JP2012244998A - Ｇｄｆ−８に対するアンタゴニスト抗体ならびにａｌｓおよびその他のｇｄｆ−８関連障害の処置における使用 - Google Patents

Ｇｄｆ−８に対するアンタゴニスト抗体ならびにａｌｓおよびその他のｇｄｆ−８関連障害の処置における使用 Download PDF

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Abstract

【課題】増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）アンタゴニスト、具体的には、ＧＤＦ−８に対する抗体、例えば、マウス、ヒトおよびヒト化抗体、ならびにそれらのフラグメント、特にインビトロおよび／またはインビボでＧＤＦ−８活性を阻害する医薬組成物を提供する。
【解決手段】増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）に関連する新規な分子、具体的には、インビトロおよび／またはインビボでＧＤＦ−８活性およびシグナル伝達を阻害するものを含む、マウスおよびヒト化抗体、ならびに抗体フラグメント。また、筋肉、骨、およびインスリン代謝、その他、具体的には筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の変性の順序を診断、処置、寛解、予防、予知、またはモニターする方法であり、その上、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクターを用いることによる、このような障害の処置のための医薬組成物。
【選択図】なし

Description

本出願は、２００５年８月１９日出願の米国特許仮出願第６０／７０９，７０４号の優
先権の利益を主張し、その内容は本明細書においてその全文が参照により本明細書に組み
込まれる。
連邦政府資金による受託研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所からの助成金の下で米国政府の支援によりなされた（Ｒ
０１ ＧＭ−４８６６１およびＲ０１ ＧＭ−５６７０７）。米国政府は本発明に一定の
権利を有する。
本発明の属する技術分野は、増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）アンタゴニスト、具体的
には、ＧＤＦ−８に対する抗体、例えば、マウス、ヒトおよびヒト化抗体、ならびにそれ
らのフラグメント、特にインビトロおよび／またはインビボでＧＤＦ−８活性を阻害する
ものに関する。当分野は、さらにＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨
変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害またはインスリン
関連障害、特に筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）を処置、寛解、予防、予知、またはモ
ニターすることに関する。
増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）は、ミオスタチンとしても公知であり、分泌タンパク
質で、構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）
スーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーメンバーは増殖調節特性
および形態形成特性を有する(Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless
et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72)。ヒトＧＤＦ−８は、ホ
モ二量体複合体を形成する３７５アミノ酸前駆体タンパク質として合成される。プロセシ
ングの間、「潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）」として公知のアミノ末端プロペプチドは切断
され、ホモ二量体と非共有結合したまま残り、「小型潜在型複合体」と名付けられる不活
性複合体を形成し得る(Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:6407-15; Wakefiel
d et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:7646-54; Brown et al. (1999) Growth Factors 3
:35-43; Thies et al. (2001) Growth Factors 18:251-59; Gentry et al. (1990) Bioch
emistry 29:6851-57; Derynck et al. (1995) Nature 316:701-05; Massague (1990) Ann
. Rev. Cell Biol. 12:597-641)。フォリスタチンおよびその類縁などのタンパク質も成
熟ＧＤＦ−８ホモ二量体と結合し、ＧＤＦ−８生物活性を阻害する(Gamer et al. (1999)
Dev. Biol. 208:222-32)。
様々な種由来の推定ＧＤＦ−８アミノ酸配列のアラインメントは、ＧＤＦ−８が高度に
保存されていることを証明する(McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 94:12457-61)。ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリＧＤＦ−８の配列は、
Ｃ末端領域が１００％同一であるが、ヒヒ、ウシ、およびヒツジＧＤＦ−８はＣ末端でわ
ずか３アミノ酸が異なる。種を超えてＧＤＦ−８が高度に保存されることは、ＧＤＦ−８
が必要不可欠な生理学的機能を有することを示唆する。
ＧＤＦ−８は、筋芽細胞および衛星細胞の増殖と分化の双方を阻害することにより筋肉
発生の調節およびホメオスタシスに重要な役割を果たすことが示されている(Lee and McP
herron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:604-07; McCroskery et al. (2003) J. Cell
. Biol. 162:1135-47)。それは骨格筋の発生の初期段階で発現し、成体骨格筋において、
優先的には速筋線維の種類に発現し続ける。さらに、成体マウスで過剰発現したＧＤＦ−
８は、顕著な筋肉損失をもたらす(Zimmers et al. (2002) Science 296:1486-88)。また
、ＧＤＦ−８遺伝子を不活性にする自然変異が、動物およびヒトの双方において肥大およ
び過形成の双方をもたらすことが示されている(Lee and McPherron (1997) 前掲)。例え
ば、ＧＤＦ−８ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨格筋の顕著な肥大および過
形成ならびに皮質骨構造の変化を特徴とする(McPherron et al. (1997) Nature 387:83-9
0; Hamrick et al. (2000) Bone 27:343-49)。ウシにおけるＧＤＦ−８自然変異では同様
の骨格筋量の増加が明らかである(Ashmore et al. (1974) Growth 38:501-07; Swatland
et al. (1994) J. Anim. Sci. 38:752-57; McPherron et al.、前掲; Kambadur et al. (
1997) Genome Res. 7:910-15)。その上、様々な研究から、ＧＤＦ−８発現の増加がＨＩ
Ｖ誘発性筋消耗に関連していることが示される(Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14938-43)。ＧＤＦ−８はまた、筋肉特異的酵素（例えば、
クレアチンキナーゼ）の産生および筋芽細胞増殖にも関与している（ＷＯ００／４３７８
１号）。
その増殖調節および形態形成特性に加えて、ＧＤＦ−８は多数のその他の生理学的プロ
セスにかかわっていると考えられ、それには、２型糖尿病発生の間のグルコースホメオス
タシス、耐糖能異常、メタボリック症候群（すなわち、２型糖尿病および／または心疾患
についての高いリスクをもたらす、一群の健康状態の同時発生を伴う症候群（例えばシン
ドロームＸ）、この一群の健康状態には、インスリン抵抗性、腹部肥満、異脂肪血症、高
血圧症、慢性炎症、血栓形成前の状態、その他が含まれ得る）、インスリン抵抗性（例え
ば、熱傷または窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗性）、および脂肪組織
障害（例えば、肥満症、異脂肪血症、非アルコール性脂肪肝疾患、その他）が含まれる(K
im et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-06)。
多数のヒトおよび動物の疾患は機能的に障害のある筋肉組織に関連し、その例は、筋萎
縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、筋ジストロフィー（「ＭＤ」；デュシェンヌ型筋ジスト
ロフィーを含む）、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サル
コペニア、悪液質、およびその他の疾患および状態に起因する筋肉消耗症候群である。現
在、これらの障害を処置するために存在する、信頼できるかまたは効果的な治療法は少数
である。これらの疾患の病態は、これらの疾患の処置における標的としてのＧＤＦ−８シ
グナル伝達の潜在的役割を示している。
ＡＬＳは、中枢神経系の変性および筋萎縮を特徴とする遅発型かつ致死性の神経変性疾
患である。ＡＬＳは、一般に歩行異常および器用さの喪失に始まり、その後手足および横
隔膜の麻痺へと進行する。ＡＬＳの大部分の症例は孤発性であって病因不明であるが、５
〜１０％の症例は、家族性の優性遺伝（ＦＡＬＳ）に起因することが示されている。約１
０〜２０％のＦＡＬＳ症例の原因は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ
１）遺伝子の変異である（Bruijn et al. (2004) Ann. Rev. Neurosci. 27:723-49に概説
されている）。ＳＯＤ１は、スーパーオキシドの過酸化水素と二原子酸素への反応を触媒
するヘテロ二量体の金属タンパク質であり、ＳＯＤ１の損失は運動ニューロン疾患を引き
起こさないため（Reaume et al. (1996) Nat. Genet. 13:43-47）、機能の毒性獲得によ
り疾患が誘発されると考えられる（Bruijn et al.、前掲に概説されている）。ＳＯＤ１
に誘発されるニューロン細胞死の具体的な機構は不明であり、軸索輸送、ミスフォールド
したタンパク質への細胞応答、ミトコンドリア機能障害、および興奮毒性の変化を伴い得
る（Bruijn et al.、前掲）。
ＡＬＳに観察される運動ニューロンの変性は、運動ニューロンによる栄養因子の取り込
みまたは輸送の中断を含む、複数の機構によって起こり得る（Holzbaur (2004) Trends C
ell Biol. 14:233-40に概説されている）。したがって、ＡＬＳは最適な生存環境をもた
らすことにより変性ニューロンを活性化させる治療法で処置され得る。神経の環境には、
グリアおよび運動ニューロンにより神経支配される筋肉細胞などの非ニューロン細胞が含
まれる。この環境が、ニューロンにより取り込まれ、逆行性の軸索輸送を経て細胞体へ輸
送される栄養因子および増殖因子をもたらす（Chao (2003) Neuron 39:1-2; Holzbaur、
前掲）。
ＦＡＬＳは、変異ＳＯＤ１の過剰発現によりマウスおよびラットの双方でモデル化され
ている（Howland et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-09）。変異Ｓ
ＯＤ１のＧ９３Ａ型を過剰発現しているトランスジェニックマウスは９０〜１００日齢で
筋力低下および萎縮を示し、一般に１３０日齢前後で死ぬ（Gurney et al. (1994) Scien
ce 264:1772-75）。しかし、その根底にある、ＳＯＤＧ９３Ａに誘発される病態（握力低
下および神経筋接合部の損失を含む）は、５０日齢程度で著しい（Frey et al. (2000) J
. Neurosci. 20:2534-42; Fisher et al. (2004) Exp. Neuro. 185:232-40; Ligon et al
. (2005) NeuroReport 16:533-36; Wooley et al. (2005) Muscle Nerve 32:43-50）。Ｓ
ＯＤＧ９３Ａ変異を発現しているトランスジェニックラットは、同様の変性の経時的変化
をたどる（Howland et al.、前掲）。最近の研究から、病態の発症が細胞自律的でないこ
とが示唆され、ＡＬＳに観察される運動ニューロンの変性が、運動ニューロンによる栄養
因子の取り込みまたは輸送の中断を含む、複数の機構によって起こり得るという仮説（上
記参照）に一致している。クレメントと共同研究者らは、キメラマウスを用いて野生型非
ニューロン細胞が変異ＳＯＤ１を発現している運動ニューロンの生存を延長することがで
きることを示した（Clement et al. (2003) Science 302:113-17）。これらの知見は、生
存に最適な微小環境を提供することによりニューロン変性を遅くできる可能性のある治療
法の検討につながった。例えば、ウイルスにより発現した増殖因子（ＩＧＦ−１、ＧＤＮ
ＦおよびＶＥＧＦを含む）の直接筋肉注射によるＳＯＤＧ９３Ａマウスの処置は動物の生
存を延長させる（Kaspar et al. (2003) Science 301:839-42; Azzouz et al. (2004) Na
ture 429:413-17; Wang et al. (2002) J. Neurosci. 22:6920-28）。その上、ＳＯＤＧ
９３Ａトランスジェニックマウスモデルにおいて、局所のＩＧＦ−１特異的イソ型（ｍＩ
ＧＦ−１）の筋肉特異的発現は、神経筋接合部を安定化させ、運動ニューロンの生存を促
進し、疾患の発病および進行を遅延させ、トランスジェニックＳＯＤ１動物において筋肉
への直接的な効果が疾患の発病および進行に影響を与え得ることを示している（Dobrowol
ny et al. (2005) J. Cell Biol. 168:193-99）。筋肉の代謝亢進と運動ニューロンの脆
弱性との関連もＡＬＳマウスにおいて報告されており、筋肉の欠損が病気の原因となり得
るという仮説を裏付ける（Dupois et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 :
11159-64）。したがって、筋肉の成長を促進することは運動ニューロンの局所支持の改善
をもたらすはずであり、その結果、治療的利益がもたらされる。
ミオスタチン発現の阻害は、筋肉肥大および過形成の双方を引き起こす（Lee and McPh
erron、前掲; McPherron et al.、前掲）。ミオスタチンは損傷後の筋肉再生を負に調節
し、ＧＤＦ−８ヌルマウスにおいてミオスタチンを欠くと筋肉の再生が加速される（McCr
oskery et al., (2005) J. Cell. Sci. 118:3531-41）。ミオスタチン中和抗体は、野生
型マウス（Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71）お
よび筋ジストロフィーのモデルであるｍｄｘマウス（Bogdanovich et al. (2002) Nature
420:418-21; Wagner et al. (2002) Ann. Neurol. 52:832-36）の体重、骨格筋量、なら
びに骨格筋の筋肉サイズおよび強度を増加させる。さらに、これらのマウスにおいてミオ
スタチン抗体は、これもＡＬＳの発病の間に標的化される筋肉である横隔膜への損傷を低
下させる。増殖因子、例えばＨＧＦの筋肉への作用はミオスタチン発現の阻害に起因し得
ると仮定されており（McCroskery et al. (2005)、前掲）、それによって再生と変性の間
の「押し引き」、すなわちバランスを正の方向へ移動させることに役立つ。したがって、
ＧＤＦ−８阻害は、ＡＬＳ、筋ジストロフィー（ＭＤ）、およびその他のＧＤＦ−８関連
障害、例えば、筋肉量、強度、サイズなどを増加させることが望ましい神経筋障害の処置
のための潜在的な薬理学的標的として存在する。ＡＬＳの利用可能な動物モデル（マウス
およびラット）を用いて、２つの異なる種において治療法を試験することが可能であり、
したがってインビボでのヒトにおける治療効果の信頼性が増大する。
ヒトにおける神経筋障害に加えて、骨の減少に関係する増殖因子関連状態、例えば骨粗
鬆症および骨関節炎もあり、これらは主に高齢者および／または閉経後の女性に発症する
。その上、代謝性骨疾患および障害には、慢性グルココルチコイド療法に起因する低骨量
、早発性性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進
症、栄養障害、および神経性食欲不振症が含まれる。これらの状態のための多くの現在の
治療法は骨吸収を阻害することにより機能するが、骨形成を促進する治療法が有用な代替
療法となる。ＧＤＦ−８は骨の発達ならびに筋肉の発達に役割を果たすので、ＧＤＦ−８
の調節も骨変性疾患の処置のための優れた薬理学的標的である。
したがって、特にヒトにおいて、さらに特にＡＬＳおよびその他の筋消耗性疾患ならび
に骨変性疾患を患っているヒトにおいて、筋肉量および／または強度および／または骨密
度、その他の全体的な増加に寄与する化合物および治療方法を開発する必要性が存在する
。ＧＤＦ−８に対する親和性の向上した中和抗体およびその他の小分子を作出することは
、これらの疾患を処置するための優れた薬理学的アプローチである。
本発明のＧＤＦ−８アンタゴニストは、抗体（例えば、インタクト抗体およびその抗原
結合フラグメント）に関し、それらは本明細書において「抗ＧＤＦ−８抗体」または「Ｇ
ＤＦ−８抗体」と呼ばれる。一実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、少なくとも１つのＧ
ＤＦ−８関連活性（すなわち「ＧＤＦ−８活性」）を低下させ、中和し、および／または
アンタゴナイズする。本発明は、したがって、これらの抗ＧＤＦ−８抗体を用いてＧＤＦ
−８活性に関連する様々な骨、筋肉、グルコースおよび脂肪の疾患を処置する方法を提供
する。本発明は、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、ＧＤＦ−８抗体が、ＡＬＳを患っ
ている動物の処置に用いられる場合に、非常に効果的な治療法であること、およびこのよ
うな抗体の投与がＡＬＳ病態の間の標的化される筋肉、例えば、横隔膜、腓腹筋、その他
の消耗を低下させることを開示する。その上、本発明は、これらのアンタゴニストがＡＬ
Ｓを患う動物において筋肉量および握力を増加させるのに非常に効果的であることを開示
する。結果として、本発明は、抗ＧＤＦ−８抗体が、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、ＡＬ
Ｓ、筋肉消耗性疾患またはＧＤＦ−８調節不全に起因するその他の疾患を処置するために
効果的な組成物であることを教示する。
一態様では、本発明は、被験体においてＧＤＦ−８関連障害を処置する（例えば、治癒
させる、抑制する）、寛解する、または予防する（例えば、該疾患の発病、再発(recurre
nce)または再発(relapse)を遅延または予防する）方法を特色とする。前記方法は、被験
体へＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体を、ＧＤＦ−８関連障害を処
置または予防するために十分な量で投与する段階を含む。ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例
えば、抗ＧＤＦ−８抗体は、被験体へ単独でまたは本明細書に記載されるその他の治療法
と組み合わせて投与することができる。ＧＤＦ−８抗体は、治療のため、予防のため、ま
たは両方のために投与することができる。一実施形態では、被験体は、例えば、骨障害お
よび筋障害を含むＧＤＦ−８関連障害を患っている哺乳類、例えば、ヒトである。好まし
くは、被験体はヒトである。より好ましくは、被験体は、本明細書に記載されるＧＤＦ−
８関連障害を患っているヒトである。
一実施形態では、本発明は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変
性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害、またはインスリン
関連障害を診断、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防す
るための安全かつ効果的な治療方法を提供し、インスリン関連障害としては、限定される
ものではないが、グルコースホメオスタシス、２型糖尿病、耐糖能異常、メタボリック症
候群（すなわち、２型糖尿病および／または心疾患についての高いリスクをもたらす一群
の健康状態の同時発生を伴う症候群、この一群の健康状態には、インスリン抵抗性、腹部
肥満、異脂肪血症、高血圧症、慢性炎症、血栓形成前の状態、その他が含まれ得る）、イ
ンスリン抵抗性（例えば、熱傷または窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗
性）、脂肪組織障害（例えば、肥満症、異脂肪血症、非アルコール性脂肪肝疾患、その他
）、ＨＩＶ誘発性筋消耗、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）
、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、うっ血性閉塞性肺疾患
、サルコペニア、悪液質、筋肉消耗症候群、骨粗鬆症、骨関節炎、代謝性骨疾患、および
代謝性骨障害（慢性グルココルチコイド療法に起因する低骨量、早発性性腺機能不全、ア
ンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養障害、および神経
性食欲不振症を含む）が挙げられる。限定されない、好ましい実施形態では、本発明は、
脊椎動物、特に哺乳類、およびさらに特にヒトにおけるＧＤＦ−８関連障害（例えば、筋
疾患）の診断、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防する
ための安全かつ効果的な治療方法を提供する。本発明の最も好ましい実施形態では、診断
、予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防されるＧＤＦ−８
関連障害（例えば、筋障害）はＡＬＳである。
もう一つの実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロでＧＤＦ−８機能を阻
害する方法を提供する。これらの方法は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉変性疾患お
よび骨変性疾患、特にＡＬＳなどの筋障害を処置するため、ならびに筋肉量および／また
は骨強度および／または骨密度を増加させるために有用である。本方法は、限定されるも
のではないが、ヒトをはじめとする正常な動物において筋肉量および骨密度を増加させる
ためにも有用である。本方法は、インビトロ（例えば、無細胞系、培養、その他で）、エ
クスビボ、またはインビボで用いることができる。例えば、ＧＤＦ−８受容体を発現して
いる細胞をインビトロにて培地中で培養し、例えば、１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗
体（例えば、本明細書に記載されるようなもの）と接触させてよい。あるいは、本方法を
被験体の体内に存在する細胞で、例えば、インビボ（例えば、治療用または予防用）プロ
トコールの一部として実行してよい。
従って、一態様では、本発明は、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、ＧＤＦ−８と相
互作用し（例えば、結合し）、中和し、かつ／または阻害する単離抗体を特色とする。具
体的には、ＧＤＦ−８抗体の結合するＧＤＦ−８タンパク質は、哺乳類、例えば、ヒト、
ヒツジ、非ヒト霊長類のＧＤＦ−８である。もう一つの実施形態では、本発明は、高い親
和性（例えば、Ｋｄが少なくとも１０-7Ｍ、好ましくは、１０-8、１０-9、１０-10、よ
り好ましくは、１０-11Ｍまたはそれ以上）で、ＧＤＦ−８と結合する抗体を提供する。
抗ＧＤＦ−８抗体の親和性および結合速度は、いくつかの周知の方法、例えば、バイオセ
ンサー技術（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて試験することがで
きる。
一実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体（例えば、インタクト抗体または抗体フラグメント
（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖフラグメント））は、モノ
クローナル抗体である。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、またはインビトロで作製された
抗体であってよい。限定されない、好ましい実施形態では、本発明の抗ＧＤＦ−８抗体は
、ヒト化抗体である。
これらの抗ＧＤＦ−８抗体は、筋肉、骨、脂肪およびグルコース代謝関連障害を診断、
予知、モニター、スクリーニング、処置、寛解、および／または予防するために用いるこ
とができる。抗ＧＤＦ−８抗体の限定されない例は、本明細書において「ＲＫ３５」と称
され、マウスおよび改変抗体の双方、例えば、キメラまたはヒト化形態を含む。マウスＲ
Ｋ３５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ
配列番号２および配列番号３として示される。ヒト化ＲＫ３５の重鎖可変領域のヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号６および配列番号７とし
て示される。マウスＲＫ３５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明
細書においてそれぞれ配列番号４および配列番号５として示される。ヒト化ＲＫ３５の軽
鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ配列番号８
および配列番号９として示される。
本発明の限定されない、好ましい実施形態では、抗体は、ＧＤＦ−８に対するマウスま
たはヒト化抗体である。本発明のより好ましい実施形態では、抗体は、配列番号３に示さ
れるＶＨ（重鎖可変）ドメインと配列番号５に示されるＶＬ（軽鎖可変）ドメインを含む
。本発明のもう一つの好ましい実施形態では、抗体は、配列番号７に示されるＶＨドメイ
ンと配列番号９に示されるＶＬドメインを含む。本発明のさらなる実施形態は、表１に記
載される１またはそれ以上のＶＨまたはＶＬドメインを含む。
本発明の他の実施形態は、ＲＫ３５のＨ３断片、すなわち配列番号１２として示される
配列を含む。さらに別の実施形態では、ＧＤＦ−８アンタゴニストは、本明細書に開示さ
れる配列番号１０〜１２および２０〜２２から選択される配列を有する抗体の重鎖可変領
域に由来の１、２、または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに別の実施形態
では、本発明のアンタゴニストは、本明細書に開示される配列番号１３〜１５および２３
〜２５から選択される配列を有する抗体の軽鎖可変領域に由来する１、２、または３つの
ＣＤＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体は、配列番号１０〜１５および２０〜２５
から選択される配列を有する１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む。
本発明の抗ＧＤＦ−８抗体の重鎖および軽鎖は、全長（例えば、抗体が少なくとも１つ
、および好ましくは２つの完全な重鎖と、少なくとも１つ、および好ましくは２つの完全
な軽鎖を含み得る）であってもよいし、または抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、
Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖフラグメント（「ｓｃＦｖ」））を含んでもよ
い。他の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、
ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択され、特に、例
えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、より特に、ＩｇＧ１（例えば、
ヒトＩｇＧ１）から選択される。もう一つの実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、例えば
、κまたはλ、特にκ（例えば、ヒトκ）から選択される。一実施形態では、抗体の特性
を改変する（例えば、１またはそれ以上のＦｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイ
ン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能を増加または低下させる）ために定
常領域が変更される（例えば、変異導入される）。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域は、１
またはそれ以上の残基で、例えば、配列番号１９の残基１１７および１２０の１以上で変
異導入され得る。一実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、配列番号１９に示されるヒトＩ
ｇＧ１定常領域を含む。もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、ヒトκ配列、例
えば、配列番号１７として示される配列を含む。
もう一つの実施形態では、本発明は、ＧＤＦ−８抗体を、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ
−８活性を中和または低下させる能力を保持する新規な抗体フラグメントとして提供する
。本発明の限定されない、好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、ｄＡｂフラグメ
ント、二重特異性抗体、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグ
メント、ｓｃＦｖフラグメント、およびＦｖフラグメントからなる群より選択される。本
発明のより好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、配列番号２、４、６または８か
ら選択されるポリヌクレオチドにコードされる。本発明のもう一つの好ましい実施形態で
は、抗体フラグメントは、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。もう一つの好ましい実施形態では、本発明は、表１
に記載される配列とは配列が異なるが（例えば、遺伝子コードの冗長性による）、ＧＤＦ
−８と結合し、ＧＤＦ−８活性を中和または低下させる能力を保持する新規な抗体フラグ
メントを提供する。
もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、表１に記載されるアミノ酸配列（ＶＨ
に関して配列番号３または７、および／またはＶＬに関して配列番号５または９）、ある
いはそれと実質的に同一の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、
９９％、またはそれ以上同一である配列、あるいは配列番号３、５、７、または９からわ
ずか１、２、５、１０、または１５アミノ酸残基が異なる配列）を有する、少なくとも１
、２、３、または４つの抗原結合領域、例えば、可変領域を含む。もう一つの実施形態で
は、抗体は、表１に記載される核酸配列（ＶＨに関して配列番号２または６、および／ま
たはＶＬに関して配列番号４または８）、あるいはそれと実質的に同一の配列（例えば、
それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一である配列、
あるいは配列番号２、４、６、または８からわずか３、６、１５、３０、または４５ヌク
レオチドが異なる配列）を有する核酸にコードされるＶＨおよび／またはＶＬドメインを
含む。さらに別の実施形態では、抗体は、表１に記載されるアミノ酸配列（配列番号１０
〜１２および２０〜２２）、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なく
とも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一であり、かつ／または１ま
たはそれ以上の置換、例えば、保存置換を有する配列）を有する重鎖可変領域に由来の１
、２、または３つのＣＤＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体は、表１に記載される
アミノ酸配列（配列番号１３〜１５および２３〜２５）、あるいはそれと実質的に相同な
配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同
一であり、かつ／または１またはそれ以上の置換、例えば、保存置換を有する配列）を有
する軽鎖可変領域に由来の少なくとも１、２、または３つのＣＤＲを含む。さらに別の実
施形態では、抗体は、表１に記載されるアミノ酸配列（ＶＨ ＣＤＲに関して配列番号１
０〜１２および２０〜２２；ＶＬ ＣＤＲに関して配列番号１３〜１５および２３〜２５
）、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、
９５％、９９％、またはそれ以上同一であり、かつ／または１またはそれ以上の置換、例
えば、保存置換を有する配列ある配列）を有する重鎖および軽鎖可変領域に由来の１、２
、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む。
もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列
あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５
％、９９％またはそれ以上同一である配列、または配列番号１９からわずか１、２、５、
１０、５０、または１００アミノ酸残基が異なる配列）を有するヒトＩｇＧ１定常領域を
含む。もう一つの実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、ヒトκ定常鎖、例えば、配列番号
１７に示されるアミノ酸配列あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なく
とも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上同一である配列、あるいは配列番
号１７からわずか１、２、５、１０、２０、または５０アミノ酸残基が異なる配列）を有
するヒトκ定常鎖を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるヒト
ＩｇＧ１定常領域およびヒトκ定常鎖を含む。
限定されない、好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、または８に示
されるポリヌクレオチドにコードされる抗体を提供する。もう一つの好ましい実施形態で
は、本発明は、ストリンジェント条件下で配列番号２、４、６、または８に示されるポリ
ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド配列にコードされる抗体を提供する
。もう一つの好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、または８に示され
る配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重により、配列番号３、５、７、９、または１０
〜１５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにコードされる抗体を提供
する。
ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体は、誘導体化するか、または別
の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、Ｆａｂフラグメント）と
結合することができる。例えば、融合タンパク質もしくは抗体、または抗原結合部分は、
１またはそれ以上のその他の分子実体、例えば特に抗体（例えば、二重特異性もしくは多
重特異性抗体）、毒素、放射性同位元素、細胞傷害性の薬剤もしくは細胞増殖抑制剤など
と機能的に結合する（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合性会合またはそれ以外
のものによって）ことができる。
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８アンタゴニストとして、本発明のＧＤＦ−８アン
タゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体をコードする精製および単離された核酸を提供す
る。一実施形態では、本発明は、表１に記載されるＶＨ（配列番号３または配列番号７）
、ＶＬ（配列番号５または配列番号９）、および／またはＣＤＲ（配列番号１０〜１５お
よび２０〜２５）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。もう一つの実施
形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で表１に記載されるＶＨ、ＶＬ、またはＣ
ＤＲ（配列番号３、５、７、９、１０〜１５、または２０〜２５）をコードする核酸とハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。もう一つの実施形態では、本発明は、配
列番号２、４、６、もしくは８、または配列番号２、４、６、もしくは８のフラグメント
を含む核酸を提供する。なおさらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下
で配列番号２、４、６または８とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。本発
明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドをＧＤＦ−８アンタゴニストとして含む宿主
細胞およびベクターを提供する。
本発明の抗体は多数の有用な特性を有する。第１に、抗体は、成熟したＧＤＦ−８と高
い親和性で結合する能力がある。第２に、開示される抗体は、インビトロおよびインビボ
でＧＤＦ−８活性を阻害する。第３に、開示される抗体は、骨格筋量および骨密度の負の
調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害する。第４に、開示される抗体は、筋疾患、特にＡ
ＬＳに効果的な処置である。これらの抗体には多くのさらなる用途があり、それにはＧＤ
Ｆ−８関連障害、例えば、筋肉および／または骨関連障害を診断、予知、モニター、スク
リーニング、処置、寛解、および／または予防することが含まれる。
本発明のその他の態様は、本発明のＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、本発明の抗Ｇ
ＤＦ−８抗体を含む組成物、ならびに、動物において、特にＡＬＳなどの筋疾患をもつヒ
トまたはその他の動物においてＧＤＦ−８を阻害するかまたは中和させる際のこのような
組成物の使用を提供する。本発明の抗体はＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉組織または
骨密度を増加させることが望ましい障害にも用いることができる。例えば、抗ＧＤＦ−８
抗体は、損傷した筋肉、例えば、心筋、横隔膜、その他を修復するための治療法および組
成物に用いることができる。開示される方法および組成物により処置されるＧＤＦ−８関
連障害および疾患の例としては、筋肉および神経筋障害、例えば筋ジストロフィー（デュ
シェンヌ型筋ジストロフィーを含む）；筋萎縮性側索硬化症；筋萎縮；器官萎縮；虚弱；
トンネル症候群；うっ血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；サルコペニア、悪液質、およびそ
の他の筋肉消耗症候群；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；２型糖尿病；耐糖能異常；メ
タボリック症候群（例えば、シンドロームＸ）；インスリン抵抗性（例えば、熱傷または
窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗性を含む）、および骨変性疾患（例え
ば、骨関節炎および骨粗鬆症）が挙げられる。本発明の限定されない、好ましい実施形態
では、抗ＧＤＦ−８抗体を含有する組成物は、ＡＬＳを処置、緩和、または寛解する方法
に用いられる。
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、製薬上許容される担体と少なくとも１つの
ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体とを含む医
薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物、例えば、医薬組成物は、２またはそれ以
上の前記ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体またはその断片の組合せ
を含む。本発明の範囲内にはまた、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗
体と、治療薬、例えば、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤（例えば、全身性抗炎症
剤）、代謝阻害剤、酵素阻害剤、および／または細胞傷害性の薬剤もしくは細胞増殖抑制
剤との組合せがある。
さらに別の実施形態では、ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、抗ＧＤＦ−８抗体、ま
たはその医薬組成物は、単独でまたは併用療法において、すなわち他の薬剤、例えば、Ｇ
ＤＦ−８関連障害を処置するために有用な治療薬と組み合わせて投与される。
様々な疾患または障害の処置における使用に加えて、抗ＧＤＦ−８抗体を生物学的サン
プル中のＧＤＦ−８タンパク質またはタンパク質断片を定量的または定性的に検出する診
断ツールとして用いてよい。検出されるＧＤＦ−８タンパク質の存在または量は、本明細
書に列挙される１またはそれ以上の病状と関連付けることができる。したがって、一実施
形態では、本発明は、ＧＤＦ−８関連障害を診断、予知、モニター、および／またはスク
リーニングする方法を提供する。
別の態様では、本発明は、インビトロでサンプル中（例えば、生物学的サンプル、例え
ば血清、血漿、組織、生検など）のＧＤＦ−８の存在を検出する方法を提供する。本方法
は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、骨、筋肉、脂肪またはグルコース代謝関連障害を診断
するために用いることができる。本方法には、（ｉ）サンプルまたは対照サンプルと本明
細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；および（ｉｉ）抗ＧＤＦ−８抗体
とサンプルまたは対照サンプルとの間の複合体の形成を検出する段階が含まれ、この際、
対照サンプルと比較してサンプル中での複合体の形成に実質的に有意な変化があれば、そ
のサンプル中にＧＤＦ−８が存在することを示す。
さらにもう１つの態様では、本発明は、被験体においてインビボでＧＤＦ−８の存在を
検出する方法（例えば、被験体におけるインビボ撮像）を提供する。本方法は、ＧＤＦ−
８関連障害、例えば、ＡＬＳを診断するために用いることができる。本方法には、（ｉ）
抗体とＧＤＦ−８の結合を可能にする条件下で、本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体
を被験体または対照被験体に投与する段階；および（ｉｉ）抗体とＧＤＦ−８との間の複
合体の形成を検出する段階が含まれ、この際、対照被験体と比較して被験体中で複合体の
形成に実質的に有意な差異があれば、ＧＤＦ−８の存在に関連する徴候が得られる。
本発明の他の実施形態は、患者がＧＤＦ−８関連障害（例えば、筋障害、神経筋障害、
骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインス
リン関連障害）を患っているかどうかを診断または検知する方法を提供し、その方法は、
（ａ）関心対象の患者からサンプルを得る段階；（ｂ）サンプルと本明細書に記載される
抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｃ）患者サンプル中に存在するＧＤＦ−８のレベ
ルを測定する段階；および（ｄ）患者サンプル中のＧＤＦ−８のレベルを対照サンプル中
のＧＤＦ−８のレベルと比較する段階を含み、この際、対照サンプル中のＧＤＦ−８のレ
ベルと比較した患者サンプル中のＧＤＦ−８のレベルの実質的な増加、低下、または類似
が、患者がＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを示す。
患者が本明細書に記載されるＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを診断または検
出する方法の別のさらなる実施形態は、（ａ）関心対象の患者から採取した第１のサンプ
ルを得る段階；（ｂ）第１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触さ
せる段階；（ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；（ｄ）ＧＤＦ
−８関連障害に罹患していない個体から第２のサンプルを得る段階；（ｅ）第２のサンプ
ルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｆ）第２のサンプル中
のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；および（ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤ
Ｆ−８のレベルを比較する段階を含み、この際、第２のサンプルと比較した第１のサンプ
ルのレベルの実質的な増加、低下、または類似が、患者がＧＤＦ−８の過剰発現に（一部
または完全に）起因するＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを示す。例えば、第２
のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加は、患者がＧＤＦ−
８関連障害を患っていることを示し得る。それに対して、第２のサンプルと比較した第１
のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの低下または類似は、患者がＧＤＦ−８関連障害を患
っていないことを示し得る。
本発明の抗体は、患者がＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾
患、代謝性または誘発性骨疾患、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連
障害を発症する可能性を予知する方法においても有用である。限定されない、好ましい実
施形態では、本方法は、（ａ）関心対象の患者から第１のサンプルを得る段階；（ｂ）第
１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｃ）第１の
サンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；（ｄ）ＧＤＦ−８関連障害に罹患して
いない個体から第２のサンプルを得る段階；（ｅ）第２のサンプルと本明細書に記載され
る抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを
測定する段階；および（ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較す
る段階を含み、この際、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベ
ルの増加、低下、または類似が、患者がＧＤＦ−８関連障害を発症する可能性を示す。例
えば、ＧＤＦ−８の過剰発現に（一部または完全に）起因するＧＤＦ−８関連障害に関し
て、もし第１のサンプルが第２のサンプルと比較して高いレベルのＧＤＦ−８を有するな
らば、患者はＧＤＦ−８関連障害を発症する可能性がある。それに対して、ＧＤＦ−８の
過剰発現に（一部または完全に）起因するＧＤＦ−８関連障害に関して、もし第１のサン
プルが第２のサンプルと比較して類似または低いレベルのＧＤＦ−８を有するならば、患
者がＧＤＦ−８関連障害を発症する見込みは低い。
本発明の抗体は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代
謝性または誘発性骨疾患、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害の
重篤度をモニターする方法においても有用である。限定されない、好ましい実施形態では
、本方法は、（ａ）第１の時点で関心対象の患者から採取した第１のサンプルを得る段階
；（ｂ）第１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（
ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；（ｄ）第２の時点で患者か
ら採取した第２のサンプルを得る段階；（ｅ）第２のサンプルと本明細書に記載される抗
ＧＤＦ−８抗体を接触させる段階；（ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定
する段階；および（ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段
階を含み、この際、第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似が
、ＧＤＦ−８関連障害の重篤度が変化したかどうかを示す。一実施形態では、本発明のモ
ニターする方法はＡＬＳをモニターするために用いられ、第２のサンプル中のＧＤＦ−８
のレベルの低下はＡＬＳの重篤度が低下したことを示す。
本明細書に記載される疾患をモニターするさらなる方法は、（ａ）関心対象の患者から
第１のサンプルを得る段階；（ｂ）第１のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８
抗体を接触させる段階；（ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；
（ｄ）第２のサンプルを、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患
、脂肪障害、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害に罹患していない個体から
得る段階；（ｅ）第２のサンプルと本明細書に記載される抗ＧＤＦ−８抗体を接触させる
段階；（ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階；および（ｇ）第１
および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階を含み、この際、第２のサ
ンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似が、
その時点でのＧＤＦ−８障害の重篤度を示す。一実施形態では、本発明のモニターする方
法はＡＬＳをモニターするために用いられ、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中
のＧＤＦ−８のレベルの低下または類似は、ＡＬＳの重篤度が低いことを示す。
好ましくは、抗体を検出可能な物質で直接または間接的に標識して結合抗体または非結
合抗体の検出を促進する。適した検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍
光物質、発光物質、および放射性物質が挙げられる。
本発明のアンタゴニスト、例えば抗体を、インビボにおいてＧＤＦ−８発現細胞へ送達
する、または標的指向化する方法も、本明細書に開示され、本発明の範囲内にある。
ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、本発明の抗ＧＤＦ−８抗体を含む治療および診断
用途のためのキットも、本発明の範囲内にある。
本発明のさらなる目的を以下の説明に示す。本発明の様々な目的、態様、および利点は
、特に請求項において指摘される要素および組合せによって実現および達成される。
前述の概要および以下の詳細な説明の双方は例示および説明のためだけのものであり、
特許請求される本発明を制限するものではないことは当然理解される。
Ｉ．定義
本明細書において「抗体」とは、免疫グロブリンまたはその一部を指し、供給源、起源
種、製造方法、および特徴にかかわらず抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含す
る。本発明の目的において、特に明記されない限り、抗体には、抗体フラグメント、例え
ばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、および抗
原結合機能を保持するその他の抗体フラグメントも含まれる。抗体は、例えば、伝統的な
ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、またはファージディスプレイ技術により、抗体ライ
ブラリーを用いて作製することができる。様々なその他の抗体製造技法については、Anti
bodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory,
1988を参照のこと。
用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全てと特異的に結合しているか、ま
たは抗原の一部または全てと相補的な領域を含む抗体分子の部分を指す。抗原が大きい場
合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合することがある。「エピトープ」または「抗原決
定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの相互作用に関与する抗原分子の一部分である。抗
原結合ドメインは、１またはそれ以上の抗体可変ドメインによりもたらされ得る（例えば
、ＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体フラグメント）。抗原結合ドメインは、抗体軽
鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。
用語「ＧＤＦ−８」とは、特異的増殖分化因子−８を指すが、構造的または機能的にＧ
ＤＦ−８に関連しているその他の因子、例えば、ＢＭＰ−１１、およびＴＧＦ−βスーパ
ーファミリーに属するその他の因子は指さない。この用語は、ＧＤＦ−８のプロセシング
されていない全長前駆体形態ならびに翻訳後切断から生じる成熟形態およびプロペプチド
形態を指す。この用語はまた、本明細書において考察される成熟ＧＤＦ−８に関連する少
なくともいくつかの生物学的活性を維持するＧＤＦ−８の任意の断片および変異体を指し
、それには改変された配列が含まれる。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列は配列番号１
に提供される。本発明は、限定されるものではないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、
ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚をはじめとする、あらゆる脊椎
動物種に由来するＧＤＦ−８に関する（配列情報に関しては、例えば、McPherron et al.
、前掲を参照）。
用語「ＧＤＦ−８活性」とは、活性ＧＤＦ−８タンパク質に関連する１またはそれ以上
の生理学的な増殖調節活性または形態形成活性を指す。例えば、活性ＧＤＦ−８は骨格筋
量の負の調節因子である。活性ＧＤＦ−８はまた、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチン
キナーゼ）の産生を調節し、筋芽細胞増殖を刺激し、プレ脂肪細胞から脂肪細胞への分化
を調節することができる。インビボおよびインビトロでＧＤＦ−８活性を測定するための
例示的手順は実施例に示される。
用語「ＧＤＦ−８アンタゴニスト」または「ＧＤＦ−８阻害剤」には、ＧＤＦ−８の活
性、発現、プロセシング、または分泌を阻害することのできる任意の薬剤が含まれる。こ
のような阻害剤としては、ＧＤＦ−８を阻害する、高分子および小分子、例えば、タンパ
ク質、抗体、ペプチド、ペプチドミメティクス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス
オリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、およびその他の小分子が挙げられる。ＧＤＦ−８ア
ンタゴニストには、本明細書において提供される抗体に加えて、ＧＤＦ−８を効率的に阻
害する任意の抗体が含まれ、それには、ＧＤＦ−８との結合に高特異性の抗体（例えば、
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他のメンバー（例えば、ＢＭＰ−１１）に対して低
親和性の抗体）が含まれる。これらの抗体の変異体（ヒト化変異体を含む）は、本発明の
診断、予知、モニター、処置、寛解、および予防方法において企図される。このような阻
害剤は、ＧＤＦ−８の生物活性を「阻害する」、「低下させる（decrease）」または「低
下させる（reduce）」と考えられている。
用語「中和する」、「中和」およびそれらの同族語は、同じ阻害剤の不在下でのＧＤＦ
−８の活性と比較したときの、ＧＤＦ−８活性の劇的な低下または抑止を指す。例えば、
活性の７５〜１００％の低下は、ＧＤＦ−８活性を「中和する」と言ってよい。
用語「処置」は、本明細書において用語「治療方法」と同義的に用いられ、治療的処置
および予防(prophylactic/ preventative)手段の双方を指す。処置を必要とする人々には
、特定の医学的障害を既に有する個体ならびにその障害を最終的に獲得する人々（すなわ
ち、予防的手段を必要とする人々）が含まれ得る。
用語「単離」とは、その自然環境から実質的に分離されている分子を指す。例えば、単
離タンパク質は、それが由来する細胞または組織源から実質的に分離されている分子であ
る。
用語「精製された」とは、その自然環境においてその分子に関連するその他の物質を実
質的に含まない分子を指す。例えば、精製されたタンパク質は、それが由来する細胞また
は組織からの細胞物質またはその他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離
タンパク質が治療用組成物として投与されるために十分に純粋であるか、または少なくと
も７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋である、より好ましくは、少なくとも８０％〜９０％（
ｗ／ｗ）純粋である、さらにより好ましくは、９０〜９５％純粋である；さらに、最も好
ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／
ｗ）純粋である場合の調製物を指す。
用語「有効量」「治療上有効量」「効果的な量」または同種のものは、患者の症状の寛
解または所望の生物学的成果（例えば、骨格筋量および／または骨密度の増加）がもたら
される化合物の量を指す。このような量は、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連する
か、またはグルコースホメオスタシスおよび脂肪代謝に関連する、ＧＤＦ−８の活性を低
下させるのに十分であるべきである。効果的な量は、本明細書に記載されるように決定す
ることができる。
「ＧＤＦ−８活性に関連する障害」「ＧＤＦ−８に関連する障害」「ＧＤＦ−８関連障
害」または同種のものは、ＧＤＦ−８（および／またはＧＤＦ−８活性）の調節不全（例
えば、異常な増加または低下）に完全にまたは一部分起因し得る障害、ならびに／あるい
は、ＧＤＦ−８（および／またはＧＤＦ−８活性）を調節および／またはモニターするこ
とにより処置、寛解、予防、診断、予知、またはモニターされ得る障害を指す。ＧＤＦ−
８関連障害としては、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘発性骨疾患、脂
肪疾患、グルコース代謝障害 またはインスリン関連障害が挙げられる。本発明の好まし
いＧＤＦ−８関連障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
用語「小分子」とは、高分子でない化合物を指す（例えば、Karp (2000) Bioinformati
cs Ontology 16：269-85; Verkman (2004) AJP-Cell Physiol. 286:465-74参照）。した
がって、小分子は、１０００ダルトン未満の化合物と考えられる場合が多い（例えば、Vo
et and Voet, Biochemistry, 2nd ed., ed. N. Rose, Wiley and Sons, New York, 14 (1
995)）。例えば、Davisら（(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102：5981-86）は、葉
酸類、メトトレキサート、およびニューロペプチド類を示すために小分子というフレーズ
を用いたが、HalpinおよびHarbury（(2004) PLos Biology 2：1022-30）は、小分子遺伝
子産物、例えば、ＤＮＡ類、ＲＮＡ類、およびペプチド類を示すためにこのフレーズを使
っている。天然小分子の例としては、限定されるものではないが、コレステロール類、神
経伝達物質類、およびｓｉＲＮＡ類が挙げられる；合成小分子としては、限定されるもの
ではないが、多数の商用の小分子データベース、例えば、ＦＣＤ（ファインケミカルデー
タベース）、ＳＭＩＤ（小分子相互作用データベース）、ＣｈＥＢＩ（ケミカル・エンテ
ィティーズ・オブ・バイオロジカル・インタレスト(Chemical Entities of Biological I
nterest)）、およびＣＳＤ（ケンブリッジ結晶構造データベース）にリストされる様々な
化学物質が挙げられる（例えば、Alfarano et al. (2005) Nuc. Acids Res. Database Is
sue 33:D416-24参照）。
ＩＩ．ＧＤＦ−８に対する抗体および抗体フラグメント
Ａ．マウスおよびヒト化抗体ＲＫ３５
本開示は、効率的にＧＤＦ−８を結合する新規な抗体（例えば、インタクト抗体および
抗体フラグメント）を提供する。そのような抗体の限定されない例示的な実施形態をＲＫ
３５と呼ぶ。この例となる実施形態は、マウスおよびヒト化抗体、ならびにその抗体フラ
グメントの形態で提供される。
本明細書において「ＲＫ３５」と称される、本発明の例となる抗体は、特有かつ有益な
特性を有する。第１に、この抗体および抗体フラグメントは、高い親和性で成熟ＧＤＦ−
８と結合する能力がある。第２に、本発明の抗体および抗体フラグメントは、例えば、Ａ
ｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイにより証明されるように、イン
ビトロおよびインビボでＧＤＦ−８活性を阻害する。第３に、開示される抗体および抗体
フラグメントは、例えば、処置した変異ＳＯＤマウスにおける筋肉量の増加により証明さ
れるように、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、特にＡＬＳに関連する症状を処置す
るために有用である。
例となる実施形態では、ＧＤＦ−８アンタゴニストは、ＧＤＦ−８と効率的に結合し、
１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を阻害する抗体である。当業者であれば、本発明
の抗体を用いて様々な種、例えば、本明細書に記載されている種に由来するＧＤＦタンパ
ク質を検出、測定、および阻害することができることを理解する。同一性パーセントは、
標準的なアラインメントアルゴリズム、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol Biol.
215:403-10に記載のベーシック・ローカル・アラインメント・ツール（ＢＬＡＳＴ）、Ne
edleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-53のアルゴリズム、またはMeyers et al.
(1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムなどにより決定される。概して
、実質的なＧＤＦ−８生物活性を保持し、配列番号１に示されるＧＤＦ−８の成熟形態の
少なくとも１００、８０、６０、４０、２０、または１５の隣接アミノ酸の配列のいずれ
かと少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列
を含む任意のタンパク質とともに、本発明の抗体および抗体フラグメントを用いることが
できる。
Ｂ．抗体可変ドメイン
インタクト抗体は、免疫グロブリンとしても知られ、一般に、各約２５ｋＤａの２本の
軽（Ｌ）鎖と、各約５０ｋＤａの２本の重（Ｈ）鎖からなる、四量体のグリコシル化タン
パク質である。λおよびκと称される２種類の軽鎖が、抗体に存在する。重鎖の定常ドメ
インのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは５つの主なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、お
よびＭに割り当てられ、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）
、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、およびＩｇＡ2に分割され得
る。各軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）か
らなる。各重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３〜４個のＣドメイン（ＣＨ）、および
ヒンジ領域からなる。ＶＨに最も近接するＣＨドメインをＣＨ１とする。ＶＨドメインお
よびＶＬドメインは、フレームワーク領域と名付けられる比較的保存された配列の４つの
領域からなり（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）、それらは超可変配列の３つの
領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）についてスキャフォールドを形成する。ＣＤＲは抗体と
抗原の相互作用に関与する大部分の残基を含む。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および
ＣＤＲ３と称される。従って、重鎖上のＣＤＲ成分は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と称され
、一方、軽鎖上のＣＤＲ成分はＬ１、Ｌ２、およびＬ３と称される。ＣＤＲ３は、抗体結
合部位内での分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基程度の
短さであっても、２６アミノ酸を超える大きさであってもよい。異なるクラスの免疫グロ
ブリンのサブユニット構造および３次元配置は、当分野で周知である。抗体構造の概説に
は、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow
et al., 1988を参照のこと。当業者であれば、各サブユニット構造、例えば、ＣＨ、ＶＨ
、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、および／またはＦＲ構造が、活性フラグメントを含むことを認識
する。例えば、活性フラグメントは、抗原と結合するＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲサブユニ
ットの部分、すなわち抗原結合フラグメント、あるいはＦｃ受容体および／または補体と
結合し、かつ／または活性化させるＣＨサブユニットの部分からなってよい。
本明細書において用いられる用語「抗体フラグメント」に包含される結合フラグメント
の限定されない例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価
のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によ
り結合されている２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’
）2フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメ
ント；（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラ
グメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；ならびに（ｖｉ）単離ＣＤ
Ｒが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の
遺伝子によってコードされているが、それらは組換え技術によって合成リンカーで結合さ
れ、ＶＬとＶＨ領域が一組となって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖を作製する
ことができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）。最もよく用いられるリンカーは１
５残基（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3ペプチドであるが、その他のリンカーも当分野で公知である。
一本鎖抗体も用語「抗体」または抗体の「抗原結合フラグメント」に包含されるものとす
る。これらの抗体は当業者に公知の従来技法を用いて得られ、フラグメントはインタクト
抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
抗体多様性は、可変領域をコードする複数の生殖細胞系列遺伝子および様々な体細胞事
象により作り出される。体細胞事象には、完全なＶＨ領域を作製するための多様性（Ｄ）
をもつ可変遺伝子セグメントおよび結合（Ｊ）遺伝子セグメントの組換え、ならびに完全
なＶＬ領域を作製するための可変遺伝子セグメントおよび結合遺伝子セグメントの組換え
が含まれる。組換えプロセス自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部でのアミノ酸の欠失
または付加が生じる。これらの多様性の機構は、抗原暴露より前にＢ細胞発生の際に生じ
る。抗原刺激後、Ｂ細胞で発現した抗体遺伝子は体細胞変異を起こす。生殖細胞系列遺伝
子セグメント、これらのセグメントのランダム組換え、およびランダムなＶＨ-ＶＬの対
合の推定数に基づいて、最大１.６×１０7の異なる抗体が産生され得る（Fundamental Im
munology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, NY）。抗体多様性（体
細胞変異など）に寄与するその他のプロセスを考慮に入れた場合、１×１０10以上の異な
る抗体を産生することができると考えられる（Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995),
eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA）。抗体多様性が生み出される際に
多くのプロセスが関与していることから、独立して生成された、同じ抗原特異性をもつモ
ノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有する可能性は低い。
したがって、本発明は、ＧＤＦ−８と結合する新規な抗体を提供する。本発明の抗体フ
ラグメント（例えば、ＣＤＲを含有する構造）は、一般に、抗体の重鎖または軽鎖配列、
またはその活性フラグメントであり、その中でＣＤＲは天然に存在するＶＨおよびＶＬの
ＣＤＲに対応する位置に置かれている。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの
構造および位置は、周知のナンバリングスキーム、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングスキ
ーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組合せ（Ａ
ｂＭ）、その他を用いて定義してよい（例えば、Sequences of Proteins of Immunologic
al Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et
al.; Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:927-48参照）。
したがって、本発明は、さらに新規なＣＤＲを提供する。本発明のＣＤＲを有するため
の構造は、一般に、ＣＤＲが、天然に存在するＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲに対応する場
所に位置するポリペプチド、例えば、抗体重鎖または軽鎖配列またはその実質的な部分で
ある。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、例えば、前掲のＫａｂａｔらお
よび前掲Ａｌ-Ｌａｚｉｋａｎｉらに記載されるように決定することができる。
本発明の抗体分子（抗体フラグメントを含む）、すなわちＧＤＦ−８に拮抗する抗体分
子としては、限定されるものではないが、マウスモノクローナル抗体ＲＫ３５およびその
変異体、特に、ヒト化変異体が挙げられる。本発明のＧＤＦ−８アンタゴニストとしては
、ＲＫ３５に加えて、ＧＤＦ−８と効率的に結合するその他の抗体が挙げられ、それには
、ＧＤＦ−８との結合に高い特異性をもつ抗体（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリー
のその他のメンバーに対して低親和性の抗体（例えば、ＢＭＰ−１１））が含まれる。ヒ
ト化変異体を含む、これらの抗体の変異体は、本発明の診断、予知、モニター、処置、寛
解、および予防方法に企図される。これらの抗体分子は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、
骨、筋肉、脂肪、およびグルコース代謝に関連する病態の予防または処置に有用であり得
る。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５
および９に示される。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、そ
れぞれ配列番号３および７に示される。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の可変軽鎖の３つの
相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５、２３、２４、
および２５に示される。マウスおよびヒト化ＲＫ３５の可変重鎖の３つのＣＤＲのアミノ
酸配列は、配列番号１０、１１、１２、２０、２１、および２２に示される。
上記のように、ＣＤＲは抗原との相互作用に関与する残基の大部分を含み、ＶＨおよび
ＶＬドメインの中、すなわち重鎖可変領域および軽鎖可変領域の中にそれぞれ含まれる。
したがって、抗体が、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ酸配列、ま
たはその活性抗体フラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤ
Ｒを含む場合、それは本発明の抗体、すなわちＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル
伝達を干渉する抗体である。従って、本発明の実施形態には、ポリペプチド、例えば、配
列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ酸配列、またはその活性フラグメン
トから選択されるアミノ酸配列を含む、１またはそれ以上のＣＤＲを含む抗体が含まれる
。したがって、当業者であれば、本発明の抗体には、ＶＬ鎖のＣＤＲが配列番号１３〜１
５および２３〜２５に示される抗体、またはＶＨ鎖のＣＤＲが配列番号１０〜１２および
２０〜２２に示される抗体が含まれることを認識する。
抗原結合フラグメントは、ＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメントであって
よい。したがって、ＲＫ３５のＦｖフラグメントは、それがＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ
−８シグナル伝達を干渉する場合、本発明の抗体を構成し得る。当業者であれば、例えば
、ＲＫ３５のＦｖフラグメントを含む任意の抗体フラグメントもまた、本発明の抗体であ
り得ることを認識する。さらに、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示されるアミノ
酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１またはそれ以上のＣＤＲを含む、任意のＦ
ｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）2フ
ラグメントも本発明の抗体であり得る。
このような抗体分子は、当業者に周知の方法により産生してよい。例えば、モノクロー
ナル抗体は、公知の方法に従ってハイブリドーマを生成することにより産生してよい。こ
のようにして生成されたハイブリドーマを、次に標準的な方法、例えば酵素結合免疫吸着
測定法（ＥＬＩＳＡ）およびＢｉａｃｏｒｅ分析を用いてスクリーニングし、ＧＤＦ−８
と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉し、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を
中和または阻害する抗体を産生する１またはそれ以上のハイブリドーマを同定する。組換
え型ＧＤＦ−８、天然に存在するＧＤＦ−８、その任意の変異体、およびＧＤＦ−８の抗
原ペプチド断片を免疫原として用いてよい。ＧＤＦ−８の抗原ペプチド断片は、少なくと
も７つの連続アミノ酸残基を含み、該ペプチドに対して作製された抗体がＧＤＦ−８と免
疫複合体を形成するようなエピトープを包含する。抗原ペプチドは、好ましくは少なくと
も１０個のアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらによ
り好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基、さらに最も好ましくは、少なくとも３
０個のアミノ酸残基を含む。さらに、ＧＤＦ−８の抗原ペプチド断片がＧＤＦ−８受容体
結合部位を含むことが好ましい。
本発明のポリクローナル血清および抗体は、適した被験体をＧＤＦ−８、その変異体、
および／またはその一部分で免疫化することにより作製し得る。免疫化した被験体におけ
る抗体力価は、標準的な技法、例えばＥＬＩＳＡにより、または固定化したＧＤＦ−８ま
たはその他のマーカータンパク質（例えば、ＦＬＡＧ）を用いることにより経持的にモニ
ターすることができる。必要であれば、本発明の抗体分子を、被験体または培地から単離
し、周知の技法、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによりさらに精製して、ＩｇＧ
画分を得てもよい。
本発明の特定の実施形態は、ＲＫ３５のＦｖフラグメントのＶＨおよび／またはＶＬド
メインを含む。本発明の抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、
およびｄＡｂフラグメントは、当分野で周知の方法に従って、抗体を切断することにより
産生することができる。例えば、免疫学的に活性なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメ
ントは、抗体をパパインおよびペプシンなどの酵素で処理することにより生成され得る。
さらなる実施形態は、配列番号１０〜１５および２０〜２５に示される、これらのＶＨ
およびＶＬドメインのいずれかの１またはそれ以上のＣＤＲを含む。一実施形態は、配列
番号１２に示されるＲＫ３５のＶＨドメインのＨ３フラグメントを含む。
本開示抗体のＶＨおよびＶＬドメインのＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列、およびＣ
ＤＲを表１に記載されるように列挙する。便宜上、ＶＨおよびＶＬドメインの中の各ＣＤ
Ｒのおおよその位置を表２に記載する。
Figure 2012244998
Figure 2012244998
抗ＧＤＦ−８抗体は、抗体定常領域またはその部分をさらに含み得る。例えば、本発明
のＶＬドメインは、そのＣ末端で抗体軽鎖定常ドメイン、例えば、ヒトＣκまたはＣλ鎖
、好ましくは、Ｃλ鎖と結合し得る。同様に、ＶＨドメインに基づく抗原結合フラグメン
トは、そのＣ末端で任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、および
ＩｇＭ、ならびに任意のアイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ1およびＩｇＧ4に由来する
免疫グロブリン重鎖の全部または一部と結合し得る。例となる実施形態では、抗体は、ヒ
トＩｇＧ1λの重鎖および軽鎖のＣ末端フラグメントを含む。軽（λ）鎖のＣ末端定常フ
ラグメントに好ましいＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６および配列番
号１７に示される。ＩｇＧ1重鎖のＣ末端定常フラグメントに好ましいＤＮＡおよびアミ
ノ酸配列は、それぞれ配列番号１８および配列番号１９に示される。遺伝子コードの縮重
により、表１に記載されるＤＮＡ配列は、単に関心対象のアミノ酸配列、ペプチド、およ
び抗体をコードする核酸の代表であって、制限するものと解釈されないことは当然理解さ
れる。
本発明の特定の実施形態は、ＲＫ３５のＦｖフラグメントのＶＨおよび／またはＶＬド
メインを含む。さらなる実施形態は、これらのＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの１ま
たはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一実施形態はＲＫ３５のＶＨドメイン
のＨ３フラグメントを含む。本発明のＶＨおよびＶＬドメインは、特定の実施形態におい
て、生殖細胞系列化されている(germlined)、すなわち、これらのドメインのフレームワ
ーク領域（ＦＲ）は、ヒト生殖細胞系列遺伝子産物のコンセンサスアミノ酸配列に合わせ
るように従来の分子生物学技術を用いて変更している。これは、ヒト化または生殖細胞系
列化抗体としても知られている。他の実施形態では、フレームワーク配列は生殖細胞系列
とは異なったままである。ヒト化抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を
発現不能であるがヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現する能力のあるトランスジェニックマ
ウスを用いて産生することができる。
Ｃ．改変抗体およびそれらのフラグメント
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８に対する抗体抗原結合ドメインを取得する方法を
提供する。当業者であれば、本発明の抗体が、表１に記載されるＶＨおよびＶＬの特定の
配列に限定されるのではなく、抗原結合能を保持するこれらの配列の変異体も含むことを
理解する。このような変異体は、当分野で公知の技術を用いて、与えられた配列から得る
ことができる。アミノ酸置換、欠失、または付加は、ＦＲ中でなされても、ＣＤＲ中でな
されてもよい。フレームワーク領域中の変化が、通常、抗体の安定性を向上させ、抗体の
免疫原性を低下させるようにデザインされるのに対して、ＣＤＲ中の変化は、通常、その
標的に対する抗体の親和性を高めるようにデザインされる。このような親和性を向上させ
る変化は、一般にＣＤＲを改変し、抗体を試験することにより、経験的に決定される。こ
のような改変は、例えば、Antibody Engineering, 2nd. ed., Borrebaeck, ed., Oxford
University Press, 1995に記載の方法に従ってなされ得る。
したがって、本発明の抗体には、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉
し、重鎖および軽鎖の定常領域に変異を有する抗体も含まれる。定常領域の特定の断片に
変異導入し不活性化させることも時には望ましい。例えば、重鎖定常領域における変異は
、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）および／または補体との結合の低下した抗体を産生するために時
には望ましい。このような変異は当分野で周知である。また、当業者であれば、ＣＬおよ
びＣＨサブユニットのどの活性フラグメントが必要であるかの決定が、本発明の抗体の適
用される用途に応じて異なることを理解する。例えば、それらの相互の共有結合に関与す
るＣＬおよびＣＨサブユニットの活性フラグメントは、インタクト抗体の生成において重
要である。
本明細書に提示されるＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを作製す
る方法は、本開示のＶＨドメインのアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸を
付加、欠失、置換または挿入する段階、所望により、このようにして得られたＶＨドメイ
ンと１またはそれ以上のＶＬドメインを組み合わせる段階、およびＶＨドメインまたはＶ
Ｈ／ＶＬの１もしくは複数の組合せをＧＤＦ−８との結合について試験する段階、および
（好ましくは）このような抗原結合ドメインの、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性
を調節する能力を試験する段階を含む。ＶＬドメインは、実質的に本明細書に提示される
ようなアミノ酸配列を有し得る。本明細書に開示されるＶＬドメインの１またはそれ以上
の配列変異体を１またはそれ以上のＶＨドメインと組み合わせる、類似の方法を用いてよ
い。
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８と相互作用する抗原結合フラグメントを調製する
方法を提供する。その方法は、
（ａ）置換されるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を含むＶＨドメインか、またはＣＤＲ（例
えば、ＣＤＲ３）コード領域を欠くＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを
準備する段階；
（ｂ）レパートリーと、配列番号２または６の活性フラグメントを含むドナーＣＤＲをコ
ードするドナー核酸、例えば、配列番号３または７に示されるアミノ酸配列をコードする
ドナー核酸とを、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを得るために、ド
ナー核酸をレパートリーのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）領域に挿入するように組み合わせ
る段階；
（ｃ）生成物レパートリーの核酸を発現させる段階；
（ｄ）ＧＤＦ−８と相互作用する抗原結合フラグメントを選択する段階；および
（ｅ）選択された抗原結合フラグメントまたはそれをコードする核酸を回収する段階
を含む。
さらに、本発明のＶＬ ＣＤＲ（例えば、Ｌ３）を、置換されるＣＤＲを含むか、また
はＣＤＲコード領域を欠くかのいずれかのＶＬドメインをコードする核酸のレパートリー
と組み合わせる、類似の方法を用いることができる。
本発明のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）のコード配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｃ
ＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーに導入することができる。
例えば、Ｍａｒｋｓら(1992) Bio/Technology 10:779-83、は、抗体可変ドメインのレパ
ートリーを作成する方法を記載し、その方法においては、可変ドメイン領域の５’末端に
指向する（direct）か、または近接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第
３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに用いて、ＣＤＲ３を欠く
ＶＨ可変ドメインのレパートリーがもたらされる。このレパートリーは、特定の抗体のＣ
ＤＲ３と組み合わせてよい。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３由来配列をＣＤＲ３
を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルし、シャッフルされた完全な
ＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて本発明の抗原結
合フラグメントを得てもよい。次に、適した抗原結合フラグメントを選択することができ
るように、例えば、ＷＯ９２／０１０４７号のファージディスプレイ系などの適した宿主
系においてレパートリーを提示することができる。
類似のシャッフル技術またはコンビナトリアル技術も、Stemmer (1994) Nature 370:38
9-91に開示されている。それにはβ−ラクタマーゼ遺伝子に関連した技術が説明されてい
るが、そのアプローチは抗体の生成のために用いられ得ることが考察されている。
さらなる代替法は、全可変ドメインの中で変異を生じるために、１またはそれ以上の選
択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を用いて、本発明のＣＤＲ由
来配列を有する新規なＶＨまたはＶＬ領域を生成することである。そのような技術は、エ
ラープローンＰＣＲを用いるGram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:35
76-80に記載されている。
新規な抗体またはそのフラグメントを生成するために用いられ得る別の方法は、ＶＨま
たはＶＬ遺伝子のＣＤＲに対して変異誘発を導くことである。そのような技術は、 Barba
s et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3809-13 およびSchier et al. (19
96) J. Mol. Biol. 263:551-67に開示されている。
同様に、１、２、または３つすべてのＣＤＲを、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリ
ーにグラフトすることができ、次にそれらのドメインをＧＤＦ−８に対する結合パートナ
ーまたは結合フラグメントについてスクリーニングする。
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくともＣＤＲと、所望により、本
明細書に提示される抗体フラグメントに由来の、それらの間に介在するフレームワーク領
域を含む。この部分はまた、少なくとも約５０％の、ＦＲ１およびＦＲ４のいずれかまた
は両方を含み、この５０％はＦＲ１のＣ末端５０％とＦＲ４のＮ末端５０％である。可変
ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメ
イン領域と通常会合しない残基であってよい。例えば、組換えＤＮＡ技術により作製され
た本発明の抗体フラグメントの構築の結果、導入されたリンカーにコードされるＮまたは
Ｃ末端残基が導入されてクローニングまたはその他の操作段階が促進され得る。その他の
操作段階としては、免疫グロブリン重鎖、その他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディ
産生時）または下記において詳細に考察されるタンパク質標識を含む、さらなるタンパク
質配列と、本発明の可変ドメインを結合するためのリンカーの導入が挙げられる。
実施例に例証される実施形態はＶＨおよびＶＬドメインの「マッチング」対を含むが、
本発明は、単一の可変ドメインを含有する結合フラグメント、例えば、ＶＨまたはＶＬド
メイン配列のいずれか、特にＶＨドメインに由来するｄＡｂフラグメントも包含する。い
ずれかの一本鎖結合ドメインの場合、これらのドメインを用いて、ＧＤＦ−８と結合可能
な２ドメインの抗原結合ドメインを形成可能な相補的ドメインについてスクリーニングす
ることができる。これは、例えば、ＷＯ９２／０１０４７号に開示されるようないわゆる
階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法
により達成され得る。この技術では、Ｈ鎖クローンまたはＬ鎖クローンのいずれかを含有
する個々のコロニーを用いてその他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なラ
イブラリーを感染させ、得られる２本鎖抗原結合ドメインを、その参照文献中に記載され
るものなどのファージディスプレイ技術に従って選択する。この技術はまた、Ｍａｒｋｓ
ら（前掲）にも開示されている。
抗体は、化学的方法により、放射性核種、薬剤、高分子、またはその他の物質と複合体
化することができ、本発明の１またはそれ以上のＣＤＲを含む融合タンパク質として作製
され得る。
抗体融合タンパク質は、これらの鎖（通常ＶＨ）のうちの１つおよび別のタンパク質が
単一のポリペプチド鎖として合成されるＶＨ−ＶＬ対を含む。これらの種類の生成物は、
それらが一般にさらなる機能的要素−小分子の活性部分、または複合体化または融合した
高分子の基本的な分子構造上の特徴−を有するという点で抗体とは異なる。
上に概説したアミノ酸配列の変化に加えて、抗体をグリコシル化、ペグ化、またはアル
ブミンもしくは非タンパク性ポリマーと結合させることができる。例えば、抗ＧＤＦ−８
抗体を、様々な非タンパク性ポリマーのうちの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン類と結合させてよい。抗体は、
例えば、それらの循環半減期を増加させるために、ポリマーとの共有結合的な複合体化に
よって化学的に修飾され得る。例となるポリマー、およびそれらをペプチドと結合させる
方法は当分野で公知である。
他の実施形態では、抗体は修飾されて、改変されたグリコシル化パターン（すなわち、
元のまたは天然のグリコシル化パターンと比較して）を有し得る。本明細書において、「
改変された」とは、１またはそれ以上の炭水化物部分が欠失されていること、および／あ
るいは、１またはそれ以上のグリコシル化部位が元の抗体に付加されていることを意味す
る。抗ＧＤＦ−８抗体へのグリコシル化部位の付加は、グリコシル化部位コンセンサス配
列を含むようアミノ酸配列を改変する周知の方法により達成される。抗体上の炭水化物部
分の数を増加させる別の方法は、抗体のアミノ酸残基とのグリコシドの化学的または酵素
によるカップリングによるものである。抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去は、当
分野で公知のように、化学的または酵素的に達成され得る。
本発明の抗体はまた、131Ｉまたは99Ｔｃなどの検出可能なまたは機能的標識でタグを
つけることができ、その標識は当分野で公知の従来の化学を用いて本発明の抗体に付ける
ことができる。標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ
などの酵素標識も含まれる。標識は、特異的な同族検出可能部分、例えば、標識アビジン
との結合によって検出され得るビオチンなどの化学的部分をさらに含む。
ＣＤＲ配列が表１に記載されるものと非実質的にのみ異なる抗体は、本発明の範囲内に
包含される。非実質的相違には、少数のアミノ酸変化、例えば、ＣＤＲの配列中の任意の
５アミノ酸のうち１または２の置換が含まれる。一般に、アミノ酸は、類似の電荷、疎水
性、または立体化学的特徴を有する近縁アミノ酸で置換される。このような置換は、当業
者の技術の範囲内である。構造フレームワーク領域（ＦＲ）は、抗体の結合特性に悪影響
を及ぼすことなくＣＤＲよりもさらに実質的に修飾することができる。ＦＲに対する変更
としては、限定されるものではないが、非ヒト由来フレームワークのヒト化、または抗原
接触または結合部位の安定化に重要な特定のフレームワーク残基の操作、例えば、定常領
域のクラスまたはサブクラスの変更、Ｆｃ受容体結合などのエフェクター機能を変え得る
特定のアミノ酸残基の変更（例えば、Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657-62; Mo
rgan et al. (1995) Immunology 86:319-24）、あるいは定常領域の由来する種の変更が
挙げられる。抗体は、重鎖のＣＨ２領域にエフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体結合お
よび補体活性化）を低下または改変する変異を有し得る。例えば、抗体は、米国特許第５
,６２４,８２１号および同第５,６４８,２６０号に記載されるものなどの変異を有し得る
。例えば、ＩｇＧ1またはＩｇＧ2重鎖では、このような変異は、ＩｇＧ1のＦｃ部分を表
す配列番号１９のアミノ酸残基１１７および１２０で起こり得る（これらの残基はＩｇＧ
1またはＩｇＧ2の全長配列のアミノ酸２３４および２３７に相当する）。抗体はまた、例
えば、Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-08に開示されるＩｇＧ4のヒンジ領域
中の変異などの、免疫グロブリンの２本の重鎖間のジスルフィド結合を安定化させる変異
を有し得る。
本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、開示されるポリペプチドおよび抗体とは構造
的に異なる、例えば、改変された配列を有するが、開示されるポリペプチドおよび抗体と
実質的に同じ生化学特性を有する、例えば、機能上非必須のアミノ酸のみを変更するタン
パク質を包含する。このような分子には、天然に存在する対立遺伝子変異体、および改変
、置換(substitutions)、置換(replacements)、挿入、または欠失を含有する意図的に操
作された変異体が含まれる。このような改変、置換(substitutions)、置換(replacements
)、挿入、または欠失のための技術は当業者に周知である。
本発明の抗体は、さらに、動物の内因性抗体よりもむしろ完全なヒト抗体を作製するよ
うに改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて、抗原への暴露に応答して産生さ
れ得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４/０２６０２号を参照のこと。非ヒト宿主において
免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内因性遺伝子は無能力化しておき、ヒト免疫
グロブリン重鎖および軽鎖をコードする活性のある遺伝子座を宿主のゲノムに挿入する。
ヒト遺伝子は、例えば、必須のヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を用いて
組み込まれる。次に、改変の完全な補完よりも少数を含む中間トランスジェニック動物を
異種交配することによって、所望の改変すべてを備える動物を後代として得る。そのよう
な非ヒト動物の一実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５号およびＷ
Ｏ９６／３４０９６号に開示されるようにゼノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ）（商標）と
名付けられている。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する
。抗体は、関心対象の免疫原で免疫化後の動物から、例えば、ポリクローナル抗体の調製
物として、またあるいはその動物由来の不死化Ｂ細胞、例えばモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマから、直接得ることができる。さらに、ヒト可変領域をもつ免疫グロ
ブリンをコードする遺伝子を回収し発現させて直接抗体を得るか、またはさらに修飾して
抗体の類似体、例えば、一本鎖Ｆｖ分子などを得ることができる。
したがって、本明細書において抗体という用語には、インタクト抗体、抗体のフラグメ
ント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、ｄＡｂ、およびｓｃＦｖフラグメント、
ならびに、その定常および／または可変領域のいずれかで変異導入されたインタクト抗体
およびフラグメント（例えば、キメラ抗体、一部分ヒト化抗体、または完全なヒト化抗体
を産生するため、ならびに所望の形質、例えば、強化されたＧＤＦ−８結合および／また
は低下したＦｃＲ結合をもつ抗体を産生するためのの変異）が含まれる。そのようなもの
として、抗体がＧＤＦ−８特異的に結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉し、および／
または１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を中和または阻害するならば、これらの抗
体は本発明の範囲に含まれる。
その他のタンパク質結合分子もＧＤＦ−８の活性を調節するために用いることができる
。このようなタンパク質結合分子には、小型モジュール免疫医薬品(small modular immun
opharmaceutical)（ＳＭＩＰ（商標））の薬物（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）が挙げられる。ＳＭＩＰは、抗原、対抗受容体また
は同種類のもの、システイン残基を１個有するかまたは有さないヒンジ領域ポリペプチド
、および免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどの同族の構造に対する結合ドメ
インからなる一本鎖ポリペプチドである（ HYPERLINK "http://www.trubion.com" www.tr
ubion.comも参照）。ＳＭＩＰおよびそれらの用途および適用は、例えば、米国特許出願
公開第２００３／０１１８５９２号、同第同第２００３／０１３３９３９号、同第２００
４／００５８４４５号、同第２００５／０１３６０４９号、同第２００５／０１７５６１
４号、同第２００５／０１８０９７０号、同第２００５／０１８６２１６号、同第２００
５／０２０２０１２号、同第２００５／０２０２０２３号、同第２００５／０２０２０２
８号、同第２００５／０２０２５３４号、および同第２００５／０２３８６４６号、なら
びにその関連パテントファミリーメンバーに開示され、その全ては本明細書においてその
全文が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の抗体の結合能は、以下の方法：Ｂｉａｃｏｒｅ分析、酵素結合免疫吸着検定法
（ＥＬＩＳＡ）、Ｘ線結晶学、下記実施例の配列解析および走査変異誘発、および当分野
で周知のその他の方法で測定することができる。本発明の抗体が１またはそれ以上のＧＤ
Ｆ−８関連活性を中和および／または阻害する能力は、以下の限定されない方法リスト：
ＧＤＦ−８依存性細胞株の増殖を測定するためのアッセイ；ＧＤＦ−８に媒介されるポリ
ペプチドの発現を測定するためのアッセイ；下流シグナル制御分子の活性を測定するため
のアッセイ；関連動物モデルにおいて筋障害を予防するための本発明の抗体の効果を試験
するアッセイ；下の実施例に記載されるアッセイ；およびその他の当分野で周知のアッセ
イによって測定され得る。
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８と結合可能な抗体を選択し、１またはそれ以上の
ＧＤＦ−８関連活性を中和および／または阻害する方法を提供する。この方法は、
ａ）複数の抗体とＧＤＦ−８を接触させること；
ｂ）ＧＤＦ−８と結合する抗体を選択すること；
ｃ）選択された抗体が、ＧＤＦ−８がＧＤＦ−８受容体と結合するのを防ぐ能力を試験す
ること；および
ｄ）ＧＤＦ−８がその受容体と結合するのを防ぐことのできる抗体を選択することを含む
。
本発明の抗ＧＤＦ−８抗体はまた、上清中、細胞溶解物中、または細胞表面上のＧＤＦ
−８を単離、精製および／または検出するために有用である。本発明において開示される
抗体は、診断的に用いてＧＤＦ−８タンパク質レベルを臨床試験手順の一部としてモニタ
ーすることができる。さらに、本発明の抗体は、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性
の中和および／または阻害を必要とする処置、例えば、ＡＬＳおよびその他の筋肉関連の
病態の処置に用いることができる。本発明はまた、ヒトＧＤＦ−８に対して作られた新規
な抗体に関連する、単離および精製された新規なポリヌクレオチドおよびポリペプチドを
提供する。本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、およびポリペプチドとして
は、限定されるものではないが、ＧＤＦ−８に対するマウスおよびヒト化抗体（例えば、
ＲＫ３５）およびその変異体が挙げられる。
Ｄ．核酸、クローニング、および発現系
本発明は、さらに、本発明の抗体をコードする単離および精製された核酸を提供する。
本発明に従う核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、完全にまたは部分的に合成され
ていてよい。本明細書に提示される核酸配列への言及は、指定された配列またはゲノム同
等物を含むＤＮＡ分子、ならびに、前後関係で別に求められなければＵがＴに置換される
、指定された配列を含むＲＮＡ分子を包含する。
例えば、本発明は、１またはそれ以上のＧＤＦ−８関連活性を調節する（例えば、ＧＤ
Ｆ−８生物活性を中和する）ＧＤＦ−８に対するマウス抗体（ＲＫ３５）、およびＲＫ３
５のヒト化版の可変領域をコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する
。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、および化学的に合成さ
れたＤＮＡ配列が含まれる。
本発明の核酸配列には、配列番号４に示されるマウスＲＫ３５の軽鎖可変領域をコード
する配列が含まれ、それには、軽鎖可変領域配列に先行するリーダー配列をコードする核
酸、例えば、配列番号３０に示される核酸配列が含まれる（ヌクレオチド１〜６０がリー
ダー配列に相当し、ヌクレオチド６１〜３８１が配列番号４に相当する）。本発明の核酸
配列には、配列番号２に示されるＲＫ３５の重鎖可変領域をコードする配列も含まれ、そ
れには、重鎖可変領域に先行するリーダー配列をコードする核酸、例えば、配列番号２８
に示される核酸配列が含まれる（ヌクレオチド１〜５７がリーダー配列に相当し、ヌクレ
オチド５８〜４０５が配列番号２に相当する）。本発明の核酸配列には重鎖および軽鎖可
変領域のヒト化配列、例えば、それぞれ配列番号６および８に示されるものなども含まれ
る。本発明のポリヌクレオチドはまた、ストリンジェント条件下で配列番号２、４、６、
および８に示される核酸配列、ならびにその補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含み、かつ／または可変領域において実質的な生物活性（すなわち、活性フラグメント
）を保持するポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも
１５連続ヌクレオチドを含む、配列番号２、４、６、および８に示される配列の連続する
部分を含む。
マウスＲＫ３５の可変軽鎖のアミノ酸配列は配列番号５に示される。リーダー配列に先
行されるマウスＲＫ３５の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列の例は配列番号３１として示
される。マウスＲＫ３５の可変重鎖のアミノ酸配列は配列番号３として示される。リーダ
ー配列に先行されるマウスＲＫ３５の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号
２９として示される。ヒト化可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７
および９に提示される。マウスＲＫ３５の重鎖の中に含まれるＣＤＲのアミノ酸配列は、
配列番号１０〜１２および２０〜２２に示される。マウスＲＫ３５の軽鎖の中に含まれる
ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号１３〜１５および２３〜２５に示される。本発明のポ
リペプチドはまた、少なくとも５連続アミノ酸を含む、配列番号３、５、７、９、１０〜
１５、および２０〜２５に実質的に示される配列の任意の連続する部分を含む。本発明の
好ましいポリペプチドは、本発明の抗体の実質的な生物活性を保持する、配列番号３、５
、７、９、および１０〜１５に実質的に示される任意の配列の任意の連続する部分を含む
。上記のそれらのポリヌクレオチドに加えて、本発明はまた、配列番号３、５、７、９、
および１０〜１５またはその連続する部分に実質的に示され、上記のポリヌクレオチドと
は周知の遺伝子コードの縮重によってのみ異なる、アミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチドを含む。
本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーと
して用いて、本開示のポリヌクレオチドをコードする配列と同一または類似の配列を有す
る核酸を同定および単離することができる。この方法で単離されたポリヌクレオチドは、
例えば、ＧＤＦ−８に対する抗体またはその他のＴＧＦ−βファミリーメンバーを産生す
るため、あるいはこのような抗体を発現している細胞を同定するために用いられ得る。核
酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーション法としては、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション
およびノーザンハイブリダイゼーションが挙げられ、当業者に周知である。
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェンシー条件下で行ってよい。ハイ
ブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、任意の２つの核酸分子が互いにハイ
ブリダイズする困難さが含まれる。好ましくは、各ハイブリダイズするポリヌクレオチド
は、低ストリンジェンシー条件、より好ましくは、ストリンジェント条件、さらに最も好
ましくは、高度にストリンジェントな条件下でその対応するポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズする。ストリンジェンシー条件の例を下の表３に示す。高度にストリンジェントな
条件は、少なくとも、例えば、条件Ａ〜Ｆ程度にストリンジェントな条件である；ストリ
ンジェント条件は、少なくとも、例えば、条件Ｇ〜Ｌ程度にストリンジェントである；さ
らに低ストリンジェンシー条件は、少なくとも、例えば、条件Ｍ〜Ｒ程度にストリンジェ
ントである。
Figure 2012244998
 1ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズされる領域
（１または複数領域）に対して予想される長さである。ポリヌクレオチドと未知配列の標
的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする場合、ハイブリッド長はハイブリダイズするポ
リヌクレオチドの長さと仮定される。公知配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズする
場合、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチド配列をアラインし、最適な配列相補性をもつ
１または複数の領域を同定することにより決定される。
2ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、および１.
２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中
のＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムであ
る）に対して置換され得る；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後１５分間行わ
れる。ＴB *〜ＴR *：長さ５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブ
リダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔm）よりも５〜１０℃低くあるべ
きであり、その場合、Ｔmは以下の方程式に従って決定される。長さ１８塩基対未満のハ
イブリッドに関して、Ｔm（℃）＝２（Ａ＋Ｔの塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃの塩基数）。長さ
１８〜４９塩基対のハイブリッドに関して、Ｔm（℃）＝８１.５＋１６.６（ｌｏｇ10Ｎ
ａ+）＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数で
あり、Ｎａ+はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×
ＳＳＣのＮａ+＝０.１６５ Ｍ）。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件のさらなる例
は、参照により本明細書に援用される、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, Chs. 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, NY (1989)、およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology
, Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995)に記載されている。
本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーと
して用いて、本開示のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体をコードする配列を有するＤ
ＮＡを同定および単離してよい。対立遺伝子変異体は、本開示のポリヌクレオチドの天然
に存在する代替形態であり、本開示のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
と同一であるかまたは有意な類似性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、対
立遺伝子変異体は、本開示のポリヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性（より好
ましくは、少なくとも９５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９９％の同一性）を
有する。
また、本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライ
マーとして用いて、本開示のポリヌクレオチドと相同なポリペプチドをコードする配列を
有するＤＮＡを同定および単離してよい。これらの相同体は、本開示のポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドの種とは異なる種から、または同じ種の中から単離された、本開示の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドと有意な配列類似性をもつ、ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドである。ポリヌクレオチド相同体は、本開示のポリヌクレオチドと少なく
とも５０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは
、少なくとも９０％の同一性）を有することが好ましく、それに対してポリペプチド相同
体は、開示される抗体／ポリペプチドと少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは
、少なくとも４５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも６０％の同一性）を有するこ
とが好ましい。本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの相同体は、哺乳類種から
単離されたものが好ましい。
また、本発明の単離ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライ
マーとして用いて、本発明の抗体を発現する細胞および組織、ならびにそれらが発現され
る条件を同定してよい。
さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドを用いて、細胞または生物において本発明のポ
リヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を改変（すなわち、増強、減少、または修飾）し
てよい。これらの「対応する遺伝子」は、転写されて本発明のポリヌクレオチドの由来す
るｍＲＮＡを作成する、本発明のゲノムＤＮＡ配列である。
本発明はまた、少なくとも１つの上記の本発明の核酸を含む、プラスミド、ベクター、
転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。
本発明の単離ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え産生のための発現制
御配列と作動可能なように連結されていてよい。さらに、当業者であれば、本発明のポリ
ヌクレオチドが、様々な抗体アイソタイプの定常領域をコードする周知の核酸配列と作動
可能なように連結され得ることを認識する。例えば、本発明の軽鎖可変領域（１または複
数）をコードする本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号４または８に示される配
列）は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかの定常領域（またはその誘導体）をコードする核
酸配列と作動可能なように（連結されたヌクレオチドが発現すると、ＧＤＦ−８と特異的
に連結し、中和する可変領域を含む完全なκまたはλ軽鎖がもたらされるように）連結さ
れている。同様に、本発明の重鎖可変領域をコードする本発明のポリヌクレオチド（例え
ば、配列番号２または６に示される配列）は、重鎖アイソタイプ（またはその誘導体）の
定常領域をコードする核酸配列、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＡ
などと作動可能なように連結され得る。組換え型タンパク質を発現する一般的な方法は当
分野で周知である。このような組換え型タンパク質は、ＧＤＦ−８活性に関連する障害、
例えば、筋肉変性疾患および骨変性疾患の処置に用いるための可溶形態で発現され得る。
本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば宿主細胞においてベクターの複
製を調節する配列（例えば、複製起点）、ヒスチジンなどのタグ配列、および選択マーカ
ー遺伝子を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選
択を促進する。例えば、一般に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主
細胞で薬剤に対する耐性を付与する（Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサー
トなど）。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺
伝子（メトトレキサート選択／増幅ｄｈｆｒ-宿主細胞で用いるため）およびneo遺伝子（
Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー
遺伝子および必要に応じたその他の配列をはじめとする、適切な調節配列を含有する適し
たベクターは、選択されたものであっても構築されたものであってもよい。ベクターは、
プラスミドであっても、ウイルス性、例えば、必要に応じてファージ、またはファージミ
ドであってもよい。さらなる詳細は、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual
: 2nd ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこ
と。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝
子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多くの公知技術および
プロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Ausubel et al.
eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
本発明はまた、上記のように１またはそれ以上の構築物を含む宿主細胞を提供する。本
明細書に規定されるＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３）、ＶＨもし
くはＶＬドメイン、または抗原結合フラグメントをコードする核酸は、本発明の一態様を
成す。
本発明はまた、宿主細胞においてコード核酸からタンパク質を発現させることによりペ
プチドを生成する方法を含む。発現は、適切な条件下で、核酸を含有する組換え宿主細胞
を培養することにより達成され得る。
本発明に従う特異的抗体フラグメント、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコ
ード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの自然環境から、実質的に純粋または同
種の形態で単離および精製されて提供されるか、あるいは、核酸の場合、必要な機能をも
つポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないか、または実
質的に含まずに提供され得る。
多数の細胞株が、本発明のポリペプチドおよび抗体の組換え発現に適した宿主細胞であ
る。哺乳類の宿主細胞株には、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ４３
１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６
０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、ジャーカット細胞、ならびに一次組織のインビトロ
培養に由来する細胞株および一次外植片が含まれる。また、このような宿主細胞は、ゲノ
ムＤＮＡからなる本発明のポリヌクレオチドのスプライシングを可能にする。
あるいは、酵母などの下等真核生物または原核生物において本発明のポリペプチドおよ
び抗体を組換えによって産生することも可能であり得る。適する可能性のある酵母株とし
ては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス
・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）株、およ
びカンジダ（Candida）株が挙げられる。適する可能性のある細菌株としては、大腸菌（E
scherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、およびネズミチフス菌（Salmonella
typhimurium）が挙げられる。本発明のポリペプチドが酵母または細菌において作成され
る場合、機能タンパク質を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル
化によりそれらを修飾することが必要であり得る。このような共有結合は、周知の化学的
または酵素的手法を用いて達成してよい。
本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、１またはそれ以上の昆虫発現ベクター（バキ
ュロウイルスベクターなど）において本発明の単離ポリヌクレオチドと適した対照配列を
作動可能なように結合させ、昆虫細胞発現系を用いることにより、組換え技術によって作
成することができる。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系のための材料および方法は、キッ
トの形態で市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製
、ＭＡＸＢＡＣ（登録商標）キット）。
適切な宿主細胞における組換え発現の後、本発明のポリペプチドおよび抗体は、公知の
精製工程、例えばゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて培地または細胞
抽出物から精製してよい。精製には、本発明のポリペプチドおよび抗体と結合することが
分かっている薬剤を用いるアフィニティークロマトグラフィーも含まれる。これらの精製
工程を用いて自然源からの本発明のポリペプチドおよび抗体を精製してもよい。
あるいは、本発明のポリペプチドおよび抗体は、組換えによって精製を促進する形態に
発現されてよい。例えば、ポリペプチドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）などの
タンパク質との融合体として発現し得る。このような融合タンパク質の発現および精製の
ためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ
，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、およびＩｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社から市販されている。本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、小型のエピトー
プでタグを付け、その後、エピトープに対する特異的抗体を用いて同定または精製するこ
ともできる。好ましいエピトープは、ＦＬＡＧエピトープであり、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏ
ｄａｋ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）社から市販されている。
本発明のポリペプチドおよび抗体はまた、公知の従来の化学合成によって作製され得る
。本発明のポリペプチドおよび抗体を化学的に合成する方法は当業者に周知である。この
ような化学合成ポリペプチドおよび抗体は、精製された天然ポリペプチドおよび抗体と共
通する生物学的特性を有してよく、したがって、天然ポリペプチドおよび抗体の生物学的
活性代替物または免疫学的代替物として用いることができる。
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される、核酸、ポリペプチド、ベクター、ま
たは抗体、およびそのフラグメントを含む宿主細胞を提供する。一層さらなる態様は、本
発明の核酸を宿主細胞に導入する段階を含む方法を提供する。導入には任意の利用可能な
技術を用いてよい。真核細胞に適した技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェ
クション、およびレトロウイルスまたは別のウイルス（例えば、ワクシニアまたは、昆虫
細胞には、バキュロウイルス）を用いる形質導入が挙げられる。細菌細胞に適した技術と
しては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを
用いる感染が挙げられる。
核酸の導入を受けて、例えば、遺伝子発現に適した条件下で宿主細胞を培養することに
より、核酸からのタンパク質産生が引き起こされるか、または可能となり得る。このよう
な条件は当分野で周知である。
ＩＩＩ．骨、脂肪、グルコース代謝、インスリンおよび筋肉の障害の進行を処置、寛解
、予防、および阻害する方法
ＧＤＦ−８がＡＬＳに関与していること、および本発明の新規な抗体が見出されたこと
により、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または
誘発性骨疾患、グルコース代謝障害、脂肪疾患、およびインスリン関連障害を処置、緩和
、および寛解する方法が可能になる。その上、抗体は、生物学的サンプルにおいてＧＤＦ
−８のレベルを測定することにより、骨、筋肉、脂肪またはインスリンの障害の進行を診
断、予知およびモニターすることを可能にする。特に、本発明の抗体は、ＡＬＳまたはそ
の他の筋障害をもつ個体を処置するために用いるか、または患者がＡＬＳまたは別の筋障
害を患っているかどうかを識別する方法に用いることができる。
本発明の抗体およびその他の分子は、ヒトまたは動物における様々な医学的障害を予防
、診断、または処置するために有用である。抗体を用いてＧＤＦ−８に関連する１または
それ以上の活性を阻害または低減することができる。最も好ましくは、抗体は、非結合Ｇ
ＤＦ−８活性と比較して、１またはそれ以上のＧＤＦ−８の活性を阻害または低減する。
特定の実施形態では、１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体と結合した場合のＧＤＦ−８
の活性は、１またはそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体と結合していない成熟ＧＤＦ−８タンパ
ク質と比較して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０、６２、６４、６６、
６８、７０、７２、７２、７６、７８、８０、８２、８４、８６、または８８％、より好
ましくは、少なくとも９０、９１、９２、９３、または９４％、さらにより好ましくは、
少なくとも９５％〜１００％阻害される。ＧＤＦ−８活性の阻害または中和は、例えば、
Ｔｈｉｅｓら、前掲、に記載されるｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）12レポーター遺伝子アッセイ（
ＲＧＡ）および実施例に例示されるＡｃｔＲＩＩＢ受容体アッセイにおいて測定すること
ができる。
ＧＤＦ−８抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解または予防される医学的障害
は、ＧＤＦ−８関連障害、例えば、筋肉障害または神経筋障害であり、それには、例えば
、筋ジストロフィー（ＭＤ；デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）、筋萎縮性側索硬
化症（ＡＬＳ）、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、手根管症候群、うっ血性閉塞性肺疾患、サル
コペニア、悪液質、およびその他の筋肉消耗症候群（例えば、その他の疾患および状態に
起因）が含まれる。その上、ＧＤＦ−８抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解ま
たは予防され得るその他の医学的障害は、脂肪組織障害、例えば肥満症、２型糖尿病、耐
糖能異常、メタボリック症候群（例えば、シンドロームＸ）、外傷性傷害（熱傷または窒
素不均衡など）により誘発されるインスリン抵抗性、または骨変性性疾患（例えば、骨関
節炎、骨粗鬆症、その他）などである。好ましい実施形態では、ＧＤＦ−８抗体により診
断、予知、モニター、処置、寛解または予防される障害は、筋肉障害または神経筋障害で
ある。より好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体により診断、予知、モニター、処置
、寛解または予防される筋肉または神経筋障害は、ＭＤまたはＡＬＳのいずれかである。
本発明の最も好ましい実施形態では、本発明のＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、ＧＤ
Ｆ−８活性を阻害する抗体により診断、予知、モニター、処置、寛解または予防される筋
肉または神経筋障害は、ＡＬＳである。
ＧＤＦ−８アンタゴニストにより診断、予知、モニター、処置、寛解または予防され得
るその他の医学的障害は、骨の減少に関する障害であり、それには、特に高齢者および／
または閉経後の女性における骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、骨減少症、
骨関節炎、ならびに骨粗鬆症に関連する骨折が含まれる。その他の標的代謝性骨疾患およ
び障害には、慢性グルココルチコイド療法に起因する低骨量、早発性性腺機能不全、アン
ドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養障害、および神経性
食欲不振症が含まれる。抗体は、哺乳類、特にヒトにおけるこのような障害を診断、予知
、モニター、処置、寛解または予防するために用いることが好ましい。
本発明の抗体は、治療上有効量で投与される。一般に、治療上有効量は、被験体の年齢
、状態、および性別、ならびに被験体における医学的状態の重篤度によって変化し得る。
投薬量は、医師により決定され、必要に応じて観察される治療効果に合うように調節され
得る。このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に致死
性である用量）およびＥＤ50（集団の５０％に治療効果のある用量）を測定するための、
標準的な薬学的手順により、細胞培養または実験動物において判定することができる。毒
性と治療効果の間の用量比、すなわち、ＬＤ50／ＥＤ50が治療係数であり、大きな治療係
数を示す抗体が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに用いる用量の範囲を処
方する際に用いることができる。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないかま
たは全くないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、投与形態
および投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明で用いられる任意の抗体に関し
て、治療上有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モ
デルにおいて処方して、細胞培養で測定されるＩＣ50（例えば、症状の最大半量の阻害ま
たは生物活性の阻害の最大半量の阻害を達成する試験抗体の濃度）を含む循環血漿中濃度
範囲を得ることができる。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより
測定することができる。任意の特定投薬量の効果は、適したバイオアッセイによりモニタ
ーされ得る。適したバイオアッセイの例としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ複
製アッセイ、転写に基づくアッセイ、ＧＤＦ−８タンパク質／受容体結合アッセイ、クレ
アチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるグルコ
ース取り込みに基づくアッセイ、および免疫学的アッセイが挙げられる。
一般に、組成物は、抗体またはそれらの結合フラグメントが、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍ
ｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／
ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、
１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍ
ｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるように投与される
。抗体は、投与後の時間の長さを最大にするために、抗体の循環レベルを最大化するボー
ラス投与で与えられることが好ましい。また、持続注入をボーラス投与の前、後、または
その代わりに用いてもよい。
ＩＶ．治療薬を同定する方法
本発明のさらに別の態様は、筋肉、例えば、グルコース代謝、脂肪、および骨障害の処
置に有用な治療薬を同定する方法を提供する。適切なスクリーニングアッセイ、例えば、
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイは、当分野で公知である。そのようなスクリーニングアッセ
イでは、第１の結合混合物が本発明の抗体とそのリガンドであるＧＤＦ−８を合わせるこ
とにより形成され、第１の結合混合物（Ｍ0）中のリガンドと抗体の間の結合の量が測定
される。第２の結合混合物も、抗体、リガンド、およびスクリーニングされる化合物もし
くは薬剤を合わせることにより形成され、第２の結合混合物（Ｍ1）中のリガンドと抗体
の間の結合の量が測定される。次に、第１および第２の結合混合物中の結合の量を、例え
ば、Ｍ1／Ｍ0比を計算することにより比較する。化合物もしくは薬剤は、第１の結合混合
物と比較して第２の結合混合物中の結合の低下が観察される場合（すなわちＭ1／Ｍ0＜１
）、ＧＤＦ−８活性を阻害することができると考えられる。結合混合物の処方および最適
化は、当分野の技術レベルの範囲内である；このような結合混合物はまた、結合を増強す
るかまたは最適化するために必要な緩衝液および塩を含んでもよく、さらなる対照アッセ
イを本発明のスクリーニングに含めてもよい。
抗体−リガンド結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ1／Ｍ0＜０.９）、好ましく
は、約３０％を上回って低下させることが見出された化合物は、このようにして同定する
ことができ、さらに次に、必要であれば、その他のアッセイ、例えばＡｃｔＲＩＩＢ結合
実験、または実施例に記載されるかまたは当分野で周知であるその他の細胞に基づくアッ
セイおよびインビボアッセイなどにおいてＧＤＦ−８活性を阻害する能力について二次ス
クリーニングすることができる。
Ｖ．小分子
ＧＤＦ−８関連障害に罹患している（またはそのリスクの高い）生物（または被験体）
において、あるいは、このような障害に関与するそのような生物からの細胞において、Ｇ
ＤＦ−８活性を阻害することも、ＧＤＦ−８の活性を拮抗、すなわち阻害するアンタゴニ
スト小分子（通常、有機小分子）の使用によって達成され得る。新規なアンタゴニスト小
分子は、上記のスクリーニング法により同定することができ、本明細書に記載される本発
明の治療法で用いることができる。
逆に、ＧＤＦ−８発現および／または活性の低下に関連する障害、あるいはＧＤＦ−８
レベルの低下に関連する障害に罹患している（またはそのリスクの高い）生物（または被
験体）におけるＧＤＦ−８活性の増加も、ＧＤＦ−８の活性を作動、すなわち増強させる
小分子（通常、有機小分子）の使用によって達成され得る。新規なアゴニスト小分子は、
上記のスクリーニング法により同定することができ、本明細書に記載される本発明の治療
法で用いることができる。
ＶＩ．骨、脂肪、グルコース代謝、および筋肉の障害の進行を診断、予知、およびモニ
ターする方法
例えば、筋肉、骨、グルコース代謝、および脂肪疾患を、処置することに加えて、本発
明は、生物学的サンプル、例えば、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液、痰、（例えば、筋肉
の）生検、その他においてＧＤＦ−８の低下または増加を検出することにより、このよう
な障害を診断する方法を提供する。「診断の」または「診断」とは、病的状態の存在また
は不在を同定することを意味する。診断方法には、例えば、被験体（ヒトまたは非ヒト哺
乳類）由来の生物学的サンプルにおいてＧＤＦ−８ポリペプチドの試験量を測定すること
によりＧＤＦ−８の存在を検出すること、および、ＧＤＦ−８ポリペプチドについて試験
量を正常な量または範囲（例えば、そのような障害を患っていないことが分かっている（
１または複数の）個体の量または範囲）と比較することが含まれる。特定の診断方法から
ＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障害の確定診断がもたされるのではないが、この方
法が診断に役立つ決定的な指標を提供するのであれば十分である。
本発明はまた、ＧＤＦ−８の上向き調節を検出することにより、ＡＬＳまたはその他の
筋障害、または例えば、骨、グルコース代謝、および脂肪の疾患を予知する方法を提供す
る。「予知の」または「予知」とは、起こり得る病的状態の発生および／または重篤度を
予測することを意味する。予知の方法には、被験体由来の生物学的サンプル中のＧＤＦ−
８の試験量を測定すること、および、ＧＤＦ−８について試験量を予知量または範囲（例
えば、例えばＡＬＳの様々な重篤度の個体からの量または範囲）と比較することが含まれ
る。試験サンプル中の様々な量のＧＤＦ−８は、ＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障
害の特定の予知と一致する。特定の予知レベルでＧＤＦ−８量を検出することにより、被
験体の予知がもたらされる。
本発明はまた、ＧＤＦ−８のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを
検出することによりＡＬＳまたはその他のＧＤＦ−８関連障害の経過をモニターする方法
を提供する。モニターする方法には、第１および第２の時点で被験体から採取した生物学
的サンプル中のＧＤＦ−８の試験量を測定すること、およびその量を比較することが含ま
れる。第１および第２の時点間のＧＤＦ−８の量の変化は、例えば、ＡＬＳまたはその他
のＧＤＦ−８関連障害の重篤度の経過における変化を示す。当業者であれば、ＡＬＳに類
似するＧＤＦ−８関連障害において、例えば、筋肉量の増加が望ましい場合、第１および
第２の時点間のＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−８活性の量の低下は障害の緩解を示し
、量の増加は障害の進行を示すことが分かる。このようなモニターアッセイは、ＡＬＳま
たはその他のＧＤＦ−８関連障害の処置を受けている患者において特定の治療的介入の効
力（例えば、疾患の減弱および／または逆転）を評価するためにも有用である。
本発明の抗体は、インビボまたはインビトロでＧＤＦ−８の存在を検出することによる
診断、予知またはモニタリングに用いられ得る。このような検出方法は当分野で周知であ
り、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット、ウエスタンブロット、免疫蛍
光、免疫沈降、およびその他の同等技術が含まれる。抗体は、ＧＤＦ−８を検出するため
の１またはそれ以上のこれらの技術を組み込んだ診断キットの状態でさらに提供され得る
。そのようなキットは、タンパク質の検出およびキットの使用を助けるその他の成分、包
装、使用説明書、またはその他の材料を含んでよい。
抗体が、診断、予知、またはモニター目的を対象とする場合、例えば、リガンド群（ビ
オチンなど）または検出可能なマーカー群（蛍光基、放射性同位元素、または酵素）でそ
れらを修飾することが望ましい。必要であれば、従来技術を用いて抗体（ポリクローナル
またはモノクローナルのいずれか）を標識してよい。適した標識としては、フルオロフォ
ア、発色団、放射性原子、電子密度の高い試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有
するリガンドが挙げられる。酵素は一般にそれらの活性により検出される。例えば、西洋
ワサビペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量化
できる青色の色素に変換するその能力により検出することができる。その他の適した標識
としては、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテイン
Ａ、ならびに当分野で公知の多数の受容体−リガンド対が挙げられ得る。その他の順列お
よび可能性は、当業者に容易に理解され、本発明の範囲内の同等物と見なされる。
ＶＩＩ．医薬組成物および投与方法
本発明は、本発明のＧＤＦ−８アンタゴニスト、すなわち ポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、ベクター、抗体、抗体フラグメント、および小分子を含む組成物を提供する。こ
のような組成物は、製薬用途および患者への投与に適し得る。組成物は、一般に、本発明
の１またはそれ以上の分子、好ましくは、抗体、および製薬上許容される賦形剤を含む。
本発明の抗ＧＤＦ−８抗体は、インビトロ、エクスビボで用いてよく、または製薬上許容
される担体と組み合わされる場合には医薬組成物に組み込んでよい。本明細書において、
「製薬上許容される賦形剤」との語句には、薬剤投与に適合する、任意のあらゆる溶媒、
溶液、緩衝液、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、お
よび同種類のものが含まれる。そのような組成物は、本発明の抗体および担体に加えて、
様々な希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当分野で周知のその他の
材料を含み得る。用語「製薬上許容される」とは、有効成分（１または複数）の生物活性
の有効性を妨げない無毒材料を意味する。担体の特徴は投与経路に依存する。薬剤活性物
質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で周知である。組成物はまた、追加
の治療機能、さらなる治療機能、または向上した治療機能をもたらすその他の活性化合物
を含んでよい。医薬組成物はまた、投与のための使用説明書とともに、容器、パック、ま
たはディスペンサーの中に含めてもよい。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体が、その他の製薬上許容される担体に加えて、ミ
セル等の凝集形態に存在する脂質、不溶性の単分子層、液晶、または水溶液中ではあるが
ラメラ層などの両親媒性物質と結合しているリポソームの形態であってよい。リポソーム
処方物に適した脂質としては、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルフ
ァチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸、および同種類のものが挙げられる
。このようなリポソーム処方物の調製は、当業者の技術のレベルの範囲内にある。
本明細書において、用語「治療上有効量」とは、有意義な患者の利益、例えば、このよ
うな状態の症状の寛解、回復、または回復速度の増加を示すために十分な、医薬組成物ま
たは方法の各活性成分の総量を意味する。単独に投与される、個々の有効成分に用いられ
る場合、この用語はその成分単独を指す。組合せに用いられる場合、この用語は、連続的
に組み合わせて投与されようと同時に組み合わせて投与されようと、治療効果をもたらす
有効成分を合わせた量を指す。
本発明の処置または使用方法を実践する際、例えば、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８
シグナル伝達を干渉する抗体の治療上有効量は、被験体、例えば、哺乳類（例えば、ヒト
）に投与される。本発明の抗体は、単独で、または抗炎症薬などのその他の治療と組み合
わせて、本発明の方法に従って投与され得る。１またはそれ以上の薬剤と同時投与される
場合、本発明の抗体は、第２の薬剤と同時に投与されるか、または順次に投与されてよい
。順次に投与される場合、主治医が他の薬剤と組み合わせた本発明の抗体の投与の適切な
順序を決定する。
一実施形態では、本発明の抗体（例えば、その医薬組成物）は、併用療法で、すなわち
、他の薬剤（例えば、病状または障害、例えば筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性
または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害、またはインスリン関連障害、例え
ば、ならびにアレルギー性および炎症性疾患の処置に有用な治療薬）と組み合わせて投与
される。この文脈において用語「組合せて」とは、薬剤が実質的に同時期に、同時にまた
は順次に投与されることを意味する。順次に投与される場合、第２の化合物の投与開始時
に、２種類の化合物の第１の化合物は、処置部位または被験体においてまだなお効果的な
濃度で検出可能であることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与を
達成する方法は当業者に公知である。局所または経口に投与され得るか、あるいは粘膜を
越えて送達可能であり得る組成物を得ることも可能である。本発明の方法を実践するため
の、医薬組成物に用いられる本発明の抗体の投与は、様々な従来の方法、例えば経口摂取
、吸入、皮膚、皮下、もしくは静脈の注射で行われ得る。
皮内もしくは皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、一般に、１またはそれ以上の
次の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射水、生理食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコ
ール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶剤など；抗菌剤、例え
ばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸ま
たは重亜硫酸ナトリウムなど；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など；緩衝
液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩など；ならびに張力の調節のための薬剤
、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースなどを含む。ｐＨは、酸または塩基、例え
ば塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。このような製剤は、ガラスまた
はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入さ
れ得る。
注射に適した医薬組成物には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液
または分散液および滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のためには、適した担体としては、
生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎ
ｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いかなる場合でも、組
成物は滅菌されていなくてはならず、容易な注入性(syringability)が存在する程度まで
流体であるべきである。それは製造および保存の条件下で安定性でなければならず、細菌
および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水
、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体
ポリエチレングリコールなど）、ならびに適したその混合物を含有する溶媒または分散媒
であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによ
り、分散液の場合には必要とされる粒径を維持することにより、さらに界面活性剤を用い
ることにより、維持することができる。微生物による作用の保護は、様々な抗菌剤および
抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメ
ロサール、および同種類のものにより達成することができる。多くの場合、等張剤、例え
ば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、および塩化ナトリウム
を組成物中に含めることが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅
延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによ
りもたらされ得る。
治療上有効量の本発明の抗体が、例えば、静脈内、皮膚または皮下注射により投与され
る場合、結合剤は、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態となる。ｐ
Ｈ、等張性、安定性などを考慮する(due regard to)、このような非経口的に許容される
タンパク質溶液の調製は、当分野の技術の範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射
に好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、等張性媒体、例えば塩化ナトリウム注射液、
リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、
乳酸化リンゲル注射液、または当分野で公知のその他の媒体を含むべきである。本発明の
医薬組成物（１または複数）はまた、安定剤、防腐剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業
者に公知のその他の添加剤を含んでよい。
本発明の医薬組成物中の本発明の抗体（または本発明のその他のアンタゴニスト）の量
は、処置される状態の性質および重篤度、および患者の受けた前処置の性質によって決ま
る。最終的に、主治医が各個別の患者を処置するための抗体の量を決定する。最初に、主
治医は低用量の抗体を投与して患者の応答を観察する。それより多い用量の抗体が、患者
に対して最適な治療効果が得られる時点まで投与され、その時点の投薬量は一般にそれ以
上増加されない。本発明の方法を実践するために用いられる様々な医薬組成物は、体重１
ｋｇあたり約０．１μｇ〜５０ｍｇの抗体を含むべきであると考えられる。
本発明の医薬組成物を用いる治療法の継続期間は、処置される疾患の重篤度および各個
別の患者の状態および潜在的な特異体質応答によって変動する。抗体の各適用の持続期間
は、例えば、皮下経路により、例えば、週に１回の範囲であることが考えられる。最終的
に主治医は本発明の医薬組成物を用いる治療法の適切な持続期間を決定する。
経口組成物には、一般に、不活性な希釈剤または食用の担体が含まれる。それらはゼラ
チンカプセル剤中に封入されてもよいし、または錠剤に圧縮されてもよい。経口治療用投
与のためには、ＧＤＦ−８アンタゴニスト（例えば、抗体、小分子、その他）を賦形剤と
ともに組み込んで錠剤またはカプセル剤の形態で用いてよい。製薬上相容な結合剤、およ
び／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル
剤、および同種類のものは、任意の以下の成分；微晶質セルロース、トラガカントガムま
たはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒ
ｉｍｏｇｅｌ（商標）、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム
またはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの磨砕剤；
スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、
またはオレンジ香味料などの香味剤、または類似の性質をもつ化合物を含んでよい。
本発明の医薬組成物、例えば、ＧＤＦ−８と結合し、ＧＤＦ−８シグナル伝達を干渉す
る抗体の治療上有効量が、経口投与される場合、結合剤は錠剤、カプセル剤、粉剤、溶液
またはエリキシル剤の形態である。錠剤の形態で投与される場合、本発明の医薬組成物は
、ゼラチンなどの固体担体またはアジュバントをさらに含んでよい。錠剤、カプセル剤、
および粉剤は、約５〜９５％の結合剤、好ましくは、約２５〜９０％の結合剤を含む。液
体形態で投与される場合、液体担体、例えば、水、石油、動物もしくは植物起源の油（ピ
ーナッツ油、鉱油、ダイズ油、もしくはゴマ油など）、または合成油を（個々の患者およ
び／または巨大な個体集団のこのような液体担体に対するアレルギーを考慮に入れた後に
）添加してもよい。医薬組成物の液体形態は、生理食塩水溶液、デキストロースまたはそ
の他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレ
ングリコールなどのグリコール類をさらに含んでよい。液体形態で投与される場合、医薬
組成物は約０.５〜９０重量％の結合剤、好ましくは、約１〜５０％の結合剤を含む。
吸入による投与のためには、ＧＤＦ−８アンタゴニストは、適した噴射剤、例えば、二
酸化炭素などのガスを含む圧縮容器もしくはディスペンサー、または噴霧器から、エアロ
ゾールスプレーの形態で送達される。従って、本明細書に記載される化合物は、肺組織へ
の吸入により投与され得る。本明細書において用語「肺組織」とは、別に示されている場
合を除いて、気道の任意の組織を指し、上気道と下気道の両方を含む。１またはそれ以上
のＧＤＦ−８抗体は、１またはそれ以上の、肺疾患を処置するための既存のモダリティと
組み合わせて投与され得る。
一例では、化合物を噴霧器用に処方する。一実施形態では、化合物を凍結乾燥形態で（
例えば、室温にて）保存し、吸入前に溶液中で再構成することができる。
また、医療用具、例えば、吸入器を用いて吸入用の化合物を処方することも可能である
（例えば、米国特許第６，１０２，０３５号（粉末吸入器）および同第６，０１２，４５
４号（乾燥粉末吸入器）を参照のこと）。吸入器は、別個の、保存に適したｐＨの活性化
合物用の区画と中和緩衝液用の別の区画、ならびに霧化の直前に化合物と中和緩衝液を合
わせるための機構を含み得る。一実施形態では、吸入器は、計量式吸入器である。
必要ではないが、界面活性剤などの送達エンハンサーを用いて肺への送達をさらに増強
することができる。本明細書において「界面活性剤」とは、２つの不混和相間の界面で相
互作用することにより薬物の吸収を促進する親水性部分と親油性部分を有する化合物を指
す。界面活性剤は、いくつかの理由（例えば、粒子の集塊の低下、マクロファージ食作用
の低下、その他）で乾燥粒子に有用である。界面活性剤、例えばＤＰＰＣなどは、化合物
の拡散を大いに促進するので、化合物は、肺表面活性剤と結合した場合、より効率的な吸
収を達成することができる。界面活性剤は当分野で周知であり、限定されるものではない
が、ホスホグリセリド類、例えば、ホスファチジルコリン類、Ｌ−α−ジパルミトイルホ
スファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘ
キサデカノール；脂肪酸；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシエチレン−９
−；アウリルエーテル(auryl ether)；パルミチン酸；オレイン酸；ソルビタントリオレ
エート（Ｓｐａｎ ８５）；グリココール酸；サーファクチン；ポロキソマー(poloxomer
)；ソルビタン脂肪酸エステル；ソルビタントリオレエート；チロキサポール；およびリ
ン脂質が挙げられる。
全身投与も経粘膜または経皮手段により可能である。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体の場
合、組成物は、ＦｃＲｎ受容体媒介経路によって粘膜（例えば、腸、口、または肺）を横
切る伝達が可能であり得る（例えば、米国特許第６，０３０，６１３号）。概して、経粘
膜投与は、例えば、トローチ剤、鼻腔スプレー、吸入器、または坐剤を用いることにより
達成することができる。経皮投与においては、活性化合物は、一般に当分野で公知の軟膏
、膏薬、ゲル、パッチまたはクリームとして処方される。経粘膜または経皮投与には、浸
透させるバリアに適切な浸透剤が処方物に用いられる。このような浸透剤は、一般に当分
野で公知であり、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる
。
医薬組成物はまた、遺伝子療法に適した組成物、すなわち本明細書に開示されるポリヌ
クレオチドで構成される組成物からなってよい。遺伝子療法の場合、製薬上許容される担
体には、例えば、脂質、コラーゲン球、陽イオンエマルジョン系、水、生理食塩水緩衝液
、ウイルスベクター、カイロミクロンレムナント、ポリマーナノ粒子（例えば、ゼラチン
−ＤＮＡまたはキトサン−ＤＮＡ）、金粒子、高分子複合体、リポプレックス、ポリプレ
ックス、その他が含まれ得る（例えば、Gardlik et al. (2005) Med. Sci. Monit. 11(4)
:RA110-21を参照のこと）。
安定化および保持
一実施形態では、ＧＤＦ−８抗体は、循環中で、例えば、血液、血清、リンパ、気管支
肺もしくは気管支肺胞洗浄、またはその他の組織において、その安定化および／または保
持を、例えば少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍改善する部分と物理的に会
合している。
本発明のアンタゴニストは、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御
放出製剤など、身体からの迅速な排出から保護する担体とともに調製され得る。生分解性
の、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、
コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸を用いてよい。このような製剤の調製
方法は当業者には明らかである。ＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、１またはそれ以上
の抗ＧＤＦ−８抗体を含有するリポソーム懸濁液も、製薬上許容される担体として用いる
ことができる。これらは当業者に公知の方法に従って調製され得る。
例えば、ＧＤＦ−８抗体はポリマー、例えば、実質的に非抗原性ポリマー、例えばポリ
アルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドと会合することができる。適したポリマ
ーは、実質的に重量により変動する。数平均分子量が約２００〜約３５，０００（または
約１，０００〜約１５，０００、または約２，０００〜約１２，５００）の範囲のポリマ
ーを用いてよい。
例えば、ＧＤＦ−８抗体を共役させて水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリ
マー類、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンとしてよい。このよ
うなポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または
ポリプロピレングリコール類などのポリアルキレンオキシドホモポリマー類、ポリオキシ
エチレン化ポリオール類、その共重合体およびそのブロック共重合体（ブロック共重合体
の水溶性が維持されるという条件で）が挙げられる。さらなる有用なポリマーとしては、
ポリオキシアルキレン類、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポ
リオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（プルロニック）；ポリメ
タクリレート類；カルボマー類；サッカリド単量体であるＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ
−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グ
ルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロ
ン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースお
よびノイラミン酸からなる、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチル
デンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン類、グリコーゲ
ン、または酸性ムコ多糖類の多糖サブユニット（例えば、ヒアルロン酸）などのホモ多糖
類およびヘテロ多糖類を含む、分枝または非分枝多糖類；ポリソルビトールおよびポリマ
ンニトールなどの糖アルコール類のポリマー；ヘパリン、その他が挙げられる。
その他の化合物、例えば、細胞毒素、標識、または別の標的指向化薬剤、例えば、別の
ＧＤＦ−８抗体または関係のないリガンドも同じポリマーに結合させることができる。モ
ノ活性化された、アルコキシ基末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、モノメ
トキシ基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、Ｃ1-4アルキル基末端ポリマー、お
よびビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を架橋に用いることができる（例え
ば、米国特許第５，９５１，９７４号を参照のこと）。
一実施形態では、リガンドと架橋する前のポリマーは、必要ではないが、水溶性である
ことが好ましい。一般に、架橋後、生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約０．０
１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは
、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。その上、ポリマーは、複合体形態で高度に
免疫原性であるべきではなく、静脈内注入、エアロゾル化、または注射と適合しない粘度
を有するべきでもない（もし複合体がこのような経路による投与を意図する場合）。
一実施形態では、ポリマーは、反応性のひとつの基のみを含む。これは、リガンド分子
が相互に架橋することを回避するために役立つ。しかし、反応条件を最大化してリガンド
分子間の架橋を減少させるか、あるいは反応生成物をゲルろ過またはイオン交換クロマト
グラフィーによって精製して実質的に均質な誘導体を回収することは本明細書の範囲内に
ある。他の実施形態では、ポリマーは、複数のリガンドとポリマー主鎖とが結合するため
に、２またはそれ以上の反応性基を含む。この場合もやはり、ゲルろ過またはイオン交換
クロマトグラフィーを用いて所望の誘導体を実質的に均質な形態で得ることができる。
ポリマーの分子量の範囲は、最大約５００，０００Ｄであり、好ましくは、少なくとも
約２０，０００Ｄ、または少なくとも約３０，０００Ｄ、または少なくとも約４０，００
０Ｄである。選択される分子量は、達成されるべき複合体の効果的なサイズ、ポリマーの
性質（例えば、直鎖状もしくは分枝状などの構造）、および誘導体化の程度に依存し得る
。
共有結合を用いてＧＤＦ−８抗体とポリマーを結合することができる（例えば、リガン
ドのＮ末端アミノ基と、リガンドのリジン残基に見出されるεアミノ基、ならびにその他
のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル、またはその他の親水
基との架橋結合）。ポリマーは、多官能性（通常は二官能性）架橋剤を用いずに、直接Ｇ
ＤＦ−８抗体と共有結合することができる。アミノ基との共有結合は、塩化シアヌル、カ
ルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアル
デヒドのジエチルアセチル；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧクロリド＋
４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル類、活
性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまた
はＰ−ニトロフェニルクロロホメート活性化ＰＥＧ）に基づく公知の化学によって達成さ
れる。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いるＰＥＧ−アミンの結合により誘導体化
することができる。スルフヒドリル基は、マレイミド−置換ＰＥＧ（例えば、アルコキシ
−ＰＥＧアミン＋スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボン酸塩）（ＷＯ９７／１０８４７号参照）またはＰＥＧ−マレイミドと結合
させることにより誘導体化することができる。あるいは、リガンド上の遊離アミノ基（例
えば、リジン残基上のεアミノ基）を２−イミノ−チオラン（トラウト試薬）でチオール
化し、次に、例えば、Pedley et al. (1994) Br. J. Cancer 70：1126-30に記載されるよ
うに、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体と結合させることができる。
ＧＤＦ−８抗体と結合することのできる官能化されたＰＥＧポリマーは、例えば、Ｓｈ
ｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から市
販されている。このような市販のＰＥＧ誘導体としては、例えば、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥ
Ｇアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−コハク酸塩、カ
ルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧコハク酸スク
シンイミジル、ＰＥＧプロピオン酸スクシンイミジル、カルボキシメチル化ＰＥＧのスク
シンイミジルエステル、ＰＥＧの炭酸スクシンイミジル、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミ
ジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカ−ボ
ネート、ＰＥＧトレシレート(tresylate)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アル
デヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフ
ィド、ヘテロ官能性ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、およびＰＥＧホスホリ
ド(phospholides)が挙げられる。これらのＰＥＧ誘導体を結合するための反応条件は、Ｇ
ＤＦ−８抗体、所望のペグ化の程度、および利用するＰＥＧ誘導体によって変動し得る。
ＰＥＧ誘導体の選択に関与する一部の要因としては、所望の結合点（リジンまたはシステ
インＲ−基など）、誘導体の加水分解安定性および反応性、安定性、結合の毒性および抗
原性、分析の適合性、その他が挙げられる。任意の特定の誘導体の使用に関する具体的な
指示は、製造業者から入手できる。
ＧＤＦ−８抗体とポリマーの複合体は、未反応出発物質から、例えば、ゲルろ過または
イオン交換クロマトグラフィー、またはクロマトグラフィーのその他の形態、例えば、Ｈ
ＰＬＣにより分離することができる。複合体の異種は、同じ方法でお互いから精製される
。異なる種（例えば、１または２つのＰＥＧ残基を含有する）の分解も、未反応アミノ酸
のイオン特性の差異によって可能である（例えば、ＷＯ９６／３４０１５号を参照のこと
）。
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書において同定される使用また
は生物活性を１またはそれ以上示すことが予期される（下に引用されるアッセイに関連す
るものも含む）。本発明のタンパク質に関して記載される使用または活性は、このような
タンパク質の投与または使用によるか、あるいはこのようなタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド（例えば、遺伝子治療またはＤＮＡの導入に適したベクター中など）の投与
または使用によってもたらされ得る。
経口もしくは非経口組成物を、投与の簡便さおよび投薬量の画一性のために、投薬単位
形態で処方することは有利であり得る。本明細書において投薬単位形態とは、処置される
べき被験体に対する単位投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は必要
とされる製薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合
物を含有する。本発明の投薬単位形態の明細は、活性化合物の特有の特性、達成されるべ
き特定の治療効果、および個体の処置のためのこのような活性化合物の処方に固有の当分
野の制限の影響を受け、直接的にそれらに依存する。
従って、本発明のもう一つの態様は、例えば、その他の治療用化合物とともに、または
その他の治療用化合物を含まずに、本発明のＧＤＦ−８抗体の投与を実行するための、あ
るいは、抗ＧＤＦ−８抗体を、生物学的サンプルにおいてＧＤＦ−８の存在および／また
はレベルを決定するための研究用または治療用ツールとして用いるためのキット、例えば
ＥＬＩＳＡキットに関する。一実施形態では、キットは、製薬担体中に処方された１また
はそれ以上の抗ＧＤＦ−８抗体および少なくとも１種類の薬剤、例えば、必要に応じて処
方される治療用薬剤を１またはそれ以上の別個の医薬品中に含む。
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示されるが、いかなる点においても本発
明の範囲を制限するものではなく、解釈されるべきでもない。実施例には、従来法、例え
ばハイブリドーマ形成、ＥＬＩＳＡ、増殖アッセイ、フローサイトメトリー分析および組
換えＤＮＡ技術などの詳細な記述が含まれていない。このような方法は当業者に周知であ
る。
本出願を通じて引用されるすべての参照文献、特許、特許出願公開、およびその他の特
許文献の全内容は、参照により本明細書に援用される。
実施例１
抗ＧＤＦ−８抗体ＲＫ３５の作製および同定
ヒトＧＤＦ−８タンパク質（成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチド）およびＢ
ＭＰ−１１タンパク質を、米国特許出願公開第２００４／０１４２３８２号に記載される
ように単離し、特性決定した。
６頭の雌ミオスタチンノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ
ら、前掲）を、フロイント完全アジュバント中２０μｇの組換え型ＧＤＦ−８二量体を用
いる皮下注射により免疫化した。
フロイント不完全アジュバント中同量の抗原の数回の追加免疫注射を２週間隔で行い、
最終のＰＢＳ中２μｇの静脈内注射（尾静脈）を融合前に行った。最大の抗体力価を示す
この２頭のマウス由来の脾細胞を、標準的な技法（Oi and Herzenberger (1980) In: Mis
hell, B.B., Shiigi, S.M., Henry, C, Mishell, R.I. (Eds.), Selected Methods in Ce
llular immunology W.H. Freemen, San Francisco, pp. 351-72）を用いてマウス骨髄腫
細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）と融合させた。１０〜１４日後、
上清を回収し、抗ＧＤＦ−８抗体産生について固相および液相ＥＬＩＳＡ（Whittemore e
t al.、前掲）によりスクリーニングした。標準的なＥＬＩＳＡ技術およびｐＧＬ３−（
ＣＡＧＡ）12レポーターアッセイ（Theis et al (2001) Growth Factors 18：251-59）を
用い、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ受容体の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と融
合させることにより生じたキメラＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを用いて、ミオスタチンとその受
容体ＡｃｔＲＩＩＢの結合の阻害についてのＩＣ50を測定した。さらなる研究のために選
択されたハイブリドーマを、単クローン性を確実にするための反復限界希釈法によりモノ
クローナルとした。モノクローナル抗体ＲＫ３５をさらなる研究用に選択した。
実施例２
ＲＫ３５モノクローナル抗体はＧＤＦ−８に対して高い親和性を有し、中和活性を示す
実施例２．１：試験手順
ＥＬＩＳＡのため、ビオチン化ＧＤＦ−８を、９６ウェルストレプトアビジンマイクロ
タイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上、１μｇ／ｍｌで４℃に
て一晩コートした。コーティング後、溶液をウェルから取り除き、プレートをＳｕｐｅｒ
Ｂｌｏｃｋ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で室温にて１時間ブロッキングした。プレートをＰＢ
Ｓですすぎ、１００μｌのＲＫ３５抗体を様々な濃度でウェルに添加した。プレートを室
温にて１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。各ウェルに、抗ｈｕＩｇＧ−Ｈ
ＲＰ複合体の１:５０００希釈１００μｌ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒ
ｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートした。各プ
レートをＰＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢ基質（１００μｌ）を各ウェルに添加し、顕色す
るまでインキュベートした。１００μｌの０．１８Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止さ
せた。マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで吸光度を読み取ること
により生じたシグナルを測定した。ヒトアイソタイプ対照抗体を用いてＧＤＦ−８との結
合を確認した。
組換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉ
ｓ，ＭＮ，カタログ番号３３９−ＲＢ／ＣＦ）を９６ウェル平底アッセイプレート（Ｃｏ
ｓｔａｒ，ＮＹ，カタログ番号３５９０）上、０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ
／ｍｌで４℃にて一晩コートした。次に、プレートを１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン
でブロッキングし、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールに従って洗浄した。ビオチン化ＧＤ
Ｆ−８またはＢＭＰ−１１のアリコート（１００μｌ）をブロックしたＥＬＩＳＡプレー
トに様々な濃度で添加し、１時間インキュベートし、洗浄し、結合したＧＤＦ−８または
ＢＭＰ−１１の量をストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、
ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１３０４７Ｅ）
により検出した後、ＴＭＢを添加した（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，カタ
ログ番号５０−７６−０４）。比色測定を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製マ
イクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで行った。阻害活性を分析するため、ＲＫ３
５を２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ−８または２０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−１１とのプレインキュベ
ーションにより様々な濃度で試験した。室温にて１時間のインキュベーションの後、１０
０μｌのＲＫ３５およびＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１混合物をプレートに添加した。結
合した因子の検出および定量化は、Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 300：965-71に記載されている。
ＧＤＦ−８の活性を実証するため、ＴＧＦ−β誘導プロモーターの制御下、ルシフェラ
ーゼを発現しているレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）12を用いてレポーター遺伝
子アッセイ（ＲＧＡ）を展開した。ＣＡＧＡは、ＴＧＦ−β−誘導遺伝子ＰＡＩ−１のプ
ロモーター内のＴＧＦ−β−応答配列である（Denner et al. (1998) EMBO J. 17:3091-3
100）。１２のＣＡＧＡボックスを含むレポーターベクターを、基本的なルシフェラーゼ
レポータープラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて作製
した。アデノウイルス主要後期プロモーターからのＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位
（−３５／＋１０）を、ＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。１２反
復のＣＡＧＡボックス、すなわちＡＧＣＣＡＧＡＣＡを含むオリゴヌクレオチドをアニー
ルし、ＸｈｏＩ部位にクローニングした。ヒト横紋筋肉腫細胞株Ａ２０４（ＡＴＣＣ Ｈ
ＴＢ−８２）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）12で一過性にトランスフ
ェクトした。トランスフェクションの後、細胞を、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ ペニシリンおよび１０％ ウシ胎児血清を補充し
たマッコイ５Ａ培地中で９６ウェルプレートにて１６時間培養した。次に、細胞を、１０
ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ−８を含むまたは含まない、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニ
シリン、および１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含有するマッコイ５Ａ培地中、３７
℃にて６時間処理した。ルシフェラーゼをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて処理細胞中で定量した。ＲＫ３５の阻害活性を試験する
ため、ＧＤＦ−８を抗体と室温にて１時間プレインキュベートした。次に、この混合物を
トランスフェクト細胞に添加し、細胞を３７℃にて６時間インキュベートした。ルシフェ
ラーゼをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて
定量した。
実施例２．２：結果
ミオスタチンに対する高親和性マウスモノクローナル抗体を、成熟マウスミオスタチン
とアミノ酸配列が同一の、精製組換えヒトＧＤＦ−８でＧＤＦ−８ノックアウトマウスを
免疫化することにより生成させた（McPherron et al., 1997）。ＲＫ３５抗体は、直接Ｅ
ＬＩＳＡにより試験したように高い親和性でＧＤＦ−８と結合した（４ｎＭ；図１Ａ）。
競合ＥＬＩＳＡを用いて、ＲＫ３５がＧＤＦ−８とその高親和性受容体、ＡｃｔＲＩＩＢ
の結合を阻害する能力を評価した。ＲＫ３５は、ビオチン化ＧＤＦ−８と固定化ＡｃｔＲ
ＩＩＢ−Ｆｃの結合をＩＣ50 約２．５ｎＭで阻害した（図１Ｂ）。可溶性ＡｃｔＲＩＩ
Ｂはまた、ＧＤＦ−８と固定化ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの結合を阻害したが、対照抗体は結
合を阻害しなかった。ＲＫ３５の中和活性もｐＧＬ３−（ＣＡＧＡ）12細胞系レポーター
アッセイを用いて測定した。このアッセイでは、ルシフェラーゼ遺伝子をＧＤＦ−８／Ｔ
ＧＦ−β応答性プロモーターの制御下でクローン化し、ヒトＡ２０４横紋筋肉腫細胞をレ
ポータープラスミドで一過性にトランスフェクトした。ＧＤＦ−８に誘導される、Ａ２０
４細胞におけるルシフェラーゼ活性の増加は、用量依存的な方法でＲＫ３５により阻害さ
れた（図１Ｃ）。ＲＫ３５は、ＧＤＦ−８シグナル伝達活性を０．２ｎＭのＩＣ50で低下
させた。従って、ＲＫ３５は、ＧＤＦ−８に対して標的指向された新規な極めて強力なマ
ウスモノクローナル中和抗体である。
実施例３
野生型およびＡＬＳげっ歯類モデルにおけるＲＫ３５のインビボ活性
実施例３．１：試験手順
実施例３．１．１：動物および薬物処置
動物の使用を伴う全ての手順は、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ大学またはＷｙｅｔｈ社の
いずれかのＩＡＣＵＣに認可された。Ｂ６ＳＪＬハイブリッドバックグラウンド（Ｊａｃ
ｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の、ヒトＳＯＤＧ９３Ａを発現しているトランス
ジェニックマウス（Gurney et al.、前掲）をＢ６ＳＪＬＦ１雌ブリーダーマウス（Ｊａ
ｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室内で交配させた。後代をＰＣＲでスクリー
ニングし；導入遺伝子に対して陰性のマウスを年齢の一致した同腹仔野生型対照として用
いた。マウスを４つの群：抗ミオスタチン抗体ＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス
２９頭、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（媒体）で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス２８
頭、ＲＫ３５で処置した野生型マウス２３頭、およびＰＢＳで処置した野生型マウス２３
頭に分割した。生後２８日目に開始して、マウスに、抗ＧＤＦ−８モノクローナル抗体Ｒ
Ｋ３５か同等量のＰＢＳのいずれかを週１回ベースで腹膜内に注射した。第１の用量は４
０ｍｇ／ｋｇであった；その後の用量は、抗ミオスタチン抗体ＪＡ１６について記載され
るプロトコールに従って２０ｍｇ／ｋｇ／週であった（Whittemore, et al.、前掲）。各
群から９〜１２頭のマウスを８４〜９０日齢（１２週）の間に（平均８８日）屠殺して湿
った（wet）筋肉量および組織を評価し、残りのマウスを、左右両側の横臥位から３０秒
以内に体を起こすことができないことと定義される、疾患末期に達するまで（約１３４日
）モニターした。
並行して、雄および雌の同数が混合されている、ヒトＳＯＤＧ９３Ａ発現トランスジェ
ニックラット（５８）（Howland et al.、前掲）にＰＢＳ（媒体）かまたはＲＫ３５のい
ずれかを投与した。各群１０頭のラットを９５日齢で安楽死させて、湿った筋肉量へのＲ
Ｋ３５の効果を測定した。各群の残りの１９頭のラットは疾患末期まで継続した。雌トラ
ンスジェニックラットおよび野生型同腹仔対照ラットを用いる第２の研究を用いて、体重
の増加ならびに握力の変化を処置群および遺伝子型にわたって比較した。各研究において
、４０ｍｇ／ｋｇのＲＫ３５をラットに腹膜注射し（６週齢（約４２日））、その後、９
５日目に筋肉量の分析のために屠殺するか、または立ち直り反射不全(right reflex fail
ure)で測定される末期段階まで、２０ｍｇ／ｋｇ／週または媒体の注射を継続した。
実施例３．１．２：体重および筋肉量測定
初期体重を用いて、研究の開始時の平均体重が確実に同等となるようにコホート間に動
物を均一に分配した。体重減少の開始を、体重減少の３回連続測定の１回目を観察した時
点の日齢として記録した。湿った筋肉量を、腓腹筋、前脛骨筋(cranial tibialis)、四頭
筋、および横隔膜にて、早期疾患（マウスは８８日、ラットは９５日）および末期段階（
マウスは約１３４日、ラットは約１２８日）に一致する時点で測定した。動物を安楽死さ
せ、各肢の筋肉を定量的に解剖し、計量した；右肢と左肢の値を平均した。
実施例３．１．３：筋肉組織病態学および運動ニューロンカウント
腓腹筋および横隔膜を固定し、Ｈ＆Ｅ染色のために切片化した（Howland et al. (2002
) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-29）。萎縮および肥大についてのスコア付け
は、２つの独立した病態について、サンプルの身元を見せずに行った。線維径を、形態計
測（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ４．３，Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）により、
８８日目および末期段階の腓腹筋（ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス
ならびにＰＢＳ処置野生型マウス）について、ならびに末期段階の横隔膜筋（ＰＢＳ処置
およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３ＡならびにＰＢＳ処置野生型マウス）について測定した
。１群あたり３つの筋肉をドライアイス冷イソペンタン中で瞬間冷凍し、厚さ８μｍの凍
結切片化し、抗ラミニン抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｌ
９３９３）を用いて免疫染色した。少なくとも２００の線維の短径の最大直径の直線的測
定を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて行った。線維径を２０μ
ｍ間隔の値域ごとにまとめ、各筋肉群について頻度ヒストグラムを生成した。
運動ニューロンカウントを、各群（野生型、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａ、およびＲＫ３
５処置ＳＯＤＧ９３Ａ）からの初期段階および疾患末期の双方の３頭のマウスにて行った
（合計１８マウスを分析した）。断頭したマウスから取り出した脊柱を４％パラホルムア
ルデヒド中で後固定（post-fixed）し、次に索（cord）を解剖し、さらに４％パラホルム
アルデヒド中で２４時間後固定した。ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（商標）技術（Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて、１８の腰
髄を、単一のブロック上で一緒に包埋し、腰膨大のセグメント全体（約６ｍｍ）に沿って
前頭面を５０ｕｍで横に切断した。６つの切片（３００μｍ）ごとにチオニンニッスルで
染色して細胞体を露呈させた（Bjugn (1993) Brain Res. 627:25-33; Kieran et al. (20
04) Nat. Med. 10:402-05）。２つの独立したアプローチを用いてカウントを行った。第
１に、１８頭のマウスの各々についてＬ３〜５を包含する１０の脊髄切片を、観察者にサ
ンプルの身元を知らせずに、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｏｐｌａｎ２を２０倍および４０倍で用い
て分析した。各切片の両前角を計数し、既に記載されているように（Kieran et al.、前
掲）目に見える核小体の存在により大型の健康な運動ニューロンを同定した。得られるデ
ータは、前角あたりの大型の運動ニューロンの平均数として表された。第２に、Ｌ３〜Ｌ
５領域由来の切片を、記載されるように、電動の試料ステージ、電子マイクロカトール(m
icrocator)、および立体解析学ソフトウェア（Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ
（ＭＢＦ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ，ＶＴ））を備えたＺｅｉｓｓ
Ａｘｉｏｓｋｏｐ２を用いて立体解析学的に分析し（West et al. (1991) Anat. Rec. 23
1:482-97; Schmitz and Hof (2000) J. Chem. Neuroanat. 20:93-114; Schmitz and Hof
(2005) Neuroscience 130:813-31）;α−運動ニューロンを、３００μｍ2を越える最大投
射野をもつニューロンとしてスコア付けした。
実施例３．１．４：表現型分析
握力測定（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を
、記載されるように、処置および対照マウスの前肢および後肢の両方において生後２８日
に開始して隔週行った（ｎ＝８〜２４）（LaMonte et al. (2002) Neuron 34:715-24）。
早期疾患相の（生後９５〜１１０日；ｎ＝１０）トランスジェニックおよび野生型ラット
を、Ｄｕｎｎｅｔｔラット握力計（ＭＪＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ
，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、前肢握力について週２回試
験した。ラットはロトロッドによっても分析され（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ，Ｃｏｍｅｒｉ
ｏ，Ｉｔａｌｙ）、ならびに、歩行異常および四肢の運動性の程度についてモニターされ
た（データは示さず）。
実施例３．１．５：電気生理学
筋電図検査（ＥＭＧ）記録およびデータ分析を、遺伝子型および処置群を知らせずに行
った。体温３５〜３７℃で維持したネンブタール麻酔下のラットを、同心単極針電極（９
０１３Ｒ００１１，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，ＭＮ，ＵＳＡ）を、ＥＭＧ妨害パターンのバー
ストが各吸気とともに表れるまで、外科的に露出した横隔膜筋に挿入することにより、針
筋電図に供した。電気シグナルを、ＭＰ１５０ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｕ
ｎｉｔ、ＵＩＭ１００Ｃ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｍｏｄｕｌｅ、Ｅ
ＭＧ１００Ｃ 筋電図検査モジュール、およびＡｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェア（Ｂ
ＩＯＰＡＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）で構成されるＢＩＯＰＡＣ
装置で２０ＫＨｚにて獲得した。シグナルを最初に分析して６０Ｈｚアーチファクトを取
り除き、５００〜１０００Ｈｚの間で帯域通過フィルタ処理して、呼吸に起因する動きア
ーチファクト、さらに運動単位放電を強調することに起因する動きアーチファクトを取り
除いた。ＥＭＧバーストを、シグナルを整流すること、１０Ｈｚで低域フィルタリングす
ること、その後、得られるエンベロープがその平均値よりも大きくなる時点を検出するこ
とにより同定した。１００ｍｓ未満続いたバーストはカウントせず、１００ｍｓ未満続い
た非バースト時間を周囲(surrounding)バーストの一部としてカウントした。最後に、非
バースト時間中のシグナル振幅の標準偏差の３倍に等しく設定されたピーク検出閾値を用
いて非整流シグナル中のスパイクを検出した。スパイクバースト分析をＫ．Ｃ．ＭｃＧｉ
ｌｌ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣＡ）によるカスタムソフトウェアで
行い、各動物に対するバーストスパイク比（Ｈｚ）を、平均バースト持続期間で割った、
バーストあたりの平均スパイク数として計算した。
実施例３．１．６：データ分析および統計
２要因反復測定ＡＮＯＶＡモデルを、ＳＡＳ混合手順を用いて体重データならびに握力
データに適用した。２要因ＡＮＯＶＡ線形モデルを、ＳＡＳ ＧＬＭ手順を用いて筋肉量
データに適用した。電気生理学データを２サンプルｔ検定により分析した。運動ニューロ
ンカウントデータには、ポアソン分布を仮定している一般化線形モデル（ＧＬＭ）を用い
た。筋線維データは、ＡＮＯＶＡの後、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定により分析した。比較
は、ｐ値が０．０５未満である場合に統計上有意であると考えられ；０．０５＜ｐ＜０．
１５での比較は傾向として記される。
実施例３．２：結果
実施例３．２．１：ＲＫ３５処置はＳＯＤＧ９３Ａげっ歯類の体重を増加させたが、生
存は延長しなかった。
ＳＯＤＧ９３Ａマウスを抗ミオスタチン抗体ＲＫ３５で処置し、それを生後２８日から
開始して疾患末期（生後約１３４日）まで継続した。ＲＫ３５処置の結果、ＰＢＳ処置Ｓ
ＯＤＧ９３Ａマウスと比較して、生後４０〜１２０日まで体重が有意に増加した。ＰＢＳ
処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは７０日で２７．７８±０．４６ｇの最大体重に達したのに対
し、ＲＫ３５処置マウスは３２．１３±０．４８ｇの最大値に達し、相対的な増加は１６
％であった（図２Ａ）。野生型マウスは研究を通じて体重増加が続いたが、ＰＢＳ処置お
よびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方は、疾患の進行に起因して生後約９８日に
有意な体重減少の徴候を示し始めた。
トランスジェニックＳＯＤＧ９３ＡラットをＲＫ３５抗体でも処置し、それを生後４２
日から開始して疾患末期（約１２８日齢）まで継続した。抗ミオスタチンＲＫ３５での処
置により、ＰＢＳ処置ラットと比較してＳＯＤＧ９３Ａラットに体重の増加がもたらされ
た（図２Ｂ）。ＲＫ３５を受けるトランスジェニックラットは、早くも投薬開始後３週に
対応する生後６０日に、ＰＢＳ処置トランスジェニックラットよりも有意に体重が重かっ
た（ｐ＜０．０５）。ＲＫ３５で処置した雄ラットは９６日で４５８．８±６．５ｇの最
大値に達し、４１９.１±１０．７ｇのＰＢＳ処置雄ラットよりも１０％の増加であった
。ＲＫ３５処置雌は２８９．７±９．３ｇの最大値に達し、２５２.８±６.０ｇのＰＢＳ
で処置した雌よりも１５％の増加であった。ＰＢＳかＲＫ３５のいずれかで処置したＳＯ
ＤＧ９３Ａラットは、約１１２日後に疾患の進行に起因する有意な体重減少を示し始めた
；ＲＫ３５処置は体重減少の開始を遅らせなかった。
ＲＫ３５処置は有意な体重増加をもたらしたが、発明者らはＲＫ３５処置が生存に効果
がないことを見出した。３０秒以内に体を起こすことができないと定義されたエンドポイ
ントを用いて判定される末期段階までの時間は、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスに対
して１３２±８日であったが（ｎ＝１６）、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは１３４±
７日で末期段階に達した（ｎ＝１７）。ＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットは、Ｐ
ＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットの１２８±６日と比較して、１２５±８日で末期段階に達
した。これらの差異はいずれも統計上有意でなく、ミオスタチンの阻害がマウスまたはラ
ットのいずれのＡＬＳモデルにおいても疾患末期までの時間を遅らせないことが示される
。
実施例３．２．２：筋肉量および強度へのミオスタチン阻害の効果
ミオスタチン阻害が筋消耗を遅くするかどうかを判定するために、ＳＯＤＧ９３Ａトラ
ンスジェニックマウスおよび野生型マウスを各群から、ＲＫ３５処置により誘導される体
重の増加が最大に近い時点である、生後８８日目に屠殺した。この時点で、ＰＢＳ処置Ｓ
ＯＤＧ９３Ａマウスは、疾患の初期段階に一致する野生型対照マウスと比較して、腓腹筋
、前脛骨筋、および四頭筋の筋肉量の有意な低下を示す（図２Ｃ）。対照的に、ＲＫ３５
処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、８８日目の時点で日齢の合致するＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３
Ａマウスと比較して、試験した全ての筋肉において筋肉量の統計上有意な改善を提示し、
その範囲は約１９％〜３２％（腓腹筋、＋２６％；前脛骨筋、＋１９％；四頭筋、＋３２
％）であった。疾患の初期段階中にＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜には筋
肉量の有意な低下は見出されなかったが、ＲＫ３５処置はなおこの筋肉の質量の有意な増
加を誘導した（＋２１％）。
各コホートの残りのマウスを、立ち直り反射試験(right reflex test)で定義される末
期段階までモニターした。末期段階で、ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマ
ウスの双方に脚筋消耗が観察された（図２Ｅ）。８８日目のマウス由来組織での知見と対
照的に、疾患末期のＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、野生型動物と比較して横隔膜筋
量の有意な低下を示した（図２Ｅ）。しかし、処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスに観察される、
ＲＫ３５に誘導される横隔膜質量の増加は末期段階で有意なままであり、ミオスタチン阻
害がＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて横隔膜の萎縮を遅らせることが示される。
抗ミオスタチン抗体の筋肉量への効果もＳＯＤＧ９３Ａラットにおいて調査した。マウ
スにおいてなされた知見に類似して、ＲＫ３５で処置した約９５日齢のＳＯＤＧ９３Ａラ
ットは、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットよりも腓腹筋（＋１７％）、前脛骨筋（＋３０
％）、四頭筋（＋３０％）および横隔膜筋（＋１７％）において質量が有意に増加したを
示した（図２Ｄ）。疾患末期までに、ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａラッ
トの双方において脚筋萎縮は明白であった（図２Ｆ）。ＳＯＤＧ９３ＡラットにおけるＲ
Ｋ３５処置の結果としての、脚筋肉量の増加に対する傾向は末期段階まで続いたが、これ
らの効果は有意には達しなかった。しかし、ＰＢＳ処置対照（約３５％）に対する、ＲＫ
３５処置ＳＯＤＧ９３Ａラット由来の横隔膜質量の堅調かつ有意な３５％の増加は疾患の
末期になお明白であり（図２Ｆ）、ＳＯＤＧ９３Ａマウスに関して見られる知見に一致し
ている（図２Ｅ）。
ミオスタチン阻害の筋肉機能への効果を試験するため、ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置
マウスに定量的握力アッセイを行った。ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマ
ウスの双方が、生後２８〜５６日の間の後肢握力において発展的な増加を示した。生後５
６日まで、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、日齢の合致する対照マウスよりも有意に
弱くなる（図３Ａ）（ｐ＜０．０００１）。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて
生後６３日まで握力の低下も明白であったが、ＲＫ３５処置マウスは生後４９〜８８日ま
でＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスよりも有意に強いままであった（または強い傾向があ
った）（ｐ＜０．０５）。前肢握力の分析は、類似のパターンを示した（図３Ｂ）。ＰＢ
Ｓ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方においてピーク前肢強度がそれぞ
れ生後約４９日および５６日までに観察された。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは野生
型動物よりも生後５６日までに有意に弱くなり（ｐ＜０．０５）、その後も低下が続いた
。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、５６〜８８日齢のＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマ
ウスよりも強かった（５６日；ｐ＝０．０８；６３日：ｐ＝０．０６；７０〜８８日；ｐ
＜０．００１）。これらのデータは、ミオスタチン阻害がＳＯＤＧ９３Ａマウスの疾患の
初期段階を通じて筋肉機能の低下を遅らせることを示す。しかし、約１００日後、握力の
低下は処置および未処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方において同様であった。
ＲＫ３５処置がＳＯＤＧ９３Ａラットに類似の変化を誘導するかどうかを判定するため
、疾患の初期段階の間のＲＫ３５およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットならびに日齢の
合致する野生型同腹仔において前肢握力も分析した（図３Ｃ）。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３
Ａラットは野生型対照よりも有意に弱く、ＳＯＤＧ９３Ａラットもマウスと同様に明白な
運動障害および体重減少に先行する早期疾患段階を示すことが確認された。ＲＫ３５処置
ＳＯＤＧ９３Ａラットの握力測定値は一般にＰＢＳで処置した野生型ラットの値よりも低
かったが、群に有意な差はなかった。ＳＯＤＧ９３Ａラットにおけるミオスタチン阻害は
、この日齢間隔でのＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットと比較した場合、握力を有意に改善
する。
実施例３．２．３：ミオスタチン阻害はＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットにおける脚
筋肉および横隔膜の変性を遅くした
ＲＫ３５処置の筋肉形態への効果も調査した。８８日（疾患の初期段階）および約１３
４日（疾患末期）ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜および内側腓腹筋について、ＲＫ３
５処置の効果をＰＢＳと比較し、並行して日齢の合致する野生型対照由来組織と比較して
検討した。各組織における萎縮および肥大の程度を、表４に示されるように盲分析でスコ
ア付けした（０、無し；１、僅か；２、軽度；３、中度；４、顕著；５、重篤）。ＰＢＳ
処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスは、疾患の初期段階に腓腹筋の有意な萎縮を示した（平均スコ
ア２.０；および図４Ｂ）。観察された筋線維の縮み、中央に置かれた核およびクロマチ
ン濃縮した核は、活発な脱神経を受けた筋肉と一致し、野生型マウスと比較して炎症の痕
跡もあった（図４ＡおよびＢ）。それに対して、ＲＫ３５で処置した初期段階ＳＯＤＧ９
３Ａマウス由来の腓腹筋（図４Ｃ）の萎縮は少量からゼロを示した（表４；平均スコア０
．３）。これらの結果は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスの疾患初期段階（生後８８日）における
脚骨格筋の萎縮がミオスタチン阻害により有意に減少することを示す筋肉量データを裏付
ける。
末期段階のＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の腓腹筋の調査により、中程度の筋萎縮がＰＢＳ
（表４；平均スコア３.０）およびＲＫ３５処置（表４；平均スコア３.３）（図４Ｅおよ
びＦ）群の双方において確認され、野生型筋肉では変性の徴候は見られなかった（図４Ｄ
）。これらの結果は筋肉量データに一致し、早期疾患におけるミオスタチン阻害の保護的
効果がＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて疾患末期まで続かないことが示される。
ＰＢＳ処置またはＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスのいずれかに由来する横隔膜の萎
縮は、８８日目の野生型マウスと比較して少量からゼロを示した（表４；平均スコア０．
６）。しかし、末期段階までに、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜において
軽度から中程度の萎縮が観察された（図４Ｈ；表４；平均スコア２．３）。それに対して
、疾患末期に分析された、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス由来の横隔膜は、ＰＢＳ処
置ＳＯＤＧ９３Ａ動物と比較して有意な萎縮の徴候を示さず（表４；図４Ｈおよび４Ｉを
比較）、日齢の合致する野生型マウス由来の横隔膜と類似した（図４Ｇ）。総合して、筋
肉量および組織学的評価は、疾患の末期段階を通じてＲＫ３５によるミオスタチン阻害が
横隔膜を保護するが、脚骨格筋の統合性は保護しないことを示す。
Figure 2012244998
腓腹筋および横隔膜筋における筋線維サイズの分析は同様のパターンを示した。８８日
の腓腹筋由来線維径測定の頻度分布は、野生型対照マウス（図５Ｃ）と比較してＳＯＤＧ
９３Ａマウスにおいてより小さい線維へのシフトを示す（図５Ａ）。ＲＫ３５処置ＳＯＤ
Ｇ９３Ａマウス由来線維径の分布（図５Ｂ）は、疾患の初期段階中の未処置ＳＯＤＧ９３
Ａマウスと野生型マウスとの間の中間である。しかし、末期段階までに、ＲＫ３５処置Ｓ
ＯＤＧ９３Ａマウスの腓腹筋の平均線維径はＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと有意な差
はなかった（データは示さず）。ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの
双方由来腓腹筋の平均線維径は、末期段階の野生型とは有意に異なり、組織診断により見
出された顕著な筋萎縮に一致する。野生型とＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスとの間の線
維サイズの有意差も末期段階の横隔膜筋において明白であった。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９
３Ａマウス由来横隔膜筋線維サイズは平均線維径の有意なシフトを示し、野生型とＰＢＳ
処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスとの間の中間のサイズ分布をもたらした（図５Ｄ）。
次に、ＳＯＤＧ９３Ａ発現の横隔膜筋の電気的活性への効果（図４Ｊおよび４Ｋ）を、
臨床上の発病に対応する時点のラットモデルを用いて調査した（約１１２日；Howland et
al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:1604-09）。ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａ
ラット群に対して示されたＥＭＧは、低密度のスパイク活性ならびに何らかの異常な自発
活性の存在を示す（図４Ｊ）。ＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットのスパイク活性
は、野生型ラットに見出されるものに類似し、異常な自発活性の形跡はなかった。図４Ｋ
に示されるように、トランスジェニックＳＯＤＧ９３Ａラット由来の横隔膜筋は、機能障
害を示すＥＭＧバーストスパイク比の統計上有意な低下を示した。それに対して、ＲＫ３
５で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットは、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａラットよりも有意に高
く、日齢の合致する野生型対照と有意差のないバーストスパイク比を示した。従って、Ｒ
Ｋ３５によるミオスタチン阻害は、横隔膜構造および横隔膜機能の双方を保護する際に効
果的であった。
実施例３．２．４：ミオスタチン阻害は前角の運動ニューロンの損失を遅らせる。
ＲＫ３５が脊髄の大型の運動ニューロンの損失を遅らせるかどうかを判定するため、Ｒ
Ｋ３５またはＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３ＡマウスおよびＰＢＳで処置した野生型マウ
スからのＬ３〜５マウス腰髄の大型の運動ニューロンをカウントした。カウントは、ＲＫ
３５処置の結果、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて筋肉量の増加、体重増加、握力増加およ
び筋肉組織病理の弱毒化がもたらされる時点である、１２週（８４〜９０日齢；平均８８
日）の脊髄で行った。この時点で、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて大型の運動ニューロン
の有意な損失があった（２５〜４０％）（Guo et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12:2519
-32; Sharp (2005) Neuroscience 130:897-910; Schutz et al. (2005) J. Neurosci. 25
:7805-12）。
ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス（図６Ｆ）における腰部の大型の運動ニューロンのカ
ウント（図６Ａ〜Ｄ）は、同腹仔野生型対照（図６Ｅ）と比較して有意に減少した。ＲＫ
３５処置は、疾患の初期段階（図６Ｇ）の運動ニューロンの損失をＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９
３Ａマウスと野生型マウスの中間のレベルまで低下させた。
疾患末期までに、腰部前角の大型の運動ニューロンの有意な損失ならびにグリオーシス
の増加は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて処置にかかわらず明らかであり（図６Ｉおよび
Ｊ）、野生型マウス（図６Ｈ）には対応する変化は示されなかった。
大型の運動ニューロンの全集団（３００μｍ2を超える面積）の立体解析学的カウント
により、野生型対照と比較したＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて２５％の運動ニ
ューロン損失の傾向が明らかとなった。ＲＫ３５で処置したマウスでは、運動ニューロン
損失を減速する傾向が観察された（ｐ＝０．０８）（図６Ａ）。変性の徴候（すなわち、
不規則な膜および空砲の存在）を示す運動ニューロンをカウントすることを避けるため、
目に見える核小体をもつ大型の運動ニューロンにカウントを制限すると、野生型対照マウ
ス（図６Ｂ）と比較して、ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける切片あたりの大型の
運動ニューロンの平均数は４０％減少し、ならびにＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤ
Ｇ９３Ａマウスの間の統計上の有意差がある（図６Ｂ）。しかし、総合して、図６Ａおよ
びＢに示される複合データは、１２週（８８日）齢間隔の、大型の運動ニューロンの損失
およびＲＫ３５処置のこの損失への効果の双方が比較的軽微であることを示す。
末期段階までに、ＲＫ３５処置およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの双方における
運動ニューロンカウントは、両方の分析方法で、野生型対照マウスと有意差があった（図
６ＣおよびＤ）。これらのデータは、疾患の初期段階に観察されたＲＫ３５に媒介される
改善点が末期段階で維持されない、上に示した骨格筋構造および機能に関するデータに一
致する。
実施例４
考察
ＡＬＳは、脊髄および脳幹の運動ニューロンが変性し、その後筋萎縮する、致死的かつ
進行性の疾患である。運動ニューロン細胞死に関与する機構には相当な関心が向けられて
きた。近年のいくつかの研究から、複数の細胞種が、神経筋接合部の細胞外微小環境にお
いて鍵となる因子の産生を制御することにより疾患の病因に関与し得ることが示唆されて
きた（Bruijn et al. (2004) Annu. Rev. Neurosci. 27:723-49）。キメラマウスを用い
る研究は、野生型非ニューロン細胞の存在が、変異ＳＯＤ１を発現している運動ニューロ
ンの生存を延長し得ることを示している（Clement et al. (2003) Science 302:113-17）
。これらの知見によって、生存に最適な微小環境を提供することによりニューロン変性を
遅くし得る治療法の調査を行うこととした。例えば、ＩＧＦ−１、ＧＤＮＦおよびＶＥＧ
Ｆを含む、ウイルスにより発現された増殖因子の筋肉内への投与は全て、ＳＯＤＧ９３Ａ
マウスモデルの生存を延長することが示されている（Kaspar et al. (2003) Science 301
:839-42; Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-17; Wang et al (2002) J. Neurosci.
22:6920-28）。さらに、ＳＯＤＧ９３Ａトランスジェニックマウスモデルにおいて、ＩＧ
Ｆ−１の筋肉特異的発現が、神経筋接合部を安定化し、運動ニューロンの生存を増強し、
疾患の発病および進行を遅延させることが示されており、筋肉への直接的な効果が疾病の
発病および進行に影響を与え得ることが示される（Dobrowolny et al. (2005) J. Cell.
Biol. 168:193-99）。筋肉代謝および運動ニューロンの脆弱性の変化はまた、ＡＬＳマウ
スにおいても報告されており、筋肉が疾患病態の能動的なドライバー(acrive driver)で
あり得るという仮説がさらに支持される（Dupois et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 101:11159-64）。
ミオスタチン、すなわちＧＤＦ−８は、筋肉成長の内因性の阻害剤であり、その生物学
的機能を、ＡｃｔｉｖｉｎＩＩｂ受容体（ＡｃｔＲＩＩｂ）の活性化により少なくとも一
部分誘発し、結果として筋芽細胞の増殖および分化を抑圧する(Langley et al. (2002) J
. Biol. Chem. 277:49831-40; Thomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:40235-43）。
抗ＧＤＦ−８中和抗体を用いるＧＤＦ−８機能の阻害は、健常成体マウスにおいて筋肉量
および強度を増強すること、ならびに筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいて機
能的改善をもたらすことが示されている（Whittemore et al. (2003) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 300:965-71; Bogdanovich et al. (2002) Nature 420:418-21）。運動ニ
ューロン疾患の進行における筋肉の役割をより理解するために、ＧＤＦ−８に対する新規
な中和抗体であり、既に記載された試薬よりも高い親和性で結合するＲＫ３５（ＪＡ１６
のＩＣ50が＞１００ ｎＭであるのに対して、ＲＫ３５のＩＣ50は３ ｎＭ；Whittemore e
t al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71; Bogdanovich et al. (2002
) Nature 420:418-21）を用い、その結果ＲＫ３５で処置した野生型マウスにおいて筋肉
量のより大きな増加がもたらされた（データは示さず）。
家族性ＡＬＳのＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットモデルにおいて、ＲＫ３５での処置
の結果、運動ニューロン疾患初期の間に体重増加ならびに筋肉量および強度の増加がもた
らされた。この疾患の初期とは、ＳＯＤＧ９３Ａマウスが握力評価により測定される有意
な筋肉強度の損失（Ligon et al. (2005) Neuroreport 16:533-36）および歩行異常（Woo
ley et al. (2005) Muscle Nerve 32:43-50）を示す日齢（生後５６〜８８日）と定義さ
れ、歩行異常は神経筋接合部の脱神経と同時に起こる（Frey et al. (2000) J. Neurosci
. 20:2534-42; Fischer et al (2004) Experimental Neurology 185:232-40）。ＲＫ３５
によるＧＤＦ−８阻害の結果起こる筋肉量増加は、試験した双方のげっ歯類モデルにおい
て、四頭筋筋肉において最も明白であったが、腓腹筋、前脛骨筋および横隔膜においても
顕著であった。後肢および前肢強度が対照と比較してＲＫ３５で処置したマウスにおいて
よりゆっくりと減少したように、これらの増加は、強度の増加と十分に相関した。ＲＫ３
５抗ＧＤＦ−８抗体での処置により誘導される筋肉量増加の程度は、ＧＤＦ−８遺伝子の
破壊のためのヘテロ接合マウスにおいて観察される筋肉量の２５％増加と規模において同
様であった（ＧＤＦ−８に関してヌルの同形接合体であるマウスからの筋肉量は野生型マ
ウスの筋肉量の約２倍である）（McPherron (1997) Nature 387:83-90）。
ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて生後約８４〜８８日で、ＳＯＤＧ９３Ａラットについて
約１１０日で、体重減少、歩行異常および麻痺をはじめとする、疾患の明白な徴候が明白
となった。ＲＫ３５処置は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスもラットのいずれにおいても生存を延
長させなかった。疾患の初期に抗ＧＤＦ−８処置に誘導されて増加した筋肉量および強度
は、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において歩行異常および四肢の麻痺の出現
を遅らせず（データは示さず）、脚筋肉量の増加も維持されなかった。
しかし、疾患の初期および末期双方の、媒体で処置したＳＯＤＧ９３Ａ対照と比較して
、ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットにおける横隔膜質量の有意な増加が見
出された。末期段階のＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜筋は、質量および組織
学的評価の双方で日齢の合致する野生型対照のものに相当した。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９
３Ａラットはまた、末期段階の横隔膜筋量の有意な増加を維持した。これらの形態学的変
化に一致して、未処置ＳＯＤＧ９３Ａラット由来の横隔膜の電気生理学的分析は、変異Ｓ
ＯＤ１の発現により筋肉機能の有意な阻害がもたらされること、およびＲＫ３５での処置
が横隔膜の筋肉機能を効果的に保護したことを示す。
この研究では、定義されたエンドポイント（有意な四肢の麻痺を示す、立ち直り反射試
験の不全）を、「末期段階」および安楽死の判定基準として用いた。従って、ＲＫ３５処
置により誘導された、増強された横隔膜筋質量、減少した萎縮、および改善された電気生
理学的機能が、栄養強化を施したげっ歯類に長期の寿命をもたらすかどうかは明確ではな
い。しかし、呼吸器機能不全がＡＬＳの患者の死亡の主な原因であるという事実を踏まえ
ると、これらの知見は重要である可能性がある（Lechtzin et al. (2002) Amyotroph. La
teral Scler. Other Motor Neuron Disord. 3:5-13）。横隔膜機能を増強するようにデザ
インされたＲＫ３５などの処置は、ＡＬＳ患者において機械に補助される呼吸の必要を遅
延させる可能性を有し得る。
ＲＫ３５によるＧＤＦ−８阻害は、疾患早期の腰髄において運動ニューロン損失に影響
を及ぼし得るが、多くの治療上の利益は見たところ疾患末期までに失われるようである。
これらのデータは、筋肉に直接作用する治療法は、おそらく栄養微小環境を調節すること
により筋肉に神経を分布する、運動ニューロンに利益を有し得ることを示すが、このアプ
ローチは疾患を遅延させるためには明らかに不十分である。これらの知見は、従って、Ｉ
ＧＦの筋肉特異的イソ型の発現の結果、ＳＯＤＧ９３Ａマウスモデルにおいて運動ニュー
ロンの損失を遅らせた、Ｄｏｂｒｏｗｏｌｎｙらの結果（(2005) J Cell. Biol. 168:193
-99）、およびＩＧＦ１の筋肉へのウイルス送達が疾患の初期段階の運動ニューロン損失
の低下をもたらしたＫａｓｐａｒらの結果（(2003) Science 301 : 839-42）に一致する
。Ｋａｓｐａｒら（（2003）、前掲）の知見に類似して、処置の運動ニューロン生存への
有益な効果は疾患末期を通じて維持されなかった。筋肉からの改善された栄養素補給は、
従って、ＳＯＤＧ９３Ａモデルにおける運動ニューロン損失を保護するためには不十分で
ある可能性がある。
要約すると、家族性ＡＬＳのマウスおよびラット双方のモデルにおいて、ミオスタチン
の阻害により筋肉量および強度の増強がもたらされ、それは疾患の初期を通じて維持され
るが末期段階までに失われる。ミオスタチン阻害は疾患の初期段階の骨格筋における変性
変化を遅くするが、麻痺の発病を遅延させず、立ち直り反射の不全で定義されるように生
存を延長させず、そしてまたミオスタチン阻害は有意に運動ニューロン損失を遅らせなか
った。しかし、未処置対照と比較して、抗ミオスタチン抗体で処置した動物の横隔膜筋に
おいて、形態学的および機能的差異の双方が疾患後期を通じて観察された。全体的に、本
明細書に提供されるデータは、ＲＫ３５での処置による筋肉の構築の有益な効果の可能性
を支持し、それは疾患過程の早期における増強された「患者の生活の質」に寄与し得る。
抗ＧＤＦ−８抗体が現在臨床開発中であることを考えると、このような臨床試薬を四肢お
よび横隔膜筋量の維持のためにＡＬＳに使用することは、さらなる調査をＡＬＳの処置の
ための多面的アプローチの要素として保証する。抗ＧＤＦ−８治療法とグルタミン酸アン
タゴニストリルゾールなどの既存薬物、または臨床開発に入っている最新の薬剤の組合せ
は、筋肉量の維持を助けることによる有効性のレベルを向上させるだけでなく、全体的な
患者の生活の質に有意な影響を与え得る。
実施例５
ＲＫ３５に対するエピトープのマッピング
ＧＤＦ−８に対する正確な抗体エピトープを位置づけるため、配列番号１に示される成
熟ＧＤＦ−８の全配列を表す４８種類の重複する１３残基のペプチドを、スポット合成技
術を用いてセルロース紙上で直接合成した（例えば、Molina et al. (1996) Peptide Res
. 9:151-55; Frank et al. (1992) Tetrahedron 48:9217-32）。ペプチドの重複は１１ア
ミノ酸であった。このアレイで、システインに起因する化学的混乱を減らすため、システ
イン残基をセリンに置換した。ポリエチレングリコールおよびＦｍｏｃ保護アミノ酸で修
飾されたセルロース膜をＡｂｉｍｅｄ社（Ｌａｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購
入した。β−アラニンスペーサーを結合することによりアレイを膜上に規定し、既に記載
されるように（Molina et al.、前掲；Frank et al.、前掲）、標準的なＤＩＣ（ジイソ
プロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）結合化学を用い
て、ペプチドを合成した。
Ａｂｉｍｅｄ ＡＳＰ ２２２ロボットを用いて活性化アミノ酸をスポットした。洗浄
および脱保護段階を手動で行い、最終の合成サイクルの後、ペプチドをＮ末端アセチル化
した。ペプチド合成の後、メタノール中で１０分間、およびブロッカー（ＴＢＳＴ（０．
１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）および１％（ｗ／ｖ） カゼインを含むＴｒｉ
ｓ−緩衝生理食塩水）中で１０分間、膜を洗浄した。次に、ブロッカー中、２.５μｇ／
ｍｌの抗ＧＤＦ−８抗体で１時間、穏やかに振盪しながら膜をインキュベートした。ブロ
ッカー中で１０分間３回洗浄した後、膜をＨＲＰ−標識二次抗体（ブロッカー中０．２５
μｇ／ｍｌ）で３０分間インキュベートした。次に、ブロッカーで各々３回１０分間、お
よびＴＢＳＴで各々２回１０分間、膜を洗浄した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅ
ｓｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）およびデジタルカメラ（Ａｌｐｈａｎａｎｏｔｅｃｈ Ｆｌｕ
ｏｒｏｍａｇｅｒ）を用いて結合抗体を可視化した。図７に示されるように、ＲＫ３５エ
ピトープはアミノ酸３０〜４０と８４〜９７との間のＧＤＦ−８の領域に位置し、特性決
定されたドメインをもつＴＧＦ−βファミリー受容体の同族体とのＧＤＦ−８受容体配列
の比較により予測されるように、ＧＤＦ−８ ２型受容体と相互作用することが推定され
る。
実施例６
ＲＫ３５抗体の特性決定
ＲＫ３５をコードする重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子を、抗体産生ハ
イブリドーマ細胞からクローン化し、アミノ酸配列を決定した。ＲＫ３５抗体の配列デー
タを用いて重鎖および軽鎖に最も近い生殖細胞系列配列を同定した。ＲＫ３５の軽鎖およ
び重鎖可変領域と、最も近いヒト生殖細胞系列配列との比較を図８に示す。適切な変異は
、適切な変異プライマーを用いる標準的な部位特異的変異誘発技術を用いてなされ得る。
次に、抗体の変異を配列解析により確認する。ヒト化ＲＫ３５の例となるアミノ酸配列は
、配列番号７（ＶＨ）および９（ＶＬ）に示され、双方とも当業者により容易に決定され
る核酸配列、例えば、配列番号６（ＶＨ）および８（ＶＬ）として示される核酸配列によ
ってコードされ得る。当業者であれば、ヒト化抗体のフレームワーク中の任意かつ／また
は全てのアミノ酸が、例えば、抗原結合フラグメントの立体構造を維持するために元のマ
ウスアミノ酸に変異し戻されることを理解する。抗体のＧＤＦ−８に対する親和性を維持
するために役立ち得る何らかの復帰変異を含む配列番号７（ＶＨ）および配列番号９（Ｖ
Ｌ）の限定されない例は、それぞれ配列番号２６および配列番号２７に示される。
キメラ抗体を作製するため、ＶＨ配列を、ヒトＦｃ受容体および補体成分との結合を減
少させる２つの点変異（Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ）を含むヒトＩｇＧ１をコードする
、ｐＥＤ６ ｈｕＩｇＧ１ ｍｕｔ発現ベクターにサブクローニングする（Morgan et al
. (1995) immunology 86:319-24; Shields et al (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604
）。ＲＫ３５のＶＬ配列は、ｐＥＤ６ κ発現ベクターにサブクローニングされ得る。Ｒ
Ｋ３５ＶＨおよびＶＬ配列を含む発現ベクターを、次にＣＯＳ−１細胞に共導入し、キメ
ラＲＫ３５抗体を馴化培地から精製する。
実施例７
筋障害の処置
ＧＤＦ−８の阻害剤、すなわちＧＤＦ−８アンタゴニスト、例えば、阻害抗体などは、
２型糖尿病、耐糖能異常、メタボリック症候群（例えば、シンドロームＸ）、インスリン
抵抗性（例えば、熱傷または窒素不均衡などの外傷性傷害により誘発される抵抗性）、お
よび脂肪組織障害（例えば、肥満症）などのＧＤＦ−８に関連する代謝障害の処置に有用
である。ＧＤＦ−８の阻害剤はまた、ＧＤＦ−８に関連する骨障害および筋障害、例えば
、ＡＬＳ、筋ジストロフィーおよび骨関節炎の処置に有用である。抗ＧＤＦ−８抗体およ
び本発明の抗体フラグメントは、被験体、例えば、ヒト被験体、好ましくは、ＡＬＳを患
っている被験体（疾患発病時）、または確立された代謝疾患または骨／筋障害を有する被
験体を処置するために用いることができる。ＧＤＦ−８に対する阻害抗体はまた、疾患の
重篤度および／または症状を予防および／または低下させるために用いることができる。
抗ＧＤＦ−８抗体および抗体フラグメントは、例えば、皮下に、頻繁には１日１回、低い
頻度では月１回投与されると予想される。処置持続期間は、約１月（またはそれ未満）か
ら数年の範囲である。
ヒトにおいて抗ＧＤＦ−８の臨床上の有効性を試験するため、ＡＬＳを患っているかそ
のリスクのある被験体を同定し、無作為に処置群に割り当てる。処置群には、プラセボ群
および抗体を（２またはそれ以上の群がある場合は異なる用量で）投与される１〜３また
はそれ以上の群が含まれる。個体は、体重、筋肉量、および握力の変化を評価するため、
将来的に、例えば、１月〜３年間経過観察される。処置を受ける個体は改善を示すことが
予想される。
好ましくは、１または複数の抗体の形態のＧＤＦ−８アンタゴニストは、唯一の活性化
合物として、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される。唯一の活性化
合物として、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される場合、投薬量は
、好ましくは、症状の重篤度および／または疾患の進行に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１０
０ｍｇ／ｋｇである。適切な有効量は、処置を行う医師により以下の限定されない範囲の
リスト：１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋ
ｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１
０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ/ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ
／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択され得る。例となる限定されな
い治療計画および起こり得る結果を表５に要約する。
Figure 2012244998
本明細書は、本明細書中に引用される参照文献の教示に照らして、最も完全に理解され
、それらの参照文献は全て、本明細書においてその全文が参照により本明細書に組み込ま
れる。明細書の中の実施形態は、本発明の実例を提供するものであり、本発明の範囲を制
限すると解釈されるべきではない。当業者は、多くのその他の実施形態が特許請求される
本発明により包含されること、ならびに明細書および実施例が単なる例とみなされること
を理解する。
ＲＫ３５抗ＧＤＦ−８抗体の特性決定を示すグラフである。Ａ．ビオチン化ＧＤＦ−８を用いるＥＬＩＳＡアッセイで測定した、ＲＫ３５抗体とＧＤＦ−８の直接結合。ＧＤＦ−８に対するＲＫ３５抗体の結合親和性（円）は４ｎＭと測定された。対照ＩｇＧは感知できる結合を示さず（正方形）。Ｂ．ＧＤＦ−８の高親和性受容体への結合に対するＲＫ３５抗体の効果。高親和性ＧＤＦ−８受容体を用いる競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢを用いてＲＫ３５のＧＤＦ−８阻害活性を測定した。ヒトＩｇＧ定常領域（Ｆｃ）と融合した固定化ヒトキメラタンパク質ＡｃｔＲＩＩＢとビオチン化ＧＤＦ−８の結合を、様々な濃度のＲＫ３５ｍＡｂ、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢまたは対照ＩｇＧの不在下（ひし形）または存在下で評価した。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ受容体（正方形）および無関係なマウスＩｇＧ（三角形）をそれぞれ陽性および陰性対照として用いた。ＲＫ３５（円）は、ビオチン化ＧＤＦ−８と固定化ＡｃｔＲＩＩＢの結合をＩＣ50 約２．５ｎＭで阻害した。Ｃ．ＧＤＦ−８に誘導されるシグナル伝達の阻害。ＴＧＦ−βプロモーター−ルシフェラーゼ融合遺伝子を発現している横紋筋肉腫細胞を、様々な濃度のＲＫ３５抗体の不在下（正方形）または存在下（円）、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８で処理した。ＲＫ３５は、ＧＤＦ−８によるルシフェラーゼ活性の誘導を用量反応的に低下させ、ＩＣ50は０．２ｎＭであった。バックグラウンド（ひし形）シグナルは、ＧＤＦ−８を加えずに測定した。 ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。ＲＫ３５処置（正方形）（ｎ＝１１）およびＰＢＳ処置（ひし形）（ｎ＝１１）トランスジェニックＳＯＤＧ９３ＡマウスならびにＰＢＳ処置同腹仔対照（野生型）マウス（三角形）（ｎ＝９）の体重。 ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。ＲＫ３５で処置した雄（円）および雌（三角形）ならびにＰＢＳ処置雄（正方形）および雌（ひし形）トランスジェニックＳＯＤＧ９３Ａラット（１群あたりｎ＝１０）の体重。 ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。ＲＫ３５およびＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３ＡならびにＰＢＳ処置同腹仔対照マウス（ｎ＝９〜１２）の疾患の初期段階の間の筋肉量。ＰＢＳで処置した８８日齢野生型マウス（黒色の棒）、ＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（白色の棒）、およびＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（灰色の棒）の腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋および横隔膜筋について湿重量を測定した。 ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。疾患の初期段階（約９５日）にＰＢＳ（白色の棒）またはＲＫ３５で処置した（灰色の棒）、ＳＯＤＧ９３Ａラットの筋肉量（１群あたりｎ＝７）。 ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。疾患の末期段階に（約１３４日）ＰＢＳで処置した野生型マウス（黒色の棒）、ＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（白色の棒）、およびＲＫ３５で処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（灰色の棒）の筋肉量。 ミオスタチンの阻害により、ＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットの双方において体重の増加および筋肉量の増加がもたらされることを示すグラフである。疾患の末期段階に（約１２８日）ＰＢＳ（白色の棒）またはＲＫ３５（灰色の棒）で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットの筋肉量。アスタリスク（＊）は、示された群間の統計上の（ｐ＜０．０５）差を表す。 ミオスタチン阻害がＳＯＤＧ９３Ａマウスおよびラットにおいて筋肉強度を高めることを示すグラフである。Ａ．ＰＢＳ処置野生型マウス（三角形）、およびＰＢＳ（ひし形）またはＲＫ３５（正方形）のいずれかで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける、年齢を関数とする後肢握力。後肢握力はキログラム（ｋｇ）で表す圧迫として表される。Ｂ．ＰＢＳ処置野生型マウス（三角形）、およびＰＢＳ（ひし形）またはＲＫ３５（正方形）のいずれかで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける、年齢を関数とする前肢握力。Ｃ．ＰＢＳで処置した野生型ラット（ＷＴ＋ＰＢＳ）、またはＰＢＳ（ＳＯＤ＋ＰＢＳ）もしくはＲＫ３５で処置した（ＳＯＤ＋ＲＫ３５）ＳＯＤＧ９３Ａラットにおける前肢握力。ラットに関して、測定は９５〜１１０日齢の間の、疾患の初期段階に対応する４週の間隔の間に行われた。前肢握力は、キログラム（ｋｇ）で表す張力として表される。アスタリスク（＊）は、示された群間の統計上の有意差を表す（ｐ＜０．０００１）。 ＳＯＤＧ９３Ａげっ歯類における筋肉構造および機能へのミオスタチン阻害の効果を示す。８８日目のマウスの内側腓腹筋のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、（Ａ）野生型または（Ｃ）ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスのいずれかと比較しても（Ｂ）ＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおいて有意な萎縮を示す。末期段階の（Ｅ）ＰＢＳ処置および（Ｆ）ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウス双方の内側腓腹筋のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、（Ｄ）野生型マウス腓腹筋と比較して、双方とも有意な筋萎縮および中央に位置する核（矢印）を示す。それぞれ末期段階の（Ｇ）ＰＢＳ処置野生型マウスおよび（Ｈ）ＰＢＳまたは（Ｉ）ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜のヘマトキシリンおよびエオシン染色。萎縮性筋線維の例に（「ａ」）で印をつける。パネルＨ中のアスタリスクは線維の分裂を表す。図示される棒は、パネルＡ〜Ｆでの５０μｍおよびパネルＧ〜Ｉでの２５μｍのスケールを表す。 パネルＪ：ＰＢＳで処置した野生型ラット（ＷＴ＋ＰＢＳ）またはＰＢＳ（ＳＯＤ＋ＰＢＳ）もしくはＲＫ３５（ＳＯＤ＋ＲＫ３５）で処置したＳＯＤＧ９３Ａラットの横隔膜筋から記録した、吸気バーストを示すＥＭＧの干渉パターン。パネルＫ：野生型ラットの横隔膜筋（ｎ＝４）、および媒体（ＰＢＳ、ｎ＝９）もしくはＲＫ３５（ｎ＝８）のいずれかで処置したＳＯＤＧ９３ＡラットのＥＭＧのバーストスパイク比（Ｈｚ）。アスタリスク（＊）は示された群間の統計上の有意差を表す（ｐ＜０．０５）。 ＲＫ３５処置による、ＳＯＤＧ９３Ａマウスにおける疾患の初期段階を通した腓腹筋の、さらに疾患末期を通した横隔膜の筋線維の直径の減少を示す。線維径を、８８日目のＰＢＳ処置（Ａ）およびＲＫ３５処置（Ｂ）ＳＯＤＧ９３ＡマウスならびにＰＢＳ処置野生型マウス（Ｃ）の腓腹筋での形態計測により測定した。ＡＮＯＶＡによる平均値は有意差があった（ｐ＜０．０００１）；Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定による対比較も有意であった（ｐ＜０．００１）。末期段階までに、ＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの腓腹筋において線維分布に有意差は観察されなかった（データは示さず）。Ｄ．日齢の合致する野生型対照マウスと比較した、末期段階のＰＢＳ処置およびＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜筋の線維の直径の分析。ＲＫ３５処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスの横隔膜筋は、末期段階のＰＢＳ処置ＳＯＤＧ９３Ａマウスと野生型対照マウスとの間の線維径分布の中間を示す。ＡＮＯＶＡによる平均値は有意差があった（ｐ＜０．０００１）；Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定による対比較も有意であった（ｐ＜０．００１）。１群につき３つの筋肉を分析した；Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて、少なくとも２００の線維の短径（minor axis）の最大直径の直線的測定を行った。線維径を２０μｍ間隔の値域ごとにまとめ、各筋肉群について頻度ヒストグラムを作成した。 脊髄の前角の運動ニューロン減少における抗ミオスタチン処置の効果を示す。日齢の合致する野生型マウス（ＷＴ＋ＰＢＳ）と比較した、ＰＢＳ（ＳＯＤ＋ＰＢＳ）またはＲＫ３５（ＳＯＤ＋ＲＫ３５）のいずれかで処置した疾患の初期段階（Ａ）および末期段階（Ｃ）のＳＯＤＧ９３Ａマウスの前角のＬ３〜５領域由来の大型の運動ニューロン（３００μｍ2より大きな領域）の立体解析学的解析が示される。ＲＫ３５処置は、疾患の初期段階（Ａ）における運動ニューロン減少の逆転傾向を示した（ｐ＝０．０８）。目に見える核小体をもつ大型の健常な運動ニューロンの個別計数を、日齢の合致する野生型マウスと比較した、ＰＢＳまたはＲＫ３５のいずれかで処置した、疾患の（Ｂ）初期段階および（Ｄ）末期段階のＳＯＤＧ９３Ａマウスからのニッスル染色切片Ｌ３〜５で行った。各切片に対して、双方の前角を計数し（１動物あたり合計２０前角）、データを前角あたりの大型運動ニューロンの平均数で表す。アスタリスク（＊）は、示された群間の統計上の有意差を表す（Ｐ＜０．００１）。 脊髄の前角の運動ニューロン減少における抗ミオスタチン処置の効果を示す。ニッスル染色前角切片の代表的な画像（拡大率２０倍）を、疾患初期（８８日）（Ｅ〜Ｇ）および末期段階（１３４日；Ｈ〜Ｊ）に解析した、ＰＢＳで処置した野生型マウス（ＥおよびＨ）、ＰＢＳで処置したＳＯＤＧ９３Ａマウス（ＦおよびＩ）、およびＲＫ３５で処理したＳＯＤＧ９３Ａマウス（ＧおよびＪ）について示す。棒は２００μｍのスケールを表す。 ＲＫ３５抗体に関するＧＤＦ−８のエピトープマッピングを示す。ＲＫ３５のＧＤＦ−８上の結合部位を、ヒトＧＤＦ−８の重複する１３アミノ酸ペプチドを用いて同定した。ＧＤＦ−８とのＲＫ３５接触部位を太字で示す。 ＲＫ３５の軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ、ＶＬおよびＶＨ）の、ヒト生殖細胞系列フレームワークＤＰＫ９およびＤＰ−４７それぞれとのアラインメント。ヒト化ＲＫ３５（ＨｕＲＫ３５）領域で変化しているマウスＲＫ３５のアミノ酸（ＭＲＫ３５）可変鎖はアスタリスク（＊）で示され、太字で表されている；ＲＫ３５の相補性決定領域は線で囲まれ、下線が引かれている。

Claims (34)

  1. ＧＤＦ−８と結合可能な単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１
    ０のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番
    号１３のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配
    列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列
    、配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸
    配列、およびそれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ
    酸配列を含む少なくとも１つの相補性決定領域を含む、単離ポリペプチド。
  2. ポリペプチドが単離抗体である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  3. 抗体が重鎖を含み、前記重鎖が第１、第２、および第３の相補性決定領域を含み、
    第１の相補性決定領域が、配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列、および配列番号２０の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    第２の相補性決定領域が、配列番号１１のアミノ酸配列、配列番号１１の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列、配列番号２１のアミノ酸配列、および配列番号２１の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
    第３の相補性決定領域が、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１２の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、および配列番号２２の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単
    離ポリペプチド。
  4. 重鎖が、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３の活性フラグメントのアミノ酸配列、
    配列番号７のアミノ酸配列、および配列番号７の活性フラグメントのアミノ酸配列からな
    る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
  5. 抗体が軽鎖を含み、前記軽鎖が第１、第２、および第３の相補性決定領域を含み、
    第１の相補性決定領域が、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１３の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列、および配列番号２３の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    第２の相補性決定領域が、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１４の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列、および配列番号２４の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
    第３の相補性決定領域が、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号１５の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列、および配列番号２５の活性フラグメ
    ントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単
    離ポリペプチド。
  6. 軽鎖が、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５の活性フラグメントのアミノ酸配列、
    配列番号９のアミノ酸配列、および配列番号９の活性フラグメントのアミノ酸配列からな
    る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
  7. 抗体が配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が配列番号３のアミノ酸配列
    を含む重鎖をさらに含む、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
  8. 抗体が配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が配列番号７のアミノ酸配列
    を含む重鎖をさらに含む、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
  9. 抗体が、インタクト抗体、二重特異性抗体、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、
    Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦＶフラグメント、およびＦｖフラグメントからなる
    群より選択される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
  10. 抗体がｄＡｂフラグメントである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の単離ポリペプ
    チド。
  11. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
  12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチド
    が調節配列と作動可能に連結されている、宿主細胞。
  13. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  14. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養する段階と、前記宿主細胞
    によって発現した抗体を回収する段階とを含む、抗体を産生する方法。
  15. 単離および精製された、請求項１４に記載の方法により産生した抗体。
  16. ＧＤＦ−８関連障害を処置、寛解、および／または予防するための医薬組成物であって
    、製薬上許容される担体と、請求項１に記載のポリペプチドおよび請求項１に記載のポリ
    ペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種類のＧ
    ＤＦ−８アンタゴニストとを含む、前記組成物。
  17. ＧＤＦ−８関連障害が、哺乳類患者における筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性
    または誘発性骨障害、脂肪疾患、グルコース代謝障害、およびインスリン関連障害からな
    る群より選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. ＧＤＦ−８関連障害が、筋ジストロフィー、ＡＬＳ、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、うっ血
    性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋肉消耗症候群、肥満症、２型糖尿病、耐糖能
    異常、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、栄養障害、早発性性腺機能不全、アンド
    ロゲン抑制、二次性副甲状腺機能亢進症、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、低骨量、ビタ
    ミンＤ欠乏症、および神経性食欲不振症からなる群より選択される、請求項１７に記載の
    医薬組成物。
  19. ＧＤＦ−８関連障害がＡＬＳである、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 治療上有効量のＧＤＦ−８アンタゴニストを、治療を必要とする哺乳類患者へ投与する
    ことを含む、ＧＤＦ−８関連障害を処置、寛解、および／または予防する方法。
  21. 治療上有効量のＧＤＦ−８アンタゴニストが、毒性がほとんどないかまたは無毒である
    、請求項２０に記載の方法。
  22. ＧＤＦ−８アンタゴニストが、請求項１に記載のポリペプチドおよび請求項１に記載の
    ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、請求項２１に記
    載の方法。
  23. ＧＤＦ−８関連障害が、哺乳類患者における筋障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性
    または誘発性骨疾患、脂肪疾患、グルコース代謝障害、およびインスリン関連障害からな
    る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. ＧＤＦ−８関連障害が、筋ジストロフィー、ＡＬＳ、筋萎縮、器官萎縮、虚弱、うっ血
    性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋肉消耗症候群、肥満症、２型糖尿病、耐糖能
    異常、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、栄養障害、早発性性腺機能不全、アンド
    ロゲン抑制、二次性副甲状腺機能亢進症、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、低骨量、ビタ
    ミンＤ欠乏症、および神経性食欲不振症からなる群より選択される、請求項２３に記載の
    方法。
  25. ＧＤＦ−８関連障害がＡＬＳである、請求項２４に記載の方法。
  26. 患者がＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを診断または検知する方法であって、
    （ａ）第１のサンプルを関心対象の患者から得る段階と；
    （ｂ）第１のサンプルと請求項２に記載の抗体を接触させる段階と；
    （ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｄ）ＧＤＦ−８関連障害に罹患していない個体から第２のサンプルを得る段階と；
    （ｅ）第２のサンプルと前記抗体を接触させる段階と；
    （ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階とを含み、第２
    のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似
    が、患者がＧＤＦ−８関連障害を患っているかどうかを示す、方法。
  27. ＧＤＦ−８関連障害の重篤度をモニターする方法であって、
    （ａ）第１の時点でＧＤＦ−８関連障害に罹患している患者から採取した第１のサンプル
    を得る段階と；
    （ｂ）第１のサンプルと請求項２に記載の抗体を接触させる段階と；
    （ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｄ）第２の時点で患者から採取した第２のサンプルを得る段階と；
    （ｅ）第２のサンプルと前記抗体を接触させる段階と；
    （ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階とを含み、第１
    のサンプルと比較した第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似
    が、ＧＤＦ−８関連障害の重篤度が変化したかどうかを示す、方法。
  28. ＧＤＦ−８関連障害がＡＬＳであり、第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの低下が
    、ＡＬＳの重篤度が低下したことを示す、請求項２７に記載のモニターする方法。
  29. ＧＤＦ−８関連障害の重篤度をモニターする方法であって、
    （ａ）ＧＤＦ−８関連障害に罹患している患者から第１のサンプルを得る段階と；
    （ｂ）第１のサンプルと請求項２に記載の抗体を接触させる段階と；
    （ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｄ）ＧＤＦ−８関連障害に罹患していない個体から第２のサンプルを得る段階と；
    （ｅ）第２のサンプルと前記抗体を接触させる段階と；
    （ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階とを含み、第２
    のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似
    が、ＧＤＦ−８関連障害の重篤度が変化したかどうかを示す、方法。
  30. ＧＤＦ−８関連障害がＡＬＳであり、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧ
    ＤＦ−８のレベルの低下または類似が、ＡＬＳの重篤度が低下したことを示す、請求項２
    ９に記載のモニターする方法。
  31. 患者がＧＤＦ−８関連障害を発症する可能性を予知する方法であって、
    （ａ）第１の時点で関心対象の患者から採取した第１のサンプルを得る段階と；
    （ｂ）第１のサンプルと請求項２に記載の抗体を接触させる段階と；
    （ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｄ）第２の時点で患者から採取した第２のサンプルを得る段階と；
    （ｅ）第２のサンプルと前記抗体を接触させる段階と；
    （ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階とを含み、第２
    のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似が、患者がＧＤＦ−８関連
    障害を発症する可能性を示す、方法。
  32. ＧＤＦ−８関連障害がＡＬＳであり、第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加が
    、患者がＡＬＳを発症する可能性の増加を示す、請求項３１に記載の予知方法。
  33. 患者がＧＤＦ−８関連障害を発症する可能性を予知する方法であって、
    （ａ）第１のサンプルを関心対象の患者から得る段階と；
    （ｂ）第１のサンプルと請求項２に記載の抗体を接触させる段階と；
    （ｃ）第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｄ）ＧＤＦ−８関連障害に罹患していない個体から第２のサンプルを得る段階と；
    （ｅ）第２のサンプルと前記抗体を接触させる段階と；
    （ｆ）第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを測定する段階と；
    （ｇ）第１および第２のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルを比較する段階とを含み、第２
    のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧＤＦ−８のレベルの増加、低下、または類似
    が、患者がＧＤＦ−８関連障害を発症する可能性を示す、方法。
  34. ＧＤＦ−８関連障害がＡＬＳであり、第２のサンプルと比較した第１のサンプル中のＧ
    ＤＦ−８のレベルの低下または類似が、患者がＡＬＳを発症する可能性の低下を示す、請
    求項３３に記載の予知方法。
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