 모델에 대한 항-TYRP1 항체의 생체내 단일제 활성에 대해, SKmel28 이종이식편의 성장은 인간 IgG 대조군에 비해 20D7 처리에 의해 억제되었다 (제43일에 T/C = 51％; P = 0.01). 또한, 확립된 624mel 종양은 20D7 처리에 의해 유의하게 억제되는 것으로 나타났다. 종양 성장이 억제되었고, 항체 처리 개시 후 제16일에 통계학적 유의성에 도달하였다 (T/C = 44％; P = 0.01). 추가의 인간 흑색종 이종이식편을 20D7의 항-종양 활성에 대해 평가하였다. 세포주 A375 및 1102mel은 항체 처리 11일 후에 단일제 20D7에 의해 유의하게 억제되는 것으로 나타났다 (A375 및 1102mel에 대해 각각 T/C = 42％; P = 0.01 및 T/C = 43％; P = 0.004). 상이한 종으로부터의 피부의 용해물을 TA99 (5 ㎍/ml)와 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅한다. 용해물을 단백질 A를 사용하여 침전시키고, 4개의 12％ 구배 겔을 사용하여 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 적용한다. 전기영동 후에, 겔을 PVDF 막 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스)에 전달하였다. 막을 20D7S (5 ㎍/ml), 이어서 HRP 표지된 항-인간 IgG (자이메드 (Zymed, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코))로 프로빙한다. 블롯 (blot)을 화학발광 기질 (KPL, 미국 매릴랜드주 개터스버그)을 사용하여 발색시킨다. 데이타는 20D7이 마우스 TYRP1과 쉽게 교차반응함을 보여준다. 그러나, 20D7로 처리된 임의의 동물에서 명시적인 독성이 분명하지 않았다. 체중 및 전체 외관은 인간 IgG 대조군 처리된 마우스에 비해 20D7 처리된 동물에서 유의하게 상이하였다.

인간 흑색종의 이종이식편 모델에 대한 항- TYRP1 항체의 생체내 단일제 용량 반응 활성

Matrigel 및 RPMI 1640 배지 (10％ FBS 열 불활성화된)의 50/50 용액 내에서 Skmel28 세포를 혼합한다. 2 x 10⁶ 세포를 누드 마우스의 좌측 옆구리 내로 피하 주사한다. 종양이 200 mm³에 도달했을 때, 마우스를 항-TYRP1 항체 (6 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 60 mg/kg) 또는 대조 인간 IgG로 매주 3회 처리한다. 종양을 캘리퍼스로 매주 2회 측정하고, ％ T/C를 계산한다. SKmel28 이종이식편에 대한 20D7의 용량-반응 연구는 용량-의존 항-종양 반응을 나타냈다. 심지어 6 mg/kg의 용량에서, 종양은 20D7에 의해 유의하게 억제되었다 (T/C = 69％; P < 0.0001). 각각의 용량에서 항종양 효과는 통계학상 유의하였다: 6 mg/kg 및 20 mg/kg (T/C = 50％; P = 0.04), 6 mg/kg 및 60 mg/kg (T/C = 19％; P < 0.003).

2가지 전이성 흑색종 모델에서 항- TYRP1 항체의 생체내 단일제 활성

B16BL6은 자발적으로 발생하는 침습성 쥐 흑색종이다. 이는 정맥내 투여 후에 누드 마우스에서 폐 전이를 형성한다. RPMI 1640 배지 (10％ FBS 열 불활성화된) 내에 배양된 SKmel23 및 B16BL6 세포 흑색종 세포를 수확, 세척 및 재현탁한다.

모델 1: 1 x 10⁵개의 B16BL6 세포를 정맥내 주사한다. 종양 주사 후 제2일에, 마우스에게 항-TYRP1 항체 또는 대조 인간 IgG를 3가지의 상이한 용량 농도 (200 ㎍/마우스, 500 ㎍/마우스, 및 1 mg/마우스)에 따라 투여한다. 마우스를 제20일에 희생시키고, 폐를 제거하고, 폐 표면 결절을 계수하고, ％ 억제를 계산한다. 많은 전이가 인간 IgG 처리된 마우스에서 폐의 표면에 걸쳐 검출되고; 유의하게 더 적은 전이가 20D7 처리된 동물에서 인지된다. 3가지의 모든 농도의 20D7이 폐 전이의 수준을 감소시킨다 (억제 = 각각 65％, 74％ 및 95％).

모델 2: 1 x 10⁵개의 인간 SKmel23 세포를 정맥내 주사한다. 종양 주사 후 제2일에, 마우스에게 항-TYRP1 항체 또는 대조 인간 IgG를 2가지의 상이한 용량 농도 (200 ㎍/마우스 및 500 ㎍/마우스)에 따라 투여한다. 마우스를 제20일에 희생시키고, 폐를 제거하고, 폐 표면 결절을 계수하고, ％ 억제를 계산한다. 전이성 결절은 200 ㎍/용량 및 500 ㎍/용량에서 20D7 또는 CTA99를 사용한 처리에 의해 유의하게 감소된다. 20D7는 전이를 각각 58％ 및 73％ 감소시켰다. CTA99는 전이를 각각 63％ 및 75％ 감소시켰다. 상기 결과는 2가지의 별개 모델에서 흑색종 전이가 20D7 및 CTA99에 의해 억제됨을 입증한다.

인간 흑색종의 피하 이종이식편 및 전이성 모델에 대한, 20 D7 및 20 D7S 의 종양 성장 억제의 생체내 비교 연구

피하 종양 모델에 대해, Matrigel 및 RPMI 1640 배지 (10％ FBS 열 불활성화된)의 50/50 용액 내에서 624mel 배양된 세포를 수거, 세척 및 재현탁한 후, 2 x 10⁶개의 624mel 세포를 누드 마우스의 의 좌측 옆구리 내로 피하 주입한다. 종양이 200 mm³에 도달했을 때, 마우스를 20D7 또는 20D7S로 40 mg/kg로 매주 2회 처리한다. 종양을 캘리퍼스로 매주 2회 측정하고, ％ T/C를 계산한다. 624mel 피하 이종이식편 모델에서, 20D7은 종양 성장을 억제하였고 (T/C = 21％), 20D7S에 대해 T/C는 25％이었다. 20D7과 20D7S 모두는 이종이식편 모델에서 종양 성장을 억제하였다.

전이성 모델에 대해, RPMI 1640 배지 (10％ FBS 열 불활성화된) 내에서 888mel 배양된 세포를 수거, 세척 및 재현탁하고, 888mel 세포를 정맥내 주사한다. 종양 주사 후 제2일에, 마우스에게 항-TYRP1 항체 또는 대조 인간 IgG를 투여한다. 마우스를 제20일에 희생시키고, 폐를 제거하고, 폐 표면 결절을 계수하고, ％ 억제를 계산한다. 누드 마우스에서 888mel의 전이성 모델에서, 20D7 및 20D7S는 모두 폐 표면 전이를 유의하게 억제하였다: 20D7 억제 = 77％, p=0.0005; 20D7S 억제 = 80％, p=0.0005. 20D7 및 20D7S는 전이성 모델에서 모두 흑색종의 전이를 감소시켰다.

20 D7 및 다카르바진 ( DTIC ) 조합 처리는 인간 이종이식편에 대해 단제요법 에 비해 더 강한 항-종양 활성을 나타냈다.

피하 모델에 대해, Matrigel 및 RPMI 1640 배지 (10％ FBS 열 불활성화된)의 50/50 용액 내에 배양된 624mel 세포를 수거, 세척 및 재현탁한다. 2 x 10⁶개의 624mel 세포를 누드 마우스의 좌측 옆구리 내로 주사한다. 종양이 200 mm³에 도달했을 때, 마우스를 항-TYRP1 항체, DTIC, 또는 항-TYRP1 항체와 DTIC의 조합물로 처리한다. 40 mg/kg 항체를 매주 1회 투여한다. DTIC 5 mg/kg를 매주 1회 투여한다. 종양을 캘리퍼스로 매주 2회 측정하고, ％ T/C를 계산한다. 전이성 모델에 대해, RPMI 1640 배지 (10％ FBS 열 불활성화된) 내에 배양된 SKmel23, 888mel 및 B16 흑색종 세포를 수거, 세척 및 재현탁한다. SKmel23, 888mel 및 B16 흑색종 세포를 정맥내 주사한다. 종양 주사 후 제2일에, 마우스에게 항-TYRP1 항체 또는 대조 인간 IgG를 투여한다. 마우스를 제20일에 희생시키고, 폐를 제거하고, 폐 표면 결절을 계수하고, ％ 억제를 계산한다.

피하 모델에서 입증된 바와 같이, 20D7과 DTIC의 조합 처리는 20D7 (p<0.001) 또는 DTIC (p<0.001) 단독의 경우보다 종양 성장을 유의하게 억제하였다.

표 9는 4개의 모델에서 단제치료 20D7 또는 DTIC에 비해 20D7S의 생체내 항-종양 활성을 요약한다. 생체 내에서 20D7의 항-종양 활성은 전이성 모델에서 ％ 억제에 의해 나타낸다 (^*는 통계학적 유의성을 나타내고; ND는 결정되지 않음을 나타낸다). 생체 내에서 20D7의 항-종양 활성은 피하 모델에서 ％ T/C에 의해 나타낸다. 20D7과 다카르바진 (DTIC)를 함께 사용한 처리는 단제요법에 비해 더 강한 항-종양 활성을 나타냈다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

아미노산 서열

를 포함하는 VH, 서열
(서열 4)를 갖는 CDRL1, 서열
(서열 5)를 갖는 CDRL2, 및 서열
(서열 6)를 갖는 CDRL3을 포함하는, 인간 TYRP1 (서열 28)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
제1항에 있어서, 아미노산 서열

를 포함하는 VL 및
아미노산 서열

를 포함하는 VH
를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 30의 중쇄 및 서열 32의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 30의 중쇄 2개 및 서열 32의 경쇄 2개를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리핵산.
코딩되는 항체 또는 단편이 발현될 수 있도록 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 제5항에 따른 폴리핵산을 포함하는 발현 벡터.
제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단편을 생산할 수 있는, 발현 벡터를 포함하는 제조합 세포이며, 상기 발현 벡터는 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리핵산을 포함하고, 상기 폴리핵산은 코딩되는 항체 또는 단편이 발현될 수 있도록 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 것인, 제조합 세포.
항체 또는 단편이 생산되도록 제7항에 따른 재조합 세포를 배양하고, 배양액으로부터 항체 또는 단편을 회수함으로써 생산되는 항체 또는 단편.
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제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는, 흑색종 치료용 제약 조성물.
제10항에 있어서, 흑색종이 악성 흑색종인 제약 조성물.
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