BRPI0614893A2 - anticorpo isolado capaz de ligar gdf-8, polinucleotìdeo isolado, célula hospedeira, vetor, método para produzir um anticorpo, in vitro para diagnosticar ou detectar se um paciente está sofrendo de um distúrbio associado com gdf-8 para monitorar a severidade de um distúrbio associado com gdf-8 e para prognosticar a possibilidade de que um paciente irá desenvolver um distúrbio associado com gdf-8, anticorpo isolado e purificado, composição farmacêutica para tratar, melhorar e/ ou prevenir um distúrbio associado com gdf-8, e, usos de uma quantidade eficaz do anticorpo e do polinucleotìdeo - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ISOLADO CAPAZ DE LIGAR GDF-8, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO, CéLULA HOSPEDEIRA, VETOR, MéTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, IN VITRO PARA DIAGNOSTICAR OU DETECTAR SE UM PACIENTE ESTA SOFRENDO DE UM DISTúRBIO ASSOCIADO COM GDF-8, PARA MONITORAR A SEVERIDADE DE UM DISTúRBIO ASSOCIADO COM GDF-8 E PARA PROGNOSTICAR A POSSIBILIDADE DE QUE UM PACIENTE IRA DESENVOLVER UM DISTúRBIO ASSOCIADO COM GDF-8, ANTICORPO ISOLADO E PURIFICADO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA PARA TRATAR, MELHORAR E/OU PREVENIR UM DISTúRBIO ASSOCIADO COM GDF-8, E, USOS DE UMA QUANTIDADE EFICAZ DO ANTICORPO E DO POLINUCLEOTìDEO. A descrição provê novas moléculas relacionadas com o fator 8 de crescimento e diferenciaçáo(GDF-8), particularmente anticorpos de camundongo e humanizados, e fragmentos de anticorpo, incluindo os que inibem a atividade de GDF-8 e a sinalização in vitro e/ou in vivo A descrição também provê métodos para diagnosticar, tratar, melhorar, prevenir, prognosticar, ou monitorar ordens degenerativas de músculo, osso, e metabolismo de insulina, etc, particularmente esclerose lateral amiotrófica (ALS). Além disso, a descrição provê composições farmacêuticas para o tratamento destes distúrbios usando anticorpos, polipeptídeos, polinucleotídeos, e vetores da invenção.

Description

"POLIPEPTÍDEO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, VETOR,MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, ANTICORPO ISOLADOE PURIFICADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOSPARA TRATAR, MELHORAR E/OU PREVENIR UM DISTÚRBIOASSOCIADO COM GDF-8, PARA DIAGNOSTICAR OU DETECTAR SEUM PACIENTE ESTÁ SOFRENDO DE UM DISTÚRBIO ASSOCIADOCOM GDF-8, PARA MONITORAR A SEVERIDADE DE UM DISTÚRBIOASSOCIADO COM GDF-8, E PARA PROGNOSTICAR APOSSIBILIDADE DE QUE UM PACIENTE IRÁ DESENVOLVER UMDISTÚRBIO ASSOCIADO COM GDF-8"

Este pedido reivindica o beneficio de prioridade do pedido depatente provisório U.S. 60/709.704, depositado em 19 de agosto de 2005,cujos conteúdos são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO À PESQUISA FINANCIADA PELOGOVERNO FEDERAL

Esta invenção foi feita com o suporte do Governo dos EstadosUnidos sob as bolsas do National Institutes of Health (R01 GM-48661 e R01GM-56707).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da invenção

O campo técnico da invenção refere-se aos antagonistas defator-8 de crescimento e diferenciação (GDF-8), em particular, anticorposcontra GDF-8, por exemplo, anticorpos de camundongos, humanos ehumanizados e seus fragmentos, particularmente os que inibem a atividade deGDF-8 in vitro e/ou in vivo. O campo ainda refere-se ao tratamento, melhora,prevenção, prognóstico, ou monitoração de distúrbios associados a GDF-8,por exemplo, distúrbios musculares, distúrbios neuromusculares, distúrbiosdegenerativos ósseos, distúrbios metabólicos ou induzidos ósseos, distúrbiode adiposes, distúrbios de metabolismo de glicoses ou distúrbios relacionadoscom insulina, particularmente esclerose lateral amiotrófíca ("ALS").Técnica antecedente relacionada

Fator 8 de crescimento e diferenciação (GDF-8), tambémconhecido como miostatina, é uma proteína secretada e membro dasuperfamília de fator beta de crescimento de transformação (TGF-[3) defatores de crescimento estruturalmente relacionados. Membros destasuperfamíla possuem propriedades morfogenéticas e reguladoras docrescimento (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8: 133 - 46; Hoodless et al.(1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235 - 72). GDF-8 humano ésintetizado como uma proteína precursora de 375 aminoácidos que forma umcomplexo homodímero. Durante o processamento, o propeptídeo aminoterminal, conhecido como o "peptídeo associado com latência" (LAP), éclivado e pode permanecer não covalentemente ligado ao homodímero,formando um complexo inativo designado o "complexo latente pequeno"(Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 6407 - 15; Wakefield et al. (1988)J. Biol. Chem. 263: 7646 - 54; Brown et al. (1999) Growth Factors 3: 35 - 43;Thies et al. (2001) Growth Factors 18: 251 - 59; Gentry et al. (1990)Biochemistry 29: 6851 - 57; Derynck et al. (1995) Nature 316: 701 - 05;Massague (1990) Ann Rev. Cell Biol. 12: 597 - 641). Proteínas comofolistatina e seus parentes também ligam homodímeros de GDF-8 maduro einibem a atividade biológica de GDF-8 (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222 - 32).

Um alinhamento da seqüência de aminoácidos de GDF-8deduzida de várias espécies demonstra que GDF-8 é altamente conservado(McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A. 94 : 12457 - 61). Asseqüências de GDF-8 de humanos, camundongos, ratos, suínos, e galinhas sãode 100% idênticas na região C-terminal, enquanto GDF-8 de babuínos,bovinos, e ovinos diferem por apenas 3 aminoácidos no C-término. O grauelevado de conservação de GDF-8 entre as espécies sugere que GDF-8 temuma função fisiológica essencial.

GDF-8 foi demonstrado como desempenhando um papelprincipal na regulação do desenvolvimento muscular e homeostase porinibição tanto da proliferação como da diferenciação de mioblastos e célulassatélite (Lee e McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 604 - 07;McCroskery et al. (2003) J. Cell. Biol. 162: 1135 - 47). Ele é expressado antesno desenvolvimento do músculo esqueletal, e continua a ser expressado nomúsculo esqueletal adulto, preferivelmente em tipos de contração muscularrápida. Adicionalmente, GDF-8 superexpressado em camundongos adultosresulta em perda muscular significante (Zimmers et al. (2002) Science 296:1486 - 88). Também, mutações naturais que tornam o gene GDF-8 inativoforam mostradas como causando tanto hipertrofia como hiperplasia em ambosos animais e humanos (Lee e McPherron (1997) supra). Por exemplo,camundongos transgênicos nocautes para GDF-8 são caracterizados por umahipertrofia e hiperplasia marcada do músculo esqueletal e estrutura ósseacortical alterada (McPherron et al. (1997) Nature 387: 83 - 90; Hamrick et al.(2000) Bone 27: 343 - 49). Aumentos similares em massa muscular esqueletalsão evidentes em mutações de GDF-8 naturais em gado (Ashmore et al.(1974) Growth 38: 501 - 07; Swatland et al. (1994) J. Anim. Sei. 38: 752 - 57;McPherron et al., supra; Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7: 910 - 15).Além disso, vários estudos indicam que expressão de GDF-8 aumentada estáassociada com enfraquecimento muscular induzido por FQV (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 14938 - 43). GDF-8também tem sido implicado na produção de enzimas específicas de músculo(por exemplo, creatina quinase) e proliferação de mioblastos (WO 00/43781).

Além de suas propriedades morfogenéticas e reguladoras docrescimento, acredita-se que GDF-8 participa em numerosos outros processosfisiológicos, incluindo homeostase de glicose durante desenvolvimento dediabetes tipo 2, tolerância prejudicada a glicose, síndromes metabólicas (istoé, uma síndrome como, por exemplo, síndrome de X, envolvendo a ocorrênciasimultânea de um grupo de condições de saúde, que pode incluir resistência ainsulina, obesidade abdominal, dislipidemia, hipertensão, inflamação crônica,um estado protrombótico, etc, que coloca a pessoa em alto risco para diabetestipo 2 e/ou doença do coração), resistência a insulina (por exemplo,resistência induzida por trauma como queimaduras ou falta de equilíbrio deníveis de nitrogênio), e distúrbios de tecido adipose (por exemplo, obesidade,dislipidemia, doença do fígado não alcoólico graxo, etc.) (Kim et al. (2000)Biochem. Biophys. Res. Comm. 281: 902 - 06).

Vários distúrbios de humanos e animais estão associados comtecido muscular funcionalmente prejudicado, por exemplo, esclerose lateralamiotrófica ("ALS"), distrofía muscular ("MD"; incluindo distrofía muscularde Duchenne), atrofia muscular, atrofia dos órgãos, debilidade, doençapulmonar obstrutiva congestiva (COPD), sarcopenia, caquexia, e síndromes de enfraquecimento muscular causadas por outras doenças e condições.Atualmente, poucas terapias eficazes ou confiáveis existem para tratar estesdistúrbios. A patologia destas doenças indica um papel em potencial parasinalização de GDF-8 como um alvo no tratamento destas doenças.

ALS é uma doença neurodegenerativa de início tardio e fatalcaracterizada por degeneração do sistema nervoso central e atrofia muscular.ALS tipicamente inicia com anormalidades no modo de andar e perda dedestreza, e então progride para paralisia dos membros e diafragma. Apesar domaior número de casos de ALS ser esporádico e de etiologia desconhecida,foi demonstrado que 5-10% dos casos resulta de herança familiar dominante(FALS). Aproximadamente 10-20%) de casos de FALS são atribuídos paramutações no gene Cu/Zn superóxido dismutase (SOD1) (estudado em Bruijnet al. (2004) Ann. Rev. Neurosci. 27: 723 - 49). SOD1 é uma metalo-proteínaheterodimérica que catalisa a reação de superóxido no peróxido de hidrogênioe oxigênio diatômico, e como perda de SOD1 não tem resultado em doençaneuronal motora (Reaume et al. (1996) Nat. Genet. 13: 43 - 47), acredita-seque induz doença por ganho tóxico de função (estudado em Bruijn et al.,supra). Os mecanismos específicos de morte celular neuronal induzida porSOD1 não são claros e podem envolver alterações em transporte axonal,respostas celulares a proteína incorretamente enovelada, disfunçãomitocondrial e excitotoxicidade (Bruijn et al., supra).

A degeneração de neurônios motores observada em ALS podeocorrer via mecanismo múltiplos, incluindo absorção ou rompimento dotransporte de fatores tróficos por neurônios motores (estudado em Holzbaur(2004) Trends Cell Biol. 14: 233 - 40). Assim, ALS pode ser tratado porterapias e rejuvenescer um neurônio degenerativo ao prover um meio desobrevivência ótimo. Um meio de nervo inclui células não neuronais comoglia e as células de músculo inervadas pelo neurônio motor. Este meio provetransportados via transporte axonal retrógrado para o corpo celular (Chão(2003) Neuron 39: 1-2; Holzbaur, supra).

FALS foi modelado em tanto camundongos como ratos pelasuperexpressão de SOD1 mutante (Howland et al. (2002) Proc Natl. Acad.Sei. U.S.A. 99: 1604 - 09). Os camundongos transgênicos superexpressando aforma G93A de SOD1 mutante demonstram fraqueza e atrofia muscular em90 a 100 dias de idade, e tipicamente morrem com quase 130 dias de idade(Gurney et al. (1994) Science 264: 1772 - 75). No entanto, a patologiainduzida por SODG93A subjacente, que inclui fraqueza da força deagarramento e perda de junções neuromusculares, é significante tão inicialcomo em 50 dias de idade (Frey et al. (2000) J. Neurosci. 20: 2534 - 42;Fisher et al. (2004) Exp. Neuro. 185: 232 - 40; Ligon et al. (2005)NeuroReport 16: 533 - 36; Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32: 43 - 50).Os ratos transgênicos expressando a mutação SODG93A seguem um curso notempo similar de degeneração (Howland et al., supra). Trabalho recente temsugerido que o desenvolvimento de patologia não é autônomo da célula,consistente com a hipótese de que a degeneração dos neurônios motores observadaem ALS ocorre via mecanismos múltiplos, incluindo a ruptura de absorção etransporte de fatores tróficos pelos neurônios motores (ver acima). Clement ecolaboradores usaram camundongos quiméricos para mostrar que as célulasnão neuronais de tipo selvagem podem prolongar a sobrevivência deneurônios motores expressando SOD1 mutante (Clement et al. (2003) Science302: 113 - 17). Estas observações levaram à investigação de terapias quepodem retardar a degeneração neuronal ao prover um micro-ambiente ótimopara sobrevivência. Por exemplo, tratamento do camundongo SODG93A viainjeção intramuscular direta de fatores de crescimento viralmente expressados(incluindo IGF-1, GDNF e VEGF) prolonga a sobrevivência do animal(Kaspar et al. (2003) Science 301: 839 - 42; Azzouz et al. (2004) Nature 429:413 - 17; Wang et al. (2002) J. Neurosci. 22: 6920 - 28). Além disso, aexpressão específica dos músculos de uma isoforma específica para IGF-1local (mIGF-1) estabiliza as junções neuromusculares, melhora asobrevivência dos neurônios motores e retarda o início e progressão dedoença em modelo de camundongo transgênico SODG93A, indicando que osefeitos diretos sobre o músculo podem impactar o início da doença eprogressão em animais SOD1 transgênicos (Dobrowolny et al. (2005) J. CellBiol. 168: 193 - 99). As ligações entre hipermetabolismo muscular evulnerabilidade dos neurônios motores também foram relatadas emcamundongos tipo ALS, suportando a hipótese de que defeitos em músculospodem contribuir para a etiologia da doença (Dupois et al. (2004) Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 101: 11159 - 64). Assim, a melhora do crescimentomuscular pode prover um melhorado suporte local para neurônios motores e,assim, resultar em benefícios terapêuticos.

A inibição de expressão de miostatina leva a tanto hipertrofiacomo hiperplasia muscular (Lee e McPherron, supra; McPherron et al.,supra). A miostatina regula negativamente a regeneração muscular após dano,e a falta de miostatina em camundongos nulos para GDF-8 resulta emregeneração muscular acelerada (McCroskery et al., (2005) J. Cell. Sei. 118:3531 - 41). Os anticorpos neutralizantes de miostatina aumentam o pesocorporal, massa muscular esqueletal, e tamanho e força muscular no músculoesqueletal dos camundongos tipo selvagem. (Whittemore et al. (2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 965 - 71) e o camundongo mdx, ummodelo para distrofia muscular (Bogdanovich et al. (2002) Nature 420: 418 -21; Wagner et al. (2002) Ann. Neurol. 52: 832 - 36). Além disso, anticorpo demiostatina nestes camundongos diminui o dano ao diafragma, um músculoque é também marcado durante a patogenese de ALS. Formulou-se a hipótesede que a ação de fatores de crescimento, como HGF, no músculo pode serdevido a inibição de expressão de miostatina (McCroskery et al. (2005),supra), assim ajudando a deslocar o "empurrar e puxar" ou equilíbrio, entreregeneração e degeneração em uma direção positiva. Assim, a inibição de GDF-8se apresenta como um alvo farmacológico em potencial para o tratamento deALS, distrofia muscular (MD), e outros distúrbios associados com GDF-8,por exemplo, distúrbios neuromusculares para os quais é desejável aumentar amassa muscular, força, tamanho, etc. Com a disponibilidade de modelosanimais (camundongo e rato) de ALS, é possível testar as terapêuticas emduas espécies diferentes, assim aumentando a confiança de efeitosterapêuticos em humanos in vivo.

Além dos distúrbios neuromusculares em humanos, também senotam as condições relacionadas com fator de crescimento associadas comuma perda óssea, como osteoporose e osteoartrite, que afetampredominantemente os idosos e/ou mulheres pós-menopausa. Além disso,doenças ósseas metabólicas e distúrbios incluem massa óssea baixa devido aterapia crônica com glucocorticóides, falha gonadal prematura, supressão deandrogênios, deficiência de vitamina D, hiperparatiroidismo secundário,deficiências nutricionais, e anorexia nervosa. Apesar de muitas terapiascorrentes para estas condições funcionarem por inibição da ressorção óssea,uma terapia que promove a formação óssea deve ser um tratamentoalternativo utilizável. Porque GDF-8 desempenha um papel nodesenvolvimento ósseo assim como desenvolvimento muscular, regulação deGDF-8 também é um alvo farmacológico excelente para o tratamento dedistúrbios degenerativos ósseos.

Assim, existe uma necessidade para desenvolver compostos emétodos de tratamento que contribuem para um aumento global em massae/ou força muscular e/ou densidade óssea, etc, particularmente em humanos,e particularmente nos sofrendo de ALS e outras doenças de enfraquecimentomuscular assim como distúrbios degenerativos ósseos. A geração deanticorpos neutralizantes e outras moléculas pequenas com melhoradaafinidade para GDF-8 é uma abordagem farmacológica excelente para tratarestes distúrbios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOOs antagonistas de GDF-8 da invenção referem-se aosanticorpos (por exemplo, anticorpos intactos e fragmentos de ligação deantígeno dos mesmos), que são referidos aqui como "anticorpos anti-GDF-8"ou "anticorpos de GDF-8". Em uma forma de realização, um anticorpo anti-GDF-8 reduz, neutraliza, e/ou antagoniza pelo menos uma atividade associadacom GDF-8 (isto é, "atividade de GDF-8"). A presente invenção assim provemétodos para tratar vários distúrbios dos ossos, músculos, glicose e adiposesassociados com atividade de GDF-8 usando estes anticorpos anti-GDF-8. Apresente invenção descreve que antagonistas de GDF-8, por exemplo,anticorpos de GDF-8, são terapêuticos altamente efetivos quando usados paratrata animais sofrendo de ALS, e que a administração de tais anticorpos reduzo enfraquecimento de músculos marcados durante a patologia de ALS, porexemplo, diafragma, gastrocnêmio, etc. Além disso, a presente invençãodescreve que estes antagonistas são altamente efetivos para aumentar a massamuscular e força de agarramento em animais afetados com ALS. Como umresultado, a invenção ensina que anticorpos anti-GDF-8 são composiçõeseficazes para tratar distúrbios associados a GDF-8, por exemplo, ALS,distúrbios de enfraquecimento muscular ou outros distúrbios que resultam dedes-regulação de GDF-8.

Em um aspecto, invenção descreve um método de tratar (porexemplo, curar, suprimir), melhorar, ou prevenir (por exemplo, retardar ouevitar o início, recorrência ou relapso de) um distúrbio associado com GDF-8em um indivíduo. O método inclui: administrar ao indivíduo um antagonistade GDF-8, por exemplo, um anticorpo anti-GDF-8, em uma quantidadesuficiente para tratar ou evitar o distúrbio associado com GDF-8. Oantagonista de GDF-8, por exemplo, o anticorpo anti-GDF-8, pode seradministrado ao indivíduo sozinho ou em combinação com outrasmodalidades terapêuticas como descrito aqui. O anticorpo de GDF-8 pode seradministrado terapeuticamente, profilaticamente, ou ambos. Em uma formade realização, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano sofrendode um distúrbio associado com GDF-8, incluindo, por exemplo, distúrbiosósseos e musculares. Preferivelmente, o indivíduo é um humano. Mais preferivelmente, o indivíduo é um humano sofrendo de um distúrbioassociado com GDF-8 como descrito aqui.

Em uma forma de realização, a presente invenção provemétodos terapêuticos efetivos e seguros para diagnosticar, prognosticar,monitorar, triar, tratar, melhorar e/ou prevenir distúrbios associado com GDF-8, por exemplo, distúrbios musculares, distúrbios neuromusculares, distúrbiosdegenerativos de ossos, distúrbios ósseos metabólicos ou induzidos,distúrbios de adipose, distúrbios de metabolismo de glicose, ou distúrbiosrelacionados com insulinas que incluem, mas não são limitados a, homeostasede glicose, diabetes tipo 2, tolerância prejudicada a glicose, síndromemetabólica (isto é, uma síndrome envolvendo a ocorrência simultânea de umgrupo de condições de saúde, que podem incluir resistência a insulina,obesidade abdominal, dislipidemia, hipertensão, inflamação crônica, umestado protrombótico, etc, que coloca uma pessoa em risco elevado paradiabetes tipo 2 e/ou doença cardíaca), resistência a insulina (por exemplo,resistência induzida por trauma como queimaduras ou desequilíbrio denitrogênio), distúrbios de tecido adiposo (por exemplo, obesidade,dislipidemia, doença do fígado não alcoólico graxo, etc), enfraquecimentomuscular induzido por HIV, distrofia muscular (incluindo distrofia muscularde Duchenne), esclerose lateral amiotrófica ("ALS"), atrofia muscular, atrofiados órgãos, debilidade, doença pulmonar obstrutiva congestiva, sarcopenia,caquexia, síndromes de enfraquecimento muscular, osteoporose, osteoartrite,doenças do osso metabólico, e distúrbios ósseos metabólicos (incluindo massaóssea baixa devido a terapia com glucocorticóides crônica, falha gonadalprematura, supressão de androgênios, deficiência de vitamina D,hiperparatiroidismo secundário, deficiências nutricionais, e anorexia nervosa).Em uma forma de realização preferida, mas não limitativa, a invenção provemétodos terapêuticos seguros e efetivos para diagnosticar, prognosticar,monitorar, triar, tratar, melhorar e/ou prevenir um distúrbio associado comGDF-8, por exemplo, um distúrbio muscular em vertebrados, particularmentemamíferos, e mais particularmente humanos. Em uma forma de realização amais preferida da invenção, o distúrbio associado com GDF-8, por exemplo,distúrbio muscular, diagnosticado, prognosticado, monitorado, triado, tratado,melhorado e/ou evitado é ALS.

Em outra forma de realização, esta invenção prove métodos deinibir a função de GDF-8 in vivo ou in vitro. Estes métodos são utilizáveispara tratar distúrbios associados a GDF-8, por exemplo, distúrbiosdegenerativos musculares e ósseos, particularmente distúrbios muscularescomo ALS, e para aumentar a massa muscular e/ou força e/ou densidadeóssea. Os métodos também são utilizáveis para aumentar a massa muscular ea densidade óssea em animais normais incluindo, mas não limitados aoshumanos. Os presentes métodos também podem ser usados in vitro (porexemplo, em um sistema isento de células, em cultura, etc), ex vivo, ou invivo. Por exemplo, células expressando receptor de -8 podem ser cultivadas invitro em meio de cultura e contatadas com, por exemplo, um ou maisanticorpos anti-GDF-8, por exemplo, como descrito aqui. Alternativamente, ométodo pode ser realizado em células presentes em um indivíduo, porexemplo, como parte de um protocolo in vivo (por exemplo, terapêutico ouprofilático).

Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção refere-se a umantagonista de GDF-8, por exemplo, um anticorpo isolado, que interage com,por exemplo, ligada a , e neutraliza e/ou inibe GDF-8. Em particular, aproteína de GDF-8 ligada pelo anticorpo de GDF-8 é GDF-8 de mamífero,por exemplo, humano, ovelha, primata não humano. Em outra forma derealização, a invenção prove anticorpos que ligam GDF-8 com afinidadeelevada, por exemplo, com um Kd de pelo menos 10"7M, preferivelmente IO"8,IO"9, IO"10, mais preferivelmente, IO"11 M ou maior. A afinidade e cinéticas deligação do anticorpo anti-GDF-8 podem ser testadas usando vários métodosbem conhecidos, por exemplo, tecnologia de biossensor (Biacore, Piscataway,NJ).

Em uma forma de realização, o anticorpo anti-GDF-8 (porexemplo, um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo (por exemplo,um Fab, F(ab')2, Fv ou um fragmento FV de cadeia única)) é um anticorpomonoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo humano, humanizado,quimérico, ou um gerado in vitro. Em uma forma de realização preferida, masnão limitativa, um anticorpo anti- GDF-8 da invenção é um anticorpohumanizado.

Estes anticorpos anti-GDF-8 podem ser usados paradiagnosticar, prognosticar, monitorar, triar, tratar, melhorar, e/ou evitardistúrbios relacionados ao metabolismo de glicose, musculares, ósseos,adiposos. Um exemplo não limitativo de um anticorpo anti-GDF-8 é referidoaqui como "RK35," e inclui tantos os anticorpos de camundongos como modificados, por exemplo, formas quiméricas ou humanizadas. As seqüênciasde nucleotídeos e de aminoácidos para a região variável de cadeia pesada deRK35 de camundongo são especificados aqui como SEQ ID NO: 2 e SEQ IDNO: 3, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos paraa região variável de cadeia pesada de RK35 humanizado são especificadasaqui como SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente. As seqüênciasde nucleotídeos e de aminoácidos para a região variável de cadeia leve decamundongo RK35 são especificados aqui como SEQ ID NO: 4 e SEQ IDNO: 5, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos paraa região variável de cadeia leve de RK35 humanizado são especificadas aquicomo SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, respectivamente.

Em uma forma de realização preferida, mas não limitativa dainvenção, o anticorpo é um anticorpo de camundongo humanizado para GDF-8. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, o anticorpo écomposto do domínio VH (pesado variável) especificado em SEQ ID NO: 3 eo domínio VL (leve variável) especificado em SEQ ID NO: 5. Em outraforma de realização preferida da invenção, o anticorpo é composto dodomínio VH especificado em SEQ ID NO: 7 e o domínio VL especificado emSEQ ID NO: 9. As formas de realização adicionais da invenção compreendemum ou mais domínios VH ou VL listados na tabela 1.

Outras formas de realização da invenção compreendem umfragmento H3 de RK35, isto é, a seqüência especificada como SEQ ID NO:12. Em ainda outra forma de realização, um antagonista de GDF-8compreende uma, duas, ou três regiões determinantes da complementaridade(CDRs) de uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo descritoaqui com as seqüências selecionadas dentre SEQ ID NOs: 10-12 e 20-22. Emainda outra forma de realização, um antagonista da invenção compreendeuma, duas, ou três CDRs de uma região variável de cadeia leve de umanticorpo descrito aqui com as seqüências selecionadas dentre SEQ ID NOs:13-15 e 23-25. Em ainda outra forma de realização, o anticorpo compreendeum, duas, três, quatro, cinco, ou seis CDRs com as seqüências selecionadasdentre SEQ ID NOs: 10-15 e 20-25.

As cadeias leves e pesadas de um anticorpo anti-GDF-8 dainvenção podem ser de comprimento completo (por exemplo, um anticorpopode incluir pelo menos uma, e preferivelmente duas, cadeias pesadascompletas, e pelo menos uma, e preferivelmente duas, cadeias levescompletas) ou podem incluir um fragmento de ligação de antígeno (porexemplo, um fragmento Fab, F(ab')2, Fv ou um Fv de cadeia única ("scFv")).Em outras formas de realização, a região constante de cadeia pesada doanticorpo é escolhida dentre, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM,IgAl, IgA2, IgD, e IgE, particularmente escolhida dentre, por exemplo, IgGl,IgG25 IgG3, e IgG4, mais particularmente, IgGl (por exemplo, IgGlhumana). Em outra forma de realização, a região constante de cadeia leve doanticorpo é escolhida dentre, por exemplo, kappa ou lambda, particularmentekappa (por exemplo, kappa humana). Em uma forma de realização, a regiãoconstante é alterada, por exemplo, mudada, para modificar as propriedades doanticorpo (por exemplo, para aumentar ou diminuir um ou mais dentre:ligação de receptor Fc, glicosilação de anticorpo, o número de resíduos decisteína, função de célula efetuadora, ou função complementar). Por exemplo,a região constante de IgGl humana pode ser mudada em um ou mais resíduos,por exemplo, um ou mais de resíduos 117 e 120 de SEQ ID NO: 19. Em umaforma de realização, o anticorpo anti-GDF-8 compreende a região constantede IgGl humana mostrada na SEQ ID NO: 19. Em outra forma de realização,o anticorpo anti-GDF-8 compreende uma seqüência kappa humana, porexemplo, a seqüência mostrada como SEQ ID NO: 17.

Em outra forma de realização, a invenção prove anticorpos deGDF-8 como fragmentos de anticorpos novos que ligam GDF-8 e retém acapacidade para neutralizar ou reduzir a atividade de GDF-8. Em uma formade realização preferida, mas não limitativa, da invenção, o fragmento deanticorpo é selecionado dentre o grupo consistindo de um fragmento de dAb,um diacorpo, um fragmento de Fd, um fragmento de Fab, um fragmento deF(ab')2, um fragmento de scFV, e um fragmento Fv. Em uma forma derealização mais preferida da invenção, o fragmento de anticorpo é codificadopor um polinucleotídeo selecionado dentre SEQ ID NOs: 2, 4, 6 ou 8. Emoutra forma de realização preferida da invenção, o fragmento de anticorpocompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre uma seqüênciade aminoácidos especificada em SEQ ID NOs: 10-15 e 20-25. Em outraforma de realização preferida, a invenção prove fragmentos de anticorponovos que diferem na seqüência (por exemplo, devido a redundância docódigo genético) destas seqüências listadas na tabela 1, ainda retêm acapacidade de ligar GDF-8 e neutralizar ou reduzir a atividade de GDF-8.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-GDF-8compreende pelo menos uma, duas, três ou quatro regiões de ligação deantígeno, por exemplo, regiões variáveis, tendo uma seqüência deaminoácidos como listada na tabela 1 (SEQ ID NOs: 3 ou 7 para VH, e/ouSEQ ID NOs: 5 ou 9 para VL), ou uma seqüência substancialmente idêntica àmesma (por exemplo, uma seqüência pelo menos de cerca de 85%, 90%,95%, 99% ou mais idêntica à mesma, ou que difere por não mais que 1, 2, 5, 10 ou 15 resíduos de aminoácido de SEQ ID NOs: 3, 5, 7 ou 9). Em outraforma de realização, o anticorpo inclui um domínio VH e/ou VL codificadopor um ácido nucleico tendo uma seqüência de nucleotídeos como listada natabela 1 (SEQ ID NOs: 2 ou 6 para VH, e/ou SEQ ID NOs: 4 ou 8 para VL),ou uma seqüência substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, umaseqüência pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica àmesma, ou que difere por não mais que 3, 6, 15, 30 ou 45 nucleotídeos deSEQ ID NOs: 2, 4, 6, ou 8). Em ainda outra forma de realização, o anticorpocompreende uma, duas, ou três CDRs dentre uma região variável de cadeiapesada tendo seqüências de aminoácidos como listadas na tabela 1 (SEQ IDNOs: 10-12 e 20-22), ou uma seqüência substancialmente homóloga à mesma(por exemplo, uma seqüência pelo menos a cerca de 85%, 90%, 95%, 99% oumais idêntica à mesma, e/ou tendo uma ou mais substituições, por exemplo,substituições conservadas). Em ainda outra forma de realização, o anticorpocompreende pelo menos uma, duas, ou três CDRs de uma região variável decadeia leve tendo seqüências de aminoácidos como listadas na tabela 1 (SEQID NOs: 13-15 e 23-25), ou uma seqüência substancialmente homóloga àmesma (por exemplo, uma seqüência pelo menos a cerca de 85%, 90%, 95%,99% ou mais idêntica à mesma, e/ou tendo uma ou mais substituições, porexemplo, substituições conservadas). Em ainda outra forma de realização, oanticorpo compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de regiõesvariáveis de cadeia leve e pesada tendo seqüências de aminoácidos comolistadas na tabela 1 (SEQ ID NOs: 10-12 e 20-22 para VH CDRs; e SEQ IDNOs: 13-15 e 23-25 para VL CDRs), ou uma seqüência substancialmentehomóloga à mesma (por exemplo, uma seqüência pelo menos a cerca de 85%,90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma, e/ou tendo uma ou maissubstituições, por exemplo, substituições conservadas).

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-GDF-8compreende uma região constante de IgGl humana tendo uma seqüência deaminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 19 ou uma seqüênciasubstancialmente homóloga à mesma (por exemplo, uma seqüência pelomenos de cerca de 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma, ou quedifere em não mais do que 1, 2, 5, 10, 50, ou 100 resíduos de aminoácidos deSEQ ID NO: 19). Em outra forma de realização, o anticorpo anti-GDF-8compreende uma cadeia constante kappa humana, por exemplo, uma cadeiaconstante kappa humana tendo uma seqüência de aminoácidos comoespecificada em SEQ ID NO: 17 ou uma seqüência substancialmentehomóloga à mesma (por exemplo, uma seqüência pelo menos cerca de 85%,90%, 95%, 99% ou mais idêntica à mesma, ou que difere em não mais do que1, 2, 5, 10, 20, ou 50 resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 17). Em aindaoutra forma de realização, o anticorpo compreende uma região constanteIgGl humana e uma cadeia constante kappa humana como descrito aqui.

Em uma forma de realização preferida, mas não limitativa, ainvenção prove anticorpos codificados por polinucleotídeos especificados emSEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8. Em outra forma de realização preferida, a invençãoprove anticorpos codificados por seqüências de polinucleotídeo quehibridizam sob condições estringentes nos polinucleotídeos especificados emSEQ ID NOs: 2, 4, 6, ou 8. Em outra forma de realização preferida, ainvenção prove anticorpos codificados por polinucleotídeos, que diferem dosdas seqüências especificadas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, ou 8, mas devido àdegeneração do código genético, codificam uma seqüência de aminoácidosespecificada em SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, ou 10-15.

O antagonista de GDF-8, por exemplo, um anticorpo anti-GDF-8, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, porexemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento de Fab).Por exemplo, uma proteína de fusão ou um anticorpo, ou porção de ligação aoantígeno, pode ser ligada funcionalmente (por exemplo, por copulaçãoquímica, fusão genética, associação não covalente ou semelhante) em uma oumais de outras entidades moleculares, como um anticorpo (por exemplo, umanticorpo bi-específico ou um multi-específico), toxinas, radioisótopos,agentes citotóxicos ou citostático, dentre outros.

Um outro aspecto da invenção prove como antagonistas deGDF-8 ácidos nucleicos purificados e isolados que codificam os antagonistasde GDF-8, por exemplo, os anticorpos anti-GDF-8, da invenção. Em umaforma de realização, a invenção prove polinucleotídeos compostos por umaseqüência codificando VH (SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7), VL (SEQ IDNO: 5 ou SEQ ID NO: 9), e/ou CDR (SEQ ID NOs: 10-15 e 20-25) comolistados na tabela 1. Em outra forma de realização, a invenção provepolinucleotídeos que hibridizam sob condições estringentes em ácidosnucleicos codificando VH, VL, ou CDR (SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 10-15, ou20-25) como listados na tabela 1. Em outra forma de realização, a invençãoprove ácidos nucleicos que compreendem SEQ ID NOs: 2, 4, 6, ou 8 oufragmentos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, ou 8. Em ainda uma outra forma derealização, a invenção prove polinucleotídeos que hibridizam sob condiçõesestringentes para SEQ ID NOs: 2, 4, 6 ou 8. Outro aspecto da invenção provecélulas hospedeiras e vetores compreendendo os polinucleotídeos da invençãocomo antagonistas de GDF-8.

Os anticorpos da invenção possuem várias propriedadesutilizáveis. Primeiro, os anticorpos são capazes de ligar GDF-8 maduro comafinidade elevada. Segundo, os anticorpos descritos inibem a atividade deGDF-8 in vitro e in vivo. Terceiro, os anticorpos descritos inibem a atividadede GDF-8 associada com regulação negativa de massa muscular esqueletal edensidade óssea. Quarto, os anticorpos descritos são um tratamento efetivopara distúrbios musculares, particularmente ALS. Estes anticorpos têm muitosusos adicionais, incluindo diagnosticar, prognosticar, monitorar, triar, tratar,melhorar e/ou prevenir distúrbios associados a GDF-8, por exemplo,distúrbios musculares e/ou ósseos associados.

Outros aspectos da invenção provêem as composiçõescompreendidas por um antagonista de GDF-8 da invenção, por exemplo, umanticorpo anti-GDF-8 da invenção, e o uso de tais composições para inibir ouneutralizar GDF-8 em animais, particularmente em humanos ou outrosanimais com distúrbios musculares como ALS. Os anticorpos da invençãotambém podem ser usados em um distúrbio associado com GDF-8, porexemplo, em um distúrbio em que é desejável aumentar o tecido muscular oudensidade óssea. Por exemplo, os anticorpos anti-GDF-8 também podem serusados em terapias e composições para reparam o músculo danificado, porexemplo, miocárdio, diafragma, etc. Distúrbios associados a GDF-8 e doençastratadas pelos métodos descritos e composições incluem distúrbiosmusculares e neuromusculares como distrofia muscular (incluindo distrofiamuscular de Duchenne); esclerose lateral amiotrófica; atrofia muscular;atrofia dos órgãos; debilidade; síndrome de túnel; doença pulmonar obstrutivacongestiva (COPD); sarcopenia, caquexia, e outras síndromes deenfraquecimento muscular; distúrbios de tecido adiposo (por exemplo,obesidade); diabetes tipo 2; tolerância prejudicada a glicose; síndromesmetabólicas (por exemplo, síndrome de X); resistência a insulina (incluindoresistência induzida por trauma, por exemplo, queimaduras ou falta deequilíbrio dos níveis de nitrogênio), e doenças degenerativas ósseas (porexemplo, osteoartrite e osteoporose). Em uma forma de realização preferida,mas não limitativa, da invenção, uma composição contendo um anticorpoanti-GDF-8 é usada em um método de tratar, reduzir, ou melhorar ALS.

Em outro aspecto, a invenção prove composições, porexemplo, composições farmacêuticas, que incluem um veículofarmaceuticamente aceitável e pelo menos um antagonista de GDF-8, porexemplo, um anticorpo anti-GDF-8 descrito aqui. Em uma forma derealização, as composições, por exemplo, as composições farmacêuticas,compreendem uma combinação de dois ou mais dos antagonistas de GDF-8acima mencionados, por exemplo, os anticorpos anti-GDF-8 ou fragmentosdos mesmos. Também dentro do escopo da invenção estão as combinações doantagonista de GDF-8, por exemplo, um anticorpo anti-GDF-8, com umagente terapêutico, por exemplo, inibidores de fator de crescimento,imunossupressores, agentes antiinflamatórios (por exemplo, agentesantiinflamatórios sistêmicos), inibidores metabólicos, inibidores de enzima,e/ou agentes citotóxicos ou citoestáticos.

Em ainda outra forma de realização, o antagonista de GDF-8,por exemplo, um anticorpo anti-GDF-8, ou uma composição farmacêutica domesmo, é administrado sozinho ou em terapia de combinação, isto é,combinado com outros agentes, por exemplo, agentes terapêuticos, que sãoutilizáveis para tratar os distúrbios associados a GDF-8.

Além de seu uso no tratamento de várias doenças oudistúrbios, os anticorpos anti-GDF-8 podem ser usados como ferramentasdiagnosticas para detectar quantitativamente ou qualitativamente a proteína deGDF-8 ou fragmentos de proteína em uma amostra biológica. A presença ouquantidade de proteína de GDF-8 detectada pode estar correlacionada comuma ou mais das condições médicas listadas aqui. Assim, em uma forma derealização, a invenção prove métodos para diagnosticar, prognosticar,monitorar, e/ou triar os distúrbios associados a GDF-8.

Em outro aspecto, a invenção prove um método para detectar apresença de GDF-8 em uma amostra in vitro (por exemplo, uma amostrabiológica, como soro, plasma, tecido, biopsia). O método em questão pode serusado para diagnosticar um distúrbio associado com GDF-8, por exemplo,distúrbios associados com o metabolismo de glicose, ósseos, musculares,adiposos. O método inclui: (i) contatar a amostra ou uma amostra de controlecom um anticorpo anti-GDF-8 como descrito aqui; e (ii) detectar a formaçãode um complexo entre o anticorpo anti-GDF-8, e a amostra ou a amostra decontrole, em que uma mudança substancialmente significante na formação docomplexo na amostra relativo a amostra de controle é indicativa da presençade GDF-8 na amostra.

Em ainda outro aspecto, a invenção prove um método paradetectar a presença de GDF-8 in vivo em um indivíduo (por exemplo,formação de imagem in vivo em um indivíduo). O método em questão podeser usado para diagnosticar um distúrbio associado com GDF-8, por exemplo,ALS. O método inclui: (i) administrar um anticorpo anti-GDF-8 comodescrito aqui a um indivíduo ou um indivíduo de controle sob condições quepermitem a ligação do anticorpo para GDF-8; e (ii) detectar a formação de umcomplexo entre o anticorpo e GDF-8, em que uma diferença substancialmentesignificante na formação do complexo no indivíduo relativo ao indivíduo decontrole prove uma indicação relacionada com a presença de GDF-8.

Outras formas de realização da invenção provêem um métodode diagnosticar ou detectar se um paciente está sofrendo de um distúrbioassociado com GDF-8 (por exemplo, distúrbio muscular, distúrbioneuromuscular, distúrbio ósseo degenerativo, distúrbio ósseo metabólico ouinduzido, distúrbio de adipose, distúrbio de metabolismo de glicose, oudistúrbio relacionado a insulina) compreendendo as etapas de: (a) obter umaamostra de um paciente de interesse; (b) contatar a amostra com um anticorpoanti-GDF-8 como descrito aqui; (c) determinar o nível de GDF-8 presente naamostra do paciente; e (d) comparar o nível de GDF-8 na amostra do pacientecom o nível de GDF-8 em uma amostra de controle, em que um aumento,diminuição, ou similaridade substancial no nível de GDF-8 na amostra dopaciente comparado ao nível de GDF-8 na amostra de controle indica se opaciente está sofrendo de um distúrbio associado com GDF-8.

Ainda outra forma de realização de um método paradiagnosticar ou detectar se um paciente está sofrendo de um distúrbioassociado com GDF-8 descrito aqui compreende as etapas de: (a) obter umaprimeira amostra tomada do paciente de interesse; (b) contatar a primeiraamostra com um anticorpo anti-GDF-8 como descrito aqui; (c) determinar onível de um GDF-8 em uma primeira amostra; (d) obter uma segunda amostrade um indivíduo não afetado com o distúrbio associado com GDF-8; (e)contatar a segunda amostra com um anticorpo anti-GDF-8 como descritoaqui; (f) determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e (g)comparar os níveis de GDF-8 em uma primeira e segunda amostras, em queum aumento substancial, diminuição, ou similaridade no nível da primeiraamostra comparado com uma segunda amostra indica se o paciente estásofrendo de um distúrbio associado com GDF-8 causado em parte outotalmente) por superexpressão de GDF-8. Por exemplo, um aumento no nívelde GDF-8 em uma primeira amostra comparado com uma segunda amostrapode indicar que o paciente está sofrendo do distúrbio associado com GDF-8.Em contraste, uma diminuição ou similaridade no nível de GDF-8 em umaprimeira amostra comparado com uma segunda amostra pode indicar que opaciente não está sofrendo do distúrbio associado com GDF-8.

Anticorpos da invenção também são utilizáveis nos métodosde prognosticar a possibilidade de que um paciente irá desenvolver umdistúrbio associado com GDF-8, por exemplo, um distúrbio muscular,distúrbio neuromuscular, distúrbio ósseo degenerativo, distúrbio ósseometabólico ou induzido, distúrbio de adipose, distúrbio de metabolismo deglicose, ou distúrbio relacionado a insulina. Em uma forma de realizaçãopreferida, mas não limitativa, o método compreende as etapas de: (a) obteruma primeira amostra de um paciente de interesse; (b) contatar a primeiraamostra com um anticorpo anti-GDF-8 como descrito aqui; (c) determinar onível de GDF-8 em uma primeira amostra; (d) obter uma segunda amostra deum indivíduo não afetado com o distúrbio associado com GDF-8; (e) contataruma segunda amostra com um anticorpo anti-GDF-8 como descrito aqui; (f)determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e (g) comparar osníveis de GDF-8 em uma primeira e segunda amostras, em que um aumento,diminuição, ou similaridade no nível de GDF-8 na primeira amostra comocomparado com a segunda amostra indica a possibilidade de que o pacienteirá desenvolver o distúrbio associado com GDF-8. Por exemplo, para umdistúrbio associado com GDF-8 causado (em parte ou totalmente) porsuperexpressão de GDF-8, é provável que o paciente irá desenvolver odistúrbio associado com GDF-8 se a primeira amostra tiver um nível deaumento de GDF-8 comparado com a segunda amostra. Em contraste, paraum distúrbio associado com GDF-8 causado (em parte ou totalmente) porsuperexpressão de GDF-8, é improvável que o paciente irá desenvolver odistúrbio associado com GDF-8 se a primeira amostra tiver um nível similarou diminuído de GDF-8 comparado com a segunda amostra.

Anticorpos da invenção também são utilizáveis nos métodosde monitorar a severidade de um distúrbio associado com GDF-8, porexemplo, distúrbio muscular, distúrbio neuromuscular, distúrbio ósseodegenerativo, distúrbio ósseo metabólico ou induzido, distúrbio de adipose,distúrbio de metabolismo de glicose, ou distúrbio relacionado com insulina.Em uma forma de realização preferida, mas não limitativa, o métodocompreende as etapas de: (a) obter uma primeira amostra tomada de umpaciente de interesse em um primeiro ponto no tempo; (b) contatar a primeira amostra com um anticorpo anti-GDF-8 como descrito aqui; (c) determinar onível de GDF-8 em uma primeira amostra; (d) obter uma segunda amostratomada do paciente em um segundo ponto no tempo; (e) contatar umasegunda amostra com um anti-GDF-8 anticorpo como descrito aqui; (f)determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e (g) comparar osníveis de GDF-8 em uma primeira e segunda amostras, em que um aumento,diminuição, ou similaridade no nível de GDF-8 em uma segunda amostraindica se o distúrbio associado com GDF-8 mudou em severidade. Em umaforma de realização, um método de monitorar da invenção é usado paramonitor ALS, e uma diminuição no nível de GDF-8 em uma segunda amostra indica que ALS diminuiu em severidade.

Um método adicional de monitorar um distúrbio como descritoaqui compreende as etapas de: (a) obter uma primeira amostra de um pacientede interesse; (b) contatar a primeira amostra com um anticorpo anti-GDF-8como descrito aqui; (c) determinar o nível de GDF-8 em uma primeiraamostra; (d) obter uma segunda amostra de um indivíduo não afetado com umdistúrbio muscular, distúrbio neuromuscular, distúrbio ósseo degenerativo,distúrbio ósseo metabólico ou induzido, distúrbio de adipose, distúrbio demetabolismo de glicose, ou distúrbio relacionado com insulina; (e) contataruma segunda amostra com um anticorpo anti-GDF-8 como descrito aqui; (f)determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e (g) comparar osníveis de GDF-8 em uma primeira e segunda amostras, em que um aumento,diminuição, ou similaridade no nível de GDF-8 em uma primeira amostracomparado com uma segunda amostra indica a severidade do distúrbio deGDF-8 neste ponto. Em uma forma de realização, um método de monitorar dainvenção é usado para monitor ALS, e uma diminuição ou similaridade nonível de GDF-8 em uma primeira amostra comparado com uma segundaamostra indica que ALS tem severidade baixa.

Preferivelmente, o anticorpo é diretamente ou indiretamenterotulado com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpoligado ou não ligado. As substâncias detectáveis apropriadas incluem váriasenzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes emateriais radioativos.

Métodos para distribuir ou marcar um antagonista da invenção,por exemplo, um anticorpo, em uma célula expressando GDF-8 in vivotambém são descritos aqui e estão dentro do escopo da invenção.

Kits compreendendo o antagonista de GDF-8, por exemplo, osanticorpos anti-GDF-8, da invenção para usos terapêuticos e diagnósticostambém estão dentro do escopo da invenção.

Objetos adicionais da invenção serão especificados na seguintedescrição. Vários objetos, aspectos, e vantagens da invenção serão realizadose atingidos por meio dos elementos e combinações particularmente apontadasnas reivindicações.

Deve-se entender que tanto a descrição geral acima como aseguinte descrição detalhada são exemplares e explicativas apenas, e não sãorestritivas da invenção, como reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG. 1. Caracterização do anticorpo anti-GDF-8 RK35. A.Ligação direta de anticorpo RK35 para GDF-8, como medido em um testeELISA com GDF-8 biotinilado. A afinidade de ligação de anticorpo RK35(círculos) para GDF-8 foi determinada como sendo 4 nM. IgG de controle nãomostra ligação apreciável (quadrados). B. Efeito de anticorpo RK35 emligação de GDF-8 para seu receptor de afinidade elevada. Em um ELISA de competição usando o receptor de GDF-8 de afinidade elevada, ActRIIB foiusado para medir a atividade inibidora de GDF-8 de RK35. A ligação deGDF-8 biotinilado para imobilizar a proteína quimérica humana ActRIIBfusionada na região constante (Fc)de IgG humana foi avaliada na ausência(diamantes) ou presença de várias concentrações de RK35 mAb, ActRIIB solúvel ou IgG de controle. Receptor de ActRIIB-Fc solúvel (quadrados) eIgG de camundongo irrelevante (triângulos) foram usados como controlespositivo e negativo, respectivamente. RK35 (círculos) bloquearam a ligaçãode GDF-8 biotinilado para ActRIIB imobilizado com um IC5o ~ 2,5 nM. C.Inibição de transdução de sinal induzida por GDF-8. Célulasrhabdomiosarcoma expressando um gene de fusão promotor TGF-P -luciferase foram tratadas com 10 ng/ml de GDF-8 na ausência (quadrados) oupresença (círculos) de concentrações variadas de anticorpo RK35. RK35reduziu a indução de GDF-8 de atividade luciferase em um modo respondentea dose, com um IC50 de 0,2 nM. Sinal de fundo (diamantes) foi medido sem GDF-8 adicionado.

FIG. 2. Inibição de miostatina leva ao aumento do pesocorporal e aumento da massa muscular em ambos os camundongos e ratosSODG93A. A. Pesos corporais de camundongos transgênicos SODG93Atratados com RK35 (quadrados) (n = 11) e tratados com PBS (diamantes) (n =11) e camundongos (tipo selvagem) de controle de ninhadas tratadas comPBS (triângulos) (n = 9). B. Pesos corporais de ratos SODG93A transgênicosmachos (círculos) e fêmea s(triângulos) tratados com RK35 e machos(quadrados) e fêmeas (diamantes) tratados com PBS (n = 10 por grupo). C.

Massa muscular de camundongos SODG93A tratados com RK35 e tratadoscom PBS e camundongos de controle de ninhada tratados com PBS (n = 9-12)durante estágios iniciais da doença. Pesos no estado molhado foramdeterminados para os músculos gastrocnêmio (gastroc), tibialis cranial(tibialis), quadríceps (quad) e diafragma (diafragma) de camundongos de tiposelvagem de 88 dias de idade tratados com PBS (barras pretas), camundongosSODG93A tratados com PBS (barras brancas), e camundongos SODG93Atratados com RK35 (barras cinzas). D. Massa muscular de ratos SODG93A,tratados com PBS (barras brancas ) ou RK35 (barras cinzas), em estágioinicial da doença (-95 dias) (n = 7 por grupo). E. Massa muscular decamundongos tipo selvagem tratados com PBS (barras pretas ), camundongosSODG93A tratados com PBS (barras brancas), e camundongos SODG93Atratados com RK35 (barras cinzas) em doença em estágio terminal (-134dias). F. Massa muscular de ratos SODG93A, tratados com PBS (barrasbrancas) ou RK35 (barras cinzas) em doença em estágio terminal (-128 dias).

Asteriscos (*) denotam uma diferenças estatisticamente (p < 0,05) entregrupos indicados.

FIG. 3. A inibição de miostatina melhora a força muscular emcamundongos e ratos SODG93A. A. A força de agarramento dos membrostraseiros em camundongos tipo selvagem tratados com PBS (triângulos), ecamundongos SODG93A tratados com ou PBS (diamantes) ou RK35(quadrados) como uma função de idade. A força de agarramento dos membrostraseiros é expressada como compressão em quilogramas (kg). B. força deagarramento dos membros anteriores camundongos tipo selvagem tratadoscom PBS (triângulos), e camundongos SODG93A tratados com ou PBS(diamantes) ou RK35 (quadrados) como uma função de idade. C. Força deagarramento dos membros dianteiros em ratos tipo selvagem tratados comPBS (WT+PBS), ou ratos SODG93A tratados com PBS (SOD+PBS) ouRK35 (SOD+RK35). Para ratos, medições foram tomadas durante umintervalo de 4 semanas correspondendo a fase prematura da doença, entre 95-110 dias em idade. A força de agarramento dos membros dianteiros éexpressada como tensão em quilogramas (kg). Asteriscos (*) denotam umadiferença estatisticamente significante (p < 0,0001) entre grupos indicados.

FIG. 4. Efeitos de inibição de miostatina em estruturamuscular e função em roedores SODG93A. A coloração com hematoxilina eeosina de músculo gastrocnêmio mediano de camundongos a 88 dias indicaatrofia significante em (B) camundongos SODG93A tratados com PBS, emcomparação com ou (A) camundongos tipo selvagem ou (C) SODG93Atratados com RK35. A coloração com hematoxilina e eosina de músculogastrocnêmio mediano de ambos camundongos SODG93A (E) tratados comPBS e (F) tratados com RK35 em estágio terminal indica tanto atrofiamuscular significante e núcleos centralmente colocados (cabeças de setas)comparados com (D) gastrocnêmio de camundongo tipo selvagem. Acoloração com hematoxilina e eosina de diafragma de (G) camundongos tiposelvagem tratados com PBS e (H) camundongos SODG93A tratados comPBS ou (I) RK35, respectivamente, em estágio terminal. Exemplos demiofibras atróficas são marcados com ("a"). O asterisco no painel H denotadivisão das fibras. Barras mostradas denotam 50 um em escala nos painéis A-F e 25 um nos painéis G-I. Painel J: O padrão de interferência de EMGmostrando rajadas inspiratórias, registradas dos músculos do diafragma deratos tipo selvagem tratados com PBS (WT+PBS) ou ratos SODG93Atratados com PBS (SOD+PBS) ou RK35 (SOD+RK35). Painel K: Taxas depico de rajada EMG (em Hz) de músculos do diafragma de ratos tiposelvagem (n = 4), e de ratos SODG93A tratados ou com veículo (PBS, n = 9)ou RK35 (n = 8). Asteriscos (*) denotam uma diferença estatisticamentesignificante (p < 0,05) entre os grupos indicados.

FIG. 5. Tratamento com RK35 mostra a diminuição emdiâmetro de fibra muscular em músculo gastrocnêmio através da doença emestágio inicial em camundongos SODG93A, e em diafragma através dedoença em estágio terminal. Diâmetros de fibra foram medidos pormorfometria em músculo gastrocnêmio de camundongos SODG93A tratadoscom PBS (A) e tratados com RK35 (B) e camundongos tipo selvagemtratados com PBS (C) em 88 dias. Meios foram significantemente diferentespor ANO VA (p < 0,0001); comparação à feição de pares por pós-teste decomparação múltipla de Tukey também foram significantes (p < 0,001). Porestágio terminal, não foram observadas diferenças significantes emdistribuição de fibra no músculo gastrocnêmio de camundongos SODG93Atratados com PBS e tratados com RK35 (dados não mostrados). D. Análise dediâmetros de fibra de músculo do diafragma de camundongos SODG93Atratados com PBS e tratados com RK35 em estágio terminal em comparaçãocom camundongos de controle de tipo selvagem equiparados em idade.Músculo do diafragma de camundongos SODG93A tratados com RK35mostra um intermediário de distribuição do diâmetro de fibra entrecamundongos SODG93A tratados com PBS e camundongos de controle tiposelvagem em estágio terminal. Meios foram significantemente diferentes porANO VA (p < 0,0001); comparações em feição aos pares por pós-teste decomparação múltipla de Tukey também foram significantes (p < 0,01). Trêsmúsculos por grupo foram analisados; medições lineares do diâmetro máximodo eixo menor de pelo menos duas centenas de fibras foram tomadas, usandosoftware Zeiss Axiovision. Diâmetros de fibra foram depositados emintervalos de 20 um, e histogramas de freqüência foram gerados para cadagrupo muscular.

FIG. 6. Efeito de tratamento anti-miostatina em perdaneuronal motora no cifre ventral da medula espinhal. São mostradas análisesestereológicas de neurônios motores grandes (área maior que 300 um2 ) dasregiões L3-5 do cifre ventral de camundongos SODG93A tratados com ouPBS (SOD + PBS) ou RK35 (SOD + RK35) em doença em estágio inicial (A)e estágio terminal (C) em comparação com camundongos de tipo selvagemequiparados em idade (WT + PBS). O tratamento com RK35 mostrou umatendência para reverter a perda neuronal motora (p = 0,08) em doença emestágio inicial (A). As contagens individuais de neurônios motores saudáveisgrandes com nucléolos visíveis foram realizadas em seções coloridas comNISSL L3-5 de camundongos SODG93A tratados com ou PBS ou RK35 emdoença em estágio inicial (B) e estágio terminal (D) em comparação comcamundongos de tipo selvagem equiparados em idade. Para cada seção,ambos os cifres ventrais foram contados (total de 20 chifres ventrais poranimal) e dados são representados como número médio de neurônios motoresgrandes por chifre ventral. Asteriscos (*) denotam diferenças estatisticamentesignificantes (P < 0,001) entre os grupos indicados. Imagens representativasde seções de chifre ventral coloridas com NISSL (ampliação de 20x) sãomostradas para camundongos de tipo selvagem (E e H) tratados com PBS,camundongos SODG93A (F e I) tratados com PBS, e camundongosSODG93A (G e J) tratados com RK35 analisados em doença em estágioinicial (88 dias) (E-G) e estágio terminal (134 dias, H-J). Barra denota escalade 200 um.

FIG. 7. Mapeamento de epítopo de GDF-8 para o anticorpoRK35. Os sítios de ligação em GDF-8 para RK35 foram identificados usandosobreposição de peptídeos de 13 aminoácidos de GDF-8 humano. Sítios decontato de RK35 com GDF-8 são em negrito.

FIG. 8. Alinhamento das regiões variáveis de cadeia leve ecadeia pesada de RK35 (VL e VH, respectivamente) com o as armações delinhagem germinal humana DPK9 e DP-47, respectivamente. Os aminoácidosdas cadeias variáveis RK35 de murinos (MRK35) que são mudados nasregiões RK35 humanizadas (HuRK35) são designados com um asterisco (*) eestão em negrito; regiões determinantes da complementaridade de RK35 estãoem caixas e sublinhadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I. Definições

"Anticorpo," como usado aqui, refere-se a umaimunoglobulina ou uma parte da mesma, e engloba qualquer polipeptídeocompreendendo um sítio de ligação a antígeno, sem levar em conta a fonte,espécie de origem, método de produção, e características. Para os fins dapresente invenção, também inclui, salvo indicado em contrário, fragmentos deanticorpo como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, diacorpos, e outrosfragmentos de anticorpo que retém a função de ligação de antígeno. Osanticorpos podem ser feitos, por exemplo, via técnicas de hibridomatradicional, métodos de DNA recombinantes, ou técnicas de apresentação nasuperfície de fagos usando bibliotecas de anticorpo. Para várias outrastécnicas de produção de anticorpo, ver Antibodies: A Laboratory Manual, eds.Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

O termo "domínio de ligação de antígeno" refere-se a parte deuma molécula de anticorpo que compreende a área específica ligando a oucomplementar a uma parte ou todo de um antígeno. Onde um antígeno égrande, um anticorpo pode somente ligar uma parte particular do antígeno. O"epítopo" ou "determinante antigênico" é uma porção de uma molécula deantígeno que é responsável para interações com o domínio de ligação deantígeno de um anticorpo. Um domínio de ligação de antígeno pode serprovido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (por exemplo, umassim chamado fragmento de anticorpo de Fd consistindo de um domínioVH). Um domínio de ligação de antígeno pode compreender uma regiãovariável de anticorpo de cadeia leve (VL) e uma região variável de anticorpode cadeia pesada (VH).

O termo "GDF-8" refere-se a um fator -8 de crescimento e dediferenciação específico, mas não outros fatores que estão relacionadosestruturalmente ou funcionalmente para GDF-8, por exemplo, BMP-11 eoutros fatores pertencendo à superfamília de TGF-p\ O termo refere-se àforma de precursor não processado de comprimento completo de GDF-8,assim como as formas maduras e de propeptídeos resultantes de clivagempós-translacional. O termo também refere-se a quaisquer fragmentos evariantes de GDF-8 que mantém pelo menos algumas atividades biológicasassociadas com GDF-8 maduro, como discutido aqui, incluindo seqüênciasque foram modificadas. A seqüência de aminoácidos de GDF-8 humanomaduro é provida em SEQ ID NO: 1. A presente invenção refere-se a GDF-8dentre todas as espécies de vertebrados, incluindo, mas não limitadas ahumanos, bovinos, galinhas, camundongos, ratos, porcinos, ovinos, perus,babuínos, e peixes (para informação de seqüência, ver, por exemplo,McPherron et al., supra).

O termo "atividade de GDF-8" refere-se a uma ou maisatividades fisiologicamente reguladoras de crescimento ou morfogenéticasassociadas com proteína de GDF-8 ativo. Por exemplo, GDF-8 ativo é umregulador negativo de massa muscular esqueletal. GDF-8 ativo também podemodular a produção de enzimas específicas musculares (por exemplo, creatinaquinase), estimular a proliferação de mioblastos, e modular a diferenciação depreadipócitos para adipócitos. Procedimentos exemplares para medir aatividade GDF-8 in vivo e in vitro são especificados nos exemplos.

O termo "antagonista de GDF-8" ou "inibidor de GDF-8"inclui qualquer agente capaz de inibir atividade, expressão, processamento, ousecreção de GDF-8. Tais inibidores incluem macromoléculas e pequenasmoléculas, por exemplo, proteínas, anticorpos, peptídeos, peptidomiméticos,siRNA, ribozimas, oligonucleotídeos antisentido, RNA de filamento duplo, eoutras pequenas moléculas, que inibem GDF-8. Um antagonista de GDF-8inclui, além dos anticorpos providos aqui, qualquer anticorpo queeficientemente inibe GDF-8, incluindo anticorpos com especificidade elevadapara ligação de GDF-8 (por exemplo, anticorpos com uma afinidade baixapara outros membros da superfamília TGF-(3 (por exemplo, BMP-11)).Variantes, incluindo variantes humanizadas, destes anticorpos sãocontempladas nos métodos de diagnosticar, prognosticar, monitorar, tratar,melhorar, e prevenir da invenção. Tais inibidores são referidos para "inibir,""diminuir," ou "reduzir" a atividade biológica de GDF-8.

Os termos "neutralizar," "neutralizando," e seus cognatosreferem-se a uma redução dramática ou ab-rogação de atividade GDF-8relativa para a atividade de GDF-8 na ausência do mesmo inibidor. Porexemplo, uma redução de 75-100% de atividade pode ser referida para"neutralizar" atividade de GDF-8.

O termo "tratamento" é usado de modo interpermutável aquicom o termo "método terapêutico" e refere-se a tanto tratamento terapêuticocomo medições profiláticas/preventivas. As pessoas em necessidade detratamento podem incluir indivíduos já tendo um distúrbio médico particularassim como as que podem por fim adquirir o distúrbio (isto é, as precisando de medições preventivas.

O termo "isolado" refere-se a uma molécula que ésubstancialmente separada de seu ambiente natural. Por exemplo, umaproteína isolada é uma que é substancialmente separada da célula ou fonte detecido da qual ela é derivada.

O termo "purificado" refere-se a uma molécula que ésubstancialmente livre de outro material que se associa com a molécula emum ambiente natural. Por exemplo, uma proteína purificada ésubstancialmente livre do material celular ou outras proteínas da célula outecido da qual ela é derivada. O termo refere-se às preparações onde aproteína isolada é suficientemente pura para ser administrada como umacomposição terapêutica, ou pelo menos 70% a 80% (p/p) pura, maispreferivelmente, pelo menos 80%-90% (p/p) pura, ainda maispreferivelmente, 90-95% pura; e, o mais preferivelmente, pelo menos 95%,96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% (p/p) pura.

O termo "dose eficaz," "dose terapeuticamente eficaz,""quantidade eficaz," ou outros refere-se à quantidade do composto que resultaem ou melhoria de sintomas em um paciente ou um resultado biológicodesejado (por exemplo, aumentar a massa muscular esqueletal e/ou densidadeóssea). Tal quantidade deve ser suficiente para reduzir a atividade de GDF-8associada com a regulação negativa de massa muscular esqueletal e densidadeóssea ou com metabolismo de adipose e homeostase de glicose. A quantidadeeficaz pode ser determinada como descrito aqui.

Um "distúrbio associado com a atividade de GDF-8,""distúrbio associado com GDF-8," "distúrbio associado com GDF-8" ououtros refere-se aos distúrbios que podem ser causados, totalmente ou emparte, por desregulação de GDF-8 (por exemplo, aumentados ou diminuídosanormalmente) (e/ou atividade de GDF-8), e/ou distúrbios que podem sertratados, melhorados, evitados, diagnosticados, prognosticados, oumonitorados por regulação e/ou monitoração de GDF-8 (e/ou atividade deGDF-8). Distúrbios associados a GDF-8 incluem distúrbios musculares,distúrbios neuromusculares, distúrbios degenerativos ósseos, distúrbiosósseos metabólicos ou induzidos, distúrbios adiposos, distúrbios demetabolismo de glicose ou distúrbios relacionados com insulina. Um distúrbioassociado com GDF-8 preferido da invenção é esclerose lateral amiotrófica(ALS).

O termo " molécula pequena " refere-se aos compostos quenão são macromoléculas (ver, por exemplo, Karp (2000) BioinformaticsOntology 16: 269 - 85; Verkman (2004) AJP-Cell Physiol. 286: 465 - 74).Assim, pequenas moléculas são com freqüência consideradas os compostos quetem menos que um mil daltons (por exemplo, Voet e Voet, Biochemistry,segunda edição, ed. N. Rose, Wiley e Sons, New York, 14 (1995)). Porexemplo, Davis et al. ((2005) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 102: 5981 - 86) usama expressão molécula pequena para indicar folatos, metotrexato, eneuropeptídeos, enquanto Halpin e Harbury ((2004) PLos Biology 2: 1022 -30) usam a expressão para indicar produtos de genes de moléculas pequenas,por exemplo, DNAs, RNAs e peptídeos. Exemplos de moléculas pequenasnaturais incluem, mas não são limitadas para, colesteróis, neurotransmissores,e siRNAs; moléculas pequenas sintetizadas incluem, mas não são limitadaspara, vários produtos químicos relacionados em bases de dados de moléculapequena comercialmente disponíveis, por exemplo, FCD (Fine ChemicalsDatabase), SMID (Small Molecule Interaction Database), ChEBI (ChemicalEntities of Biological Interest), e CSD (Cambridge Structural Database) (ver, por exemplo, Alfarano et al. (2005) Nuc. Acids Res. Database Issue 33: D416-24).

II. Anticorpos contra GDF-8 e fragmentos de anticorpo

A. Anticorpo RK35 de camundongo e humanizado

A presente descrição prove anticorpos novos (por exemplo, anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo) que ligam GDF-8eficientemente. Uma forma de realização ilustrativa não limitativa desteanticorpo é chamada RK35. Esta forma de realização exemplar é provida naforma de anticorpos de camundongo e humanizados, e fragmentos deanticorpos dos mesmos.

O anticorpo exemplar da invenção, referido aqui como"RK35," possui características únicas e benéficas. Primeiro, este anticorpo efragmentos de anticorpos são capazes de ligar GDF-8 maduro com afinidadeelevada. Segundo, o anticorpo e fragmentos de anticorpos da invenção inibematividade de GDF-8 in vitro e in vivo como demonstrado, por exemplo, porinibição de ligação de ActRIIB e testes de gene repórter. Terceiro, o anticorpoe fragmentos de anticorpos descritos são utilizáveis para tratar sintomasassociados com um distúrbio associado com GDF-8, por exemplo, distúrbiosmusculares, particularmente ALS, como demonstrado, por exemplo, poraumento da massa muscular em camundongos SOD mutantes tratados.

Em uma forma de realização exemplar, antagonistas de GDF-8são os anticorpos que ligam eficientemente para GDF-8 e inibem uma ou maisatividades associadas com GDF-8. O versado na técnica irá reconhecer que osanticorpos da invenção podem ser usados para detectar, medir, e inibir asproteínas de GDF derivadas de várias espécies, por exemplo, as descritas nopresente relatório. O identidade percentual é determinada por algoritmos dealinhamento padrão como, por exemplo, Basic Local Alignment Tool(BLAST) descrito em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 10, oalgoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 444 - 53, ou oalgoritmo de Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11 - 17. Em geral,os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção podem ser usados comqualquer proteína que retém atividade biológica de GDF-8 substancial ecompreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70%,80%, 90%, 95%, ou mais idêntica a qualquer seqüência de pelo menos 100,80, 60, 40, 20, ou 15 aminoácidos contíguos da forma madura de GDF-8especificado em SEQ ID NO: 1.

B. Domínios variáveis de anticorpo

Anticorpos intactos, também conhecidos comoimunoglobulinas, são tipicamente proteínas glicosiladas tetraméricascompostos de duas cadeias leves (L) de aproximadamente 25 kDa cada, eduas cadeias pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada. Dois tipos decadeia leve, terminadas com lambda e kappa, existem em anticorpos.Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de cadeiaspesadas, imunoglobulinas são designadas a cinco classes principais: A, D, E,G, e M, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos),por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAb e IgA2. Cada cadeia leve écomposta de um domínio variável N-terminal (V) (VL) e um domínioconstante (C) (CL). Cada cadeia pesada é composta de um domínio N-terminal V (VH), três ou quatro domínios C (CHs), e uma região de gancho.O domínio CH mais próximo a VH é designado CHI. Os domínios VH e VLconsistem de quatro regiões de seqüências relativamente conservadaschamadas de regiões de armação (FR1, FR2, FR3, e FR4), que formam umaestrutura para três regiões de seqüências hipervariáveis (regiões determinantesda complementaridade, CDRs). CDRs contém a maior parte dos resíduosresponsáveis para interações do anticorpo com o antígeno. CDRs são referidascomo CDR1, CDR2, e CDR3. Conseqüentemente, constituintes de CDR nacadeia pesada são referidos como Hl, H2, e H3, enquanto os constituintes deCDR na cadeia leve são referidos como LI, L2, e L3. CDR3 é a maior fontede diversidade molecular dentro do sítio de ligação de anticorpos. H3, porexemplo, pode ser tão curto como dois resíduos de aminoácidos ou maior doque 26 aminoácidos. As estruturas de subunidade e configuraçõestridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidasna técnica. Para um estudo da estrutura de anticorpos, ver Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.Um versado na técnica irá reconhecer que cada estrutura de subunidade, porexemplo, uma estrutura CH, VH, CL, VL, CDR, e/ou FR, compreendefragmentos ativos. Por exemplo, fragmentos ativos podem consistir da porçãoda subunidade VH, VL, ou CDR que liga o antígeno, isto é, o fragmento deligação ao antígeno, ou a porção da subunidade CH que liga para e/ou ativaum receptor de Fc e/ou complemento.

Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação englobadosdentro do termo "fragmento de anticorpo" usados aqui incluem: (i) umfragmento de Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL,VH, CL e CHI; (ii) um fragmento de F(ab')2, um fragmento bivalentecompreendendo dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfetona região de gancho; (iii) um fragmento de Fd consistindo dos domínios VH eCHI; (iv) um fragmento de Fv consistindo dos domínios VL e VH de umbraço único de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb, que consiste de umdomínio VH; e (vi) uma CDR isolada. Além disso, apesar dos dois domíniosdos fragmentos de Fv, VL e VH, serem codificados por genes separados, elespodem ser recombinantemente unidos por um ligador sintético, criando umacadeia de proteína única em que as regiões VL e VH formam pares paraformar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv).

O ligador mais comumente usado é um peptídeo de 15 resíduos (Gly4Ser)3,mas outros ligadores também são conhecidos na técnica. Os anticorpos decadeia única também se destinam a serem englobados dentro do termo"anticorpo" ou "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo. Estesanticorpos são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas dosversados na técnica, e os fragmentos são triados para utilidade do mesmomodo que os anticorpos intactos.

Diversidade de anticorpo é criada por genes de linhagemgerminal múltipla codificando regiões variáveis e uma variedade de eventossomáticos. Os eventos somáticos incluem recombinação de segmentos degene variáveis com diversidade (D) e união (J) de segmentos de gene parafazer uma região VH completa, e a recombinação de variáveis e união desegmentos de genes para fazer uma região VL completa. O próprio processode recombinação é impreciso, resultando na perda ou adição de aminoácidosnas junções V(D) J. Estes mecanismos de diversidade ocorrem nodesenvolvimento de células B antes da exposição do antígeno. Aposestimulação antigênica, os genes de anticorpo expressados em células Bsofrem mutação somática. Com base no número estimado de segmentos degene de linhagem germinal, a recombinação aleatória destes segmentos, eformação de pares aleatórios VH-VL, até 1,6 x IO7 anticorpos diferentespodem ser produzidos (Fundamental Immunology, terceira edição (1993), ed.Paul, Raven Press, New York, NY). Quando outros processos que contribuempara diversidade de anticorpo (como mutação somática) são levados emconta, pensa-se que até 1 x IO10 anticorpos diferentes podem ser gerados(Immunoglobulin Genes, segunda edição (1995), eds. Jonio et ai, AcademicPress, San Diego, CA). Porque muitos processos envolvidos na geração dediversidade de anticorpos, é improvável que anticorpos monoclonaisindependentemente derivados com a mesma especificidade de antígenotenham seqüências de aminoácidos idênticas.

Assim, a presente invenção prove anticorpos novos que ligamGDF-8. Os fragmentos de anticorpos da invenção, por exemplo, estruturascontendo CDR, serão geralmente uma seqüência de cadeia leve ou cadeiapesada de anticorpo, ou um fragmento ativo da mesma, em que CDR écolocada no local correspondente a CDR de VH e VL de ocorrência natural.As estruturas e locais de domínios variáveis de imunoglobulina, por exemplo,CDRs, podem ser definidas usando esquemas de numeração bem conhecidos,por exemplo um esquema de numeração de Kabat, o esquema de numeraçãode Chothia, uma combinação de Kabat e Chothia (AbM), etc. (ver, porexemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Departmentof Health e Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Al-Lazikani et al.(1997) J. MoIBiol. 273: 927 - 48).

Assim, a presente invenção ainda prove CDRs novas. Aestrutura para realizar uma CDR da invenção será geralmente umpolipeptídeo, por exemplo, uma seqüência de cadeia leve ou pesada deanticorpo ou uma porção substancial do mesmo, em que a CDR estálocalizada na posição correspondente a CDR regiões VH e VL de ocorrêncianatural. As estruturas e locais de domínios variáveis de imunoglobulinapodem ser determinadas como descrito em, por exemplo, Kabat et al., supra eAl-Lazikani et al., supra.

As moléculas de anticorpo (incluindo fragmentos deanticorpos) da presente invenção, isto é, moléculas de anticorpo queantagonizam GDF-8, incluem, mas não são limitadas para anticorpomonoclonal de murinos RK35 e suas variantes, especificamente a variantehumanizada. Antagonistas de GDF-8 da invenção incluem, além de RK35,outros anticorpos que eficientemente ligam para GDF-8, incluindo anticorposcom especificidade elevada para ligação para GDF-8 (por exemplo,anticorpos com uma afinidade inferior para outros membros da superfamíliaTGF-P (por exemplo, BMP-11)). Variantes, incluindo variantes humanizadas,destes anticorpos são contempladas nos métodos de diagnosticar,prognosticar, monitorar, tratar, melhorar, e prevenir da invenção. Estasmoléculas de anticorpo podem ser utilizáveis para evitar ou tratar umdistúrbio associado com GDF-8, por exemplo, osso, músculo, adipose epatologias relacionadas a metabolismo de glicose. As seqüências deaminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve de RK35 murino ehumanizado são especificadas em SEQ ID NOs: 5 e 9, respectivamente. Asseqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada de RK35murino e humanizado são especificadas em SEQ ID NOs: 3 e 7,respectivamente. As seqüências de aminoácidos das três regiõesdeterminantes da complementaridade (CDRs) nas cadeias leves variáveis deRK35 murino e humanizado são especificadas em SEQ ID NOs: 13, 14, 15,23, 24, e 25. As seqüências de aminoácido das três CDRs nas cadeias pesadasvariáveis de RK35 murino e humanizado são especificados em SEQ ID NOs:10, 11, 12, 20,21, e 22.

Como descrito acima, CDRs contêm o máximo dos resíduosresponsáveis para interações com um antígeno, e estão contidas dentro dosdomínios VH e VL, isto é, a região variável de cadeia pesada e a regiãovariável de cadeia leve, respectivamente. Conseqüentemente, desde que umanticorpo compreenda pelo menos uma CDR compreendendo uma seqüênciade aminoácidos selecionada dentre as seqüências de aminoácidosespecificadas em SEQ ID NOs: 10- 15 e 20-25, ou um fragmento deanticorpos ativos das mesmos, é um anticorpo da invenção, isto é, um que ligaa GDF-8 e interfere com sinalização de GDF-8. Assim, uma forma derealização da invenção inclui polipeptídeos, por exemplo, anticorpos, quecontém uma ou mais CDRs que compreendem uma seqüência de aminoácidosselecionada dentre as seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ IDNOs: 10-15 e 20-25, ou um fragmento ativo das mesmas. Conseqüentemente,um versado na técnica irá reconhecer que os anticorpos da invenção incluemum anticorpo em que as CDRs da cadeia VL são as especificadas em SEQ IDNOs: 13-15 e 23-25, ou as CDRs da cadeia VH são as especificadas em SEQIDNOs: 10-12 e 20-22.

Um fragmento de ligação de antígeno pode ser um fragmentoFv, que consiste de domínios VH e VL. Assim, um fragmento Fv de RK35pode constituir um anticorpo da invenção, desde que ele ligue a GDF-8 einterfira com a sinalização de GDF-8. Um versado na técnica irá reconhecerque qualquer fragmento de anticorpo contendo o fragmento Fv de, porexemplo, RK35, também pode ser um anticorpo da invenção.Adicionalmente, qualquer fragmento de Fv, fragmento de scFv, fragmento deFab, ou fragmento de F(ab')2, que contém uma ou mais CDRs tendo umaseqüência de aminoácidos selecionada dentre as seqüências de aminoácidosespecificadas em SEQ ID NOs: 10-15 e 20-25, também pode ser um anticorpoda invenção.

Tais moléculas de anticorpo podem ser produzidas pormétodos bem conhecidos do versado na técnica. Por exemplo, anticorposmonoclonais podem ser produzidos por geração de hibridomas de acordo commétodos conhecidos. Hibridomas formados deste modo são então triadosusando métodos padrões, como teste imunossorvente ligado a enzima(ELISA) e análise Biacore, para identificar um ou mais hibridomas queproduzem um anticorpo que liga GDF-8, interfere com a sinalização de GDF-8, e neutraliza ou inibe uma ou mais atividades associadas com GDF-8. OGDF-8 recombinante, GDF-8 de ocorrência natural, quaisquer variantes dosmesmos, e fragmentos de peptídeo antigênico de GDF-8 podem ser usadoscomo o imunogênio. Um fragmento de peptídeo antigênico de GDF-8compreende pelo menos sete resíduos de aminoácidos contínuos e engloba umepítopo de modo que um anticorpo criado contra o peptídeo forma umcomplexo imune com GDF-8. Preferivelmente, o peptídeo antigênicocompreende pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente pelomenos 15 resíduos de aminoácidos, ainda mais preferivelmente pelo menos 20resíduos de aminoácidos, e o mais preferivelmente pelo menos 30 resíduos deaminoácidos. Adicionalmente, é preferível que o fragmento de peptídeoantigênico de GDF-8 compreenda o sítio de ligação de receptor GDF-8.

Soros policlonais e anticorpos da invenção podem serproduzidos por imunização de um indivíduo apropriado com GDF-8, suasvariantes, e/ou porções do mesmo. O título de anticorpos no indivíduoimunizado pode ser monitorado com o tempo por técnicas padrões, comoELISA, ou por uso de GDF-8 imobilizado ou outras proteínas de marcador(por exemplo, FLAG). Se desejado, as moléculas de anticorpo da presenteinvenção podem ser isoladas do indivíduo ou meio de cultura e aindapurificadas por técnicas bem conhecidas, como cromatografia de proteína A,para obter uma fração de IgG.

Certas formas de realização da invenção compreendem odomínio VH e/ou VL do fragmento Fv de RK35. Os fragmentos de anticorposda presente invenção, por exemplo, fragmentos de Fab, F(ab')2, Fd, e dAb,podem ser produzidos por clivagem dos anticorpos de acordo com os métodosbem conhecidos na técnica. Por exemplo, fragmentos de Fab e F(ab')2imunologicamente ativos podem ser gerados por tratamento dos anticorposcom uma enzima como papaína e pepsina.

Outras formas de realização compreendem uma ou mais CDRsde qualquer um destes domínios VH e VL, como especificado em SEQ IDNOs: 10- 15 e 20-25. Uma forma de realização compreende um fragmento deH3 do domínio VH de RK35 como especificado em SEQ ID NO: 12.

Seqüências de DNA e de aminoácidos (AA) de domínios VH eVL, e CDRs dos anticorpos presentemente descritos são enumeradas comolistadas na tabela 1. Para conveniência, as posições aproximadas de cada CDRdentro dos domínios VH e VL são listadas na tabela 2.

Tabela 1: Seqüências de DNA e de aminoácidos de VH, VL, CH, CL e CDRs

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Tabela 2: Posição de CDR aproximada de acordo com definições de Kabat

<table>table see original document page 42</column></row><table>Os anticorpos anti-GDF-8 podem ainda compreender asregiões constantes de anticorpo ou partes das mesmas. Por exemplo, umdomínio VL da invenção pode ser fixado em sua extremidade C-terminal emum domínio constante de cadeia leve de anticorpo, por exemplo, uma cadeiaCk ou CX humana, preferivelmente uma cadeia CX. Similarmente, umfragmento de ligação de antígeno com base no domínio VH pode ser fixadoem sua extremidade C-terminal todo ou em parte de uma cadeia pesada deimunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG,IgA, IgE, e IgM, e qualquer uma das subclasses de isotipo, particularmenteIgGi e IgG4. Nas formas de realização exemplares, os anticorposcompreendem fragmentos C-terminais de cadeias leve e pesada de IgGahumana. As seqüências de DNA e de aminoácidos preferidas para ofragmento constante C-terminal da cadeia X leve são especificadas em SEQID NO: 16 e SEQ ID NO: 17, respectivamente. As seqüências de DNA e deaminoácidos preferidas para o fragmento constante C-terminal de cadeiapesada IgGi são especificadas em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19,respectivamente. Deve-se entender que, devido a degeneração do códigogenético, as seqüências de DNA listadas na tabela 1 são meramenterepresentativas de ácidos nucleicos que codificam as seqüências deaminoácidos, peptídeos, e anticorpos de interesse, e não devem serconsideradas como limitativas.

Algumas formas de realização da invenção compreendem odomínio VH e/ou VL do fragmento Fv de RK35. Outras formas de realizaçãocompreendem uma ou mais regiões determinantes da complementaridade(CDRs) de qualquer um destes domínios VH e VL. Uma forma de realizaçãocompreende um fragmento de H3 do domínio VH de RK35. Os domínios VHe VL da invenção, em certas formas de realização, são de linhagem germinal,isto é, as regiões de armação (FRs) destes domínios são mudadas usandotécnicas de biologia molecular convencionais para fazer as correspondênciasdas seqüências de aminoácidos de consenso dos produtos de genes delinhagem germinal humana. Isto é também conhecido como anticorpohumanizado ou de linhagem germinal. Em outras formas de realização, asseqüências de armação permanecem desviadas da linhagem germinal.Anticorpos humanizados podem ser produzidos usando camundongostransgênicos que são incapazes de expressar genes de cadeia leve e pesada deimunoglobulina endógena, mas são capazes de expressar genes de cadeia levee pesada humanos.

C. Anticorpos modificados e seus fragmentos

Um outro aspecto da invenção prove métodos para obter umdomínio de ligação de antígeno de anticorpo dirigido contra GDF-8. Oversado na técnica irá apreciar que os anticorpos da invenção não sãolimitados para as seqüências específicas de VH e VL como listadas na tabela1, mas também incluem variantes destas seqüências que retém a capacidadede ligação de antígeno. Tais variantes podem ser derivadas das seqüênciasprovidas usando técnicas conhecidas na técnica. Substituições, deleções, ouadições de aminoácidos, podem ser feitas ou em FRs ou CDRs. Apesar demudanças nas regiões de armação serem geralmente projetadas para melhorara estabilidade e reduzir a imunogenicidade do anticorpo, mudanças nas CDRssão geralmente projetadas para aumentar a afinidade do anticorpo para seualvo. Tais mudanças aumentando a afinidade são tipicamente determinadasempiricamente por alteração de CDR e teste do anticorpo. Tais alteraçõespodem ser feitas de acordo com os métodos descritos em, por exemplo,Antibody Engineering, segunda edição, Borrebaeck, ed., Oxford UniversityPress, 1995.

Assim, os anticorpos da invenção também incluem os queligam a GDF-8, interferem com a sinalização de GDF-8, e tem mutações nasregiões constantes das cadeias leve e pesada. E às vezes desejável mudar einativar alguns fragmentos da região constante. Por exemplo, mutações naregião constante pesada são algumas vezes desejáveis para produziranticorpos com ligação reduzida no receptor Fc (FcR) e/ou complemento; taismutações são bem conhecidas na técnica. Um versado na técnica também iráreconhecer que a determinação de quais fragmentos ativos das subunidadesCL e CH são necessários irá depender da aplicação em qual um anticorpo dainvenção é aplicado. Por exemplo, os fragmentos ativos das subunidades CL eCH que são envolvidos com sua ligação covalente para cada outro seráimportante na geração de um anticorpo intacto.

O método para fazer um domínio VH que é uma variante deseqüência de aminoácidos de um domínio VH especificada aqui compreendeuma etapa de adicionar, deletar, substituir ou inserir um ou mais aminoácidosna seqüência de aminoácidos do domínio VH presentemente descrito,opcionalmente combinar o domínio VH assim provido com um ou maisdomínios VL, e testar o domínio VH ou combinação VH/VL ou combinaçõespara ligar a GDF-8, e (preferivelmente) testar a capacidade de tal domínio deligação de antígeno para modular uma ou mais atividades associadas comGDF-8. O domínio VL pode ter uma seqüência de aminoácidos que ésubstancialmente como especificado aqui. Um método análogo pode serempregado em que uma ou mais variantes de seqüência de um domínio VLdescrito aqui são combinadas com um ou mais domínios VH.

Um outro aspecto da invenção prove um método de prepararum fragmento de ligação de antígeno que interage com GDF-8. O métodocompreende:

(a) prover um repertório de partida de ácidos nucléicos codificando um domínio VH que ou inclui uma CDR, por exemplo, CDR3, aser substituído, ou um domínio VH que falta uma região de codificação deCDR, por exemplo, CDR3;

(b) combinar o repertório com um ácido nucléico doadorcodificando uma CDR de doador compreendendo um fragmento ativo de SEQID NO: 2 ou 6, por exemplo, um ácido nucléico doador codificando aseqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 3 ou 7, de modo queo ácido nucléico doador é inserido na região CDR, por exemplo, CDR3, norepertório de modo a prover um repertório de produtos de ácidos nucléicoscodificando um domínio VH;

(c) expressar os ácidos nucléicos do repertório de produto;

(d) selecionar um fragmento de ligação de antígeno queinterage com GDF-8; e

(e) recuperar o fragmento de ligação de antígeno selecionadoou ácido nucléico codificado o mesmo.

Novamente, um método análogo pode ser empregado em queuma CDR VL (por exemplo, L3) da invenção é combinada com um repertóriode ácidos nucléicos codificando um domínio VL, que ou inclui uma CDR aser substituída ou falta uma região de codificação de CDR.

Uma seqüência de codificação de uma CDR da invenção (porexemplo, CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domíniosvariáveis faltando uma CDR (por exemplo, CDR3), usando tecnologia deDNA recombinante. Por exemplo, Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779 - 83, descreve os métodos de produzir repertórios de domínios deanticorpo variáveis em que iniciadores de consenso dirigidos a ou adjacentesà extremidade 5' da área de domínio variável são usados em conjunto cominiciadores de consenso para uma terceira região de armação de genes VHhumanos para prover um repertório de domínios VH variáveis faltando umaCDR3. O repertório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpoparticular. Usando técnicas análogas, as seqüências derivadas de CDR3 dapresente invenção podem ser embaralhadas com repertórios de domínios VHou VL faltando uma CDR3, e os domínios VH ou VL completosembaralhados combinados com um domínio VL ou VH cognato para proverfragmentos de ligação de antígeno da invenção. O repertório pode então serexibido em um sistema hospedeiro apropriado, como o sistema deapresentação na superfície de fagos , por exemplo, WO 92/01047, de modoque os fragmentos de ligação de antígeno apropriados podem serselecionados.

Embaralhamento análogo ou técnicas combinatórias tambémsão descritos por Stemmer (1994) Nature 370: 389 - 91, que descrevem umatécnica em relação ao gene p-lactamase mas observa-se que a abordagempode ser usada para a geração de anticorpos.

Uma outra alternativa é para regiões VH ou VL novastransportando uma seqüência derivada de CDR da invenção usandomutagenese aleatória de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados paragerar mutações dentro do domínio variável completo. Tal técnica é descritaem Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 3576 - 80 usandoPCR passível de erros.

Outro método que pode ser usado para gerar anticorpos novosou fragmentos dos mesmos é para dirigir mutagenese para CDRs de genes VHou VL. Tais técnicas são descritas em Barbas et al. (1994) Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A. 91: 3809 - 13 e Schier et al. (1996) J. MoL Biol. 263: 551 - 67.

Similarmente, uma, duas, ou todas as três CDRs, podem serenxertadas em um repertório de domínios VH ou VL que são então triadospara um parceiro de ligação ou fragmentos de ligação para GDF-8.

Uma porção substancial de um domínio variável deimunoglobulina irá compreender pelo menos CDRs e, opcionalmente, suasregiões de armação intervenientes dos fragmentos de anticorpos comoespecificado aqui. A porção também irá incluir pelo menos cerca de 50% deum ou ambos dentre FR1 e FR4, 50% sendo os 50%C-terminais de FR1 e os50% N-terminais de FR4. Os resíduos adicionais na extremidade N-terminalou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser os nãonormalmente associados com regiões de domínio variável naturalmenteocorrendo. Por exemplo, a construção de fragmentos de anticorpos dapresente invenção feita por técnicas de DNA recombinantes pode resultar naintrodução de resíduos N- ou C-terminais codificados por ligadoresintroduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação.

Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligadores para unirdomínios variáveis da invenção a outras seqüências de proteína incluindocadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo,na produção de diacorpos) ou rótulos de proteína como discutido em maioresdetalhes abaixo.

Apesar das formas de realização ilustradas nos exemploscompreenderem um par "de correspondência" de domínios VH e VL, ainvenção também engloba fragmentos de ligação contendo um domíniovariável único, por exemplo, um fragmento de dAb, derivado de ouseqüências de domínio VH ou VL, especialmente domínios VH. No caso de ou dos domínios de ligação de cadeia única, estes domínios podem ser usadospara triar domínios complementares capazes de formar um domínio de ligaçãode antígeno de dois domínios, capaz de ligar GDF-8. Isto pode ser obtido pormétodos de triagem de apresentação na superfície de fagos, usando a assimchamada abordagem combinatorial dual hierárquica, como descrito em, porexemplo, WO 92/01047. Nesta técnica, uma colônia individual contendo ouum clone de cadeia H ou L é usado para infectar uma biblioteca completa declones codificando a outra cadeia (L ou H) e o domínio de ligação de antígenode duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas deapresentação na superfície de fagos, como as descritas nesta referência. Esta técnica também é descrita em Marks et al., supra.

Anticorpos podem ser conjugados por métodos químicos comradionuclídeos, fármacos, macromoléculas, ou outros agentes, e podem serfeitos como proteínas de fusão compreendendo uma ou mais CDRs dainvenção.Uma proteína de fusão de anticorpo contém um par VH-VLem que uma destas cadeias (usualmente VH) e outra proteína são sintetizadascomo uma cadeia de polipeptídeo única. Estes tipos de produtos diferem deanticorpos em que eles geralmente tem um elemento funcional adicional - aporção ativa de uma pequena molécula ou o aspecto estrutural molecularprincipal do conjugado ou macromolécula fusionada.

Além das mudanças para a seqüência de aminoácido descritaacima, os anticorpos podem ser glicosilados, peguilados, ou ligados aalbumina ou a um polímero não proteináceo. Por exemplo, os anticorpos anti-GDF-8 podem ser ligados a uma dentre uma variedade de polímeros nãoproteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, oupolioxialquilenos. Os anticorpos podem ser quimicamente modificados, porexemplo, para aumentar sua meia-vida circulante por conjugação covalentepara um polímero. Polímeros exemplares, e métodos para fixar os mesmos empeptídeos são conhecidos na técnica.

Em outras formas de realização, o anticorpo pode sermodificado para ter um padrão de glicosilação alterado (isto é, relativo aopadrão de glicosilação original ou nativo). Como usado aqui, "alterado"significa tendo uma ou mais porções de carboidrato deletadas, e/ou tendo umou mais sítios de glicosilação adicionados no anticorpo original. Adição desítios de glicosilação para um anticorpo anti-GDF-8 é acompanhada pormétodos bem conhecidos de alterar a seqüência de aminoácidos para conterseqüências de consenso de sítio de glicosilação. Outros meios para aumentar onúmero de porções de carboidratos nos anticorpos é por copulação química ouenzimática de glicosídeos para os resíduos de aminoácidos do anticorpo.Remoção de quaisquer porções de carboidratos presentes nos anticorpos podeser quimicamente ou enzimaticamente acompanhada como conhecido natécnica.

Anticorpos da invenção também podem ser etiquetados comum rótulo detectável ou funcional como 131I ou 99Tc, que podem ser fixadosnos anticorpos da invenção usando química convencional conhecida natécnica. Rótulos também incluem rótulos de enzima como peroxidase de raizforte ou fosfatase alcalina. Rótulos ainda incluem porções químicas comobiotina, que pode ser detectada via ligação em uma porção detectável cognataespecífica, por exemplo, avidina rotulada.

Anticorpos, em que seqüências de CDR diferem somenteinsubstancialmente das listadas na tabela 1, são englobados dentro do escopoda invenção. Diferenças insubstanciais incluem mudanças de aminoácidospequenas, por exemplo, substituições de um ou dois dentre cinco aminoácidosna seqüência de uma CDR. Tipicamente, um aminoácido é substituído por umaminoácido relacionado tendo carga similar, hidrofobicidade, oucaracterísticas estereoquímicas. Tais substituições podem estar de acordo como conhecimento do versado. As regiões de armação de estrutura (Frs) podemser modificadas mais substancialmente do que as CDRs sem afetaradversamente as propriedades de ligação de um anticorpo. Mudanças paraFRs incluem, mas não são limitadas a humanização de uma armação derivadanão humana ou engenharia de alguns resíduos de armação que sãoimportantes para contato do antígeno ou para estabilizar o sítio de ligação, porexemplo, mudando a classe ou subclasse da região constante, mudando osresíduos de aminoácidos específicos que podem alterar uma função deefetuador como ligação de receptor de Fc (por exemplo, Lund et al. (1991) J.Immunol. 147: 2657 - 62; Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319 - 24), oumudança da espécie da qual a região constante é derivada. Anticorpos podemter mutações na região CH2 da cadeia pesada que reduzem ou alteram afunção do efetuador, por exemplo a ligação do receptor de Fc e ativação docomplemento. Por exemplo, anticorpos podem ter mutações como as descritosem patentes U.S. 5.624.821 e 5.648.260. Na cadeia pesada de IgGj ou IgG2,por exemplo, estas mutações podem ser feitas em resíduos de aminoácidos117 e 120 de SEQ ID NO: 19, que representa a porção Fc de IgGi (estesresíduos correspondem a 234 e 237 aminoácidos na seqüência decomprimento completo de IgG) ou IgG2). Anticorpos também podem termutações que estabilizam a ligação de dissulfeto entre as duas cadeiaspesadas de uma imunoglobulina, como mutações na região de gancho deIgG4, como descrito em, por exemplo, Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105 -08.

Os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção tambémenglobam proteínas que são estruturalmente diferentes dos polipeptídeos eanticorpos descritos, por exemplo, que tem uma seqüência alterada, massubstancialmente as mesmas propriedades bioquímicas como os polipeptídeose anticorpos descritos, por exemplo, tem mudanças somente em aminoácidosfuncionalmente não essenciais. Tais moléculas incluem variantes alélicas deocorrência natural e variantes deliberadamente engenheiradas contendoalterações, substituições, reposições, inserções, ou deleções. Técnicas paratais alterações, substituições, reposições, inserções, ou deleções são bemconhecidas dos versados na técnica.

Anticorpos da invenção adicionalmente podem ser produzidosusando animais não humanos transgênicos que são modificados de modo aproduzir anticorpos completamente humanos em vez dos anticorposendógenos do animal em resposta a desafio por um antígeno. Ver, porexemplo, PCT publicação WO 94/02602. Os genes endógenos codificando ascadeias de imunoglobulina leve e pesada no hospedeiro não humano foramincapacitados, e loci ativos codificando imunoglobulinas de cadeia pesada eleve humanas são inseridos no genoma do hospedeiro. Os genes humanos sãoincorporados, por exemplo, usando cromossomos artificiais de levedurascontendo os segmentos de DNA humanos requeridos. Um animal que provetodas as modificações desejadas é então obtido como progênie de animaistransgênicos intermediários endogâmicos contendo menos do que ocomplemento completo das modificações. Uma forma de realização desteanimal não humano é um camundongo, que é chamado XENOMOUSE™como descrito em publicações PCT WO 96/33735 e WO 96/34096. Esteanimal produz células B que secretam completamente imunoglobulinashumanas. Os anticorpos podem ser obtidos diretamente do animal apósimunização com um imunogene de interesse, como, por exemplo, umapreparação de um anticorpo policlonal, ou alternativamente de células Bimortalizadas derivadas do animal, como hibridomas produzindo anticorposmonoclonais. Adicionalmente, os genes codificando as imunoglobulinas comregiões variáveis humanas podem ser recuperados e expressados para obter osanticorpos diretamente, ou podem ser ainda modificados para obter análogosde anticorpos como, por exemplo, moléculas Fv de cadeia única.

Conseqüentemente, o termo anticorpo como usado aqui incluianticorpos intactos, fragmentos de anticorpos, por exemplo, fragmentos deFab, F(ab')2 Fd, dAb e scFv, e anticorpos intactos e fragmentos que forammudados ou em suas regiões constantes e/ou variáveis (por exemplo,mutações para produzir anticorpos quiméricos, parcialmente humanizados, oucompletamente humanizados, assim como para produzir anticorpos com um traçodesejado, por exemplo, ligação de GDF-8 melhorada e/ou ligação de FcRreduzida. Como tal, estes anticorpos são incluídos no escopo da invenção, desdeque o anticorpo ligue especificamente para GDF-8, interfira com sinalização deGDF-8, e/ou neutralize ou iniba uma ou mais atividades associadas com GDF-8.

Outras moléculas de ligação de proteína também podem serempregadas para modular a atividade de GDF-8. Tais moléculas de ligação deproteína incluem fármacos imuno-farmacêuticos (SMIP™) (TrubionPharmaceuticals, Seattle, WA). SMIPs são polipeptídeos de cadeia únicacompostos de um domínio de ligação para uma estrutura cognata como umantígeno, um contra-receptor ou semelhante, um polipeptídeo de região degancho tendo ou uma ou nenhum resíduo de cisteína, e domínios CH2 e CH3 deimunoglobulina (ver também vvww.trubion.com). SlVGOPs e seus usos e aplicaçõessão descritos em, por exemplo, pedidos de patente publicados U.S. Nos.2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614,2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028,2005/0202534, e 2005/0238646, e membros da família de patentes relacionadasdos mesmos, todos sendo aqui incorporados por referência em suas totalidades.

A capacidade de ligação de um anticorpo da invenção pode sermedição pelos seguintes métodos: análise de Biacore, teste imunossorventeligado a enzima (ELISA), cristalografia de raios-X, análise de seqüência emutagenese de varredura como descrito nos exemplos abaixo, e outrosmétodos que são bem conhecidos na técnica. A capacidade de um anticorpoda invenção para neutralizar e/ou inibir uma ou mais atividades associadascom GDF-8 pode ser medição pela seguinte lista não limitativa de métodos:testes para medir a proliferação de uma linhagem de célula dependente deGDF; testes para medir a expressão de polipeptídeos mediados por GDF-8;testes medindo a atividade de moléculas de sinalização a jusante, testestestando a eficiência de um anticorpo da invenção para evitar distúrbiosmusculares em um modelo de animal relevante; testes como descritos nosexemplos abaixo; e outros testes que são bem conhecidos na técnica.

Um outro aspecto da invenção prove um método de selecionaranticorpos capazes de ligar GDF-8 e neutralizar e/ou inibir uma ou maisatividades associadas com GDF-8. O método compreende:

a) obter uma pluralidade de anticorpos com GDF-8;

b) escolher anticorpos que ligam a GDF-8;

c) testar a capacidade de escolher anticorpos para evitar GDF-8 de ligar no receptor de GDF-8; e

d) selecionar anticorpos capazes de prevenir GDF-8 de se ligarpara seu receptor.

Os anticorpos anti-GDF-8 da invenção também são utilizáveispara isolar, purificar, e/ou detectar GDF-8 em sobrenadantes, lisadoscelulares, ou em uma superfície celular. Anticorpos descritos nesta invençãopodem ser usados diagnosticamente para monitorar os níveis de proteína deGDF-8 como parte de um procedimento de teste clínico. Adicionalmente, os anticorpos da invenção podem ser usados nos tratamentos requerendo aneutralização e/ou inibição de uma ou mais atividades associadas com GDF-8, por exemplo, tratamentos para ALS e outras patologias relacionadas aomúsculo. A presente invenção também prove polinucleotídeos e polipeptídeosisolados e purificados novos relacionados com os anticorpos novos dirigidoscontra GDF-8 humano. Os genes, polinucleotídeos, proteínas, e polipeptídeosda presente invenção incluem, mas não são limitados a anticorpos murinos ehumanizados para GDF-8 (por exemplo, RK35) e variantes dos mesmos.

D. Ácidos nucleicos, clonagem, e sistemas de expressão

A presente invenção ainda prove ácidos nucleicos isolados epurificados codificando anticorpos da presente invenção. Ácidos nucleicos deacordo com a presente invenção podem compreender DNA ou RNA e podemser totalmente ou parcialmente sintéticos. Referencia para seqüências denucleotídeo, como aqui especificado, engloba moléculas de DNA com asseqüências especificadas ou equivalentes genômicos, assim como moléculasde RNA como as seqüências especificadas em que U é substituído para T,salvo se o contexto requerer em contrário.

Por exemplo, a invenção prove polinucleotídeos purificados eisolados codificando a região variável de um anticorpo murino para GDF-8que modula uma ou mais atividades associadas com GDF-8 (por exemplo,neutraliza a bioatividade de GDF-8) (RK35), e uma versão humanizada deRK35. As seqüências de DNA preferidas da invenção incluem cDNAgenômico, e seqüências de DNA quimicamente sintetizadas.

As seqüências de nucleotídeo da invenção incluem as quecodificam as regiões variáveis de cadeia leve de camundongo RK35especificadas em SEQ I NO: 4, incluindo as que codificam uma seqüêncialíder precedendo a seqüência de região variável de cadeia leve, por exemplo, aseqüência de nucleotídeo especificada como SEQ ID NO: 30 (nucleotídeos 1-60 correspondem à seqüência líder, e nucleotídeos 61-381 correspondem aSEQ ID NO: 4). As seqüências de nucleotídeo da invenção também incluemas que codificam a região variável de cadeia pesada de RK35 especificada emSEQ ID NO: 2, incluindo as que codificam a região de seqüência líderprecedendo a região variável de cadeia pesada, por exemplo, a seqüência denucleotídeo especificada como SEQ ID NO: 28 (nucleotídeos 1-57corresponde a seqüência líder, e nucleotídeos 58-405 correspondem a SEQ IDNO: 2). As seqüências de nucleotídeo da invenção também incluemseqüências humanizadas das regiões variáveis de cadeia leve e pesada, comoas especificadas em SEQ ID NOs: 6 e 8, respectivamente. Os polinucleotídeosda presente invenção também incluem os polinucleotídeos que hibridizam sobcondições estringentes para as seqüências de ácido nucleico especificadas emSEQ ID NOs :2, 4, 6, e 8, e complementos das mesmas, e/ou codificapolipeptídeos que retém a atividade biológica substancial (isto é, fragmentosativos) nas regiões variáveis. Os polinucleotídeos da presente invençãotambém incluem porções contínuas das seqüências especificadas em SEQ IDNOs: 2, 4, 6, e 8, compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos.

A seqüência de aminoácidos das cadeias leves variáveis deRK35 de camundongo é especificada em SEQ ID NO: 5. Um exemplo de umaseqüência de aminoácidos do domínio de cadeia leve variável de camundongoRK35 precedida por uma seqüência líder é especificado como SEQ ID NO:31. A seqüência de aminoácidos das cadeias pesadas variáveis de RK35 éespecificada em SEQ ID NO: 3. Um exemplo de uma seqüência deaminoácidos do domínio de cadeia pesada variável de camundongo RK35precedida por uma seqüência líder é especificado como SEQ ID NO: 29. Asseqüências de aminoácido de cadeias leve e pesada variáveis humanizadas sãoespecificadas em SEQ ID NOs: 7 e 9, respectivamente. As seqüências deaminoácido das CDRs contidas dentro das cadeias pesadas de camundongoRK35 são especificadas em SEQ ID NOs: 10-12 e 20-22. As seqüências deaminoácidos das CDRs contidas dentro das cadeias leves de camundongoRK35 são especificadas em SEQ ID NOs: 13-15e23-25. Os polipeptídeos dapresente invenção também incluem porções contínuas de qualquer uma dasseqüências substancialmente especificadas em SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 10-15,e 20-25 compreendendo pelo menos 5 aminoácidos consecutivos. Umpolipeptídeo preferido da presente invenção inclui qualquer porção contínua de qualquer seqüência substancialmente especificada em SEQ ID NOs: 3, 5,7, 9, e 10-15 retendo atividade biológica substancial de um anticorpo dainvenção. Além disso, para os polinucleotídeos descritos acima, a presenteinvenção também inclui os polinucleotídeos que codificam as seqüências deaminoácidos substancialmente especificadas em SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, e 10-15ou uma porção contínua da mesma, e que diferente dos polinucleotídeos descritosacima somente devido à degenerescência bem conhecida do código genético.

Os polinucleotídeos isolados da presente invenção podem serusados como sondas de hibridização e iniciadores para identificar e isolar ácidosnucleicos tendo seqüências idênticas a ou similares às codificando ospolinucleotídeos descritos. Os polinucleotídeos isolados deste modo podem serusados, por exemplo, para produzir anticorpos contra GDF-8 ou outros membrosda família TGF-P ou para identificar células expressando estes anticorpos.Métodos de hibridização para identificar e isolar ácidos nucleicos incluem reaçãode cadeia de polimerase (PCR), hibridizações Southern, hibridização in situ ehibridização Northern, e são bem conhecidos dos versados na técnica.

As reações de hibridização podem ser realizadas sob condiçõesde estringências diferentes. A estringência de uma reação de hibridizaçãoinclui a dificuldade com que quaisquer duas moléculas de ácido nucleico irãohibridizar uma com a outra. Preferivelmente, cada polinucleotídeohibridizando hibridiza em seu polinucleotídeo correspondente sob condiçõesde estringência reduzida, mais preferivelmente as condições estringentes, e omais preferivelmente condições altamente estringentes. Exemplos decondições de estringência são mostrados na tabela 3 abaixo: condiçõesaltamente estringentes são as que são pelo menos tão estringentes como, porexemplo, condições A-F; condições estringentes são pelo menos comoestringentes como, por exemplo, condições G-L; e condições de estringênciareduzida são pelo menos tão estringentes como, por exemplo, condições M-R.

Tabela 3

<table>table see original document page 57</column></row><table>'O comprimento do híbrido é que antecipado para a (s) região (ões) hibridizada(s) dospolinucleotídeos de hibridização. Quando hibridizando um polinucleotídeo em umpolinucleotídeo alvo de seqüência desconhecida, o comprimento híbrido é consideradocomo sendo o do polinucleotídeo de hibridização. Quando os polinucleotídeos deseqüência conhecida são hibridizados, o comprimento híbrido pode ser determinado poralinhamento das seqüências dos polinucleotídeos e identificando a região ou regiões decomplementaridade de seqüência ótima.

2SSPE (lxSSPE é 0,15M de NaCl, 10 mM de NaH2P04, e l,25mM de EDTA, pH 7,4)pode ser substituído para SSC (lxSSC é 0,15M de NaCl e 15mM de citrato de sódio) nostampões de hibridização e de lavagem; as lavagens são realizadas durante 15 minutosdepois a hibridização é completada. Tb* - Tr*: A temperatura de hibridização parahíbridos antecipada como sendo menor do que 50 pares de base em comprimento deve serde 5-10 °C menos que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido, onde Tm é determinado deacordo com as seguintes equações. Para híbridos menores do que 18 base pares emcomprimento, Tm(°C) = 2(# de bases A + T) + 4(# de bases G + C). Para híbridos entre 18e 49 pares de base de comprimento, Tm(°C) = 81,5 + 16,6(logi0Na+) + 0,41 (%G + C) -(600/N), onde N é o número de bases no híbrido, e Na+ é a concentração de íons de sódiono tampão de hibridização (Na+ para IX SSC = 0,165 M).

Exemplos adicionais de condições de estringência para hibridização de polinucleotídeo sãoprovidos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulos 9 & 11,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), e Ausubel et al,eds., Current Protocols in Molecular Biology, sects. 2,10 & 6,3-6,4, John Wiley & Sons,Inc. (1995), incorporado aqui por referência.

Os polinucleotídeos isolados da presente invenção podem serusados como sondas de hibridização e iniciadores para identificar e DNAsisolados tendo seqüências codificando variantes alélicas dos polinucleotídeosdescritos. Variantes alélicas são formas alternativas naturalmente ocorrendodos polinucleotídeos descritos que codificam polipeptídeos que são idênticosou tem similaridade significante para os polipeptídeos codificados pelospolinucleotídeos descritos. Preferivelmente, variantes alélicas tem pelo menos90% de identidade de seqüência (mais preferivelmente, pelo menos 95% deidentidade; o mais preferivelmente, pelo menos 99% de identidade) com ospolinucleotídeos descritos.

Os polinucleotídeos isolados da presente invenção tambémpodem ser usados como sondas de hibridização e iniciadores para identificar eisolar DNAs tendo seqüências codificando polipeptídeos homólogos para ospolinucleotídeos descritos. Estes homólogos são polinucleotídeos epolipeptídeos isolados de uma espécie diferente da dos polipeptídeos epolinucleotídeos descritos, ou dentro de uma mesma espécie, mas comsimilaridade de seqüência significante para os polinucleotídeos epolipeptídeos descritos. Preferivelmente, polinucleotídeos homólogos tempelo menos 50% de identidade de seqüência (mais preferivelmente, pelomenos 75% de identidade; o mais preferivelmente, pelo menos 90% deidentidade) com os polinucleotídeos descritos, enquanto o polipeptídeohomólogo tem pelo menos 30% de identidade de seqüência (maispreferivelmente, pelo menos 45% de identidade; o mais preferivelmente, pelomenos 60% de identidade) com os anticorpos/ polipeptídeos descritos.Preferivelmente, os homólogos dos polinucleotídeos e polipeptídeos descritossão os isolados de espécies de mamíferos.

Os polinucleotídeos isolados da presente invenção podemtambém ser usados como sondas de hibridização e iniciadores para identificarcélulas que expressam os anticorpos da presente invenção e as condições nasquais eles são expressados.

Além disso, os polinucleotídeos isolados da presente invençãopodem ser usados para alterar (isto é, melhorar, reduzir ou modificar) aexpressão dos genes correspondentes aos polinucleotídeos da presenteinvenção em uma célula ou organismo. Estes "genes correspondentes" são asseqüências de DNA genômicas da presente invenção que são transcritas paraproduzir os mRNAs dos quais os polinucleotídeos da presente invenção sãoderivados.

A presente invenção também prove construções na forma deplasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou de expressão quecompreendem pelo menos um ácido nucleico da invenção como acima.

Os polinucleotídeos isolados da presente invenção podem seroperativamente ligados a uma seqüência de controle de expressão para aprodução recombinante dos polipeptídeos da presente invenção. Além disso,um versado na técnica irá reconhecer que os polinucleotídeos da invençãopodem ser ligados operativamente a seqüências de nucleotídeos bemconhecidas codificando a região constante de vários isotipos de anticorpos.Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção que codifica uma região (ões)variável (eis) de cadeia leve da invenção (por exemplo, a seqüênciaespecificada em SEQ ID NOs: 4 ou 8) pode ser ligado operativamente a umaseqüência de nucleotídeos que codifica a região constante (ou derivados damesma) tanto de uma cadeia leve k como cadeia leve X de modo que aexpressão dos nucleotídeos ligados irá resultar em uma cadeia leve kappa oulambda completa com uma região variável que liga especificamente a eneutraliza GDF-8. Similarmente, um polinucleotídeo da invenção que codificauma região variável de cadeia pesada da invenção (por exemplo, a seqüênciaespecificada em SEQ ID NOs: 2 ou 6) pode ser ligado operativamente a umaseqüência de nucleotídeos que codifica a região constante de um isotipo decadeia pesada (ou derivados do mesmo), por exemplo, IgM, IgD, IgE, IgG eIgA. Métodos gerais para expressar proteínas recombinantes são bemconhecidos na técnica. Estas proteínas recombinantes podem ser expressadasna forma solúvel para uso no tratamento de distúrbios relacionados àatividade de GDF-8, por exemplo, distúrbios degenerativos musculares eósseos.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podemconter seqüências adicionais, como seqüências que regulam a replicação dovetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação), seqüênciasde etiqueta como histidina, e genes marcadores selecionáveis. O genemarcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais ovetor foi introduzido. Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionávelconfere resistência a fármacos, como G418, higromicina ou metotrexato, emuma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido. Genes marcadoresselecionáveis preferidos incluem o gene diidrofolato redutase (DHFR) (parauso em células hospedeiras dhfr com seleção/ amplificação de metotrexato) eo gene neo (para seleção de G418).Vetores apropriados, contendo seqüências regulatóriasapropriadas, incluindo seqüências de promotores, seqüências de terminadores,seqüências de poliadenilação, seqüências melhoradoras, genes marcadores eoutras seqüências como apropriado, podem ser tanto escolhidos ouconstruídos. Os vetores podem ser plasmídeos ou virais, por exemplo, fago,ou fagomídeo, como apropriado. Para outros detalhes ver, por exemplo,Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a. ed., Sambrook et al., ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989. Muitas técnicas e protocolosconhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparaçãode construções de ácidos nucleicos, mutagênese, seqüenciamento, introduçãode DNA em células e expressão de genes, e análises de proteínas, sãodescritos em detalhes em Current Protocols in Molecular Biology, 2a ed.,Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992.

A presente invenção também prove uma célula hospedeira quecompreende uma ou mais construções como acima. Um ácido nucleicocodificando qualquer domínio de CDR (Hl, H2, H3, LI, L2 ou L3), VH ouVL, ou fragmento de ligação de antígeno como provido aqui, forma umaspecto da presente invenção.

A presente invenção também inclui um método para produzirum peptídeo expressando a proteína do ácido nucleico de codificação em umacélula hospedeira. A expressão pode ser obtida cultivando células hospedeirasrecombinantes contendo o ácido nucleico em condições apropriadas.

Fragmentos de anticorpos específicos, domínios de VH e/ouVL, e moléculas de ácido nucleico de codificação e vetores de acordo com apresente invenção podem ser providos isolados e purificados, por exemplo, deseu ambiente natural, na formas substancialmente pura ou homogênea, ou, nocaso de ácidos nucleicos, livres ou substancialmente livres de ácidosnucleicos ou genes de origem diferente da seqüência codificando umpolipeptídeo com a função requerida.Várias linhagens de células incluem células hospedeirasapropriadas para expressão recombinante dos polipeptídeos e anticorpos dapresente invenção. Linhagens de células hospedeiras de mamíferos, porexemplo, células COS, células CHO, célula 293T, células A431, células 3T3,células CV-1, células HeLa, células L, células BHK21, células HL-60, célulasU937, células HaK, células Jurkat, bem como cepas de células derivadas decultura in vitro de tecidos primários e explantes primários. Estas célulashospedeiras também permitem a emenda dos polinucleotídeos da invençãoque consistem de DNA genômico.

Além disso, pode ser possível produzir recombinantemente ospolipeptídeos e anticorpos da presente invenção em eucariotos inferiorescomo levedura ou em procariotos. Cepas de leveduras potencialmenteapropriadas incluem cepas de Saccharomyces cerevisiae,

Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, e cepas de Cândida. Cepasbacterianas potencialmente apropriadas incluem Escherichia coli, Bacillussubtilis e Salmonella typhimurium. Se os polipeptídeos da presente invençãosão produzidos em leveduras ou bactérias, pode ser necessário modificar osmesmos, por exemplo, por fosforilação ou glicosilação de sítios apropriados,a fim de obter proteínas funcionais. Estas fixações covalentes podem serrealizadas usando métodos químicos ou enzimáticos bem conhecidos.

Os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção tambémpodem ser recombinantemente produzidos ligando operativamente ospolinucleotídeos isolados da presente invenção a seqüências de controleapropriadas em um ou mais vetores de expressão de insetos, como vetores de baculovírus, e empregando um sistema de expressão de célula de inseto.Materiais e métodos para sistemas de expressão de baculovírus/Sf9 estãocomercialmente disponíveis na forma de kit (por exemplo, o kit MAXBAC®,Invitrogen, Carlsbad, CA).

Após expressão recombinante nas células hospedeirasapropriadas, os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção podem serpurificados do meio de cultura ou extratos de células usando processos depurificação bem conhecidos, como filtração de gel e cromatografia demudança iônica. A purificação também pode incluir cromatografia deafinidade com agentes que ligam, como se sabe, os polipeptídeos e anticorposda presente invenção. Estes processos de purificação também podem serusados para purificar os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção defontes naturais.

Além disso, os polipeptídeos e anticorpos da presente invençãopodem ser expressados recombinantemente em uma forma que facilita apurificação. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser expressados comoproteína de ligação a maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST) outioredoxin (TRX). Kits para expressão e purificação destas proteínas de fusãoestão comercialmente disponíveis de New England BioLabs (Beverly, MA),Pharmacia (Piscataway, NJ), e Invitrogen, respectivamente. Os polipeptídeose anticorpos da presente invenção também podem ser etiquetados com umepítopo pequeno e subseqüentemente identificados ou purificados usando umanticorpo específico para o epítopo. Um epítopo preferido é o epítopo FLAG,que está comercialmente disponível de Eastman Kodak (New Haven, CT).

Os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção tambémpodem ser produzidos por síntese química convencional conhecida. Métodospara sintetizar quimicamente os polipeptídeos e anticorpos da presenteinvenção são bem conhecidos dos versados na técnica. Os polipeptídeos eanticorpos quimicamente sintéticos podem possuir propriedades biológicasem comum com os polipeptídeos e anticorpos purificados naturais, e, assim,podem ser empregados como substitutos biologicamente ativos ouimunológicos para os polipeptídeos e anticorpos naturais.

Um outro aspecto da presente invenção prove uma célulahospedeira compreendendo ácidos nucléicos, polipeptídeos, vetores, ouanticorpos e fragmentos dos mesmos como descrito aqui. Um outro aspectoainda prove um método compreendendo introduzir um ácido nucleico dainvenção em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquertécnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas apropriadas podemincluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação,transfecção e transdução mediadas por lipossoma usando um retrovírus ou umoutro vírus, por exemplo, vacínia ou, para células de inseto, baculovírus. Paracélulas bacterianas, as técnicas apropriadas podem incluir transformação,eletroporação e infecção com cloreto de cálcio, usando bacteriófago.

A introdução de ácidos nucleicos pode ser seguidaprovocando-se ou permitindo a produção a partir do ácido nucleico, porexemplo, cultivando as células hospedeiras nas condições apropriadas paraexpressão de genes. Estas condições são bem conhecidas na técnica.III. Métodos para tratar, melhorar, prevenir e inibir o progresso de distúrbiosósseos, de adipose, do metabolismo de glicose, de insulina e musculares

O envolvimento de GDF-8 em ALS, e a descoberta dos novosanticorpos da invenção, possibilitam métodos para tratar, aliviar e melhorar osdistúrbios associados a GDF-8, por exemplo, distúrbios musculares,distúrbios neuromusculares, distúrbios degenerativos dos ossos, distúrbiosósseos metabólicos ou induzidos, distúrbios do metabolismo de glicose,distúrbios de adipose, e distúrbios relacionados a insulina. Além disso, osanticorpos permitem diagnosticar, prognosticar e monitorar o progresso dedistúrbios ósseos, de adipose ou de insulina medindo o nível de GDF-8 emuma amostra biológica. Em particular, os anticorpos da invenção podem serusados para tratar um indivíduo com ALS ou outro distúrbio muscular, ou emum método para distingui se um paciente está sofrendo a ALS ou de um outrodistúrbio muscular.

Os anticorpos e outras moléculas da presente invenção sãoutilizáveis para prevenir, diagnosticar, ou tratar vários distúrbios médicos emhumanos ou animais. Os anticorpos podem ser usados para inibir ou reduziruma ou mais atividades associadas com GDF-8. Mais preferivelmente, osanticorpos inibem ou reduzem uma ou mais das atividades de GDF-8 comrelação a atividades de GDF-8 não ligadas. Em determinadas formas derealização, a atividade de GDF-8, quando ligado por um ou mais anticorposanti-GDF-8 é inibida em pelo menos 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82,84, 86 ou 88%, mais preferivelmente pelo menos 90, 91, 92, 93 ou 94%, eainda mais preferivelmente pelo menos 95% a 100% com relação a umaproteína de GDF-8 madura que não está ligada por um ou mais dos anticorposanti-GDF-8. A inibição ou neutralização da atividade de GDF-8 pode sermedida, por exemplo, em testes do gene repórter pGL3(CAGA)]2 (RGA)como descrito em Thies et al., supra, e em testes do receptor ActRIIB comoilustrado nos exemplos.

Os distúrbios médicos diagnosticados, prognosticados,monitorados, tratados, melhorados ou prevenidos por anticorpos GDF-8 sãodistúrbios associados a GDF-8, por exemplo, distúrbios musculares ouneuromusculares incluindo, por exemplo, distrofia muscular (MD; incluindodistrofia muscular de Duchenne), esclerose lateral amiotrófíca (ALS), atrofiamuscular, atrofia de órgãos, fraqueza, síndrome do túnel carpal, doençapulmonar obstrutiva congestiva, sarcopenia, caquexia, e outras síndromes deenfraquecimento muscular (por exemplo, causadas por outras doenças oucondições). Além disso, outros distúrbios médicos que podem serdiagnosticados, prognosticados, monitorados, tratados, melhorados ouprevenidos pelos anticorpos GDF-8 são distúrbios de tecidos adiposos comoobesidade, diabetes tipo 2, tolerância prejudicada a glicose, síndromesmetabólicas (por exemplo, síndrome de X), resistência a insulina induzida portrauma (como queimaduras ou desequilíbrio de nitrogênio), ou doençasdegenerativas ósseas (por exemplo, osteoartrite, osteoporose, etc). Em formasde realização preferidas, os distúrbios que são diagnosticados, prognosticados,monitorados, tratados, melhorados ou prevenidos por anticorpos GDF-8 sãodistúrbios musculares ou neuromusculares. Em uma forma de realização maispreferida, o distúrbio muscular ou neuromuscular que é diagnosticado,prognosticado, monitorado, tratado, melhorado ou prevenido por anticorposanti-GDF-8 é tanto MD como ALS. Na forma de realização mais preferida dainvenção, o distúrbio muscular ou neuromuscular que é diagnosticado,prognosticado, monitorado, tratado, melhorado ou prevenido pelosantagonistas de GDF-8 da presente invenção, por exemplo, anticorpos queinibem a atividade de GDF-8, é ALS.

Outros distúrbios médicos que podem ser diagnosticados,prognosticados, monitorados, tratados, melhorados ou prevenidos pelosantagonistas de GDF-8 são os associados com uma perda óssea, que incluiosteoporose, especialmente nos idosos e/ou mulheres na menopausa,osteoporose induzida por glucocorticóide, osteopenia, osteoartrite e fraturasrelacionadas a osteoporose. Outras doenças e distúrbios ósseos metabólicosalvos incluem baixo teor de massa óssea devido a terapia comglucocorticóide, falha gonadal prematura, supressão de androgênio,deficiência de vitamina D, hiperparatireodismo secundário, deficiênciasnutricionais, e anorexia nervosa. Os anticorpos são preferivelmente usadospara diagnosticar, prognosticar, monitorar, tratar, melhorar ou prevenir estesdistúrbios em mamíferos, particularmente em humanos.

Os anticorpos da presente invenção são administrados emquantidades terapeuticamente eficazes. Geralmente, uma quantidadeterapeuticamente eficaz pode variar com a idade do indivíduo, condição eseco, bem como a severidade da condição médica do indivíduo. A dosagempode ser determinada por um clínico e ajustada, como necessário, para seadequar aos efeitos observados do tratamento. A toxicidade e eficáciaterapêutica destes compostos podem ser determinadas por procedimentosfarmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, porexemplo, determinando o LD5o (a dose letal em 50% de uma população) e oED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% de uma população). A relaçãode dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos, isto é o LD50/ED50, é o índiceterapêutico, e anticorpos demonstrando grandes índices terapêuticos sãopreferidos.

Os dados obtidos de testes de cultura de células e estudos emanimais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para usoem humanos. A dosagem destes compostos está preferivelmente em umafaixa de concentrações circulantes que incluem ED50 com pequena ounenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro de uma faixa dependendoda forma de dosagem e da via de administração. Para qualquer anticorpousado na presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimadainicialmente a partir de testes de cultura de células. A dose pode serformulada em modelos animais para obter uma faixa de concentração deplasma circulante que inclui o IC50 (por exemplo, a concentração do anticorpode teste que obtém uma inibição meio-máxima de sintomas ou inibição meio-máxima de inibição de atividade biológica). Os níveis no plasma podem sermedidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho. Osefeitos de qualquer dosagem particular podem ser monitorados por umbioteste apropriado. Exemplos de biotestes apropriados incluem, mas nãoestão limitados a testes de replicação de DNA, testes baseados em transcrição,testes de ligação de proteína /receptor de GDF-8, testes de creatina quinase,testes baseados na diferenciação de preadipócitos, testes baseados na absorçãode glicose em adipócitos, e testes imunológicos.

Geralmente, as composições são administradas de modo queos anticorpos ou seus fragmentos de ligação são dados em uma dose de 1ug/kg a 150 mg/kg, 1 fig/kg a 100 mg/kg, 1 jLig/kg a 50 mg/kg, 1 ug/kg a 20mg/kg, 1 ug/kg a 10 mg/kg, 1 ug/kg a 1 mg/kg, 10 ug/kg a 1 mg/kg, 10 ug/kga 100 ug/kg, 100 ug a 1 mg/kg e 500 ug/kg a 1 mg/kg. Preferivelmente, osanticorpos são dados como uma dose de bolo para maximizar os níveiscirculantes de anticorpos para a maior extensão de tempo após a dose. Infusãocontínua também pode ser usada antes, após ou em lugar da dose de bolo.IV. Métodos para identificar agentes terapêuticos.

Ainda um outro aspecto da invenção prove um método paraidentificar agentes terapêuticos utilizável no tratamento de distúrbiosmusculares, por exemplo, metabolismo de glicose, adipose, e ósseos. Testesde triagem apropriados, por exemplo, testes baseados em ELISA, sãoconhecidos na técnica. Neste teste de triagem, uma primeira mistura deligação é formada combinando-se um anticorpo da invenção e seu ligando,GDF-8, e a quantidade de ligação entre o ligando e o anticorpo na primeiramistura de ligação (M0) é medida. Uma segunda mistura de ligação também éformada combinando o anticorpo, o ligando e um composto ou agente a sertriado, e a quantidade de ligação entre o ligando e o anticorpo na segundamistura de ligação (Mi) é medida. As quantidades de ligação na primeira esegunda misturas de ligação são então comparadas, por exemplo, calculando-se a relação Mi/M0. Considera-se que o composto ou agente é capaz de inibira atividade de GDF-8 se um decréscimo em ligação na segunda mistura deligação, como comparada à primeira mistura de ligação, for observado (isto é,Mi/Mo < 1). A formulação e otimização das misturas de ligação está dentro donível dos versados na técnica; as misturas de ligação também podem contertampões e sais necessários para melhorar ou otimizar a ligação, e outros testesde controle podem ser incluídos no teste de triagem da invenção.

Os compostos verificados reduzirem a ligação anticorpo-ligando em pelo menos cerca de 10% (isto é, Mi/M0 < 0,9), preferivelmentemais do que cerca de 30%, podem assim ser identificados e então, sedesejado, secundariamente triados para a capacidade de inibir a atividade deGDF-8 em outros testes como o teste de ligação de ActRIIB, ou outros testesin vivo e baseados em células como descrito nos exemplos ou bem conhecidosna técnica.

V. Moléculas pequenas

A inibição da atividade de GDF-8 em um organismo (ouindivíduo) afetado com (ou em risco para) um distúrbio associado a GDF-8,ou em uma célula do organismo envolvido nestes distúrbios, também pode serobtida através do uso de moléculas pequenas antagonistas (geralmentemoléculas pequenas orgânicas) que antagonizam, isto é, inibem a atividade deGDF-8. Novas moléculas pequenas antagonísticas podem ser identificadaspelos métodos de triagem descritos acima e podem ser usadas nos métodos detratamento da presente invenção descritos aqui.

Inversamente, o aumento da atividade de GDF-8 em umorganismo (ou indivíduo) afligido com (ou em risco para) um distúrbiorelacionado a expressão e/ou atividade de GDF-8 diminuída ou um distúrbiorelacionado a níveis de GDF-8 diminuídos também pode ser obtido através douso de moléculas pequenas (geralmente moléculas pequenas orgânicas) queagonizam, isto é, melhoram a atividade de GDF-8. As novas moléculaspequenas agonísticas podem ser identificadas pelos métodos de triagemdescritos acima e podem ser usadas nos métodos de tratamento da presenteinvenção descritos aqui.

VI. Métodos para diagnosticar, prognosticar e monitorar o progresso dedistúrbios ósseos, de adipose, de metabolismo de glicose, e musculares

Além de tratar, por exemplo, distúrbios musculares, ósseos, demetabolismo de glicose, e de adipose, a presente invenção prove métodospara diagnosticar estes distúrbios detectando a diminuição ou aumento deGDF-8 em uma amostra biológica, por exemplo, soro, plasma, fluido delavagem broncoalveolar, catarro, biópsias (por exemplo, de músculo), etc."Diagnóstico" ou "diagnosticar" significa identificar a presença ou ausênciade uma condição patológica. Métodos de diagnóstico envolvem detectar apresença de GDF-8, por exemplo, determinando uma quantidade de teste depolipeptídeo de GDF-8 em uma amostra biológica de um indivíduo (humano ou mamífero não humano), e comparando a quantidade de teste com uma quantidade ou faixa normal (por exemplo, uma quantidade ou faixa de um indivíduo (s) que se sabe não sofre deste distúrbio) para o polipeptídeo de GDF-8. Embora um método de diagnóstico particular não possa prover um diagnóstico definitivo de ALS ou outros distúrbios associados a GDF-8, ele é suficiente se o método prover uma indicação positiva que ajuda em diagnose.

A presente invenção também prove métodos para prognosticar ALS ou outros distúrbios musculares, ou por exemplo, distúrbios ósseos, de metabolismo de glicose e de adipose detectando regulação positiva de GDF-8. "Prognóstico" ou "prognosticar" significa prever o provável desenvolvimento e/ou severidade de uma condição patológica. Métodos de prognóstico envolvem determinar a quantidade de teste de GDF-8 em uma amostra biológica de um indivíduo, e comparar a quantidade de teste em uma quantidade ou faixa de prognóstico (por exemplo, uma quantidade ou faixa de indivíduos com severidades variadas de, por exemplo, ALS) para GDF-8. Várias quantidades de GDF-8 em uma amostra de teste são consistentes com certos prognósticos para ALS ou outros distúrbios associados a GDF-8. A detecção de uma quantidade de GDF-8 em um nível de prognóstico particular prove um prognóstico para o indivíduo.

A presente invenção também prove métodos para monitorar o curso de ALS ou outros distúrbios associados a GDF-8 detectando a regulação positiva ou regulação negativa de GDF-8. Os métodos de monitoração envolvem a determinação das quantidades de teste de GDF-8 em amostras biológicas tomadas de um indivíduo em um primeiro e segundo tempo, e comparando as quantidades. Uma mudança na quantidade de GDF-8 entre o primeiro e segundo tempo indica uma mudança no curso de, por exemplo, severidade de ALS ou outros distúrbios associados a GDF-8. Um versado na técnica irá reconhecer que em distúrbios associados a GDF-8similares a ALS, por exemplo, onde um aumento na massa muscular é desejável, um decréscimo na quantidade de GDF-8 e/ou atividade de GDF-8 entre o primeiro e segundo tempo indica remissão do distúrbio, e um aumento na quantidade indica progressão do distúrbio. Estes testes de monitoração também são utilizáveis para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica particular (por exemplo, atenuação e/ou reversão da doença) em pacientes sendo tratados para ALS ou outros distúrbios associados a GDF-8.

Os anticorpos da presente invenção podem ser usados para diagnóstico, prognóstico ou monitoração detectando a presença de GDF-8 in vivo ou in vitro. Os métodos de detecção são bem conhecidos na técnica e incluem ELISA, radioimunoteste, imunoblot, Western blot, imunofluorescência, imunoprecipitação, e outros técnicas comparáveis. Os anticorpos podem ainda ser providos em um kit de diagnóstico que incorpora uma ou mais destas técnicas para detectar GDF-8. Este kit pode conter outros componentes, embalagem, instruções, ou outro material para auxiliar na detecção da proteína e uso do kit.

Quando os anticorpos são destinados para fins de diagnóstico, prognóstico ou monitoração, pode ser desejável modificar os mesmos, por exemplo, com um grupo de ligandos (como biotina) ou um grupo marcador detectável (como um grupo fluorescente, um radioisótopo ou uma enzima). Se desejado, os anticorpos (se policlonais ou monoclonais) podem ser rotulados usando técnicas convencionais. Rótulos apropriados incluem fluoróforos, cromóforos, átomos radioativos, reagentes densos de elétrons, enzimas, e ligandos tendo parceiros de ligação específicos. As enzimas são tipicamente detectadas por sua atividade. Por exemplo, peroxidase de raiz forte pode ser detectada por sua capacidade de converter tetrametilbenzidina (TMB) em um pigmento azul, quantificável com um espectrofotômetro. Outros rótulos apropriados podem incluir biotina e avidina ou estreptavidina, IgG e proteína A, e as numerosos conjugados receptor-ligando conhecidos na técnica. Outrasmudanças e possibilidades serão prontamente evidentes aos versados na técnica, e são consideradas como equivalentes dentro do escopo da presente invenção.

VIL Composições farmacêuticas e métodos de administração

A presente invenção prove composições compreendendo umantagonista de GDF-8 da invenção, isto é, polipeptídeos, polinucleotídeos, vetores, anticorpos, fragmentos de anticorpos, e moléculas pequenas. Estas composições podem ser apropriadas para uso farmacêutico e administração a pacientes. As composições compreendem tipicamente uma ou mais moléculas da presente invenção, preferivelmente um anticorpo, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os anticorpos GDF-8 da presente invenção podem ser usados in vitro, ex vivo, ou incorporados em uma composição farmacêutica quando combinados com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, soluções, tampões, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifungicos, agentes de retardo isotônicos e de absorção, e outros, que são compatíveis com a administração farmacêutica. A composição pode conter, além dos anticorpos da invenção e veículo, vários diluentes, cargas, sais, tampões, estabilizadores, solubilizadores, e outros materiais bem conhecidos na técnica. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da atividade biológica do(s) ingrediente(s) ativo(s). As características do veículo irão depender da via de administração. O uso de meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. As composições também podem conter outros compostos ativos provendo funções terapêuticas suplementares, adicionais ou melhoradas. As composições farmacêuticas também podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor junto com instruções para administração.

A composição farmacêutica da invenção pode estar na formade um lipossoma em que um anticorpo da invenção é combinado, além de outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfifáticos como lipídeos que existem na forma agregada em micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos ou camadas lamelares enquanto em solução aquosa. Lipídeos apropriados para formulação lipossomal incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfatídeos, lisolecitina, fosfolipídeos, saponina, ácidos de bile, e outros. A preparação das formulações lipossomais está entre o nível dos versados na técnica.

Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade total de cada componente ativo da composição farmacêutica ou método que é suficiente para mostrar um benefício ao paciente significativo, por exemplo, melhora de sintomas de, cura de, ou aumento na taxa de cura destas condições. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administrado sozinho, o termo refere-se ao ingrediente sozinho. Quando aplicado em uma combinação, o termo refere-se a quantidades combinadas de ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, se administrado em combinação, serialmente ou simultaneamente.

Na prática do método de tratamento ou uso da presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de, por exemplo, um anticorpo que liga a GDF-8 e interfere com a sinalização de GDF-8 é administrado em um mamífero, por exemplo, mamífero (por exemplo, um humano). Um anticorpo da invenção pode ser administrado de acordo com o método da invenção tanto sozinho como em combinação com outras terapias como agentes antiinflamatórios. Quando co-administrado com um ou mais agentes, um anticorpo da invenção pode ser administrado tanto simultaneamente com o segundo agente, como seqüencialmente, Se administrado seqüencialmente, o clínico atendente irá decidir sobre a seqüência apropriada de administração de um anticorpo da invenção emcombinação com outros agentes.

Em uma forma de realização, os anticorpos da invenção, por exemplo, composições dos mesmos, são administrados em terapia de combinação, isto é, combinados com outros agentes, por exemplo, agentes terapêuticos, que são utilizáveis para tratar condições ou distúrbios patológicos, como distúrbios musculares, distúrbios neuromusculares, distúrbios degenerativos ósseos, distúrbios ósseos metabólicos ou induzidos, distúrbios de adipose, distúrbios do metabolismo de glicose ou distúrbios relacionados a insulina, por exemplo,, bem como distúrbios alérgicos e inflamatórios. O termo "em combinação" neste contexto significa que os agentes são dados substancialmente contemporaneamente, tanto simultaneamente como seqüencialmente. Se dados seqüencialmente, no início da administração do segundo composto, o primeiro dos dois compostos é preferivelmente ainda detectável em concentrações eficazes no sítio de tratamento ou no indivíduo.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Métodos para realizar a administração são conhecidos dos versados na técnica. Também pode ser possível obter composições que podem ser administradas topicamente ou oralmente, ou que podem ser capazes de transmissão através de membranas da mucosa. A administração de um anticorpo da invenção usado em uma composição farmacêutica para praticar o método da presente invenção pode ser realizada em uma variedade de modos convencionais, como ingestão oral, inalação, injeção cutânea, subcutânea ou intravenosa.

Soluções ou suspensões usadas para aplicação intradérmica ou subcutânea incluem tipicamente um ou mais dos seguintes componentes: um diluente estéril como água para injeção, solução salina, óleos fixados, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metil parabenos;antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Estas preparações podem ser encerradas em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas de vidro ou plástico.

Composições farmacêuticas apropriadas para injeção incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, veículos apropriados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor™EL (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na extensão em que facilita a capacidade de ser aplicada por injeção. Ela deve ser estável em condições de fabricação e armazenagem e deve ser conservada contra a ação de redução da pressão intraocular contaminante de microorganismos como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e outros), e misturas apropriadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de redução da pressão intraocular de microorganismos pode ser obtida por vários agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo, parabenos,clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e outros. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol e cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearatode alumínio e gelatina.

Onde uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção é administrada, por exemplo, por injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, o agente de ligação estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, isenta de pirogênio. A preparação das soluções de proteína parenteralmente aceitáveis, tendo devida consideração a pH, isotonicidade, estabilidade, e outros, está de acordo com a compreensão do versado na técnica. Uma composição farmacêutica preferida para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea pode conter, além de agentes de ligação, um veículo isotônico como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose e injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer lactada, ou outro veículo como conhecido na técnica. A(s) composição(ões) farmacêutica(s) da presente invenção também pode(m) conter estabilizadores, conservantes, tampões, antioxidantes, ou outro aditivo conhecido dosversados na técnica.

A quantidade de um anticorpo da invenção (ou outro antagonista da invenção) na composição farmacêutica da presente invenção dependerá da natureza e severidade da condição sendo tratada, e da natureza de tratamentos anteriores sofridos pelo paciente. Por último, o clínico atendente irá decidir a quantidade de anticorpo com que tratar cada paciente individual. Inicialmente, um clínico atendente administra doses baixas de anticorpo e observa a resposta do paciente. Doses maiores de anticorpo podem ser administradas até o efeito terapêutico ótimo ser obtido para o paciente, e em que ponto a dosagem é geralmente não mais aumentada. E contemplado que as várias composições farmacêuticas usadas para praticar o método da presente invenção devem conter cerca de 0,1 fig a 50 mg de anticorpo por kg do peso corporal.

A duração da terapia usando a composição farmacêutica da presente invenção irá variar, dependendo da severidade da doença sendotratada e da condições e resposta idiossincrática potencial de cada pacienteindividual. É contemplado que a duração de cada aplicação de anticorpo será,por exemplo, por via subcutânea e, por exemplo, na faixa de uma vez porsemana. Por último, o clínico atendente irá decidir sobre a duração apropriadada terapia usando a composição farmacêutica da presente invenção.

As composições orais geralmente incluem um diluente inerteou um veículo comestível. Elas podem ser encerradas em cápsulas de gelatinaou prensadas em comprimidos. Para o fim de administração terapêutica oral, oantagonista de GDF-8 (por exemplo, anticorpo, molécula pequena, etc.) podeser incorporado com excipientes e usados na forma de comprimidos oucápsulas. Agentes de ligação compatíveis farmacêuticos, e/ou materiaisadjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos,pílulas, cápsulas, e outros podem conter qualquer um dos seguintesingredientes, ou compostos de uma natureza similar; um aglutinante comocelulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente comoamido ou lactose; um agente de desintegração como ácido algínico,Primogel™, ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésioou Sterotes™; um deslizante como dióxido de silício coloidal; um agenteadoçante como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante comohortelã-pimenta, salicilato de metila, ou aromatizante de laranja.

Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de umacomposição farmacêutica da invenção, por exemplo, um anticorpo que liga aGDF-8 e interfere com a sinalização de GDF-8, é administrada oralmente, oagente de ligação estará na forma de um comprimido, cápsula, pó, solução ouelixir. Quando administrada na forma de comprimido, a composiçãofarmacêutica da invenção pode além disso conter um veículo sólido comogelatina ou um adjuvante. O comprimido, cápsula e pó contêm de cerca de 5 a95% de agente de ligação, e preferivelmente de cerca de 25 a 90% de agentede ligação. Quando administrado na forma líquida, um veículo líquido comoágua, petrolatos de origem animal ou de planta como óleo de amendoim, óleomineral, óleo de soja ou óleo de gergelim, ou óleos sintéticos podem seradicionados (após levar em conta as alergias do paciente individual e/ou vastapopulação de indivíduos nestes veículos líquidos). A forma líquida dacomposição farmacêutica pode ainda conter solução salina fisiológica,dextrose ou outra solução de sacarídeos, ou glicóis como etileno glicol,propileno glicol ou polietileno glicol. Quando administrada na forma líquida,a composição farmacêutica contém de cerca de 0,5 a 90% em peso do agentede ligação, e preferivelmente de cerca de 1 a 50% do agente de ligação.

Para administração por inalação, um antagonista de GDF-8 éliberado na forma de uma pulverização de aerossol de um recipiente oudistribuidor pressurizado, que conte, um propelente apropriado, por exemplo,um gás como dióxido de carbono, ou um nebulizador. Conseqüentemente, oscompostos descritos aqui podem ser administrados por inalação em tecidopulmonar. O termo "tecido pulmonar" como usado aqui refere-se a qualquertecido do trato respiratório e inclui ambos o trato respiratório superior einferior, exceto quando indicado ao contrário. Um ou mais anticorpos GDF-8podem ser administrados em combinação com uma ou mais das modalidadesexistentes para tratar doenças pulmonares.

Em um exemplo, o composto é formulado para umnebulizador. Em uma forma de realização, o composto pode ser armazenadoem uma forma liofilizada (por exemplo, em temperatura ambiente) ereconstituído em solução antes da inalação.

Também é possível formular o composto para inalação usandoum dispositivo médico, por exemplo, um inalador (ver, por exemplo, patentesUS 6.102.035 (um inalador de pó) e 6.012.454 (um inalador de pó seco)). Oinalador pode incluir compartimentos separados para o composto ativo em umpH apropriado para armazenagem e um outro compartimento para um tampãoneutralizante, e um mecanismo para combinar o composto com um tampãoneutralizante imediatamente antes da atomização. Em uma forma derealização, o inalador é um inalador de dose medida.

Embora não necessário, melhoradores de liberação, comotensoativos, podem ser usados para ainda melhorar a liberação pulmonar. Um"tensoativo" como usado aqui refere-se a um composto tendo porçõeshidrofílicas e lipofílicas que promover a absorção de uma fármaco interagindocom uma interface entre duas fases imiscíveis. Os tensoativos são utilizáveiscom partículas secas por várias razões, por exemplo, redução da aglomeraçãode partículas, redução de fagocitose de macrófagos, etc. Quando copuladacom um tensoativo no pulmão, uma absorção mais eficiente do compostopode ser obtida porque os tensoativos, como DPPC, irão facilitar muito adifusão do composto. Os tensoativos são bem conhecidos na técnica eincluem, mas não estão limitados a, fosfoglicerídeos, L-alfa-fosfatidilcolinadipalmitoil (DPPC) e difosfatidil glicerol (DPPG); hexadecanol; ácidosgraxos; polietileno glicol (PEG); polioxietileno-9-; ácido palmítico; ácidooléico; trioleato de sorbitano (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxômero;éster de ácido graxo de sorbitano; trioleato de sorbitano; tiloxapol; efosfolipídeos.

A administração sistêmica também pode ser por meiostransmucosais ou transdérmicos. Por exemplo, no caso de anticorpos quecompreendem a porção Fc, as composições podem ser capazes de transmissãoatravés de membranas da mucosa (por exemplo, intestino, boca ou pulmões)pela via mediada pelo receptor FcRn (por exemplo, patente US 6.030.613).Em geral, a administração transmucosal pode ser realizada, por exemplo,através do uso de pastilhas, pulverizações nasais, inalantes, ou supositórios.Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados emungüentos, pomadas, géis, bandagens ou cremes como geralmente conhecidosna técnica. Para administração transmucosal ou transdérmica, penetrantesapropriados para a barreira para ser permeada são usados na formulação.Estes penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, porexemplo, detergentes, sais de biles, e derivados de ácido fluídico.

As composições farmacêuticas também podem consistir decomposições apropriadas para terapia de genes, isto é, composiçõescompreendidas dos polinucleotídeos descritos aqui. No caso de terapia degenes, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir, por exemplo,lipídeos, esferas de colágeno, sistemas de emulsão catiônicos, água, tampõessalinos, vetores virais, restos de quilomícron, nanopartículas poliméricas (porexemplo, gelatina-DNA ou quitosana-DNA), partículas de ouro, complexospoliméricos, lipoplexos, poliplexos, etc. (ver, por exemplo, Gardlik et al.(2005) Med. Sei. Monit. 11 (4): RA110-21).

Estabilização e Retenção

Em uma forma de realização, um anticorpo GDF-8 estáfisicamente associado com uma porção que melhora sua estabilização e/ouretenção na circulação, por exemplo, no sangue, soro, linfa, lavagembroncopulmonar ou broncoalveolar, ou outros tecidos, por exemplo, em pelomenos 1,5, 2, 5, 10 ou 50 vezes.

O antagonista da invenção pode ser preparado com veículosque protegerão contra eliminação rápida do corpo, como uma formulação deliberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberaçãomicroencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem serusados, como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico,colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos para preparação destasformulações serão evidentes aos versados na técnica. Suspensões lipossomaiscontendo um antagonista de GDF-8, por exemplo, um ou mais anticorposanti-GDF-8, também podem ser usados como veículos farmaceuticamenteaceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com os métodos conhecidosdos versados na técnica.

Por exemplo, um anticorpo GDF-8 pode ser associado com umpolímero, por exemplo, um polímero substancialmente não antigênico, comoóxidos de polialquileno ou óxidos de polietileno. Os polímeros apropriadosirão variar substancialmente em peso. Polímeros tendo pesos molecularesmédios numéricos na faixa de cerca de 200 a cerca de 35.000 (ou a cerca de1.000 a cerca de 15.000, ou a cerca de 2.000 a cerca de 12.500) pode serusado.

Por exemplo, um anticorpo GDF-8 pode ser conjugado em umpolímero solúvel em água, por exemplo, polímeros de polivinila hidrofílico,por exemplo, álcool polivinílico e polivinilpirrolidona. Uma lista nãolimitativa de tais polímeros inclui homopolímeros de oxido de polialquilenocomo polietileno glicol (PEG) ou polipropileno glicóis, polióispolioxietilenados, copolímeros dos mesmos e copolímeros em bloco dosmesmos, desde que a solubilidade em água dos copolímeros em bloco émantida. Os polímeros adicionais utilizáveis incluem polioxialquilenos comopolioxietileno, polioxipropileno, e copolímeros em bloco de polioxietileno epolioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbômeros; polissacarídeosramificados ou não ramificados, que compreendem os monômeros desacarídeos D-manose, D- e L-galactose, fucose, frutose, D-xilose, L-arabinose, ácido D-glucurônico, ácido siálico, ácido D-galacturônico, ácidoD-manurônico (por exemplo, ácido polimanurônico, ou ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glicose e ácido neuramínico incluindohomopolissacarídeos e heteropolissacarídeos como lactose, amilopectina,amido, amido de hidroxietila, amilose, sulfato de dextrano, dextrano,dextrinas, glicogênio, ou a subunidade de polissacarídeo demucopolissacarídeos de ácido, por exemplo, ácido hialurônico; polímeros deálcoois de açúcar, como polissorbitol e polimanitol; heparina, etc.

Outros compostos também podem ser fixados no mesmopolímero, por exemplo, uma citotoxina, um rótulo, ou outro agente demarcação, por exemplo, outro anticorpo GDF-8 ou um ligando nãorelacionado. Óxidos de polialquileno (PAOs) terminado em alcóxi mono-ativado, por exemplo, polietileno glicóis terminado em monometóxi(mPEGs), polímeros terminados em Q.4 alquila, e óxidos de polietileno(glicóis) bis-ativados podem ser usados para a reticulação (ver, por exemplo,patente U.S. número 5.951.974).

Em uma forma de realização, o polímero antes da reticulaçãopara o ligando não precisa ser, mas preferivelmente é, geralmente solúvel emágua. Geralmente, após a reticulação, o produto é solúvel em água, porexemplo, exibe uma solubilidade em água de pelo menos cerca de 0,01mg/ml, e mais preferivelmente pelo menos a cerca de 0,1 mg/ml, e ainda maispreferivelmente pelo menos a cerca de 1 mg/ml. Além disso, o polímero nãodeve ser altamente imunogênico na forma conjugada, nem deve possuirviscosidade que é incompatível com infusão intravenosa, aerossolizaçao, ouinjeção, se o conjugado for destinado a ser administrado por tais vias.

Em uma forma de realização, o polímero contém somente umgrupo único que é reativo. Isto ajuda a evitar a reticulação de moléculas deligando entre si. No entanto, está dentro do escopo aqui maximizar ascondições de reação para reduzir a reticulação entre as moléculas de ligando,ou para purificar os produtos de reação através de filtração em gel oucromatografia de troca iônica para recuperar os derivados substancialmentehomogêneos. Em outras formas de realização, o polímero contém dois oumais grupos reativos para o fim de ligar os ligandos múltiplos na estruturadorsal do polímero. Novamente, filtração em gel ou cromatografia de trocaiônica pode ser usada para recuperar o derivado desejado na formasubstancialmente homogênea.

O peso molecular do polímero pode estar na faixa de até cercade 500.000 D, e preferivelmente é pelo menos a cerca de 20.000 D, ou pelomenos a cerca de 30.000 D, ou pelo menos a cerca de 40.000 D. O pesomolecular escolhido pode depender do tamanho efetivo do conjugado a serobtido, a natureza (por exemplo, estrutura, como linear ou ramificada) dopolímero, e o grau de derivatização.

Uma ligação covalente pode ser usada para fixar um anticorpoGDF-8 para um polímero, por exemplo, reticulação no grupo amino N-terminal do ligando e grupos amino epsilon encontrados nos resíduos de lisinado ligando, assim como outro amino, imino, carboxila, sulfidrila, hidroxila ououtros grupos hidrofílicos. O polímero pode ser covalentemente ligadodiretamente no anticorpo GDF-8 sem o uso de um agente de reticulaçãomultifuncional (comumente bifuncional). Ligação covalente para gruposamino é obtida por produtos químicos conhecidos com base em cloretocianúrico, carbonil diimidazol, grupos reativos de aldeído (PEG alcóxido maisdietil acetila de bromoacetaldeído; PEG mais DMSO e anidrido acético, oucloreto de PEG mais o fenóxido de 4-hidroxibenzaldeído, ésteressuccinimidílicos ativados, ditiocarbonato PEG ativado, 2,4,5-triclorofenilcloroformiato ou P-nitrofenilcloroformiato PEG ativado). Osgrupos carboxila podem ser derivados por copulação PEG-amina usandocarbodiimida. Os grupos sulfhidrila podem ser derivados por copulação paraPEG maleimido substituído (por exemplo, alcóxi-PEG amina maissulfosuccinimidila 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato) (ver WO97/10847) ou PEG-maleimida). Alternativamente, grupos amino livres noligando (por exemplo, grupos amino epsilon nos resíduos de lisina) podem sertiolados com 2-imino-tiolano (reagente de Traut) e então copulados paraderivados contendo maleimida de PEG, por exemplo, como descrito emPedley et al. (1994) Br. J. Câncer 70: 1126-30.

Polímeros PEG funcionalizados que podem ser fixados em umanticorpo GDF-8 são disponíveis, por exemplo, de Shearwater Polymers, Inc.(Huntsville, AL). Tais derivados PEG comercialmente disponíveis incluem,por exemplo, amino-PEG, ésteres de aminoácido PEG, PEG-hidrazida, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, ácido PEG-propiônico,aminoácidos PEG, succinato de succinimidila PEG, propionato desuccinimidila PEG, éster succinimidílico de PEG carboximetilado, carbonatode succinimidila de PEG, ésteres succinimidílicos de PEGs aminoácidos,PEG-oxicarbonilimidazol, carbonato de PEG-nitrofenila, tresilato de PEG,éter PEG-glicidílico, PEG-aldeído, PEG vinilsulfona, PEG-maleimida, PEG-ortopiridil-dissulfeto, PEGs heterofuncionais, derivados de vinil PEG, PEGsilanos, e PEG fosfolipídeos. As condições de reação para copular estesderivados PEG podem variar dependendo do anticorpo GDF-8, o graudesejado de PEGuilação, e o derivado PEG utilizado. Alguns fatores envolvidos na escolha de derivados PEG incluem: o ponto desejado defixação (como grupos R lisina ou cisteína), estabilidade hidrolítica ereatividade dos derivados, estabilidade, toxicidade e antigenicidade daligação, apropriabilidade para análise, etc. Instruções específicas para o usode qualquer derivado particular são disponíveis do fabricante.

Os conjugados de um anticorpo GDF-8 e um polímero podemser separados dos materiais de partida não reagidos, por exemplo, porfiltração em gel ou cromatografia de troca iônica, ou outras formas decromatografia, por exemplo, HPLC. Espécies heterólogas dos conjugados sãopurificadas uma da outra do mesmo modo. Resolução de espécies diferentes(por exemplo, contendo um ou dois resíduos PEG) também é possível devidoa diferença nas propriedades iônicas dos aminoácidos não reagidos (ver, porexemplo, WO 96/34015).

Os polinucleotídeos e proteínas da presente invenção sãoesperados como demonstrando um ou mais dos usos ou atividades biológicas(incluindo os associados com testes citados abaixo) identificados aqui. Usosou atividades descritos para proteínas da presente invenção podem serprovidos por administração ou uso de tais proteínas, ou por administração ouuso de polinucleotídeos codificando tais proteínas (como, por exemplo, nasterapias de genes ou vetores apropriados para introdução de DNA).Pode ser vantajoso formular composições oral ou parenteral naforma de dosagem única para facilidade de administração e uniformidade dedosagem. A forma de dosagem única como usada aqui refere-se às unidadesfisicamente discretas apropriadas, como dosagens únicas para o indivíduo aser tratado, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada decomposto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado emassociação com o veículo farmaceuticamente requerido. A especificação paraas formas de dosagem única da invenção são ditadas por e diretamentedependentes das características singulares do composto ativo, o efeitoterapêutico particular a ser obtido, e as limitações inerentes na técnica deformular este composto ativo para o tratamento de indivíduos.

Outro aspecto da presente invenção conseqüentemente refere-se aos kits para realizar a administração dos anticorpos GDF-8 da invenção,por exemplo, com ou sem outros compostos terapêuticos, ou para usar osanticorpos anti-GDF-8 como uma ferramenta de pesquisa ou terapêutica paradeterminar a presença e/ou nível de GDF-8 em uma amostra biológica, comoum kit ELISA. Em uma forma de realização, o kit compreende um ou maisanticorpos anti-GDF-8 formulados em um veículo farmacêutico, e pelo menosum agente, por exemplo, um agente terapêutico, formulado como apropriado,em uma ou mais preparações farmacêuticas separadas.

Os exemplos a seguir são descritos para ajudar nacompreensão da invenção, mas não são destinados para, e não devem serconstruídos para, limitar o escopo da invenção de forma alguma. Os exemplosnão incluem descrições detalhadas de métodos convencionais, como formaçãode hibridoma, ELISA, testes de proliferação, análise citométrica de fluxo etécnicas de DNA recombinantes. Estes métodos são bem conhecidos dosversados na técnica.

Os conteúdos completos de todas as referências, patentes,pedidos de patentes publicados, e outros documentos de patente citados portodo este pedido são aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Criação e Identificação do anticorpo RK35 anti-GDF-8

A proteína de GDF-8 humana (GDF-8 e pró-peptídeo de GDF-8 maduros) e proteína de BMP-11 foram isoladas e caracterizadas comodescrito no pedido de patente n°. 2004/0142382.

Seis camundongos BALB/c nocaute com miostatina, do sexofeminino (8 semanas de idade; McPherron et al., supra) foram imunizados porinjeções subcutâneas com 20 ug de dímero de GDF-8 recombinante emadjuvante completo de Freund.

Várias injeções de reforço da mesma quantidade de antígenoem adjuvante incompleto de Freund foram dadas em intervalos de 2 semanase uma injeção intravenosa final (veia da cauda) de 2 ug em PBS foi dada antes da fusão. Esplenócitos de dois dos camundongos demonstrando os maisaltos títulos de anticorpos foram fusionados com células de mieloma decamundongos (acesso ATCC no. P3X63.Ag8.653) usando técnicas padrão (Oie Herzenberger (1980) Em: Mishell, B.B., Shiigi, S.M., Henry, C, Mishell,RJ. (Eds.), Selected Methods in Cellular Immunology W.H. Freemen, San Francisco, pp. 351-72). Após 10-14 dias, os sobrenadantes foram coletados etriados para produção de anticorpos anti-GDF-8 por ELISA em fase sólida ede solução (Whittemore et al., supra). Técnicas ELISA padrão e o testerepórter pGL3-(CAGA)i2 (Theis et al. (2001) Growth Factors 18: 251-59)foram usadas para determinar o IC5o para inibição da ligação de miostatina a seu receptor, ActRIIB, usando um ActRIIB-Fc quimérico gerado fusionandoo domínio extracelular do receptor ActRIIB-Fc humano com a região Fc deIgGl humana. Os hibridomas escolhidos para outros estudos foram tornadosmonoclonais por diluição limitante repetida para assegurar monoclonalidade.O anticorpo monoclonal RK35 foi selecionado para outro estudo.Exemplo 2

Anticorpo monoclonal RK35 tem alta afinidade para GDF-8 e demonstraatividade de neutralização

Exemplo 2.1: Procedimentos Experimentais

Para ELISA, GDF-8 biotinilado foi revestido durante a noite, a

4°C, em placas de microtitulação de estreptavidina de 96 cavidades (Pierce,Rockford, IL) a 1 ug/ml. Após revestir, as soluções foram removidas dascavidades, e as placas bloqueadas durante 1 hora em temperatura ambiente emsolução SuperBlock (Pierce). As placas foram enxaguadas com PBS, e 200 ulde anticorpo RK35 foram adicionados às cavidades em várias concentrações.As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 1 hora e entãolavadas com PBS. A cada cavidade, foram adicionados 100 ul de umadiluição 1:5000 de conjugado anti-huIgG-HRP (Southern Biotech,Birmingham, AL) e as placas foram incubadas em temperatura ambientedurante 1 horas. Cada placa foi lavada três vezes com PBS. O substrato TMB(100 ul) foi adicionado a cada cavidade e incubado até a revelação de cor. Areação foi interrompida pela adição de 100 ul de H2SO4 0,18 M. O sinalgerado foi medido lendo a absorbância de 450 nm usando uma leitora deplaca de microtitulação. A ligação a GDF-8 foi confirmada usando anticorpode controle de isotipo humano.

Quimeras de ActRIIB-Fc recombinante (R&D Systems,Minneapolis, MN, Cat. No. 339-RB/CF) foram revestidas em placas de testede fundo plano de 96 cavidades (Costar, NY, Cat. No. 3590) a 1 ug/ml emtampão de carbonato de sódio 0,2 M durante a noite, a 4°C. As placas foramentão bloqueadas com 1 mg/ml de albumina de soro bovino e lavadas apósprotocolo ELISA padrão. Alíquotas (100 ul) de GDF-8 biotinilado ou BMP-11 foram adicionadas à placa ELISA bloqueada em várias concentrações,incubadas durante 1 h, lavadas, e a quantidade de GDF-8 ou BMP-11 ligadofoi detectada por estreptavidina- peroxidase de raiz forte (SA-HRP, BDPharMingen, San Diego, CA, Cat. No. 13047E) seguido pela adição de TMB(KPL, Gaithersburg, MD, Cat. No. 50-76-04). Medições colorimétricas foramtomadas a 450 nm em uma leitora de microplaca Molecular Devices. Paraanalisar a atividade inibitória, RK35 foi testado em várias concentrações porpré-incubação com 20 ng/ml de GDF-8 ou 20 ng/ml de BMP-11. Apósincubação durante 1 h em temperatura ambiente, 100 ul de mistura de RK35 eGDF-8 ou BMP-11 foram adicionados à placa. A detecção e quantificação dofator ligado são descritas em Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res.Commun. 300: 965-71.

Para demonstrar a atividade de GDF-8, um teste do generepórter (RGA) foi desenvolvido usando um vetor repórter pGL3 (CAGA)i2expressando luciferase sob o controle do promotor induzido por TGF-p. OCAGA é uma seqüência respondente de TGF-P dentro do promotor do genePAI-1 induzido por TGF-p (Denner et al. (1998) EMBO J. 17: 3091-3100).

Um vetor repórter contendo 13 caixas CAGA foi feito usando o plasmídeopGL3 repórter de luciferase básico (Promega Madison, WI). A caixa TATA esítio de início de transcrição do promotor posterior maior de adenovírus (-3 5/+10) foram inseridos entre os sítios BglII e HindIII. Oligonucleotídeoscontendo 12 repetições de caixas CAGA, isto é, AGCCAGACA, foramrecombinados e clonados no sítio Xhol. A linhagem de células A204 derabdomiossarcoma humanas (ATCC HTB-82) foi transientementetransfectada com pGL3(CAGA)i2 usando reagente de transfecção FuGENE 6(Boehringer Manheim, Alemanha). Após transfecção, as células foramcultivadas em placas de 96 cavidades em meio 5 A de McCoy suplementadocom glutamina 2 mM, 100 U/ml de estreptomicina, 100 ug/ml de penicilina e10% de soro de bezerro fetal durante 16 h. As células então foram tratadascom ou sem 10 ng/ml de GDF-8 e meio 5A de McCoy com glutamina,estreptomicina, penicilina e 1 mg/ml de albumina de soro bovino, durante 6 ha 37°C. Luciferase foi quantificada nas células tratadas usando o LuciferaseAssay System (Promega). Para testar a atividade inibitória de RK35, GDF-8foi pré-incubado com o anticorpo durante 1 h e temperatura ambiente. Estamistura foi então adicionada às células transfectadas e as células foramincubadas durante 6 h a 37°C. Luciferase foi quantificada usando o Luciferase Assay System (Promega).

Exemplo 2.2: Resultados

Um anticorpo monoclonal de camundongo de alta afinidadepara miotastina foi gerado imunizando camundongos tipo nocaute com GDF-8 com GDF-8 humano recombinante purificado, que é idêntico na seqüênciade aminoácidos para miostatina de murino madura (McPherron et al., 1997).O anticorpo RK35 ligou com alta afinidade GDF-8 como testado por ELISAdireto (4 nM; FIG. IA). Um ELISA de competição foi usado para avaliar acapacidade de RK35 inibir a ligação de GDF-8 a seu receptor de altaafinidade, ActRIIB. RK35 bloqueou a ligação de GDF-8 biotinilado a ActRIIB-Fc imobilizado com um IC50 ~ 2,5 nM (FIG. 1B). ActRIIB solúveltambém bloqueou a ligação de GDF-8 a ActRIIB-Fc imobilizado apesar deque os anticorpos de controle não bloquearam a ligação. A atividade deneutralização de RK35 também foi medição usando um teste repórter baseadona célula pGL3-(CAGA)12. Neste teste, o gene luciferase foi clonado sob ocontrole do promotor respondente de GDF-8/ TGF-p e células derabdomiossarcoma A204 humanas foram transientemente transfectadas com oplasmídeo repórter. Aumentos na atividade de luciferase em células A204induzidos por GDF-8 foram bloqueados em um modo dependente da dose porRK35 (FIG. 1C). RK35 reduziu a atividade de transdução de sinal de GDF-8com um IC50 de 0,2 nM. Assim. RK35 é um novo anticorpo neutralizantemonoclonal de murino altamente potente dirigido contra GDF-8.

Exemplo 3

Atividade in vivo de RK35 em modelos de roedores do tipo selvagem e ALSExemplo 3.1: Procedimentos ExperimentaisExemplo 3.1.1: Tratamento em animais e com fármacos

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovadospelo IACUC tanto da Universidade da Pensilvânia como Wyeth.Camundongos transgênicos expressando SODG93A humano (Gurney et al.,supra) em um antecedente híbrido B6SJL (Jackson Laboratories) foramacasalados na empresa com camundongos reprodutores do sexo femininoB6SJLF1 (Kackson Laboratories). As progênies foram tríadas por PCR;camundongos negativos para o transgene foram usados como controles dotipo selvagem de uma ninhada equiparada em idade. Os camundongos foramdivididos em quatro grupos: 29 camundongos SODG93A tratados com oanticorpo RK35 anti-miostatina, 28 camundongos SODG93A tratados comsolução salina tamponada com fosfato (PBS) veículo), 23 camundongos dotipo selvagem tratados com RK35, e 23 camundongos do tipo selvagemtratados com PBS. Iniciando 28 dias após o nascimento, os camundongosforam injetados intraperitonealmente em uma base semanal, tanto comanticorpo monoclonal anti-GDF-8 RK35 como com um volume equivalentede PBS. A primeira dose foi de 40 mg/kg; as doses subseqüentes foram 20mg/kg/semana seguindo o protocolo descrito para o anticorpo JA16 anti-miostatina (Whittemore, et al., supra). 0-12 camundongos de cada grupoforam sacrificados entre 84 e 90 dias (12 semanas) de idade (média de 88dias) para avaliar a massa muscular úmida e histologia, e os camundongosrestantes foram monitorados até alcançarem o doença em estágio terminal (~134 dias), definida como uma falha para se deitar de lado à direita em 30 s deambas as posições deitadas laterais à esquerda e à direita.

Em paralelo, ratos transgênicos (58) expressando SODG93Ahumano (Howland et al., supra) em uma mistura igual de machos e fêmeasforam administrados tanto com PBS (veículo) como RK35. Dez ratos em cadagrupo foram submetidos à eutanásia em 95 dias de idade para determinar oefeito de RK35 em massa muscular úmida. Os 19 ratos restantes em cadagrupo continuaram até doença em estágio terminal. Um segundo estudousando ratos transgênicos do sexo feminino e de controle de uma ninhada dotipo selvagem foi usado para comparar aumentos do peso corporal bem comomudanças de força de agarramento através de grupos de tratamento egenótipo. Em cada estudo, os ratos foram injetados peritonealmente comRK35 a 40 mg/kg (em 6 semanas (~ 42 dias) de idade) e subseqüentementeinjetados com 20 mg/kg/semana ou veículo continuando até tanto sacrifícioem 95 dias para analisar a massa muscular, ou estágio terminal como medidopor falha de reflexo de endireitamento.

Exemplo 3.1.2: Medições do peso corporal e massa muscular

O pesos corporais iniciais foram usados para distribuiruniformemente os animais entre coortes de modo a assegurar pesos corporaismédios equivalentes no início do estudo. O início da perda de peso foiclassificado como a idade em que a primeira de três medições consecutivas deperda de corpo foi observada. A massa muscular úmida foi determinada nogastrocnêmio, no tibialis cranial, no quadríceps, e no diafragma em um pontoconsistente com o início da doença (88 dias para camundongos, 95 dias pararatos) e no estágio terminal (~ 134 dias para camundongo e ~ 128 dias pararatos). Os animais foram submetidos à eutanásia e os músculos de cadamembro foram quantitativamente dissecados e pesados; calculou-se a médiados valores das pernas direita e esquerda.

Exemplo 3.1.3: Histopatologia muscular e contagens de neurônios motores

O gastrocnêmio e o diafragma foram fixados e seccionadospara coloração H&E (Howland et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 99:1604-29). A classificação para atrofia e hipertrofia foi realizada por doispatologistas independentes, de controle "cego" para identidade da amostra. Osdiâmetros das fibras foram medidos por morfometria (Axiovision 4.3, Zeiss,Thornwood, NY) no músculo do gastrocnêmio (camundongos SODG93Atratados com PBS e RK35 e camundongos do tipo selvagem tratados comPBS) em 88 dias e estágio terminal, bem como para o músculo do diafragma(camundongos SODG93A tratados com PBS e RK35 e camundongos do tiposelvagem tratados com PBS) e estágio terminal. Três músculos por grupoforam congelados de modo rápido em isopentano resinado com gelo seco,criosseccionados em uma espessura de 8 um, e imunocoloridos usando umanticorpo anti-laminina (Sigma, St. Louis, MO; catálogo número L9393).Medições lineares do diâmetro máximo do eixo menor de pelo menosduzentas fibras foram tomadas, usando o software Zeiss Axiovision. Osdiâmetros das fibras foram colocados em intervalos de 20 um, e histogramasde freqüência foram gerados para cada grupo de músculos.

Contagens de neurônios motores foram realizadas em 3camundongos de cada grupo (tipo selvagem, SODG93A tratados com PBS eSODG93A tratados com RK35) em tanto no estágio inicial como no estágioterminal da doença (total de 18 camundongos analisados). As colunasvertebrais removidas dos camundongos decapitados foram pós-fixadas em 4%de paraformaldeído, dez cordões foram dissecados e pós-fixados durante mais24 horas em 4% de paraformaldeído. Usando a tecnologia MultiBrain™(Neurosciences Associates, Knoxville, TN), 18 medulas espinhais foramincrustadas em um bloco único, e trans-seccionadas a 50 nm no plano coronaljunto com o segmento total (~ 6 mm) do alargamento lombar. Cada sextaseção (300 fim) foi colorida com tionina NISSL para revelar corpos celulares(Bjugn (1993) Brain Res. 627: 25-33; Kieran et al. (2004) Nat. Med. 10: 402-05). As contagens foram realizadas usando duas abordagens independentes.

Primeiramente, dez seções da medula espinhal englobando L3-5 para cada um de 18 camundongos foram analisadas por um observador "cego" paraidentidade de amostra usando um Zeiss Axoplan2 a 20x e 40x. Ambos oscifres ventrais de cada seção foram contados, identificando grandes neurôniosmotores saudáveis pela presença de nucléolos visíveis como descritoanteriormente (Kieran et al., supra). Os dados resultantes foram representadoscomo o número médio de grandes neurônios motores por cifre ventral. Emsegundo lugar, as seções da região L3-L5 foram analisadasestereologicamente usando um Zeiis Axioskop2 equipado com um estágio deamostra motorizado, microcator eletrônico, e software de estereologia (StereoInvestigator (MBF Bioscience, Williston, VT), como descrito (West et al.(1991) Anat. Rec. 231: 482-97; Schmitz e Hof (2000) J. Chem. Neuroanat.20: 93-114; Schmitz e Hof (2005) Neuroscience 130: 813:31); os neurôniosa-motores foram classificados como neurônios com uma área de projeçãomáxima maior do que 300 um2.

Exemplo 3.1.4: Análises Fenotípicas

Medições de força de agarramento (Columbus Instruments,Columbus, OH) foram realizadas bi-semanalmente iniciando 28 dias após onascimento em ambos os membros frontais e traseiros de camundongostratados e de controle (n=8-24), como descrito (LaMonte et al. (2002) Neuron34: 715-24). Ratos transgênicos e do tipo selvagem foram testados para forçade agarramento dos membros dianteiros duas vezes por semana usando ummedidor de força de agarramento de rato Dunnett (MJS Technology,Stevenage, Hertfordshire, Inglaterra) na fase da doença prematura (entre 95 e100 dias após o nascimento; n=10). Os ratos também foram analisados porrotorod (Ugo Basile, Comerio, Itália) bem como monitorados paraanormalidades no modo de andar e graus de mobilidade dos membros (dadosnão mostrados).

Exemplo 3.1.5: Eletrofisiologia

Registros de eletromiografia (EMG) e análises de dados foramrealizados para grupo de genótipo e de tratamento. Ratos anestesiados comNembutal mantidos a 35-37°C da temperatura do corpo foram submetidos aagulha EMG inserindo um eletrodo de agulha monopolar concêntrico(9013R0011, Medtronic, MN, USA) no músculo do diafragma cirurgicamenteexposto até rajadas de padrão de interferência de EMG aparecerem com cadainspiração. Sinais elétricos foram adquiridos a 20 KHz com uma configuraçãoBIOPAC consistindo da Unidade de Aquisição de Dados MP150, Módulo deInterface Universal UIM100C, módulo de Eletromiografia EMG100C e osoftware Acknowledge (BIOPAC Systems Inc, Goleta, CA). Os sinais foramprimeiramente analisados para remover artefato de 60 Hz e filtrado banda depassagem entre 500 e 1000 Hz para remover artefatos de movimento devido àrespiração e para enfatizar as descargas de unidades motoras. As rajadas deEMG foram identificadas retificando o sinal, filtrando com baixa banda depassagem a 10 Hz, e então detectando os tempos em que o envelope resultantefoi maior do que seu valor médio. As rajadas que duraram menos do que 100ms não foram contadas, e períodos sem rajadas que duraram menos do que100 ms foram contados como partes das rajadas circundantes. Finalmente, ospicos no sinal não retificado foram detectados usando um conjunto de limiarde detecção de pico igual a três vezes o desvio padrão da amplitude de sinaldurante os períodos sem rajadas. Análise de rajadas de picos foram realizadascom software comum descrito por K.C. McGill (Stanford University, CA), e ataxa de pico de rajada (Hz) para cada animal computada como o númeromédio de picos por rajada dividido pela duração de rajadas média.

Exemplo 3.1.6: Análises de Dados e Estatística

Um modelo ANO VA de medições repetidas de dois fatores foiaplicado em dados do peso corporal bem como todos os dados de força deagarramento usando um procedimento misturado SAS. Um modelo linearANO VA de dois fatores foi aplicado aos dados de massa muscular usando oprocedimento SAS GLM. Os dados de eletrofisiologia foram analisados pelos dois testes-t da amostra. Para dados de contagens de neurônios motores, ummodelo linear generalizado (GLM) assumindo a distribuição Poisson foiusado. Os dados de fibras dos músculos foram analisados por ANOVAseguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. As comparaçõesforam consideradas estatisticamente significativas quando valores p forammenores do que 0,05; as comparações com 0,05 < p < 0,15 foram notadascomo tendências.

Exemplo 3.2: Resultados

Exemplo 3.2.1: Tratamento com RK35 aumentou os pesos corporais deroedores SODG93A mas não prolongou a sobrevivência

Camundongos SODG93A foram tratados com o anticorpoRK35 anti-miostatina iniciando 28 dias após o nascimento e continuando atéo doença em estágio terminal (aproximadamente 134 dias após o nascimento).O tratamento com RK35 resultou no peso corporal significativamenteaumentado de 40 a 120 dias após o nascimento comparado a camundongosSODG93A tratados com PBS. Apesar dos camundongos SODG93A tratadoscom PBS alcançarem um peso corporal máximo de 27,78 ± 0,46 g em 70 dias,camundongos tratados com RK35 alcançaram um máximo de 32,13 ± 0,48 g,um aumento relativo de 16% (FIG. 2A). Apesar de camundongos do tiposelvagem continuarem a ganhar peso por todo o estudo, ambos oscamundongos SODG93A tratados com PBS e RK35 começaram a mostrarsinais significativos de perda de peso devido à progressão da doençaaproximadamente 98 dias após o nascimento.

Ratos SODG93A transgênicos também foram tratados comanticorpo RK35, iniciando 42 dias após o nascimento e continuando até odoença em estágio terminal (~ 128 dias de idade). O tratamento com RK35anti-miostatina levou a peso corporal aumentado em ratos SODG93Acomparados a ratos tratados com PBS (FIG. 2B). Os ratos transgênicosrecebendo RK35 pesavam significativamente mais do que ratos transgênicostratados com PBS tão inicial quanto 60 dias após o nascimento (p < 0,05),correspondendo a 3 semanas após o início da dosagem. Ratos do sexomasculino tratados com RK35 alcançaram um máximo de 458,8 ± 6,5 g em96 dias, um aumento de 10% sobre ratos do sexo masculino tratados com PBSem 419,1 ± 10,7 g. Fêmeas tratadas com RK35 alcançaram um máximo de289,7 ± 9,3 g, um aumento de 15% sobre fêmeas tratadas com PBS em 252,8± 6,0 g. Ratos SODG93A tratados tanto com PBS como RK35 começaram amostrar perda de peso significativa após -112 dias devido à progressão dadoença; tratamento com RK35 não retarda o início de perda de peso.

Apesar do tratamento com RK35 levar a aumentossignificativos em peso corporal, os inventores não observaram nenhum efeitodo tratamento com RK35 sobre a sobrevivência. O tempo até o estágioterminal foi medido usando o ponto final definido de falha para se endireitarem 30 s, foi 132 ± 8 dias para camundongos SODG93A tratados com RK35(n=16), enquanto camundongos SODG93A tratados com PBS alcançaram oestágio terminal em 134 ± 7 dias (n=17). Ratos SODG93A tratados comRK35 alcançaram o estágio terminal em 125 ± 8 dias comparados a 128 ± 6dias para ratos SODG93A tratados com PBS. Nenhuma destas diferençasforam estatisticamente significativas, indicando que a inibição de miostatinanão retarda o tempo até o doença em estágio terminal em ambos os modelosde camundongo ou rato de ALS.

Exemplo 3.2.2.: Efeitos da inibição de miostatina sobre massa e forçamuscular

A fim de determinar se a inibição de miostatina diminuiu oenfraquecimento muscular, camundongos transgênicos SODG93A e do tiposelvagem de cada grupo foram sacrificados em 88 dias após o nascimento, umponto de tempo próximo ao aumento máximo no peso corporal induzido pelotratamento com RK35. Neste ponto de tempo, camundongos SODG93Atratados com PBS mostram diminuições significativas em massa muscular nogastrocnêmio, tibialis cranial e quadríceps com relação a camundongos decontrole do tipo selvagem consistentes com o doença em estágio inicial (FIG.2C). Em contraste, camundongos SODG93A tratados com RK35 exibirammelhoras estatisticamente significativas na massa muscular em todos osmúsculos examinados em comparação a camundongos SODG93A tratadoscom PBS equiparados em idade no ponto de tempo de 88 dias na faixa de ~19% a 32% (músculo gastrocnêmio, +26%; tibialis cranial, +19%, quadríceps,+32%). Embora nenhuma perda significativa de massa muscular foiobservada nos diafragmas de camundongos SODG93A tratados com PBSdurante o doença em estágio inicial; o tratamento com RK35 induziu umaumento significativo em massa neste músculo também (+21%).

Os camundongos restantes em cada coorte foram monitoradosaté o estágio terminal como definido pelo teste de reflexo de endireitamento.No estágio terminal, o enfraquecimento muscular das pernas foi observadoem ambos os camundongos SODG93A tratados com RK35 e PBS (FIG. 2E).Em contraste com as observações no tecido de camundongos de 88 dias, noestágio terminal da doença camundongos SODG93A tratados com PBSmostraram uma redução significativa na massa do músculo do diafragma comrelação a animais do tipo selvagem (FIG. 2E). No entanto, o aumentoinduzido por RK35 na massa do diafragma observado em camundongosSODG93A tratados permaneceu significativo no estágio terminal, indicandoque a inibição de miostatina diminuiu a atrofia do diafragma no camundongoSODG93A.

Os efeitos do anticorpo anti-miostatina sobre a massa musculartambém foram investigados em ratos SODG93A. Similar a observações feitasem camundongos, ratos SODG93A de ~ 95 dias de idade tratados com RK35mostrou massa significativamente aumentada sobre ratos SODG93A tratadoscom PBS em músculos gastrocnêmio (+17%), tibialis cranial (+30%),quadríceps (+30%) e diafragma (+17%) (FIG. 2D). No doença em estágioterminal, a atrofia dos músculos das pernas foi evidente em ambos os ratosSODG93A tratados com PBS e RK35 (FIG. 2F). Uma tendência para massamuscular das pernas aumentada como um resultado do tratamento com RK35nos ratos SODG93A persistiu até o estágio terminal, mas estes efeitos nãoalcançaram significância. No entanto, um aumento forte e significativo de35% na massa do diafragma de ratos SODG93A tratados com RK35 sobrecontroles tratados com PBS (~ 35%) foi ainda evidente no doença em estágioterminal (FIG. 2F), de acordo com as observações vistas com oscamundongos SODG93A (FIG. 2E).

A fim de testar os efeitos da inibição de miostatina sobre afunção muscular, testes de força de agarramento quantitativos emcamundongos tratados com RK35 e PBS foram realizados. Ambos oscamundongos SODG93A tratados com RK35 e tratados com PBS mostraramaumentos desenvolvimentais na força de agarramento dos membros traseirosentre 28 e 56 dias após o nascimento. Em 56 dias após o nascimento, oscamundongos SODG93A tratados com PBS tornam-se significativamentemais fracos do que camundongos de controle equiparados em idade (FIG. 3A)(p < 0,0001). Embora declínios na força de agarramento também fossemevidentes em camundongos SODG93A tratados com RK35 em 63 dias após onascimento, os camundongos tratados com RK35 permaneceramsignificativamente mais fortes (ou tenderam para mais fortes) do quecamundongos SODG93A tratados com PBS de 49 a 88 dias após onascimento (p < 0,05). Análise da força de agarramento dos membrosdianteiros mostraram um padrão similar (FIG. 3B). O pico de força dosmembros dianteiros em ambos os camundongos SODG93A tratados com PBSe RK35 foi observado ~ 49 e 56 dias após o nascimento, respectivamente.Camundongos SODG93A tratados com PBS tornaram-se significativamentemais fracos do que os animais do tipo selvagem em 56 dias após o nascimento(p < 0,05) e continuaram a declinar depois. Camundongos SODG93A tratadoscom RK35 foram mais fortes do que camundongos SODG93A tratados comPBS de 56 a 88 dias de idade (56 d; p=0,08; 63 d: p=0,06; 70-88 d; p <0,001). Estes dados indicam que a inibição de miostatina diminui a perda dafunção muscular até o doença em estágio terminal nos camundongosSODG93A. No entanto, após -100 dias, os declínios na força de agarramentoforam similares em ambos os camundongos SODG93A tratados e nãotratados.

Para determinar se o tratamento com RK35 induz mudançassimilares em ratos SODG93A, a força de agarramento dos membrosdianteiros também foi analisada em ratos SODG93A tratados com RK35 ecom PBS e ninhadas do tipo selvagem equiparadas em idade durante o doençaem estágio inicial (FIG. 3C). Ratos SODG93A tratados com PBS foramsignificativamente mais fracos do que controles do tipo selvagem,confirmando que ratos SODG93A também demonstram uma fase de doençaprematura que precede déficits motores evidentes e perda de peso em ummodo similar a camundongos. As medições de força de agarramento de ratosSODG93A tratados com RK35 foram geralmente mais baixas do que de ratosdo tipo selvagem tratados com PBS, embora os grupos não fossemsignificativamente diferentes. A inibição de miostatina em ratos SODG93Anão melhorou significativamente a força de agarramento quando comparado aratos SODG93A tratados com PBS neste intervalo de idade.Exemplo 3.2.3: A Inibição de miostatina diminuiu a geração de músculos dosmembros e do diafragma em ratos e camundongos SODG93A

Os efeitos do tratamento com RK35 sobre a morfologiamuscular também foram examinados. O músculo do diafragma egastrocnêmio mediano de camundongos SODG93A de 88 dias (doença noestágio inicial) e ~ 134 dias (doença no estágio terminal) foram examinados,comparando os efeitos de tratamento com RK35 e com PBS, em paralelo comtecido de controles do tipo selvagem equiparados em idade. O grau de atrofiae hipertrofia em cada tecido foi classificado em uma análise "cega" (0,nenhum; 1, leve; 2, brando; 3, moderado; 4, marcante; 5, severo) comomostrado na tabela 4. Camundongos SODG93A tratados com PBS mostraramatrofia significativa do gastrocnêmio na doença na fase inicial (classificaçãomédia de 2,0; e FIG. 4B). O encolhimento observado das fibras dos músculos,núcleos colocados centralmente e núcleos condensados com cromatina foramconsistentes com músculo sofrendo desenervação ativa; também houveevidência de inflamação comparada a camundongos do tipo selvagem (FIG.4A e B). Em contraste, o gastrocnêmio de camundongos SODG93A noestágio inicial tratados com RK35 (FIG. 4C) mostrou pouca a nenhumaatrofia (tabela 4; classificação média de 0,3). Estes resultados suportam osdados de massa muscular indicando que a atrofia do músculo da pernaesqueletal na doença na fase inicial (88 dias após o nascimento) noscamundongos SODG93A é significativamente reduzida pela inibição demiostatina.

O exame do gastrocnêmio de camundongos SODG93A noestágio terminal confirmou atrofia muscular moderada em ambos os grupostratados com PBS (tabela 4; classificação média de 3,0) e tratados com RK35(tabela 4; classificação média de 3,3) (FIG. 4E e F) sem sinal degenerativo nomúsculo do tipo selvagem (FIG. 4D). Estes resultados são consistentes comos dados de massa muscular, indicando que os efeitos protetores da inibiçãode miostatina na doença inicial não persistem até o doença em estágioterminal em camundongos SODG93A.

O diafragma tanto de camundongos SODG93A tratados comPBS como tratados com RK35 mostrou pouca ou nenhuma atrofia (tabela 4;classificações médias de 0,6) comparada a camundongos do tipo selvagem em88 dias. No estágio terminal, no entanto, atrofia branda a moderada foiobservada no diafragma de camundongos SODG93A tratados com PBS (FIG.4H, tabela 4; classificação média de 2,3). Em contraste, o diafragma decamundongos SODG93A tratados com RK35 analisados no estágio terminalda doença não mostrou nenhum sinal significativo de atrofia comparado aanimais SODG93A tratados com PBS (tabela 4; comparar FIGs. 4H e 41),similar ao diafragma de camundongos do tipo selvagem equiparados em idade(FIG. 4G). Tomadas juntas, a avaliação de massa muscular e histológicaindica que a inibição de miostatina por RK35 preserva o diafragma mas não aintegridade do músculo da perna esqueletal até o estágio terminal da doença.Tabela 4: Sumário da patologia muscular observada em camundongosSODG93A tratados com PBS ou RK35, em comparação com camundongosde controle do tipo selvagem equiparados em idade.

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Classificação: 0, nenhum; 1, leve; 2, brando; 3, moderado; 4, marcante; 5, severo

A análise do tamanho das fibras musculares no músculogastrocnêmio e diafragma mostrou um padrão similar. As distribuições dafreqüência de medições do diâmetro das fibras de músculo gastrocnêmio de 88 dias mostraram um deslocamento para fibras menores em camundongosSODG93A (FIG. 5A) em comparação a camundongos de controle do tiposelvagem (FIG. 5C). A distribuição de diâmetros das fibras de camundongosSODG93A tratados com RK35 (FIG. 5B) é intermediária entre camundongosSODG93A não tratados e camundongos do tipo selvagem durante o doençaem estágio inicial. No estágio terminal, no entanto, o diâmetro das fibrasmédio no músculo gastrocnêmio de camundongos SODG93A tratados comRK35 não diferiram significativamente de camundongos SODG93A tratadoscom PBS (dados não mostrados). Os diâmetros de fibras médios no músculogastrocnêmio de ambos os camundongos SODG93A tratados com RK35 e tratados com PBS foram significativamente diferentes do que do tiposelvagem no estágio terminal, consistente com a atrofia muscular marcanteobservada por histologia. Diferenças significativas no tamanho das fibrasentre camundongos do tipo selvagem e SODG93A tratados com PBS tambémforam evidentes no estágio terminal no músculo do diafragma. O tamanho defibras do músculo do diafragma de camundongos SODG93A tratados comRK35 mostrou um deslocamento significativo no diâmetro de fibra médio,levando a uma distribuição de tamanho intermediária entre camundongos dotipo selvagem e SODG93A tratados com PBS (FIG. 5D).

Os efeitos da expressão de SODG93A sobre a atividadeelétrica do músculo do diafragma (FIGs. 4J e 4K) foram a seguir examinadosusando o modelo de rato em um tempo correspondente ao início clínico (~112 dias; Howland et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 1604-09). OEMG mostrado para o grupo de ratos SODG93A tratados com PBS mostraatividade de pico esparsa bem como alguma presença de atividade espontâneaanormal (FIG. 4J). A atividade de pico de ratos SODG93A tratados comRK35 foi similar à observada para ratos do tipo selvagem, com nenhumaevidência de atividade espontânea anormal. Como mostrado na FIG. 4K, omúsculo do diafragma de ratos SODG93A transgênicos mostrou umdecréscimo estatisticamente significativo nas taxas de pico de rajadas deEMG indicativas de função prejudicada. Em contraste, ratos SODG93Atratados com RK35 mostraram uma taxa de pico de rajadas que foisignificativamente mais alta do que os ratos SODG93A tratados com PBS, eque não foi significativamente diferente de controles do tipo selvagemequiparados em idade. Assim, a inibição de miostatina por RK35 foi eficaz napreservação de ambas a estrutura do diafragma e função do diafragma.Exemplo 3.2.4: A inibição de miostatina diminui a perda de neurôniosmotores no cifre ventral

Para determinar se RK35 diminuiu a perda de grandesneurônios motores na medula espinhal, grandes neurônios motores na medulaespinhal L3-5 lombar de camundongos SODG93A tratados com RK35 ouPBS e camundongos do tipo selvagem tratados com PBS foram contados. Ascontagens foram realizadas na medula espinhal em 12 semanas (80-90 dias deidade; média de 88 dias), um tempo quando o tratamento com RK35 resultouem massa muscular aumentada, peso corporal aumentado, força deagarramento aumentada e histopatologia muscular atenuada em camundongosSODG93A. Neste tempo, há perda significativa (25-40%) de grandesneurônios motores no camundongo SODG93A (Guo et al. (2003) Hum. Mol.Genet. 12: 2519-32; Sharp (2005) Neuroscience 130> 897-910; Schultz et al.(2005) J. Neurosci. 25: 7805-12).

As contagens de grandes neurônios motores lombares (FIGs.6A-D) em camundongos tratados com PBS (FIG. 6F) diminuiusignificativamente comparadas a controles de ninhadas tipo selvagem (FIG.6E). O tratamento com RK35 reduziu a perda de neurônios motores nodoença em estágio inicial (FIG. 6G) a um nível intermediário entrecamundongos SODG93A tratados com PBS e camundongos do tiposelvagem.

No doença em estágio terminal, perdas significativas degrandes neurônios motores no chifre ventral lombar bem como glicoseaumentada foram evidentes nos camundongos SODG93A independente dotratamento (FIGs. 61 e J) com nenhuma mudança correspondente notada emcamundongos do tipo selvagem (FIG. 6H).

A contagem estereológica da população total de grandesneurônios motores (área maior do que 300 um2) revelou uma tendência de25% de perda de neurônios motores em camundongos SODG93A tratadoscom PBS em comparação a controles do tipo selvagem. Uma tendência parauma diminuição da perda de neurônios motores foi observada emcamundongos tratados com RK35 (p=0,08) (FIG. 6A). Se as contagens foramrestritas a grandes neurônios motores com nucléolos visíveis para impedir acontagem de neurônios motores mostrando sinais de degeneração (isto é,presença de membranas e vacúolos irregulares), há um decréscimo de 40% nonúmero médio de grandes neurônios motores Poe seção em camundongosSODG93A tratados com PBS em comparação a camundongos de controle dotipo selvagem (FIG. 6B), bem como uma diferença estatisticamentesignificativa entre camundongos SODG93A tratados com RK35 e tratadoscom PBS (FIG. 6B). Tomados juntos, no entanto, os dados compósitosmostrados nas FIGs. 6A e B indicam que ambas a perda de grandes neurôniosmotores e os efeitos do tratamento com RK35 nesta perda são relativamentesutis no intervalo de idade de 12 semanas (dia 88).

No estágio terminal, as contagens de neurônios motores emambos os camundongos SODG93A tratados com RK35 e tratados com PBSforam significativamente diferentes de camundongos de controle do tiposelvagem por ambos os métodos de análise (FIGs. 6C e D). Estes dados sãoconsistentes com dados sobre a estrutura muscular esqueletal e a funçãoapresentada acima de que as melhoras mediadas por RK35 observadasdurante o doença em estágio inicial não são mantidas no estágio terminal.

Exemplo 4

Discussão

ALS é uma doença fatal e progressiva em que os neurôniosmotores da medula espinhal e tronco encefálico degeneram com subseqüenteatrofia muscular. Atenção considerável é focalizada sobre os mecanismosenvolvidos na morte de células de neurônios motores. Vários estudos recentessugerem que tipos de células múltiplos podem estar envolvidos na etiologiada doença controlando a produção de fatores chave no microambienteextracelular da junção neuromuscular (Bruijn et al. (2004) Annu. Rev.Neurosci. 27: 723-49). Estudos usando camundongos quiméricos mostramque a presença de células não neuronais do tipo selvagem podem prolongar asobrevivência de neurônios motores expressando SOD1 mutante (Clement etal. (2003) Science 302: 113-17). Estas observações levam à investigação deterapias que podem diminuir a degeneração neuronal provendo ummicroambiente ótimo para sobrevivência. Por exemplo, a administração nomúsculo de fatores de crescimento viralmente expressados incluindo IGF-1,GDNF e VEGF todos mostram prolongar a sobrevivência no modelo decamundongo SODG93A (Kaspar et al. (2003) Science 301: 839-42; Azzous etal. (2004) Nature 429: 413-17; Wang et al (2002) J. Neurosci. 22: 6920-28).Além disso, a expressão de IGF-1 específica de músculos mostra estabilizarjunções neuromusculares, melhorar a sobrevivência de neurônios motores eretardar o início e progressão da doença no modelo de camundongotransgênico SODG93A, indicando que efeitos diretos sobre o músculo podemimpactar o início e progressão da doença (Dobrowolny et al. (2005) J. Cell.Biol. 168: 193-99). Trocas no metabolismo muscular e vulnerabilidade deneurônios motores são relatadas em camundongos com ALS, aindasuportando a hipótese de que o músculo pode ser um condutor ativo dapatologia da doença (Dupois et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101:11159-64).

Miostatina, ou GDF-8, é um inibidor endógeno de crescimentomuscular, elicitando sua função biológica, pelo menos em parte, por ativaçãodo receptor de activina Ilb (ActRIIb), resultando na repressão dadiferenciação e proliferação de células do mioblasto (Langley et al. (2002) J.Biol. Chem. 277: 49831-40; Thomaz et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 40235-43). A inibição da função de GDF-8 usando anticorpos neutralizantes anti-GDF-8 mostra melhorar a massa e força muscular em camundongos adultossaudáveis bem como prove melhora funcional no modelo de camundongomdx de distrofia muscular (Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res.Commun. 300: 965-71; Bogdanovich et al (2002) Nature 420: 418-21). Paramelhor compreender o papel do músculo na progressão da doença dosneurônios motores, um novo anticorpo neutralizante para GDF-8, RK35, queliga com afinidade mais alta do que um reagente previamente descrito (IC5o 3nM para RK35 vs. > 100 nM para JA16; Whittemore et al. (2003) Biochem.Biophys. Res. Commun. 300: 965-71; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21) foi usado, resultando em aumentos maiores na massa muscular emcamundongos do tipo selvagem tratados com RK35 (dados não mostrados).

Em modelos de ratos e camundongos SODG93A de ALSfamiliar, o tratamento com RK35 resultou em peso corporal aumentado emassa e força muscular aumentadas durante as fases iniciais da doença deneurônios motores. Esta fase inicial da doença é definida como a idade (56-88dias após o nascimento) em que camundongos SODG93A mostram umaperda significativa de força muscular, como medido pela avaliação de forçade agarramento (Ligon et al. (2005) Neuroreport 16: 533-36) e anormalidadesno modo de andar (Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32: 43-50), e quecoincide com a desenervação de junções neuromusculares (Frey et al. (2000)J. Neurosci. 20: 2534-42; Fischer et al (2004) Experimental Neurology 185:232-40). Aumentos na massa muscular resultantes da inibição de GDF-8 porRK35 foram mais evidentes nos músculos do quadríceps, mas foram tambémpronunciados no gastrocnêmio, tibialis cranial e no diafragma de ambos osmodelos de roedores testados. Estes aumentos correlacionaram-se bem comforça aumentada, à medição que a força dos membros traseiros e membrosdianteiros declinou lentamente em camundongos tratados com RK35 emcomparação aos controles. A extensão do aumento da massa muscularinduzida pelo tratamento com o anticorpo anti-GDF-8 RK35 foi similar emamplitude a um aumento de 25% em massa muscular observado emcamundongos heterozigotos para ruptura do gene de GDF-8; a massamuscular de camundongos que são homozigotos nulos para GDF-8 é cerca deduas vezes a de camundongos do tipo selvagem (McPherron (1997) Nature387: 83-90).

Em aproximadamente 84-88 dias após o nascimento emcamundongos SODG93A, e aproximadamente 110 dias para ratos SODG93,sinais evidentes de doença incluindo decréscimos do peso corporal,anormalidade no modo de andar e paralisia tornam-se evidentes. O tratamentocom RK35 não prolonga a sobrevivência em quaisquer camundongos ou ratosSODG93A. A massa e força muscular aumentadas induzidas por tratamentocom anti-GDF-8 na fase inicial da doença não retarda no aparecimento deanormalidades no modo de andar e paralisia dos membros em amboscamundongos e ratos SODG93A (dados não mostrados), nem houve ganhosna massa muscular das pernas mantidos.

No entanto, aumentos significativos na massa do diafragma emcamundongos e ratos SODG93A tratados com RK35 como comparados acontroles de SODG93A tratados com veículo em ambas as fases da doençainicial e no estágio terminal foram observados. O músculo do diafragma emcamundongos SODG93A tratados com RK35 no estágio terminal foicomparável ao de controles do tipo selvagem equiparados em idade em ambasas avaliações de massa e histológica. Ratos SODG93A tratados com RK35também mantiveram um aumento significativo na massa do músculo dodiafragma no estágio terminal. De acordo com estas mudanças morfológicas,análise eletrofisiológica de diafragmas de ratos SODG93A não tratados indicaque a expressão de SOD1 mutante resulta na inibição significativa da funçãomuscular, e que o tratamento com RK35 preservou eficazmente a funçãomuscular no diafragma.

Neste estudo, um ponto final definido (falha no teste de reflexode endireitamento, indicando paralisia de membro significativa) foi usado,como o critério para "estágio terminal" e eutanásia. Assim, não está claro se amassa muscular do diafragma melhorada, atrofia diminuída, e funçãoeletrofisiológica melhorada induzidas por tratamento com RK35 podem terresultado em tempo de vida prolongado em roedores providos comsuplementação nutricional. No entanto, estas descobertas são potencialmenteimportantes dado o fato de que a disfunção respiratória é a causa líder demorte em pacientes com ALS (Lechtzin et al. (2002) Amyotroph. LateralScler. Other Motor Neuron Disord. 3: 5-13). Tratamentos como RK35projetados para melhorar a função do diafragma podem ter o potencial pararetardar a necessidade de respiração mecanicamente assistida em pacientescom ALS.

A inibição de GDF-8 por RK35 pode influenciar a perda deneurônios motores na medula espinhal lombar na fase inicial da doença,embora muitos benefícios terapêuticos aparentemente foram perdidos pelodoença em estágio terminal. Estes dados indicam que terapias agindodiretamente no músculo podem ter um benefício sobre o músculo enervandoos neurônios motores, possivelmente modulando o microambiente trófico,embora esta abordagem não seja aparentemente suficiente para retardar adoença. Estas observações são assim consistentes com os resultados deDobrowolny et al. ((2005) J. Cell. Biol. 168: 193-99), em que a expressão deuma isoforma de IGF específica de músculo leva a perda diminuída deneurônios motores no modelo de camundongo SODG93A, e o de Kaspar et al.((2003) Science 301: 839-42), onde a liberação viral de IGF1 no músculo resultou em perda de neurônios motores reduzida no doença em estágioinicial. Similar às observações de Kaspar et al. ((2003), supra), os efeitosbenéficos do tratamento na sobrevivência de neurônios motores não forammantidos até o estágio terminal da doença. O suporte de fator tróficomelhorado do músculo é assim provável de ser insuficiente para prevenirperda de neurônios motores no modelo SODG93A.

Em resumo, em ambos os modelos de camundongos e ratos deALS familiar, a inibição de miostatina resulta em massa e força muscularmelhoradas, o que é mantido através dos estágios iniciais da doença masperdida no estágio terminal. A inibição de miostatina diminuiu as mudançasdegenerativas no músculo esqueletal no doença em estágio inicial, mas nãoretarda o início de paralisia nem prolonga a sobrevivência, como definido porfalha de reflexo de endireitamento, nem a inibição de miostatina diminuiperda de neurônios motores. No entanto, ambas as diferenças morfológicas efuncionais através do doença em estágio terminal foram observadas nomúsculo do diafragma de animais tratados com anticorpo anti-miostatina, emcomparação com controles não tratados. No todo, os dados providos aquisuportam o potencial para um efeito benéfico de encorpamento muscular portratamento com RK35, que pode contribuir para uma "qualidade de vida dopaciente" melhorada anterior no processo da doença. Dado que anticorposanti-GDF-8 estão atualmente em desenvolvimento clínico, o uso destesreagentes químicos em ALS para a manutenção da massa muscular demembros e do diafragma autoriza outra investigação como um componente deuma abordagem multi-prolongada para o tratamento de ALS. A combinaçãode uma terapia anti-GDF-8 com fármacos existentes como riluzol antagonistade glutamato, ou agentes mais novos entrando em desenvolvimento clínico,pode não somente melhorar o nível de eficácia ajudando a manter a massamuscular, mas também tem impacto significativo na qualidade de vida globaldo paciente.

Exemplo 5

Mapeamento de epítopos para RK35

A fim de mapear os epítopos de anticorpo exatos para GDF-8,48 peptídeos sobrepondo 13 resíduos representando a seqüência total de GDF-8 maduro descrita em SEQ ID NO: 1 foram sintetizados diretamente em papelde celulose usando a técnica de síntese de coloração (por exemplo, Molina etal. (1996) Peptide Res. 9: 151-55; Frank et al. (1992) Tetrahedron 48: 9217-32). A sobreposição dos peptídeos foram 11 aminoácidos. Neste arranjo,resíduos de cisteína foram substituídos com serina a fim de reduzir ascomplicações químicas causadas por cisteínas. Membranas de celulosemodificadas com polietileno glicol e aminoácidos protegidos com Fmocforam adquiridos de Abimed (Lagenfeld, Alemanha). O arranjo foi definidona membrana copulando um espaçador de P-alanina, e os peptídeos foramsintetizados usando química de copulação de DIC (diisopropilcarbodiimida) /HOBt (hidroxibenzotriazol) como descrito anteriormente (Molina et al, supra;Frank et al., supra).

Os aminoácidos ativados foram coloridos usando um robotASP 222 Abimed. As etapas de lavagem e desproteção foram feitasmanualmente, e os peptídeos foram acetilados N-terminalmente após o ciclode síntese final. Após síntese de peptídeos, a membrana foi lavada emmetanol durante 10 minutos e no bloqueador (TBST (solução salinatamponada com Tris com 0,1% (v/v) de Tween™ 20) e 1% (p/v) de caseína)durante 10 minutos. A membrana foi então incubada com 2,5 ug/ml de umanticorpo anti-GDF-8 no bloqueador durante 1 h com agitação suave. Apóslavar no bloqueador 3 vezes durante 10 min, a membrana foi incubada comanticorpo secundário rotulado com HRP (0,25 ug/ml no bloqueador) durante30 min. A membrana foi então lavada três vezes durante 10 min cada combloqueador e 2 vezes durante 10 min cada com TBST. O anticorpo ligado foivisualizado usando o reagente SuperSignal™ West (Pierce) e uma câmeradigital (Alphananotech Fluoromager). Como mostrado na FIG. 7, o epítopo deRK35 mapeia em uma região de GDF-8 entre os aminoácidos 30-40 e 84-97,que interage putativamente com o receptor tipo II de GDF-8 como previstopela comparação da seqüência do receptor de GDF-8 com receptores dafamília TGF-P homólogos com domínios caracterizados.

Exemplo 6

Caracterização do anticorpo RK35

Os genes de região pesada variável (VH) e leve variável (VL)codificando RK35 foram clonados de células de hibridoma produzindo oanticorpo, e as seqüências de aminoácidos foram determinadas. Dados deseqüências para o anticorpo RK35 foram usados para identificar a seqüênciade linhagem embrionária mais próxima para a cadeia pesada e leve. Umacomparação de regiões variáveis leves e pesadas de RK35 com as seqüênciasde linhagem embrionária humana mais próxima é mostrada na FIG. 8.Mutações apropriadas podem ser feitas usando técnicas de mutagênesedirigidas ao sítio padrão com os iniciadores mutagênicos apropriados. Amutação do anticorpo é então confirmada por análise de seqüência. Exemplosde seqüências de aminoácidos para RK35 humanizado são descritos em SEQID Nos: 7 (VH) e 9 (VL), ambas as quais podem ser codificadas por umaseqüência de ácido nucleico prontamente determinada por um versado natécnica, por exemplo, as seqüências de ácido nucleico descritas como SEQ IDNO: 6 (VH) e 8 (VL). Um versado na técnica irá reconhecer que qualquere/ou todos os aminoácidos do anticorpo humanizado podem ser mutados devolta ao aminoácido de murino original, por exemplo, para manter aconformação do fragmento de ligação de antígeno. Exemplos não limitantesde SEQ ID NO: 7 (VH) e SEQ ID NO: 9 (VL) com algumas retro-mutaçõesque podem ajudar a manter a afinidade do anticorpo para GDF-8 são descritoscomo SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, respectivamente.

Para criar anticorpos quiméricos, a seqüência VH é subclonadaem um vetor de expressão pED6 hulgGl mut, que codifica IgGl humanacontendo duas mutações de ponto (L234A e G237A( para reduzir a ligação areceptores Fc humanos e complementar os componentes (Morgan et al.(1995) Immunology 86: 319-24; Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604). A seqüência VL de RK35 pode ser subclonada no vetor deexpressão pED6 Kappa. Os vetores de expressão contendo as seqüências VHe VK de RK35 são então co-transfectados em células COS-1 e um anticorpoRK35 quimérico é purificado de meio condicionado.

Exemplo 7

Tratamento de Distúrbios Musculares

Inibidores de GDF-8, isto é, antagonistas de GDF-8, como, porexemplo, anticorpos inibitórios, são utilizáveis para tratamento de distúrbiosmetabólicos associados com GDF-8 como diabetes tipo 2, tolerânciaprejudicada a glicose, síndrome metabólica (por exemplo, síndrome de X),resistência a insulina (por exemplo, induzida por trauma como queimadurasou desequilíbrio de nitrogênio), e distúrbios de tecidos adiposos (por exemplo,obesidade). Os inibidores de GDF-8 também são utilizáveis para o tratamentode distúrbios ósseos e musculares associados com GDF-8, como ALS,distrofia muscular e osteoartrite. Os anticorpos anti-GDF-8 e fragmentos deanticorpos da invenção podem ser usados para tratar um indivíduo, porexemplo, um indivíduo humano, preferivelmente um indivíduo sofrendo deALS, no início da doença, ou um indivíduo tendo um distúrbio metabólico ouósseo/muscular estabelecido. Os anticorpos inibitórios contra GDF-8 podemtambém ser usados para prevenir e/ou reduzir a severidade e/ou os sintomasda doença. É antecipado que os anticorpos anti-GDF-8 e fragmentos deanticorpos são administrados, por exemplo, subcutaneamente, tãofreqüentemente como uma vez por dia e tão não freqüentemente como umavez por mês. As durações do tratamento estão na faixa de cerca de um mês(ou menos) até vários anos.

Para testar a eficácia clínica de anti-GDF-8 em humanos,indivíduos sofrendo de ou em risco de ALS são identificados e randomizadosem grupos de tratamentos. Os grupos de tratamento incluem um grupo deplacebo e um a três ou mais grupos recebendo anticorpo (em doses diferentesquando existem dois ou mais grupos). Os indivíduos são seguidospossivelmente durante, por exemplo, um mês a três anos para avaliarmudanças em peso, massa muscular e força de agarramento. É antecipado queindivíduos recebendo tratamento demonstrarão uma melhora.

Um antagonista de GDF-8, preferivelmente na forma de umanticorpo ou anticorpos, é administrado como o único composto ativo ou emcombinação com um outro composto ou composição. Quando administradocomo o único composto ativo ou em combinação com um outro composto oucomposição, a dosagem é preferivelmente de aproximadamente 1 )Lig/kg a 100mg/kg, dependendo da severidade dos sintomas e/ou da progressão da doença.A dose eficaz apropriada pode ser selecionada por um clínico a partir daseguinte lista não limitante de faixas: 1 ug/kg a 100 mg/kg, 1 ug/kg a 50mg/mg, 1 ug/kg a 20 mg/kg, 1 ug/kg a 10 mg/kg, 1 ug/kg a 10 mg/kg, 1ug/kg a 1 mg/kg, 10 ug/kg a 1 mg/kg, 10 ug/kg a 100 mg/kg, 100 ug a 1mg/kg e 500 ug/kg a 1 mg/kg. Exemplos de regimes de tratamento nãolimitante e resultados potenciais são resumidos na tabela 5.

Tabela 5: Exemplos de Casos Clínicos Potenciais

<table>table see original document page 113</column></row><table>

O relatório é mais completamente compreendido à luz dosensinamentos das referências citadas dentro do relatório, sendo todas aquiincorporadas por referência em suas totalidades. As formas de realizaçãodentro do relatório provêem ilustrações da invenção e não devem serconstruídas como limitando o escopo da invenção. O versado na técnicareconhece que muitas outras formas de realização são englobadas pelainvenção reivindicada, e que o relatório e exemplos devem ser consideradoscomo exemplares somente.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> wyeth

The Trustees of the University of Pennsylvania

<120> "ANTICORPOS ANTAGONISTAS CONTRA GDF-8 E USOS NO TRATAMENTO DE ALS EOUTROS DISTÚRBIOS ASSOCIADOS COM GDF-8"

<130> 01997.040600

<150> US 60/709,704<151> 2005-08-19

<160> 31

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1<211> 109<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys1.5 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Vai Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp20 25 30

lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu35 40 45

Phe Vai Phe Leu Gln Lys Tyr Pro Mis Thr His Leu Vai Mis Gln Ala- 50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser65 70 75 80

Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln ile ile Tyr Gly85 90 95

Lys Ile Pro Ala Met Vai Vai Asp Arg Cys Gly Cys ser100 105

<210> 2

<211> 348

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 2

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctcctat 180ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 24 0ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacaagac 300tatgctatga actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 34 8

<210> 3

<211> 116<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 3

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Vai100 105 110

Thr vai Ser Ser115

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

gacattgaga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 12 0

ggacaatctc ctaaactact gctttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 18 0

cggttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 2 40

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 5<211> 107<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 5Asp Tle Glu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai ser fie Thr Cys Lys Ala ser Gln Asp Vai Ser Thr Ala20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Leu35 40 45

Tyr ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60

ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Vai Gln Ala65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys100 105

<210> 6

<211> 348<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de ácido nucleico codificando região variável de cadeiapesada RK35 humanizada (retro-transladada de SEQ.ID NO: 7)223

<400> 6 gaggtccaac tattagaatc gggaggcggt ctggttcagc caggagggag tctcaggctt 60

agttgcgctg cgtcgggatt caccttttca agttacgcaa tgtcatgggt tcgtcaggca 120

ccggggaaag gcttagagtg ggtgtcaact attagctctg gcggtagcta tacgtcgtat 180

cctgactctg tgaagggacg atttacaata agccgggaca attctaaaaa cactttgtac 240

ctacagatga attccttgag agccgaagat accgccgtct actattgtgc gaagcaagat 300

tacgctatga actattgggg tcaagggaca atggtaacgg tatcctcc 348

<210> 7<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada RK35 humanizada <400> 7

Glu Vai Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ser Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys10 85 90 95

Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly «Thr Met Vai100 105 110

Thr Vai Ser Ser115

<210> 8

<211> 321<212> DNA<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> Seqüência de ácido nucleico codificando região variável de cadeialeve RK35 humanizada (retro-transladada de SEQ.ID NO: 9)

<400> 8

gacattcaaa tgacccaaag cccttcttcc ttaagcgcat cagtaggtga ccgagttaca 60

ataacgtgta aagcgagcca agatgtgagt actgcagtag cgtggtatca gcaaaagcca 120

gggaaggctc cgaaactatt gatttactcc gcctcttaca gatatacggg cgttcctgat 180

aggtttagtg gaagtgggtc gggtacggac tttaccctga ctatatcgtc acttcagcca 24 0

gaggattttg ctacctacta ttgccaacag cattattcaa caccgtggac attcggccag 300

ggaactaagg tcgaaataaa a 321

<210> 9<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve RK35 humanizada<400> 9

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Thr ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Vai Ser Thr Ala20 25 30Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Hi s Tyr Ser Thr Pro Trp85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys100 105

<210> 10<211> 5<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 10

Ser Tyr Ala Met Ser1 5

<210> 11<211> 17<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 11

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly<210> 12

<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 12

Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr1 5

<210> 13 <211> 11 <212>PRT <213> Mus musculus

<400> 13

Lys Ala Ser Gln Asp Vai Ser Thr Ala Vai Ala15 10<210> 14<211> 7<212> PRT

<213> MUS musculus

<400> 14

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro1 5

<210> 16<211> 321<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

cgaaccgtag cggcaccgtc agtattcata ttccctccat cggacgagca attgaaaagt 60

gggacagctt cggtcgtgtg tctcttgaat aacttttacc ccagagaagc taaggtccag 120

tggaaagttg acaatgcgtt acagagcgga aattctcaag aatccgttac tgaacaggat 180

agtaaggatt ctacgtattc acttagcagt actctgaccc tatcaaaggc agattatgaa 240

aaacacaagg tatacgcctg cgaggtgacg catcaaggct tatccagccc agttacaaaa 300

tcttttaaca ggggtgagtg t 321

<210> 17<211> 107<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 17

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu15 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu65 70 75 80

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105

<210> 18<211> 990<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

gcctccacaa aaggaccatc tgtttttccc ttggcgccat caagtaaatc tacttccgga 60

ggtaccgctg cgcttggctg cctcgtgaaa gactatttcc cagaacctgt cacagtctcg 12 0

tggaatagtg gtgctttaac ctcgggcgta catacttttc ctgctgtact tcaatcaagc 18 0

ggactgtact cattatcgtc tgtagtcacg gtcccgagtt cttcactcgg aacacagact 24 0

tatatatgca acgttaatca taagcctagc aacaccaagg ttgacaaaaa ggtggaacca 300

aaatcgtgcg ataagacgca cacatgtcca ccctgtcctg caccagaagc tctgggcgcg 360

ccatcggttt tcttgttccc acccaaacct aaggacacgt taatgataag tcgaacgcca 42 0

gaggtgacat gtgttgtagt ggatgtgagc cacgaagatc cggaagtaaa attcaattgg 48 0

tatgtagatg gtgttgaagt ccataacgca aaaactaagc cgagggaaga gcagtacaac 54 0

tctacttata gggtagtctc cgtactaact gtcttgcacc aagattggct aaatgggaag 600

gaatataaat gtaaggtttc aaataaggca ctaccagccc cgatagagaa gacaataagc 660

aaagcgaagg ggcaaccaag agagccccaa gtgtacacct tgcctccgag cagagaggaa 720

atgacaaaaa atcaagtatc ccttacgtgt ctggtaaagg gattttatcc aagtgacata 780

gcagtggagt gggagagtaa cggccagcca gaaaacaatt acaaaaccac tcccccggtt 84 0

ttagatagcg atgggagttt ctttttgtac tcaaagttga ccgttgacaa gtcacgatgg 900

cagcaaggta atgtatttag ttgttctgtt atgcatgagg ccttacataa tcactacacg 960

cagaaatctc tctccttaag ccccgggaaa 990

<210> 19<211> 330<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys85 90 95

Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys130 135 140

Vai Vai Vai Asp Vai ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp145 150 155 160

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175

Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg vai vai ser Vai Leu Thr Vai Leu180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr245 250 255

Pro Ser Asp fie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300

Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330

<2 10> 2 0

<2 11 > 10

<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 20

Gly Phe Thr Phe Ser ser Tyr Ala Met ser15 10<210> 21<211> 10<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 21

Thr ile ser ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser1 5 10

<210> 22<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 22

Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr1 5

<210> 23<2 11> 11<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 23

Lys Ala Ser Gln Asp vai ser Thr Ala vai Ala1 5 10

<210> 24<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr1 5

<210> 25<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 25

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro1 5

<210> 26<211> 116<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada RK35 humanizada com retro-mutações

<400> 26Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Lys Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Vai100 105 110

Thr Vai ser Ser115

<210> 27<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve humanizada RK35 com retro-mutações<400> 27

Asp lie Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Vai Ser Thr Ala20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys100 105<210> 28

<211> 405

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 28

atgaactttg tgctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgccatgt cttgggttcg ccagactccg 180

gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctcctatcca 240

gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300

caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acaagactat 360

gctatgaact actggggtca aggaacctca . gtcaccgtct cctca 405

<210> 2915 <211> 135<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 29

Met Asn Phe Vai Leu Ser Leu lie Phe Leu Ala Leu lie Leu Lys Gly20 1 5 10 15

Vai Gln Cys Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys20 25 30

Pro Gly Gly ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45

25 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu50 55 60

Glu Trp Vai Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro65 70 75 80

Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn30 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Asp Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125

35 Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser130 135

<210> 30<211> 38140 <212> DNA

<213> Mus musculus<400> 30

atggagtcac agattcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60

gacattgaga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180

ggacaatctc ctaaactact gctttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 240

cggttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa ; a 381

<210> 31<211> 127<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 31

Met Glu Ser Gln lie Gln Vai Phe Vai Phe Vai Phe Leu Trp Leu Ser15 10 15

Gly Vai Asp Gly Asp lie Glu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser20 25 30

Thr Ser Vai Gly Asp Arg Vai Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp35 40 45

Vai Ser Thr Ala Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro50 55 . 60

Lys Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser

85 90 95

Ser Vai Gln Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr100 105 110

Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys

115

120

125

Claims (34)

1. Polipeptídeo isolado capaz de ligar GDF-8, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo compreende pelo menos uma região dedeterminação da complementaridade compreendendo uma seqüência deaminoácido selecionada dentre o grupo consistindo de uma seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 10, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:-11, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12, a seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 13, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14, aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15, a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:20, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO:22, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:-23, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 24, a seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 25, e as seqüências de aminoácido dos fragmentos ativos dosmesmos.

2. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo isolado.

3. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada, eem que a cadeia pesada compreende uma primeira, segunda e terceira regiõesde determinação da complementaridade,em que a primeira região de determinação dacomplementaridade compreende uma seqüência de aminoácido selecionadadentre o grupo consistindo da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 10, aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 20, e a seqüência de aminoácido deum fragmento ativo de SEQ ID NO: 20,em que a segunda região de determinação dacomplementaridade compreende uma seqüência de aminoácido selecionadadentre o grupo consistindo da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11, aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 11, aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:21, e a seqüência de aminoácido deum fragmento ativo de SEQ ID NO:21,e em que a terceira região de determinação dacomplementaridade compreende uma seqüência de aminoácido selecionadadentre o grupo consistindo da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12, aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 12, aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 22, e a seqüência de aminoácido deum fragmento ativo de SEQ ID NO: 22.

4. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma seqüência deaminoácido selecionada dentre o grupo consistindo da seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 3, a seqüência de aminoácido de um fragmentoativo de SEQ ID NO: 3, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, e aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 7.

5. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia leve, e emque a cadeia leve compreende uma primeira, segunda e terceira regiões dedeterminação da complementaridade,em que a primeira região de determinação dacomplementaridade compreende uma seqüência de aminoácido selecionadadentre o grupo consistindo da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 13, aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:23, e a seqüência de aminoácido deum fragmento ativo de SEQ ID NO:23,em que a segunda região de determinação dacomplementaridade compreende uma seqüência de aminoácido selecionadadentre o grupo consistindo da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14, aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 14, aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:24, e a seqüência de aminoácido deum fragmento ativo de SEQ ID NO:24,e em que a terceira região de determinação dacomplementaridade compreende uma seqüência de aminoácido selecionadadentre o grupo consistindo da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15, aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 15, aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:25, e a seqüência de aminoácido deum fragmento ativo de SEQ ID NO:25.

6. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende uma seqüência deaminoácido selecionada dentre o grupo consistindo da seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:5, a seqüência de aminoácido de um fragmentoativo de SEQ ID NO:5, a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e aseqüência de aminoácido de um fragmento ativo de SEQ ID NO: 9.

7. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia levecompreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, e em que oanticorpo ainda compreende uma cadeia pesada compreendendo a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 3.

8. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia levecompreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e em que oanticorpo ainda compreende uma cadeia pesada compreendendo a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO: 7.

9. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2-8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionadodentre o grupo consistindo de um anticorpo intacto, uma diacorpo, umfragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento scFV,e um fragmento Fv.

10. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2-4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmentodAb.

11. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato decodificar o polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreenderum polinucleotídeo como definido na reivindicação 11, em que opolinucleotídeo é ligado operativamente a uma seqüência regulatória.

13. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender umpolinucleotídeo como definido na reivindicação 11.

14. Método para produzir um anticorpo, caracterizado pelofato de compreender cultivar uma célula hospedeira compreendendo umpolinucleotídeo como definido na reivindicação 11, e recuperar o anticorpoexpressado pela célula hospedeira.

15. Anticorpo isolado e purificado, caracterizado pelo fato deser produzido pelo método como definido na reivindicação 14.

16. Composição farmacêutica para tratar, melhorar e/ouprevenir um distúrbio associado com GDF-8 caracterizada pelo fato decompreender um veículo farmaceuticamente aceitável e pelo menos umantagonista de GDF-8 selecionado dentre o grupo consistindo de polipeptídeocomo definido na reivindicação 1 e um polinucleotídeo codificando opolipeptídeo como definido na reivindicação 1.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação16, caracterizada pelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é selecionado dentre o grupo consistindo de um distúrbio muscular, distúrbioneuromuscular, distúrbio degenerativo do osso, distúrbio do osso metabólicoou induzido, distúrbio de adipose, distúrbio de metabolismo de glicose, edistúrbio relacionado com insulina em um paciente mamífero.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-17, caracterizada pelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 éselecionado dentre o grupo consistindo de distrofia muscular, ALS, atrofiamuscular, atrofia dos órgãos, debilidade, doença pulmonar obstrutivacongestiva, sarcopenia, caquexia, síndromes de enfraquecimento muscular,obesidade, diabete tipo 2, tolerância a glicose prejudicada, síndromesmetabólicas, resistência a insulina, distúrbios nutricionais, falha gonadalprematura, supressão de androgênios, hiperparatiroidismo secundário,osteoporose, osteopenia, osteoartrite, massa óssea baixa, deficiência devitamina D, e anorexia nervosa.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-18, caracterizada pelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é ALS.

20. Método para tratar, melhorar e/ou prevenir um distúrbioassociado com GDF-8, caracterizado pelo fato de compreender aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de GDF-8 a um paciente mamífero em necessidade desta terapia.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista de GDF-8 tem pouca ou nenhuma toxicidade.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o antagonista de GDF-8 é selecionado dentre o grupoconsistindo de polipeptídeo como definido na reivindicação 1 e umpolinucleotídeo codificando o polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é selecionado dentre o grupo consistindo de um distúrbio muscular, distúrbio neuromuscular,distúrbio degenerativo do osso, distúrbio do osso metabólico ou induzido,distúrbio de adipose, distúrbio de metabolismo de glicose, e distúrbiorelacionado com insulina no paciente mamífero.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é selecionado dentre ogrupo consistindo de distrofia muscular, ALS, atrofia muscular, atrofia dosórgãos, debilidade, doença pulmonar obstrutiva congestiva, sarcopenia,caquexia, síndromes de enfraquecimento muscular, obesidade, diabete tipo 2,tolerância a glicose prejudicada, síndromes metabólicas, resistência a insulina,distúrbios nutricionais, falha gonadal prematura, supressão de androgênios,hiperparatiroidismo secundário, osteoporose, osteopenia, osteoartrite, massaóssea baixa, deficiência de vitamina D, e anorexia nervosa.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é ALS.

26. Método para diagnosticar ou detectar se um paciente estásofrendo de um distúrbio associado com GDF-8, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de:(a) obter uma primeira amostra do paciente de interesse;(b) contatar a primeira amostra com o anticorpo como definidona reivindicação 2;(c) determinar o nível de GDF-8 em uma primeira amostra;(d) obter uma segunda amostra de um indivíduo não afetadocom o distúrbio associado com GDF-8;(e) contatar uma segunda amostra com o anticorpo;(f) determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra;(g) comparar os níveis de GDF-8 em uma primeira e segundaamostras,em que um aumento, diminuição, ou similaridade no nível deGDF-8 em uma primeira amostra comparado com uma segunda amostraindica se o paciente está sofrendo do distúrbio associado com GDF-8.

27. Método para monitorar a severidade de um distúrbioassociado com GDF-8, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) obter uma primeira amostra tomada de um paciente afetadocom o distúrbio associado com GDF-8 em um primeiro ponto no tempo;(b) contatar a primeira amostra com o anticorpo como definidona reivindicação 2;(c) determinar o nível de GDF-8 em uma primeira amostra;(d) obter uma segunda amostra tomada do paciente em umsegunda ponto no tempo;(e) contatar uma segunda amostra com o anticorpo;(f) determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e(g) comparar os níveis de GDF-8 em uma primeira e segundaamostras,em que um aumento, diminuição, ou similaridade no nível deGDF-8 em uma segunda amostra comparado com uma primeira amostraindica se o distúrbio associado com GDF-8 mudou em severidade.

28. Método para monitorar de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é ALS, e emque a diminuição no nível de GDF-8 em uma segunda amostra indica queALS diminuiu em severidade.

29. Método para monitorar a severidade de um distúrbioassociado com GDF-8, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) obter uma primeira amostra de um paciente afetado com odistúrbio associado com GDF-8;(b) contatar a primeira amostra com o anticorpo como definidona reivindicação 2;(c) determinar o nível de GDF-8 em uma primeira amostra;(d) obter uma segunda amostra de um indivíduo não afetadocom o distúrbio associado com GDF-8;(e) contatar uma segunda amostra com o anticorpo;(f) determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e(g) comparar os níveis de GDF-8 em uma primeira e segundaamostras,em que um aumento, diminuição, ou similaridade no nível deGDF-8 em uma primeira amostra comparado com uma segunda amostraindica se o distúrbio associado com GDF-8 mudou em severidade.

30. Método para monitorar de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é ALS, e emque a diminuição ou similaridade no nível de GDF-8 em uma primeiraamostra comparado com uma segunda amostra indica que ALS é diminuídoem severidade.

31. Método para prognosticar a possibilidade de que umpaciente irá desenvolver um distúrbio associado com GDF-8, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de:(a) obter uma primeira amostra tomada do paciente deinteresse em um primeiro ponto no tempo;(b) contatar a primeira amostra com o anticorpo como definidona reivindicação 2;(c) determinar o nível de GDF-8 em uma primeira amostra;(d) obter uma segunda amostra tomada do paciente em umsegundo ponto no tempo;(e) contatar uma segunda amostra com o anticorpo;(f) determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e(g) comparar os níveis de GDF-8 em uma primeira e segundaamostras,em que um aumento, diminuição, ou similaridade no nível deGDF-8 em uma segunda amostra indica a possibilidade de que o paciente irádesenvolver um distúrbio associado com GDF-8.

32. Método para prognosticar de acordo com a reivindicação-31, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é ALS, eem que um aumento no nível de GDF-8 em uma segunda amostra indica umaumento da possibilidade de que o paciente irá desenvolver ALS.

33. Método para prognosticar a possibilidade de que umpaciente irá desenvolver um distúrbio associado com GDF-8, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de:(a) obter uma primeira amostra do paciente de interesse;(b) contatar a primeira amostra com o anticorpo como definidona reivindicação 2;(c) determinar o nível de GDF-8 em uma primeira amostra;(d) obter uma segunda amostra de um indivíduo não afetadocom o distúrbio associado com GDF-8;(e) contatar uma segunda amostra com o anticorpo;(f) determinar o nível de GDF-8 em uma segunda amostra; e(g) comparar os níveis de GDF-8 em uma primeira e segundaamostras,em que um aumento, diminuição, ou similaridade no nível deGDF-8 na primeira amostra comparado com uma segunda amostra indica apossibilidade de que o paciente irá desenvolver um distúrbio associado comGDF-8.

34. Método para prognosticar de acordo com a reivindicação-33, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com GDF-8 é ALS, eem que a diminuição ou similaridade no nível de GDF-8 em uma primeiraamostra comparado com uma segunda amostra indica uma possibilidadediminuída de que o paciente irá desenvolver ALS.