MX2008002367A - Anticuerpos antagonistas contra el factor 8 de crecimiento y diferenciacion y usos en el tratamiento de esclerosis lateral amiotrofica y otros trastornos relacionados con el factor 8 de crecimiento y diferenciacion. - Google Patents

Abstract

La descripcion provee novedosas moleculas relacionadas con el factor-8 de crecimiento y diferenciacion (GDF-8), en particular anticuerpos de raton y humanizados, y fragmentos de anticuerpos, incluyendo aquellos que inhiben la actividad de GDF-8 y senalizacion in vitro y/o in vivo; la descripcion tambien provee metodos para diagnosticar, tratar, aliviar, prevenir, pronosticar, o monitorear trastornos degenerativos de musculo, hueso, y metabolismo de insulina, etcetera, en particulas esclerosis lateral amiotrofica (ALS); ademas, la descripcion provee composiciones farmaceuticas para el tratamiento de dichos trastornos al utilizar los anticuerpos, polipeptidos, polinucleotidos y vectores de la invencion.

Description

ANTICUERPOS ANTAGONISTAS CONTRA EL FACTOR 8 DE CRECIMIENTO Y DIFERENCIACIÓN Y USOS EN EL TRATAMIENTO DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTROFICA Y OTROS TRASTORNOS RELACIONADOS CON EL FACTOR 8 DE CRECIMIENTO Y DIFERENCIACIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/709,704, presentada el 19 de agosto del 2005, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA Esta invención se realizó con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo concesiones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM-48661 y R01 GM-56707). El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo técnico de la invención se refiere a los antagonistas del factor -8 (GDF-8) de crecimiento y diferenciación, en particular, anticuerpos contra GDF-8, por ejemplo, anticuerpos de ratón, humano y humanizados y sus fragmentos, particularmente aquellos que inhiben la actividad de GDF-8 in vitro y/o in vivo. El campo además se refiere al tratamiento, mejora, prevención, pronóstico o monitoreo de trastornos relacionados con GDF-8, por ejemplo, trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos óseos, trastornos de hueso inducido o metabólico, trastornos adiposos, trastornos del metabolismo de la glucosa o trastornos relacionados con la insulina, particularmente esclerosis lateral amiotrófica ("ALS").

TÉCNICA ANTECEDENTE El factor-8 (GDF-8) de crecimiento y diferenciación, también conocido como miostatina, es una proteína secretada y elemento de la superfamilia del factor - beta de crecimiento transformante (TGF-ß) de factores de crecimiento estructuralmente relacionados. Los elementos de esta superfamilia poseen propiedades reguladoras de crecimiento y morfogenéticas (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8-133-46; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). Los GDF-8 de humano se sintetizan como una proteína precursora de 375 aminoácidos que forma un complejo homodímero. Durante el procesamiento, el polipéptido amino-terminal, conocido como el "péptido asociado de latencia" (LAP), se rompe y puede permanecer unido de manera no covalente al homodimero, formando un complejo inactivo designado el "complejo latente pequeño" (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:6407-15; Wakefield et al. (1988) J. Biol. , Chem. 263:7646-54; Brown et al. (1999) Growth Factors 3:35-43; Thies et. al. (2001 ) Growth Factors 18:251-59; Gentry et al. (1990) Biochemistry 29:6851-57; Derynck et al. (1995) Nature 316:701-05; Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12:597-641 ). Las proteínas tal como folistatina y sus relativos también unen los homodímeros GDF-8 maduros e inhiben la actividad biológica de GDF-8 (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-32). Una alineación de la secuencia de aminoácido GDF-8 deducida de varias especies demuestra que los GDF-8 se conservan altamente (McPherron et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-61). Las secuencias de GDF-8 de humano, ratón, rata, porcino y pollo son 100% idénticas en la región C-terminal, mientras los GDF-8 de babuino, bovino y ovino difieren por 3 aminoácidos en la C-terminal. El alto grado de conservación de GDF-8 a través de especies sugiere que los GDF-8 tienen una función fisiológica esencial. Los GDF-8 ha demostrado jugar un papel principal en la regulación del desarrollo muscular y homeostasis al inhibir tanto la proliferación como la diferenciación de mioblastos y células satelitales (Lee and McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:604-07; McCroskery et al. (2003) J. Cell. Biol. 162:1135-47). Se expresa tempranamente en el desarrollo de músculo esquelético y continúa expresándose en el músculo de esqueleto de adulto, preferiblemente en tipos de espasmos musculares rápidos. Adicionalmente, los GDF-8 sobreexpresados en ratones adultos da como resultado una pérdida muscular importante (Zimmers et al. (2002) Science 296:1486-88). También, las mutaciones naturales que hacen inactivo al gen GDF-8 han mostrado provocar tanto hipertrofia como hiperplasia en animales y humanos (Lee and McPherron (1997) supra). Por ejemplo, los ratones transgénicos y knockout GDF-8 se caracterizan por una hipertrofia e hiperplasia marcadas del músculo esquelético y estructura ósea cortical alterada (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90; Hamrick et al. (2000) Bone 27:343-49). Incrementos similares en la masa muscular esquelética son evidentes en mutaciones de GDF-8 naturales en ganado (Ashmore et al. (1974) Growth 38:501-07; Swatland et al. (1994) J. Anim. Sci. 38:752-57; McPherron et al., supra; Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-15). Además, varios estudios indican que la expresión de GDF-8 incrementada se relaciona con pérdida muscular inducida por VIH (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95:14938-43). Los GDF-8 también han sido implicados en la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, creatina cinasa) y proliferación de mioblasto (WO 00/43781 ). Además de sus propiedades reguladoras de crecimiento y morfogenéticas, se cree que los GDF-8 participan en numerosos procedimientos fisiológicos, incluyendo homeostasis de la glucosa durante el desarrollo de la diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndromes metabólicos (es decir, un síndrome tal como, por ejemplo, síndrome X, que implica la aparición simultánea de un grupo de condiciones de salud, que pueden incluir resistencia a la insulina, obesidad abdominal, dislipidemia, hipertensión, inflamación crónica, un estado protrombótico, etc., que hace que una persona se encuentre en alto riesgo para diabetes tipo 2 y/o enfermedades del corazón), resistencia a la insulina (por ejemplo, resistencia inducida por trauma tal como quemaduras o desequilibrio en nitrógeno), y trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad, dislipidemia, enfermedad de hígado graso no alcohólico, etc.) (Kim et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 281 :902-06). Un número de trastornos de humano y animal se relacionan con tejido muscular funcionalmente dañado, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica ("ALS"), distrofia muscular ("MD"; que incluye la distrofia muscular de Duchenne), atrofia muscular, atrofia de órganos, desgaste, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (COPD), sarcopenia, caquexia, y síndromes de pérdida muscular provocados por otras enfermedades y condiciones. En la actualidad, pocas terapias confiables o efectivas existen para tratar estos trastornos. La patología de estas enfermedades indica un papel potencial para la señalización de GDF-8 como un objetivo en el tratamiento de estas enfermedades. ALS es un inicio tardío y una enfermedad neurodegenerativa fatal caracterizada por la degeneración del sistema nervioso central y atrofia muscular. ALS típicamente inicia con anormalidades en motricidad y pérdida de destreza, y posteriormente progresa a parálisis de los miembros y diafragma. Aunque la mayoría de los casos de ALS son esporádicos y son de etiología desconocida, 5-10% de los casos han mostrado dar como resultado la herencia familiar dominante (FALS). Aproximadamente 10-20% de los casos de FALS se atribuyen a mutaciones en el gen de Cu/Zn superóxido dismutasa (SODI) (revisado en Brujin et al., (2004) Ann. Rev. Neurosci. 27:723-49). SODI es una metaloproteína heterodimérica que cataliza la reacción del superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno diatómico, y como la pérdida de SODI no da como resultado la enfermedad de neuronas motoras (Reaume et al. (1996) Nat. Genet. 13:43-47), se cree que induce la enfermedad mediante ganancia tóxica de la función (revisado en Brujin et al., supra). Los mecanismos específicos de muerte celular neuronal inducida por SOD1 no son claros, y pueden implicar alteraciones en transporte axonal, respuestas celulares a proteínas deformadas, disfunción mitocondrial y excitotoxicidad (Bruijn et al., supra). La degeneración de neuronas motoras observada en ALS puede ocurrir por medio de mecanismos múltiples, incluyendo dificultad de captación o de transporte de factores tróficos mediante neuronas motoras (revisado en Holzbaur (2004) Trends Cell Biol. 14:233-40). De este modo, ALS puede tratarse mediante terapias que rejuvenecen una neurona de degeneración al proporcionar un entorno de supervivencia óptimo. Un entorno nervioso incluye células no neuronales como las células de glia y musculares inervadas mediante la neurona motora. Este entorno proporciona factores tróficos y de crecimiento que son endocitosados mediante la neurona y transportados por medio de un transporte axonal retrógrado al cuerpo celular (Chao (2003) Neuron 39:1-2; Holzbar, supra).

FALS se ha modelo en ratones y rata mediante la sobreexpresión del SOD1 mutante (Howland et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-09). Los ratones transgénicos que sobreexpresan la forma G93A de SODI mutante despliegan desgaste muscular y atrofia a los 90 a 100 días de edad, y típicamente mueren cerca de los 130 días de edad (Gumey et al. (1994) Science 264:1772-75). Sin embargo, la patología inducida por SODG93A subyacente, que incluye desgaste a la resistencia a la sujeción y pérdida de articulaciones neuromusculares, es importante en los primeros 50 días de edad (Frey et al. (2000) J. Neurosci. 20:2534-42; Fisher et al. (2004) Exp. Neuro. 185:232-40; Ligón et al. (2005) NeuroReport 16:533-36; Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32:43-50). La ratas transgénicas que expresan la mutación SODG93A sigue un transcurso de tiempo similar de degeneración (Howland et al., supra). El trabajo reciente ha sugerido que el desarrollo de patología no es autónomo de manera celular, consistente con la hipótesis de que la degeneración de neuronas motoras observado en ALS ocurre por medio de mecanismos múltiples, incluyendo la interrupción de la captación y transporte de factores tróficos mediante la neurona motora (véase arriba). Clement y colaboradores han utilizado ratones quiméricos para mostrar que las células no neuronales de tipo silvestre pueden extender la supervivencia de neuronas motoras que expresan el SOD1 mutante (Clement et al. (2003) Science 302:113-17). Esas observaciones han llevado a la investigación de terapias que pueden disminuir la degeneración neuronal al proporcionar un microentorno óptimo para supervivencia. Por ejemplo, el tratamiento de los ratones SODG93A por medio de inyección intramuscular directa de factores de crecimiento viralmente expresados (incluyendo IGF-1 , GDNF y VEGF) prolonga la supervivencia animal (Kaspar et al. (2003) Science 301 :839-42; Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-17; Wang et al. (2002) J Neurosci. 22:6920-28). Además, la expresión específica muscular de una isoforma específica de IGF-1 local (mlGF-1 ) estabiliza las articulaciones neuromusculares, mejora la supervivencia de neuronas motoras y retarda la aparición y avance de la enfermedad en el modelo de ratón transgénico SODG93A indicando que los efectos directos en el músculo pueden impactar la aparición de la enfermedad y avance en los animales SOD1 transgénicos (Dobrowolny et al., (2005) J. Cell Biol. 168:193-99). Los enlaces entre un hipermetabolismo muscular y la vulnerabilidad de las neuronas motoras también se ha reportado en ratones con ALS, soportando la hipótesis de que los defectos en el músculo pueden contribuir a la etiología de la enfermedad (Dupois et al. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101 :11159-64). De este modo, mejorar el crecimiento muscular debe proporcionar un soporte local mejorado para neuronas motoras, y por lo tanto dar como resultado beneficios terapéuticos. La inhibición de la expresión de miostatina conduce a hipertrofia muscular e hiperplasia (Lee and McPherron, supra; McPherron et al., supra). La miostatina regula negativamente la regeneración muscular después de la lesión, y la carencia de miostatina en ratones que carecen de GDF-8 da como resultado una regeneración muscular acelerada (McCroskery et al., (2005) J.

Cell. Sci. 118-3531-41 ). Los anticuerpos neutralizantes de miostatina incrementan el peso corporal, la masa muscular esquelética y tamaño del músculo y resistencia en el músculo esquelético de ratones tipo silvestre (Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71 ), y el ratón mdx, un modelo para distrofia muscular (Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21 ; Wagner et al. (2002) Ann. Neurol. 52:832-36). Además, el anticuerpo de miostatina en estos ratones disminuyeron el daño al diafragma, un músculo que también se dirige durante la patogénesis de ALS. Se ha hecho la hipótesis de que la acción de factores de crecimiento, tal como HGF, en el músculo puede deberse a la inhibición de la expresión de miostatina (McCroskery et al. (2005), supra), ayudando así al desplazamiento de "empuja y afloja" o equilibrio entre la regeneración y degeneración en una dirección positiva. De este modo, la inhibición de GDF-8 se presenta como objetivo farmacológico potencial para el tratamiento de ALS, distrofia muscular (MD), y otros relacionados con GDF-8, por ejemplo, trastornos neuromusculares para los cuales se desea incrementar la masa muscular, resistencia, tamaño, etc. Con la disponibilidad de modelos animales (ratón y rata) de ALS, es posible probar productos terapéuticos en dos especies diferentes, incrementando así la confianza de efectos terapéuticos en humanos in vivo. Además de los trastornos neuromusculares en humanos, también existen condiciones relacionadas con el factor de crecimiento relacionadas con una pérdida de hueso, tal como osteoporosis y osteoartritis, que afectan predominantemente a las mujeres de edad y/o postmenopausicas.

Además, las enfermedades óseas metabólicas y trastornos incluyen baja masa ósea debido a una terapia glucocorticoide crónica, una falla gonadal prematura, una supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa. Aunque muchas terapias actuales para estas condiciones funcionan al inhibir la resorción ósea, una terapia que promueve la formación ósea puede ser un tratamiento alternativo útil. Ya que GDF-8 juega un papel en el desarrollo óseo como también en el desarrollo muscular, la regulación de GDF-8 también es un objetivo farmacológico excelente para el tratamiento de trastornos degenerativos óseos. De este modo, existe la necesidad de desarrollar compuestos y métodos de tratamiento que contribuyan a un incremento total en la masa muscular y/o resistencia y/o densidad ósea, etc, particularmente en humanos, y particularmente en aquellos que sufren de ALS y otras enfermedades de pérdida muscular como también trastornos degenerativos óseos. Generar anticuerpos neutralizantes y otras pequeñas moléculas con afinidad incrementada a GDF-8 es un excelente enfoque farmacológico para tratar estos trastornos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los antagonistas de GDF-8 de la invención se refieren a anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos intactos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos), que se mencionan en la presente como "anticuerpos anti-GDF-8" o "anticuerpos GDF-8". En una modalidad, un anticuerpo anti-GDF-8 reduce, neutraliza y/o antagoniza al menos una actividad relacionada con GDF-8 (es decir, "actividad de GDF-8). La presente invención de esta manera proporciona métodos para tratar varios trastornos óseos, musculares, de glucosa y adiposos relacionados con la actividad de GDF-8 utilizando estos anticuerpos anti- GDF-8. La presente invención describe que los antagonistas GDF-8, por ejemplo, anticuerpos GDF-8, son terapéuticos altamente efectivos cuando se utilizan para tratar animales que sufren de ALS, y que la administración de dichos anticuerpos reduce la pérdida de músculos dirigidos durante la patología de ALS, por ejemplo, diafragma, gastrocnemio, etc. Además, la presente invención describe que estos antagonistas son altamente efectivos para incrementar la masa muscular y resistencia ala sujeción en anímales que padecen ALS. Como resultado, la invención enseña que los anticuerpos anti- GDF-8 son composiciones efectivas para tratar trastornos relacionados con GDF-8, por ejemplo, ALS, trastornos de pérdida muscular y otros trastornos que dan como resultado la desregulación de GDF-8. En un aspecto, la invención caracteriza un método para tratar (por ejemplo curar, suprimir), aliviar o prevenir (retardar o prevenir el inicio, repetición o recaída de) un trastorno relacionado con GDF-8 en un sujeto. El método incluye: administrar al sujeto un antagonista de GDF-8, por ejemplo, un anticuerpo anti- GDF-8, en una cantidad suficiente para tratar o evitar el trastorno relacionado con GDF-8. El antagonista de GDF-8, por ejemplo el anticuerpo anti- GDF-8, puede administrarse al sujeto sólo o en combinación con otras modalidades terapéuticas como se describe en la presente. El anticuerpo GDF-8 puede administrarse terapéuticamente, profilácticamente o ambos. En una modalidad, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un humano que sufre de un trastorno relacionado con GDF-8, incluyendo, por ejemplo, trastornos óseos y musculares. Preferiblemente, el sujeto es un humano. Más preferiblemente, el sujeto es un humano que sufre de un trastorno relacionado con GDF-8 como se describe en la presente. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos terapéuticos seguros y efectivos para diagnosticar, pronosticar, monitorear, analizar, tratar, aliviar, y/o prevenir trastornos relacionados con GDF-8, por ejemplo, trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos óseos, trastornos óseos metabólicos o inducidos, trastornos de la adiposa, trastornos del metabolismo de glucosa o trastornos relacionados con la insulina que incluyen, pero no se limitan a, homeostasis de glucosa, diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndrome metabólico (es decir, un síndrome que implica la aparición simultanea de un grupo de condiciones de salud, que pueden incluir resistencia a la insulina, obesidad abdominal, dislipidemia, hipertensión, inflamación crónica, un estado protrombótico, etc, que coloca a una persona en alto riesgo de diabetes tipo 2 y/o enfermedad del corazón), resistencia a la insulina (por ejemplo, resistencia inducida por trauma tal como quemadura o desequilibrio en nitrógeno), trastorno de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad, dislipidemia, enfermedad de hígado graso no alcohólico, etc), pérdida muscular inducida por VIH, distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrófica ("ALS"), atrofia muscular, atrofia del órgano, desgaste, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, síndrome de pérdida muscular, osteoporosis, osteoartritis, enfermedades óseas metabólicas y trastornos óseos metabólicos (incluyendo baja masa ósea debido a terapia por glucocorticoides crónica, falla gonadal prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa). En una modalidad preferida pero no limitada, la invención proporciona métodos terapéuticos seguros y efectivos para diagnosticar, pronosticar, monitorear, analizar, tratar, aliviar, y/o prevenir un trastorno relacionado con GDF-8, por ejemplo un trastorno muscular en vertebrados, particularmente mamíferos, y más particularmente humanos. En una modalidad más preferida de la invención, el trastorno relacionado con GDF-8, por ejemplo trastorno muscular, diagnosticado, pronosticado, monitoreado, analizado, tratado, aliviado, y/o prevenido es ALS. En otra modalidad, esta invención proporciona métodos para inhibir la función GDF-8 in vivo o in Vitro. Estos métodos son útiles para tratar trastornos relacionados con GDF-8, por ejemplo, trastornos degenerativos musculares y óseos particularmente trastornos musculares tales como ALS, y para incrementar la masa muscular y/o resistencia ósea y/o densidad. Los métodos también son útiles para incrementar la masa muscular y densidad ósea en animales normales incluyendo, más no limitándose a, humanos. Los métodos objetivo pueden utilizarse in vitro (por ejemplo, en un sistema libre de células, en cultivo, etc), ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las células que expresan el receptor de GDF-8 pueden cultivarse in vitro en un medio de cultivo y ponerse en contacto con, por ejemplo, uno o más anticuerpos anti-GDF-8, por ejemplo, como se describe en la presente. Alternativamente, el método puede realizarse en células presentes dentro de un sujeto, por ejemplo, como parte de un protocolo in vivo (por ejemplo, terapéutico o profiláctico). Asimismo, en un aspecto, la invención presenta un antagonista de GDF-8, por ejemplo un anticuerpo aislado, que interactúa con, por ejemplo, se une a, y neutraliza y/o inhibe GDF-8. En particular, la proteína de GDF-8 unida mediante el anticuerpo GDF-8 es mamífero, por ejemplo, humano, borrego, GDF-8 de primate no humano. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen a GDF-8 con alta afinidad, por ejemplo, con un Kd de al menos 10"7 M, preferiblemente 10"8, 10"9,10"10, más preferiblemente 10~11 M o mayor. La afinidad y cinética de unión del anticuerpo anti- GDF-8 puede probarse utilizando varios métodos bien conocidos, por ejemplo tecnología por biosensor (Biacore, Piscataway.NJ). En una modalidad, el anticuerpo anti- GDF-8 (por ejemplo, un anticuerpo intacto o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F (ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena individual)) es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico o un anticuerpo generado in vitro. En una modalidad preferida, pero no limitativa, un anticuerpo anti-GDF-8 de la invención es un anticuerpo humanizado. Estos anticuerpos anti-GDF-8 pueden utilizarse para diagnosticar, pronosticar, monitorear, analizar, tratar, aliviar, y/o prevenir trastornos relacionados con el metabolismo, muscular, óseo, de la adiposa y glucosa. Un ejemplo no limitativo de un anticuerpo anti-GDF-8 se menciona en la presente como "RK35", e incluye anticuerpos de ratón y modificados, por ejemplo, formas quiméricas o humanizadas. Las secuencias de aminoácido y nucleótido para la región variable de cadena pesada de RK35 de ratón se fijan en la presente como SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, respectivamente. Las secuencias del nucleótido y aminoácido para la región variable de cadena pesada de RK35 humanizado se fijan en la presente como SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y de aminoácido para la región variable de cadena ligera del RK35 de ratón se fijan como SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácido para la región variable de cadena ligera de RK35 humanizado se fijan en la presente como SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9, respectivamente. En una modalidad preferida, pero no limitativa de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo de ratón o humanizado para GDF-8. En una modalidad más preferida de la invención, el anticuerpo está comprendido del dominio VH (variable pesada) fijada en SEQ ID NO:3 y el dominio VL (variable ligera) fijado en SEQ ID NO:5. En otra modalidad preferida de la invención, el anticuerpo está comprendido de un dominio VH fijado en SEQ ID N0:7 y el dominio VL fijado en SEQ ID NO:9. Modalidades adicionales de la invención comprenden uno o más dominio VH o VL listados en el cuadro 1. Otras modalidades de la invención comprenden un fragmento H3 de RK35, es decir, la secuencia fijada como SEQ ID NO:12. En incluso otra modalidad, un antagonista de GDF-8 comprende uno, dos, o tres regiones de determinación complementarias (CDR) para una región variable de cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente con las secuencias seleccionadas de SEQ ID NOs:10-12 y 20-22. En incluso otra modalidad, un antagonista de la invención comprende uno, dos, o tres CDR de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo descrito en la presente con las secuencias seleccionadas de SEQ ID NOs:13-15 y 23-25. En incluso otra modalidad, el anticuerpo comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR con las secuencias seleccionadas de SEQ ID NOs:10-15 y 20-25. Las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-GDF-8 de la invención pueden tener una longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo puede incluir al menos uno, y preferiblemente dos, cadenas pesadas completas, y al menos una, y preferiblemente dos, cadenas ligeras completas) o pueden incluir un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento de Fv de cadena individual ("scFv")). En otras modalidades, la región constante de cadena pesada de anticuerpo se elige de, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgD, y IgE, particularmente se elige de, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, y lgG4, más particularmente, lgG1 (por ejemplo, lgG1 de humano). En otra modalidad, la región constante de cadena ligera de anticuerpo se elige de, por ejemplo, kappa o lambda, particularmente kappa (por ejemplo, kappa de humano). En una modalidad, la región constante se altera, por ejemplo, se muta, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para incrementar o disminuir uno o más de: unión al receptor Fc, glucosilación de anticuerpo, el número de residuos de cisteína, función celular efectora, o función de complemento). Por ejemplo, la región constante de lgG1 de humano puede mutarse en uno o más residuos, por ejemplo, uno o más residuos 117 y 120 de SEQ ID NO:19. En una modalidad, el anticuerpo anti-GDF-8 comprende la región constante de lgG1 de humano que se muestra en SEQ ID NO:19. En otra modalidad, el anticuerpo anti-GDF-8 comprende una secuencia kappa de humano, por ejemplo, la secuencia mostrada como SEQ ID NO:17. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos GDF-8 como fragmentos de anticuerpo novedosos que unen GDF-8 y retienen la capacidad de neutralizar o reducir la actividad de GDF-8. En una modalidad preferida, pero no limitativa de la invención, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento dAb, un diacuerpo, y un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento scFV y un fragmento Fv. En una modalidad más preferida de la invención, el fragmento de anticuerpo se codifica para un polinucleótido seleccionado de SEQ ID NOs: 2, 4, 6 o 8. En otra modalidad preferida de la invención, el fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos fijada en SEQ ID NOs:10-15 y 20-25. En otra modalidad preferida, la invención proporciona fragmentos de anticuerpo novedosos que difieren en la secuencia (por ejemplo, debido a la redundancia del código genético) de aquellas secuencias nombradas en el cuadro 1 , que aún retienen la capacidad de unir GDF-8 y neutralizar o reducir la actividad de GDF-8. En otra modalidad, el anticuerpo anti-GDF-8 comprende al menos uno, dos, tres o cuatro regiones de unión a antígeno, por ejemplo, regiones variables, que tienen una secuencia de aminoácidos como se nombra en el cuadro 1 (SEQ ID NOs: 3 o 7 para VH, y/o SEQ ID NOs: 5 o 9 para VL), o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere por no más de 1 , 2, 5, 10 ó 15 residuos aminoácidos de SEQ ID NOs:3, 5, 7 o 9). En otra modalidad, el anticuerpo incluye un dominio VH y/o VL codificado para un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como se nombra en el cuadro 1 (SEQ ID NOs: 2 o 6 para VH, y/o SEQ ID NOs:4 u 8 para VL), o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere por no más de 3, 6, 15, 30 ó 45 nucleótidos de SEQ ID NOs:2, 4, 6 u 8). En incluso otra modalidad, el anticuerpo comprende 1 , 2, ó 3 CDR de una región variable de cadena pesada que tiene secuencias de aminoácidos como se nombra en el cuadro 1 (SEQ ID NOs:10-12 y 20-22), o una secuencia sustancialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). En incluso otra modalidad, el anticuerpo comprende al menos uno, dos, o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tiene secuencias de aminoácidos como se nombra en el cuadro 1 (SEQ ID N0s:13-15 y 23-25), o una secuencia sustancialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tienen una o más sustituciones, por ejemplo sustituciones conservadas). En incluso otra modalidad, el anticuerpo comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de regiones variables de cadena ligera y pesada que tienen secuencias de aminoácidos como se nombra en el cuadro 1 (SEQ ID NOs:10-12 y 20-22 para VH CDR; y SEQ ID NOs:13-15 y 23-25 para VL CDR), o una secuencia sustancialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). En otra modalidad, el anticuerpo anti-GDF-8 comprende una región constante de lgG1 de humano que tiene un secuencia de aminoácidos como se fija en SEQ ID NO:19 o una secuencia substancialmente homologa a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica al mismo, o que difiere por no más de 1 , 2, 5, 10, 50 o 100 residuos aminoácidos de SEQ ID NO:19). En otra modalidad, el anticuerpo anti-GDF-8 comprende una cadena constante kappa de humano, por ejemplo, una cadena constante kappa de humano que tiene una secuencia de aminoácidos como se fija en SEQ ID NO:17 o una secuencia sustancialmente homologa al mismo (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere por no más de 1 , 2, 5, 10, 20, o 50 residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:17). En incluso otra modalidad, el anticuerpo comprende una región constante de lgG1 de humano y una cadena constante kappa de humano como se describe en la presente. En una modalidad preferida, pero no limitativa, la invención proporciona anticuerpos codificados por polinucleótidos fijados en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8. En otra modalidad preferida, la invención proporciona anticuerpos codificados para las secuencias de polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas a los polinucleótidos fijados en SEQ ID NOs:2, 4, 6 u 8. En otra modalidad preferida, la invención proporciona anticuerpos codificados para los polinucleótidos, que difieren de las secuencias fijadas en SEQ ID NOs:2, 4, 6 u 8 pero debido a la degeneración del código genético, codifican para una secuencia de aminoácidos fijada en SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9 o 10-15. El antagonista de GDF-8, por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF-8, puede derivarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab). Por ejemplo, una proteína de fusión o un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno, puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra forma) a una o más entidades moleculares, tal como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citoestáticos, entre otros. Un aspecto adicional de la invención proporciona un antagonista de GDF-8 purificado y ácidos nucleicos aislados que codifican para los antagonistas de GDF-8, por ejemplo, anticuerpos anti-GDF-8, de la invención. En una modalidad, la invención proporciona polinucleótidos comprendidos de una secuencia que codifica para VH (SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:7), VL (SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:9), y/o CDR (SEQ ID Nos:10-15 y 20-25) como se nombra en el cuadro 1. En otra modalidad, la invención proporciona polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas a ácidos nucleicos que codifican para VH, VL, o CDR (SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 10-15 o 20-25) como se nombra en el cuadro 1. En otra modalidad, la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden SEQ ID NOs:2, 4, 6 u 8 o fragmentos de SEQ ID NOs:2, 4, 6, u 8. En incluso una modalidad adicional, la invención proporciona polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas para SEQ ID NOs:2, 4, 6 u 8. Otro aspecto de la invención proporciona células hospedero y vectores que comprenden los polinucleótidos de la invención como antagonistas de GDF-8. Los anticuerpos de la invención poseen un número de propiedades útiles. En primer lugar, los anticuerpos son capaces de unir GDF- 8 maduro con alta finidad. En segundo lugar, los anticuerpos descritos inhiben la actividad GDF-8 in vitro e ip vivo. En tercer lugar, los anticuerpos descritos inhiben la actividad de GDF-8 relacionada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética y densidad ósea. En cuarto lugar, los anticuerpos descptos son un tratamiento efectivo para trastornos musculares, particularmente ALS. Estos anticuerpos pueden tener muchos usos adicionales, incluyendo diagnóstico, pronóstico, monitoreo, análisis, tratamiento, alivio, y/o prevención de trastornos relacionados con GDF-8, por ejemplo, trastornos relacionados con el músculo y/o huesos. Otros aspectos de la invención proporcionan composiciones comprendidas de un antagonista de GDF-8 de la invención, por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF-8 de la invención, y el uso de dichas composiciones para inhibir o neutralizar GDF-8 en animales, particularmente en humanos u otros animales con trastornos musculares tales como ALS. Los anticuerpos de la invención también pueden utilizarse en un trastorno relacionado con GDF-8, por ejemplo, en un trastorno en donde se desea incrementar el tejido muscular o densidad ósea. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GDF-8 pueden utilizarse en terapias y composiciones para reparar el músculo dañado por ejemplo, miocardio, diafragma, etc. Los trastornos relacionados con GDF-8- ejemplares y enfermedades tratadas con los métodos descritos y composiciones incluyen trastornos musculares y neuromusculares tales como distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular, atrofia de órganos, desgaste, síndrome del túnel, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (COPD), sarcopenia, caquexia, y otros síndromes de pérdida muscular, trastornos de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad); diabetes tipo 2; tolerancia dañada a la glucosa; síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X); resistencia a la insulina (que incluye resistencia inducida por trauma, por ejemplo, quemaduras o desequilibrio en nitrógeno), y enfermedades degenerativas óseas (por ejemplo, osteoartritis y osteoporosis). En una modalidad preferida, pero no limitativa de la invención, una composición que contiene un anticuerpo anti-GDF-8 se utiliza en un método para tratar, reducir o aliviar ALS. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que incluyen un portador farmacéuticamente aceptable y al menos un antagonista de GDF-8, por ejemplo un anticuerpo anti-GDF-8 descrito en la presente. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, comprenden una combinación de dos o más de los antagonistas de GDF-8 anteriormente mencionados, por ejemplo, anticuerpos anti-GDF-8 o fragmentos de los mismos. También dentro del alcance de la invención están las combinaciones de los antagonistas de GDF-8, por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF-8, con un agente terapéutico, por ejemplo, inhibidores del factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes anti-inflamatorios (por ejemplo, agentes sistémicos anti-inflamatorios), inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos, y/o agentes citotóxicos o citoestáticos.

En incluso otra modalidad, el antagonista de GDF-8, por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF-8 o una composición farmacéutica del mismo, se administra sólo o en terapia de combinación, es decir, combinado con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos que son útiles para tratar trastornos relacionados con GDF-8. Además de utilizarse en el tratamiento de varios trastornos o enfermedades, los anticuerpos anti-GDF-8 pueden utilizarse como herramientas de diagnóstico para detectar cuantitativa o cualitativamente la proteína de GDF-8 o fragmentos de proteína en una muestra biológica. La presencia o cantidad de la proteína de GDF-8 detectada puede correlacionarse con una o más condiciones médicas nombradas en la presente. De este modo, en una modalidad, la invención proporciona métodos para diagnosticar, pronosticar, monitorear, y/o analizar trastornos relacionados con GDF-8. En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia de GDF-8 en una muestra in vitro (por ejemplo, una muestra biológica, tal como suero, plasma, tejido, biopsia). El método en cuestión puede utilizarse para diagnosticar un trastorno relacionado con GDF-8, por ejemplo, trastorno relacionado con el metabolismo óseo, muscular, adiposa o glucosa. El método incluye: (i) poner en contacto la muestra o una muestra de control con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en la presente; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-GDF-8, y la muestra o la muestra de control, en donde un cambio sustancialmente importante en la formación del complejo en la muestra con relación a la muestra de control indica la presencia de GDF-8 en la muestra. En incluso otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia de GDF-8 in vivo en un sujeto (por ejemplo, formación de imagen in vivo en un sujeto). El método en cuestión puede utilizarse para diagnosticar un trastorno relacionado con GDF-8-, por ejemplo ALS. El método incluye: (i) administrar un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en la presente a un sujeto o un sujeto de control bajo condiciones que permitan la unión del anticuerpo a GDF-8; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y GDF-8, en donde una diferencia sustancialmente importante en la formación del complejo en el sujeto con relación al sujeto de control proporciona una indicación relacionada con la presencia de GDF-8. Otras modalidades de la invención proporcionan un método para diagnosticar o detectar si un paciente sufre de un trastorno relacionado con GDF-8 (por ejemplo, trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo inducido o metabólico, trastorno de la adiposa, trastorno del metabolismo de la glucosa, o trastorno relacionado con insulina) que comprende los pasos de: (a) obtener una muestra de un paciente de interés; (b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en la presente; (c) determinar el nivel de GDF-8 presente en la muestra del paciente; y (d) comparar el nivel de GDF-8 en la muestra del paciente al nivel de GDF-8 en una muestra de control, en donde un incremento, disminución, o similitud sustancial en el nivel de GDF-8 en la muestra del paciente comparado con el nivel de GDF-8 en la muestra de control indica si el paciente sufre de un trastorno relacionado con GDF-8. Otra modalidad adicional de un método para diagnosticar o detectar si un paciente sufre de un trastorno relacionado con GDF-8 descrita en la presente comprende los pasos de: (a) obtener una primera muestra tomada del paciente de interés; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se descpbe en la presente; (c) determinar el nivel de GDF-8 en la ppmera muestra; (d) obtener una segunda muestra de un individuo que no padece del trastorno relacionado con GDF-8; (e) poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en la presente; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución o similitud sustancial en el nivel de la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica si el paciente sufre de un trastorno relacionado con GDF-8 provocado (en parte o totalmente) por la sobreexpresión de GDF-8. Por ejemplo, un incremento en el nivel de GDF-8 en la primera muestra comparado con la segunda muestra puede indicar que el paciente sufre de un trastorno relacionado con GDF-8. En contraste, una disminución o similitud en el nivel de GDF-8- en la primera muestra en comparación con la segunda muestra puede indicar que el paciente no sufre del trastorno relacionado con GDF-8.

Los anticuerpos de la invención también son útiles en métodos para pronosticar la probabilidad de que un paciente desarrollará un trastorno relacionado con GDF-8, por ejemplo, un trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo inducido o metabólico, trastorno adiposo, trastorno del metabolismo de glucosa, o trastorno relacionado con insulina. En una modalidad preferida, pero no limitativa, el método comprende los pasos de: (a) obtener una primera muestra de un paciente de interés; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en la presente; (c) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra de un individuo que no sufre del trastorno relacionado con GDF-8; (e) poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en la presente; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica la probabilidad de que el paciente desarrollará el trastorno relacionado con GDF-8. Por ejemplo, para un trastorno relacionado con GDF-8 provocado (en parte o totalmente) por sobreexpresión de GDF-8, es probable que el paciente desarrolle el trastomo relacionado con GDF-8- si la primera muestra tiene un nivel incrementado en GDF-8 en comparación con la segunda muestra. En contraste, para un trastorno relacionado con GDF-8 provocado (en parte o totalmente) por sobreexpresión de GDF-8, no es probable que el paciente desarrolle el trastorno relacionado con GDF-8 si la primera muestra tiene un nivel similar o disminuido de GDF-8 en comparación con la segunda muestra. Los anticuerpos en la invención también son útiles en métodos para monitorear la severidad del trastorno relacionado con GDF-8, por ejemplo, trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo metabólico o inducido, trastorno adiposo, trastorno del metabolismo de glucosa, o trastorno relacionado con insulina. En una modalidad preferida, pero no limitativa, el método comprende los pasos de: (a) obtener una primera muestra tomada de un paciente de interés en un primer punto de tiempo; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en presente; (c) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra tomada del paciente de un segundo punto de tiempo; (e) poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en la presente; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra indica si el trastorno relacionado con GDF-8 ha cambiado en severidad. En una modalidad, un método para monitorear la invención se utiliza para monitorear ALS, y una disminución en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra indica que ALS ha disminuido en severidad. Un método adicional para monitorear un trastorno como se describe en la presente comprende los pasos de: (a) obtener una primera muestra de un paciente de interés; (b) poner en contacto la primera muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se describe en presente; (c) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra de un individuo que no padece un trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo metabólico o inducido, trastorno adiposo, trastorno del metabolismo de glucosa, o trastorno relacionado con insulina; (e) poner en contacto la segunda muestra con un anticuerpo anti-GDF-8 como se descpbe en la presente; (f) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (g) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra, comparado con la segunda muestra indica la severidad del trastorno de GDF-8 en ese punto. En una modalidad, un método para monitorear la invención se utiliza para monitorear ALS, y una disminución o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra comparado con la segunda muestra indica que ALS tiene una baja severidad. Preferiblemente, el anticuerpo se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los métodos para suministrar o dirigir un antagonista de la invención, por ejemplo, un anticuerpo, a una célula de expresión de GDF-8 in vivo también se describen en la presente y están dentro del alcance de la invención. Los equipos que comprenden los antagonistas de GDF-8, por ejemplo, los anticuerpos anti-GDF-8, de la invención para uso terapéutico y de diagnóstico también están dentro del alcance de la invención. Objetivos adicionales de la invención se fijarán en la siguiente descripción. Varios objetivos, aspectos y ventajas de la invención se realizarán y lograrán por medio de los elementos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones. Debe entenderse que la descppción general anterior y la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas únicamente, y no restringen la invención según se reclama.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 C muestran la caracterización del anticuerpo RK35 anti-GDF-8. La figura 1A muestra la unión directa del anticuerpo RK35 a GDF-8, según se midió en un ensayo ELISA con GDF-8 biotinilado. Se determinó que la afinidad de unión del anticuerpo RK35 (círculos) a GDF-8 era de 4 nM. La IgG de control muestra una unión apreciable (cuadrados). La figura 1 B muestra el efecto del anticuerpo RK35 en la unión de GDF-8 a su receptor de alta afinidad. En un ELISA de competencia en que se usa el receptor de GDF-8 de alta afinidad, se usó ActRIIB para medir la actividad inhibitoria de GDF-8 por parte de RK35. Se evaluó la unión de GDF-8 biotinilada a proteína quimérica humana inmovilizada a ActRIIB fusionada a la región constante de IgG (Fc) en ausencia (rombos) o presencia de varias concentraciones de RK35 mAb, ActRIIB soluble o IgG de control. Se usó receptor de ActRIIB-Fc soluble (cuadrados) e IgG de ratón no pertinente (triángulos) como controles positivo y negativo, respectivamente. El RK35 (círculos) bloqueó la unión de la GDF-8 biotinilada a la ActRIIB inmovilizada con un IC5o~2.5 nM. La figura 1 C muestra la inhibición de la transducción de señal inducida por GDF-8. Se trataron células de rabdomiosarcoma que expresan un gen de fusión de promotor-TGF-ß-luciferasa con 10 ng/ml de GDF-8 en ausencia (cuadrados) o presencia (círculos) de varias concentraciones de anticuerpo RK35. El RK35 redujo la inducción de GDF-8 de la actividad de luciferasa de manera sensible a la dosis, con un IC50 de 0.2 nM. Se midió la señal de fondo (rombos) sin GDF-8. Las figuras 2A-2F muestran la inhibición de miostatina que da lugar al peso corporal incrementado y la masa muscular incrementada tanto en ratones como en ratas SODG93A. La figura 2A muestra los pesos corporales de ratones SODG93A transgénicos tratados con RK35 (cuadrados) (n=11 ) y tratados con PBS (rombos) (n=11 ) y ratones de control (tipo silvestre) miembros de camada tratados con PBS (triángulos) (n=9). La figura 2B muestra los pesos corporales de ratas SODG93A transgénicas tratadas con RK35 machos (círculos) y hembras (triángulos) y tratadas con PBS machos (cuadrados) y hembras (rombos) (n=10 por grupo). La figura 2C muestra la masa muscular de los ratones de control miembros de camada SODG93A tratados con RK35 y PBS y tratados con PBS (n=9-12) durante la etapa temprana de la enfermedad. Se determinaron los pesos en húmedo para los músculos gastrocnemio (gastroc) craneal tibial (tibial), cuadríceps (cuad) y diafragma (diafragma) de ratones de tipo silvestre de 88 días de edad tratados con PBS (barras negras), ratones SODG93A tratados con PBS (barras blancas) y ratones SODG93A tratados con RK35 (barras grises). La figura 2D muestra la masa muscular de ratas SODG93A, tratadas con PBS (barras blancas) o RK35 (barras grises), en la etapa temprana de la enfermedad (-95 días) (n=7 por grupo). La figura 2E muestra la masa muscular de ratones de tipo silvestre tratados con PBS (barras negras), ratones SODG93A tratados con PBS (barras blancas) y ratones SODG93A tratados con RK35 (barras grises) en la etapa terminal de la enfermedad (-134 días). La figura 2F muestra la masa muscular de ratas SODG93A 93A, tratadas con PBS (barras blancas) o RK35 (barras grises) en la etapa terminal de la enfermedad (-128 días). Los asteriscos (*) denotan estadísticamente (p <0.05) diferencias entre los grupos indicados. Las figuras 3A-3C muestran la inhibición de miosatina que mejora la fuerza muscular en ratones y ratas SODG93A. La figura 3A muestra la fuerza de agarre con las extremidades traseras en ratones de tipo silvestre tratados con PBS (triángulos) y ratones SODG93A tratados ya sea con PBS (rombos) o RK35 (cuadrados) en función de la edad. La fuerza de agarre con las extremidades traseras está expresada como la compresión en kilogramos (kg). La figura 3B muestra la fuerza de agarre con las extremidades traseras en ratones de tipo silvestre tratados con PBS (triángulos) y ratones SODG93A tratados ya sea con PBS (rombos) o RK35 (cuadrados) en función de la edad. La figura 3C muestra la fuerza de agarre con las extremidades traseras en ratas de tipo silvestre tratadas con PBS (WT+PBS) o ratas SODG93A tratadas con PBS (SOD+PBS) o RK35 (SOD+RK35). Para las ratas, se realizaron mediciones durante un intervalo de 4 semanas correspondiente a la fase temprana de la enfermedad, entre 95 y 110 días de edad. La fuerza de agarre con las extremidades traseras está expresada como la tensión en kilogramos (kg). Los asteriscos (*) denota una diferencia estadísticamente significante (p<0.0001 ) entre los grupos indicados. Las figuras 4A-4K muestran los efectos de la inhibición de mesotina en la estructura muscular y la función en roedores SODG93A. La tinción con hematoxilina y eosina del músculo gastrocnemio medial para ratones de a los 88 dias indica atrofia significante en ratones SODG93A tratados con PBS (figura 4B), en comparación con ratones SODG93A de tipo silvestre (figura 4A) o tratados con RK35 (figura 4C). La tinción con hematoxilina y eosina del músculo gastrocnemio medial tanto de los ratones SODG93A tratados con PBS (figura 4E) como de los tratados con RK35 (figura 4F) en la etapa terminal indica tanto atrofia muscular significante como núcleos colocados centralmente (cabezas de flecha) en comparación con el gastrocnemio de ratones de tipo silvestre (figura 4D). La tinción con hematoxilina y eosina del diafragma de ratones de tipo silvestre tratados con PBS (figura 4G) y ratones SODG93A tratados con PBS (figura 4H) o RK35 (figura 41), respectivamente, en etapa terminal. Los ejemplos de miofribas atróficas están marcados ("a"). El asterisco en la figura 4H denota la ruptura de las fibras. Las barras mostradas denotan 50 µm en escala en las figuras 4A-4F y 25 µm en las figuras 4G-4I. La figura 4J es un patrón de interferencia de EMG que muestra esfuerzos supremos de inhalación, registrados de los músculos de diafragma de ratas de tipo silvestre tratadas con PBS (WT+PBS) o ratas SODG93A tratadas con PBS (SOD+PBS) o RK35 (SOD+RK35). La figura 4K muestra velocidades (en Hz) de punta de esfuerzo supremo de EMG de los músculos de diafragma de ratas de tipo silvestre (n=4) y de ratas SODG93A tratadas ya sea con vehículo (PBS, n=9) o RK35 (n=8). Los asteriscos (*) denotan una diferencia estadísticamente significante (p < 0.05) entre los grupos indicados. Las figuras 5A-5D muestran el tratamiento con RK35 que desacelera la disminución del diámetro de fibra muscular en el músculo gastrocnemio a través de la etapa temprana de la enfermedad en ratones SODG93A y el diafragma a través de la etapa terminal de la enfermedad. Se midieron los diámetros de fibra por morfometría en el músculo gastrocnemio en ratones de ratones SODG93A tratados con PBS (figura 5A) y tratados con RK35 (figura 5B) y ratones del tipo silvestre tratados con PBS (figura 5C) a los 88 días. Las medias fueron significantemente diferentes por ANOVA (p<0.0001 ); las comparaciones por pares por comparación múltiple de Tukey después de la prueba fueron también significantes (p<0.001 ). Para la etapa terminal, no se observaron diferencias significantes de la distribución de fibra en el músculo gastrocnemio de ratones SODG93A tratados con PBS y tratados con RK35 (datos no mostrados). La figura 5D muestra el análisis de los diámetros de fibra del músculo de diafragma de ratones SODG93A de etapa terminal tratados con PBS y tratados con RK35 en comparación con ratones de control del tipo silvestre de la misma edad. El músculo de diafragma de ratones SODG93A tratados con RK35 muestra una distribución de diámetros de fibra intermedia entre los ratones SODG93A tratados con PBS y los ratones de control de tipo silvestre en la etapa terminal. Las medias fueron significantemente diferentes por ANOVA (p<0.0001 ); las comparaciones por pares por comparación múltiple de Tukey después de la prueba fueron también significantes (p<0.01 ). Se analizaron tres músculos por grupo; se realizaron mediciones lineales del diámetro máximo del eje menor por lo menos de doscientas fibras, usando software Zeiss Axiovision. Se formaron grupos discretos de los diámetros de fibra en intervalos de 20 µm y se generaron histogramas de frecuencias para cada grupo de músculo. Las figuras 6A-6J muestran el efecto de tratamiento contra la miostatina en la pérdida de neuronas motoras en el asta anterior de la médula espinal. Se muestran análisis estereológicos de neuronas motoras grandes (área mayor a 300 µm2) de las regiones L3-5 del asta anterior de ratones SODG93A tratados ya sea con PBS (SOD+PBS) o RK35 (SOD+RK35) en la etapa temprana (figura 6A) y de etapa terminal (figura 6C) de la enfermedad en comparación con ratones de tipo silvestre de la misma edad (WT+PBS). El tratamiento con RK35 exhibió una tendencia hacia invertir la pérdida de neuronas motoras (p=0.08) en la etapa temprana de la enfermedad (figura 6A). Se realizaron conteos individuales de neuronas motoras saludables grandes con nucléolos visibles en las secciones L3-5 teñidas con NISSL de ratones SODG93A tratados ya sea con PBS o RK35 en la etapa temprana (figura 6B) y de etapa terminal (figura 6D) de la enfermedad en comparación con ratones de tipo silvestre de la misma edad. Para cada sección, se contaron las astas anteriores (total de 20 astas anteriores por animal) y se representan los datos como el número medio de neuronas motoras grandes por asta anterior. Los asteriscos (*) denotan diferencias estadísticamente significantes (p < 0.001 ) entre los grupos indicados. Se muestran imágenes representativas de secciones de astas anteriores teñidas con NISSL (20x de amplificación) para ratones de tipo silvestre tratados con PBS (figuras 6E y 6H), ratones SODG93A tratados con PBS (figura 6F y 61) y ratones SODG93A tratados con RK35 (figuras 6G y 6J) analizados en las etapas temprana (88 días) (figura 6E-6G) y terminal (134 días; figuras 6H-6J) de la enfermedad. La barra denota una escala de 200 µm. La figura 7 muestra un mapeo de epítope de GDF-8 para el anticuerpo RK35. Se identificaron los sitios de unión en GDF-8 para RK35 usando péptídos traslapantes de 13 aminoácidos de GDF-8 humano. Los sitios de contacto de RK35 con GDF-8 están en negritas. La figura 8 muestra la alineación de las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de RK35 (VL y VH, respectivamente) con las estructuras de línea de células germinales humana DPK9 y DP-47, respectivamente. Los aminoácidos de las cadenas vapables RK35 murino (MRK35) que están cambiados en las regiones de MK35 humanizado (HuRK35) están designados con un asterisco (*) y están en negritas; las regiones determinadoras de complementariedad de RK35 están encerradas en casillas y subrayadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones "Anticuerpo", como se usa en la presente, se refiere a una ¡nmunoglobulina o parte de la misma, y abarca cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión de antígeno independientemente de la fuente, especie de origen, método de producción y características. Para los propósitos de la presente invención, incluye también, a no ser que se indique de otra manera, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, F(ab')2, Fv , scFv, Fd, dAb, diacuerpos y otros fragmentos de anticuerpo que retienen la función de unión antígeno. Se pueden hacer los anticuerpos, por ejemplo, mediante técnicas tradicionales de hibridoma, métodos de ADN recombinante o técnicas de despliegue de fagos usando genotecas de anticuerpo. Para otras varias técnicas para la producción de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

El término "dominio de unión de antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende el área que se une específicamente o es complementaria a una parte de un antígeno o todo. Si un antígeno es grande, un anticuerpo se puede unir solamente a una parte particular del antígeno. El "epítope" o "determinante antigénico" es una porción de una molécula de antígeno que es responsable de las interacciones del dominio de unión de antígeno de un anticuerpo. Un dominio de unión de antígeno puede ser provisto por uno o más dominios de anticuerpos variables (por ejemplo, un llamado fragmento de anticuerpo Fd que consiste en un dominio VH). Un dominio de unión de antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera de anticuerpos (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpos (VH). El término "GDF-8" se refiere a un factor específico 8 de crecimiento y diferenciación, pero no a otros factores que estén relacionados estructural y funcionalmente con la GDF-8, por ejemplo, BMP-11 y otros factores que pertenecen a la superfamilia de TGF-ß. El término se refiere a la forma precursora no procesada de longitud completa de GDF-8 así como a las formas maduras y de propéptidos que resultan de la segmentación después de la traducción. El término se refiere también a cualesquiera fragmentos y variantes de GDF-8 que mantengan por lo menos algunas actividades biológicas relacionadas con GDF-8 madura, como se discute en la presente, incluyendo secuencias que se hayan modificado. La secuencia de aminoácidos de GDF-8 humana madura está provista en la SEQ ID NO:1. La presente invención se refiere a la GDF-8 de todas las especies de vertebrados, incluyendo, pero no limitándose a las mismas, humana, bovina, gallo, ratón, rata, porcina, ovina, pavo, mandril y peces (para la información de secuencias, véase, por ejemplo, McPherron et al., supra). El término "actividad de GDF-8" se refiere a una o más actividades fisiológicamente reguladoras del crecimiento o morfogenéticas, relacionadas con la proteína GDF-8 activa. Por ejemplo, la GDF-8 activa es un regulador negativo de la masa músculo-esquelética. La GDF-8 activa puede modular también la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina cinasa), estimular la proliferación de mioblastos y modular la diferenciación de preadipocitos a adipocitos. En los ejemplos se dan a conocer procedimientos ejemplares para medir la actividad de GDF-8 in vivo e in vitro. El término "antagonista de GDF-8" o "inhibidor de GDF-8" incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento o secreción de GDF-8. Tales inhibidores incluyen macromoléculas y moléculas pequeñas, por ejemplo proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ARNsi, ribozimas, oligonucleótidos de antisentido, ARN de cadena doble y otras moléculas pequeñas, que inhiben la GDF-8. Un antagonista de GDF-8 incluye, además de los anticuerpos provistos en el mismo, cualquier anticuerpo que inhiba eficientemente la GDF-8, incluyendo anticuerpos de alta especificidad para unirse a GDF-8 (por ejemplo anticuerpos con baja afinidad para otros miembros de la superfamilia de TGF-ß (por ejemplo BMP-11 )). Se contemplan variantes, incluyendo variantes humanizadas de estos anticuerpos en los métodos de diagnóstico, pronóstico, monitoreo, tratamiento, alivio y prevención de la invención. Se dice que tales inhibidores "inhiben", "disminuyen" o "reducen" la actividad biológica de GDF-8. Los términos "neutralizar", "neutralizando" y sus cognados se refieren a una reducción o abrogación notable de la actividad de GDF-8 en relación con la actividad de GDF-8 en ausencia del mismo inhibidor. Por ejemplo, se puede decir que una reducción del 75-100% de la actividad "neutraliza" la actividad de GDF-8. El término "tratamiento" se usa indistintamente en la presente con el término "método terapéutico" y se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas/preventivas. Aquéllos en necesidad de tratamiento pueden incluir individuos que tengan ya un trastorno médico particular así como aquéllos que adquieran con el tiempo el trastorno (es decir aquéllos que necesiten medidas preventivas). El término "aislado" se refiere a una molécula que está separada sustancialmente de su medio ambiente natural. Por ejemplo, una proteína aislada es aquélla que está separada sustancialmente de la fuente de célula o tejido de la cual se ha derivado. El término "purificado" se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de otro material que se relacione con la molécula en su medio ambiente natural. Por ejemplo, una proteína purificada está sustancialmente libre del material celular u otras proteínas de las células o tejido de los cuales se haya depvado. El término se refiere a preparaciones en las cuales la proteína aislada es suficientemente pura para ser administrada como composición terapéutica, o por lo menos del 70% al 80% (p/p) pura, más preferiblemente por lo menos el 80%-90% (p/p) pura, más preferiblemente aún el 90-95% pura; y muy preferiblemente por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% (p/p) pura. El término "dosis efectiva", "dosis terapéuticamente efectiva", "cantidad efectiva" o similar se refiere a la cantidad de compuesto que da por resultado cualquier alivio de los síntomas en un paciente o un suceso biológico deseado (por ejemplo el aumento de la masa músculo-esquelética y/o de la densidad ósea). Tal cantidad debe ser suficiente para reducir la actividad de GDF-8 relacionada con la regulación negativa de la masa músculo-esquelética y la densidad ósea o con la homeostasis de la glucosa y el metabolismo de la adiposa. Se puede determinar la cantidad efectiva como se describe en la presente. Un "trastorno relacionado con la actividad de GDF-8", trastorno relacionado con la GDF-8", "trastorno en relación con la GDF-8" o similar se refiere a trastornos que pueden ser causados, por completo o en parte, por la disregulación de la GDF-8 (y/o la actividad de GDF-8) (por ejemplo anormalmente aumentada o disminuida) y/o trastornos que pueden ser tratados, aliviados, revenidos, diagnosticados, pronosticados o monitoreados regulando y/o monitoreando la GDF-8 (y/o la actividad de GDF-8). Los trastornos relacionados con la GDF-8 incluyen trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos de los huesos, trastornos metabólicos o inducidos por los huesos, trastornos de la adiposa, trastornos del metabolismo de la glucosa o trastornos relacionados con la insulina. Un trastorno preferido de la invención relacionado con la GDF-8 es la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). El término "molécula pequeña" se refiere a compuestos que no son macromoléculas (Véase por ejemplo Karp (2000) Bioinformatics Ontology 16:269-85; Verkman (2004) AJP-Cell Physiol. 286:465-74. Siendo así, como moléculas pequeñas se consideran a menudo aquellos compuestos que son menores a mil daltons (por ejemplo., Voet y Voet, Biochemistry, 2nd ed., ed. N. Rose, Wiley and Sons, New Cork, 14 (1995)). Por ejemplo Davis et al. ((2005) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102:5981-86) usan la frase molécula pequeña para indicar folatos, metotrexato y neuropéptidos, mientras que Hilpin y Harbury ((2004) PLos Biology 2:1022-30) usan la frase para indicar productos génicos de moléculas pequeñas, por ejemplo ADN, ARN y péptidos. Los ejemplos de moléculas pequeñas naturales incluyen, pero no se limitan a las mismas, colesteroles, neurotransmisores y ARNsi; las moléculas pequeñas sintetizadas incluyen, pero no se limitan a las mismas, varias sustancias químicas listadas en numerosas bases de datos de moléculas pequeñas, comercialmente obtenibles, por ejemplo FCD (Fine Chemicals Datábase), SMID (Small Molecule Interaction Datábase), ChEBI (Chemical entities of Biological Interest), y CSD (Cambridge Structural Datábase) (véase por ejemplo Alfarano et al. (2005) Nuc. Acids Res. Datábase Issue 33:D416-24).

II. Anticuerpos contra GDF-8 y fragmentos de anticuerpo A. Anticuerpo RK35 de ratón y humanizado La presente descripción provee anticuerpos novedosos (por ejemplo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo) que se unen eficientemente a la GDF-8. Una modalidad ilustrativa no limitativa de tal anticuerpo es denominada RK35. Se provee esta modalidad ejemplar en forma de anticuerpos de ratón y humanizados y de fragmentos de anticuerpo de los mismos. El anticuerpo ejemplar de la invención, al cual se hace referencia a la presente como "RK35", posee características únicas y beneficiosas. En primer lugar, este anticuerpo y estos fragmentos de anticuerpo son capaces de unirse a la GDF-8 madura con alta afinidad. En segundo lugar, el anticuerpo y los fragmentos de anticuerpo de la invención inhiben la actividad de GDF-8 in vitro e in vivo como se ha demostrado, por ejemplo por inhibición de la unión ActlIB y ensayos de genes reporteros. En tercer lugar, el anticuerpo y los fragmentos de anticuerpo expuestos son útiles para tratar síntomas relacionados con un trastornos relacionado con GDF-8, por ejemplo trastornos musculares, particularmente ALS, como se ha demostrado, por ejemplo aumentado la masa muscular en ratones SOD mutantes tratados. En una modalidad ejemplar, los antagonistas de GDF-8 son anticuerpos que se unen eficientemente a la GDF-8 e inhiben una o más actividades relacionadas con GDF-8. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden usar los anticuerpos de la invención para detectar, medir e inhibir las proteínas GDF derivadas de varias especies, por ejemplo las descptas en la presente especificación. El porcentaje de identidad está determinado por algoritmos estándar de alineación tales como, por ejemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descpto en Altschul et al. (2990) J. Mol. Biol. 215:403-10, el algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-53, o el algoritmo de Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17. En general, se puede usar el anticuerpo y los fragmentos de anticuerpo de la invención con cualquier proteína que retenga sustancialmente la actividad biológica de GDF-8 y comprenda una secuencia de aminoácidos que sea por lo menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95%, o más idéntica a cualquier secuencia por lo menos de 100, 80, 60, 40, 20 ó 15 aminoácidos contiguos de la forma madura de GDF-8 dada a conocer en la SEQ ID NO:1.

B. Dominios variables de anticuerpos Los anticuerpos intactos, conocidos también como inmunoglobulinas, son típicamente proteínas glicosiladas tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente de 50 kDa cada una. Existen en los anticuerpos dos tipos de cadena ligera, denominadas lambda y kappa. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de cadenas pesadas, las inmunoglobulinas están designadas a cinco clases principales: A, D, E, G, y M, y varias de éstas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, lgG2, lgG3, lgG , IgAi e lgA2. Cada cadena ligera está compuesta de un dominio variable (V) N-terminal (VL) y un dominio constante (C) (CL). Cada cadena pesada está compuesta de un dominio V N-terminal (VH), tres o cuadro dominios C (CH) y una región de bisagra. El dominio CH más proximal o VH es designado CH1. Los dominios VH y VL constan de cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas llamadas regiones de marco (FR1 , FR2, FR3, y FR4), las cuales forman un supercóntigo para tres regiones de secuencias hipervariables (regiones determinadoras de complementariedad, CDR). Las CDR contienen la mayor parte de los residuos responsables de las interacciones del anticuerpo con el antígeno. Se hace referencia a las CDR como CDR1 , CDR2 y CDR3. De acuerdo con lo anterior, se hace referencia a los constituyentes de CDR en la cadena pesada como H1 , H2, y H3, mientras que se hace referencia a los constituyentes de CDR en la cadena ligera como L1 , L2 y L3. La CDR3 es la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión de anticuerpo. El H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácidos o mayor a 26 aminoácidos. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para un repaso de la estructura de los anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Un experto en la técnica reconocerá que cada estructura de subunidad, por ejemplo una estructura de CH, VH, CL, VL, CDR y/o FR, comprende fragmentos activos. Por ejemplo, los fragmentos activos pueden consistir en una porción de la subunidad de VH, VL o CDR que se una al antígeno, es decir al fragmento de unión de antígeno o a la porción de la subunidad de CH que se une a un receptor Fc y/o un complemento y/o lo activa. Algunos ejemplos no limitativos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "fragmento de anticuerpo" usados en la presente incluyen: (i) un fragmento Fab, fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, VL y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios o VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominio VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento de dAb, que consiste en un dominio VH; y (vi) una CDR aislada. Además, aunque los dos dominios para el fragmento Fv, VL y VH, están codificados para genes separados, se pueden unir recombinantemente mediante un enlazador sintético, creando una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv)). El enlazador usado más comúnmente es un péptido de 15 residuos (Gly4Ser)3, pero se conocen también otros enlazadores en la técnica. Se pretende también que los anticuerpos de cadena sencilla estén abarcados dentro del término "anticuerpo" o "fragmento de unión de antígeno" de un anticuerpo. Se obtienen estos anticuerpos usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica y se seleccionan sus fragmentos en cuanto a utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Se crea la diversidad de anticuerpos mediante múltiples genes de línea de células germinales que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen las recombinaciones de segmentos génicos variables con segmentos génicos de diversidad (D) y unión (J) para hacer una región VH completa y la recombinación de segmentos génicos variables y de unión para hacer una región VL completa. El procedimiento de recombinación en sí es impreciso, dando por resultado la pérdida o la adición de aminoácidos en las uniones de V(D)J. Estos mecanismos de diversidad ocurren en la célula B en desarrollo antes de la exposición del antígeno. Después de la estimulación antigénica, los genes de anticuerpos expresados en las células B experimentan mutación somática. Con base en el número estimado de segmentos de genes de línea de células germinales, se puede producir la recombinación aleatoria de estos segmentos y el apareamiento VH-VL aleatorio, hasta 1.6x107 anticuerpos diferentes (Fundamental Immunology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, NY). Cuando se toman en cuenta otros procedimientos que contribuyen a la diversidad de anticuerpos (tales como mutación somática), se piensa que se puede generar arriba de 1 x1010 anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA). En vista de los muchos procedimientos implicados en la generación de diversidad de anticuerpos, es improbable que los anticuerpos monoclonales derivados independientemente con la misma especificidad de antígeno tengan secuencias idénticas de aminoácidos.

Así, la presente invención provee novedosos anticuerpos que se unen a GDF-8. Los fragmentos de anticuerpo de la invención, por ejemplo estructuras que contengan una CDR, serán generalmente una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo, o un fragmento activo de la misma, en que la CDR está colocado en la ubicación que corresponde a la CDR de VH y VL existentes en la naturaleza. Las estructuras y las ubicaciones de los dominios de inmunoglobulina variable, por ejemplo CDR, se pueden definir usando esquemas de numeración bien conocidos, por ejemplo el esquema de numeración de Rabat, el esquema de numeración de Chothia, una combinación de Rabat y Chothia (AbM), etc. (véase por ejemplo Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991 ), eds. Kabat et al.; Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:927-48). Así, la presente invención provee además novedosas CDR. La estructura para llevar una CDR de la invención será generalmente un polipéptido, por ejemplo una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porción sustancial de la misma, en la cual la CDR está ubicada en una posición correspondiente a la CDR de las regiones VH y VL existentes en la naturaleza. Se pueden determinar las estructuras y las ubicaciones de dominios de inmunoglobulina variable, como se describe por ejemplo en Rabat et al., supra and Al-Lazikani et al., supra. La moléculas de anticuerpo (incluyendo fragmentos de anticuerpo) de la presente invención, es decir moléculas de anticuerpo que antagonizan GDF-8, incluyen, pero no se limitan a las mismas, anticuerpo monoclonal murino RK35 y sus variantes, específicamente la variante humanizada. Los antagonistas de a GDF-8 de la invención incluyen, además de RK35, otros anticuerpos que se unen eficientemente a GDF-8, incluyendo anticuerpos con alta especificidad para unirse a GDF-8 (por ejemplo, anticuerpos con menor afinidad a otros miembros de la superfamilia de TGF-ß (por ejemplo, BMP-11 )). Se contemplan variantes, incluyendo variantes humanizadas, de estos anticuerpos en los métodos de diagnóstico, pronóstico, monitoreo, tratamiento, alivio y prevención de la invención. Estas moléculas de anticuerpo pueden ser útiles en la prevención o el tratamiento de un trastorno relacionado con GDF-8, por ejemplo patologías óseas, musculares, relacionadas con el metabolismo de la adiposa y la glucosa. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera RK35 murino y humanizado se dan a conocer en las SEQ ID NO: 5 y 9, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de RK35 murino y humanizado se dan a conocer en las SEQ ID NO: 3 y 7, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las tres regiones determinadoras de complementariedad (CDR) en las cadenas ligeras variables de RK35 murino y humanizado se dan a conocer en las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 23, 24, y 25. Las secuencias de aminoácidos de las tres CDR en las cadenas pesadas variables de RK35 murino y humanizado se dan a conocer en las SEQ ID NO: 10, 11 , 12, 20, 21 , y 22.

Como se describe anteriormente, las CDR contienen la mayor parte de los residuos responsables de las interacciones con un antígeno y están contenidas dentro de los dominios VH y VL, es decir la región de cadena pesada variable y la región de cadena ligera variable, respectivamente. Consecuentemente, con la condición de que un anticuerpo comprenda por lo menos una CDR que comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en las SEQ ID NO: 10-15 y 20-25, o un fragmento de anticuerpo activo de la misma, es un anticuerpo de la invención, es decir uno que se une a GDF-8 e interfiere con la señalización de GDF-8. Por lo tanto, una modalidad de la invención incluye polipéptidos, por ejemplo anticuerpos, que contienen una o más CDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la SEQ ID NO: 10-15 y 20-25, o un fragmento activo de las mismas. Consecuentemente, un experto en la técnica reconocerá que los anticuerpos de la invención incluyen un anticuerpo en que las CDR de la cadena VL son aquéllas dadas a conocer en la SEQ ID NO: 13-15 y 23-25, o las CDR de la cadena VH son aquéllas dadas a conocer en las SEQ ID NO: 10-12 y 20-22. Un fragmento de unión de antígeno puede ser un fragmento Fv que consta de dominios VH y VL. Así, un fragmento Fv de RK35 puede constituir un anticuerpo de dimensión, con la condición de que se una a GDF-8 e interfiera con la señalización de GDF-8. Un experto en la técnica reconocerá que cualquier fragmento de anticuerpo que contenga el fragmento Fv de RK35, por ejemplo, puede ser un anticuerpo de la invención. Adicionalmente, cualquier fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab o fragmento (ab')2, que contenga una o más CDR que tengan una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos dada a conocer en las SEQ ID NO: 10-15 Y 20-25, puede ser también un anticuerpo de la invención. Se pueden producir tales moléculas de anticuerpo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales mediante la generación de hibridomas de acuerdo con métodos conocidos. Se seleccionan luego los hibridomas formados de esta manera usando métodos estándar, tales como ensayo ¡nmunosorbente de enzima enlazada (ELISA) y análisis Biacore para identificar uno o más hibridomas que produzcan un anticuerpo que se una a GDF-8, interfieran con la señalización de GDF-8 y neutralicen o inhiban una o más actividades relacionadas con GDF-8. Como inmunógeno se puede usar GDF-8 recombinante, GDF-8 existente en la naturaleza, cualesquiera variantes de las mismas y fragmentos peptídico antigénicos de GDF-8. Un fragmento peptídico antigénico de GDF-8 comprende residuos continuos por lo menos de siete aminoácidos y abarca un epítope, de tal manera que un anticuerpo cultivado contra el péptido forme un complejo inmune con GDF-8. Preferiblemente, el péptido antigénico residuos por lo menos de 10 aminoácidos, más preferiblemente residuos por lo menos de 15 aminoácidos, más preferiblemente aún por lo menos residuos de 20 aminoácidos y muy preferiblemente por lo menos residuos de 30 aminoácidos. Adicionalmente, es preferible que el fragmento peptídico antigénico de GDF-8 comprenda el sitio de unión de receptor de GDF-8. Se pueden producir los sueros y anticuerpos policlonales de la invención inmunizando a un sujeto adecuado con GDF-8, sus variantes y/o porciones de las mismas. El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede monitorear en el transcurso del tiempo mediante técnicas estándar, tales como un ELISA o usando GDF-8 inmovilizada u otras proteínas marcadoras (por ejemplo FLAG). Si se desea, se pueden aislar las moléculas de anticuerpo de la presente invención del sujeto o medios de cultivo y purificar adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A, para obtener una fracción de IgG. Ciertas modalidades de la invención comprenden el dominio VH y/o VL del fragmento Fv de RK35. Se pueden producir fragmentos de los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo fragmentos Fab, F(ab')2, Fd, y dAb, por segmentación de los anticuerpos de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica por ejemplo, se pueden generar fragmentos Fab y F(ab') 2, inmunológicamente activos tratando los anticuerpos con una enzima tal como papaína y pepsina. Otras modalidades comprenden una o más CDR de cualquiera de estos dominios o VH y VL, como se dan a conocer en la SEQ ID NO: 10-15 y 20-25. Una modalidad comprende un fragmento H3 del dominio VH de RK35 como se da a conocer en la SEQ ID NO: 12.

Las secuencias de ADN y aminoácidos (AA) de los dominios VH y VL y las CDR de los anticuerpos expuestos en la presente están enumeradas según se enlista en el cuadro 1. Por conveniencia, las posiciones apropiadas de cada CDR dentro de los dominios VH y VL están listadas en el cuadro 2. CUADRO 1 Secuencias de ADN y aminoácidos de VH, VL, CH, CL y CDR en RK35 CUADRO 2 Posición aproximada de CDR de acuerdo con las definiciones de Kabat (no itál.) or AbM (itál.) dentro de las regiones variables de anticuerpos de ratón humanizados de RK35 Los anticuerpos anti-GDF-8 pueden comprender además regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas. Por ejemplo, se puede agregar un dominio VL de dimensión por su extremo C-terminal a un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo, por ejemplo una cadena CK O C? humana, preferiblemente una cadena C?. Similarmente, se puede agregar un fragmento de unión de antígeno con base en un dominio VH por su extremo C-terminal a toda o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo IgG, IgA. IgE e igM, y cualquiera de las subclases de isotipos, particularmente IgGi e igG4. En modalidades ejemplares, los anticuerpos comprenden fragmentos C-terminales de cadenas pesadas y ligeras de IgGn humana. Las secuencias preferidas de ADN y aminoácidos para el fragmento constante C-terminal de la cadena ? ligera se dan a conocer en las SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:17, respectivamente. Las secuencias preferidas de ADN y aminoácidos para el fragmento constante C-terminal de la cadena pesada de IgGi se dan a conocer en las SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:19, respectivamente. Se entiende que, debido a la degeneración del código genético, las secuencias de ADN listadas en el cuadro 1 son meramente representativas de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos, péptidos y anticuerpos de interés, y no se deben de interpretar como limitativas. Ciertas modalidades de la invención comprenden el dominio VH y/o VL del fragmento Fv de RK35. Otras modalidades comprenden una o más regiones determinadoras de complementariedad (CDR) de cualquiera de los dominios o VH y VL. Una modalidad comprende un fragmento H3 del dominio VH de RK35. Los dominios VH y VL de la invención, en ciertas modalidades, son de linea de células germinales, es decir se cambian las regiones de marco (FR) de estos dominios usando técnicas convencionales de biología molecular para equiparar las secuencias de aminoácidos de consenso de productos génicos humanos de línea de células germinales. Se conoce esto también como anticuerpo humanizado o de línea de células germinales. En otras modalidades, las secuencias de estructura permanecen divergidas de la línea de células germinales. Se pueden producir anticuerpos humanizados usando ratones transgénicos que sean incapaces de expresar genes endógenos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, pero sean capaces de expresar genes humanos de cadena pesada y ligera.

C. Anticuerpos modificados y sus argumentos Un aspecto adicional de la invención provee métodos para obtener un dominio de unión de antígenos de anticuerpo dirigido contra GDF-8. El experto en la técnica apreciará que los anticuerpos de la invención no están limitados a secuencias específicas de VH y VL, según se enlista en el cuadro 1 , sino que incluyen también variantes de estas secuencias que retienen la capacidad de unión de antígeno. Se pueden derivar tales variantes de las secuencias provistas usando procedimientos conocidos en la técnica. Se pueden hacer sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en las FR o en las CDR. Mientras que en los cambios en las regiones de marco están diseñados usualmente para mejorar la estabilidad y reducir la inmunogenicidad del anticuerpo, los cambios en las CDR están diseñados usualmente para aumentar la afinidad del anticuerpo para su objetivo. Tales cambios de aumento de afinidad se determinan típicamente de manera empírica alterando la CDR y sometiendo a prueba el anticuerpo. Se pueden hacer tales alteraciones de acuerdo con los métodos descritos por ejemplo en Antibody Engineering, 2nd. Ed., Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995. Así, los anticuerpos de la invención pueden incluir aquéllos que se unen a GDF-8, interfieren con la señalización de GDF-8 y tienen mutaciones en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. Es aconsejable algunas veces mutar y desactivar ciertos fragmentos de la región constante. Por ejemplo, son aconsejables algunas veces mutaciones en la región constante pesada para producir anticuerpos con unión reducida al receptor Fc (FcR) y/o complemento; tales mutaciones son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica reconocerá también que la determinación de cuáles fragmentos activos de las subunidades CL y CH son necesarios dependerá de la aplicación a la cual se aplique un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, los fragmentos activos de las subunidades CL y CH que están implicados con su enlace covalente de uno a otro serán importantes en la generación de un anticuerpo intacto. El método de elaborar un dominio VH de una variante de secuencia de aminoácidos de un dominio VH dada conocer en la presente comprende un paso de añadir, suprimir, sustituir o insertar uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VH expuesto en la presente, combinar opcionalmente el dominio VH así provisto con uno o más dominios VL y someter a prueba el dominio VH o la combinación o las combinaciones de VH/VL para unirse a GDF-8, y (preferiblemente) someter a prueba la capacidad de tal dominio de unión antígeno para modular una o más actividades relacionadas a GDF-8. El dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos que sea sustancialmente como las dadas a conocer en la presente. Se puede emplear un método análogo en el cual se combinen una o más variantes de secuencia de un dominio VL expuesto en la presente, con uno o más dominios VH.

Un aspecto adicional de la invención provee un método de preparar un fragmento de unión de antígeno que interactúe con GDF-8. El método comprende: (a) proveer un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifiquen un dominio VH que incluya ya sea una CDR, por ejemplo CDR3, a reemplazar, o un dominio VH que carezca de una región de codificación CDR, por ejemplo CDR3; (b) combinar el repertorio con un ácido nucleico donador que codifique una CDR donadora que comprenda un fragmento activo de la SEQ ID NO: 2 ó 6, por ejemplo un ácido nucleico donador que codifique la secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la SEQ ID NO: 3 ó 7, de tal manera que el ácido nucleico donador se inserte a la región CDR, por ejemplo CDR3, en el repertorio a fin de proveer un repertorio de productos de ácidos nucleicos que codifiquen un dominio VH; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos; (d) seleccionar un fragmento de unión de antígeno que interactúe con GDF-8; y (e) recuperar el fragmento seleccionado de unión de antígeno o ácido nucleico que lo codifique. Por otra parte, se puede emplear un método análogo en el cual se combina una CDR VL (por ejemplo L3) de la invención con un repertorio de ácidos nucleicos que codifiquen un dominio VL, el cual incluye ya sea una CDR a reemplazar o que carece de una región de codificación de CDR.

Se puede introducir una secuencia de codificación de una CDR de la invención (por ejemplo CDR3) a un repertorio de dominios variables que carezcan de una CDR (por ejemplo CDR3), usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-83 describe métodos de reproducir repertorios de dominios de anticuerpos variables en los cuales se usan iniciadores de consenso dirigidos al extremo 5', o adyacentemente a éste, del área del dominio variable en conjunto con iniciadores de consenso a la tercera región de estructura de genes VH humanos para proveer un repertorio de dominios de VH variable que carecen de una CDR3. Se puede combinar el repertorio con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, se pueden mezclar las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención con repertorios de dominios VH o VL que carezcan de una CDR3 y combinar los dominios VH o VL completos mezclados con un dominio VL o VH cognado, para proveer los fragmentos de unión de antígeno de la invención. Se puede desplegar luego el repertorio en un sistema hospedero adecuado, tal como el sistema de despliegue de fagos, por ejemplo de WO 92/01047, de manera que se puedan seleccionar fragmentos adecuados de unión de antígeno. Técnicas análogas de mezclado o combinatoriales son expuestas también por Stemmer (1994) Nature 370:389-91 , que describe una técnica en relación con un gen de ß-lactamasa, pero observa que se puede usar el método para la generación de anticuerpos.

Una alternativa adicional es generar regiones VH o VL novedosas que tengan una secuencia derivada de CDR de la invención usando mutagénesis aleatoria de uno o más genes VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. Se describe tal técnica en Gram et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89:3576-80, usando una PCR propensa a error. Otro método que se puede usar para generar anticuerpos novedosos o fragmentos de los mismos es dirigir la mutagénesis a varias CDR de los genes VH o VL. Se exponen tales técnicas en Barbas et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91 :3809-13 y Schier et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:551-67. Similarmente, se pueden injertar una, dos o las tres CDR a un repertorio de dominios VH o VL que se analizan luego para un socio de unión o fragmentos de unión para GDF-8. Una porción sustancial de un dominio de inmunoglobulina variable comprenderá por lo menos la CDR y, opcionalmente, sus regiones de marco que intervienen procedentes de los fragmentos de anticuerpo como se da a conocer en la presente. La porción incluirá también por lo menos aproximadamente 50% de uno o tanto FR1 como FR4, el 50% siendo el 50% C-terminal de FR1 y el 50% N-terminal de FR4. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquéllos no relacionados normalmente con regiones de dominio variable existentes en la naturaleza. Por ejemplo, la construcción de fragmentos de anticuerpo de la presente invención elaborados mediante técnicas de ADN recombinante puede dar por resultado la introducción de residuos N- o C-terminales codificados por enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlazadores para unir los dominios variables de la invención a secuencias adicionales de proteínas que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o marcas de proteína, como se discute con más detalles a continuación. Aunque las modalidades ilustradas en los ejemplos comprenden un par de "equiparación" de dominios de VH y VL, la invención abarca también fragmentos de unión que contengan un solo dominio variable, por ejemplo un fragmento dAb, derivado de secuencias de dominios VH o VL, especialmente dominios VH. En el caso de cualquiera de los dominios de unión de cadena sencilla, se pueden usar estos dominios para analizar los dominios complementarios capaces de formar un dominio de unión de antígeno de dos dominios, capaz de unirse a GDF-8. Se puede lograr esto mediante métodos de análisis de despliegue de fagos usando el llamado método combinatorial doble jerárquico, como se expone por ejemplo en WO 92/01047. En esta técnica, se usa una colonia individual que contiene un clon de cadena ya sea H o L para infectar una genoteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y se selecciona el dominio resultante de unión de antígeno de dos cadenas de acuerdo con técnicas de despliegue de fagos, tales como las descritas en aquella referencia. Se describe también esa técnica en Marks et al., supra. Se pueden conjugar anticuerpos mediante métodos químicos con radionúclidos, fármacos, macromoléculas u otros agentes y se pueden elaborar como proteínas de fusión que comprenden una o más CDR de la invención. Una proteína de fusión de anticuerpo contiene un par VH-VL en el cual se sintetiza una de esas cadenas (usualmente VH) y otra proteína como una sola cadena de polipéptidos. Estos tipos de productos difieren de los anticuerpos en el sentido de que tienen generalmente un elemento funcional adicional - la porción activa de una molécula pequeña o la característica estructural molecular principal de la macromolécula conjugada o fusionada. Además de los cambios a la secuencia de aminoácidos delineada arriba, los anticuerpos pueden ser glicosados, pegilados o enlazados a albúmina o a un polímero no proteináceo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GDF-8 pueden enlazarse a uno de una variedad de polímeros no proteínaceos, por ejemplo polietilenglicol como propilenglicol o polioxialquilenos. Los anticuerpos pueden ser modificados químicamente, por ejemplo para incrementar su vida media de circulación mediante conjugación covalente a un polímero. Polímeros de ejemplo y métodos para fijarlos a péptidos se conocen en la técnica.

En otras modalidades, el anticuerpo puede modificarse para tener un patrón de glicosilación alterada (es decir, en relación con el patrón de glicosilación original o nativo). Como se utiliza aquí, "alterado" quiere decir que tiene una o más porciones de carbohidratos eliminadas, y/o que tiene uno o más sitios de glicosilación añadidos al anticuerpo original. La adición de sitios de glicosiliacion a un anticuerpo anti-GDF-8 se logra mediante métodos bien conocidos para alterar la secuencia de aminoácidos para que contengan secuencias de consenso de sitio de glicosilación. Otro medio para incrementar el número de porciones de carbohidratos en los anticuerpos es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a los residuos de aminoácidos del anticuerpo. La remoción de cualesquiera porciones de carbohidratos presentes en los anticuerpos puede lograrse químicamente o enzimáticamente como se conoce en la técnica. Los anticuerpos de la invención también pueden marcarse con una marca funcional o detectable como 131l o "Te, que puede fijarse a anticuerpos de la invención utilizando química convencional conocida en la técnica. Las marcas también incluyen marcas de enzima como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Las marcas a base incluyen porciones químicas como biotina, que pueden detectarse mediante unión a una porción detectable de cognado específico, por ejemplo avidina marcada. Los anticuerpos, en los cuales las secuencias CDR difieren sólo insustancialmente de aquellas enlistadas en el cuadro 1 , están abarcados dentro del alcance de la invención. Las diferencias insustanciales incluyen cambios menores en aminoácidos, por ejemplo sustituciones de uno o dos de cualesquiera 5 aminoácidos en la secuencia de un CDR. Típicamente, un aminoácido es sustituido mediante un aminoácido relacionado que tenga carga similar, hidrofobicidad o características estereoquímicas. Tales sustituciones estarían dentro de la experiencia ordinaria de un técnico. Las regiones de marco de estructura (FR) pueden modificarse más sustancialmente que CDR sin afectar adversamente las propiedades de unión de un anticuerpo. Los cambios de FR incluyen, sin restricción, humanizar una estructura derivada no de humano o diseñar ciertos residuos de marco que son importantes para el contacto con el antígeno o para estabilizar el sitio de unión, por ejemplo cambiar la clase o subclase de la región constante, cambiar residuos de aminoácido específicos que pudieran alterar una función efectora como la unión al receptor de Fc (por ejemplo Lund et al. (1991 ) J. Immunol. 147:2657-62; Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24) o cambiar la especie a partir de la cual se deriva la región constante. Los anticuerpos pueden tener mutaciones en la región CH2 de la cadena pesada que reducen o alteran la función del efector, por ejemplo la unión al receptor de Fc y activación de complemento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener mutaciones como las descritas en las patentes de E.U.A. 5,624,821 y 5,648,260. En la cadena pesada de IgG-i o lgG2, por ejemplo, tales mutaciones pueden hacerse en los residuos de aminoácidos 117 y 120 de SEQ ID NO: 19, que representa la porción Fc de IgG-i (estos residuos corresponden a aminoácidos 234 y 237 en la secuencia de longitud completa de IgGi o lgG2). Los anticuerpos también pueden tener mutaciones que estabilizan el enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas de una inmunoglobulina, como mutaciones en la región de bisagra de lgG4, como se describe por ejemplo en Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-08. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención también abarcan proteínas que son estructuralmente diferentes de los polipéptidos y anticuerpos descritos, por ejemplo que tienen una secuencia alterada pero las propiedades bioquímicas sustancialmente iguales como los polipéptidos y anticuerpos descritos, por ejemplo, tienen cambios sólo en aminoácidos funcionalmente no esenciales. Tales moléculas incluyen variantes alélicas que se presentan naturalmente y variantes diseñadas deliberadamente que contienen alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o deleciones. Las técnicas para tales alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o deleciones se conocen bien por los expertos en la técnica. Los anticuerpos de la invención pueden producirse adicionalmente utilizando animales transgénicos no humanos que se modifican para producir anticuerpos totalmente humanos en vez de los anticuerpos endógenos del animal en respuesta a la tolerancia por parte de un antígeno. Ver por ejemplo la publicación del PCT WO 94/02602. Los genes endógenos que codifican las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina en el hospedero no humano se han incapacitado y se insertan lugares activos que codifican las ¡nmunoglobulinas de cadena ligera y pesada en el genoma del hospedero. Los genes humanos se incorporan como por ejemplo utilizando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos ADN humanos de requisito. Un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas se ose obtiene como progenie al hacer una cruza de animales transgénicos intermedios que contienen menos del complemento total de las modificaciones. Una modalidad de dicho animal no humano es un ratón, y se le llama el XENOMOUSE™ como se describe en las publicaciones del PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce células B que secretan inmunoglobulinas totalmente de humano. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente del animal después de la inmunización con un inmunógeno de interés como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal o alternativamente de células B inmortalizadas derivadas del animal, como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables de humano pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente o pueden modificarse adicionalmente para obtener análogos de anticuerpos como, por ejemplo, moléculas de Fv de cadena individual. En consecuencia, el termino anticuerpo como se utiliza aquí incluye anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos por ejemplo anticuerpos Fab, F(ab')2 Fd.dAb y scFv y anticuerpos intactos y fragmentos que se han mutado ya sea en sus regiones constantes y/o variables (por ejemplo mutaciones para producir anticuerpos completamente humanizados, parcialmente humanizados o quiméricos, así como producir anticuerpos con un rasgo deseado, por ejemplo mejor unión GDF-8 y/o menor unión a FcR).

Como tal, estos anticuerpos incluyen en el alcance la invención, siempre que el anticuerpo según específicamente a GDF-8, interfiera con la señalización de GDF-8 y/o neutralice o inhiba una o más actividades relacionadas con GDF-8. Otras moléculas de unión a proteína también pueden emplearse para modular la actividad de GDF-8. Tales moléculas de unión a proteína incluyen pequeños fármacos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP™) (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA). SMIP son polipéptidos de cadena individual compuestos por un dominio de unión para una estructura similar como un antígeno, o un contrarreceptor o similares, un polipéptido de región de bisagra que tiene ya sea uno o nulos residuos de cisteína y dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina (ver también www.trubion.com). SMIP y usos y aplicaciones se describen en, por ejemplo, las solicitudes de patentes publicadas de los Estados Unidos No. 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 y 2005/0238646, y miembros relacionados de la familia de patentes de éstas, todas de las cuales son aquí incorporadas mediante referencia aquí en sus totalidades. La capacidad de unión de un anticuerpo de la invención puede medirse mediante los siguientes métodos: análisis Biacore, ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), cristalografía de rayos X, análisis de secuencia y mutagénesis de escaneo como se describe en los ejemplos a continuación y otros métodos que son bien conocidos en la técnica.

La capacidad de un anticuerpo de la invención para neutralizar y/o inhibir una o más actividades relacionadas con GDF-8 puede medirse mediante la siguiente lista no excluyente de métodos: ensayos para medir la proliferación de una línea celular dependiente de GDF-8; ensayos para medir la expresión de polipéptidos mediados por GDF-8; ensayos que miden la actividad de moléculas de señalización hacia el extremo 3'; ensayos que prueban la eficiencia de un anticuerpo de la invención para evitar trastornos musculares en un modelo animal relevante; ensayos como se describen en los ejemplos a continuación; y otros ensayos que son bien conocidos en la técnica. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para seleccionar anticuerpos capaces de unir GDF-8 y naturalizar y/o inhibir una o más actividades relacionadas con GDF-8. El método comprende: a) contraer una pluralidad de anticuerpos con GDF-8; b) elegir anticuerpos que se unan a GDF-8; c) probar la capacidad de anticuerpos probados para evitar que GDF-8 se una al receptor de GDF-8; y d) seleccionar anticuerpos capaces de evitar que GDF-8 se una a su receptor. Los anticuerpos GDF-8 de la invención también son útiles para aislar, purificar y/o detectar GDF-8 en sobrenadantes, usados celulares o sobre una superficie celular. Los anticuerpos descritos en esta invención pueden utilizarse como diagnóstico para monitorear niveles de proteína de GDF-8 como parte de un procedimiento de prueba clínica. Adicionalmente los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en tratamientos que requieren la neutralización y/o inhibición de una o más actividades relacionadas con GDF-8, por ejemplo tratamientos para ALS y otras patologías relacionadas con músculos. La presente invención también proporciona polinucleótidos y polipéptidos novedosos aislados y purificados relacionados con anticuerpos novedosos dirigidos contra GDF-8 de humano. Los genes, polinucleótidos, proteínas y polipéptidos de la presente invención incluyen, sin restricción, anticuerpos de murino y humanizados a GDF-8 (p.ej., RK35) y variantes de éstos.

D. Ácidos nucleicos, clonación y sistemas de expresión La presente invención además proporciona ácidos nucleicos aislados y purificados que codifican anticuerpos de la presente invención. Los ácidos nucleicos de conformidad con la presente invención pueden comprender ADN o ARN y pueden ser total o parcialmente sintéticos. La referencia a secuencias de nucleótidos como se delinea aquí abarca moléculas de ADN con las secuencias específicas o equivalentes genómicos así como moléculas ARN con las secuencias especificadas en las cuales U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera otra cosa. Por ejemplo, la invención proporciona polinucleótidos purificados y aislados que codifican la región variable de un anticuerpo de murino a GDF-8 que modula una o más actividades relacionadas con GDF-8 (por ejemplo neutraliza la bioactividad GDF-8) (RK35), y una versión humanizada de RK35.

Secuencias de ADN preferidas de la invención incluyen secuencias genómicas, de ADNc, y de ADN químicamente sintetizadas. Las secuencias de nucleótido de la invención incluyen aquellas que codifican las regiones variables de cadena ligera de RK35 de ratón que se establecen en SEQ ID NO:4, incluyendo aquellas que codifican una secuencia líder que precede a la secuencia de región variable de cadena ligera, por ejemplo la secuencia de nucleótidos establecidas como SEQ ID NO:30 (los nucleótidos 1 -60 corresponden a la secuencia líder y los nucleótidos 61-381 corresponden a SEQ ID NO:4). Las secuencias de nucleótido de la invención también incluyen aquellas que codifican la región variable de cadena pesada de RK35 que se establece en SEQ ID NO: 2, incluyendo aquellas que codifican una secuencia líder que precede la región variable de cadena pesada, por ejemplo la secuencia de nucleótidos establecida como SEQ ID NO: 28 (nucleótidos 1-57 corresponden a la secuencia líder y los nucleótidos 58-405 corresponden a SEQ ID NO: 2). Las secuencias de nucleótido de la invención también incluyen secuencias humanizadas de las regiones variables de cadena ligera y pesada, como las que se establecen en SEQ ID NO: 6 y 8, respectivamente. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que hibridan bajo condiciones estrictas a las secuencias de ácido nucleico que se establecen en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, y complementos de éstas y/o codifican polipéptidos que retienen actividad biológica sustancial (es decir fragmentos activos) en las regiones variables. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen porciones continuas de las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, que comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos. La secuencia de aminoácido de las cadenas ligeras variables de RK35 de ratón se establece en SEQ ID NO: 5. Un ejemplo de una secuencia de aminoácido del domino de cadena ligera variable de RK35 de ratón precedida por una secuencia líder se establece como SEQ ID NO: 31. La secuencia de aminoácido de las cadenas pesadas variables de RK35 se estable en SEQ ID NO: 3. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable de RK35 de ratón precedida por una secuencia líder se establece como SEQ ID NO: 29. Las secuencias de aminoácido de cadenas ligeras y pesadas variables humanizadas como se estable en SEQ ID NOs: 7 y 9, respectivamente. Las secuencias de aminoácido de los CDR contenidos dentro de las cadenas pesadas de RK35 de ratón se establecen en SEQ ID NO: 10-12 y 20-22. Las secuencias de aminoácido de los CDR contenidos dentro de las cadenas ligeras de RK35 de ratón se establecen en SEQ ID NOJ 3-15 y 23-25. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen porciones continuas de cualquiera de las secuencias sustancialmente establecidas en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 10-15 y 20-25 que comprenden al menos 5 aminoácidos consecutivos. Un polipéptido preferido de la presente invención incluye cualquier porción continua de cualquier secuencia sustancialmente establecida en SEQ ID NO: 3, 5 7, 9 y 10-15 que retiene actividad biológica sustancial de un anticuerpo de la invención. Además de los polinucleótidos descritos arriba, la presente invención también ¡ncluye polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos sustancialmente establecidas en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 y 10-15 o una porción continua de éstas y que difieren de los polinucleótidos descritos arriba sólo debido a la degeneración bien conocida del código genético. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden utilizarse como sondas de hibridación e iniciadores para identificar y aislar ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas a o similares a aquellas que codifican los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos aislados de esta manera pueden utilizarse, por ejemplo, para producir anticuerpos contra GDF-8 u otros miembros de la familia de TGF-8 o para identificar células que expresan tales anticuerpos. Los métodos de hibridación para identificar y . aislar ácidos nucleicos incluyen reacción en cadena de polimerasa (PCR), hibridaciones Southern, hibridación in situ e hibridación Northern, y todas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Las reacciones de hibridación pueden realizarse bajo diferentes condiciones estrictas. La severidad de una reacción de hibridación incluye la dificultad con la cual cuales dos moléculas de ácido nucleico se hibridarán una con la otra. Preferiblemente, cada polinucleótido de hibridación hibrida a su polinucleótido correspondiente bajo condiciones de severidad reducida, más preferiblemente condiciones severas y más preferiblemente condiciones altamente severas. Ejemplos de condiciones de severidad se muestran en el cuadro 3 a continuación: las condiciones altamente severas son aquellas que son al menos tan severas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones severas que son al menos tan severas como, por ejemplo, las condiciones G-L, y las condiciones de menor severidad al menos tan severas como, por ejemplo, las condiciones M-R.

CUADRO 3 La longitud de híbrido es la anticipada para las regiones hibndadas de los po nucleotidos hibpdados Cuando se híbrida un polmucleotido a un pohnucleotido objetivo de secuencia desconocida la longitud del híbrido se asume como la del polinucleótido de hibridación Cuando polmucleotidos de secuencias conocidas son hibndados, la longitud de hibridación puede determinarse al alinear las secuencias de los po nucleótidos e identificar la región o regiones de complementapedad de secuencia óptima 2 SSPE (IxSSPE es 0 15 NaCI, 10 mM NaH2P04, y 1 25 M EDTA, pH 7 4) puede sustituirse por SSC (1xSSC es 0 15 M NaCI y 15 mM de citrato de sodio) en la hibridación y soluciones reguladoras de lavado, los lavados se realizan por 15 minutos después de que se completa la hibridación TB* - TR\ la temperatura de hibridación para híbridos anticipada como menos de 50 pares de base en longitud debería estar a 5-10°C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones Para híbridos con menos de 18 pares de base de longitud, Tm(°C)=2(# de bases A + T)+ 4(# de bases G + C) Para híbridos entre 18 y 49 pares de base de longitud, Tm(°C)=81 5 + 16 6(log,0Na*) + 0 41(%G + C)-(600/N) en donde N es el numero de bases en el híbrido y Na* es la concentración de iones de sodio en la solución reguladora de hibridación (NA' para 1X SSC = 0 165 M) Ejemplos adicionales de condiciones estrictas para la hibridación de polinucleotidos se proporcionan en Sambrook et al Molecular Cloning A laboratory Manual, Chs 9 & 11 , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y Ausubel et al , eds , Current Procois m Molecular Biology, Sects 2 10 & 6 3-6 4 John Wiley & Sons Inc (1995), incorporados aquí mediante referencia Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden utilizarse como sondas de hibridación e iniciadores para identificar y aislar ADN que tienen secuencias que codifican variantes alélicas de los polinucleótidos descritos. Las variantes alélicas son formas alternativas que se presentan naturalmente de los polinucleótidos descritos que codifican polipéptidos que son idénticos a o que tienen una gran similitud con los polipéptidos codificados por los polinucleótidos descritos. Preferiblemente, las variantes alélicas tienen al menos 90% de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos 95% de identidad; más preferiblemente al menos 99% de identidad) con los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden utilizarse como sondas de hibridación e iniciadores para identificar y aislar ADN que tienen secuencias que purifican polipéptidos homólogos a los polinucleótidos descritos. Estos homólogos son polinucleótidos y polipéptidos aislados de diferentes especies a los de los polipéptidos y polinucleótidos descritos, o dentro de la misma especie, pero con una similitud de secuencia significativa a los de los polinucleótidos y polipéptidos descritos. Preferiblemente, los homólogos de polinucleótido tienen al menos 50% de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos 75% de identidad; más preferiblemente al menos 90% de identidad) con los polinucleótidos descritos, mientras que los homólogos de polipéptido tienen al menos 30% de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos 45% de identidad; más preferiblemente al menos 60% de identidad) con los polipéptidos/anticuerpos descritos. Preferiblemente, los homólogos de los polinucleótidos y polipéptidos descritos son aquellos aislados de especies de mamíferos. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden también utilizarse como sondas de hibridación e iniciadores para identificar células y tejidos que expresan los anticuerpos de la presente invención y las condiciones bajo las cuales se expresan. Adicionalmente, los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden utilizarse para alterar (es decir mejorar, reducir o modificar) la expresión de los genes que corresponden a los polinucleótidos de la presente invención en una célula u organismo. Estos "genes correspondientes" son las secuencias de ADN genómico de la presente invención que se transcribe para producir los ARNm a partir de los cuales se derivan los polinucleótidos de la presente invención. La presente invención también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores, cassettes de transcripción o expresión que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención como se mencionó arriba. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden enlazarse operativamente a una secuencia de puntos de expresión para la producción recombinante de los polipéptidos de la presente invención. Adicionalmente un experto en la técnica reconocerá que los polinucleótidos de la invención pueden enlazarse operativamente a secuencias de nucleótido bien conocidas que codifican la región constante de varios isótopos de anticuerpo. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención que codifica una región variable de cadena ligera de la invención (la secuencia establecida en SEQ ID NO:4 u 8) puede enlazarse operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica la región constante (o derivados de ésta) de una cadena ligera K O cadena ligera ?, tal que la expresión de los nucleótidos enlazados resultará en una cadena ligera completa kappa o lambda con una región variable que se une específicamente a y neutraliza a GDF-8. De manera similar, un polinucleótido de la invención que codifica una región variable de cadena pesada de la invención (por ejemplo la secuencia establecida en SEQ ID NO:2 o 6) puede enlazarse operativamente una secuencia de nucleótido que codifica la región constante de un isotipo de cadena pesada (o derivados de éste), por ejemplo IgM, IgD, IGE, IgG e IgA. Métodos generales para expresar proteínas recombinantes se conocen bien en la técnica. Tales proteínas recombinantes pueden expresarse en forma soluble para uso en tratamiento de trastorno relacionados con actividades GDF-8, por ejemplo trastornos degenerativos de músculos y huesos. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, como secuencias que regulen la replicación del vector en células hospederas (por ejemplo orígenes de replicación), secuencias de marca como histidina, y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospederas dentro de las cuales se ha introducido el vector. Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera dentro de la cual se ha introducido el vector. Genes marcadores seleccionados preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células hospederas dhrf con selección/amplificación de amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418). Vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado, pueden elegirse o construirse. Los vectores pueden ser plásmidos o virales, por ejemplo fagos o fagémidos, según sea apropiado. Para mayores detalles vea por ejemplo Molecular Cloning: a Laboratory Manual:2 nd ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Muchas técnicas y protocolos conocidos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcción de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y en expresión génica, y análisis de proteína, se describen en detalle Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. La presente invención también proporciona una célula hospedera que comprende una o más construcciones como los anteriores. Un ácido nucleico que codifica cualquier CDR (H1 , H2, H3, L1 , L2, o L3) dominio VH o VL o fragmentos de unión antígeno como se estipula aquí, forma un aspecto de la presente invención. La presente invención también incluye un método para producir un péptido al expresar la proteína a partir del ácido nucleico en una célula hospedera. La expresión puede lograrse al cultivar células hospederas recombinantes que contienen el ácido nucleico bajo condiciones apropiadas. Fragmentos anticuerpos específicos, dominios VH y/o VL, y codificación de moléculas de ácido nucleico y vectores de conformidad con la presente invención puede estipularse para hacer aislado y purificados, por ejemplo a partir de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso de ácidos nucleicos, libres o sustancialmente libres de ácidos nucleicos o genes de origen distintos a la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. Una serie de líneas celulares son células hospederas adecuadas para la expresión recombinante de los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención. Las líneas celulares hospederas de mamífero incluyen, por ejemplo, células COS, células CHO, células 293T, células A431 , células 3T3, células CV-1 , células HeLa, células L, células BHK21 , células HL-60, células U937, células HaK, células Jurkat, así como cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario y explantaciones primarias. Tales células hospederas también permiten el empalmado de los polinucleótidos de la invención que consisten en ADN genómico. Alternativamente, puede ser posible producir recombinantemente los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención en eucariotes inferiores como en levaduras o en procariotes. Cepas de levadura potencialmente adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces y cepas de Candida. Cepas bacterianas potencialmente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, y Salmonella typhimurium. Si los polipéptidos de la presente invención se hacen en levadura o bacterias, puede ser necesario modificarla mediante, por ejemplo, fosforilación o glicosilación de sitios apropiados, para obtener proteínas funcionales. Tales uniones covalentes pueden lograrse utilizando métodos enzimáticos o químicos bien conocidos. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención también pueden producirse recombinantemente al enlazar operativamente los polinucleótidos aislados de la presente invención a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insecto, como vectores de baculovirus y emplear un sistema de expresión celular de insectos. Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/Sf9 están comercialmente disponibles en forma de equipos (por ejemplo el equipo MAXBAC®, Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la expresión recombinante en las células hospederas apropiadas, los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden purificarse del medio de cultivo o extracto celulares utilizando procesos de purificación conocidos, como filtración por gel y cromatografía de intercambios de iones. La purificación también puede incluir cromatografía de afinidad con agentes que se sabe unen los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención. Estos procesos de purificación también pueden utilizarse para purificar los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención a partir de fuentes naturales. Alternativamente, los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden expresarse recombinantemente en una forma que facilite su purificación. Por ejemplo, los polipéptidos pueden expresarse como fusiones con proteínas, como proteína de unión a maltosa (MBP), glutationa-S-transferasa (GST), o tioredoxina (TRX). Equipos para expresión y purificación de tales proteínas de fusión están comercialmente disponibles con New England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ), e Invitrogen, respectivamente. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención también pueden marcarse con un epítope pequeño e identificarse posteriormente o purificarse utilizando un anticuerpo específico al epítope. Un epítope preferido es el epitope FLAG, que está comercialmente disponible con Eastman Kodak (New Haven, CT).

Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención también pueden producirse mediante síntesis químicas convencionales conocidas. Métodos para sintetizar químicamente los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales polipéptidos y anticuerpos químicamente sintéticos pueden poseer propiedades biológicas comunes con los polipéptidos y anticuerpos purificados naturales y por ende pueden emplearse como sustitutos biológicamente activos o inmunológicos para los anticuerpos y polipéptidos naturales. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula hospedera que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, vectores o anticuerpos y fragmentos de éstos como se describe aquí. Un incluso aún aspecto adicional proporciona un método que comprende introducir un ácido nucleico de la invención en una célula hospedera. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas, técnicas adecuadas pueden incluir transfección de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción utilizando un retrovirus u otro virus, por ejemplo vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación e infección utilizando bacteriófagos. A la introducción de ácidos nucleicos puede seguirle ocasionar o permitir la producción de proteínas del ácido nucleico, por ejemplo mediante cultivo de las células hospederas bajo condiciones adecuadas para la expresión génica. Tales condiciones son bien conocidas en la técnica.

III. Métodos para tratar, mejorar, prevenir e inhibir el avance de trastornos óseos, adiposos, de metabolismo de glucosa, de insulina y musculares La participación de GDF-8 en ALS y el descubrimiento de los anticuerpos novedosos de la invención, permite métodos para tratar, aliviar y mejorar trastornos relacionados con GDF-8, por ejemplo trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos de los huesos, trastornos óseos inducidos o metabólicos, trastornos por metabolismo de glucosa, trastornos de adiposa y trastornos relacionados con insulina. Adicionalmente, los anticuerpos permiten el diagnóstico, prognosis y monitoreo del avance de trastornos óseos, musculares, adiposos o de insulina al medir el nivel de GDF-8 en una muestra biológica. En particular, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar a un individuo con ALS u otro trastorno muscular o en un método para distinguir si un paciente sufre de ALS u otro trastorno muscular. Los anticuerpos y otras moléculas de la presente invención son útiles para prevenir, diagnosticar o tratar varios trastornos médicos en humanos o animales. Los anticuerpos pueden utilizarse para inhibir o reducir una o más actividades relacionadas con GDF-8. Más preferiblemente, los anticuerpos inhiben o reducen uno o más de las actividades de GDF-8 en relación con actividades no ligadas a GDF-8. En ciertas modalidades, al actividad de GDF-8, cuando se une mediante uno o más anticuerpos GDF-8 se inhiben al menos 50%, preferiblemente al menos 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, u 88%, más preferiblemente al menos 90, 91 , 92, 93 ó 94%, e incluso más preferiblemente al menos 95% a 100% en relación con una proteína GDF-8 madura que no está unida mediante uno o más de los anticuerpos anti-GDF-8. La inhibición o neutralización de la actividad de GDF-8 puede medirse, por ejemplo en ensayos de genes reporteros pGL3(CAGA)12 (RGA) como se describe en Thies et al., supra, y en los ensayos de receptores de ActRIIB como se ilustran en los ejemplos. Los trastornos médicos diagnosticados, pronosticados, monitoreados, tratados, mejorados o prevenidos mediante anticuerpos GDF-8 son trastornos relacionados con GDF-8, por ejemplo trastornos musculares o neuromusculares incluyendo por ejemplo distrofia muscular (MD; incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular, atrofia de órganos, debilidad, síndrome de túnel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia y otros síndromes de desgaste muscular (por ejemplo ocasionados por otras enfermedades y condiciones). Adicionalmente, otros trastornos que pueden ser diagnosticados, pronosticados, como monitoreados, tratados, mejorados o prevenidos mediante los anticuerpos GDF-8 son trastornos de tejido adiposo como obesidad, diabetes tipo 2, tolerancia disminuida a la glucosa, síndromes metabólicos (por ejemplo síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma (como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno) o enfermedades degenerativas del hueso (por ejemplo osteoartritis, osteoporosis, etcétera). En modalidades preferidas los trastornos que se diagnostican, pronostican, monitorean, tratan, mejoran o previenen mediante anticuerpos GDF-8 son trastornos neuromusculares o musculares. En una modalidad más preferida, el trastorno muscular o neuromuscular que se diagnostica, pronostica, monitorea, trata, mejora o previene mediante anticuerpos anti- GDF-8 es MD o ALS. En la modalidad más preferida de la invención, el trastorno muscular o neuromuscular que se diagnostica, pronostica, monitorea, trata, mejora o previene mediante antagonistas de GDF-8 de la presente invención, por ejemplo anticuerpos que inhiben a la actividad de GDF-8, es ALS. Otros trastornos médicos que pueden diagnosticarse, pronosticarse, monitorearse, tratarse, mejorarse o prevenirse mediante antagonistas de GDF-8 son aquellos relacionados con una pérdida de hueso que incluye osteoporosis, especialmente en los mayores y/o mujeres posmenopáusicas, osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteopenia, osteoartritis y fracturas relacionadas con osteoporosis. Otras enfermedades y trastornos óseos metabólicos objetivo incluyen baja masa ósea debido a terapia crónica con glucocorticoide, falla gonadal prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa. Los anticuerpos preferiblemente se utilizan para diagnosticar, pronosticar, monitorear, tratar, mejorar o prevenir tales trastornos en mamíferos, en particular en humanos.

Los anticuerpos de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Por lo general una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad, condición o sexo del sujeto, así como la severidad de la condición médica en el sujeto. La dosificación puede determinarse por parte de un médico y ajustarse, según sea necesario, para adecuarse a los efectos observados del tratamiento. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos de estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo para determinar LD50 (la dosis letal para 50% de una población) y ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de una población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos, es decir LD50/ED50, es el índice terapéutico y se prefieren anticuerpos que muestren grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos celulares y estudios animales pueden utilizarse para formular una gama de dosificaciones para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos está preferiblemente dentro de una escala de concentraciones en circulación que incluye ED50 con escasa o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de esta escala dependiendo de la forma de dosificación y la ruta de administración. Para cualquier anticuerpo utilizado en la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede calcularse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr una escala de concentración en plasma en circulación que incluye IC50 (por ejemplo la concentración del anticuerpo de prueba que logra una inhibición media máxima de síntomas o inhibición media máxima de inhibición de actividad biológica) como se determina en cultivos celulares. Se pueden medir los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño. Los efectos de cualquier dosificación en particular pueden monitorearse mediante un bioensayo adecuado. Ejemplos de bioensayo adecuados incluyen, sin restricción, ensayos de replicación de ADN, ensayos basados de trascripción, ensayos de unión a receptor/proteína GDF-8, ensayos de creatina cinasa, ensayos basados en la diferenciación de preadipocitos, ensayos basados en la captación de glucosa en adipositos, y ensayos inmunológicos. Por lo general, las composiciones se administran para que los anticuerpos o sus fragmentos de unión se den en una dosis a partir de 1 µg/Kg a 150 mg/kg, 1 µg/Kg a 100 mg/kg, 1 µg/kg a 50 mg/kg, 1 µg/kg a 20 mg/kg, 1 µg/kg a 10 mg/kg, 1 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 100 µg/kg, 100 µg a 1 mg/kg, y 500 µg/kg a 1 mg/kg. Preferiblemente, los anticuerpos se dan como una dosis en bolo para aumentar al máximo los niveles en circulación de los anticuerpos para la mayor longitud después de la dosis. La infusión continua también puede utilizarse antes, después o en lugar de la dosis en bolo.

IV. Métodos para identificar agentes terapéuticos Incluso otros aspecto de la invención proporciona un método para identificar agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de trastornos musculares, por ejemplo metabolismo de glucosa, adiposa, y trastornos óseos. Ensayos de detección apropiados, por ejemplo ensayos basados en ELISA se conocen en la técnica. En dicho ensayo de detección, se forma una primera mezcla de unión al combinar un anticuerpo de la invención y su ligando GDF-8 y la cantidad de unión entre ligando y el anticuerpo en la primera mezcla de unión (Mo) se mide. Una segunda mezcla de unión también se forma al combinar el anticuerpo, el ligando, y un compuesto o agente a ser detectado, y la cantidad de unión entre ligando y el anticuerpo en la segunda mezcla de unión (Mi) se mide. Las cantidades de unión en la primera y segunda mezclas de unión se comparan, por ejemplo, al calcular la relación M^Mo. El compuesto agente se considera capaz de inhibir la actividad de GDF-8 si se observa una disminución de unión en la segunda mezcla de unión en comparación con la primera mezcla de unión (es decir M-|/M0<1 ). La formulación y optimización de mezclas de unión está dentro del nivel de experiencia en la técnica; tales mezclas de unión también pueden contener soluciones reguladoras y sales necesarias para mejorar u optimizar la unión, y ensayos de control adicionales pueden incluirse en el ensayo de detección de la invención. Los compuestos que se ha encontrado reducen la unión de anticuerpo-ligando mediante al menos alrededor de 10% (es decir, M1/M0<0.9), preferiblemente mayor que alrededor de 30%, pueden así identificarse y luego, si se desea, detectarse de forma secundaria en cuanto a la capacidad para inhibir la actividad de GDF-8 en otros ensayos como ensayo de unión a ActRIIB u otros ensayos basados en células e in vivo, se describen en los ejemplos o se conocen bien en la técnica.

V. Moléculas pequeñas Inhibir la actividad de GDF-8 en un organismo (o sujeto) afligido con (o en riesgo de) un trastorno relacionado con GDF-8, o en una célula de dicho organismo involucrado en tales trastornos, también puede lograrse mediante el uso de moléculas pequeñas de antagonista (por lo general moléculas pequeñas orgánicas) que antagonizan, es decir inhiben la actividad de GDF-8. Moléculas pequeñas antagonistas novedosas pueden identificarse mediante métodos de detección descritos arriba y pueden utilizarse en métodos de tratamiento de la presente invención que se describen aquí. Por el contrario, incrementar la actividad de GDF-8 en un organismo (o sujeto) afligido con (o en riesgo de) un trastorno relacionado con una menor expresión de GDF-8 y/o actividad o un trastorno relacionado con menores niveles de GDF-8 también puede lograrse mediante el uso de moléculas pequeñas (por lo general, moléculas pequeñas orgánicas) que agonizan, es decir mejoran la actividad de, GDF-8. Moléculas pequeñas agonistas novedosas pueden identificarse mediante los métodos de detección descritos arriba y pueden utilizarse en métodos de tratamiento de la presente invención descrita aquí.

VI. Métodos para diagnosticar, pronosticar y monitorear el avance de trastornos óseos, adiposos, de metabolismo de glucosa y musculares Además de tratar, por ejemplo trastornos musculares, óseos, de metabolismo de glucosa y adiposos, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar tales trastornos al detectar la disminución o incremento de GDF-8 en una muestra biológica, por ejemplo suero, plasma, fluido de lavado broncoalveolar, esputo, biopsia (por ejemplo de músculos), etc. "Diagnosticar" o "diagnóstico" quiere decir identificar la presencia o ausencia de una condición patológica. Los métodos de diagnóstico involucran detectar la presencia de GDF-8 mediante, por ejemplo, determinar una cantidad de prueba de polipéptido GDF-8 en una muestra biológica de un sujeto (humano o mamífero no animal) y comparar la cantidad de prueba con una cantidad o rango normal (por ejemplo una cantidad o rango de una persona que no se sepa sufre de tal trastorno) del polipéptido de GDF-8. Aunque un método de diagnóstico en particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de ALS u otros trastornos relacionados con GDF-8, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayude en el diagnóstico.

La presente invención también proporciona métodos para pronosticar ALS u otros trastornos musculares, o por ejemplo trastornos óseos, de metabolismo de glucosa y adiposos al detectar la regulación al alza de GDF-8. "Pronóstico" o "pronosticar" quiere decir predecir el desarrollo probable y/o severidad de una condición patológica. Métodos de pronóstico incluyen determinar la cantidad de prueba de GDF-8 en una muestra biológica a partir de un sujeto, y comparar la cantidad de prueba a una cantidad de pronóstico o rango (por ejemplo una cantidad o rango de individuos con severidades variadas de por ejemplo ALS) para GDF-8. Varias cantidades de GDF-8 en una muestra de prueba son consistentes con ciertos pronósticos para ALS u otros trastornos relacionados con GDF-8. La detección de una cantidad de GDF-8 en un nivel de pronóstico particular proporciona un pronóstico para el sujeto. La presente invención también proporciona métodos para monitorear el curso de ALS u otros trastornos relacionados con GDF-8 al detectar la regulación al alza o regulación a la baja de GDF-8. Métodos de monitoreo involucran determinar las cantidades de prueba de GDF-8 en muestras biológicas tomadas de un sujeto en un primer y segundo tiempo y comparar las cantidades. Un cambio en cantidad de GDF-8 entre el primer y segundo tiempo indica un cambio del curso de, por ejemplo, severidad de, ALS u otros trastornos relacionados con GDF-8. Un experto en la técnica reconocerá que en trastornos relacionados con GDF-8 similares a ALS, por ejemplo cuando un incremento en masa muscular es deseable, la disminución en cantidades ALS y/o actividades GDF-8 entre el primer y segundo tiempo indica remisión del trastorno y un incremento en cantidad indica avance del trastorno. Tales ensayos de monitoreo también son útiles para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica particular (por ejemplo atenuación de enfermedad y/o inversión) en pacientes siendo tratados para ALS u otros trastornos relacionados con GDF-8. Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para el diagnóstico, pronóstico o monitoreo al detectar la presencia de GDF-8 in vivo o in vitro. Tales métodos de detección son bien conocidos en la técnica e incluyen ELISA, radioinmunoensayo, inmunoblot, Western blot, ¡nmunofluorescencia, inmunoprecipitación y otras técnicas comparables. Los anticuerpos pueden además ser provistos en un equipo de diagnóstico que incorpora una o más de estas técnicas para detectar GDF-8. Dicho equipo puede contener otros componentes, empaques, instrucciones u otro material para ayudar a la detección de la proteína y uso del equipo. Cuando los anticuerpos se pretenden para diagnóstico, pronóstico o monitoreo, puede ser deseable modificarlos, por ejemplo, con un grupo ligando (como biotina) o un grupo marcador detectable (como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima). Si se desea, los anticuerpos (ya sea policlonales o monoclonales) pueden marcarse utilizando técnicas convencionales. Marcas adecuadas incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos, reactivos densos en electrones, enzimas y ligandos que tienen socios de unión específicos. Las enzimas típicamente se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante puede detectarse mediante su capacidad para convertir tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azul, que se cuantifica con un espectrofotómetro. Otras marcas adecuadas pueden incluir biotina y avidita o estreptavidina, IgG y la proteína A, y los numerosos pares de receptor ligando conocidos en la técnica. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes a los expertos de la técnica y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la invención de ejemplo.

Vil. Composiciones farmacéuticas y métodos de administración La presente invención proporciona composiciones que comprenden un antagonista de GDF-8 de la invención, es decir polipéptidos, polinucleótidos, vectores, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y moléculas pequeñas. Tales composiciones pueden ser adecuadas para uso farmacéutico y su administración a pacientes. Las composiciones típicamente comprenden uno o más moléculas de la presente invención, preferiblemente un anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos anti-GDF-8 de la presente invención pueden utilizarse in vitro, ex vivo o incorporados en una composición farmacéutica cuando se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza aqui la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los solventes, soluciones, soluciones reguladoras, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngícos, agentes isotónicos y de demora de absorción y similares, que sean compatibles con administración farmacéutica. Dicha composición puede contener, además de los anticuerpos de la invención y el portador, varios diluyentes, llenadores, sales, soluciones reguladoras, estabilizadores, solubilizadores y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" quiere decir un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Las características del portador dependerán de la ruta de administración. El uso de tales medios y activos para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionen funciones adicionales, suplementales o mejoradas terapéuticas. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluirse en un contenedor, empaque o despachador junto con instrucciones para su administración. La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un liposoma en la cual un anticuerpo de la invención se combina, además de otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes amfifáticos como lipidos que existen en una forma agregada como micelos, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamelares mientras están en una solución acuosa. Lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin restricción monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidas, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales está dentro del nivel de experiencia en la técnica.

Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" quiere decir la cantidad total de cada componente activo de una composición farmacéutica o un método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para un paciente, por ejemplo mejora de síntomas, curación de, o incrementar la proporción de curación de tales condiciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, se administra solo, el término se refiere a ese ingrediente únicamente. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico, ya sea administrado en combinación, en serie simultáneamente. Al llevar a la práctica el método de tratamiento o uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de, por ejemplo, un anticuerpo que se une a GDF-8 e interfiere con la señalización de GDF-8 se administra a un sujeto, por ejemplo mamífero (por ejemplo un humano). Un anticuerpo de la invención puede administrarse de conformidad con el método de la invención ya sea sólo o en combinación con otras terapias como agentes antiinflamatorios. Cuando se coadministra con uno o más agentes, un anticuerpo de la invención puede administrarse ya sea simultáneamente con el segundo agente o en secuencia. Si se administra en secuencia, el médico tratante decidirá la secuencia apropiada para administrar un anticuerpo de la invención en combinación con otros agentes. En una modalidad, los anticuerpos de la invención, por ejemplo composiciones farmacéuticas de ésta se administran en terapia de combinación, es decir combinados con otros agentes, por ejemplo agentes terapéuticos, que son útiles para tratar condiciones o trastornos patológicos, como trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos óseos, trastornos óseos metabólicos o inducidos, trastornos de adiposa, trastornos de metabolismo de glucosa o trastornos relacionados con insulina, por ejemplo así como trastornos alérgicos e inflamatorios. El término "en combinación" en este contexto quiere decir que los agentes se dan sustancialmente contemporáneamente, ya sea simultáneamente o secuencialmente. Si se da secuencialmente, al inicio de administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos preferiblemente es aún detectable a concentraciones efectivas en el sitio de tratamiento o en el sujeto. Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta de administración pretendida. Métodos para lograr la administración son conocidos por los expertos en la técnica. También puede ser posible obtener composiciones que pueden administrarse tópicamente u oralmente o que pueden ser capaces de trasmitirse a través de membranas mucosas. La administración de un anticuerpo de la invención utilizado en una composición farmacéutica para poner en práctica el método de la presente invención puede llevarse a cabo en una serie de maneras convencionales, como ingestión oral, inhalación, cutánea, subcutánea o inyección intravenosa.

Soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación intradérmica o subcutánea típicamente incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacteriales tales como alcohol de bencilo o metilparaben; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; los agentes quelantes tales como el ácido etilendiamintetraacético; reguladores de pH tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Tales preparaciones pueden encerrarse en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechas de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la inyección incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o de dispersión. Para administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacterioestática, Cremophor™ EL (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina regulada con pH de fosfato (PBS)- En todos los casos la composición debe ser estéril y debe fluir de tal manera que exista fácil jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y debe de protegerse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglico líquido y similares), y las mezclas adecuadas del mismo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, al usar un revestimiento tal como lecitina, al mantener el tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión y al usar agentes tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse por varios agentes antibacteriales y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo al incluir en la composición un agente que retrace la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención se administra por, por ejemplo inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de enlace estará en la forma de una solución acuosa aceptable parenteralmente libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones de proteína aceptables parenteralmente, que tienen debida relación con el pH, isotonicidad, estabilidad y similares está dentro de los expertos en la técnica. Una composición farmacéutica aceptable para inyección intravenosa, cutánea, o subcutánea debe contener, además de agentes de enlace, un vehículo isotónico tal como la inyección de cloruro de sodio, la inyección de Ringer, inyección de dextrosa, e inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer lactado u otro vehículo como se conoce en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden contener estabilizadores, conservadores, reguladores de pH, antioxidantes u otros aditivos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La cantidad del anticuerpo de la invención (u otros antagonistas de la invención) en la composición farmacéutica de esta invención dependerán de la naturaleza y severidad de la condición que se ha tratado, y en la naturaleza de los tratamientos anteriores experimentados por el paciente. En última instancia, el médico tratante decidirá la cantidad de anticuerpos con la cual tratará cada paciente individual. Inicialmente, el médico tratante administra dosis bajas de anticuerpo y observa la respuesta del paciente. Las dosis grandes de anticuerpo pueden administrarse hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto, la dosis generalmente no se aumenta más. Se ha observado que varias composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar el método de esta invención deben contener aproximadamente OJ µg a 50 mg de anticuerpos por kilo en peso corporal. La duración de la terapia utilizada en la composición farmacéutica de esta invención variará, dependiendo de la severidad de la enfermedad que se está tratando y la condición y respuesta idiosincrática potencial de cada paciente. También se observa que la duración de cada aplicación de anticuerpos será por medio de, por ejemplo la ruta subcutánea y por ejemplo, en el alcance de una vez a la semana. Al final, el médico tratante decidirá la duración adecuada de la terapia utilizando la composición farmacéutica de esta invención. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte de un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el antagonista GDF-8 (por ejemplo, anticuerpo, molécula pequeña, etc.) puede incorporarse con excipiente y utilizarse en la forma de tabletas o cápsulas. Los agentes de enlace farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar; un enlazador tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina, un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente desintegrador tal como ácido algínico, Primogel™, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes™; un glidante tal como un dióxido de silicón coloidal; un edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, metilsalicilato o sabor naranja. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, un anticuerpo que se une al GDF-8 e interfiere con la señalización de GDF-8, se administra oralmente, el agente enlazante estará en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en la forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un portador sólido tal como una gelatina o un adyuvante. La tableta, cápsula y el polvo contienen de aproximadamente 5 a 95% de agente enlazante, y preferiblemente de aproximadamente 25 a 90% de agente enlazante. Cuando se administra la forma líquida, un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites de animal o de plantas tal como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya o aceite de ajonjolí o aceites sintéticos pueden agregarse (después de tomar en cuenta las alergias del paciente y/o la población vasta de individuos con tales portadores líquidos). La forma líquida de la composición farmacéutica puede además contener solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución sacárida, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en la forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente 0.5 a 90% en peso del agente enlazante y preferiblemente de aproximadamente 1 a 50% de agente enlazante. Para la administración por inhalación, se suministra un antagonista GDF-8 en la forma de un aerosol desde un contenedor presurizado o dispensador, el cual contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador. Subsecuentemente, los compuestos descritos aquí pueden administrarse por inhalación al tejido pulmonar. El término "tejido pulmonar" como aquí se utiliza se refiere a cualquier tejido del tracto respiratorio e incluye tanto el tracto respiratorio superior como inferior excepto donde se indique otra cosa. Uno o más anticuerpos GDF-8 pueden administrarse en combinación con una o más de las modalidades existentes para tratar las enfermedades pulmonares. En un ejemplo, el compuesto está formulado para un nebulizador. En una modalidad, el compuesto puede almacenarse en una forma liofilizada (por ejemplo, a temperatura ambiente) y reconstituirse en la solución antes de la inhalación. También es posible formular el compuesto para la inhalación utilizando un dispositivo médico, por ejemplo un inhalador (ver, por ejemplo la patente de E.U.A. 6,102,035 (un inhalador de polvo) y 6,102,454 (un inhalador de polvo seco)). El inhalador puede incluir compartimientos separados para el compuesto activo en un pH adecuado para almacenamiento y otro compartimiento para un regulador neutralizante y un mecanismo para combinar el compuesto con un regulador neutralizante inmediatamente antes de la atomización. En una modalidad, el inhalador es un inhalador de dosis medida. Aunque no es necesario, los mejoradores de suministro tales como agentes tensoactivos pueden utilizarse para mejorar adicionalmente el suministro pulmonar. Un "agente tensoactivo" como aquí se utiliza se refiere a un compuesto que tiene porciones hidrófilas y lipófilas que promueven la absorción de un medicamento al interactuar con una interfase entre dos fases insolubles. Los agentes tensoactivos son útiles con partículas secas por varias razones, por ejemplo, la reducción de aglomeración de partícula como la reducción de fagocitosis macrófaga, etc. Cuando se acopla con un agente tensoactivo de pulmón, puede lograrse una absorción más eficiente del compuesto debido a los agentes tensoactivos, tales como DPPC, que facilitarán en gran medida la difusión del compuesto. Los agentes tensoactivos son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a fosfoglicéridos, por ejemplo fosfaticolinas, L-alfa-fosfatidilcolina dipalmitoilo (DPPC) y difosfatidil glicerol (DPPG), hexadecanol; ácidos grasos; polietilenglicol (PEG); polioxietileno-9-; éter de aurilo; ácido palmíticoo; ácido oléico; trioleato de sorbitán; (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxómero; éter de ácido fático de sorbitán; trioelato de sorbitán; tiloxapol; y fosfolípidos. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Por ejemplo, en el caso de los anticuerpos que comprenden la porción Fc, puede ser capaz de la transmisión a través de las membranas mucosas (por ejemplo, intestino, boca o pulmones) por medio de la trayectoria mediada por el receptor FcRn (por ejemplo en la patente de E.U.A. 6,030,613). En general la administración transmucosa puede lograrse, por ejemplo, a través del uso de comprimidos, sprays nasales, inhaladores o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos están formulados en ungüentos, salvas, geles, parches o cremas como generalmente se conocen en la técnica. Para la administración transmucosa o transdérmica, los agentes penetrantes adecuados para la barrera deben permearse como se utilizan en la formulación. Tales agentes penetrantes generalmente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico.

Las composiciones farmacéuticas pueden también consistir en composiciones adecuadas para terapia génica, es decir composiciones comprendidas de los polinucleótidos aquí descritos. En el caso de la terapia génica, el portador farmacéuticamente aceptable puede incluir, por ejemplo lípidos, esferas de colágeno, sistemas de emulsión catiónica, agua, reguladores salinos, vectores virales, remanentes de quilomicron, nanopartículas de polímero (por ejemplo ADN en gelatina o ADN con kitosan), partículas de oro, complejos de polímetro, lipoplejos, poliplejos, etc. (ver por ejemplo, Gardlik et al. (2005) Med. Sci. Monit. 11 (4): RA110-21 ).

Estabilización y retensión En una modalidad, un anticuerpo GDF-8 está asociado físicamente con una porción que mejora su estabilización y/o retención en circulación, por ejemplo, en lavado sanguíneo, seroso, linfático, broncopulmonar o broncoalveolar u otros tejidos, por ejemplo por al menos 1.5, 2, 5, 10 ó 50 veces. Los antagonistas de la invención pueden estar preparados con portadores que protegerán contra la eliminación rápida del cuerpo tal como una formulación de liberación controlada que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulado. Pueden utilizarse los polímeros biodegradables y biocompatibles tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Las suspensiones liposomales que contienen un antagonista GDF-8, por ejemplo, uno o más anticuerpos anti GDF-8 también pueden utilizarse como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo GDF-8 puede estar asociado con un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como óxidos de polialquileno u óxidos de polietileno. Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Pueden utilizarse los polimeros que tienen pesos promedio del número molecular que varía desde aproximadamente 200 a aproximadamente 35,000 (o aproximadamente 1000 a aproximadamente 15,000 o aproximadamente 2000 a 12,500). Por ejemplo, un anticuerpo GDF-8 puede estar conjugado con un polímero soluble en agua, por ejemplo polímeros polivinílicos hidrófilos, por ejemplo polivinil alcohol y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de tales polímeros incluyen homopolímeros de óxido de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, poliolos polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Los polímeros adicionales útiles incluyen polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); los polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados, que comprenden monómeros sacaridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructuosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D- glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo ácido polimanurónico, ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico que incluye homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, almidón de hidroxietilo, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad polisacárida de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo .ácido hialurónico, polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol, heparina, etc. Otros compuestos también pueden unirse al mismo polímero, por ejemplo, una citotoxina, un marcador u otro agente dirigido, por ejemplo, otro anticuerpo GDF-8 o un ligando no relacionado. Los óxidos de polialquileno terminados en alcoxi mono activados (PAO), por ejemplo polietilenglicoles terminados con monometoxi (mPEG), polímeros terminados en alquilo de C^ y óxidos de polietileno biactivados (glicoles) pueden utilizarse para el enlace cruzado (ver por ejemplo, la patente de E.U.A. No 5,951 ,974). En una modalidad, el polímero antes del cruce al ligando no necesita, pero preferiblemente ser soluble en agua. Generalmente, después del cruce, el producto es soluble en agua, por ejemplo exhibe una solubilidad en agua de al menos aproximadamente 0.01 mg/ml y más preferiblemente al menos aproximadamente 0J mg/mlm, y más preferiblemente aún al menos aproximadamente 1 mg/ml. Además, el polímero no debe ser altamente inmunogénico en la forma conjugada, ni debe tener viscosidad que sea incompatible con la infusión intravenosa, aerosolización, o inyección si el conjugado está provisto para ser administrado por tales rutas. En una modalidad, el polímero contiene sólo un grupo que es reactivo. Esto ayuda a evitar el cruce de moléculas de ligando a otra. Sin embargo, se encuentra dentro del alcance maximízar las condiciones de reacción para reducir el cruce entre las moléculas ligando, o para purificar los productos de reacción a través de la filtración de gel o la cromatografía de intercambio de iones para recubrir sustancialmente los derivados homogéneos. En otras modalidades, el polímero contiene dos o más grupos reactivos para el propósito de enlazar ligandos múltiples a la estructura de polímero. Nuevamente, la filtración de gel o de la cromatografía de intercambio de iones puede utilizarse para recubrir el derivado deseado en la forma sustancialmente homogénea. El peso molecular del polímero puede variar arriba de aproximadamente 500,000 D, y preferiblemente está al menos aproximadamente 20,000 D, o al menos aproximadamente 30,000 D, o al menos 40,000 D. El peso molecular escogido puede depender del tamaño efectivo del conjugado que se va a lograr, la naturaleza (por ejemplo estructura, tal como lineal o ramificada) del polímero y el grado de derivatización. Un enlace covalente puede utilizarse para unir un anticuerpo GDF-8 a un polímero, por ejemplo, el cruce de grupo de amino de terminal N del ligando y los grupos de amino epsilon encontrados en los residuos de lisina del ligando, así como otros grupos de amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo u otros grupos hidrófilos. El polímero puede ser enlazado, covalentemente directamente al anticuerpo GDF-8 sin usar un agente de cruce multifuncional (ordinariamente bifuncional). El enlace covalente a grupos amino se logra por medio de los ionogramas conocidos con base en el cloruro cianúrico, carbonildiimidazola, grupos reactivos de aldehido (alcóxido PEG más acetildietilo de bromoacetildehído, PEG más DMSO y anhídrido acético, o cloruro PEG más el fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, esteres de succinimidilo activado, PEG ditiocarbonato, activado 2,4,5-triclorofenilcloroformato o P-nitrofenilflorofomato PEG activado). Los grupos de carboxilo pueden derivarse al acoplar amina PEG utilizando carbodiimida. Los grupos de sulfidrilo pueden derivatizarse al acoplarse a PEG sustituido por maleimido (por ejemplo, amina PEG-alcoxi más sulfosuccinimidilo 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1 -carboxilato (ver WO 97/10847) o PEG-maleimida). Alternativamente, los grupos libres de amino en el ligando (por ejemplo, grupos de amino epsilon en residuos de lisina) pueden tiolizarse con 2-imino-tiolan (Traut's reactivo) y después acoplarse a los derivados que contienen maleimida de PEG, como por ejemplo como se describe en Pedley et al. (1994) Br. J. Cáncer 70:1126-30. Los polímeros PEG funcionalizados que pueden unirse al anticuerpo GDF-8 están disponibles, por ejemplo en Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Tales derivados de PEG comercialmente disponibles, por ejemplo PEG amino, esteres de ácido de amino PEG, PEG-hidrazido, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, PEG-ácido propiónico, PEG aminoácido, succinimidil succinato PEG, succimidil propionato PEG, éster de succinimidilo de PEG carboximetilado, succimidilcarbonato de PEG, esteres de succimidilo de aminoácido PEG, PEG-oxicarboniimidazola, PEG-nitrofenilcarbonato, PEG tresilato, PEG glicidiléter, PEG-aldehído, PEG-vinilsulfona, PEG-maleimida, PEG-ortopiridildisulfida, PEG heterofuncional, derivados de vinil PEG, PEG silano, y PEG fosfolida. Las condiciones de reacción para acoplar estos derivados de PEG pueden variar dependiendo en el anticuerpo GDF-8, el grado deseado de PEGIación, y lo derivado PEG utilizado. Algunos factores involucrados en escoger los derivados PEG incluyen: el punto deseado de unión (tal como lisina o grupos R cisteína), estabilidad hidrolítica y reactividad de los derivados, estabilidad, toxicidad y antigenicidad de la unión, adecuación para el análisis, etc. Las instrucciones específicas para el uso de cualquier derivado particular están disponibles en el fabricante. Los conjugados de un anticuerpo GDF-8 y un polímero pueden separarse de los materiales de inicio no reaccionados, por ejemplo, por la filtración de gel o la cromatografía de intercambio de iones u otras formas de cromatografía, por ejemplo HPLC. Las especies heterólogas de los conjugados están purificadas de uno a otro en la misma manera. La resolución de diferentes especies (por ejemplo, que contiene uno o más residuos PEG) también es posible debido a la diferencia en las propiedades iónicas de los aminoácidos no reaccionados (ver por ejemplo WO 96/34015).

Se espera que los polinucleótidos y proteínas de esta invención exhiban uno o más de los usos o actividades biológicas (incluyendo aquellas asociadas con los ensayos que a continuación se mencionan) identificadas aquí. Los usos o actividades descritas para las proteínas de esta invención pueden proveerse para administración o uso de tales proteinas, o por administración o usos de polinucleótidos que codifican tales proteínas (tales como por ejemplo, en terapias génicas o vectores adecuados para la introducción de ADN). Puede ser ventajoso formular composiciones orales o parenterales en la forma de unidad de dosis para facilitar la administración y la uniformidad de dosis. La unidad de dosis como aquí se utiliza se refiere a unidades discretas físicamente adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se va a tratar, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico requerido. La especificación de la forma de unidad de dosis de la invención se indica por y directamente dependiendo de las características únicas de compuesto activo, el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de formulaciones de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos. Otro aspecto de esta invención se refiere a los equipos para llevar a cabo la administración del anticuerpo GDF-8 de la invención, por ejemplo con o sin otros compuestos terapéuticos, o para utilizar los anticuerpos anti GDF-8 como una investigación o herramienta terapéutica para determinar la presencia y/o nivel de GDF-8 en una muestra biológica, tal como un equipo ELISA. En una modalidad, el equipo comprende uno o más anticuerpos anti GDF-8 formulados en un portador farmacéutico, y al menos un agente, por ejemplo, un agente terapéutico, formulado como es adecuado en una o más operaciones farmacéuticas separadas. Los siguientes ejemplos se establecen para ayudar al entendimiento de la invención pero no pretenden y no deben estar construidos para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de los métodos convencionales, tales como formación de hibridoma, ELISA, ensayos de proliferación, análisis citométrico de flujo y técnicas de ADN recombinante. Tales métodos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los contenidos completos de todas las referencias, patentes, solicitudes de patentes publicadas y otros documentos de patente citados a través de esta solicitud están incorporados aquí a manera de referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Creación e identificación de anticuerpo Anti-GDF-8 RK35 La proteína GDF-8 humana (GDF-8 maduro y propéptido GDF-8) y proteína BMP-11 se separaron y caracterizaron como se describe en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos No. 2004/0142382. Seis ratones hembra BALB/c de knockout de miostatina (de 8 semanas de edad; McPherron et al., supra) se inmunizaron por inyecciones subcutáneas con 20 µg de dímero de GDF-8 recombinante en el adyuvante completo de Freund. Varias inyecciones impulsoras de la misma cantidad de antígeno en el adyuvante incompleto de Freund se dieron en intervalos de 2 semanas y una inyección final intravenosa (vena de cola) de 2 µg en PBS se dio antes de la fusión. Los esplenocitos de dos de los ratones que demostraron los títulos más altos de anticuerpo se fusionaron con las células de mieloma de ratón (ATCC Accession No. P3X63.Ag8.653) utilizando técnicas estándar (Oi and Herzenberger (1980) In: Mishell, B.B. Shiigi, S.M. Henry, C, Mishell, R.l. (Eds). Selected Methods in Cellular Immunology W.H. Freemen, San Francisco, pp. 351 -72). Después de 10 a 14 días, los sobrenadantes se cultivaron y examinaron para la producción de anticuerpos anti GDF-8 por medio de fases sólidas y de solución ELISA de (Whittemore et al., supra). Las técnicas de ELISA estándar y el ensayo de reporte pGL3-(CAGA)?2 (Theis et al (2001 ) Growth Factors 18:251-59) se utilizó para determinar el IC5u para inhibición del enlace de miostatina a su receptor, ActRIIB utilizando un ActRIIB-Fc quimérico generado por la fusión del dominio extracelular de receptor ActRIIB-Fc humano con la región lgG1 Fc humana. Los hibridomas escogidos para estudios posteriores rindieron monoclonales para la dilución limitante repetida para asegurar la monoclonalidad. RK35 monoclonal de anticuerpo se seleccionó para otro estudio.

EJEMPLO 2 Anticuerpo monoclonal RK35 que tiene alta afinidad para GDF-8 y muestra actividad de neutralización Ejemplo 2.1 : Procedimientos experimentales Para el ELISA, GDF-8 biotinilado se cubrió durante la noche a 4°C en unas placas de microtítulos de estreptavidina de 96 pozos (Pierce, Rockford, IL) a 1 µg/ml. Después del recubrimiento, las soluciones se desprendieron de los pozos y las placas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en la solución SuperBIock (Pierce). Las placas se enjuagaron con PBS, y 100 µl de anticuerpo RK35 se agregó a los pozos en varias constituciones. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y después se lavaron con PBS. Para cada pozo, 100 µil de 1 dilución 1 :5000 de conjugado anti hulgG-HRP (Southern Biotech, Birmingham, AL) se agregó en las placas que fueron incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada placa se lavó tres veces con PBS. El sustrato de TMB (100 µl) se agregó a cada pozo y se incubó hasta el desarrollo de color. La reacción se detuvo por la adición de 100 µl de 0J 8 M H2S04. La señal generada se midió al leer la absorbencia a 450 nm utilizando un lector de placa de microtítulos. El enlace a GDF-8 se confirmó utilizando anticuerpos de control de isotipo humano. La quimera ActRIIB-Fc recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat. No. 339-RB/CF) se cubrió en placas de ensayo de fondo plano de 96 pozos (Costar, NY, Cat. No. 3590) a 1 µg/ml en un regulador de carbonato de sodio en 0.2 M durante la noche a 4°C. Después las placas se bloquearon con 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino y se lavaron siguiendo el protocolo de ELISA estándar. Los alícuotas (100 µl) de GDF-8 o BMP-11 biotinilado se agregaron a la placa ELISA bloqueada en varias concentraciones, se incubaron durante 1 hora, se lavaron y la cantidad del GDF-8 o BMP-11 unido se detectó por la peroxidasa streptavidin. horseradish (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, Cat. No. 13047E) seguido de la adición de TMB (KPL, Gaithersburg, MD, Cat. No. 50-76-04). Las mediciones colorimétricas se tomaron a 450 nm en un lector de microplacas de dispositivo molecular. Para analizar la actividad inhibitoria, se probó RK35 en varias concentraciones por la preincubación con 20 ng/ml GDF-8 o 20 ng/ml BMP-11. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se agregaron a la placa 100 µl de RK35 y GDF-8 o mezcla de BMP-11. La detección y cuantificación del factor de unión se describe en Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71. Para demostrar la actividad de GDF-8, se desarrolló un ensayo génico reportero (RGA) utilizando un vector reportero pGL3(CAGA)12 que expresa la luciferasa bajo el control del promotor inducido por TGF-ß. El CAGA es una secuencia de respuesta TGF-ß sin el promotor del TGB-ß génico inducido por PAI-1 Denner et al. (1998) EMBO J. 17:3091-3100). Un vector reportero que contiene 12 cajas de CAGA se hizo utilizando el pGL3 plásmido de reportero luciferasa básico (promega, Madison, Wl). La caja TATA y el sitio de iniciación de transcripción desde el último promotor de adenovirus (-35/+10) se insertó entre los sitios Bglll y Hindlll. Los oligonucleótidos que contienen 12 repeticiones de cajas CAGA, es decir AGCCAGACA, se recocieron y clonaron en el sitio Xhol. La línea celular de rabdomiosarcoma humano A204 (ATCC HTB-82) se transfectó transitoriamente con pGL3(CAGA)?2 utilizando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Boehringer Manheim, Germany). Después de la transfección, se cultivaron las células en placas de 96 pozos en un medio 5A de mcCoy suplementado con glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, penicilina 100 µg/ml y 10% de suero fetal de becerro durante 16 horas. Las células se trataron con o sin 10 ng/ml GDF-8 en McCoy con glutamina, estreptomicina, penicilina y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino durante 6 horas a 37°C. La luciferasa se cuantificó en las células tratadas utilizando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega). Para probar la actividad inhibitoria de RK35, GDF-8 se preincubó con el anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. Esta mezcla se agregó a las células transfectadas y las células se incubaron durante 6 horas a 37°C. La luciferasa se cuantificó utilizando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega).

Ejemplo 2.2: resultados Un anticuerpo monoclonal de ratón de alta afinidad para la miostatina se generó al inmunizar ratones GDF-8 knockout con GDF-8 humano recombinante purificado el cual es idéntico en la secuencia de aminoácidos para la miostatina de murina madura (McPherron et al., 1997). El anticuerpo RK35 unido con alta afinidad al GDF-8 se probó por el ELISA directo (4 nM; fig. 1A). Un ELISA se utilizó para valorar la habilidad de RK35 para inhibir el enlace de GDF-8 en su receptor de afinidad alta, ActRIIB. RK35 bloqueó el enlace de GDF-8 biotinilado para inmovilizar ActRIIB-Fc con un IC50 ~ 2.5 nM. (FIG. 1 B). ActRllb soluble también bloqueó el enlace de GDF-8 para inmovilizar ActRllb. Fc mientras los anticuerpos control no bloquearon el enlace. La actividad de neutralización de RK35 también se midió utilizando un ensayo reportero con base celular pGL3-(CAGA)12. En este ensayo el gen de luciferasa se clonó bajo el control del promotor de respuesta GDF-8/TGF-ß y las células de rabdomiosarcoma A204 humanas se transfectaron transitoriamente con el plásmido reportero. Los aumentos en actividad de luciferasa en las células A204 inducidas por GDF-8 se bloquearon en una manera de dosis dependiente por RK35 (fig. 1 C). RK35 redujo la actividad de transducción de señal GDF-8 con un IC50 de 0.2 nM. Por lo tanto, RK35 es un nuevo anticuerpo neutralizador monoclonal de murina altamente potente contra GDF-8.

EJEMPLO 3 Actividad in vivo de RK35 en el tipo silvestre y modelo de roedores ALS Eiemplo 3.1 : Procedimientos experimentales Eiemplo 3.1 A : Tratamiento de animales y fármacos Todos los procedimientos que involucran animales se aprobaron para el IACUC de la Universidad de Pennsylvania o Wyeth. Los ratones transgénicos que expresan SODG93A humano (Gurney et al., supra) en una circunstancia híbrida B6SJL (laboratorios Jackson) se acoplaron al ratón criador hembra B6SJLF1 (laboratorio Jackson). La progenie se examinó por PCR; los ratones negativos para el transgénico se utilizaron como controles de tipo silvestre de edades iguales. Los ratones se dividieron en cuatro grupos: ratones 29 SODG93A tratados con RK35 de anticuerpo antimiostatina, ratones28 SODG93A tratados con solución salina regulada por fosfato (PBS) (vehículo), 23 ratones de tipo silvestre tratados con RK35 y 23 ratones de tipo silvestre tratados con PBS. Empezando a los 28 días después del nacimiento, los ratones se inyectaron intraperitonealmente cada semana con RK35 de anticuerpo monoclonal anti-GDF-8 o un volumen equivalente de PBS. La primera dosis fue de 40 mg/kg; las dosis subsecuentes fueron 20 mg/kg/semana siguiendo el protocolo descrito por el JA16 de anticuerpo de antimiostatina (Whittemore, et al., supra) de 9 a 12 ratones de cada grupo se sacrificaron entre los 84 y 90 días (12 semanas) de edad (media de 88 días) para valorar la masa de músculo húmedo y la histología y los ratones restantes se monitorearon hasta que alcanzaran la enfermedad en fase terminal (-134 días), definido como un fallo dentro de 30 segundos de lateralidad izquierda y derecha. Paralelamente, las ratas transgénicas (58) expresando SODG93A humano (Howland et al., supra) en una mezcla igual de machos y hembras se administró tanto PBS (vehículo) como RK35. Diez ratas en cada grupo se eutanizaron a los 95 días de edad para determinar el efecto de RK35 en la masa muscular húmeda. Las 19 ratas restantes en cada grupo continuaron a través de una enfermedad en etapa terminal. Un segundo estudio que usa ratas de control hembras de tipo silvestre y transgénicas se utilizó para comparar los aumentos de peso corporal así como los cambios de fuerza de agarre a través de los grupos de tratamiento y genotipo. En cada estudio, las ratas se inyectaron intraperitonealmente con RK35 a 40 mg/kg (a las 6 semanas (-42 días) de edad) y subsecuentemente inyectadas con 20 mg/kg/semanas o el vehículo que continuó hasta el sacrificio a 95 días para analizar la masa muscular o la fase Terminal al medirse por el fallo de reflejo derecho.

Eiemplo 3.1.2: Medidas de peso corporal y masa muscular Los pesos corporales iniciales se utilizaron para distribuir de igual manera los animales entre los cohortes para asegurar los pesos corporales promedio equivalentes en el inicio del estudio. Se midió la pérdida de peso así como la edad en la cual la primera de tres mediciones consecutivas de pérdida de peso se observó. La masa muscular húmeda se determinó en el gastrocnemio, el tibial craneal, los cuadriceps, y el diafragma en un punto consistente con la enfermedad temprana (88 días para ratones, 95 días para ratas) y en una fase terminal (-134 días para ratones y -128 días para ratas). Los animales se eutanizaron y los músculos de cada pata se diseccionaron y pesaron cuantitativamente; los valores de las patas derecha e izquierda se promediaron.

Ejemplo 3.1.3: Histopatológica muscular y cuentas de neuronas motoras El gastrocnemio y el diafragma se fijaron y seccionaron por tinsión H & E (Howland et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 99:1604-29). El marcador para atrofia e hipertrofia se realizó con dos patólogos independientes en forma ciega para la identidad de muestra. Los diámetros de fibra se midieron con la morfometria (Axiovision 4.3, Zeiss, Thomwood, NY) en el músculo del grastrocnemio (ratones SODG93A tratados con PBS-y RK35 y ratones de tipo silvestre tratados con PBS) a los 88 días y en etapa terminal, así como para el músculo de diafragma (ratones de tipo silvestre tratados con PBS y SODG93 tratados con RK35 y PBS) y etapa terminal. Se congelaron tres músculos por grupo en isopentano enfriado con hielo seco, crioseccionado en un grosor de 8 µm, e inmunoteñidos utilizando un anticuerpo de antilaminina (Sigma, St. Louis, MO; número de catálogo L9393). Las medidas lineales del diámetro máximo de los ejes menores de al menos 200 fibras se tomaron, utilizando el software Zeiss Axiovision. Los diámetros fibrosos se dividieron en dos en intervalos de 20 µm y los histogramas de frecuencias se generaron para cada grupo de músculos. Las cuentas de neuronas motoras se .realizaron en 3 ratones de cada grupo (tipo silvestre, SODG93A tratado con PBS, y SODG93A tratado con RK35) tanto en enfermedad de tapa inicial como etapa terminal (total de 18 ratones analizados). Las columnas vertebrales removidas del ratón decapitado se post-fijaron en 4% de paraformaldehído, después las cuerdas se disecaron y post-fijaron durante 24 horas adicionales en 4% de paraformaldehído. Al utilizar la tecnología MultiBrain™ (Neuroscience Associates, Knoxville, TN), 18 vértebras lumbares se empotraron juntas en un solo bloque y se cortaron a 50 um en el plano coronal a lo largo del segmento completo (-6 mm) del alargamiento lumbar. Cada sexta sección (300 µm) se tiñó con tionina NISSL para revelar los cuerpos celulares (Bjugn (1993) Brain Res. 627:25-33; Kieran et al. (2004) Nat. Med. 10:402-05). Las cuentas se realizaron utilizando dos acercamientos independientes. Primero, diez secciones vertebrales que rodean L3-5 para cada uno de los 18 ratones se analizaron por un observador en ciego para la identidad de muestra utilizando un Zeiss Axoplan2 a 20x y 40x. Ambas astas anteriores de cada sección se contaron, identificando las neuronas de motor saludables grandes por la presencia de nucléolos visibles como se describió previamente (Kieran et al., supra). Los datos resultantes se representaron como el número promedio de las neuronas motoras grandes por asta anterior. En segundo lugar, las secciones de la región L3-L5 se analizaron estereológicamente utilizando un Zeiss Axioskop2 equipado con una etapa de espécimen motorizado, microcator electrónico y software de estereología (Stereo Investigator (MBF Bioscience, Williston VT) como se describe (West et al. (1991 ) Anat. Rec. 231 :482-97; Schmitz y Hof (2000) J. Chem. Neuroanat. 20:93-114; Schmitz y Hof (2005) Neuroscience 130:813-31 ); las neuronas motoras se calificaron como neuronas con un área de proyección máxima mayor a 300 µm2.

Ejemplo 3.1.4: Análisis fenotipico Las mediciones de fuerza de agarre (Columbus Instruments, Columbus, OH) se realizaron cada dos semanas empezando a los 28 días después del nacimiento en ambas extremidades delanteras y traseras de los ratones tratados y de control (n=8-24) como se describió (LaMonte et al. (2002) Neuron 34:715-24). Las ratas de tipo silvestre y transgénicas se probaron para la fuerza de agarre de la extremidad delantera 2 veces a la semana utilizando un medidor de fuerza de agarre Dunnett de rata (MJS Technology, Stevenage, Hertfordshire, Inglaterra) en enfermedades en fase temprana (entre 95 y 110 días después del nacimiento; n=10). Las ratas también se analizaron por un rotorod (Ugo Basile, Comerio, Italia) y se monitorearon para las normalidades en marcha y grados de movilidad de extremidades (no se muestran los datos).

Ejemplo 3.1.5: Electrofisioloqia Los registros de electromiografía (EMG) y los análisis de datos se realizaron en ciego para el genotipo y el grupo de tratamiento. Las ratas anestesiadas con nembutal se mantuvieron de 35 a 37°C de temperatura corporal que estuvo sujeta a EMG de aguja al insertar un electrodo de aguja monopolar concéntrica (9013R0011 , Medtronic, MN, E.A.U.) en músculo de diafragma expuesto quirúrgicamente hasta que los rompimientos del patrón de interferencia EMG aparecieron con cada inspiración. Las señales eléctricas se adquirieron a 20 KHz con una configuración BIOPAC que consiste en unidades de adquisición de datos MP150, módulo de interfase universal UIM100C, módulo de electromiografías EMG100C, y software de reconocimiento (BIOPAC Systems Inc, Goleta, CA). Las señales primero se analizaron para remover 60 Hz del artefacto y filtrarlas por el paso de banda entre 500 y 100 Hz para remover los artefactos de movimiento debido a la respiración y para enfatizar las descargas de unidad de motor. Los rompimientos de EMG se identificaron al rectificar la señal, filtrando el paso bajo a 10Hz y después detectando los tiempos en los cuales la envoltura resultante era más grande que su valor medio. Los rompimientos que duraron menos de 100 ms no se contaron y los períodos de no rompimientos que duraron menos de 100 ms se contaron como partes de rompimientos circundantes. Finalmente, los picos en la señal no rectificada se detectaron utilizando un umbral de detección pico igual a tres veces la desviación estándar de la amplitud de la señal durante los periodos de no rompimiento. En análisis de picos de rompimiento se realizó con el software acostumbrado escrito por K.C. McGill (Stanford University, CA), y el índice de pico de rompimiento (Hz) para cada animal calculado es el número medio de picos por rompimiento dividido entre la duración de rompimiento medio.

Ejemplo 3.1.6: Análisis y estadísticas de datos Se aplicó un modelo ANOVA de medidas repetidas de dos factores en los datos de peso corporal así como en los datos de fuerza de agarre utilizando un procedimiento mezclado SAS. Un modelo lineal ANOVA de dos factores se aplicó en los datos de masa muscular utilizando el procedimiento SAS GLM. Los datos de electrofisiología se analizaron por medio de dos pruebas t muestra. Para los datos de cuenta de neuronas motoras, se utilizó un modelo lineal generalizado (GLM) que asume la distribución Poisson. Los datos de fibra muscular se analizaron con ANOVA seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey. Las comparaciones se consideraron estadísticamente importantes cuando los valores p fueron menores a 0.05; las comparaciones con 0.05< p < 0.15 se notaron como tendencias.

Ejemplo 3.2: Resultados Ejemplo 3.2J : Pesos corporales aumentados de tratamiento RK35 de roedores SODG93A pero que no extienden la supervivencia Los ratones SODG93A se trataron con RK35 de anticuerpo antimiostatina empezando a los 28 días después del nacimiento y continuando hacia la enfermedad en etapa terminal (aproximadamente 134 días después de nacimiento). El tratamiento RK35 resultó en el aumento significativo de peso corporal desde 40 a 120 días después del nacimiento comparadas con el ratón SODG93A tratado con PBS. Mientras los ratones SODG93A tratados con PBS alcanzaron un peso corporal máximo de 27.78 ± 0.46 g a los 70 días, los ratones tratados con RK35 alcanzaron un máximo de 32.13 ± 0.48 g, un aumento relativo de 16% (Fig. 2A). Mientras los ratones de tipo silvestre continuaron ganando peso a través del estudio, los ratones SODG93A tratados con PBS tanto como los tratados con RK35 empezaron a mostrar signos importantes de pérdida de peso debido a la progresión de la enfermedad aproximadamente 98 días después del nacimiento. Las ratas SODG93A transgénicas también fueron tratadas con anticuerpos RK35 empezando a los 42 días después del nacimiento y continuando hacia la enfermedad etapa terminal (-128 días de edad). El tratamiento con RK35 antiomiostatina llevo al peso corporal aumentado en ratas SODG93A comparadas con las ratas tratadas con PBS (figura 2B). Las ratas transgénicas que recibieron PBS pesaron significativamente más que las ratas transgénicas tratadas con PBS, tan pronto como a los 60 días después de nacimiento (p<0.05), que corresponden a tres semanas después de la iniciación de la dosis. Las ratas macho tratadas con RK35 alcanzaron un máximo de 458.8 ± 6.5g a los 96 días, un aumento del 10% sobre las ratas macho tratadas con PBS a 419J ± 10.7g. Las hembras tratadas con RK35 alcanzaron un máximo de 289.7 ± 9.3, un 15% de aumento sobre las hembras tratadas con PBS a 252.8 ± 6.0 g. Las ratas SODG93A tratadas con PBS o RK25 empezaron a mostrar pérdida de peso importante después de -112 días debido a la progresión de la enfermedad; el tratamiento RK35 no retardó la iniciación de la pérdida del peso. Mientras el tratamiento RK25 ocasionó aumentos importantes en el peso corporal, los inventores no observaron efectos de tratamiento RK25 en los sobrevivientes. El tiempo a la etapa terminal, como se midió utilizando el el criterio de valoración definido de falla al derecho dentro de 30 segundos, fue 132 + 8 días para los ratones SODG93A tratados con RK35 (n=16), mientras que los ratones SODG93A tratados con PBS alcanzaron la etapa terminal hacia el 134 ± 7 días (n=17). Las ratas SODG93A tratadas con RK35 alcanzaron la etapa terminal a los 125 ± 8 días comparadas con los 128 ± 6 días para las ratas PBS tratadas con SODG93A. Ninguna de estas diferencias fue estadísticamente importante, indicando que la inhibición de miostatina no retarda el tiempo de la enfermedad de etapa terminal en cualquiera de los modelos de ratones o ratas de ALS.

Ejemplo 3.2.2: Efectos de inhibición de miostatina en la masa y fuerza muscular Para determinar si la inhibición de miostatina desaceleró el desgaste muscular, los ratones transgénicos SODG93A y de tipo silvestre de cada grupo se sacrificaron a los 88 días después del nacimiento, en un punto de tiempo cerca del aumento máximo en el peso corporal inducido por el tratamiento con RK35. En este punto de tiempo, los ratones SODG93A tratados con PBS muestran disminuciones importantes en la masa muscular en el gastrocnemio, en el tibialis craneal, y el cuadriceps con relación a los ratones control de tipo silvestre que tenían enfermedad en etapa inicial (figura 2C). En contraste, los ratones SODG93A tratados con RK35 mostraron mejoras significativas estadísticamente en la masa muscular en todos los músculos examinados en comparación a los ratones SODG93A tratados con PBS de igual edad en el punto de 88 días que varía de -19% a 32% (músculo de gastrocnemio, +26%; tibialis craneal; +19%; cuadriceps, +32%). Mientras no se observe una pérdida importante de la masa muscular en los diafragmas de los ratones SODG93A tratados con PBS durante la enfermedad en etapa inicial; el tratamiento con RK35, también indujo un aumento importante en la masa en este músculo (+21 %). Los ratones restantes en cada cohorte se monitorearon hasta que se definió la etapa terminal por la prueba de reflejos derechos. En este punto, el desgaste de músculo de patas se observó en los ratones SODG93A tratados con RK35 y PBS (figura 2E). En contraste con las observaciones de tejido de los ratones de 88 días, los ratones SODG93A tratados con PBS de enfermedad de etapa terminal mostraron una reducción importante en la masa muscular del diafragma con relación a los animales de tipo silvestre (figura 2E). Sin embargo, el aumento inducido por RK35 en la masa de diafragma observado en los ratones SODG93A tratados fue importante en la etapa terminal indicando que la inhibición de miostatina desaceleró la atrofia de diafragma en el ratón SODG93A. Los efectos de anticuerpo anti-miostatina en la masa muscular también se investigaron en ratas SODG93A. De manera similar a las observaciones hechas en ratones, las ratas SODG03A —95 de días de nacido tratadas con RK35 mostraron masa aumentada de manera importante las ratas SODG93A tratadas con PBS en gastrocnemio (+17%), tibialis craneal (+30%), cuadriceps (+30%) y diafragma (+17%) músculos (figura 2D). En la enfermedad en etapa terminal, la atrofia muscular de la pata fue evidente tanto en ratas SODG93A tratadas con PBS como RK35 (figura 2F). Una tendencia hacia la masa muscular de la pata aumentada es un resultado del tratamiento con RK35 en las ratas SODG93A que persiste hasta la etapa terminal, pero estos efectos no alcanzan importancia. Sin embargo, un aumento importante de 35% en la masa de diafragma de ratas SODG93A tratadas con RK35 sobre controles tratados con PBS (—35%) aún fue evidente en la enfermedad en etapa terminal (figura 2F), de acuerdo con las observaciones vistas en los ratones SODG93A (figura 2E).

Para probar los efectos de la inhibición de miostatina en la función muscular, se realizaron los ensayos cuantitativos de fuerza de agarre en ratones tratados con RK35 y PBS. Los ratones SODG93A, tratados con RK35 y tratados con PBS mostraron aumentos de desarrollo en la fuerza de agarre de extremidades traseras entre las 28 y 56 días después de nacimiento. Para los 56 días después de nacimiento, los ratones SODG93A tratados con PBS se volvieron significativamente más débiles que los ratones de control de edad igual (Figura 3A) (p < 0.001 ). Mientras la disminución en la fuerza de agarre también era evidente en los ratones SODG93A tratados con RK35 para los 63 días después de nacimiento, los ratones tratados con RK35 permanecieron significativamente más fuertes (o tendieron a ser más fuertes), que los ratones SODG93A tratados con PBS desde los 49 a los 88 después de nacimiento (p < 0.05). El análisis de fuerza de agarre de las extremidades delanteras mostraron un patrón similar (figura 3B). La fuerza pico de las extremidades delanteras en los ratones SODG93A tratados con PBS y RK35 se observaron a -49 y 56 días después de nacimiento respectivamente. Los ratones SODG93A tratados con PBS se volvieron significativamente más débiles que los animales de tipo silvestre a los 56 días después de nacimiento (p < 0.05) y continuaron a disminuir de ahí en adelante. Los ratones SODG93A tratados con RK35 fueron más fuertes que los ratones SODG93A tratados con PBS de los 56 a los 88 días de edad (56d; p=0.08; 63d; p=0.06; 70-88d; p < 0.001 ). Estos datos indican que la inhibición de miostatina desacelera la pérdida de la función muscular a través de la enfermedad en etapa inicial en los ratones SODG9A. Sin embargo, después de -100 días, la disminución en la fuerza de agarre fue similar en ambos ratones SODG93A tratados y no tratados. Para determinar si el tratamiento con RK35 indujo cambios similares en ratas SODG93A, la fuerza de agarre de las extremidades delanteras también se analizó en ratas SODG93A tratadas con RK35 y PBS y los miembros de camada de tipo silvestre de igual edad durante la enfermedad de etapa inicial (figura 3C). Las ratas SODG93A tratadas con PBS fueron significativamente más débiles que los controles de tipo silvestre confirmando que las ratas SODG93A también mostraron una fase de enfermedad temprana que precede los déficits de motor y la pérdida de peso de una manera similar a los ratones. Las mediciones de la fuerza de agarre de las ratas SODG93A tratadas con RK35 fueron generalmente más bajas que aquellas de las ratas de tipo silvestre tratadas con PBS aunque los grupos no fueron significativamente diferentes. La inhibición de miostatina en ratas SODG93A no mejoró significativamente la fuerza de agarre cuando se comparó con las ratas SODG93A tratadas con PBS en este intervalo de edad.

Ejemplo 3.2.3: La inhibición de miostatina desaceleró la degeneración de los músculos de las extremidades y el diafragma en ratones y ratas SODG93A Los efectos de tratamiento con RK35 en la morfología muscular fueron también examinadas. Se examinaron el diafragma y el músculo del gastrocnemio medial de 88 días (enfermedad en edad temprana) y -134 día enfermedad en etapa terminal) de los ratones SODG93A, comparando los efectos del tratamiento RK35 con PBS, en paralelo con el tejido de los controles tipo silvestre de igual edad. El grado de atrofia y de hipertrofia en cada tejido se calificó en un análisis en ciego (0, ninguno; 1 , ligero; 2, leve; 3, moderado; 4, marcado; 5, severo) como se muestra en el Cuadro 4. Los ratones SODG93A tratados con PBS mostraron atrofia importante del gastrocnemio en la enfermedad de la etapa inicial (calificación media de 2:0; y figura 4B). El encogimiento observado de las fibras musculares, colocó centralmente a los núcleos y al núcleo cromaticondensado que fueron consistes con la desenervarción activa en proceso muscular; también hubo pruebas de la inflamación comparada con los ratones de tipo silvestre (Figuras 4A y figura 4B). En contraste, el gastrocnemio de los ratones SODG93A en etapa temprana tratados con RK35 (figura 4C) mostraron poca atrofia (cuadro 4; calificación media de 0.3). Estos resultados sostienen los datos de masa muscular que indican que la atrofia del músculo de la pata esquelética en enfermedad de etapa temprana (88 días después de nacimiento) en los ratones SODG93A significativamente se redujo por la inhibición de miostatina. La examinación del gastrocnemio de ratones SODG93A en etapa terminal confirmaron la atrofia muscular moderada en ambos grupos tratados con PBS (cuadro 4; calificación media de 3.0) y RK35 (cuadro 4; calificación media de 3.3) (figura 4E y 4F) estos grupos no tienen signos degenerativos en músculo de tipo silvestre (figura 4D). Estos resultados fueron consistentes con los datos de masa muscular que indican que los efectos protectores de la inhibición de miostatina en enfermedad temprana no persisten a través de la enfermedad en la edad terminal en los ratones SODG93A. El diafragma de cada ratón SODG93A tratado con PBS o tratado con RK35 mostró poca atrofia (cuadro 4; calificación media de 6.0) comparada con los ratones de tipo silvestre a los 88 días. Sin embargo, en la etapa terminal, se observó atrofia de leve a moderada en el diafragma de los ratones SODG93A tratada con PBS (figura 4H; cuadro 4; calificación media de 2.3). En contraste, el diafragma de ratones SODG93A tratados con RK35 analizado en la enfermedad de etapa terminal no mostró signos importantes de atrofia comparada con los animales SODG93A tratados con PBS (cuadro 4; compara figuras 4H, y 41), similar al diafragma de los ratones de tipo silvestre de misma edad (figura 4G). En conjunto, la valoración de masa muscular e histológica indicaron que la inhibición de miostatina por RK35 conserva el diafragma pero no la integridad del músculo de la pata esquelética a través de la enfermedad de la etapa terminal.

CUADRO 4 Resumen de patología muscular observada en ratones SODG93A tratados con PBS o RK35, en comparación con ratones de control de tipo silvestre de la misma edad Genotipo G93A G93A WT G93A G93A WT RK35: - + - - + - Edad: 88d 88d 88d 134d 134d 134d # ratones: 3 3 3 3 3 3 Gastrocnemio Hipertrofia 0 0 0 0 0 0 Atrofia 2 0.3 0 3.0 3.3 0 Diafragma Hipertrofia 0 0.6 0 0 1.7 0 Atrofia 0.6 0.6 0 2.3 0 0 Puntuación: 0, ninguno; 1 , ligero; 2, leve; 3, moderado; 4, marcado; 5, severo El análisis de tamaño de fibra muscular en gastrocnemio y músculo del diafragma mostraron un patrón similar. Las distribuciones de frecuencia de las mediciones de diámetro de fibra del músculo gastrocnemio a los 88 días mostró un desplazamiento hacia fibras más pequeñas en ratones SODG93A (figura 5A) en comparación con ratones de control de tipo silvestre (figura 5C). La distribución de diámetros de fibra de los ratones SODG93A tratados con RK35 (figura 5B) es intermedia entre ratones SODG93A no tratados y ratones de tipo silvestre durante enfermedad en etapa temprana. Sin embargo, en etapa terminal, el diámetro de fibra promedio en el músculo gastrocnemio de ratones SODG93A tratados con RK35 no difirió de manera importante con ratones SODG93A tratados con PBS (datos no mostrados). Los diámetros de fibra promedio en el músculo gastrocnemío de ambos ratones SODG93A tratados con RK35 y tratados con PBS fueron significativamente diferentes al tipo silvestre en etapa terminal, consistentes con la atrofia muscular marcada observada mediante histología. Diferencias importantes en el tamaño de fibra entre ratones SODG93A de tipo silvestre y tratados con PBS también fueron evidentes en etapa terminal en músculo del diafragma. El tamaño de fibra del músculo del diafragma de ratones SODG93A tratados con RK35 mostró un desplazamiento importante en el diámetro de fibra promedio, conduciendo a una distribución de tamaño intermedia entre los ratones SODG93A de tipo silvestre y los tratados con PBS (figura 5D). Posteriormente se examinaron los efectos de la expresión de SODG93A en la actividad eléctrica del músculo del diafragma (figuras 4J y 4K) utilizando el modelo de rata en un tiempo que corresponde al inicio clínico (-1 12 días; Howland et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-09). El EMG mostrado para el grupo de ratas SODG93A tratadas con PBS muestra una escasa actividad de punta así como alguna presencia de actividad espontánea anormal (figura 4J). La actividad de punta de ratas SODG93A tratadas con RK35 fue similar a aquella observada para ratas de tipo silvestre, sin evidencia de actividad espontánea anormal. Como se muestra en la figura 4K, el músculo del diafragma de ratas SODG93A transgénicas mostró una disminución estadísticamente importante en índices de punta de estallido de EMG que indican una función dañada. En contraste, las ratas SODG93A tratadas con RK35 mostraron un índice de punta de estallido que fue significativamente superior a las ratas SODG93A tratadas con PBS y la cual no fue significativamente diferente a los controles de tipo silvestre de la misma edad. Por lo tanto, la inhibición de miostatina mediante RK35 fue efectiva para preservar tanto la estructura del diafragma como la función del diafragma.

Eiemplo 3.2.4 La inhibición de miostatina desacelera la pérdida de neuronas motoras en el asta anterior Para determinar si RK35 desaceleró la pérdida de grandes neuronas motoras en la médula espinal, se contaron grandes neuronas motoras en la médula espinal lumbar de ratón L3-5 de ratones SODG93A tratados con RK35 o PBS y ratones de tipo silvestre tratados con PBS. Los conteos se realizaron en la médula espinal a las 12 semanas (84-90 días de edad; media de 88 días), tiempo cuando el tratamiento de RK35 dio como resultado masa muscular incrementada, peso corporal incrementado, fuerza de agarre incrementada e histopatología muscular atenuada en ratones SODG93A. En este momento, hay una pérdida importante (25-40%) de grandes neuronas motoras en el ratón SODG93A (Guo et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12:2519-32; Sharp (2005 Neuroscience 130:897-910; Schutz et al. (2005) J. Neurosci. 25:7805-12).

Los conteos de grandes neuronas motoras lumbares (figuras 6A-6D) en ratones SODG93A tratados con PBS (figura 6F) disminuyeron significativamente en comparación con controles de tipo silvestre de miembros de camada (figura 6E). El tratamiento de RK35 redujo la pérdida de neuronas motoras en enfermedad en etapa temprana (figura 6G) a un nivel intermedio entre ratones SODG93A tratados con PBS y ratones de tipo silvestre. En enfermedad en etapa terminal, fueron evidentes pérdidas importantes de grandes neuronas motoras en el asta anterior lumbar así como gliosis incrementada en los ratones SODG93A independientemente del tratamiento (figuras 61 y 6J) sin cambios correspondientes percibidos en ratones de tipo silvestre (figura 6H). El conteo estereológico de la población total de grandes neuronas motoras (área mayor a 300 µm2) reveló una tendencia de 25% de pérdida de neurona motora en ratones SODG93A tratados con PBS en comparación con controles de tipo silvestre. Se observó un tendencia hacia una desaceleración de pérdida de neuronas motoras en ratones tratados con RK35 (p=0.08) (figura 6A). Si los conteos se restringen a grandes neuronas motoras con nucléolos visibles para evitar el conteo de neuronas motoras que muestran signos de degeneración (es decir, presencia de membrana y vacuolas irregulares), hay un 40% de disminución en el número promedio de grandes neuronas motoras por sección en ratones SODG93A tratados con PBS en comparación con ratones de control de tipo silvestre (figura 6B), así como una diferencia estadísticamente importante entre ratones SODG93A tratados con RK35 y tratados con PBS (figura 6B). Sin embargo, tomados en conjunto, los datos combinados mostrados en las figuras 6A y 6B indican que tanto la pérdida de grandes neuronas motoras como los efectos del tratamiento de RK35 en cuanto a esta pérdida son relativamente sutiles en el intervalo de edad de 12 semanas (88 días). En etapa terminal, los conteos de neuronas motoras en ratones SODG93A tratados con RK35 y tratados con PBS fueron significativamente diferentes con los ratones de control de tipo silvestre a través de ambos métodos de análisis (figuras 6C y 6D). Estos datos son consistentes con datos sobre función y estructura muscular esquelética presentados anteriormente de que las mejoras mediadas por RK35 observadas durante enfermedad en etapa temprana no se mantienen en la etapa terminal.

EJEMPLO 4 Discusión ALS es una enfermedad fatal y progresiva en la cual las neuronas motoras de la médula espinal y tronco cerebral se degeneran con atrofia muscular subsiguiente. Se ha puesto una considerable atención en mecanismos involucrados en muerte celular de neuronas motoras. Varios estudios recientes han sugerido que múltiples tipos celulares pueden estar involucrados en la etiología de la enfermedad al controlar la producción de factores clave en el microambiente extracelular de la unión neuromuscular (Bruijn et al. (2004) Annu. Rev. Neurosci. 27:723-49). Los estudios que utilizan ratones quiméricos han mostrado que la presencia de células no neuronales de tipo silvestre puede extender la supervivencia de neuronas motoras que expresan SOD1 mutante (Clement et al. (2003 Science 302:113-17). Estas observaciones han conducido a la investigación de terapias que pudieran desacelerar la degeneración neuronal al proveer un microambiente óptimo para supervivencia. Por ejemplo, la administración en el músculo de factores de crecimiento viralmente expresados incluyendo IGF-1 , GDNF y VEGF ha mostrado prolongar la supervivencia en el modelo de ratón SODG93A (Kaspar et al. (2003) Science 301 :839-42; Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-17; Wang et al (2002) J. Neurosci. 22:6920-28). Además, la expresión de músculo específico de IGF-1 ha mostrado estabilizar las uniones neuromusculares, mejorar la supervivencia de neuronas motoras y retrasar el inicio y avance de enfermedad en el modelo de ratón transgénico SODG93A, indicando que los efectos directos en el músculo pueden impactar el inicio y el avance de la enfermedad (Dobrowolny et al. (2005) J. Cell. Biol. 168:193-99). Los cambios en metabolismo muscular y vulnerabilidad de neuronas motoras también se ha informado en ratones con ALS, fundamentando adicionalmente la hipótesis de que el músculo puede ser un indicador activo de la patología de la enfermedad (Dupois et al. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101 :11159-64). La miostatina, o GDF-8, es un inhibidor endógeno de crecimiento muscular que produce su función biológica, por lo menos en parte, mediante la activación del receptor de Activina llb (ActRllb), dando como resultado la represión de proliferación y diferenciación de células de mioblasto (Langley et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:49831-40; Thomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:40235-43). La inhibición de la función GDF-8 utilizando anticuerpos neutralizantes Anti- GDF-8 ha mostrado mejorar la masa y fuerza muscular en ratones adultos sanos así como proporcionar una mejora funcional en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular (Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commum. 300:965-71 ; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21 ). Para entender mejor el papel del músculo en el avance de la enfermedad en neuronas motoras, se utilizó un novedoso anticuerpo neutralizante para GDF-8, RK35, el cual se une con mayor afinidad que un reactivo previamente descrito (IC50 3 nM para RK35 vs.>100 nM para JA16; Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res Commun. 300:965-71 ; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21 ), dando como resultado mayores incrementos en masa muscular en ratones de tipo silvestre tratados con RK35 (datos no mostrados). En modelos de rata y ratón SODG93A de ALS familiar, el tratamiento con RK35 dio como resultado un peso corporal incrementado y masa y fuerza muscular incrementadas durante las fases tempranas de enfermedad de neuronas motoras. Esta fase temprana de la enfermedad se define como la edad (56-88 días después de nacimiento) en la cual los ratones SODG93A muestran una pérdida importante de fuerza muscular, según lo medido con la evaluación de fuerza de agarre (Ligón et al. (2005) Neuroreport 16:533-36) y anormalidades de marcha (Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32:43-50), y que coincide con la denervación de uniones neuromusculares (Frey et al. (200) J. Neurosci. 20:2534-42; Fischer et al (2004) Experimental Neurology 185:232-40). Los incrementos en masa muscular que resultan de la inhibición de GDF-8 mediante RK35 fueron más evidentes en los músculos de cuadriceps, pero también se pronunciaron en el gastrocnemio, tibial craneal y el diafragma en ambos modelos de roedores analizados. Estos incrementos se correlacionaron bien con fuerza incrementada, ya que la fuerza de la extremidad trasera y extremidad delantera disminuyó más lentamente en ratones tratados con RK35 en comparación con los controles. El grado de incremento de masa muscular inducido mediante el tratamiento con el anticuerpo anti-GDF-8 de RK35 fue similar en magnitud a un incremento de 25% en masa muscular observada en ratones heterocigotos para alteración del gen GDF-8; la masa muscular de ratones que son homocigotos que carecen de GDF-8 es de aproximadamente dos veces aquella de los ratones de tipo silvestre (McPherron (1997) Nature 387:83-90). En aproximadamente 84-88 días después de nacimiento en ratones SODG93A, y aproximadamente 110 días para ratas SODG93A, se hacen evidentes signos manifiestos de enfermedad incluyendo disminuciones de peso corporal, anormalidades de marcha y parálisis. El tratamiento de RK35 no extendió la supervivencia en ratones o ratas SODG93A. La masa y fuerza muscular incrementada inducida por tratamiento anti-GDF-8 en la fase temprana de enfermedad no retrasó la aparición de anormalidades de marcha y parálisis de extremidades en ratones y ratas SODG93A (datos no mostrados), ni tampoco se mantuvieron ganancias en masa muscular de patas. Sin embargo, se observaron importantes incrementos en masa de diafragma en ratones y ratas SODG93A tratados con RK35 en comparación con controles SODG93A tratados con vehículo en las fases de enfermedad en etapa temprana y terminal. El músculo del diafragma en ratones SODG93A tratados con RK35 en etapa terminal fue comparable con aquel de controles de tipo silvestre con coincidencia de edad en la evaluación histológica y de masa. Las ratas SODG93A tratadas con RK35 también mantuvieron un incremento importante en masa muscular del diafragma en etapa terminal. Consistente con estos cambios morfológicos, el análisis electrofisiológico de diafragmas de ratas SODG93A no tratadas indica que la expresión de SOD1 mutante da como resultado la inhibición significativa de función muscular, y que el tratamiento con RK35 conserva de manera efectiva la función muscular en el diafragma. En este estudio se utilizó un criterio de valoración definido (falla de la prueba de reflejo derecho, indicando una parálisis significativa de extremidades), como el criterio para "etapa terminal" y eutanasia. Por lo tanto, no es claro si la masa muscular mejorada del diafragma, atrofia disminuida, y función electrofisiológica mejorada inducida por tratamiento de RK35 daría como resultado un período de vida prolongado en roedores provistos con suplementación nutricional. Sin embargo, estos descubrimientos son potencialmente importantes dado el hecho de que la disfunción respiratoria es la causa principal de muerte en pacientes con ALS (Lechtzin et al. (2002) Amyotroph. Lateral Soler. Other Motor Neuron Disord. 3:5-13). Los tratamientos tales como RK35, diseñados para mejorar la función del diafragma pueden tener el potencial de retrasar la necesidad de respiración mecánicamente asistida en pacientes con ALS. La inhibición de GDF-8 mediante RK35 puede influir en la pérdida de neuronas motoras en la médula espinal lumbar en la fase temprana de la enfermedad, aunque aparentemente se perdieron muchos beneficios terapéuticos en la enfermedad en etapa terminal. Estos datos indican que las terapias que actúan directamente en el músculo pueden tener un beneficio en neuronas motoras que enervan músculo posiblemente al modular el microambiente trófico, aunque este método aparentemente no es suficiente para retrasar la enfermedad. Estas observaciones, por lo tanto, son consistentes con los resultados de Dobrowolny et al. ((2005) J. Cell. Biol. 168:193-99)), en los cuales la expresión de una isoforma de músculo específico de IGF condujo a pérdida desacelerada de neuronas motoras en el modelo de ratón SODG93A, y de Kaspar et al. ((2003) Science 301 :839-42), en donde el suministro viral de IGF1 al músculo dio como resultado una pérdida de neuronas motoras reducida en la enfermedad en etapa temprana. Similar a las observaciones de Kaspar et al. ((2003), supra), no se mantuvieron efectos benéficos de tratamiento en supervivencia de neuronas motoras a través de la enfermedad en etapa terminal. Por consiguiente, es probable que el soporte del factor trófico mejorado de músculo sea insuficiente para prevenir la pérdida de neuronas motoras en el modelo SODG93A. En resumen, en ambos modelo de ratón y rata de ALS familiar, la inhibición de miostatina da como resultado una masa y fuerza muscular incrementada, la cual se mantiene a través de las etapas tempranas de la enfermedad pero se pierde en la etapa terminal. La inhibición de miostatina desaceleró los cambios degenerativos en músculo esquelético en enfermedad en etapa temprana, pero no retrasó el inicio de parálisis y extendió la supervivencia, según lo definido por la falla del reflejo derecho, ni tampoco la inhibición de miostatina redujo significativamente la pérdida de neuronas motoras. Sin embargo, ambas diferencias morfológicas y funcionales a través de la enfermedad en etapa tardía se observaron en el músculo del diafragma de animales tratados con anticuerpo anti-miostatina, en comparación con controles no tratados. De manera general, los datos provistos en la presente soportan el potencial de un efecto benéfico de construcción muscular mediante el tratamiento con RK35, lo cual puede contribuir a una "calidad de vida del paciente" mejorada a principios del proceso de enfermedad. Dado que los anticuerpos anti-GDF-8 están actualmente en desarrollo clínico, el uso de dichos reactivos clínicos en ALS para el mantenimiento de masa muscular de extremidades y diafragma garantiza la investigación adicional como un componente de un método de acciones múltiples para el tratamiento de ALS. La combinación de una terapia antí-GDF-8 con fármacos existentes tales como el antagonista de glutamato riluzol, o agentes más nuevos que entran en desarrollo clínico, pudiera no solamente mejorar el nivel de eficacia al ayudar a mantener la masa muscular, sino también tiene un impacto importante en la calidad de vida general del paciente.

EJEMPLO 5 Mapeo de epítopes para RK35 Con el fin de mapear los epítopes exactos de anticuerpo para GDF-8, 48 péptidos traslapantes de 13 residuos que representan la secuencia completa de GDF-8 maduro expuesta en SEQ ID NO:1 se sintetizaron directamente en papel de celulosa utilizando técnica de síntesis de mancha (por ejemplo, Molina et al. (1996) Peptide Res 9:151-55; Frank et al. (1992) Tetrahedron 48:9217-32). El traslape de los péptidos fue de 11 aminoácidos. En esta disposición, los residuos cisteína se reemplazaron con serina con el fin de reducir las complicaciones químicas ocasionadas por cisteínas. Las membranas de celulosa modificadas con polietilenglicol y aminoácidos Fmoc-protegidos se adquirieron de Abimed (Lagenfeld, Alemania). La disposición se definió sobre la membrana al acoplar un espaciador de ß-alanina, y los péptidos se sintetizaron utilizando química de acoplamiento estándar DIC (diisopropilcarbodiimida)/HOBt (hidroxibenzotriazol) como se describió anteriormente (Molina et al., supra; Frank et al., supra). Los aminoácidos activados se mancharon utilizando un robot Abimed ASP 222. Los pasos de lavado y desprotección se realizaron manualmente, y los péptidos se acetilaron N-terminalmente después del ciclo de síntesis final. Después de síntesis del péptido, la membrana se lavó en metanol durante 10 minutos y en bloqueador (TBST (Tris-solución salina regulada de pH con 0.1 % (v/v) Tween™ 20) y 1 % (p/v) caseína) durante 10 minutos. Luego la membrana se incubó con 2.5 µg/ml de un anticuerpo anti-GDF-8 en bloqueador durante 1 hora con agitación uniforme. Después de lavar en bloqueador 3 veces durante 10 minutos, la membrana se incubó con anticuerpo secundario HRP-marcado (0.25 µg/ml en bloqueador) durante 30 minutos. Luego la membrana se lavó tres veces durante 10 minutos cada una con bloqueador y 2 veces durante 10 minutos cada una con TBST. El anticuerpo unido se visualizó utilizando reactivo SuperSignal™ West (Pierce) y una cámara digital (Alphananotech Fluoromager). Como se muestra en la figura 7 el epítope RK35 mapea hacia una región de GDF-8 entre los aminoácidos 30-40 y 84-97, que interactúa de manera putativa con el receptor de GDF-8 Tipo II según lo pronosticado por la comparación de secuencias del receptor de GDF-8 con los receptores homólogos de la familia TGF-ß con dominios caracterizados.

EJEMPLO 6 Caracterización del anticuerpo RK35 Los genes pesados variables (VH) y ligeros variables (VL) que codifican RK35 se clonaron a partir de células de hibridoma que producen el anticuerpo, y se determinaron las secuencias de aminoácidos. Los datos de secuencias para el anticuerpo RK35 se utilizaron para identificar la secuencia de línea de células germinales más cercana para la cadena pesada y ligera. Una comparación de regiones variables ligeras y pesadas de RK35 con la secuencia de línea de células germinales humana más cercana se muestra en la figura 8. Se pueden realizar mutaciones adecuadas utilizando técnicas de mutagénesis estándar de sitio dirigido con los iniciadores mutagénicos adecuados. La mutación del anticuerpo luego se confirma de mediante análisis de secuencias. La secuencia de aminoácidos ejemplares para RK35 humanizado se exponen en SEQ ID NOs:7 (VH) y 9 (VL), las cuales pueden ser codificadas a través de una secuencia de ácidos nucleicos fácilmente determinada por un experto, por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos expuestas como SEQ ID NO:6 (VH) y 8 (VL). Un experto en la técnica reconocerá que cualquiera y/o todos los aminoácidos en el marco del anticuerpo humanizado se pueden mutar de vuelta al aminoácido de murino original, por ejemplo, para mantener la conformación del fragmento de unión a antígeno. Ejemplos no limitativos de SEQ ID NO:7 (VH) y SEQ ID NO:9 (VL) con algunas retromutaciones que pueden a ayudar a mantener la afinidad del anticuerpo para GDF-8 se exponen como SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27, respectivamente. Para crear anticuerpos quiméricos, la secuencia VH se subclona en un vector de expresión pED6 hulgGI mut, el cual codifica lgG1 humano que contiene dos mutaciones puntuales (L234A y G237A) para reducir la unión a receptores Fc humanos y componentes complementarios (Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24; Shields et al (2001 ) J. Biol. Chem. 276-6591-604). La secuencia VL de RK35 se puede subclonar en el vector de expresión pED6 Kappa. Los vectores de expresión que contienen la secuencias VH y VL de RK35 luego se cotransfectan en células COS-1 y un anticuerpo RK35 quimérico se purifica a partir del medio acondicionado.

EJEMPLO 7 Tratamiento de trastornos musculares Los inhibidores de GDF-8, es decir, antagonistas de GDF-8, tales como por ejemplo, anticuerpos inhibidores, son útiles para el tratamiento de trastornos metabólicos relacionados con GDF-8 tal como diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina (por ejemplo, inducida por trauma tal como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno), y trastornos de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad). Los inhibidores de GDF-8 también son útiles para el tratamiento de trastornos óseos y musculares relacionados con GDF-8, tal como ALS, distrofia muscular y osteoartritis. Los anticuerpos anti-GDF-8 y fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden utilizar para tratar a un sujeto, por ejemplo a un sujeto humano, de preferencia a un sujeto que padece de ALS, en el inicio de la enfermedad, o a un sujeto que tiene una enfermedad establecida ósea/muscular o metabólica. Los anticuerpos inhibidores contra GDF-8 también se pueden utilizar para prevenir y/o reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se anticipa que los anticuerpos anti-GDF-8 y fragmentos de anticuerpos se administran, por ejemplo, de manera subcutánea tan frecuentemente como una vez al día y de manera no tan frecuente como una vez al mes. Las duraciones de tratamiento varían de aproximadamente 1 mes (o menos) a varios años. Para probar la eficacia clínica de anti-GDF-8 en humanos, se identifican sujetos que padecen o que están en riesgo de ALS y se aleatorizan en grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluyen un grupo de placebo y uno a tres o más grupos que reciben anticuerpo (en diferentes dosis cuando existen dos o más grupos). Se da seguimiento a los individuos de manera prospectiva, por ejemplo, durante un mes a tres años para evaluar los cambios en peso, masa muscular y fuerza de agarre. Se anticipa que los individuos que reciben tratamiento presentarán una mejora. Un antagonista de GDF-8, de preferencia en forma de un anticuerpo o anticuerpos, se administra como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administra como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosificación de preferencia es de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y/o el avance de la enfermedad. La dosis efectiva adecuada puede ser seleccionada por un médico tratante a partir de la siguiente lista no limitativa de escalas: 1 µg/kg a 100 mg/kg, 1 µg/kg a 50 mg/kg, 1 µg/kg a 20 mg/kg, 1 µg/kg a 10 mg/kg, 1 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 100 mg/kg, 100 µg a 1 mg/kg, y 500 µg/kg a 1 mg/kg. Los regímenes de tratamiento no limitativos ejemplares y resultados potenciales se resumen en el cuadro 5.

CUADRO 5 Eiemplos de casos clínicos potenciales La especificación se entiende de manera más completa en vista de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de la especificación, las cuales se incorporan en su totalidad a la presente como referencia. Las modalidades dentro de la especificación proveen ilustraciones de la invención y no deben ser interpretadas para limitar el alcance de la invención. El experto en la técnica reconoce que muchas otras modalidades están contempladas por la invención reclamada, y que la especificación y ejemplos se deben considerar solamente como ilustrativos.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un polipéptido aislado capaz de unirse a GDF-8, en donde el polipéptido comprende por lo menos una región determinadora de complementariedad que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 , la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 , la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, y las secuencias de aminoácidos de los fragmentos activos de las mismas. 2.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido es un anticuerpo aislado. 3.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una cadena pesada, y en donde la cadena pesada comprende una primera, segunda y tercera región determinadora de complementariedad, en donde la primera región determinadora de complementariedad comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:10, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:20, y la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:20, en donde la segunda región determinadora de complementariedad comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 , la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:11 , la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 , y la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:21 , y en donde la tercera región determinadora de complementariedad comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 , la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:12, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, y la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:22. 4.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:3, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo SEQ ID NO:7. 5.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una cadena ligera, y en donde la cadena ligera comprende una primera, segunda y tercera región determinadora de complementariedad, en donde la primera región determinadora de complementariedad comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:13, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:23, y la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:23, en donde la segunda región determinadora de complementariedad comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14, la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:14, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24, y la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:24, y en donde la tercera región determinadora de complementariedad comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15 , la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:15, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, y la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:25. 6.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:5, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, y la secuencia de aminoácidos de un fragmento activo de SEQ ID NO:9. 7 '.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. 8.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, y en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7. 9.- El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-8, caracterizado además porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo intacto, un diacuerpo, un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento scFV, y un fragmento Fv. 10.- El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado además porque el anticuerpo es un fragmento dAb. 11.- Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1. 12.- Una célula hospedera que comprende un polinucleótido de la reivindicación 11 , en donde el polinucleótido está operablemente enlazado a una secuencia reguladora. 13.- Un vector que comprende un polinucleótido de la reivindicación 11. 14.- Un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula hospedera que comprende un polinucleótido de la reivindicación 11 , y recuperar el anticuerpo expresado por la célula hospedera. 15.- El anticuerpo aislado y purificado producido a través del método de la reivindicación 14. 16.- Una composición farmacéutica para tratar, aliviar, y/o prevenir un trastorno relacionado con GDF-8 que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y por lo menos un antagonista de GDF-8 seleccionado del grupo que consiste en el polipéptido de la reivindicación 1 y un polinucleótido que codifica el polipéptido de la reivindicación 1. 17.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el trastorno relacionado con GDF-8 se selecciona del grupo que consiste en un trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo inducido o metabólico, trastorno de la adiposa, trastorno de metabolismo de glucosa, y trastorno relacionado con insulina en un paciente mamífero. 18.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el trastorno relacionado con GDF-8 se selecciona del grupo que consiste en distrofia muscular, ALS, atrofia muscular, atrofia de órganos, debilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, síndromes de desgaste muscular, obesidad, diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndromes metabólicos, resistencia a la insulina, trastornos nutricionales, falla gonadal prematura, supresión de andrógenos, hiperparatiroidismo secundario, osteoporosis, ostopenia, osteoartritis, masa ósea baja, deficiencia de vitamina D y anorexia nerviosa. 19.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el trastorno relacionado con GDF-8 es ALS. 20.- El uso de un antagonista de GDF-8 para la elaboración de un medicamento útil para tratar, aliviar y/o prevenir un trastorno relacionado con GDF-8 en un paciente mamífero. 21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde la cantidad del antagonista de GDF-8 tiene poca o ninguna toxicidad. 22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde el antagonista de GDF-8 se selecciona del grupo que consiste en el polipéptido de la reivindicación 1 y un polinucleótido que codifica el polipéptido de la reivindicación 1. 23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde el trastorno relacionado con GDF-8 se selecciona del grupo que consiste en un trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno degenerativo óseo, trastorno óseo inducido o metabólico, trastorno de la adiposa, trastorno de metabolismo de glucosa, y trastorno relacionado con insulina en un paciente mamífero. 24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde el trastorno relacionado con GDF-8 se selecciona del grupo que consiste en distrofia muscular, ALS, atrofia muscular, atrofia de órganos, debilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, síndromes de desgaste muscular, obesidad, diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndromes metabólicos, resistencia a la insulina, trastornos nutricionales, falla gonadal prematura, supresión de andrógenos, hiperparatiroidismo secundario, osteoporosis, ostopenia, osteoartritis, masa ósea baja, deficiencia de vitamina D y anorexia nerviosa. 25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde el trastorno relacionado con GDF-8 es ALS. 26.- Un método in vitro para diagnosticar o detectar si un paciente está sufriendo de un trastorno relacionado con GDF-8, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una primera muestra previamente obtenida del paciente de interés con el anticuerpo de la reivindicación 2; (b) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (c) poner en contacto una segunda muestra previamente obtenida de un individuo que no padece el trastorno relacionado con GDF-8 con el anticuerpo; (d) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; (e) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica si el paciente está sufriendo del trastorno relacionado con GDF-8. 27.- Un método in vitro para monitorear la severidad de un trastorno relacionado con GDF-8, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una primera muestra previamente obtenida de un paciente que padece el trastorno relacionado con GDF-8 en un primer punto de tiempo con el anticuerpo de la reivindicación 2; (b) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (c) poner en contacto una segunda muestra previamente obtenida del paciente en un segundo punto de tiempo con el anticuerpo; (d) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (e) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra en comparación con la primera muestra indica si el trastorno relacionado con GDF-8 ha cambiado de severidad. 28.- El método de monitoreo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el trastorno relacionado con GDF-8 es ALS, y en donde una disminución en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra indica que ALS ha disminuido de severidad. 29.- Un método in vitro para monitorear la severidad de un trastorno relacionado con GDF-8, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una primera muestra previamente obtenida de un paciente que padece el trastorno relacionado con GDF-8 con el anticuerpo de la reivindicación 2; (b) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (c) poner en contacto una segunda muestra previamente obtenida de un individuo que no padece el trastorno relacionado con GDF-8 con el anticuerpo; (d) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (e) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución, o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica si el trastorno relacionado con GDF-8 ha modificado en severidad. 30.- El método de monitoreo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el trastorno relacionado con GDF-8 es ALS, y en donde una disminución o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica que ALS está disminuida en severidad. 31.- Un método in vitro para pronosticar la probabilidad de que un paciente desarrolle un trastorno relacionado con GDF-8, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una primera muestra previamente obtenida del paciente de interés en un primer punto de tiempo con el anticuerpo de la reivindicación 2; (b) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (c) poner en contacto una segunda muestra previamente obtenida del paciente en un segundo punto de tiempo con el anticuerpo; (d) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (e) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución o similitud en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra indica la probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno relacionado con GDF-8. 32.- El método de pronóstico de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el trastorno relacionado con GDF-8 es ALS, y en donde un incremento en el nivel de GDF-8 en la segunda muestra indica una probabilidad incrementada de que el paciente desarrolle ALS. 33.- Un método in vitro para pronosticar la probabilidad de que un paciente desarrolle un trastorno relacionado con GDF-8, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una primera muestra previamente obtenida del paciente de interés con el anticuerpo de la reivindicación 2; (b) determinar el nivel de GDF-8 en la primera muestra; (c) poner en contacto una segunda muestra previamente obtenida de un individuo que no padece el trastorno relacionado con GDF-8 con el anticuerpo; (d) determinar el nivel de GDF-8 en la segunda muestra; y (e) comparar los niveles de GDF-8 en la primera y segunda muestras, en donde un incremento, disminución o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica la probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno relacionado con GDF-8. 34.- El método de pronóstico de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el trastorno relacionado con GDF-8 es ALS, y en donde una disminución o similitud en el nivel de GDF-8 en la primera muestra en comparación con la segunda muestra indica una probabilidad disminuida de que el paciente desarrolle ALS.