ES2866935T3 - Anticuerpos dirigidos contra interleucina-33 (IL-33) - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo que comprende (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de SEQ ID NÚM.: 136; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de SEQ ID NÚM.: 171.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos dirigidos contra interleucina-33 (IL-33)

Antecedentes de la invención

La interleucina 33 (IL-33), también conocida como factor nuclear (NF) en las venas endoteliales altas (NF-HEV), es una citoquina perteneciente a la superfamilia IL-1. IL-33 induce a los linfocitos T auxiliares, mastocitos, eosinófilos y basófilos a producir citoquinas tipo 2. IL-33 media sus efectos biológicos al interactuar con los receptores ST2 (también conocidos como IL1RL1) y la Proteína Accesoria del Receptor IL-1 (IL1RAP) para activar moléculas intracelulares en las vías de señalización NF-kB y MAP quinasa que impulsan la producción de citoquinas tipo 2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, E IL-13) de células T auxiliares polarizadas (Th2) y células linfoides innatas del Grupo 2 (ILC2) en la piel, los pulmones y el tracto gastrointestinal. IL-33 actúa directamente sobre los mastocitos para activar su activación, y estimula los eosinófilos y los basófilos a degranular, causando daño tisular. Se presume que la inducción de citoquinas tipo 2 por IL-33 in vivo induce los cambios patológicos graves observados en los órganos de la mucosa tras la administración de IL-33 (véase, por ejemplo, Schmitz et al., Immunity, 23(5): 479-490 (2005); y Chackerian et al., J. Immunol., 179 (4): 2551-2555 (2007)).

Tanto el perfil de expresión in vivo de IL-33 como sus objetivos celulares sugieren un papel para IL-33 en las patologías controladas por Th2. Por ejemplo, la expresión de IL-33 se ha detectado en tejido inflamado de pacientes con asma moderada a grave, dermatitis atópica, rinitis alérgica, alergias alimentarias, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y enfermedad de Crohn. Además, los polimorfismos funcionales de un solo nucleótido (SNP) en la región promotora distal de ST2 (IL-33R) han mostrado una asociación significativa con la dermatitis atópica (véase, por ejemplo, Shimizu et al., Hum. Mol. Genet., 14(19): 2919-2927 (2005)). Los estudios de asociación genómica (Gw AS) también han mostrado un fuerte vínculo con los SNP en los genes IL-33 y ST2 (IL-33R) para el asma en múltiples estudios de grupos étnicos diversos (véase, por ejemplo, Gudbjartsson et al., Nat. Genet., 41(3): 342-347 (2009); Melén et al., J Allergy Clin. Immunol., 126(3): 631-637 (2010); Moffatt et al., New Engl J. Med., 363(13):1211-1221 (2010); y Torgerson et al., Nat. Genet., 43(9): 887-92 (2011)). LA IL-33 (posiblemente en combinación con IL-25 y TSLP) también activa las células linfoides innatas (ILC2 células) que conducen a la secreción de citoquinas Th2, respuestas antiparasitarias e inmunopatología tisular.

Los estudios también sugieren que la IL-33 juega un papel directo en algunos cánceres que expresan el receptor de la IL-33, tal como, por ejemplo, los cánceres epiteliales (es decir, los carcinomas) actuando como factor de supervivencia o crecimiento de las células cancerosas. Tal capacidad de respuesta a la IL-33 puede contribuir a escapar de ciertos tipos de células cancerosas del estándar de cuidado actual (por ejemplo, leucemia mielógena crónica (LMC), cánceres de mama y cánceres gastrointestinales). Además, la IL-33 puede desempeñar un papel indirecto en la progresión del cáncer al reducir la actividad protectora del sistema inmunitario en el control de las células tumorales. Otros estudios recientes sugieren que la IL-33 juega un papel en la patología de la fibrosis, tal como, por ejemplo, la fibrosis de la piel, la fibrosis hepática, esclerosis sistémica y fibrosis pulmonar. Además, Mchedlidze et al., Immunity, 39: 357-371 (2013), demuestra que la expresión hepática de la interleucina-33 (IL-33) es necesaria y suficiente para la fibrosis hepática grave in vivo.

Los anticuerpos que se unen a IL-33 son desvelados en el documento WO 2005/079844 A2, WO 2011/031600 A1y WO 2014/164959 A2.

Mingcai et al. describen que el bloqueo de IL-33 suprime el desarrollo de encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL/6 (J. Neuromunsol., 247: 23-31 (2012)).

Liu et al. describen que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-33 inhibe la inflamación de las vías respiratorias en un modelo murino de asma alérgica (Biochem. Biophys. Res Commun., 386: 181-185 (2009)).

Yuan et al. describen la construcción de una biblioteca humana no inmune y la selección de scFvs contra IL-33 (Appl. Biochem. Biotechniol., 167: 498-509 (2012)).

Por lo tanto, existe una necesidad de inhibidores de IL-33 (por ejemplo, anticuerpos) que unen IL-33 con alta afinidad y neutralizan eficazmente la actividad de IL-33. La invención proporciona un agente de unión a IL-33 que se une e inhibe IL-33.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo que comprende (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de SEQ ID NÚM.: 136; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de SEQ ID NÚM.: 171.

Las realizaciones preferentes de la invención, así como realizaciones no de la invención de anticuerpos de unión a IL-33, son proporcionadas por la siguiente divulgación.

La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislada que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID Nú M.: 1, SEQ ID NÚM.: 2 y SEQ ID NÚM.: 5-50, o (b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a cualquiera de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, SEQ ID NÚM.: 5-50, SEQ ID NÚM.: 67-140, SEQ ID NÚM.: 176, SEQ ID NÚM.: 177, SEQ ID NÚM.: 178-188, y SEQ ID NÚM.: 206-217.

La divulgación proporciona un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislada que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4 y SEQ ID NÚM.: 51-66, o (b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 51-66, SEQ ID NÚM.: 141-175, SEQ ID NÚM.: 189-205, y SEQ ID NÚM.: 218-231.

Además, la divulgación proporciona secuencias de ácido nucleico aisladas o purificadas que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina anteriores, vectores que comprenden tales secuencias de ácido nucleico, agentes aislados de unión a IL-33 que comprenden los polipéptidos de inmunoglobulina anteriores, secuencias de ácido nucleico que codifican tales agentes de unión a IL-33, vectores que comprenden tales secuencias de ácido nucleico, células aisladas que comprenden tales vectores, composiciones que comprenden tales agentes de unión a IL-33 o tales vectores con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno en mamíferos que es sensible a la inhibición o neutralización de IL-33 mediante la administración de cantidades efectivas de tales composiciones a los mamíferos.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

La Figura 1A es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran la determinación de EC50para la estimulación por IL-33 de la secreción de IL-5 de células KU812. La Figura 1B es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran que el agente de unión a IL-33 de la invención inhibe la liberación mediada por IL-33 de IL-5 a partir de células KU812.

La Figura 2A es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran que IL-33 induce la expresión de luciferasa del promotor IL-8 en células ST2-HEK293. La Figura 2B es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran que el agente de unión a IL-33 de la invención inhibe la expresión de luciferasa inducida por IL-33 del promotor IL-8 en células ST2-HEK293.

La Figura 3 es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran que el agente de unión a IL-33 de la invención inhibe la liberación mediada por IL-33 de IL-5 en basófilos humanos primarios. Para APE4909, IC50 = 2,2 ± 1,1 Nm (N=3); para monómero ST2, IC50 = 20 Nm (N=1). Las líneas discontinuas marcadas con "IL-33" y "medio" representan la concentración de IL-5 secretada en ausencia de anticuerpo y en ausencia de IL-33, respectivamente. El sufijo 02 adjunto a APE4909 se refiere al lote de proteínas ensayadas en estos experimentos.

La Figura 4 es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran que el agente de unión a IL-33 de la invención inhibe la liberación mediada por IL-33 de IL-9 de basófilos humanos primarios. IC50para APE4909 se midió a 3 Nm. Las líneas discontinuas marcadas con "IL-33" y "medio" representan la concentración de IL-9 secretada en ausencia de anticuerpo y en ausencia de IL-33, respectivamente. El anticuerpo APE0422 representa un anticuerpo de control de isotipo.

La Figura 5 es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran la afinidad del anticuerpo de la invención APE4909 para IL-33 humana medido por KINEXA™. Los resultados indican KD=1,0 pM (N=2) con un intervalo de confianza (IC) del 95% de 1,9pM - 420fM.

La Figura 6 es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran la afinidad del anticuerpo de la invención APE4909 para IL-33 de cinomolgus medido por KINeXa ™.

La Figura 7 es un gráfico que muestra datos experimentales que ilustran la capacidad del anticuerpo de la invención APE4909 para inhibir la expansión del eosinófilo humano impulsado por IL-33 en el compartimiento sanguíneo periférico.

Descripción detallada de la invención

La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislada y/o un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislada, o un fragmento (por ejemplo, fragmento de unión a antígeno) del mismo. El término "inmunoglobulina" o "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína que se encuentra en la sangre u otros fluidos corporales de vertebrados, que es utilizada por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar objetos extraños, tal como bacterias y virus. El polipéptido está "aislado" en el sentido de que se elimina de su entorno natural. En una realización preferente, una inmunoglobulina o anticuerpo es una proteína que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR). Las CDR forman la "región hipervariable" de un anticuerpo, que es responsable de la unión al antígeno (como se discute más adelante). Una inmunoglobulina completa consiste típicamente en cuatro polipéptidos: dos copias idénticas de un polipéptido de cadena pesada (H) y dos copias idénticas de un polipéptido de cadena ligera (L). Cada una de las cadenas pesadas contiene una región de variable extremo terminal N (V H ) y tres regiones constantes de extremo terminal C (C H 1, C H 2 y C H 3), y cada cadena ligera contiene una región variable de extremo terminal N (V^l) y una región constante de extremo terminal C (C^l). Las cadenas ligeras de anticuerpos se pueden asignar a uno de dos tipos distintos, ya sea kappa (k) o lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. En una inmunoglobulina típica, cada cadena ligera está vinculada a una cadena pesada por enlaces disulfuro, y las dos cadenas pesadas están vinculadas entre sí por enlaces disulfuro. La región variable de cadena ligera se alinea con la región variable de la cadena pesada, y la región constante de la cadena ligera se alinea con la primera región constante de la cadena pesada. Las regiones constantes restantes de las cadenas pesadas están alineadas entre sí.

Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión del antígeno de un anticuerpo. Las regiones V^h y V^l tienen la misma estructura general, y cada región comprende cuatro regiones marco (FW o FR). El término "región marco", tal como se utiliza en la presente, se refiere a las secuencias de aminoácidos relativamente conservadas dentro de la región variable que se encuentran entre las regiones determinantes hipervariables o complementarias (CDR). Hay cuatro regiones marco en cada dominio variable, que se designan FR1, f R2, FR3 y FR4. Las regiones marco forman las hojas p que proporcionan el marco estructural de la región variable (véase, por ejemplo, C.A. Janeway et al (Eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)).

Las regiones marco están conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Como se discutió anteriormente, las tres CDR, conocidas como CDR1, CDR2 y CDR3, forman la "región hipervariable" de un anticuerpo, que es responsable de la unión del antígeno. Las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos comprenden parte de, la estructura de hoja beta formada por las regiones marco. Mientras que las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas no están directamente involucradas en la unión del anticuerpo a un antígeno, las regiones constantes pueden influir en la orientación de las regiones variables. Las regiones constantes también presentan diversas funciones de efector, tal como la participación en la lisis mediada por complemento dependiente de anticuerpos o la toxicidad celular dependiente de anticuerpos a través de interacciones con moléculas y células efectoras.

Idealmente, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislada y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislada de la invención se unen a IL-33. Como se ha comentado anteriormente, la interleucina-33 (IL-33) (también conocida como factor nuclear (NF) en las venas endoteliales altas (NF-HEV)) es una citoquina de la familia IL-1, que también incluye las citoquinas inflamatorias IL-1a, IL-1p e IL-18. Se ha demostrado que IL-33 envía señales a través del receptor ST2 y el receptor IL1RAP. IL-33 se expresa ampliamente en varios tejidos, incluyendo el estómago, pulmón, médula espinal, cerebro, y la piel, así como en las células, incluyendo las células musculares lisas y las células epiteliales que revisten los bronquios y las vías respiratorias pequeñas. La expresión de IL-33 se induce por IL-1p y factor de necrosis tumoral a (TNF-a) en fibroblastos pulmonares y dérmicos y, en menor medida, por activación de macrófagos. Se ha demostrado que el tratamiento con IL-33 induce respuestas T-helper (Th) tipo 2 en ratones, como lo indica un aumento en la producción de citoquinas Th2 e inmunoglobulina sérica. El tratamiento sistémico de ratones con IL-33 produce cambios patológicos en el pulmón y el tracto digestivo (véase, por ejemplo, Choi et al., Blood, 114(14): 3117-3126 (2009); y Yagami et al., J. Immunology, 185(10): 5743-5750 (2010)).

IL-33 se produce como una proteína precursora de 30 kDa que se escinde in vitro mediante caspasa-1, liberando la forma madura de 18 kDa (véase, por ejemplo, Schmitz et al., Immunity, 23(5): 479-490(2005)). Al unirse al receptor ST2, IL-33 promueve la activación del factor nuclear (NP)-kB y la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), lo que lleva a una mayor transcripción de citoquinas Th2 (Schmitz et al., supra).

Los anticuerpos que se unen a IL-33, y sus componentes, son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente de los EE.UU. 2009/0041718 A1y2012/0263709 A1). Los anticuerpos anti-IL-33 también están disponibles comercialmente a partir de fuentes tal como, por ejemplo, Abcam (Cambridge, MA).

La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, SEQ ID NÚM.: 5-50, SEQ ID NÚM.: 67-140, SEQ ID NÚM.: 176, SEQ ID NÚM.: 177, SEQ ID NÚM.: 178-188, y SEQ ID NÚM.: 206-217, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a cualquiera de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, SEQ ID NÚM.: 5-50, SEQ ID NÚM.: 67-140, SEQ ID NÚM.: 176, SEQ ID NÚM.: 177, SEQ ID NÚM.: 178-188, y SEQ ID NÚM.: 206-217. En una realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislada comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, SEQ ID NÚM.: 5-50, SEQ ID NÚM.: 67-140, SEQ ID NÚM.: 176, SEQ ID NÚM.: 177, SEQ ID NÚM.: 178-188, y SEQ ID NÚM.: 206-217. Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, SEQ ID NÚM.: 5-50, SEQ ID NÚM.: 67-140, SEQ ID NÚM.: 176, SEQ ID NÚM.: 177, SEQ ID NÚM.: 178-188, y SEQ ID NÚM.: 206-217, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afectan materialmente al polipéptido (por ejemplo, los restos de proteínas como la biotina que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina consiste en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, SEQ ID NÚM.: 5-50, SEQ ID NÚM.: 67-140, SEQ ID NÚM.: 176, SEQ ID NÚM.: 177, SEQ ID NÚM.: 178-188, y SEQ ID NÚM.: 206-217, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina).

La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica (por ejemplo, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica) a cualquiera de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, SEQ ID NÚM.: 5-50, SEQ ID NÚM.: 67-140, SEQ ID NÚM.: 176, SEQ ID NÚM.: 177, SEQ ID NÚM.: 178-188, o SEQ ID NÚM.: 206-217. La "identidad" de la secuencia de ácido nucleico o aminoácido, como se describe en la presente memoria, puede determinarse comparando una secuencia de ácido nucleico o aminoácido de interés con una secuencia de ácido nucleico o aminoácido de referencia. La identidad porcentual es el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales (es decir, que son idénticos) entre la secuencia de interés y la secuencia de referencia dividida por la longitud de la secuencia más larga (es decir, la longitud de la secuencia de interés o la secuencia de referencia, la que sea más larga). Se conocen diversos algoritmos matemáticos para obtener la alineación óptima y calcular la identidad entre dos o más secuencias, que se incorporan a diversos programas informáticos disponibles. Los ejemplos de tales programas incluyen CLUSTAL-W, T-Coffee, y ALIGN (para la alineación de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos), programas BLAST (por ejemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ y versiones posteriores) y programas FASTA (por ejemplo, Fa STA3x , FASTM y SSEAr Ch ) (para la alineación de secuencias y búsquedas de similitud de secuencias). Los algoritmos de alineación de secuencias también son desvelados en, por ejemplo, Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), y Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)).

La divulgación proporciona un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 51-66, SEQ ID NÚM.: 141-175, SEQ ID NÚM.: 189-205, y SEQ ID NÚM.: 218-231, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 51-66, SEQ ID NÚM.: 141-175, SEQ ID NÚM.: 189­ 205, y SEQ ID NÚM.: 218-231. En una realización, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislada comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 51-66, SEQ ID NÚM.: 141-175, SEQ ID NÚM.: 189-205, y SEQ ID NÚM.: 218-231. Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 51-66, SEQ ID NÚM.: 141-175, SEQ ID NÚM.: 189-205, y SEQ ID NÚM.: 218-231, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afectan materialmente al polipéptido (por ejemplo, los restos de proteínas como la biotina que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina consiste en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 51-66, SEQ ID NÚM.: 141-175, SEQ ID NÚM.: 189-205, y SEQ ID NÚM.: 218-231, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina).

La divulgación proporciona un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica (por ejemplo, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica) a cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 51-66, SEQ ID NÚM.: 141-175, SEQ ID NÚM.: 189-205, o SEQ ID NÚM.: 218-231. La "identidad" de la secuencia de ácido nucleico o aminoácido, como se describe en la presente memoria, puede determinarse utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria.

Uno o más aminoácidos de los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina mencionados anteriormente y/o polipéptidos de cadena ligera pueden ser reemplazados o sustituidos por un aminoácido diferente. Un "reemplazo" o "sustitución" de aminoácidos se refiere al reemplazo de un aminoácido en una posición o residuo dados por otro aminoácido en la misma posición o residuo dentro de una secuencia de polipéptido.

Los aminoácidos se agrupan ampliamente como "aromáticos" o "alifáticos". Un aminoácido aromático incluye un anillo aromático. Algunos ejemplos de aminoácidos "aromáticos" son histidina (H o His), fenilalanina (F o Phe), tirosina (Y o Tyr) y triptófano (W o Trp). Los aminoácidos no aromáticos se agrupan ampliamente como "alifáticos". Algunos ejemplos de aminoácidos "alifáticos" son glicina (G o Gly), alanina (A o Ala), valina (V o Val), leucina (L o Leu), isoleucina (I o Ile), metionina (M o MET), serina (S o ser), treonina (T o Thr), ciprolina (C o ácido glutámico) (E o Glu), ácido aspártico (A o ASP), asparagina (N o ASN), glutamina (Q o Gln), lisina (K o Lys) y arginina (R o Arg).

Los aminoácidos alifáticos pueden subdividirse en cuatro subgrupos. El "gran subgrupo alifático no polar" consiste en valina, leucina e isoleucina. El "subgrupo alifático ligeramente polar" consiste en metionina, serina, treonina y cisteína. El "subgrupo alifático polar/cargado" consiste en ácido glutámico, ácido aspártico, asparagina, glutamina, lisina, y arginina. El "subgrupo de residuos pequeños" consiste en glicina y alanina. El grupo de aminoácidos cargados/polares puede subdividirse en tres subgrupos: El "subgrupo con carga positiva" que consiste en lisina y arginina, el "subgrupo con carga negativa" que consiste en ácido glutámico y ácido aspártico, y el "subgrupo polar" que consiste en asparagina y glutamina.

Los aminoácidos aromáticos pueden subdividirse en dos subgrupos: El "subgrupo de anillo de nitrógeno" que consiste en histidina y triptófano y el "subgrupo de fenilo" que consiste en fenilalanina y tirosina.

El reemplazo o sustitución de aminoácidos puede ser conservador, semi-conservador o no conservador. La frase "sustitución conservadora de aminoácidos" o "mutación conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido con una propiedad común. Una forma funcional de definir las propiedades comunes entre los aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de los cambios de aminoácidos entre las proteínas correspondientes de los organismos homólogos (Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). De acuerdo con tales análisis, pueden definirse grupos de aminoácidos en los que los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sí, y por lo tanto se parecen más en su impacto sobre la estructura proteica general (Schulz and Schirmer, supra).

Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen sustituciones de aminoácidos dentro de los subgrupos descritos anteriormente, por ejemplo, lisina por arginina y viceversa, de manera tal que se pueda mantener una carga positiva, ácido glutámico para ácido aspártico y viceversa de manera tal que se pueda mantener una carga negativa, serina para treonina de manera tal que se pueda mantener -OH libre, y glutamina para la asparagina de manera tal que se pueda mantener -NH2 libre.

Las "mutaciones semi-conservadoras" incluyen sustituciones de aminoácidos dentro de los mismos grupos mencionados anteriormente, pero no dentro del mismo subgrupo. Por ejemplo, la sustitución del ácido aspártico por asparagina, o asparagina por lisina, involucra aminoácidos dentro del mismo grupo, pero diferentes subgrupos. Las "mutaciones no conservadoras" implican sustituciones de aminoácidos entre diferentes grupos, por ejemplo, lisina para triptófano, o fenilalanina para serina, etc.

Además, se pueden insertar uno o más aminoácidos en los polipéptidos de cadena pesada y/o polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina mencionados anteriormente. Cualquier número de aminoácidos adecuados puede ser insertado en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o polipéptido de cadena ligera. A este respecto, al menos un aminoácido (por ejemplo, 2 o más, 5 o más, o 10 o más aminoácidos), pero no más de 20 aminoácidos (por ejemplo, 18 o menos, 15 o menos, o 12 o menos aminoácidos), se puede insertar en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o polipéptido de cadena ligera. Preferentemente, 1-10 aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos) se insertan en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o polipéptido de cadena ligera. A este respecto, el aminoácido puede insertarse en cualquiera de los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina mencionados anteriormente y/o polipéptidos de cadena ligera en cualquier lugar adecuado. Preferentemente, los aminoácidos se insertan en una CDR (por ejemplo, CDR1, CDR2 o c DR3) del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o polipéptido de cadena ligera.

El polipéptido de cadena pesada y polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina aislada desvelados sin limitación polipéptidos que comprenden las secuencias específicas de aminoácidos descritas en la presente memoria. De hecho, el polipéptido de inmunoglobulina o polipéptido de cadena ligera de cadena pesada puede ser cualquier polipéptido de cadena pesada o polipéptido de cadena ligera que compite con el polipéptido de inmunoglobulina o polipéptido de cadena ligera de cadena pesada para unirse a IL-33. A este respecto, por ejemplo, el polipéptido de inmunoglobulina o polipéptido de cadena ligera de cadena pesada puede ser cualquier polipéptido de cadena pesada o polipéptido de cadena ligera que se une al mismo epitopo de IL-33 reconocido por los polipéptidos de cadena pesada y ligera descritos en la presente memoria. La competencia de anticuerpos puede analizarse utilizando ensayos de competencia de péptidos rutinarios que utilizan procedimientos ELISA, Western blot o inmunohistoquímica (véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. 4.828.981 y 8.568.992; y Braitbard et al., Proteome Sci., 4: 12 (2006)).

La divulgación proporciona un agente aislado de unión a interleucina-33 (IL-33) que comprende, esencialmente, o consiste en una o más de las secuencias aisladas de aminoácidos descritas en la presente memoria. Por "agente de unión a interleucina-33 (IL-33)" se entiende una molécula, preferentemente una molécula proteinácea, que se une específicamente a IL-33. Preferentemente, el agente de unión a IL-33 es un anticuerpo o un fragmento (por ejemplo, un fragmento inmunogénico) del mismo. El agente aislado de unión a IL-33 de la divulgación comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislada y/o el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislada. En una realización, el agente aislado de unión a IL-33 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina o el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina. En otra realización, el agente aislado de unión a IL-33 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina.

Cualquier residuo de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina puede ser reemplazado, en cualquier combinación, por un residuo de aminoácidos diferente, o se puede eliminar o insertar, a condición de que la actividad biológica del agente de unión a IL-33 se realce o mejore como resultado de los reemplazos de aminoácidos, inserciones y/o supresiones. La "actividad biológica" de un agente de unión a IL-33 se refiere, por ejemplo, a la afinidad de unión de un epitopo de IL-33 particular, neutralización o inhibición de la unión a IL-33 a sus receptores, neutralización o inhibición de la actividad in vivo de IL-33 (por ejemplo, IC50), farmacocinética y reactividad cruzada (por ejemplo, con homólogos no humanos u ortólogos de la proteína IL-33, o con otras proteínas o tejidos). Otras propiedades biológicas o características de un agente de unión al antígeno reconocido en la técnica incluyen, por ejemplo, avidez, selectividad, solubilidad, plegamiento, inmunotoxicidad, expresión y formulación. Las propiedades o características mencionadas pueden observarse, medirse y/o evaluarse utilizando técnicas estándar, incluyendo, pero sin limitación a, ELISA, ELISA competitivo, análisis de resonancia plasmática superficial (BIACORE™), o KINEXA™, ensayos de neutralización in vitro o in vivo, ensayos de unión receptor-ligando, producción de citoquinas o factores de crecimiento y/o ensayos de secreción, y ensayos de transducción de señales e inmunohistoquímica.

Los términos "inhibir" o "neutralizar", como se utilizan en la presente memoria con respecto a la actividad de un agente de unión a IL-33, se refieren a la capacidad de antagonizar, prohibir, evitar, restringir, frenar, ralentizar, interrumpir, alterar, eliminar, detener o revertir la progresión o gravedad de, por ejemplo, la actividad biológica de IL-33, o una enfermedad o condición asociada con IL-33. El agente aislado de unión a IL-33 de la invención inhibe o neutraliza preferentemente la actividad de IL-33 en al menos aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores.

El agente aislado de unión a IL-33 de la invención puede ser un anticuerpo entero, como se describe en la presente memoria, o un fragmento de anticuerpo. Los términos "fragmento de un anticuerpo", "fragmento de anticuerpo" y "fragmento funcional de un anticuerpo" se utilizan indistintamente en la presente memoria para significar uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (véase, generalmente, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). El agente aislado de unión a IL-33 puede contener cualquier fragmento de anticuerpo de unión a IL-33. El fragmento de anticuerpo comprende, por ejemplo, una o más CDR, región variable (o sus porciones), región constante (o sus porciones) o sus combinaciones. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^l, y CH1, (ii) un fragmento F(ab')2, que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab vinculados por un puente disulfuro en la región de bisagra, (iii) un fragmento Fv que consiste en los dominios V^l y V^h de una rama única de un anticuerpo, (iv) un fragmento Fab', que resulta de la ruptura del puente de disulfuro de un fragmento F(ab')2 usando condiciones de reducción suaves, (v) un fragmento Fv estabilizado por disulfuro (dsFv), y (vi) un anticuerpo de dominio (dAb), que es un polipéptido (V^h o V^l) de dominio de región variable única de anticuerpo que se une específicamente a antígeno.

En las realizaciones en las que el agente aislado de unión a IL-33 comprende un fragmento del polipéptido de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, el fragmento puede ser de cualquier tamaño a condición de que el fragmento se una a, y preferentemente inhiba la actividad de, IL-33. A este respecto, un fragmento del polipéptido de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende de manera deseable entre 5 y 18 (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores) aminoácidos. De manera similar, un fragmento del polipéptido de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende entre 5 y 18 (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores) aminoácidos.

Cuando el agente de unión a IL-33 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende de manera deseable una región constante de cadena pesada (Fc) de cualquier clase adecuada. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que se basa en anticuerpos de tipo silvestre IgG1, IgG2 o IgG4, o sus variantes.

El agente de unión a IL-33 también puede ser un fragmento de anticuerpo de una sola cadena. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos de cadena única incluyen, pero sin limitación, (i) un F^v de cadena única (scFv), que es una molécula monovalente que consiste en los dos dominios del fragmento F^v (es decir, VLy V^h) unida por un vinculador sintético que permite sintetizar los dos dominios como una sola cadena de polipéptido (véase, por ejemplo, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); y Osbourn et al., Nat. Biotechniol., 16: 778 (1998)) y (ii) un diacuerpo, que es un dímero de cadenas polipeptídicas, en el que cada cadena polipeptídica comprende una V^h conectada a una V^l por un enlazador peptídico que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre la VHy VLen la misma cadena de polipéptido, lo que conduce al apareamiento entre los dominios complementarios en diferentes cadenas de polipéptido V^h -V^l para generar una molécula dimérica funcional con dos sitios de unión de antígeno. Los fragmentos de anticuerpos se conocen en la técnica y se describen con más detalle en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. 2009/0093024 A1.

El agente aislado de unión a IL-33 también puede ser un cuerpo o fragmento de este. Un intracuerpo es un anticuerpo que se expresa y que funciona intracelularmente. Los intracuerpos típicamente carecen de enlaces disulfuro y son capaces de modular la expresión o actividad de los genes objetivo a través de su actividad específica de unión. Los intracuerpos incluyen fragmentos de un solo dominio como los dominios V^h y V^l aislados y scFv. Un intracelular puede incluir señales de tráfico subcelular adheridas al extremo terminal N o C del intracelular para permitir la expresión a altas concentraciones en los compartimentos subcelulares en los que se encuentra una proteína diana. Tras la interacción con un gen diana, un intrafamiliar modula la función de la proteína diana y/o logra el enmascaramiento fenotípico/funcional mediante mecanismos tal como aceleración de la degradación de la proteína diana y secuestro de la proteína diana en un compartimento subcelular no fisiológico. Otros mecanismos de inactivación génica mediada por el cuerpo pueden depender del epitopo al que se dirige el cuerpo, tal como la unión al sitio catalítico de una proteína diana o a epitopos que participan en interacciones proteína-proteína, proteína-ADN o proteína-ARN.

El agente aislado de unión a IL-33 también puede ser un conjugado de anticuerpos. A este respecto, el agente aislado de unión a IL-33 puede ser un conjugado de (1) un anticuerpo, un andamio alternativo, o fragmentos de éste, y (2) una fracción proteica o no proteica que comprende el agente de unión a IL-33. Por ejemplo, el agente de unión a IL-33 puede ser todo o parte de un anticuerpo conjugado con un péptido, una molécula fluorescente o un agente quimioterapéutico.

El agente aislado de unión a IL-33 puede ser, o puede obtenerse de, un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano, o un anticuerpo quimérico. Por "quimérico" se entiende un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende tanto las regiones humanas como no humanas. Preferentemente, el agente aislado de unión a IL-33 es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo monoclonal que comprende un andamio de anticuerpos humanos y al menos una CDR obtenida o derivada de un anticuerpo no humano. Los anticuerpos no humanos incluyen anticuerpos aislados de cualquier animal no humano, tal como, por ejemplo, un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata). Un anticuerpo humanizado puede comprender, uno, dos o tres CDR obtenidas o derivadas de un anticuerpo no humano. En una realización de la invención, CDRH3 del agente de la invención de unión a IL-33 se obtiene o se deriva de un anticuerpo monoclonal de ratón, mientras que el resto de las regiones variables y la región constante del agente de la invención de unión a IL-33 se obtiene o se deriva de un anticuerpo monoclonal humano.

Un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado pueden obtenerse por cualquier medio, incluso a través de fuentes in vitro (por ejemplo, un hibridoma o una línea celular que produce un anticuerpo recombinante) y fuentes in vivo (por ejemplo, roedores). Los procedimientos de generación de anticuerpos se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Kohler and Milstein, EUR J. Immunol., 5: 511­ 519 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); y Janeway et al. (Eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). En ciertas realizaciones, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico puede ser generado usando un animal transgénico (por ejemplo, un ratón) en el que uno o más genes de inmunoglobulina endógena son reemplazados por uno o más genes de inmunoglobulina humana. Los ejemplos de ratones transgénicos en los que los genes de anticuerpos endógenos se reemplazan efectivamente con genes de anticuerpos humanos incluyen, pero sin limitación, Medarex HUMAB-MOUSE™, Kirin TC MOUSE™ y Kyowa Kirin KM-m Ou SE™ (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat. Biotechniol., 23(9): 1117-25 (2005), y Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)). Un anticuerpo humanizado puede ser generado usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica (véase, por ejemplo, An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009)), incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR no humanos en un andamio de anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., Methods, 36(1): 25-34 (2005); y Hou et al., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)). En una realización, se puede producir un anticuerpo humanizado utilizando los procedimientos descritos en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. 2011/0287485 A1.

En una realización, una CDR (por ejemplo, CDR1, CDR2, O CDR3) o una región variable del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina descrita en la presente memoria pueden ser trasplantadas (es decir, injertadas) en otra molécula, tal como un polipéptido de anticuerpo o no anticuerpo, utilizando química de proteína o tecnología de ADN recombinante. A este respecto, la divulgación proporciona un agente aislado de unión a IL-33 que comprende al menos una CDR de una cadena pesada de inmunoglobulina y/o polipéptido de cadena ligera, como se describe en la presente memoria. El agente aislado de unión a IL-33 puede comprender uno, dos o tres CDR de una cadena pesada de inmunoglobulina y/o una región variable de cadena ligera como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, con respecto a los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina que comprenden cualquiera de SEQ iD NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 2, o SEQ ID NÚM.: 5-50, la CDR1 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 26 y 35, incluidos; la CDR2 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 50 y 59, incluidos (SEQ ID NÚM.: 1 y s Eq ID NÚM.: 2) o entre los residuos de aminoácidos 50 y 66, incluidos (SEQ iD NÚM.: 5-50); y la CDR3 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 99 y 102, inclusive (SEQ ID NÚM.: 1 y SEQ ID NÚM.: 2) o entre los residuos de aminoácidos 99 y 111, incluidos (SEQ ID NÚM.: 5-50). Con respecto a los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina que comprenden cualquiera de SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, y SEQ ID NÚM.: 51-66, por ejemplo, la CDR1 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 24 y 39, incluidos (Se Q ID NÚM.: 3 y SEQ ID NÚM.: 4) o entre los residuos de aminoácidos 24 y 34, incluidos (SEQ iD NÚM.: 51-66); la CDR2 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 55 y 61, incluidos (SEQ ID NÚM.: 3 y SEQ ID NÚM.: 4) o entre los residuos de aminoácidos 50 y 56, incluidos (SEQ ID NÚM.: 51-66); la CDR3 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 94 y 102, incluidos (SEQ ID Nú M.: 3 y SEQ ID NÚM.: 4) o entre los residuos de aminoácidos 89 y 97, incluidos (s Eq ID NÚM.: 51-66).

En una realización preferente, el agente de unión a IL-33 une un epitopo de IL-33 que bloquea la unión a IL-33 a los receptores ST2 (también conocido como IL1RL1) y/o proteína accesoria del receptor IL-1 (IL1RAP) e inhibe la señalización mediada por IL-33. La divulgación también proporciona un epitopo aislado o purificado de IL-33 que bloquea la unión a IL-33 a los receptores ST2 e IL1RAP de una manera indirecta o alostérica.

La invención también proporciona una o más secuencias aisladas o purificadas de ácido nucleico que codifican el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, y el agente de unión a IL-33 de la invención.

El término "secuencia de ácido nucleico" tiene por objeto abarcar un polímero de ADN o ARN, es decir, un polinucleótido, que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleótidos no naturales o alterados.

Los términos "ácido nucleico" y "polinudeótido", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula, y por lo tanto incluyen ADN de doble cadena y de una sola cadena, y ARN de doble cadena y de una sola cadena. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN hechos de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tal como, aunque sin limitación, los polinucleótidos metilados y/o tapados. Los ácidos nucleicos suelen estar vinculados a través de enlaces de fosfato para formar secuencias de ácidos nucleicos o polinucleótidos, aunque muchos otros vínculos se conocen en la técnica (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, y similares).

La invención proporciona además un vector que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, y/o el agente de unión a IL-33 de la invención. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un episoma, un cósmido, vector viral (por ejemplo, retroviral o adenoviral), o fago. Los vectores y procedimientos adecuados de preparación de vectores son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Ed. 3rd, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)).

Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido pesado de inmunoglobulina de la invención, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención y/o el agente de unión a IL-33 de la invención, el vector comprende preferentemente secuencias de control de expresión, tal como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de transcripción, sitios internos de entrada de ribosomas (IRES), y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de codificación en una celda huésped. Las secuencias de control de expresión ejemplares se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

Un gran número de promotores, incluyendo promotores constitutivos, inducibles y represables, de una variedad de fuentes diferentes son bien conocidos en la técnica. Las fuentes representativas de los promotores incluyen por ejemplo, virus, mamífero, insecto, planta, levadura, y bacterias, y los promotores adecuados de estas fuentes están fácilmente disponibles, o pueden fabricarse sintéticamente, basados en secuencias disponibles públicamente, por ejemplo, de depósitos como ATCC así como otras fuentes comerciales o individuales. Los promotores pueden ser unidireccionales (es decir, iniciar la transcripción en una dirección) o bidireccionales (es decir, iniciar la transcripción en una dirección de 3' o 5'). Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, por ejemplo, el sistema de expresión bacteriana T7, el sistema de expresión bacteriana pBAD (araA), el promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor SV40, el promotor de RSV. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, el sistema Tet (Patentes de los EE.UU.

5.464.758 y 5.814.618), el sistema inducible de Ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), el sistema T-ReX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), el sistema LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA), y el sistema de recombinasa inducible por tamoxifeno CRE-ERT (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: E99 (2000); Patente de los EE.UU. 7.112.715; y Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).

El término "potenciador", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ADN que aumenta la transcripción de, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico a la que está vinculado operablemente. Los potenciadores pueden ser localizados muchas kilobases lejos de la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico y pueden mediar la unión de factores reguladores, patrones de metilación del ADN, o cambios en la estructura del ADN. Un gran número de potenciadores de una variedad de fuentes diferentes son bien conocidos en la técnica y están disponibles como o dentro de polinucleótidos clonados (de, por ejemplo, depósitos como ATCC, así como otras fuentes comerciales o individuales). Un número de polinucleótidos que comprenden promotores (como el promotor de CMV de uso común) también comprenden secuencias potenciadoras. Los potenciadores se pueden ubicar corriente arriba, dentro, o corriente abajo de las secuencias de codificación.

El vector también puede comprender un "gen marcador seleccionable". El término "gen marcador seleccionable", como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que permite que las células que expresan la secuencia de ácido nucleico se seleccionen específicamente para o contra, en presencia de un agente selectivo correspondiente. Los genes marcadores seleccionables adecuados se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud Internacional de Patente WO 1992/008796 y WO 1994/028143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980); o'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapinet al., J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147-156 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817­ 823 (1980); y Patentes de los Estados Unidos 5.122.464 y 5.770.359.

En algunas realizaciones, el vector es un "vector de expresión episómica" o "episoma", que es capaz de replicarse en una célula huésped, y persiste como un segmento extracromosómico del ADN dentro de la célula huésped en presencia de presión selectiva apropiada (véase, por ejemplo, Conese et al., Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004)). Los vectores representativos de expresión episómica disponibles comercialmente incluyen, pero sin limitación, los plásmidos episómicos que utilizan el antígeno nuclear de Epstein Barr 1 (EBNA1) y el origen de replicación del virus de Epstein Barr (EBV) (ORP). Los vectores pREP4, pCEP4, pREP7 y pcDNA3,1 de Invitrogen (Carlsbad, CA) y pbkCMV de Stratagene (La Jolla, CA) representan ejemplos no limitantes de un vector episómico que utiliza el antígeno T y el origen de replicación SV40 en lugar de EBNA1 y oriP.

Otros vectores adecuados incluyen la integración de vectores de expresión, que pueden integrarse aleatoriamente en el ADN de la célula huésped, o pueden incluir un sitio de recombinación para permitir la recombinación específica entre el vector de expresión y el cromosoma de la célula huésped. Tales vectores de expresión integradora pueden utilizar las secuencias de control de expresión endógena de los cromosomas de la célula huésped para efectuar la expresión de la proteína deseada. Ejemplos de vectores que se integran de una manera específica del sitio incluyen, por ejemplo, componentes del sistema flp-in de Invitrogen (Carlsbad, CA) (por ejemplo, pcDNA™5/FRT), o el sistema cre-lox, como se puede encontrar en los vectores centrales pExchange-6 de Stratagene (La Jolla, CA). Entre los ejemplos de vectores que se integran aleatoriamente en los cromosomas de las células huésped se incluyen, por ejemplo, pcDNA3,1 (cuando se introducen en ausencia del antígeno T) de Life Technologies (Carlsbad, CA), UCOE de Millipore (Billerica, MA), y pCI o pFN10A (ACT) FLEXI™ de Promega (Madison, WI).

También se pueden utilizar vectores virales. Los vectores de expresión viral representativos comercialmente disponibles incluyen, pero sin limitación, el sistema Per.C6 basado en adenovirus disponible en Crucell, Inc. (Leiden, The Netherlands), el pLP1 basado en lentivirus de Invitrogen (Carlsbad, CA), y los vectores retrovirales pFB-ERV más pCFB-EGSH de Stratagene (La Jolla, CA).

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser proporcionadas a una célula en el mismo vector (es decir, en cis). Se puede utilizar un promotor unidireccional para controlar la expresión de cada secuencia de ácido nucleico. En otra realización, una combinación de promotores bidireccionales y unidireccionales puede usarse para controlar la expresión de múltiples secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de la invención pueden proporcionarse alternativamente a la población de células en vectores separados (es decir, en trans). Cada una de las secuencias de ácido nucleico en cada uno de los vectores separados puede comprender las mismas o diferentes secuencias de control de expresión. Los vectores separados pueden ser proporcionados a las células simultáneamente o secuencialmente.

El vector que comprende los ácidos nucleicos que codifica las secuencias de aminoácidos de la invención puede ser introducido en una célula huésped que es capaz de expresar los polipéptidos codificados por lo tanto, incluyendo cualquier célula procariótica o eucariótica adecuada. Como tal, la invención proporciona una célula aislada que comprende el vector de la invención. Las células anfitrionas preferentes son aquellas que pueden ser de crecimiento fácil y fiable crecer, tengan tasas de crecimiento razonablemente rápidas, sistemas de expresión bien caracterizados, y pueden ser transformadas o transfectadas de manera fácil y eficiente.

Los ejemplos de células procarióticas adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de los géneros Bacillus (tal como Bacillus subtilis y Bacillus brevis), Escherichia (tal como E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella y Erwinia. Las células procarióticas particularmente útiles incluyen las diversas cepas de Escherichia coli (por ejemplo, K12, HB101 (ATCC Núm. 33694), DH5a, DH10, MC1061 (ATCC Núm. 53338), y CC102).

Preferentemente, el vector se introduce en una célula eucariota. Las células eucariotas adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos. Los ejemplos de células de levadura adecuadas incluyen las de los géneros Kluyveromyces, Pichia, Rhino-sporidium, Saccharomyces, y Schizosaccharomyces. Las células de levadura preferentes incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerevisae y Pichia pastoris.

Las células de insectos adecuadas se describen en, por ejemplo, Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechniol., 4: 564-572 (1993); y Lucklow et al., J. Virol., 67: 4566-4579 (1993). Las células de insectos preferentes incluyen Sf-9 y HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Preferentemente, las células de mamíferos se utilizan en la invención. Un número adecuado de células huésped de mamíferos son conocidas en la técnica, y muchas están disponibles en American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Los ejemplos de células mamíferas adecuadas incluyen, pero sin limitación, las células ováricas de hámster chino (CHO) (ATCC Núm. CCL61), células CHO DHFR (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216­ 4220 (1980)), células de riñón embrionario humano (HEK) 293 o 293T (ATCC Núm. CRL1573) y células 3T3 (ATCC Núm. CCL92). Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas son las líneas celulares de mono COS-1 (ATCC Núm. CRL1650) y COS-7 (ATCC Núm. CRL1651), así como la línea celular CV-1 (ATCC Núm. CCL70). Otras células huésped de mamíferos ejemplares incluyen líneas celulares de primates y líneas celulares de roedores, incluyendo líneas celulares transformadas. También son adecuadas las células diploides normales, las cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, así como los explantes primarios. Otras líneas de células de mamíferos adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de neuroblastoma de ratón N2A, HeLa, células de ratón L-929 y líneas de células de hámster BHK o Hak, todas las cuales están disponibles en ATCC. Los procedimientos para seleccionar células huésped de mamíferos adecuadas y los procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, tamizaje y purificación de células son conocidos en la técnica.

Con la mayor preferencia, la célula mamífera es una célula humana. Por ejemplo, la célula mamífera puede ser una línea celular derivada linfoide o linfoide humana, tal como una línea celular de origen linfocitario pre-B. Los ejemplos de líneas de células linfoides humanas incluyen, sin limitación, RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988)), Raji cells (CCL-86), y sus derivados.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la invención puede introducirse en una célula por "transfección", "transformación" o "transducción". "Transfección", "transformación" o "transducción", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en una célula huésped mediante el uso de procedimientos físicos o químicos. Muchas técnicas de transfección son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, coprecipitación de ADN de fosfato de calcio (véase, por ejemplo, Murray E.J. (Ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dextran; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN de fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Se pueden introducir fagos o vectores virales en las células huésped, después del crecimiento de partículas infecciosas en células de embalaje adecuadas, muchas de las cuales están disponibles comercialmente.

La invención proporciona una composición que comprende una cantidad efectiva del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, el agente de unión a IL-33 de la invención, la secuencia de ácido nucleico de la invención de codificación de cualquiera de lo anterior, o el vector de la invención que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención. Preferentemente, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, fisiológicamente aceptable), que comprende un vehículo, preferentemente un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, fisiológicamente aceptable), y las secuencias de aminoácidos de la invención, agente de unión al antígeno o vector. Cualquier vehículo adecuado puede ser utilizado dentro del contexto de la invención, y tales vehículos son bien conocidos en la técnica. La elección del vehículo se determinará, en parte, por el lugar específico al que se pueda administrar la composición y el procedimiento particular utilizado para administrar la composición. La composición opcionalmente puede ser estéril. La composición puede congelarse o liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. Las composiciones se pueden generar de acuerdo con las técnicas convencionales descritas en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).

La divulgación proporciona además un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un mamífero que es sensible a la inhibición o neutralización de IL-33. El procedimiento comprende la administración de la composición mencionada anteriormente a un mamífero que tiene una enfermedad o trastorno que es sensible a la inhibición o neutralización de IL-33, con lo cual el trastorno de la enfermedad se trata en el mamífero. Una enfermedad o trastorno que "responde a la inhibición de IL-33" o "responde a la neutralización de IL-33", se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en el que una disminución de los niveles o actividad de IL-33 tiene un beneficio terapéutico en los mamíferos, preferentemente en los seres humanos, o la expresión inadecuada (por ejemplo, sobreexpresión) o el aumento de la actividad de IL-33 causa o contribuye a los efectos patológicos de la enfermedad o trastorno. Las enfermedades o trastornos que responden a la inhibición o neutralización de la IL-33 incluyen, por ejemplo, trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunes, ciertos cánceres (por ejemplo, cánceres epiteliales (carcinomas), leucemia mielógena crónica (LMC), cánceres de mama y cánceres gastrointestinales) y cualquier trastorno atópico. Los trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, inflamación alérgica de la piel, los pulmones y el tracto gastrointestinal, dermatitis atópica (también conocida como eccema atópico), asma (alérgica y no alérgica), fibrosis (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática, esclerodermia, fibrosis renal, y cicatrices), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, alergias alimentarias (por ejemplo, alergias a los cacahuetes, huevos, lácteos, mariscos, nueces de árbol, etc.), alergias estacionales, y otras alergias. Las enfermedades autoinmunes incluyen, por ejemplo, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, psoriasis, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso y esclerodermia. El término "atópico", como se usa en la presente memoria, se refiere a una predisposición hereditaria hacia el desarrollo de ciertas reacciones de hipersensibilidad (por ejemplo, eczema (dermatitis atópica), fiebre del heno (rinitis alérgica) y asma inducida por alergias (asma alérgica)), que suele estar mediada por una producción excesiva de IgE.

Como se usa en la presente memoria, los términos "tratamiento", "tratar", y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. Preferentemente, el efecto es terapéutico, es decir, el efecto cura parcial o completamente una enfermedad y/o síntoma adverso atribuible a la enfermedad. Para ello, el procedimiento consiste en administrar una "cantidad terapéutica efectiva" del agente de unión a IL-33. Una "cantidad terapéutica efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y por períodos de tiempo requeridos, para lograr un resultado terapéutico deseado. La cantidad terapéutica efectiva puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del agente de unión a IL-33 para obtener una respuesta deseada en el individuo. Por ejemplo, una cantidad terapéutica eficaz de un agente de unión a IL-33 de la invención es una cantidad que disminuye la actividad biológica de IL-33 en un ser humano.

Alternativamente, el efecto farmacológico y/o fisiológico puede ser profiláctico, es decir, el efecto previene total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma. A este respecto, el procedimiento comprende la administración de una "cantidad profilácticamente efectiva" del agente de unión a IL-33. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante los períodos de tiempo requeridos, para lograr un resultado profiláctico deseado (por ejemplo, la prevención de la aparición de la enfermedad).

Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 1 pg/kg a 20 mg/kg de peso corporal animal o humano; sin embargo, las dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar están dentro del alcance de la invención. La dosis parenteral diaria puede ser de aproximadamente 0,00001 pg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 0,001 pg/kg, aproximadamente 0,1 pg/kg, aproximadamente 1 pg/kg, aproximadamente 5 pg/kg, aproximadamente 10 pg/kg, aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 500 pg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores), preferentemente de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 0,5 pg/kg, aproximadamente 1 pg/kg, aproximadamente 50 pg/kg, aproximadamente 150 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 750 pg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores), preferentemente de aproximadamente 1 pg/kg a 5 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 3 pg/kg, aproximadamente 15 pg/kg, aproximadamente 75 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 900 pg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores), e incluso más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal por día (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, o un intervalo definido por dos de los valores anteriores). La eficacia terapéutica o profiláctica se puede controlar mediante la evaluación periódica de los pacientes tratados. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento puede repetirse hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y están dentro del alcance de la invención. La dosis deseada se puede administrar mediante una sola administración de bolo de la composición, mediante múltiples administraciones de bolo de la composición o mediante la administración continua de infusión de la composición.

La composición que comprende una cantidad efectiva del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, el agente de unión a IL-33 de la invención, la secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica cualquiera de las anteriores, o el vector de la invención que comprende la secuencia de la invención de ácido nucleico puede administrarse a un mamífero utilizando técnicas de administración estándar, incluyendo administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o por supositorio. La composición es preferentemente adecuada para administración parenteral. El término "parenteral", tal como se usa en la presente memoria, incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. Más preferentemente, la composición se administra a un mamífero mediante la administración sistémica periférica por inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

Una vez administrada a un mamífero (por ejemplo, un ser humano de reacción cruzada), la actividad biológica del agente de unión a IL-33 de la invención puede medirse por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la actividad biológica puede evaluarse determinando la estabilidad de un agente de unión a IL-33 en particular. En una realización de la invención, el agente de unión a IL-33 (por ejemplo, un anticuerpo) tiene una semivida in vivo entre aproximadamente 30 minutos y 45 días (por ejemplo, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 1 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 35 días, aproximadamente 40 días, aproximadamente 45 días, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). En otra realización, el agente de enlace IL-33 tiene una semivida in vivo entre 2 horas y 20 días (por ejemplo, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 19 días, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). En otra realización, el agente de unión a IL-33 tiene una semivida in vivo entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 40 días (por ejemplo, aproximadamente 10 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 23 días, aproximadamente 26 días, aproximadamente 29 días, aproximadamente 30 días, aproximadamente 33 días, aproximadamente 37 días, aproximadamente 38 días, aproximadamente 39 días, aproximadamente 40 días, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores).

La actividad biológica de un agente de unión a IL-33 en particular también puede evaluarse determinando su afinidad de unión a IL-33 o un epitopo del mismo. El término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes y se expresa como la constante de disociación (K^d). La afinidad de un agente de unión a un ligando, como la afinidad de un anticuerpo por un epitopo, puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 femtomolar (fM) a aproximadamente 100 micromolares (pm) (por ejemplo, de aproximadamente 1 fM a aproximadamente 1 picomolar (pM), de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 nanomolar (Nm), de aproximadamente 1 Nm a aproximadamente 1 micromolares (pm), o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 100 pm). En una realización, el agente de unión a IL-33 puede unirse a una proteína IL-33 con una K^d menor o igual que 1 nanomolar (por ejemplo, 0,9 Nm, 0,8 Nm, 0,7 Nm, 0,6 Nm, 0,5 Nm, 0,4 Nm, 0,3 Nm, 0,2 Nm, 0,1 Nm, 0,05 Nm, 0,025 Nm, 0,01 Nm, 0,001 Nm, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). En otra realización, el agente de enlace IL-33 puede unirse a IL-33 con una Kd menor o igual que 200 pM (por ejemplo, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). La afinidad de inmunoglobulina por un antígeno o epitopo de interés puede medirse utilizando cualquier ensayo reconocido en la técnica. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), microesferas separables (por ejemplo, microesferas magnéticas), resonancia plasmática superficial (SPR), competencia de fase de solución (KINeXa ™), barrido de antígenos y/o ELISA (véase, por ejemplo, Janeway et al. (Eds.), Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001).

El agente de unión a IL-33 de la invención puede ser administrado solo o en combinación con otros fármacos (por ejemplo, como adyuvante). Por ejemplo, el agente de unión a IL-33 puede administrarse en combinación con otros agentes para el tratamiento o la prevención de las enfermedades o trastornos desvelados en la presente memoria. A este respecto, el agente de unión a IL-33 puede usarse en combinación con al menos otro agente antiinflamatorio, incluyendo, por ejemplo, corticosteroides (por ejemplo, prednisona y fluticasona) y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINES) (por ejemplo, aspirina, ibuprofeno y naproxeno).

Además de los usos terapéuticos, el agente de unión a IL-33 descrito en la presente memoria puede usarse en aplicaciones de diagnóstico o investigación. En este sentido, el agente de unión a IL-33 puede usarse en un procedimiento de diagnóstico de una enfermedad o trastorno que sea sensible a la inhibición o neutralización de IL-33. De manera similar, el agente de unión a IL-33 se puede utilizar en un ensayo para controlar los niveles de proteína de IL-33 en un individuo que se está probando para una enfermedad o trastorno que responde a la inhibición o neutralización de IL-33. Las aplicaciones de investigación incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilizan el agente de unión a IL-33 y una etiqueta para detectar una proteína IL-33 en una muestra, por ejemplo, en un fluido del cuerpo humano o en un extracto de células o tejidos. El agente de unión a IL-33 se puede utilizar con o sin modificación, como el etiquetado covalente o no covalente con un resto detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo (por ejemplo, 3H,14C,32P,35S o 125I), un compuesto fluorescente o quimioluminiscente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o grupos protésicos o de rábano o peroxidasa). Cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar por separado un agente de unión al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) a un resto detectable puede ser empleado en el contexto de la invención (véase, por ejemplo, Hunter et al., Nature, 194: 495-496 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); and Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982))).

Los niveles de proteína IL-33 se pueden medir utilizando el agente de unión a IL-33 de la invención por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), y FACS. Los valores de expresión normales o estándar de IL-33 pueden establecerse utilizando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, combinando una muestra que comprende, o se sospecha que comprende, IL-33 con un anticuerpo específico de IL-33 en condiciones adecuadas para formar un complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo está marcado directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo ligado o no ligado. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos (véase, por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). La cantidad de polipéptido IL-33 expresada en una muestra se compara con un valor estándar.

El agente de unión a IL-33 puede suministrarse en un kit, es decir, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar un ensayo de diagnóstico. Si el agente de unión a IL-33 se etiqueta con una enzima, el kit incluye de manera deseable sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona un cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos en el kit, tal como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis), y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar para proporcionar concentraciones en la solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden suministrarse en polvo seco (normalmente liofilizado), incluidos excipientes que, al disolverse, proporcionarán una solución de reactivo con la concentración adecuada.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención de manera adicional, pero, por supuesto, no deben interpretarse de ninguna manera como limitando su alcance.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe los ensayos utilizados para determinar la actividad funcional de los polipéptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de la invención.

Liberación mediada por IL-33 de IL5 de células KU812.

Las células KU812, una línea celular de CML similar a la de basófilos humana (ATCC Núm. CRL-2099) (véase, por ejemplo, Tare et al., Exp. Cell Res., 316(15): 2527-37 (2010); Lefrancais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USa , 109(5): 1673-1978 (2012), responde a la estimulación por IL-33 secretando IL-5. Se suspendieron células KU812 en un medio de cultivo de 10 RPM1% de FBS, y se laminaron 500.000 células por pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos. Un stock de |jg 30/ml para anticuerpos de interés se diluyó en serie para generar 8 concentraciones a intervalos de medio registro. Las muestras diluidas se añadieron en filas a las células e incubaron a 37 °C durante 30 minutos. A continuación se añadió a cada pocillo IL-33-his6-bio (etiquetado en extremo terminal C con 6 His y biotinilado con un promedio de 1 a 2 biotinas por molécula) (3 ng), y se incubaron placas a 37 °C durante 48 horas. Los sobrenadantes se retiraron y se mantuvieron a 4 °C hasta que se realizaron pruebas mediante ELISA. Los sobrenadantes se analizaron con un kit IL-5 DuoSet ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) y se evaluaron en un lector de microplacas SPECTRAMAX™ (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA) utilizando el software de adquisición y análisis de datos de microplacas SOFTMAX PRO™ (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA) para determinar la producción de IL-5.

Expresión mediada por IL-33 de Luciferasa en células ST2-HEK293

Se generó una línea celular estable HEK/ST2 mediante la primera laminación de células HEK naive a 3x103 células/matraz T75 en DMEM/FBS 10% e incubación durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las células fueron transfectadas mezclando 500 jL Optimem (Life Technologies, Carlsbad, CA) 24 jL HD FUGERE™ (Promega, Madison, WI) y se permitió incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se añadió la codificación de ADN ST2-FC (4 jg ) a la mezcla FUGERE™ y se permitió incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos. La mezcla de ADN/FUGERE™ se distribuyó a continuación sobre las células HEK y se permitió incubar durante la noche a 37 °C, CO²5%. 24 horas después DE la transfección, las células se dividieron y se colocaron bajo la selección de higromicina durante un período de 3-4 semanas hasta que se seleccionaron de forma estable.

Ensayo reportero luciferasa IL-8

Se sembraron células HEK293-Fc/ST2 4x106 en un matraz T-75 durante la noche a 37 °C, CO²5%. A la mañana siguiente, la construcción de ADN AB4111 que codifica la expresión impulsora humana del promotor de IL-8 de un gen reportero de la luciferasa, fue transfectada a las células mezclando 500 jL Optimem 24 jL HD FUGERE™ y se permitió incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. El promotor IL-8 responde a la cascada de transducción de señal iniciada por la estimulación del complejo receptor ST2-IL-1RAcP por ocupación de IL-33. Se añadió AB4111 (2 jg ) a la mezcla FUGERE™ y se permitió incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos. La mezcla de ADN/FUGERE™ se distribuyó a través de las células HEK/ST2 y se permitió incubar durante 8 horas. Las células se recolectaron con ACCUTASE™ y se sembraron en una placa de fondo plano de 96 pocillos, con 2,0x104 células por pocillo en 0,1 ml de DMEM/FBS 10%. Las placas se incubaron durante 15-18 horas a 37 °C, CO²5%. A la mañana siguiente, las placas se invirtieron suavemente y se golpearon con las toallas de papel para retirar los medios. Se añadieron 50 jL/pocillo de DMEM fresco/FBS 10% a cada pocillo. Las células fueron estimuladas con IL-33/ST2-FC o IL-33/Ab precomplejado durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego se añadieron a las células y se permitió incubar durante 5 horas adicionales a 37 °C. Después de 5 horas, la actividad de la luciferasa se determinó utilizando el Steady Glo-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) añadiendo a cada pocillo reactivo luciferasa a 1:1 vol/vol. Los pocillos se mezclaron y se transfirieron 150 jL/pocillo a placas de fondo transparente de paredes negras y se leyeron en el lector de placas ENVISTION™ (PerkinElmer, Waltham, MA) utilizando el programa de luminiscencia (retardo de 60 segundos). Los datos se analizaron utilizando una curva de 4 parámetros con el software GraphPad Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA).

Procedimientos de resonancia de plasmón superficial (SPR)

La cinética de unión y las afinidades de los anticuerpos anti-IL33 fueron determinadas por SPR en un instrumento BIACORE™ T200 (GE Healthcare). Cada una de las cuatro células de flujo en un chip de la serie S CM5 se inmovilizó con 10.000 ~ RU de IgG anti-humana (Fc). Los anticuerpos (~1 jg/m l) se capturaron durante 60 segundos a un flujo de 10 jL/min. La IL-33 monomérica se diluyó en tampón de funcionamiento (HBS-EP+, pH 7,6) a partir de una concentración aproximadamente 100 veces mayor que la K^d de cada anticuerpo. Cada concentración de IL-33 se pasó sobre todas las células de flujo durante 180 segundos a 30 jL/min, y luego se permitió disociar durante 1800 segundos. Las superficies se regeneraron con MgCh 3 M durante 60 segundos. Las constantes cinéticas de asociación y disociación (kony koff) y la afinidad de estado estable (K^d) se derivaron de los sensogramas resultantes utilizando la versión 1.0 del Software de Evaluación BIACORE T200.

Los resultados de los ensayos anteriores con respecto a varios de los agentes de unión a IL-33 descritos en la presente memoria se muestran en las Figuras 1A, 1B, 2A y 2B.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe experimentos que demuestran la actividad funcional de un agente de unión a IL-33 de la invención.

Un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 136 se emparejó con un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 171. El anticuerpo resultante se denominó APE4909. La capacidad de APE4909 para inhibir la liberación mediada por IL-33 de IL-5 e IL-9 en basófilos humanos primarios fue evaluada como se describe a continuación.

Las unidades del sistema de reducción de leucocitos (LRS) procesadas a partir de sangre completa de donantes se obtuvieron del Banco de Sangre de San Diego. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante procedimientos estándar mediante la separación por centrifugación de densidad de Ficoll. Aproximadamente 109PBMC se obtuvieron típicamente de una unidad de LRS. Los basófilos fueron aislados de PBMC usando un kit de aislamiento de basófilos humanos II (Miltenyi Biotec cat#130-092-662, San Diego, CA). El rendimiento total de los basófilos fue de aproximadamente 106

Los basófilos se diluyeron a una densidad de 2 x106/ml en medio de RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina (P/S) y 25 ng/ml de IL-3 humana recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN). 100 |jL de células diluidas por pocillo se han laminado en placas de cultivo de tejido de fondo plano estándar de 96 pocillos para una densidad celular final de 2 x 105 por pocillo. Los pocillos exteriores se llenaron con 200 jL de PBS/pocillo para minimizar los efectos de la evaporación no uniforme. Las células se cultivaron durante la noche en CO²5% en una incubadora a 37 °C.

Al día siguiente, se añadieron APE4909 y una proteína humana monomérica ST2 (hST2 - conocida como APE3906) a concentraciones que oscilan entre 30 y 0 jg/m l diluidas en serie a intervalos de medio log en RPMI 10% FBS P/S con 50 ng/ml de IL-33. Aproximadamente 18 horas después, las placas se centrifugaron a 300 x g durante 3 minutos. Los sobrenadantes se retiraron, se transfirieron a una placa limpia y se almacenaron a -80 °C en espera del análisis.

Los niveles de IL-5 y/o IL-9 en los sobrenadantes celulares se evaluaron mediante ELISA utilizando un kit ELISA DUOSET™ (R&D Systems, Minneapolis, MN) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. El anticuerpo de APE4909 inhibe la liberación mediada por IL-33 de IL-5 e IL-9 en basófilos humanos primarios, como se muestra en las Figuras 3 y 4.

Los resultados de este ejemplo demuestran que el agente de unión a IL-33 de la invención puede inhibir la actividad de IL-33.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la afinidad de un agente de unión a IL-33 de la invención para IL-33.

La capacidad del anticuerpo APE4909 descrito en el Ejemplo 2 para interactuar con IL-33 se analizó biofísicamente utilizando una plataforma de biosensores KINEXA™ 3200 de Sapidyne Instruments (Boise, ID). Los experimentos de unión a IL-33 para seres humanos y cinomolgus (cynoIL-33) se realizaron como se describe a continuación y se realizaron dos veces de forma independiente. Las condiciones para el primer experimento se muestran no parentéticamente, mientras que las condiciones para el segundo experimento se proporcionan parentéticamente.

IL-33 APE4909/humano

La fase sólida se preparó utilizando microesferas revestidas de azlactona revestidas con una solución de IL-33 humana marcada con histidina de 50 jg/ml. Se realizaron experimentos de unión en IX PBS pH 7,4, BSA 0,1%. El anticuerpo de APE4909 a una concentración final de 10 pM (o 20 pM) se incubó con IL-33 a concentraciones finales de 200 pM a 3,4 fM (o de 400 pM a 6,7 fM) durante 3 (o 4) días a 4 °C. Se aplicaron 5 ml (o 10 ml) de cada mezcla a las microesferas revestidas con IL-33 a una tasa de 0,25 ml/min durante 1200 segundos (o 2400 segundos). Se detectó anticuerpo libre con un anticuerpo anti-humano de burro marcado ALEXAFLUOR™ 647-(Life Technologies, Carlsbad, CA). Todos los datos se ajustan usando el software KINEXA™ estándar.

IL-33 APE4909/Cyno (cIL-33)

Se realizaron experimentos como se describe anteriormente para IL-33 humana, excepto que el anticuerpo de APE4909 a las 20 pM y la concentración final de 100 pM se incubaron con cIL-33 a las concentraciones finales de 3Nm a 315 fM durante 24 horas a 4 °C. Cada mezcla se aplicó a las microesferas revestidas con cIL-33 a una tasa de 0,25 ml/min durante 500 segundos (para 20 pM) o 2120 segundos (para 100 pM). Se detectó anticuerpo libre con un anticuerpo anti-humano de burro marcado ALEXAFLUOR™ 647-(Life Technologies, Carlsbad, CA). Las dos curvas se combinaron mediante el análisis de la curva N y todos los datos se ajustaron mediante el software KINEXA™. Para verificar, el experimento se repitió a una concentración de 200pm de anticuerpos APE4909 utilizando fase sólida preparada de forma similar, tampones y reactivo de detección. El anticuerpo APE4909 fue incubado con cIL-33 a concentraciones finales de 15Nm a 250 fM durante 24 horas a 4 °C y aplicado a las microesferas revestidas con cIL-33 a una tasa de 0,25 ml/min durante 180 segundos. Estos datos se ajustan con el software KINEXA™ estándar.

Las afinidades de APE4909 para IL-33 de seres humanos y cynoIL-33 se muestran en la Figura 5 y en la Figura 6, respectivamente. Los resultados de este ejemplo demuestran que el agente de unión a IL-33 de la invención se une tanto a IL-33 de primates humanos y no humanos con alta afinidad.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra que ciertos agentes de unión a IL-33 de la invención compiten con el receptor ST2 por la unión a IL-33 humana.

La unión a IL-33 se monitoreó usando un sistema BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK). La unión a IL-33 a varios anticuerpos de IL-33 desvelados en la presente memoria o al receptor humano ST2 se trató capturando un anticuerpo y examinando la respuesta de unión de una concentración fija de iL-33 en combinación con cantidades crecientes de ST2. IgG anti-humana (específica de Fc, -10.000 RU) se inmovilizó en un chip BIACORE™ CM5 utilizando la química de acoplamiento de aminas activada por EDC. Los anticuerpos IL-33 o ST2 humana de la invención fusionados en una región Fc humana de IgG1 (2,0 pg/ml, tiempo de contacto de 1 minutos a una velocidad de flujo de 10 pL/min) se capturaron a 25 °C (-300 RU) en esta superficie. A continuación, se hizo fluir una solución de analito (preincubada durante más de 30 minutos) que contenía IL-33 (1 Nm) humana soluble monomérica y ST2 humana sin etiquetar (10, 3,3, 1,1 o 0,37 Nm) sobre los ligandos capturados durante 2 minutos a una velocidad de 30 pL/min, y la disociación se monitorizó durante 2 minutos adicionales. La superficie del chip sensor se regeneró entre cada ciclo con 3M MgCh(60 segundos a 30 pL/min).

Se realizó un segundo conjunto de experimentos como se describió anteriormente, pero con los siguientes cambios: (1) el chip sensor se inmovilizó con IgG anti-ratón (específica para Fc, -7500 RU); (2) se capturaron ST2 humanas fusionados con murina IgG2aFc (1,0 pg/ml) en el chip con un tiempo de contacto de 4 minutos; y (3) la solución de analito preincubada contenía IL-33 humana soluble monomérica sin etiquetar (10 Nm) y un anticuerpo IL-33 de la invención o ST2 humana monomérica sin etiquetar (100 Nm, 25 Nm, 6,3 Nm o 1,6 Nm). La solución de analito continuó se incubó durante aproximadamente 30 minutos mientras la máquina realizaba ciclos de inicio. La captura y la unión de analitos se realizaron en tampón de análisis HBS-EP+ (10 mm HEPES, pH 7,6, 150 mm NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Tensioactivo P-20; Teknova).

La unión de ST2 al mismo epitopo de IL-33 como anticuerpo de la invención se asoció con una pérdida de respuesta de unión, ya que la preincubación de ST2 con IL-33 impediría el acceso del anticuerpo al epitopo. La unión de ST2 a un epitopo diferente de IL-33 permite a IL-33 unir el anticuerpo de la invención capturado, lo que se observó como un aumento en la respuesta de unión ya que la respuesta de unión es directamente proporcional a la masa del analito/complejo. Los resultados de estos experimentos se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1

Los resultados de este ejemplo demuestran que ciertos agentes de unión a IL-33 de la invención se unen a un epitopo de IL-33 similar o idéntico al epitopo ligado por el receptor ST2.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra que un agente de unión a IL-33 de la invención inhibe la expansión humana impulsada por IL-33 de eosinófilos periféricos.

IL-33 induce una mayor expresión y liberación de IL-5 de poblaciones de células CD4+TH2, células linfoides innatas tipo 2 (células ILC2) y basófilos. La IL-5 es una citoquina que juega un papel clave en la diferenciación, expansión y supervivencia de los eosinófilos, una población de células conocidas por mediar ciertos aspectos de las indicaciones de enfermedades atópicas, tal como el asma y la rinitis. En un estudio preliminar, la IL-33 humana se inyectó intraperitonealmente en ratones Balb/c de tipo silvestre durante seis días consecutivos a una dosis de 5 pg por animal.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo que comprende (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de SEQ ID NÚM.: 136; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de SEQ ID NÚM.: 171.

2. El anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo.

3. El anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que es un fragmento de anticuerpo seleccionado de F(ab')² , Fab', Fab, FV, scFv, dsFv, y un polipéptido de unión de cadena única.

4. El anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo de IgG1.

5. El anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la IL-33 humana con un Kd menor o igual que 1 nanomolar (Nm), medido por la competencia de fase de solución.

6. Un ácido nucleico aislado o purificado que codifica el anticuerpo de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el ácido nucleico está opcionalmente en un vector.

7. Una composición que comprende: (a) el anticuerpo aislado de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición de la reivindicación 7 para uso como fármaco para tratamiento de un trastorno.

9. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el trastorno es un trastorno inflamatorio, enfermedad autoinmune, o cáncer.

10. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el trastorno es asma alérgica, alergia a los alimentos o fibrosis.

11. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el trastorno es alergia al maní.

12. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el trastorno es dermatitis atópica.

13. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el trastorno es enfermedad de Crohn o artritis reumatoide.

14. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el cáncer es cáncer epitelial, leucemia mielógena crónica (LMC), cáncer de mama, o cáncer gastrointestinal.

15. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-14, en la que la semivida del anticuerpo de unión a IL-33 o fragmento de anticuerpo en el mamífero está entre 30 minutos y 45 días.

16. Una célula aislada que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo de unión a iL-33 o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.