CN103450359A - 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途 - Google Patents

抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗GDF-8的拮抗剂抗体以及在ALS和其他GDF-8-相关病症治疗中的用途。具体地，本申请提供了与生长和分化因子-8（GDF-8）有关的新分子，尤其是小鼠和人源化的抗体以及抗体片段，包括在体外和/或体内抑制GDF-8活性和信号的那些。本申请还提供了用于诊断、治疗、改善、预防、预测或监测肌肉、骨和胰岛素代谢等等，尤其是肌萎缩性侧索硬化（ALS）退化等级的方法。此外，本申请提供利用本发明的抗体、多肽、多核苷酸和载体用于所述病症治疗的药物组合物。

Description

抗GDF-8的拮抗剂抗体以及在ALS和其他GDF-8-相关病症治疗中的用途
本申请是申请日为2006年8月14日的中国专利申请200680039173.8“抗GDF-8的拮抗剂抗体以及在ALS和其他GDF-8-相关病症治疗中的用途”的分案申请。 
本申请要求2005年8月19日提交的美国临时专利申请No.60/709,704的优先权其内容再次通过引用整体引入。 
关于联邦赞助研究的声明 
本发明在美国政府支持下由国立卫生研究院(R01 GM-48661和R01GM-56707)资助完成。政府对本发明具有一定的权利。 
技术领域
本发明的技术领域涉及生长和分化因子-8(GDF-8)拮抗剂，尤其是GDF-8的抗体，例如小鼠、人和人源化的抗体及其片段，尤其是在体外和/或体内抑制GDF-8活性的那些。该领域进一步涉及治疗、改善、预防、预后或监测GDF-8-相关病症，例如肌肉病症，神经肌肉病症，骨退化病症，代谢性或诱发性骨病症，脂肪病症，葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关的病症，尤其是肌萎缩性侧索硬化症(“ALS”)。 
背景技术
生长和分化因子-8(GDF-8)亦称抑肌素(myostatin)，为分泌蛋白并且是结构相关生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员。本超家族成员具有生长调节和形态发生的性质(Kingsley等(1994)Genes Dev.8：133-46；Hoodless等(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.228：235-72)。人GDF-8以形成同型二聚体复合物的375个氨基酸的前体蛋白合成。在加工期间，称为”潜伏相关肽”(LAP)的氨基-末端前肽被裂解并且可以保持非共价结合至该同型二聚体，形成命名为”小潜伏复合物”的无活性复合物(Miyazono等(1988)J.Biol.Chem.263：6407-15； Wakefield等(1988)J.Biol.Chem.263：7646-54；Brown等(1999)Growth Factors3：35-43；Thies等(2001)Growth Factors18：251-59；Gentry等(1990)Biochemistry 29：6851-57；Derynck等(1995)Nature316：701-05；Massague(1990)Ann.Rev.Cell Biol.12：597-641)。诸如卵泡抑素的蛋白质和其相关蛋白也结合成熟的GDF-8同型二聚体并且抑制GDF-8的生物学活性(Gamer等(1999)Dev.Biol.208：222-32)。 
来自不同物种的推断的GDF-8氨基酸序列的比对表明GDF-8为高度保守的(McPherron等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12457-61)。人、小鼠、大鼠、猪和鸡GDF-8的序列在C-末端区域100％相同，而狒狒、牛和羊的GDF-8在C-末端仅仅3个氨基酸不同。物种之间高度的GDF-8保守性提示GDF-8具有重要的生理功能。 
已表明GDF-8通过抑制成肌细胞和卫星细胞的增殖和分化而在肌肉发育和体内平衡的调控中起着重要的作用(Lee和McPherron1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9：604-07；McCroskery等(2003)J.Cell.Biol.162：1135-47)。其在发育骨骼肌早期表达，并且继续在成年骨骼肌中表达，优先在快肌(fast twitch)类型中。另外，GDF-8在成年小鼠中过表达引起明显的肌肉萎缩(Zimmers等(2002)Science296：1486-88)。此外，已表明使得GDF-8基因无活性的天然突变导致动物和人中的肥大和增生(Lee和McPherron(1997)上文)。例如，GDF-8敲除转基因小鼠以骨骼肌的明显肥大和增生以及改变的皮质骨结构为特征(McPherron等(1997)Nature387：83-90；Hamrick等(2000)Bone27：343-49)。类似的骨骼肌质量的增加在天然GDF-8突变的牛中也很明显(Ashmore等(1974)Growth38：501-07；Swatland等(1994)J.Anim.Sci.38：752-57；McPherron等，上文；Kambadur等(1997)Genome Res.7：910-15)。此外，不同的研究表明提高的GDF-8表达与HIV-诱发的肌肉损耗有关(Gonzalez-Cadavid等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：14938-43)。GDF-8还参与肌肉-特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生以及成肌细胞的增殖(WO00/43781)。 
除了其生长调节和形态发生的性质之外，认为GDF-8参与许多其他的生理学过程，包括2型糖尿病发展期间葡萄糖的体内平衡、葡萄糖耐量减低、代谢性综合症(即涉及一组健康状况(可包括胰岛素抵抗、腹部肥胖、脂血异常、高血压、慢性炎症、血栓前状态等等)同时发生的 综合症，例如X综合症，，其使得人处于2型糖尿病和/或心脏病的高风险中)、胰岛素抵抗(例如，通过诸如烧伤或氮失衡的外伤诱发的抵抗)以及脂肪组织病症(例如肥胖、脂血异常、非酒精性脂肪肝疾病等等。)(Kim等(2000)Biochem.Biophys.Res.Comm.281：902-06)。 
人和动物的许多病症与功能受损的肌肉组织有关，例如肌萎缩性侧索硬化症(“ALS”)、肌营养不良症(“MD”；包括Duchenne’s肌营养不良)、肌肉萎缩症、器官萎缩症、虚弱、充血梗阻性肺病(COPD)、肌肉减少症、恶病质和由其他疾病和病情引起的肌肉损耗综合症。目前，几乎没有可靠的或有效的治疗用于治疗这些病症。这些疾病的病理学表明GDF-8信号作为靶标在这些疾病的治疗中的潜在作用。 
ALS是以中枢神经系统退化和肌肉萎缩为特征的晚期发病和致死的神经退行性疾病。ALS通常以步态异常和不灵巧开始，并且随后发展至四肢和隔肌麻痹。虽然ALS的大多数病例为突发的并且病原不明，已表明5-10％的病例由显性家族性(FALS)遗传引起。大约10-20％的FALS病例归因于Cu/Zn过氧化物歧化酶(SOD1)基因的突变(Bruijn等的综述(2004)Ann.Rev.Neurosci.27：723-49)。SOD1为催化过氧化物为过氧化氢和二价氧反应的异源二聚体金属-蛋白，并且由于SOD1的损失并不引起运动神经元疾病(Reaume等(1996)Nat.Genet.13：43-47)，其被认为通过毒性的功能获得而诱导疾病(Bruijn等的综述，上文)。SOD1-诱发的神经元细胞死亡的特定机制并不清楚，并且可能涉及轴突运输的改变、对错误折叠蛋白的细胞应答、线粒体机能障碍和兴奋毒性(Bruijn等，上文)。 
ALS中观察到的运动神经元退化可能通过多个机制发生，包括营养因子被运动神经元的摄取或运输破坏(Holzbaur的综述(2004)Trends Cell Biol.14：233-40)。因此，ALS可通过经提供最适的生存环境而复原退行神经元的疗法而治疗。神经环境包括非神经元细胞，例如由运动神经元神经支配的的神经胶质和肌细胞。该环境提供营养和生长因子，其由神经元内化并且经逆行性轴突运输而运输至细胞体(Chao(2003)Neuron39：1-2；Holzbaur，上文)。 
FALS已在小鼠和大鼠中通过突变体SOD1的过表达而模式化(Howland等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：1604-09)。过表达G93A型突变体SOD1的转基因小鼠在90至100天龄时呈现肌肉虚弱 和萎缩，并且通常在130天龄左右死亡(Gurney等(1994)Science264：1772-75)。然而，下面的SODG93A-诱发的病理(包括握力虚弱和神经肌肉连接损失)，早在50天龄时就很明显(Frey等(2000)J.Neurosci.20：2534-42；Fisher等(2004)Exp.Neuro.185：232-40；Ligon等(2005)NeuroReport 16：533-36；Wooley等(2005)Muscle Nerve32：43-50)。表达SODG93A突变的转基因大鼠遵循类似的退化时程(Howland等，上文)。最近的工作提示了病变的发展并不是细胞自主的，与ALS中观察到的运动神经元退化通过多种机制发生的假设一致，其包括营养因子被运动神经元摄取和运输的破坏(参见如上)。Clement和合作者已使用嵌合小鼠表明野生型非神经元细胞可以延长表达突变体SOD1的运动神经元的生存(Clement等(2003)Science302：113-17)。这些观察引导了可能通过提供最适的生存微环境而延缓神经元退化的疗法的研究。例如，SODG93A小鼠通过直接肌内注射由病毒表达的生长因子(包括IGF-1、GDNF和VEGF)的治疗延长了动物的生存(Kaspar等(2003)Science301：839-42；Azzouz等(2004)Nature429：413-17；Wang等(2002)J.Neurosci.22：6920-28)。此外，局部IGF-1-特异的异构型(mIGF-1)的肌肉-特异性表达稳定神经肌肉连接，增强运动神经元的生存并且延缓SODG93A转基因小鼠模型中疾病的发作和发展，表明对肌肉的直接作用可以影响转基因SOD1动物中疾病的发作和发展(Dobrowolny等(2005)J.Cell Biol.168：193-99)。在ALS小鼠中还报道了肌肉代谢亢进和运动神经元易损性之间的联系，其支持肌肉中的缺陷可能与疾病病因有关的假设(Dupois等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：11159-64)。因此，增强肌肉生长定当提供运动神经元提高的局部支持，并且因此产生治疗益处。 
抑肌素表达的抑制导致肌肉肥大和增生(Lee和McPherron，上文；McPherron等，上文)。抑肌素在损伤后负调节肌肉再生，并且GDF-8基因敲除小鼠中抑肌素的缺乏导致加速的肌肉再生(McCroskery等(2005)J.Cell.Sci.118：3531-41)。抑肌素-中和抗体提高野生型小鼠(Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300：965-71)和用于肌营养不良模型的mdx小鼠(Bogdanovich等(2002)Nature420：418-21；Wagner等(2002)Ann.Neurol.52：832-36)的体重、骨骼肌质量以及骨骼肌的肌肉大小和力量。此外，这些小鼠中的抑肌素抗体降 低对隔肌(其也是ALS发病期靶向的肌肉)的破坏。已假设生长因子(例如HGF)对肌肉的作用可能由于抑肌素表达的抑制(McCroskery等(2005)，上文)而有助于在再生和退化之间以积极的方向转变“推进和牵拉”或平衡。因此，GDF-8抑制以治疗ALS、肌营养不良(MD)和其他的GDF-8-相关病症(例如神经肌肉病症)的潜在药理学靶标存在，对这些病症需要增强肌肉质量质量、力量、大小等等。利用ALS动物模型(小鼠和大鼠)，有可能在两种不同的物种中检测疗法，由此提高人体内治疗作用的把握。 
除了人的神经肌肉病症之外，还存在生长因子-相关的病情，其与例如骨质疏松症和骨关节炎的骨损失有关，其主要影响老年人和/或绝经后的妇女。此外，代谢性骨疾病和病症包括由于长期糖皮质激素疗法、早期性腺衰竭、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食造成的较低骨质量。虽然许多用于这些病情的当前疗法通过抑制骨吸收而起作用，促进骨形成的疗法将是有效的替代治疗。因为GDF-8在骨发育以及肌肉发育中起作用，GDF-8的调控对骨-退行性病症的治疗也是极好的药理学靶标。 
因此，存在对开发化合物和治疗方法的需求，其促进尤其在人中，并且尤其在患有ALS和其他肌肉-损耗疾病以及骨-退行性病症的那些人中肌肉质量和/或力量和/或骨密度等等的整体加强。生产具有对GDF-8增强的亲和力的中和抗体和其他小分子是治疗这些病症的极好的药理学方法。 
发明内容
本发明的GDF-8拮抗剂涉及抗体(例如完整的抗体和其抗原结合片段)，其在此指“抗-GDF-8抗体”或“GDF-8抗体”。在一个实施方案中，抗-GDF-8抗体降低、中和和/或拮抗至少一种GDF-8-相关的活性(即“GDF-8活性”)。本发明因此提供利用这些抗-GDF-8-抗体治疗与GDF-8活性有关的各种骨、肌肉、葡萄糖和脂肪病症的方法。本发明公开了GDF-8拮抗剂，例如GDF-8抗体在用于治疗患有ALS的动物时为高度有效的疗法，以及所述抗体的给药降低ALS病变期间肌肉靶标(例如隔肌、腓肠肌等等)的损耗。此外，本发明公开了这些拮抗剂对于患有ALS的动物增强肌肉质量和握力是高度有效的。因此，本发明教导了抗 -GDF-8抗体为治疗GDF-8-相关病症，例如ALS、肌肉损耗病症或由GDF-8调节异常引起的其他病症的有效成分。 
在一个方面，本发明的特征为治疗(例如治愈、抑制)、改善或预防(例如延缓或预防发作、复发或反复)患者中GDF-8-相关病症的方法。该方法包括：给予患者足以治疗或预防GDF-8-相关病症量的GDF-8拮抗剂，例如抗-GDF-8抗体。GDF-8拮抗剂，例如抗-GDF-8抗体可以单独或与此处所述的其他治疗方法结合给予患者。GDF-8抗体可以治疗性地、预防性地或同时治疗并预防性地给予。在一个实施方案中，患者为哺乳动物，例如患有GDF-8-相关病症，包括例如骨和肌肉病症的人。优选地，患者为人。更优选，患者为患有此处所述的GDF-8-相关病症的人。 
在一个实施方案中，本发明提供用于诊断、预后、监测、筛查、治疗、改善和/或预防GDF-8-相关病症的安全且有效的治疗方法，相关病症例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨-退行性病症、代谢性或诱发的骨病症、脂肪病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症，其包括但不限于，葡萄糖体内平衡、2型糖尿病、葡萄糖耐受性减低、代谢综合症(即涉及一组健康状况(其可能包括胰岛素抵抗、腹部肥胖、脂血异常、高血压、慢性炎症、血栓前状态等等)同时发生的综合症，其使得人处于2型糖尿病和/或心脏病的高风险中)、胰岛素抵抗(例如通过创伤(例如烧伤或氮不平衡)诱发的抵抗)、脂肪组织病症(例如肥胖、脂血异常、非酒精性脂肪肝疾病等等)、HIV-诱发的肌肉损耗、肌营养不良(包括Duchenne’s肌营养不良)、肌萎缩性侧索硬化(“ALS”)、肌肉萎缩、器官萎缩、虚弱、充血梗阻性肺病、骨骼肌减少症、恶病质、肌肉损耗综合症、骨质疏松症、骨关节炎、代谢性骨疾病和代谢性骨病症(包括由于长期的糖皮质激素疗法、早期性腺衰竭、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食造成的低骨质量)。在优选但非限制性的实施方案中，本发明提供用于在脊椎动物，尤其是哺乳动物且更尤其是人中诊断、预后、监测、筛查、治疗、改善和/或预防GDF-8-相关病症(例如肌肉病症)的安全且有效的治疗方法。本发明最优选的实施方案中，诊断、预后、监测、筛查、治疗、改善和/或预防的GDF-8-相关病症，例如肌肉病症为ALS。 
在另一实施方案中，本发明提供体内或体外抑制GDF-8功能的方法。这些方法可用于治疗GDF-8-相关病症，例如肌肉和骨骼退行性病症， 尤其是肌肉病症例如ALS，并且可用于增强肌肉质量和/或骨力量和/或密度。该方法也可用于增强正常动物，包括但不限于人中的肌肉质量和骨密度。本方法可用于活体外(例如无细胞体系中、培养物中等等)、体外或体内。例如，GDF-8受体-表达细胞可在培养基中体外培养并且与此处所述的诸如一种或多种抗-GDF-8抗体接触。或者，该方法可在患者的细胞上进行，例如作为体内(例如治疗性的或预防性的)方案的一部分。 
因此，在一个方面，本发明的特征为GDF-8拮抗剂，例如与GDF-8相互作用(例如结合)和中和和/或抑制它的分离的抗体。特别地，由GDF-8抗体结合的GDF-8蛋白为哺乳动物例如人、绵羊、非人灵长类的GDF-8。在另一实施方案中，本发明提供以高亲和力，例如以至少10-7M，优选10-8、10-9、10-10，更优选10-11M或更高的Kd结合GDF-8的抗体。抗-GDF-8抗体的亲和力和结合动力学可利用一些熟知的方法检测，例如生物传感器技术(Biacore，Piscataway，NJ)。 
在一个实施方案中，抗-GDF-8抗体(例如完整的抗体或抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段))为单克隆抗体。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的或体外-产生的抗体。在优选而非限制性的实施方案中，本发明的抗-GDF-8抗体为人源化抗体。 
这些抗-GDF-8抗体可用于诊断、预后、监测、筛查、治疗、改善和/或预防肌肉、骨骼、脂肪和葡萄糖代谢-相关病症。抗-GDF-8抗体的非限制性实例在此称为“RK35”，并且包括小鼠和修饰的抗体，例如嵌合或人源化形式。小鼠RK35重链可变区的核苷酸和氨基酸序列在此分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。人源化RK35重链可变区的核苷酸和氨基酸序列在此分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。小鼠RK35轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列在此分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。人源化RK35轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列在此分别为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。 
在本发明优选而非限制性的实施方案中，抗体为GDF-8的小鼠或人源化抗体。本发明更优选的实施方案中，抗体由SEQ ID NO：3的VH(可变重链)结构域和SEQ ID NO：5的VL(可变轻链)组成。本发明的另一个优选实施方案中，抗体由SEQ ID NO：7的VH结构域和SEQ ID NO：9的VL结构域组成。本发明另外的实施方案包括列于表1的一个 或多个VH或VL结构域。 
本发明的其他实施方案包括RK35的H3片段，即SEQ ID NO：12所述的序列。又一个实施方案中，GDF-8拮抗剂包括具有选自SEQ ID NO：10-12和20-22序列、来自此处公开抗体重链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)。又一个实施方案中，本发明的拮抗剂包括具有选自SEQ ID NO：13-15和23-25序列、来自此处公开抗体轻链可变区的一个、两个或三个CDR。又一个实施方案中，该抗体包括具有选自SEQ ID NO：10-15和20-25序列的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。 
本发明的抗-GDF-8抗体的重链和轻链可以是全长的(例如抗体可包括至少一个，并且优选两个全长重链，以及至少一个，并且优选两个全长轻链)或可以包括抗原-结合片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(“scFv”))。其他的实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，尤其选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更尤其是IgG1(例如人IgG1)。在另一实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，尤其是κ(例如人κ)。在一个实施方案中，恒定区改变(例如突变)以改变抗体的性质(例如提高或降低一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数目、效应细胞功能或补体功能)。例如，人IgG1恒定区可在一个或多个残基处突变，例如SEQ ID NO：19的117和120残基的一个或多个。在一个实施方案中，抗-GDF-8抗体包括在SEQ ID NO：19所示的人IgG1恒定区。在另一实施方案中，抗-GDF-8抗体包括人κ序列，例如SEQ ID NO：17所示的序列。 
在另一实施方案中，本发明提供GDF-8抗体作为结合GDF-8并且保留中和或降低GDF-8活性能力的新的抗体片段。在本发明优选而非限制性的实施方案中，抗体片段选自由dAb片段、双链抗体(diabody)、Fd片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFV片段和Fv片段组成的组。本发明更优选的实施方案中，抗体片段由选自SEQ ID NO：2、4、6或8的多核苷酸编码。本发明另一个优选实施方案中，抗体片段包括选自SEQ ID NO：10-15和20-25所述氨基酸序列的氨基酸序列。另一个优选实施方案中，本发明提供序列与列于表1中的那些序列不同(例如由于遗传密码的冗余)，然而保留结合GDF-8以及中和或降低GDF-8活性能力 的新的抗体片段。 
在另一实施方案中，抗-GDF-8抗体包括至少一个、两个、三个或四个具有列于表1(VH的SEQ ID NO：3或7，和/或VL的SEQ ID NO：5或9)的氨基酸序列或与其基本上相同的序列(例如与SEQ ID NO：3、5、7或9至少约85％、90％、95％、99％或以上相同，或与之相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的序列)的抗原-结合区域，例如可变区。在另一实施方案中，抗体包括由具有列于表1(VH的SEQ ID NO：2或6和/或VL的SEQ ID NO：4或8)的核苷酸序列的核酸，或与其基本上相同的序列(例如与SEQ ID NO：2、4、6或8至少约85％、90％、95％、99％或以上相同，或与之相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列)编码的VH和/或VL结构域。又一个实施方案中，抗体包括来自重链可变区、具有列于表1(SEQ ID NO：10-12和20-22)的氨基酸序列或与其基本上同源的序列(例如与之至少约85％、90％、95％、99％或以上相同和/或具有一个或多个取代，例如保守取代的序列)的一个、两个或三个CDR。又一个实施方案中，抗体包括来自轻链可变区、具有列于表1(SEQ ID NO：13-15和23-25)的氨基酸序列或与其基本上同源的序列(例如与之至少约85％、90％、95％、99％或以上相同和/或具有一个或多个取代，例如保守取代的序列)的一个、两个或三个CDR。又一个实施方案中，抗体包括来自重链和轻链可变区的、具有列于表1(VH CDR的SEQ ID NO：10-12和SEQ20-22；VL CDR的SEQ ID NO：13-15和23-25)的氨基酸序列或与其基本上同源的序列(例如与之至少约85％、90％、95％、99％或以上相同和/或具有一个或多个取代，例如保守取代的序列)的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。 
在另一实施方案中，抗-GDF-8抗体包括人IgG1恒定区，其具有SEQ ID NO：19所述的氨基酸序列或与其基本上同源的序列(例如与SEQ ID NO：19至少约85％、90％、95％、99％或以上相同，或与之相差不超过1、2、5、10、50或100个氨基酸残基的序列)。在另一实施方案中，抗-GDF-8抗体包括人κ恒定链，例如具有SEQ ID NO：17所述氨基酸序列或与其基本上同源的序列(例如与SEQ ID NO：17至少约85％、90％、95％、99％或以上相同，或与之相差不超过1、2、5、10、50或100个氨基酸残基的序列)的人κ恒定链。又一个实施方案中， 抗体包括此处所述的人IgG1恒定区和人κ恒定链。 
在优选而非限制性的实施方案中，本发明提供由SEQ ID NO：2、4、6或8所述多核苷酸编码的抗体。另一个优选实施方案中，本发明提供由在严谨条件下与SEQ ID NO：2、4、6或8所述多核苷酸杂交的多核苷酸序列编码的抗体。另一个优选实施方案中，本发明提供由不同于SEQ ID NO：2、4、6或8所述的序列，但由于遗传密码的简并性而编码SEQ ID NO：3、5、7、9或10-15所述氨基酸序列的多核苷酸编码的抗体。 
GDF-8拮抗剂，例如抗-GDF-8抗体，可衍生或连接至另一个功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(例如Fab片段)。例如，融合蛋白或抗体或抗原-结合部分可功能性地连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他)至一个或多个其他分子体，例如其中的抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞生长抑制剂。 
本发明又一方面提供作为GDF-8拮抗剂的纯化和分离的核酸，其编码GDF-8拮抗剂，例如本发明的GDF-8抗体。在一个实施方案中，本发明提供由编码列于表1的VH(SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7)、VL(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9)和/或CDR(SEQ ID NO：10-15和20-25)的序列组成的多核苷酸。在另一实施方案中，本发明提供在严谨条件下杂交至编码列于表1的VH、VL或CDR(SEQ ID NO：3、5、7、9、10-15或20-25)的核酸的多核苷酸。在另一实施方案中，本发明提供包括SEQ ID NO：2、4、6或8或SEQ ID NO：2、4、6或8的片段的核酸。另一个实施方案中，本发明提供在严谨条件下与SEQ ID NO：2、4、6或8杂交的多核苷酸。本发明另一个方面提供包括本发明多核苷酸作为GDF-8拮抗剂的宿主细胞和载体。 
本发明的抗体具有许多有用的性质。第一，该抗体能够以高亲和力结合成熟的GDF-8。第二，公开的抗体抑制体外和体内的GDF-8活性。第三，公开的抗体抑制与骨骼肌质量和骨骼密度负调节有关的GDF-8活性。第四，公开的抗体为用于肌肉病症，尤其是ALS的有效治疗。这些抗体具有许多另外的用途，包括诊断、预后、监测、筛查、治疗、改善和/或预防GDF-8-相关病症，例如肌肉和/或骨骼-相关病症。 
本发明的其他方面提供由本发明的GDF-8拮抗剂，例如本发明的抗 -GDF-8抗体组成的组合物，以及所述组合物抑制或中和动物，尤其患有肌肉病症(例如ALS)的人或动物中GDF-8中的用途。本发明的抗体还可以用于GDF-8-相关病症，例如用于需要增强肌肉组织或骨骼密度的病症中。例如，抗-GDF-8抗体可以用于疗法和组合物以修复受损的肌肉，例如心肌、隔肌等等。通过公开的方法和组合物治疗的例证性的GDF-8-相关病症和疾病包括肌肉和神经肌肉失调例如肌营养不良(包括Duchenne’s肌营养不良)；肌萎缩性侧索硬化；肌肉萎缩；器官萎缩；虚弱；管综合症(tunnel syndrome)；充血梗阻性肺病(COPD)；骨骼肌减少症，恶病质和其他肌肉损耗综合症；脂肪组织病症(例如肥胖)；2型糖尿病；葡萄糖耐受性减低；代谢性综合症(例如X综合症)；胰岛素抵抗(包括由诸如烧伤或氮不平衡的创伤诱发的抵抗)以及骨骼-退行性疾病(例如骨关节炎和骨质疏松症)。在本发明优选而非限制性的实施方案中，包含抗-GDF-8抗体的组合物用于治疗、降低或改善ALS的方法中。 
另一个方面中，本发明提供组合物，例如药物组合物，其包括药学可接受载体和至少一种GDF-8拮抗剂，例如此处所述的抗-GDF-8抗体。在一个实施方案中，组合物，例如药物组合物包括两种或多种上述GDF-8拮抗剂(例如抗-GDF-8抗体或其片段)的组合。GDF-8拮抗剂，例如抗-GDF-8抗体与治疗剂，例如生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂(例如全身性抗炎剂)、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒剂或细胞生长抑制剂的组合也在本发明的范围内。 
又一个实施方案中，GDF-8拮抗剂，例如抗-GDF-8抗体或其药物组合物单独或以联合治疗，即与其他试剂例如可用于治疗GDF-8-相关病症的治疗剂结合而给予。 
除了治疗各种疾病或病症的用途之外，抗-GDF-8抗体可以用作诊断工具以定量或定性检测生物样品中的GDF-8蛋白或蛋白片段。检测的GDF-8蛋白的存在或量可与此处所列的一种或多种医学状况相关连。因此在一个实施方案中，本发明提供诊断、预后、监测和/或筛查GDF-8-相关病症的方法。 
另一方面中，本发明提供用于体外检测样品(例如生物样品，如血清、血浆、组织、活组织)中GDF-8存在的方法。本方法可用于诊断GDF-8-相关病症，例如骨骼、肌肉、脂肪或葡萄糖代谢-相关病症。该 方法包括：(i)将样品或对照样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；和(ii)检测抗-GDF-8抗体和样品或对照样品之间复合物的形成，其中样品相对于对照样品的复合物形成的基本上显著的变化指示样品中存在GDF-8。 
又一个方面中，本发明提供用于检测患者体内GDF-8存在的方法(例如患者的体内成像)。本方法可用于诊断GDF-8-相关病症，例如ALS。该方法包括：(i)将此处所述的抗-GDF-8抗体在允许抗体结合GDF-8的条件下给予患者或对照受试者；和(ii)检测抗体和GDF-8之间复合物的形成，其中患者相对于对照受试者的复合物形成基本上显著的差异提供与GDF-8存在有关的指示。 
本发明其他的实施方案提供诊断或检测患者是否患有GDF-8-相关病症(例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、代谢性或诱发的骨骼病症、脂肪病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症)的方法，包括步骤：(a)获得来自目的患者的样品；(b)将样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(c)测定患者样品中存在的GDF-8的水平；和(d)比较患者样品中GDF-8的水平与对照样品中GDF-8的水平，其中患者样品中GDF-8的水平相比对照样品中GDF-8的水平的显著提高、降低或类似表明患者是否患有GDF-8-相关病症。 
用于诊断或检测患者是否患有此处所述GDF-8-相关病症的再一个实施方案包括步骤：(a)获得取自目的患者的第一样品；(b)将该第一样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(c)测定第一样品中GDF-8的水平；(d)获得来自未患GDF-8-相关病症的个人的第二样品；(e)将该第二样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(f)测定第二样品中GDF-8的水平；和(g)比较第一和第二样品中GDF-8的水平，其中第一样品相比第二样品水平的显著提高、降低或类似表明患者是否患有由GDF-8过表达(部分或全部)引起的GDF-8-相关病症。例如第一样品中GDF-8水平相比第二样品的提高可能表明患者患有GDF-8-相关病症。相反，第一样品中GDF-8水平相比第二样品的降低或类似可能表明患者并不患有GDF-8-相关病症。 
本发明的抗体在预测患者发展为GDF-8相关病症，例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、代谢性或诱发的骨骼病症、脂肪病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症的可能性的方法中也有效。在优选但 非限制性的实施方案中，该方法包括步骤：(a)获得来自目的患者的第一样品；(b)将该第一样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(c)测定第一样品中GDF-8的水平；(d)获得来自未患GDF-8-相关病症的个体的第二样品；(e)将该第二样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(f)测定第二样品中GDF-8的水平；和(g)比较第一和第二样品中GDF-8的水平，其中第一样品相比第二样品GDF-8水平的显著提高、降低或类似指示患者发展为GDF-8-相关病症的可能性。例如，对于由GDF-8过表达(部分或全部)引起的GDF-8-相关病症，如果第一样品相比第二样品具有提高的GDF-8水平则很可能该患者将发展GDF-8-相关病症。相反，对于由GDF-8过表达(部分或全部)引起的GDF-8-相关病症，如果第一样品相比第二样品具有类似的或降低的GDF-8水平则该患者不太可能将发展GDF-8-相关病症。 
本发明的抗体在监测GDF-8相关病症，例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、代谢性或诱发的骨骼病症、脂肪病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症的严重程度的方法中也有效。在优选而非限制的实施方案中，该方法包括步骤：(a)在第一时间点获得取自目的患者的第一样品；(b)将该第一样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(c)测定第一样品中GDF-8的水平；(d)在第二时间点获得取自该患者的第二样品；(e)将该第二样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(f)测定第二样品中GDF-8的水平；和(g)比较第一和第二样品中GDF-8的水平，其中第二样品中GDF-8水平的显著提高、降低或类似指示GDF-8-相关病症的严重程度是否改变。在一实施方案中，本发明的监测方法用于监测ALS，并且第二样品中GDF-8水平的降低表明ALS严重程度的降低。 
监测此处所述病症的另外的方法包括步骤：(a)获得来自目的患者的第一样品；(b)将该第一样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(c)测定第一样品中GDF-8的水平；(d)获得来自未患肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、代谢性或诱发的骨骼病症、脂肪病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症的个体的第二样品；(e)将该第二样品与此处所述的抗-GDF-8抗体接触；(f)测定第二样品中GDF-8的水平；和(g)比较第一和第二样品中GDF-8的水平，其中第一样品相比第二样品GDF-8水平的显著提高、降低或类似指示GDF-8病症在该 时间点的严重程度。在一实施方案中，本发明的监测方法用于监测ALS，并且第一样品相比第二样品GDF-8水平的降低或类似表明ALS具有低的严重程度。 
优选地，抗体用可检测的物质直接或间接标记以便于结合或未结合抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。 
用于将本发明的拮抗剂，例如抗体递送或靶向至体内的GDF-8-表达细胞的方法在此处公开并且在本发明的范围内。 
用于治疗和诊断用途的包括本发明的GDF-8拮抗剂，例如抗-GDF-8抗体的试剂盒也在本发明范围内。 
本发明另外的目的将在下列描述中阐述。本发明的不同的目的、方面和优点将通过尤其在权利要求中指出的要素和组合而实现和获得。 
可理解的是上述概述和下列详细说明仅仅是例证性的和说明性的，并且不是如所主张的本发明的限制。 
附图说明
图1：RK35抗-GDF-8抗体的表征。A.如用生物素化的GDF-8的ELISA测定法中测定，RK35抗体直接结合至GDF-8。RK35抗体(圆圈)对GDF-8的结合亲和力测定为4nM。对照IgG不呈现明显的结合(正方形)。B.RK35抗体对结合至其高亲和力受体的GDF-8的作用。在利用高亲和力GDF-8受体的竞争ELISA中，ActRIIB用于测量RK35的GDF-8抑制活性。在缺乏(菱形)或存在不同浓度的RK35mAb、可溶性ActRIIB或对照IgG时评估生物素化的GDF-8与融合至人IgG恒定区(Fc)的固定的人嵌合蛋白ActRIIB的结合。可溶性ActRIIB-Fc受体(正方形)和无关的小鼠IgG(三角形)分别用作阳性和阴性对照。RK35(圆圈)以IC50～2.5nM阻断生物素化的GDF-8结合至固定的ActRIIB。C.GDF-8-诱导信号转导的抑制。表达TGF-β启动子-荧光素酶融合基因的横纹肌肉瘤细胞在缺乏(正方形)或存在(圆圈)不同浓度的RK35抗体时用10ng/ml的GDF-8处理。RK35按剂量-应答方式，以IC50为0.2nM降低荧光素酶活性的GDF-8诱导。在不添加GDF-8时测量本底(菱形)信号。 
图2：抑肌素的抑制导致SODG93A小鼠和大鼠中体重和肌肉质量 的增加。A.RK35-处理(正方形)(n＝11)和PBS-处理(菱形)(n＝11)的转基因SODG93A小鼠以及PBS-处理的同窝对照(野生型)小鼠(三角形)(n＝9)的体重。B.雄性(圆圈)和雌性(三角形)RK35-处理以及雄性(正方形)和雌性(菱形)PBS-处理的转基因SODG93A大鼠(每组n＝10)的体重。C.疾病早期-阶段RK35-和PBS-处理的SODG93A和PBS-处理的同窝对照小鼠(n＝9-12)的肌肉质量。测定来自用PBS处理的88天的野生型小鼠(黑条)、用PBS处理的SODG93A小鼠(白条)和用RK35处理的SODG93A小鼠(灰条)的腓肠肌(腓肠肌)、颅胫骨肌(胫骨肌)、四头肌(四)和隔肌(隔肌)肌肉的鲜重。D.来自疾病早期-阶段(～95天)用PBS(白条)或RK35(灰条)处理的SODG93A大鼠的肌肉质量(每组n＝7)。E.在疾病末期-阶段(～134天)用PBS处理的野生型小鼠(黑条)、用PBS处理的SODG93A小鼠(白条)和用RK35处理的SODG93A小鼠(灰条)的肌肉质量。F.来自疾病结束-阶段(～128天)用PBS(白条)或RK35(灰条)处理的SODG93A大鼠的肌肉质量。星号(*)表示所示组之间的统计学(p＜0.05)差异。 
图3：抑肌素抑制增强SODG93A小鼠和大鼠的肌肉力量。A.PBS-处理的野生型小鼠(三角形)和PBS(菱形)或RK35(正方形)处理的SODG93A小鼠中与年龄有关的下肢握力。下肢握力可以表示为千克压力(kg)。B.PBS-处理的野生型小鼠(三角形)和PBS(菱形)或RK35(正方形)处理的SODG93A小鼠中与年龄有关的前肢握力。C.PBS-处理的野生型大鼠(WT+PBS)或PBS(SOD+PBS)或RK35(SOD+RK35)处理的SODG93A大鼠的前肢握力。对于大鼠，在95-110天，相当于疾病早期的4-周时间间隔期间进行测量。前肢握力可以表示为千克张力(kg)。星号(*)表示所示组之间的统计学显著(p＜0.0001)差异。 
图4：在SODG93A啮齿类中抑肌素抑制对肌肉结构和功能的作用。来自88天小鼠的中央腓肠肌的苏木素伊红染色表明(B)PBS-处理的SODG93A小鼠相比(A)野生型或(C)RK35-处理的SODG93A小鼠显著的萎缩。末期(E)PBS-处理和(F)RK35-处理的SODG93A小鼠中央腓肠肌的苏木素伊红染色表明相比(D)野生型小鼠腓肠肌显著的肌肉萎缩和细胞核集中(箭头)。分别来自(G)PBS-处理的野生型小鼠和(H)PBS-或(I)RK35-处理的SODG93A小鼠末期的隔肌的苏木 素伊红染色。萎缩的肌纤维的实例标记为(“a”)。平板H中的星号表示纤维劈裂。示出条表示平板A-F中50μm和平板G-I中25μm的比例尺。平板J：示出记录自PBS处理的野生型大鼠(WT+PBS)或PBS(SOD+PBS)或RK35(SOD+RK35)处理的SODG93A大鼠隔肌肌肉的吸入脉冲的EMG干涉图。平板K：来自野生型大鼠(n＝4)和来自载体(PBS，n＝9)或RK35(n＝8)处理的SODG93A大鼠隔肌肌肉的EMG脉冲峰速率(Hz)。星号(*)表示所示组之间的统计学显著(p＜0.05)差异。 
图5：SODG93A小鼠中RK35处理在早期-阶段疾病中减缓腓肠肌肌肉肌纤维直径的减小以及在末期疾病中减缓隔肌肌纤维直径的减小。在88天通过对来自PBS-处理(A)和RK35-处理(B)的SODG93A小鼠以及PBS-处理的野生型小鼠(C)的腓肠肌形态测量而测量纤维直径。ANOVA表明平均值显著不同(p＜0.0001)；通过Tukey’s多重比较后-检验的两两比较也显著不同(p＜0.001)。在末期，PBS-处理和RK35-处理的SODG93A小鼠腓肠肌中观察到纤维分布无显著差异(数据没有示出)。D.与年龄-相当的野生型对照小鼠相比，来自末期PBS-处理和RK35-处理的SODG93A小鼠隔肌肌肉的纤维直径的分析。来自RK35-处理的SODG93A小鼠隔肌肌肉呈现在末期PBS-处理的SODG93A小鼠和野生型对照小鼠之间的纤维直径分布中间值。ANOVA表明平均值显著不同(p＜0.0001)；通过Tukey’s多重比较后-检验的两两比较也显著不同(p＜0.01)。每组分析三个肌肉；利用Zeiss Axiovision软件进行至少两百个纤维短轴最大直径的长度测量。纤维直径以20μm间隔设置，对每个肌肉组产生频率直方图。 
图6：抗-抑肌素处理对脊髓腹角中运动神经元损失的作用。显示与年龄-相当的野生型小鼠(WT+PBS)相比，来自疾病早期-阶段(A)和末期-阶段(C)PBS(SOD+PBS)或RK35(SOD+RK35)处理的SODG93A小鼠腹角L3-5区域大运动神经元(面积大于300μm2)的体视学分析。RK35处理显示在疾病早期-阶段(A)抵消运动神经元损失(p＝0.08)的趋向。与年龄-相当的野生型小鼠相比，对来自(B)疾病早期-阶段和(D)末期-阶段PBS或RK35处理的SODG93A小鼠的NISSL-染色切片L3-5进行可见细胞核的大的健康运动神经元的单独计数。对于每个切片，计数两种腹角(每个动物总计20个腹角)并且数据表示 为每个腹角的大运动神经元的平均数。星号(*)表示所示组之间的统计学显著(p＜0.001)差异。示出在疾病早期(88天)(E-G)和末期(134天；H-J)分析的用PBS处理的野生型小鼠(E和H)、用PBS处理的SODG93A小鼠(F和I)以及用RK35处理的SODG93A小鼠(G和J)的来自NISSL-染色腹角切片(20x放大倍数)的代表性的图像。条表示200μm的比例尺。 
图7：对RK35抗体的GDF-8表位作图。利用人GDF-8的重叠13个氨基酸的肽鉴定GDF-8上RK35的结合位点。RK35与GDF-8的接触位点为粗体。 
图8：RK35的轻链和重链可变区(分别为VL和VH)分别与人系框架DPK9和DP-47的比对。在人源化的RK35(HuRK35)区域改变的鼠科RK35(MRK35)可变链的氨基酸用星号(*)表示并且为粗体；RK35的互补决定区圈入框中并下划线。 
具体实施方式
I.定义 
如此处所用的“抗体”指免疫球蛋白或其部分，并且包含任何包括不管其来源，物种来源，产生方法和特性的抗原结合位点的多肽。除非另有说明，本发明的目的还包括抗体片段如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb、双链抗体和保留抗原-结合功能的其他抗体片段。抗体可例如通过常规的杂交瘤技术、重组DNA方法或利用抗体文库的噬菌体展示技术制备。对于各种其他的抗体产生技术，参见Antibodies：A Laboratory Manual，eds.Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。 
术语“抗原-结合结构域”指包括特异性结合或互补部分或所有抗原的区域的抗体分子部分。当抗原很大时，抗体仅可结合至抗原的特定部分。“表位”或“抗原决定簇”为负责与抗体的抗原-结合结构域相互作用的抗原分子部分。抗原-结合结构域可通过一个或多个抗体可变结构域(例如由VH结构域组成的所谓的Fd抗体片段)提供。抗原-结合结构域可包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。 
术语“GDF-8”指特定的生长和分化因子-8，而不是结构或功能与GDF-8有关的其他因子，例如BMP-11和属于TGF-β超家族的其他因子。该术语指GDF-8的全长未加工的前体形式以及由翻译后裂解产生的成 熟和前肽形式。该术语还指包括序列已修饰的GDF-8的任何片段和变体，其维持如此处论述的至少某些与成熟GDF-8有关的生物学活性。成熟的人GDF-8氨基酸序列在SEQ ID NO：1提供。本发明涉及来自所有脊椎动物物种的GDF-8，包括但不限于人、牛、鸡、小鼠、大鼠、猪、羊、火鸡、狒狒和鱼(对于序列信息，参见例如McPherron等，上文)。 
术语“GDF-8活性”指与有活性的GDF-8蛋白有关的一种或多种生理生长-调控或形态发生的活性。例如，有活性的GDF-8为骨骼肌质量的负调节剂。有活性的GDF-8还可以调节肌肉-特异性酶的产生(例如肌酸激酶)、刺激成肌细胞增殖和调节前成脂肪细胞分化为脂肪细胞。用于测量体内和体外GDF-8活性的例证性的方法在实施例中阐述。 
术语“GDF-8拮抗剂”或“GDF-8抑制剂”包括能够抑制GDF-8活性、表达、加工或分泌的任何试剂。所述抑制剂包括大分子和小分子，例如蛋白质、抗体、肽、肽模拟物、siRNA、核酶、反义寡核苷酸、双链RNA和抑制GDF-8的其他小分子。除了此处提供的抗体之外，GDF-8拮抗剂包括有效抑制GDF-8的任何抗体，包括以高特异性结合GDF-8的抗体(例如对TGF-β超家族的其他成员(例如BMP-11)具有低亲和力的抗体)。这些抗体的变体，包括人源化的变体也考虑在本发明的诊断、预测、监测、治疗、改善和预防方法中。所述抑制剂“抑制”、“减小”或“降低”GDF-8的生物学活性。 
术语“中和”、“中和”和其同义词指GDF-8活性相对于无相同的抑制剂时GDF-8活性的显著降低或消除。例如，75-100％活性的降低可认为是“中和”GDF-8活性。 
术语“治疗”在此可与术语“治疗方法”互换使用并且指治疗性的治疗和预防性的/预防措施。需要治疗的人包括已患有特定的医学病症的个体以及可能最终患上该病症的人(即需要预防措施的人)。 
术语“分离的”指基本上从其自然环境分离的那些分子。例如，分离蛋白为基本上从其来源的细胞或组织源分离的蛋白。 
术语“纯化的”指基本上没有在其自然环境中与该分子缔合的其他物质的分子。例如，纯化的蛋白质基本上没有来自其来源的细胞或组织的细胞物质或其他蛋白质。该术语指其中分离蛋白足够纯以作为治疗组合物给予，或至少70％至80％(w/w)纯的，更优选至少80％-90％(w/w)纯的，甚至更优选90-95％纯的和最优选至少95％、96％、97％、98％、 99％或100％(w/w)纯的制备物。 
术语“有效剂量”、“治疗有效剂量”、“有效量”等等指引起患者中症状改善或所需生物学结果(例如提高骨骼肌质量和/或骨骼密度)的化合物的量。所述量应该足以降低与骨骼肌质量和骨骼密度的负调节或与葡萄糖体内平衡和脂肪代谢有关的GDF-8活性。有效量可如此处所述而确定。 
“与GDF-8活性有关的病症”、“与GDF-8有关的病症”、“GDF-8-相关病症”等等指可能完全或部分由GDF-8(和/或GDF-8活性)的调节异常(例如异常提高或降低)引起的病症，和/或可以通过调节和/或监测GDF-8(和/或GDF-8活性)治疗、改善、预防、诊断、预测或监测的病症。GDF-8-相关病症包括肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、代谢性或诱发的骨骼病症、脂肪病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症。本发明优选的GDF-8-相关病症为肌萎缩性侧索硬化(ALS)。 
术语“小分子”指非大分子的化合物(参见，例如Karp(2000)Bioinformatics Ontology 16：269-85；Verkman(2004)AJP-Cell Physiol.286：465-74)。因此，小分子常常为小于一千道尔顿的化合物(例如，Voet and Voet，Biochemistry，2nd ed.，ed.N.Rose，Wiley and Sons，New York，14(1995))。例如，Davis等((2005)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 102：5981-86)使用短语小分子表示叶酸，甲氨喋呤和神经肽，而Halpin和Harbury((2004)PLos Biology2：1022-30)使用该短语表示小分子基因产物，例如DNAs、RNAs和肽。天然小分子的实例包括，但不限于胆固醇、神经递质和siRNA；合成的小分子包括，但不限于登记在许多市场上可买到的小分子数据库的各种化学品，例如FCD(Fine Chemicals Database)、SMID(Small Molecule Interaction Database)、ChEBI(Chemical Entities of Biological Interest)和CSD(Cambridge Structural Database)(参见例如，Alfarano等(2005)Nuc.Acids Res.Database Issue33：D416-24)。 
II.GDF-8的抗体和抗体片段 
A.小鼠和人源化抗体RK35 
本说明书提供有效结合GDF-8的新型抗体(例如完整的抗体和抗体片段)。所述抗体的非限制性的例证性实施方案称为RK35。该例证性 的实施方案以小鼠和人源化抗体和其抗体片段的形式提供。 
本发明的例证性抗体在此指具有独特和有益特性的“RK35”。第一，该抗体和抗体片段能够以高亲和力结合成熟的GDF-8。第二，本发明的该抗体和抗体片段例如通过ActRIIB结合抑制和报告基因测定法表明体外和体内抑制GDF-8活性。第三，该公开的抗体和抗体片段例如通过提高所治疗突变SOD小鼠中的肌肉质量而表明可用于治疗与GDF-8-相关病症有关的症状，例如肌肉病症尤其是ALS。 
例证性的实施方案中，GDF-8拮抗剂为有效结合至GDF-8并且抑制一种或多种GDF-8相关活性的抗体。本领域普通技术人员将认识到本发明的抗体可用于检测、测量和抑制源自不同物种(例如本说明书中所述的那些)的GDF蛋白。通过标准的比对算法确定同一性百分比，例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中所述的Basic Local Alignment Tool(BLAST)、Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：444-53的算法或Meyers等(1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17的算法。通常，本发明的抗体和抗体片段可与任何蛋白质一起使用，所述蛋白保留基本的GDF-8生物学活性并且包括与SEQ ID NO：1所述的GDF-8成熟形式至少100、80、60、40、20或15个连续氨基酸的任何序列至少约70％、80％、90％、95％或更高同一性的氨基酸序列。 
B.抗体可变结构域 
完整的抗体，亦称免疫球蛋白，通常为四聚体的糖基化蛋白，其由每条大约25kD的两条轻(L)链和每条大约50kD的两条重(H)链组成。抗体中存在两种类型的轻链，称为λ和κ。取决于重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白分为五种主要类别：A、D、E、G和M，并且其部分可进一步分成亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每条轻链由N-末端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)组成。每条重链由N-末端V结构域(VH)，三个或四个C结构域(CH)和铰链区组成。最接近VH的CH结构域称为CH1。VH和VL结构域由名为框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)的四个序列相对保守区组成，其形成对三个序列高变区(互补决定区，CDR)的支架。CDR包含负责抗体与抗原相互作用的大部分残基。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR组分称为H1、H2和H3，而轻链 上的CDR组分称为L1、L2和L3。CDR3为抗体-结合位点内分子多样性的最大来源。例如H3可短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同免疫球蛋白类别的亚基结构和三维构型为本领域所熟知。抗体结构的综述，参见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，eds.Harlow等，1988。本领域技术人员将认识到每种亚基结构，例如CH、VH、CL、VL、CDR和/或FR结构包括有活性的片段。例如，有活性的片段可由结合抗原，即抗原-结合片段的VH、VL或CDR亚基的部分或结合和/或活化Fc受体和/或补体的CH亚基的部分组成。 
此处所用术语“抗体片段”包含的结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；和(vi)分离的CDR。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，其可通过合成接头重组连接，产生其中VL和VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)的单个蛋白质链。最常用的接头为15个残基(Gly4Ser)3肽，但其他接头也是本领域已知的。单链抗体也意图包含在术语“抗体”或抗体的“抗原-结合片段”中。这些抗体利用本领域技术人员已知的常规方法获得，并且以与完整的抗体相同的方法筛查片段的功用。 
抗体多样性由编码可变区的多个种系基因和多种体细胞事件产生。体细胞事件包括可变基因片段与差异(D)和连接(J)基因片段重组以形成全长VH区域，以及可变和连接基因片段重组以形成全长VL区域。重组过程本身不精确，导致V(D)J连接处的氨基酸丢失或添加。这些多样性机制在抗原暴露之前正发育的B细胞中出现。抗原刺激后，B细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。以评估的种系基因片段、这些片段的随机重组和随机的VH-VL配对的数量为基础，可产生上至1.6x107的不同抗体(Fundamental Immunology，第三版(1993)，Paul，RavenPress，New York，NY)。当考虑促进抗体多样性的其他方法时(如体细胞突变)，认为可产生超过1x1010的不同抗体(Immunoglobulin Genes，第二版(1995)，Jonio等，Academic Press，San Diego，CA)。由于参与产生抗体多样性的许多方法，具有相同抗原特异性的独立来源的单 克隆抗体可能不具有相同的氨基酸序列。 
因此，本发明提供结合GDF-8的新抗体。本发明的抗体片段，例如包含CDR的结构通常为抗体重或轻链序列，或其活性片段，其中CDR位于相当于天然存在的VH和VL的CDR部位。免疫球蛋白可变结构域(例如CDR的结构和部位)，可利用熟知的编号方案定义，例如Kabat编号方案，Chothia编号方案，Kabat和Chothia组合(AbM)等等(参见例如，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services(1991)，Kabat等；Al-Lazikani等(1997)J.Mol.Biol.273：927-48)。 
因此，本发明进一步提供新的CDR。携带本发明CDR的结构通常为多肽，例如抗体重或轻链序列或其相当大的部分，其中CDR位于相当于天然存在的VH和VL区域的CDR位点。免疫球蛋白可变结构域的结构和部位可如上文Kabat等和上文Al-Lazikani等中所述的而确定。 
本发明的抗体分子(包括抗体片段)，即拮抗GDF-8的抗体分子，包括但不限于鼠科单克隆抗体RK35和其变体，特别是人源化的变体。本发明的GDF-8拮抗剂除了RK35之外包括有效结合GDF-8的其他抗体，包括以高特异性结合GDF-8的抗体(例如，对TGF-β超家族的其他成员(例如BMP-11)具有较低亲和力的抗体)。这些抗体的变体，包括人源化的变体也考虑在本发明的诊断、预测、监测、治疗、改善和预防方法中。这些抗体分子可用于预防或治疗GDF-8-相关病症，例如骨骼、肌肉、脂肪和葡萄糖代谢相关的病变。鼠科和人源化RK35的轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9。鼠科和人源化RK35的重链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7。鼠科和人源化RK35可变轻链中的三个互补决定区(CDR)的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、14、15、23、24和25所示。鼠科和人源化RK35可变重链中的三个CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO：10、11、12、20、21和22所示。 
如上所述，CDR包含负责与抗原相互作用的大部分残基，并且分别包含在VH和VL结构域，即重链可变区和轻链可变区内。因此，如果抗体包括至少一个CDR或其活性抗体片段，该CDR其包含选自SEQ ID NO：10-15和20-25所示氨基酸序列的氨基酸序列，则其为本发明的抗体，即结合GDF-8并且干涉GDF-8信号的抗体。因此本发明的实施方 案包括诸如抗体的多肽，其包含一个或多个CDR或其活性片段，该CDR包括选自SEQ ID NO：10-15和20-25所示氨基酸序列的氨基酸序列。因此，本领域技术人员将认识到本发明的抗体包括其中VL链的CDR为SEQ ID NO：13-15和23-25所示或VH链的CDR为SEQ ID NO：10-12和20-22所示的抗体。 
抗原-结合片段可以是Fv片段，其由VH和VL结构域组成。因此，RK35的Fv片段可组成本发明的抗体，条件是其结合GDF-8并且干涉GDF-8信号。本领域技术人员将认识到包含诸如RK35的Fv片段的任何抗体片段也可以是本发明的抗体。另外，包含具有选自SEQ ID NO：10-15和20-25所示氨基酸序列的氨基酸序列的一个或多个CDR的任何Fv片段、scFv片段、Fab片段或F(ab’)2片段，也可以是本发明的抗体。 
所述抗体分子可通过本领域技术人员熟知的方法产生。例如，单克隆抗体可通过按照已知方法生产杂交瘤而产生。以此方式形成的杂交瘤随后利用标准方法(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和Biacore分析)筛查，以鉴定产生结合GDF-8、干涉GDF-8信号以及中和或抑制一种或多种GDF-8-相关活性的抗体的杂交瘤。重组GDF-8、天然存在的GDF-8、其任何变体以及GDF-8的抗原性肽片段可以用作免疫原。GDF-8抗原性肽片段包含七个连续的氨基酸残基并且包含一个表位使得该肽的抗体与GDF-8形成免疫复合物。优选地，抗原性肽包含至少10个氨基酸残基，更优选至少15个氨基酸残基，甚至更优选至少20个氨基酸残基，并且最优选至少30个氨基酸残基。另外，优选GDF-8的抗原性肽片段包含GDF-8受体-结合位点。 
本发明的多克隆血清和抗体可通过用GDF-8、其变体和/或其部分来免疫合适的受试者而产生。免疫受试者中的抗体效价可通过标准技术(如ELISA)，或通过利用固定的GDF-8或其他标记蛋白(例如FLAG)而实时监测。如果需要，本发明的抗体分子可分离自受试者或培养基并且通过熟知的技术(如蛋白A色谱法)进一步纯化而获得IgG组分。 
本发明的某些实施方案包括RK35Fv片段的VH和/或VL结构域。本发明的抗体片段，例如Fab、F(ab’)2、Fd和dAb片段可按照本领域熟知的方法通过裂解抗体而产生。例如，免疫活性的Fab和F(ab’)2片段可通过用酶(如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)处理抗体而产生。 
另外的实施方案包括如SEQ ID NO：10-15和20-25所示的、任何 这些VH和VL结构域的一个或多个CDR。一个实施方案包括如SEQ IDNO：12所示的、RK35VH结构域的H3片段。 
本文公开的抗体的VH和VL结构域以及CDR的DNA和氨基酸(AA)序列列于表1中。为方便起见，VH和VL结构域内的每个CDR的近似位点列于表2中。 
表1：RK35中VH、VL、CH、CL和CDR的DNA和氨基酸序列 
Figure BDA00003346823700241
表2：根据Kabat(非斜体)或AbM(斜体)定义的小鼠和人源化抗体RK35可变区内的近似CDR位点 
Figure BDA00003346823700251
抗-GDF-8抗体可进一步包括抗体恒定区或其部分。例如，本发明的VL结构域可以其C-末端附着于抗体轻链恒定结构域，例如人Cκ或Cλ链，优选Cλ链。同样，基于VH结构域的抗原-结合片段可以其C-末端附着于源自任何同型抗体(例如IgG、IgA、IgE和IgM)以及任何同型亚类(尤其IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的所有或部分。例证性的实施方案中，抗体包括人IgG1λ的重链和轻链的C-末端片段。优选的轻λ链C-末端恒定片段的DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示。优选的IgG1重链C-末端恒定片段的DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示。应理解的是，由于遗传密码的简并性，列于表1的DNA序列仅仅为编码目的氨基酸序列、肽和抗体的代表，而并不认为是限制性的。 
本发明的某些实施方案包括RK35Fv片段的VH和/或VL结构域。另外的实施方案包括任何这些VH和VL结构域的一个或多个互补决定区(CDR)。一个实施方案包括RK35VH结构域的H3片段。某些实施方案中，本发明的VH和VL结构域为种系的，即这些结构域的框架区(FR)利用常规的分子生物学技术改变以匹配人种系基因产物的共有氨基酸序列。此亦称人源化的或种系抗体。其他的实施方案中，框架序列偏离种系。人源化的抗体可利用转基因小鼠产生，其不能表达内源的免疫球蛋白重链和轻链基因，但能够表达人重链和轻链基因。 
C.修饰的抗体和其片段 
本发明另一方面提供用于获得针对抗GDF-8的抗体抗原-结合结构 域的方法。技术人员将理解本发明的抗体不限于表1中列举的VH和VL的特定序列而且包括保留这些序列的抗原-结合能力的变体。所述变体可利用本领域已知的技术由所提供的序列获得。可在FR或CDR中进行氨基酸取代、缺失或添加。虽然框架区中的改变通常设计成提高抗体的稳定性以及降低其免疫原性，CDR中的改变通常设计成增强抗体对于其靶标的亲和力。所述亲和力-增强的改变通常通过改变CDR并且检测抗体而凭经验确定。所述改变可根据例如Antibody Engineering，第二版，Borrebaeck，ed.，Oxford University Press，1995中所述的方法完成。 
因此，本发明的抗体也包括结合GDF-8、干涉GDF-8信号并且在重链和轻链恒定区具有突变的那些。有时需要突变和灭活某些恒定区的片段。例如，有时需要重恒定区的突变以产生减少结合Fc受体(FcR)和/或补体的抗体；所述突变为本领域所熟知。本领域技术人员还会认识到确定CL和CH亚基的哪个活性片段是必须的将取决于本发明抗体的应用。例如，以其共价键相互连接的CL和CH亚基的活性片段在完整抗体的产生中将是重要的。 
制备此处所述的VH结构域氨基酸序列变体的VH结构域的方法包括在目前公开的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸，选择性地组合VH结构域从而具有一个或多个VL结构域，以及检测VH结构域或VH/VL组合或结合GDF-8的组合，以及(优选)检测所述抗原-结合结构域调节一种或多种GDF-8-相关活性的能力。VL结构域可能具有基本如此处所述的氨基酸序列。可应用类似的方法，其中此处公开VL结构域的一种或多种序列变体与一种或多种VH结构域相结合。 
本发明另一方面提供制备与GDF-8相互作用的抗原-结合片段的方法。该方法包括： 
(a)提供编码VH结构域的核酸的起始组分(repertoire)，所述VH结构域或包括所要取代的CDR(例如CDR3)或缺乏CDR(例如CDR3)编码区域的VH结构域； 
(b)将该组分与编码供体CDR的供体核酸组合，其包括SEQ ID NO：2或6的活性片段，例如编码SEQ ID NO：3或7所示氨基酸序列的供体核酸，使得供体核酸插入组分中例如CDR3区域的CDR中以提供编码VH结构域的核酸的产物组分； 
(c)表达产物组分的核酸； 
(d)选择与GDF-8相互作用的抗原-结合片段；和 
(e)回收选择的抗原-结合片段或编码其的核酸。 
此外，可应用类似的方法，其中本发明的VL CDR(例如L3)与或包括所要取代的CDR或缺乏CDR编码区域的编码VL结构域的核酸组分结合。 
本发明的CDR编码序列(例如CDR3)可利用重组DNA技术导入缺乏CDR(例如CDR3)的可变结构域组分中。例如，Marks等(1992)Bio/Technology10：779-83描述了产生抗体可变结构域组分的方法，其中定向或接近于可变结构域区域5’端的共有引物用于连接人VH基因第三框架区的共有引物以提供缺乏CDR3的VH可变结构域的组分。该组分可与特定抗体的CDR3相结合。利用类似的技术，本发明源自CDR3的序列可用缺乏CDR3的VH或VL结构域组分改组(shuffle)，改组的全长VH或VL结构域与同源的VL或VH结构域结合以提供本发明的抗原结合片段。该组分可随后在合适的宿主系统中展示，如WO92/01047的噬菌体展示系统，以便能够选择合适的抗原结合片段。 
类似的改组或组合技术也由Stemmer(1994)Nature370：389-91公开，其描述了与β-乳糖酶基因有关的技术但观察到该方法可用于产生抗体。 
另外的替代方案为利用一个或多个所选VH和/或VL基因的随机诱变以产生整个可变结构域内的突变而产生携带本发明的源自CDR序列的新VH或VL区域。所述技术在Gram等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：3576-80中通过利用易错PCR描述。 
可用于产生新抗体或其片段的另一种方法为直接诱变VH或VL基因的CDR。所述技术在Barbas等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：3809-13和Schier等(1996)J.Mol.Biol.263：551-67中公开。 
同样，一个、两个或所有三个CDR可移植入VH或VL结构域的组分中，其随后筛查GDF-8的结合伴侣或结合片段。 
免疫球蛋白可变结构域的大部分将包括至少CDR和选择性地来自此处所述抗体片段的其插入框架区。该部分也包括FR1和FR4纸已或全部的至少约50％，50％为50％的FR1C-末端和50％的FR4N-末端。可变结构域大部分的N-末端或C-末端其他的残基可以是通常与天然存在 的可变结构域区域无关的那些。例如，通过重组DNA技术产生的本发明抗体片段的构建可以使得导入由引入的接头所编码的N-或C-末端残基以便于克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括接头导入以连接本发明的可变结构域至另外的蛋白质序列，包括以下更详细地论述的免疫球蛋白重链、其他的可变结构域(例如双链抗体的产生)或蛋白标记物。 
虽然实施例中举例说明的实施方案包括VH和VL结构域的“配”对，本发明还包含含有单个可变域的、源自VH或VL结构域序列(尤其是VH结构域)的结合片段，例如dAb片段。任何一个单链结合结构域的情况下，这些结构域可用于筛选能够形成能结合GDF-8的两个-结构域抗原-结合结构域的互补结构域。此可通过利用如WO92/01047中公开的所谓分级双组合方法的噬菌体展示筛选法实现。该技术中，包含或H或L链克隆的单一克隆用于感染编码另一种链(L或H)的克隆全长文库并且根据如参考文献中所述的噬菌体展示技术选择得到的两条-链抗原-结合结构域。该技术也在Marks等，上文中公开。 
抗体可通过化学方法与放射性核素、药物、大分子或其他试剂偶联，并且可制备成包括本发明的一个或多个CDR的融合蛋白。 
抗体融合蛋白包含VH-VL对，其中这些链(通常VH)之一和另一种蛋白质作为单个多肽链合成。这类产物不同于抗体，其通常具有另外的功能元件-小分子的活性部分或偶联或融合的大分子的主要分子结构特征。 
除了如上所述对氨基酸序列的改变之外，抗体可以糖基化、聚乙二醇化或连接至白蛋白或非蛋白质聚合物。例如，抗-GDF-8抗体可连接至多种非蛋白质聚合物的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。抗体可以是化学修饰的，例如通过共价偶联至聚合物而提高其循环半衰期。例证性的聚合物和将其附着至肽的方法为本领域所知。 
其他的实施方案中，抗体可以修饰以具有改变的糖基化类型(即相对于原始的或天然的糖基化类型)。如此处所用，“改变的”指具有一个或多个糖类部分缺失，和/或具有一个或多个糖基化位点添加至原始的抗体。糖基化位点添加至抗-GDF-8抗体通过改变氨基酸序列以包含糖基化位点共有序列的熟知方法实现。提高抗体上糖类部分数目的另一种方法为通过糖苷化学或酶促偶联至抗体的氨基酸残基。抗体上任何糖类部分的除去可如本领域已知的那样化学或酶促实现。 
本发明的抗体还可用可检测的或功能性的标记物如131I或99Tc标记，该标记物可利用本领域已知的常规化学过程附着于本发明的抗体。标记物还包括如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶的酶标记物。标记物进一步包括化学部分如生物素，其可通过结合特定的同源可检测部分，例如标记的抗生物素蛋白而检测。 
其中CDR序列仅非实质性地不同于列于表1的那些的抗体包含在本发明的范围内。非实质差异包括微小的氨基酸改变，例如CDR序列中任何五个氨基酸中一个或两个的取代。通常，氨基酸被具有类似电荷、疏水性或立体化学特性的相关氨基酸取代。所述取代在本领域普通技术人员的理解范围之内。结构框架区(FR)可比CDR更实质性地改变而不负面影响抗体结合性质。FR的改变包括，但不限于人源化非人类来源的框架或遗传改造对抗原接触或对稳定结合位点重要的某些框架残基，例如改变恒定区的类或亚类、改变可能改变效应物功能(如Fc受体结合)的特定的氨基酸残基(例如Lund等(1991)J.Immunol.147：2657-62；Morgan等(1995)Immunology86：319-24)，或改变恒定区所来源的物种。抗体可具有重链CH2区域的突变，其降低或改变效应物功能，例如Fc受体结合和补体激活。例如抗体可具有如美国专利No.5,624,821和5,648,260中所述的那些突变。例如IgG1或IgG2重链中，所述突变可在SEQ ID NO：19的氨基酸残基117和120处，其代表IgG1的Fc部分(这些残基相当于IgG1或IgG2全长序列的氨基酸234和237)。抗体还可以具有稳定免疫球蛋白的两条重链之间二硫键的突变，如在例如Anga1等(1993)Mol.Immunol.30：105-08中所公开的IgG4铰链区的突变。 
本发明的多肽和抗体还包含结构上不同于所公开多肽和抗体的蛋白质，例如其与所公开的多肽和抗体具有改变的序列但基本相同的生物化学性质，例如仅在功能上非必要氨基酸中具有改变。所述分子包括天然存在的等位变体和有意遗传改造(包含改变、取代、替换、插入或缺失)的变体。用于所述改变、取代、替代、插入或缺失的技术为本领域技术人员所熟知。 
本发明的抗体可另外利用转基因的非人类动物产生，其经修饰以便完全产生人抗体而不是动物内源性抗体来应答抗原攻击。参见例如，PCT出版物WO94/02602。非人宿主中编码重和轻免疫球蛋白链的内源性基 因已丧失能力，并且编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入该宿主基因组中。人基因例如利用包含必要的人DNA片段的酵母人工染色体掺入。提供所有所需修饰的动物随后通过杂交包含比全部修饰补体更少的中间转基因动物而作为子代获得。所述非人动物的一个实施方案为小鼠，并且如PCT出版物WO96/33735和WO96/34096所公开被称为XENOMOUSETM。该动物产生完全分泌人免疫球蛋白的B细胞。抗体可在用目的免疫原，例如作为多克隆抗体的制剂免疫后直接获自该动物，或者直接获自源自该动物的永生化的B细胞，如产生单克隆抗体的杂交瘤。另外，可回收编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因并且表达以直接获得抗体，或可进一步修饰以获得抗体类似物，例如单链Fv分子。 
因此，如此处所用的术语抗体包括完整的抗体、抗体片段，例如Fab、F(ab’)2Fd、dAb和scFv片段，以及已经在其恒定和/或可变区中突变(例如突变以产生嵌合的、部分人源化的或完全人源化的抗体，以及产生具有所需特性的抗体，例如增强的GDF-8结合和/或降低的FcR结合)的完整抗体和片段。所述这些抗体包括在本发明的范围中，条件是该抗体特异地结合GDF-8，干涉GDF-8信号和/或中和或抑制一种或多种GDF-8-相关活性。 
也可采用其他的蛋白结合分子调节GDF-8的活性。所述蛋白结合分子包括小的模块化免疫药物(SMIPTM)药品(Trubion Pharmaceuticals，Seattle，WA)。SMIP为由用于同源结构(如抗原、拮抗受体等等)的结合结构域、具有一个或没有半胱氨酸残基的铰链-区多肽以及免疫球蛋白CH2和CH3结构域组成的单链多肽(也参见www.trubion.com)。SMIP和其用途及应用在例如美国公开专利申请号No.2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534和2005/0238646以及其相关的专利族成员中公开，其所有在此通过引用整体引入。 
本发明抗体的结合能力可通过以下方法测定：Biacore分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、X射线结晶学、序列分析和以下实施例所述扫描诱变，以及本领域熟知的其他方法。本发明抗体中和和/或抑制一种或多种GDF-8-相关活性的能力可通过下列非限制性方法测定：测量 GDF-8-依赖的细胞系增殖的测定法；测量GDF-8-介导的多肽表达的测定法；测量下游信号分子活性的测定法；检测本发明抗体预防相关的动物模型中肌肉病症的效率的测定法；以下实施例中所述的测定法；以及本领域熟知的其他测定法。 
本发明另一方面提供选择能够结合GDF-8并且中和和/或抑制一种或多种GDF-8-相关活性的抗体的方法。该方法包括： 
a)将大量抗体与GDF-8缔合； 
b)选择结合GDF-8的抗体； 
c)检测所选择的抗体阻止GDF-8结合GDF-8受体的能力；和 
d)选择能够阻止GDF-8结合其受体的抗体。 
本发明的抗-GDF-8抗体也可用于分离、纯化和/或检测上清液、细胞裂解物或细胞表面上的GDF-8。本发明中公开的抗体可作为临床检验方法的一部分诊断性地用于监测GDF-8蛋白水平。另外，本发明的抗体可用于需要中和和/或抑制一种或多种GDF-8-相关活性的治疗中，例如ALS和其他肌肉-相关病理学的治疗。本发明也提供与针对抗人GDF-8新抗体有关的新分离和纯化的多核苷酸和多肽。本发明的基因、多核苷酸、蛋白质和多肽包括但不限于，GDF-8的鼠科和人源化的抗体(例如RK35)和其变体。 
D.核酸、克隆和表达系统 
本发明进一步提供编码本发明抗体的分离和纯化的核酸。根据本发明的核酸可包括DNA或RNA并且可以是全部或部分合成的。除非上下文另有需要，在此所述的核苷酸序列的参照包含具有指定序列或基因组同等物的DNA分子，以及具有其中U取代T的指定序列的RNA分子。 
例如，本发明提供编码鼠科GDF-8抗体可变区的纯化和分离的多核苷酸，其调节一种或多种GDF-8-相关活性(例如中和GDF-8生物活性)(RK35)以及人源化的RK35型。本发明优选的DNA序列包括基因组、cDNA和化学合成的DNA序列。 
本发明的核苷酸序列包括编码SEQ ID NO：4所示小鼠RK35轻链可变区的核苷酸序列，包括编码轻链可变区序列前的前导序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列(核苷酸1-60对应前导序列，并且核苷酸61-381对应SEQ ID NO：4)。本发明的核苷酸序列包括编码SEQ ID NO：2所示小鼠RK35重链可变区的核苷酸序列，包 括编码重链可变区序列前的前导序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列(核苷酸1-57对应前导序列，而核苷酸58-405对应SEQ ID NO：2)。本发明的核苷酸序列还包括分别如SEQ ID NO：6和8所示的重链和轻链可变区的人源化序列。本发明的多核苷酸还包括在严谨条件下与SEQ ID NO：2、4、6和8中所示核酸序列及其互补物杂交，和/或编码保留可变区基本生物学活性多肽(即活性片段)的多核苷酸。本发明的多核苷酸还包括SEQ ID NO：2、4、6和8所示序列的连续部分，包括至少15个连续的核苷酸。 
小鼠RK35可变轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。小鼠RK35可变轻链结构域前的前导序列的氨基酸序列的实例如SEQ ID NO：31所示。RK35可变重链的氨基酸序列以SEQ ID NO：3所示。小鼠RK35可变重链结构域前的前导序列的氨基酸序列的实例如SEQ ID NO：29所示。人源化的可变重链和轻链的氨基酸序列分别以SEQ ID NO：7和9所示。小鼠RK35重链内包含的CDR的氨基酸序列以SEQ ID NO：10-12和20-22所示。小鼠RK35轻链内包含的CDR的氨基酸序列以SEQ ID NO：13-15和23-25所示。本发明的多肽还包括基本上如SEQ ID NO：3、5、7、9、10-15和20-25所示序列的任何连续部分，包括至少5个连续的氨基酸。本发明优选的多肽保留本发明抗体的基本生物学活性的、包括SEQ ID NO：3、5、7、9、10-15所示序列的任何连续部分。除如上所述的多核苷酸之外，本发明还包括编码基本如SEQ ID NO：3、5、7、9和10-15所示氨基酸序列或其连续的部分，以及仅由于熟知的遗传密码简并性而不同于上述多核苷酸的多核苷酸。 
本发明分离的多核苷酸可用作杂交探针和引物以鉴定和分离具有与编码所公开多核苷酸的序列相同或类似的核酸。用这种方式分离的多核苷酸可例如用于产生GDF-8或其他TGF-β家族成员的抗体或鉴定表达所述抗体的细胞。鉴定和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链式反应(PCR)、Southern杂交、原位杂交和Northern杂交，并且为本领域技术人员所熟知。 
杂交反应在不同严谨度的条件下进行。杂交反应的严谨度包括任何两种核酸分子相互杂交的难度。优选地，每个杂交多核苷酸在降低的严谨度条件下，更优选严谨条件下，并且最优选高严谨条件下杂交至其相应的多核苷酸。严谨度条件的实例在以下表3中显示：高严谨条件为至 少如条件A-F的严谨；严谨条件为至少如条件G-L的严谨；而降低的严谨度条件为至少如条件M-R的严谨。 
表3 
Figure BDA00003346823700331
1杂交物长度为预期杂交多核苷酸杂交区域的长度。当多核苷酸杂交至未知序列的靶标多核苷酸时，杂交物长度假定为杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸杂交时，杂交物长度可通过比对多核苷酸序列并且鉴定该区域或最优序列互补性区域而确定。 
2杂交和洗涤缓冲液中SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可替代SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；洗涤在杂交完成后进行15分钟。 
TB*-TR*：预期小于50个碱基对长度的杂交物的杂交温度应当低于杂交物的解链温度(Tm)5-10℃，其中Tm根据下列等式确定。对于小于18个碱基对长度的杂交物，Tm(℃)＝2(A+T碱基)+4(G+C碱基)。对于18和49个碱基对长度之间的杂交物，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交物中碱基数，并且Na+为杂交缓冲液中钠离子浓度(1X SSC的Na+＝0.165M)。 
其他多核苷酸杂交严谨度条件的其他实例提供于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Chs.9 & 11，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，Sects.2.10 & 6.3-6.4，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，此处通过引用引入。 
本发明的分离多核苷酸可用作杂交探针和引物以鉴定和分离具有编码所公开多核苷酸等位变体序列的DNA。等位变体为所公开多核苷酸天然存在的替代形式，其编码与所公开的多核苷酸编码的多肽相同或与其具有显著相似性的多肽。优选地，等位变体具有与所公开的多核苷酸至少90％序列同一性(更优选至少95％同一性；最优选至少99％同一性)。 
本发明的分离多核苷酸还可用作杂交探针和引物以鉴定和分离具有编码与所公开多核苷酸相同的多肽序列的DNA。这些同系物为分离自与所公开多肽和多核苷酸不同的物种或在相同的物种内，但具有与所公开多核苷酸和多肽显著序列相似性的多核苷酸和多肽。优选地，多核苷酸同系物具有与所公开多核苷酸至少50％序列同一性(更优选至少75％同一性；最优选至少90％同一性)，而多肽同系物具有与所公开抗体/多肽至少30％序列同一性(更优选至少45％同一性；最优选至少60％同一性)。优选地，所公开多核苷酸和多肽的同系物分离自哺乳动物物种。 
本发明的分离多核苷酸还可用作杂交探针和引物以鉴定表达本发明抗体的细胞和组织以及表达其的条件。 
另外，本发明的分离多核苷酸可用于改变(即增强、降低或改变)对应于本发明多核苷酸的基因在细胞或生物体中的表达。这些“对应基因”为本发明的基因组DNA序列，其转录产生本发明的多核苷酸来源的mRNA。 
本发明还提供质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包括如 上的至少一种本发明的核酸。 
本发明的分离多核苷酸可有效地(operably)连接至表达调控序列用于重组产生本发明的多肽。另外本领域技术人员将认识到本发明的多核苷酸可有效地连接至编码不同抗体同型恒定区的熟知的核苷酸序列。例如，编码本发明轻链可变区(例如SEQ ID NO：4或8所示序列)的本发明的多核苷酸可有效地连接至编码κ轻链或λ轻链恒定区(或其衍生物)的核苷酸序列，使得连接的核苷酸的表达产生具有特异性结合和中和GDF-8的可变区的完全的κ或λ轻链。同样，编码本发明重链可变区(例如SEQ ID NO：2或6中所示序列)的本发明的多核苷酸可有效地连接至编码重链同型恒定区(或其衍生物)，例如IgM、IgD、IgE、IgG和IgA的核苷酸序列。表达重组蛋白质的常规方法为本领域所熟知。所述重组蛋白质可以可溶形式表达，用于治疗与GDF-8活性有关的病症，例如肌肉和骨骼退行性病症。 
本发明的重组表达载体可携带其他的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)、标签序列(如组氨酸)和筛选标记基因。筛选标记基因便于选择已导入载体的宿主细胞。例如，通常筛选标记基因(如G418、潮霉素或氨甲喋呤)赋予抗药性给已导入载体的宿主细胞，。优选的筛选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲喋呤选择/扩增的dhff-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。 
可选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和视情况而定的其他序列。载体可以是质粒或病毒，例如视情况而定为噬菌体或噬粒。为了解详情参见，例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第二版，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。例如核酸构建体的制备、突变、测序、DNA导入细胞和基因表达以及蛋白质分析中用于核酸操作的许多已知技术和方案在Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等，John Wiley & Sons，1992中详细描写。 
本发明还提供包括如上的一种或多种构建体的宿主细胞。编码任何此处提供的CDR(H1、H2、H3、L1、L2或L3)、VH或VL结构域或抗原-结合片段的核酸形成本发明的一个方面。 
本发明还包括通过在宿主细胞中表达来自编码核酸的蛋白质而产生肽的方法。表达可通过在合适的条件下培养包含该核酸的重组宿主细胞而实现。 
根据本发明的特异性抗体片段，VH和/或VL结构域以及编码核酸分子和载体可以分离和纯化的形式提供，例如从其自然环境，以基本上纯的或均一的形式，或对于核酸，没有或基本上没有非编码具有所需功能多肽的序列来源的核酸或基因。 
许多细胞系为用于本发明的多肽和抗体重组表达的合适的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括，例如COS细胞、CHO细胞、293T细胞、A431细胞、3T3细胞、CV-1细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞，以及源自原代组织和原代外植体体外培养的细胞株。所述宿主细胞还允许剪接由基因组DNA组成的本发明的多核苷酸。 
或者，可以在较低等的真核生物如酵母或在原核生物中重组产生本发明的多肽和抗体。可能合适的酵母菌株包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、克卢费氏酵母属菌株和假丝酵母属菌株。可能合适的菌株包括大肠杆菌、枯草杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。如果本发明的多肽在酵母或细菌中制备，其可能有必要例如通过合适位点的磷酸化或糖基化修饰以获得功能性的蛋白质。所述共价吸附可利用熟知的化学或酶促方法完成。 
本发明的多肽和抗体还可通过将本发明的分离多核苷酸有效地连接至一种或多种昆虫表达载体(如杆状病毒载体)中的合适的调控序列并且利用昆虫细胞表达系统而重组产生。用于杆状病毒/Sf9表达系统的材料和方法为市场上可买到的试剂盒形式(例如
Figure BDA00003346823700361
试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)。 
在合适的宿主细胞中重组表达后，可利用已知的纯化方法，如凝胶过滤和离子交换层析从培养基或细胞提取物纯化本发明的多肽和抗体。纯化还可包括用已知结合本发明多肽和抗体的试剂的亲和层析。这些纯化方法还可用于从天然来源纯化本发明的多肽和抗体。 
或者，本发明的多肽和抗体可以便于纯化的形式重组表达。例如，多肽可以表达为与蛋白(例如麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX))的融合体。表达和纯化所述融合蛋白的试剂盒为分别从New England BioLabs(Beverly，MA)、 Pharmacia(Piscataway，NJ)和Invitrogen市售购买。本发明的多肽和抗体还可用小表位标记且随后利用该表位的特异性抗体鉴定或纯化。优选的表位为FLAG表位，其为可从Eastman Kodak(New Haven，CT)买到的。 
本发明的多肽和抗体还可通过已知的常规化学合成产生。用于化学合成本发明多肽和抗体的方法为本领域技术人员所熟知。所述化学合成的多肽和抗体可具有与天然纯化的多肽和抗体同样的生物学特性，并且因此可作为天然的多肽和抗体的生物学活性或免疫代替物而应用。 
本发明另一方面提供包括此处公开的核酸、多肽、载体或抗体和其片段的宿主细胞。更进一步的方面提供包括将本发明的核酸导入宿主细胞的方法。导入可应用任何有效的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体-介导的转染和利用逆转录病毒或另一种病毒例如牛痘或用于昆虫细胞的杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和利用噬菌体的感染。 
核酸导入后可引起或允许从该核酸产生蛋白质，例如通过在适于基因表达的条件下培养该宿主细胞。所述条件为本领域所熟知。 
III.治疗、改善、预防和抑制骨、脂肪、葡萄糖代谢、胰岛素和肌肉病症发展的方法 
ALS中涉及GDF-8以及本发明新抗体的发现使得能够进行治疗、减轻和改善GDF-8-相关病症的方法，例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、代谢性或诱导的骨病症、葡萄糖代谢病症、脂肪病症和胰岛素-相关病症。此外，抗体允许通过测量生物样品中GDF-8的水平而诊断、预测和监测骨、肌肉、脂肪或胰岛素病症的发展。尤其，本发明的抗体可用于治疗患有ALS或其他肌肉病症的个体，或可用于辨别患者是否患有ALS或另一种肌肉病症的方法中。 
本发明的抗体和其他的分子可用于预防、诊断或治疗人或动物中的各种医疗病症。该抗体可用于抑制或降低一种或多种与GDF-8有关的活性。最优选，该抗体抑制或降低相对于未结合的GDF-8活性的一种或多种GDF-8活性。某些实施方案中，GDF-8的活性当由一种或多种抗-GDF-8抗体结合时相对于未通过一种或多种抗-GDF-8抗体结合的成熟 GDF-8蛋白被抑制至少50％，优选至少60、62、64、66、68、70、72、72、76、78、80、82、84、86或88％，更优选至少90、91、92、93或94％，并且甚至更优选至少95％至100％。GDF-8活性的抑制或中和可在例如Thies等，上文中所述的pGL3(CAGA)12报告基因测定法(RGA)和实施例中举例说明的ActRIIB受体测定法中测定。 
通过GDF-8抗体诊断、预后、监测、治疗、改善或预防的医疗病症为GDF-8相关病症，例如，肌肉或神经肌肉病症，包括例如，肌营养不良(MD；包括Duchenne’s肌营养不良)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、肌肉萎缩、器官萎缩、虚弱、管综合症、充血的梗阻性肺病、骨骼肌减少症、恶病质和其他的肌肉损耗综合症(例如由其他疾病和病情引起)。此外，可通过GDF-8抗体诊断、预后、监测、治疗、改善或预防的其他医疗病症为脂肪组织病症，例如肥胖、2型糖尿病、葡萄糖耐受性减低、代谢性综合症(例如X综合症)、由创伤(如烧伤或氮不平衡)诱导的胰岛素抵抗或骨骼退行性疾病(例如骨关节炎、骨质疏松症等等)。优选实施方案中，通过GDF-8抗体诊断、预后、监测、治疗、改善或预防的医疗病症为肌肉或神经肌肉病症。更优选的实施方案中，通过GDF-8抗体诊断、预后、监测、治疗、改善或预防的医疗病症为MD或ALS。本发明最优选的实施方案中，通过本发明的GDF-8拮抗剂(例如抑制GDF-8活性的抗体)诊断、预后、监测、治疗、改善或预防的肌肉或神经肌肉病症为ALS。 
可通过GDF-8拮抗剂诊断、预后、监测、治疗、改善或预防的其他医疗病症为与骨损失有关的病症，其包括骨质疏松症，尤其在老年人和/或经绝后的妇女中、糖皮质激素-诱导的骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎和骨质疏松症-相关的骨折。其他靶代谢性骨疾病和病症包括由于慢性糖皮质激素治疗引起的低骨质量、早期的性腺衰竭、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺陷和神经性厌食。抗体优选用于诊断、预后、监测、治疗、改善或预防哺乳动物，尤其人的所述病症。 
本发明的抗体以治疗有效量给予。通常，治疗有效量可随受试者年龄、病情和性别，以及受试者中医疗病情的严重程度而变化。剂量可由医师确定并且根据需要调整，以适合观察到的治疗效果。所述化合物的毒性和治疗效力可通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法确定，例 如用于确定LD50(群体50％的致死剂量)和ED50(群体50％的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比例，即LD50/ED50为治疗指数，并且优选表现出大的治疗指数的抗体。 
获自细胞培养测定法和动物研究的数据可用于配制用于人中的剂量范围。所述化合物的剂量优选处于包括带有少量毒性或不具毒性的ED50剂量的血液循环浓度范围之内。此剂量可以在此范围内变动，取决于剂型和给药途径。对于在本发明方法中使用的任何抗体，可根据细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。根据动物模型可配制此剂量，使之达到包括如在细胞培养中测定的IC50(即达到对症状半数最大抑制或生物学活性半数最大抑制的检测抗体的浓度)在内的循环血浆浓度范围。例如利用高效液相层析可测定血浆中的水平。可通过合适的生物测定法监测任何特定剂量的效果，包括但不限于，DNA复制测定法、基于转录的测定法、GDF-8蛋白/受体结合测定法、肌酸激酶测定法、基于前成脂肪细胞分化的测定法、基于脂肪细胞中葡萄糖摄取的测定法和免疫学测定法。 
通常，组合物以使得抗体或其结合片段在以1μg/kg至150mg/kg、1μg/kg至100mg/kg、1μg/kg至50mg/kg、1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg至1mg/kg和500μg/kg至1mg/kg的剂量给予而给药。优选，抗体作为丸剂剂量给予，以在该剂量给予后最长时间最大化抗体的循环水平。连续的输液也可在丸剂剂量之前、之后或代替使用。 
IV.鉴定治疗剂的方法 
本发明的又一个方面提供鉴定用于肌肉治疗例如葡萄糖代谢、脂肪和骨病症中的治疗剂的方法。合适的筛选测定法(例如基于ELISA的测定法)为本领域已知。所述筛选测定法中，通过将本发明的抗体和其配体GDF-8组合形成第一结合混合物，并且测量第一结合混合物(M0)中配体与抗体间的结合量。还通过将抗体、配体和待筛的化合物或试剂组合形成第二结合混合物，并且测量第二结合混合物(M1)中配体与抗体间的结合量。随后例如通过计算M1/M0的比例来比较第一和第二结合混合物中的结合量。如果观察到相比第一结合混合物第二结合混合物中结合的降低(即M1/M0＜1)，则该化合物或试剂认为能够抑制GDF-8活 性。结合混合物的配制和优化在本领域技术人员水平内；所述结合混合物还可包含增强或优化结合所必需的缓冲液和盐，并且本发明的筛选测定法中可以包括另外的对照测定法。 
可由此鉴定发现降低抗体-配体结合至少约10％(即M1/M0＜0.9)，优选大于约30％的化合物，并且随后如果需要，在其他测定法(如ActRIIB结合测定法)或实施例中所述或本领域熟知的其他基于细胞和体内测定法中对抑制GDF-8活性的能力进行第二次筛选。 
V.小分子 
抑制患有(或处于患病风险中)GDF-8-相关病症的生物体(或受试者)中或来自涉及所述病症的生物体细胞中的GDF-8活性也可通过使用拮抗，即抑制GDF-8活性的拮抗剂小分子(通常有机小分子)而实现。新的拮抗小分子可通过上述筛选法鉴定并且可用于此处所述的本发明的治疗方法中。 
反之，提高患有(或处于患病风险中)与降低的GDF-8表达和/或活性有关的病症或与降低的GDF-8水平有关的病症生物体(或受试者)中GDF-8活性也可通过使用促进，即增强GDF-8活性的小分子(通常有机小分子)而实现。新的激发型小分子可通过上述筛选法鉴定并且可用于此处所述的本发明的治疗方法中。 
VI.诊断、预后和监测骨、脂肪、葡萄糖代谢、胰岛素和肌肉病症发展的方法 
除治疗例如肌肉、骨、葡萄糖代谢和脂肪病症之外，本发明提供通过检测生物样品，例如血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、唾液、活组织(例如肌肉的)等等中GDF-8降低或提高而诊断上述病症的方法。“诊断的”或“诊断”指确定病理病情的有或无。诊断方法包括通过例如测定来自受试者(人或非人哺乳动物)的生物样品中GDF-8多肽的检测量而检测GDF-8的存在，以及将该检测量与GDF-8多肽的正常量或范围(例如来自已知未患有上述病症的个体的量或范围)比较。虽然特定的诊断方法也许不提供ALS或其他GDF-8-相关病症的确诊，其在该方法提供有助于诊断的阳性指标时确诊。 
本发明还提供通过检测GDF-8的上调而用于预后ALS或其他肌肉 病症或例如骨、葡萄糖代谢和脂肪病症的方法。“预后的”或“预后”指预测病理病情的大概的发展和/或严重程度。预后的方法包括测定来自受试者的生物样品中GDF-8的检测量，以及将该检测量与GDF-8的预后量或范围(例如来自患有不同ALS严重程度的个体的量或范围)比较。检测样品中GDF-8的不同量与对ALS或其他GDF-8-相关病症的某些预后一致。检测特定预后水平的GDF-8的量提供对于受试者的预后。 
本发明还提供通过检测GDF-8的上调或下调用于监测ALS或其他GDF-8-相关病症进程的方法。监测方法包括测定在第一和第二时间取自受试者的生物样品中GDF-8的检测量，以及比较该量。第一和第二时间之间GDF-8量的改变表明在例如ALS或其他GDF-8-相关病症期间严重程度的变化。技术人员将认识到在类似ALS的GDF-8-相关病症中(例如希望增加肌肉质量的病症)，第一和第二时间之间GDF-8的量和/或GDF-8活性的降低表明病症的缓解，而量的提高表明病症的发展。上述监测测定法还可用于评估治疗ALS或其他GDF-8-相关病症的患者中特定治疗干预(例如疾病减弱和/或抵消)的效力。 
本发明的抗体可通过检测体内或体外GDF-8的存在而用于诊断、预后或监测。上述检测方法为本领域所熟知并且包括ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、蛋白质印迹、免疫荧光、免疫沉淀和其他可比较的技术。抗体可另外在诊断试剂盒中提供，其结合一种或多种检测GDF-8的技术。上述试剂盒可包含其他的组分、包装、说明书或其他的材料以帮助检测该蛋白质和使用该试剂盒。 
当抗体设计为诊断、预后或监测的目的时，例如用配体基团(如生物素)或可检测的标记基团(如荧光基团、放射性同位素或酶)修饰他们可能是需要的。如果需要，抗体(不管多克隆的或单克隆的)可利用常规方法标记。合适的标记物包括荧光团、生色团、放射性原子、密电子试剂、酶和具有特定结合伴侣的配体。酶通常通过其活性检测。例如，辣根过氧化酶可通过其转变四甲基联苯胺(TMB)为蓝色颜料的能力而检测，用分光光度计计量。其他合适的标记物可包括生物素和抗生物素蛋白或链亲和素、IgG和蛋白A，以及本领域已知的许多受体-配体偶联物。其他排列和可能性对本领域普通技术人员将是显而易见的，并且认为是在本发明范围内的同等物。 
VII.药物组合物和给药方法 
本发明提供包括本发明GDF-8拮抗剂，即多肽、多核苷酸、载体、抗体、抗体片段和小分子的组合物。上述组合物可适合于药学用途并且给予患者。该组合物通常包括本发明的一种或多种分子，优选抗体，以及药学可接受的赋形剂。本发明的抗-GDF-8抗体可用于体外、活体外或与药学可接受载体结合时掺入药物组合物中。如此处所用，短语“药学可接受的赋形剂”包括任何以及所有的溶剂、溶液、缓冲液、分散体介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等等，其适合药学给予。除本发明的抗体和载体之外，所述组合物可包含各种稀释剂、填料、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和本领域熟知的其他材料。术语“药学可接受的”指不干扰活性组分生物学活性有效性的无毒材料。载体的特征取决于给药途径。用于药学活性物质的所述介质和试剂的用途为本领域所熟知。组合物还可包含提供辅助的、额外的或增强的治疗功能的其他活性化合物。该药物组合物还可与给药说明书一起包括在容器、包装或配量器中。 
本发明的药物组合物可以是脂质体形式，其中除其他的药学可接受载体之外，本发明的抗体与两性试剂(如脂类)组合，所述试剂以水溶液中的胶粒、不溶性单层、液态结晶或片状层的聚集形式存在。适于脂质体配制的脂类包括，但不限于单酸甘油酯、甘油二酯、脑硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、胆汁酸等等。所述脂质体制剂的制备在本领域技术水平内。 
如此处所用的，术语“治疗有效量”指药物组合物或方法的每种活性组分的总量，其足以表现出有意义的患者益处，例如症状的改善、所述病情的痊愈或痊愈速率的提高。当施加单一的活性成分时，单独给予，该术语指组分单独的。当施加组合时，术语指产生治疗效果的活性成分的组合量，而不管其以组合、连续或同时给予。 
在实践本发明的治疗方法或使用中，例如治疗有效量的结合GDF-8并且干涉GDF-8信号的抗体给予受试者，例如哺乳动物(例如人)。本发明的抗体可根据本发明的方法单独或与其他的疗法(如抗炎剂)结合给予。当与一种或多种试剂共同给予时，本发明的抗体可与第二种试剂或同时或按顺序给予。如果按顺序给予，主治医师将决定给予本发明的抗体联合其他试剂的合适顺序。 
在一个实施方案中，本发明的抗体，例如其药物组合物以联合治疗给予，即结合可用于治疗病理病情或病症，如肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、代谢性或诱导的骨病症、脂肪病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症，以及过敏性和炎症病症的其他试剂，例如治疗剂。术语“以组合”在这里指试剂基本上同时给予，或同时或按顺序。如果按顺序给予，在第二种化合物给药的起始时，两种化合物的第一种优选在治疗部位或在受试者中仍然可检测其有效浓度。 
本发明的药物组合物被配制成与其计划的给药途径相适应。完成给药的方法为本领域普通技术人员所知。还可能获得局部或口服给予，或其能够透过粘膜传递的组合物。实践本发明方法的用于药物组合物中本发明抗体的给药可以各种常规方式，如进行口腔摄入、吸入、皮肤、皮下或静脉注射。 
用于皮内或皮下给药的溶液或悬液通常包括一种或多种下列组分：无菌稀释剂如注射用水、生理盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及渗透压调节剂如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节。所述制剂可被封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器、或多剂量药瓶内。 
适合于注射的药物组合物包括无菌的水溶液或分散体，以及用于临时配制成无菌注射液或分散体的无菌粉末。用于静脉内给药的适合载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorTMEL(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下此组合物都必须是无菌的，并且应该是易于以可注射状态存在的流质。在生产和贮存条件下它必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。此载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及其适合的混合物。例如借助于如下方法可保持其适当的流动性：使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下保持所需的颗粒大小，以及使用表面活性剂。用各种抗菌剂和抗真菌剂可实现防止微生物作用，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在很多情况下，最好是在组合物内包含等渗剂例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物内包含延缓吸收剂(如单 硬脂酸铝和明胶)可引起注射的组合物吸收的延迟。 
当本发明抗体的治疗有效量通过例如静脉内的、皮肤或皮下注射给予时，结合剂将是无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式。适当注意pH、等渗性、稳定性等等，所述肠胃外可接受的蛋白质溶液的制备在本领域技术人员能力范围内。用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选药物组合物应当包含结合剂之外的等渗载体如氯化钠注射液、Ringer’s注射液、葡萄糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸盐Ringer’s注射液或本领域已知的其他载体。本发明的药物组合物还可包含本领域技术人员已知的稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或其他添加剂。 
本发明药物组合物中的本发明抗体(或本发明其他的拮抗剂)的量将取决于所治疗的病情的性质和严重程度，以及患者之前所经历的治疗的性质。最终，主治医师将决定治疗每个单独患者的抗体量。最初，主治医师给予低剂量的抗体并且观察患者的应答。大剂量抗体可给至患者获得最优的治疗效果，并且在那点时剂量通常不进一步增加。预期用于实践本发明方法的各种药物组合物应当包含约每公斤体重0.1μg至50mg抗体。 
利用本发明药物组合物的治疗持续时间取决于所治疗的疾病严重程度和病情以及每个单独的患者潜在的特异性应答而不同。预期抗体每次施用的持续时间将例如通过皮下途径在每周一次的范围内。最终主治医师将决定利用本发明的药物组合物合适的治疗持续时间。 
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装在明胶胶囊内或压制成片剂。为了口服治疗给药的目的，可使GDF-8拮抗剂(例如抗体、小分子等等)同赋形剂混合，以片剂或胶囊剂的形式使用。作为组合物的一部分还可包含药剂学相容的结合剂和/或佐剂材料。片剂、丸剂、胶囊剂等可以包含任何如下成分或类似特性的化合物：结合剂如微晶纤维素、西黄蓍树脂或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、PrimogelTM或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或SterotesTM；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者芳香剂如薄荷、甲基水扬酸酯或柑橘芳香剂。 
当口服给予治疗有效量的本发明药物组合物，例如结合GDF-8并且干涉GDF-8信号的抗体时，结合剂将为片剂、胶囊、粉剂、溶液或酏剂的形式。当以片剂形式给予时，本发明的药物组合物可另外包含固体载 体如明胶或佐剂。片剂、胶囊和粉剂包含约5至95％的结合剂，并且优选约25至90％的结合剂。当以液态给予时，可以添加液体载体如水、石油、动物或植物来源的油例如花生油、矿物油、豆油或芝麻油或合成油(考虑个体患者和/或个体的大群体对所述液体载体的过敏反应后)。药物组合物的液体形式可进一步包含生理盐溶液、右旋糖或其他的糖类溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给予时，药物组合物包含约0.5至90％重量计的结合剂，并且优选约1至50％的结合剂。 
对于吸入给药，GDF-8拮抗剂以气雾剂喷雾的形式用装有适当推进剂(如二氧化碳气体)的压缩容器或分送器，或者喷雾器递送。因此，此处所述的化合物可通过吸入肺组织而给予。除非另外指明，如此处所用的术语“肺组织”指呼吸道的任何组织并且包括上下呼吸道。一种或多种GDF-8抗体可与用于治疗肺疾的一种或多种现有模式结合给予。 
在一个实例中，配制化合物用于喷雾器。在一个实施方案中，化合物可以冻干形式贮存(例如在室温下)并且在吸入之前在溶液中重构。 
还可以配制该化合物用于以利用医疗装置，例如吸入器(参见例如，美国专利No.6,102,035(粉末吸入器)和6,012,454(干粉吸入器))吸入。吸入器可包括用于活性化合物(以适于贮存的pH存在)的分离室和用于中和缓冲液的另一个室，以及将该化合物在雾化之前立即与中和缓冲液组合的机构。在一个实施方案中，吸入器为定量吸入器。 
虽然不是必需的，递送增强剂(如表面活性剂)可用于进一步提高肺递送。如此处所用的“表面活性剂”指具有亲水性和亲脂性部分的化合物，其通过与两种不互溶相之间接触面的相互作用而促进药物吸收。具有干燥颗粒的表面活性剂由于若干原因(例如颗粒结块减少，巨噬细胞吞噬作用降低等等)是有用的，。当与肺表面活性剂偶联时，可因为表面活性剂(如DPPC)将大大促进化合物扩散而实现化合物更有效的吸收。表面活性剂为本领域所熟知并且包括但不限于，磷酸甘油酯，例如卵磷脂、L-α卵磷脂二棕榈酰基(DPPC)和心磷脂(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧化乙烯-9-；氧金根醚(auryl ether)；棕榈酸；油酸；去水山梨糖醇三油酸酯(Span85)；甘胆酸盐；表面活性素；poloxomer；山梨糖醇酐脂肪酸酯；去水山梨糖醇三油酸酯；泰洛沙泊和磷脂。 
还可以通过透粘膜或透皮方式进行全身性给药。例如，在包括Fc部分的抗体的情况下，组合物能够通过FcRn受体-介导的途径(例如美国专利No.6,030,613)而透粘膜传递(例如肠、口腔或肺)。通常，可例如通过使用糖锭、鼻喷雾剂、吸入器或栓剂实现透粘膜给药。对于透皮给药，活性化合物配制成本领域通常已知的软膏、油膏剂、凝胶剂、膜片或乳膏剂。对于透粘膜或透皮给药，该制剂中使用了适于透过屏障的渗透剂。所述渗透剂是本领域通常所知的，包括例如洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。 
药物组合物还可由适于基因治疗的组合物组成，即由此处公开的多核苷酸组成的组合物。在基因治疗的情况下，药学可接受载体可包括，例如脂类、胶原球、阳离子乳剂系统、水、盐水缓冲液、病毒载体、乳糜粒剩余物、聚合纳米颗粒(例如明胶-DNA或壳聚糖-DNA)、金颗粒、聚合复合物、脂聚物(lipoplexes)、多聚物(polyplexes)等等(参见例如，Gardlik等(2005)Med.Sci.Monit.11(4)：RA110-21)。 
稳定性和保留 
在一个实施方案中，例如在血液、血清、淋巴、支气管肺或支气管肺泡灌洗或其他组织中，GDF-8抗体与提高其循环中稳定性和/或滞留至少1.5、2、5、10或50倍的部分物理连接。 
本发明的拮抗剂可用保护免受身体快速消除的载体制备，如控-释制剂，包括植入和微囊密封的递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。包含GDF-8拮抗剂，例如一种或多种抗-GDF-8抗体的脂质体悬液还可以用作药学可接受载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备。 
例如，GDF-8抗体可与聚合物缔合，例如基本上非抗原性的聚合物，如聚烯基氧化物或聚环氧乙烷。合适的聚合物重量基本上不同。可使用具有数均分子量约200至约35,000(或约1,000至约15,000，或约2,000至约12,500)的聚合物。 
例如，GDF-8抗体可偶联至水溶性聚合物，例如亲水性的聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。所述聚合物的非限制性列表包 括聚烯基氧化物同聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持该嵌段共聚物的水溶性。其他有用的聚合物包括聚氧化烯如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；分枝或不分枝的多糖，其包括糖类单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如多聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同聚多糖和杂多糖如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、葡聚糖硫酸盐、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖的多糖亚基例如透明质酸；糖醇聚合物如聚山梨醇和聚甘露醇；肝素等等。 
其他化合物也可附着于相同的聚合物，例如细胞毒素、标记物或另一种靶试剂，例如另一种GDF-8抗体或无关的配体。单-活化的、烷氧基-封端的聚烯基氧化物(PAO)，例如单甲氧基-封端的聚乙二醇(mPEG)、C1-4烷基-封端聚合物和双-活化的聚环氧乙烷(乙二醇)可用于交联(参见例如，美国专利No.5,951,974)。 
在一个实施方案中，交联至配体之前的聚合物不必，但优选为水溶性的。通常，交联后的产物为水溶性的，例如表现出水溶性至少约0.01mg/ml，并且更优选至少约0.1mg/ml，且更优选至少约1mg/ml。此外，聚合物在偶联形式中不应该是高免疫原性的，如果偶联物想要通过静脉内输液、气溶胶化或注射液给予，则也不应该具有不适于该途径的粘度。 
在一个实施方案中，聚合物仅包含反应性的单个基团。此有助于避免配体分子相互交联。然而，最佳化反应条件以降低配体分子之间交联或通过凝胶过滤或离子交换层析纯化反应产物以回收基本上同质的衍生物也在此处所述范围内。其他的实施方案中，聚合物包含用于将多个配体连接至聚合物骨架的两个或更多反应基团。此外，凝胶过滤或离子交换层析可用于回收基本上均一形式的所需的衍生物。 
聚合物的分子量可上至约500,000D，并且优选为至少约20,000D或至少约30,000D，或至少约40,000D。分子量的选择取决于获得的偶联物的有效大小、聚合物的性质(例如结构，如线性的或分枝的)以及衍生化程度。 
共价键可用于将GDF-8抗体附着于聚合物，例如交联至配体的N-末端氨基和配体赖氨酸残基上的ε氨基，以及其他的氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其他亲水性基团。聚合物可不用多功能的(通常双功能的)交联剂而直接共价键合至GDF-8抗体。利用基于三聚氯氰、羧基二咪唑、醛-活性基团(PEG醇盐加溴代乙醛的二乙基乙酰基；PEG加DMSO和乙酸酐，或PEG氯化物加4-羟基苯甲醛的苯酚盐，活化的琥珀酰亚胺酯，活化的PEG二硫代碳酸盐，2，4，5-氯甲酸三氯苯酯(2，4，5-trichlorophenylcloroformate)或P-氯甲酸硝基苯酯活化的PEG)的已知化学物实现共价键合至氨基基团。羧基可通过利用碳二亚胺偶联PEG-胺而衍生。巯基可通过偶联至马来酰亚氨基-取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐)(参见WO97/10847)或PEG-马来酰亚胺)而衍生。或者，配体上的游离氨基(例如赖氨酸残基上的ε氨基)可用2-亚氨基-四氢噻吩(Traut’s试剂)硫化且随后偶联至PEG的含马来酰亚胺的衍生物，例如Pedley等(1994)Br.J.Cancer70：1126-30中所述的。 
可附着于GDF-8抗体的功能化的PEG聚合物例如从Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，AL)得到。这些市售的PEG衍生物包括：例如氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG的琥珀酰亚胺基碳酸酯、氨基酸PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG-氧羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG-三氟乙基磺酸酯、PEG-缩水甘油基醚、PEG-醛、PEG-乙烯砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-二硫化邻吡啶(orthopyridyl-disulfide)、杂官能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷、和PEG phospholide。取决于GDF-8抗体、所需的PEG化程度和所采用的PEG衍生物，对这些PEG衍生物进行偶联的反应条件可有所不同。在选择PEG衍生物中涉及的一些因素包括：所需的连接位点(如赖氨酸或半胱氨酸的R-基团)，衍生物的水解稳定性和反应性，连接的稳定性、毒性和免疫原性，分析的适合性等。使用任一特定衍生物的具体说明可从制造商处获得。 
GDF-8抗体和聚合物的偶联物可例如通过凝胶过滤或离子交换层析或其他的层析形式(例如HPLC)分离自未反应的起始材料。用相同 方式将不同种类的偶联物相互纯化开。也可由于未反应的氨基酸离子性质的差异(参见例如WO96/34015)而分辨不同的种类(例如包含一个或两个PEG残基)。 
本发明的多核苷酸和蛋白质预计表现出此处鉴定的一种或多种用途或生物学活性(包括与以下引用的测定法有关的那些)。本发明蛋白质所述的用途或活性可通过所述蛋白质的给予或使用，或通过编码所述蛋白质的多核苷酸(如在基因治疗或适于DNA导入的载体中)的给予或使用而提供。 
以便于剂量给予和均匀性的剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物将是有利的。如此处所用剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理分散单位，每一单位包含与所需的药学载体结合、预测产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格由如下因素规定并直接取决于这些因素：活性化合物的独特特征和将要达到的特定治疗作用，以及配制用于个体治疗的该活性化合物在技术上的内在局限性。 
本发明的另一方面因此涉及用于例如与或不与其他的治疗化合物一起给予本发明的GDF-8抗体或用于利用抗-GDF-8抗体作为研究或治疗工具以确定生物样品中GDF-8的存在和/或水平的试剂盒，如ELISA试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括配制在药学载体中的一种或多种抗-GDF-8抗体以及酌情配制在一种或多种分离药物制剂中的至少一种试剂，例如治疗剂。 
以下实施例用于理解本发明但并不试图，以及不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。该实施例不包括常规方法的详细说明，如杂交瘤形成、ELISA、增殖测定法、流式细胞分析和重组DNA技术。所述方法为本领域普通技术人员所熟知。 
贯穿本申请引用的所有参考文献、专利、公开的专利申请和其他的专利文件的全部内容在此通过引用引入。 
实施例 
实施例1 
抗-GDF-8抗体RK35的产生和鉴定 
人GDF-8蛋白(成熟的GDF-8和GDF-8前肽)以及BMP-11蛋白 如美国公开专利申请No.2004/0142382中所述分离和鉴定。 
六只雌性肌肉抑制素基因敲除的BALB/c小鼠(8周龄；McPherron等，上文)通过用Freund’s完全佐剂中20mg的重组GDF-8二聚体皮下注射免疫。 
以2-周的时间间隔给予数次Freund’s不完全佐剂中相同量抗原的激发注射并且融合之前给予PBS中2μg的最终静脉注射(尾部静脉)。表现最高抗体效价的小鼠中两只的脾细胞利用标准技术与小鼠骨髓瘤细胞(ATCC登录号No.P3X63.Ag8.653)融合(Oi和Herzenberger(1980)In：Mishell，B.B.，Shiigi，S.M.，Henry，C.，Mishell，R.I.(Eds.)，Selected Methods in Cellular Immunology W.H.Freemen，San Francisco，pp.351-72)。10-14天后，收集上清并且通过固相和液相ELISA(Whittemore等，上文)筛选抗-GDF-8抗体的产生。标准ELISA技术和pGL3-(CAGA)12报道分子测定法(Theis等(2001)Growth Factors 18：251-59)利用通过融合人ActRIIB-Fc受体胞外域与人IgG1Fc区域而产生的嵌合ActRIIB-Fc用于测定抑制抑肌素结合至其受体ActRIIB的IC50。被选择用于进一步研究的杂交瘤通过重复限制稀释以确保单克隆化而实现单克隆。选择单克隆抗体RK35用于进一步研究。 
实施例2 
对GDF-8具有高亲和力并且呈现中和活性的RK35单克隆抗体 
实施例2.1：实验流程 
对于ELISA，生物素化的GDF-8以1μg/ml涂布于96孔链亲和素微量滴定板(Pierce，Rockford，IL)上4℃过夜。涂布后，从孔除去溶液，并且该平板在室温下在SuperBlock溶液(Pierce)中封阻1小时。平板用PBS漂洗，并且100μl RK35抗体以不同的浓度添加至孔。平板在室温下温育1小时且随后用PBS洗涤。100μl抗-huIgG-HRP偶联物(Southern Biotech，Birmingham，AL)的1∶5000稀释物添加至每个孔并且平板在室温下温育1小时。每个平板用PBS洗涤三次。TMB底物(100μl)添加至每个孔并且温育至显色。通过添加100μl0.18M的H2SO4终止反应。产生的信号通过利用微量滴定板读数器读取450nm的吸光度而测量。利用人同型对照抗体证实对GDF-8的结合。 
重组ActRIIB-Fc嵌合体(R & D Systems，Minneapolis，MN，Cat.No. 339-RB/CF)以0.2M碳酸钠缓冲液中1μg/ml涂布于96-孔平底测定平皿(Costar，NY，Cat.No.3590)在4℃过夜。平皿随后用1mg/ml牛血清白蛋白封阻并且遵循标准ELISA方案洗涤。等分(100μl)生物素化的GDF-8或BMP-11以不同的浓度添加至封阻的ELISA平皿，温育1hr，洗涤并且通过链亲和素辣根过氧化酶(SA-HRP，BD PharMingen，San Diego，CA，Cat.No.13047E)随后添加TMB(KPL，Gaithersburg，MD，Cat.No.50-76-04)而检测结合的GDF-8或BMP-11量。在Molecular Devices微量板读数器中于450nm处进行比色测量。为了分析抑制活性，通过与20ng/ml GDF-8或20ng/ml BMP-11预温育而在不同浓度检测RK35。在室温下温育1hr后，100μl RK35和GDF-8或BMP-11混合物添加至该平皿。结合因子的检测和定量在Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300：965-71中描述。 
为了证实GDF-8的活性，利用在TGF-β诱导启动子控制下表达荧光素酶的报告载体pGL3(CAGA)12产生报告基因测定法(RGA)。CAGA为TGF-β-诱导基因PAI-1启动子内的TGF-β-应答序列(Denner等(1998)EMBO J.17：3091-3100)。利用基础的荧光素酶报道分子质粒pGL3(Promega，Madison，WI)制备包含12个CAGA框的报告载体。来自腺病毒主要晚期启动子的TATA框和转录起始位点(-35/+10)插入BglII和HindIII位点之间。退火包含12个重复CAGA框，即AGCCAGACA的寡核苷酸且克隆入XhoI位点。人横纹肌肉瘤细胞系A204(ATCCHTB-82)用pGL3(CAGA)12利用FuGENE6转染试剂(Boehringer Manheim，Germany)瞬时转染。转染后，细胞在补充2mM谷氨酰胺、100U/ml链霉素、100μg/ml青霉素和10％胎牛血清的McCoy’s5A培养基中在96-孔平皿上培养16小时。细胞随后用有或无10ng/mlGDF-8的具有谷氨酰胺、链霉素、青霉素和1mg/ml牛血清白蛋白的McCoy’s5A培养基37℃处理6小时。利用荧光素酶测定系统(Promega)定量所处理细胞中的荧光素酶。为了检测RK35的抑制活性，GDF-8与抗体在室温下预温育1小时。该混合物随后添加至转染的细胞并且细胞在37℃温育6小时。利用荧光素酶测定系统(Promega)定量荧光素酶。 
实施例2.2：结果 
通过用纯化的重组人GDF-8，其氨基酸序列与成熟的鼠抑肌素氨基 酸序列相同(McPherron等，1997)免疫GDF-8敲除小鼠而产生抑肌素的高亲和力小鼠单克隆抗体。以高亲和力结合GDF-8的RK35抗体通过直接的ELISA检测(4nM；图1A)。竞争性ELISA用于评估RK35抑制GDF-8结合其高亲和力受体ActRIIB的能力。RK35以IC50～2.5nM封阻生物素化的GDF-8结合至固定的ActRIIB-Fc(图1B)。可溶性ActRIIb也封阻GDF-8结合至固定的ActRIIb-Fc而对照抗体不封阻结合。也利用基于报道分子测定法的pGL3-(CAGA)12细胞测量RK35的中和活性。该测定法中荧光素酶基因在GDF-8/TGF-β应答启动子控制下克隆并且人A204横纹肌肉瘤细胞用该报道分子质粒瞬时转染。GDF-8诱导的A204细胞中荧光素酶活性的提高以剂量依赖性的方式被RK35封阻(图1C)。RK35以0.2nM的IC50降低GDF-8的信号转导活性。因此，RK35为针对抗GDF-8的新型的高效鼠单克隆中和抗体。 
实施例3 
野生型和ALS啮齿类模型中RK35的体内活性 
实施例3.1：实验流程 
实施例3.1.1：动物和药物治疗 
所有涉及动物的过程由University of Pennsylvania或Wyeth的IACUC批准。在B6SJL杂交背景(Jackson Laboratories)上表达人SODG93A的转基因小鼠室内交配B6SJLF1雌性种鼠(Jackson Laboratories)。通过PCR筛选子代；转基因阴性小鼠用作年龄-匹配的同窝野生型对照。小鼠分成四组：29只SODG93A小鼠用抗-抑肌素抗体RK35处理，28只SODG93A小鼠用磷酸缓冲盐溶液处理(PBS)(介载体)，23只野生型小鼠用RK35处理，并且23只野生型小鼠用PBS处理。出生后28天开始，小鼠每周经腹膜内注射抗-GDF-8单克隆抗体RK35或等体积PBS。第一次剂量为40mg/kg；随后的剂量为20mg/kg/周，按照描述用于抗-抑肌素抗体JA16的方案(Whittemore，等，上文)。每组的9-12只小鼠在84～90天(12周)龄(平均88天)处死以评估湿的肌肉质量和组织结构，并且剩下的小鼠监测至到达疾病末期(～134天)，定义为左右外侧躺卧时30秒内无法向右(failure to right)。 
同时，雄性和雌性等量混合的表达人SODG93A的转基因大鼠(Howland等，上文)(58只)给予PBS(介载体)或RK35。每组中 十只大鼠在95天龄安乐死以测定RK35对湿的肌肉质量的作用。每组剩下的19只持续至疾病末期。利用雌性转基因的和野生型同窝对照大鼠的第二项研究用于比较跨越处理组和基因型的体重提高以及握力变化。每项研究中，大鼠经腹膜内注射40mg/kg的RK35(6周龄时(～42天))并随后注射20mg/kg/周或介载体，直至在95天安乐死以分析肌肉质量或由右侧反射失败(right reflex failure)测量的末期。 
实施例3.1.2：体重和肌肉质量测量 
最初的体重均匀分配至群组当中的动物以确保研究开始时相等的体重平均值。重量损失的发作以年龄记分，该年龄是观察到三次连续的重量损失的第一次。在与疾病早期(小鼠为88天，大鼠为95天)和末期(小鼠～134天并且大鼠～128天)一致的时间点对腓肠肌、颅胫骨肌、四头肌和隔肌测定湿的肌肉质量。动物安乐死并且每条腿的肌肉定量解剖并且称重；平均左右腿的值。 
实施例3.1.3：肌肉组织病理学和运动神经元计数 
固定腓肠肌和隔肌并且切片用于H&E染色(Howland等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：1604-29)。由不知样品身份的两个独立的病理学家进行萎缩和增生的计分。通过在88天和末期对腓肠肌肌肉(PBS-和RK35-处理的SODG93A小鼠和PBS-处理的野生型小鼠)，以及末期对隔肌肌肉(PBS-和RK35-处理的SODG93A和PBS-处理的野生型)的形态测量(Axiovision4.3，Zeiss，Thornwood，NY)测定纤维直径。每组的三个肌肉速冻于干冰-冷却的异戊烷中，以8μm厚冷冻切割并且利用抗-层粘连蛋白抗体免疫染色(Sigma，St.Louis，MO；目录编号L9393)。利用Zeiss Axiovision软件进行至少两百个纤维短轴最大直径的长度测量。纤维直径以20μm间隔设置，并对每个肌肉组产生频率直方图。 
对每组(野生型、PBS-治疗的SODG93A和RK35-治疗的SODG93A)3只小鼠在疾病早期阶段和末期进行运动神经元计数(总计分析18只小鼠)。从去头小鼠除去的脊柱后-固定于4％多聚甲醛中，随后解剖脊索并且在4％多聚甲醛中后-固定另外的24小时。利用MultiBrainTM技术(Neuroscience Associates，Knoxville，TN)，18条腰段脊髓一起包埋 于单个块(block)，并且顺着腰椎扩大部分的整个区段(～6mm)50um以冠状平面横切。每第六个切片(300μm)用劳氏紫NISSL染色以显示细胞体(Bjugn(1993)Brain Res.627：25-33；Kieran等(2004)Nat.Med.10：402-05)。利用两种独立的方法进行计数。第一种，由不知样品身份的观察者利用Zeiss Axoplan2以20x和40x分析每18只小鼠中包含L3-5的十个脊髓切片。计数每个切片的腹角，通过之前所述的可见的细胞核确定大的健康运动神经元(Kieran等，上文)。得到的数据表示为每一腹角大运动神经元的平均数。第二种，来自L3-L5区域的切片利用配备了机械化载物台、电子指针测微计和体视学软件的Zeiss Axioskop2(Stereo Investigator(MBF Bioscience，Williston，VT)体视学分析，如(West等(1991)Anat.Rec.231：482-97；Schmitz和Hof(2000)J.Chem.Neuroanat.20：93-114；Schmitz和Hof(2005)Neuroscience130：813-31)所述；α-运动神经元作为具有大于300μm2最大投影面积的神经元而计分。 
实施例3.1.4：表型分析 
按所述的(LaMonte等(2002)Neuron34：715-24)在出生后28天开始每两周对治疗和对照小鼠(n＝8-24)的前肢和后肢进行握力测量(Columbus Instruments，Columbus，OH)。转基因和野生型大鼠利用Dunnett大鼠握力计量仪(MJS Technology，Stevenage，Hertfordshire，England)在早期疾病期(出生后95和110天之间；n＝10)每周两次检测前肢握力。大鼠还通过旋转(rotorod)(Ugo Basile，Comerio，Italy)分析以及监测步态异常和四肢可动性程度(数据未示出)。 
实施例3.1.5：电生理学 
对基因型和处理组双盲进行肌电图学(EMG)记录和数据分析。维持35-37℃体温的戊巴比妥-麻醉的大鼠通过将同轴单极针电极(9013R0011，Medtronic，MN，USA)插入由手术暴露的隔肌肌肉而进行针EMG直至每次吸气出现EMG干涉类型脉冲。用由MP150 Data acquisition Unit、UIM100C Universal Interface Module、EMG100CElectromyopraphy组件和Acknowledge软件(BIOPAC Systems Inc，Goleta，CA)组成的BIOPAC装备获得20KHz的电信号。首先分析信 号以除去60Hz假象并且在500和1000Hz之间带通过滤以除去由于呼吸造成的运动假象并且加强运动-单位流量。EMG脉冲通过校正信号，在10Hz低通过滤并且随后检测得到的包封大于其平均值的时间而鉴定。持续小于100ms的脉冲并不计数，并且持续小于100ms的非脉冲周期算作是周围脉冲的部分。最后，非整流信号中的峰值利用等于三倍于非脉冲周期期间信号振幅标准差的峰值检测阈设置检测。脉冲峰爆发分析(spike burst analysis)用K.C.McGill(Stanford University，CA)编写的定制软件(custom software)进行，并且每只动物的脉冲峰速率(Hz)计算为每一脉冲的峰值除以平均脉冲持续时间的平均数。 
实施例3.1.6：数据分析和统计 
双-因子-重复测量ANOVA模型利用SAS混合方法应用于体重数据以及所有握力数据。二-因子ANOVA线性模型利用SAS GLM方法应用于肌肉质量数据。电生理数据通过双样品t-检验分析。对于运动神经元计数数据，利用呈现泊松分布的归纳的线性模型(GLM)。通过ANOVA，随后是Tukey’s多次对比检验分析肌纤维数据。p值小于0.05时的对比认为是统计学上显著的；0.05＜p＜0.15的对比指趋向。 
实施例3.2：结果 
实施例3.2.1：RK35治疗提高SODG93A啮齿类的体重但不延长生存 
在出生后28天开始，SODG93A小鼠用抗-抑肌素抗体RK35治疗并且持续至疾病末期(出生后大约134天)。相比PBS-治疗的SODG93A小鼠，RK35治疗导致出生后40至120天体重的显著增加。虽然PBS-治疗的SODG93A小鼠在70天达到27.78±0.46g的最大体重，但RK35-治疗的小鼠达到32.13±0.48g的最大体重，相对提高16％(图2A)。虽然野生型小鼠在整个研究过程中继续增加体重，PBS-和RK35-治疗的小鼠开始显示由于出生后大约98天疾病发展造成的显著失重迹象。 
转基因SODG93A大鼠还在出生后42天开始用RK35抗体治疗并且持续至疾病末期(～128天大小)。相比PBS-治疗的大鼠，SODG93A大鼠中抗-抑肌素RK35的治疗导致体重增加(图2B)。接受RK35的转基因大鼠早在出生后60天称重显著超过PBS-治疗的转基因大鼠(p＜0.05)，相当于剂量给药起始后3周。RK35-治疗的雄性大鼠在96天达 到最大的458.8±6.5g，超过PBS-治疗的雄性大鼠419.1±10.7g10％的增加。RK35-治疗的雌性达到最大的289.7±9.3g，超过PBS-治疗的雌性252.8±6.0g 15％的增加。用PBS或RK35治疗的SODG93A大鼠在～112天后由于疾病发展而开始显示显著的失重；RK35治疗没有延缓失重的起始。 
虽然RK35治疗导致体重的显著提高，发明人观察到RK35治疗对生存无作用。由确定的30秒内不能向右的端点所测量的末期时间对于RK35-治疗的SODG93A小鼠(n＝16)为132±8天，而PBS-治疗的小鼠通过134±7天(n＝17)达到末期。相比PBS-治疗的SODG93A大鼠的128±6天，用RK35治疗的SODG93A大鼠通过125±8天达到末期。这些差异不是统计显著的，表明在ALS的小鼠或大鼠模型中抑肌素的抑制不延缓到达疾病末期的时间。 
实施例3.2.2：抑肌素抑制对肌肉质量和力量的作用 
为了测定抑肌素抑制是否减缓肌肉损耗，每组的SODG93A转基因和野生型小鼠在出生后88天处死，此时间接近通过RK35治疗诱导的最大体重增加。在该时间点，相对于与疾病早期一致的野生型对照小鼠，PBS-治疗SODG93A小鼠显示腓肠肌、颅胫骨肌和四头肌肌肉质量的显著降低(图2C)。相反，与在88-天的时间点的年龄-匹配的PBS-治疗SODG93A小鼠相比，RK35-治疗的SODG93A小鼠呈现所有检查的肌肉中肌肉质量的统计学意义的提高，从～19％至32％(腓肠肌肌肉，+26％；颅胫骨肌，+19％；四头肌，+32％)。虽然疾病早期阶段PBS-治疗的SODG93A小鼠隔肌中没有观察到显著的肌肉质量损失；RK35治疗同样诱导该肌肉中质量的显著增加(+21％)。 
监测每组中剩下的小鼠直至由右侧反射检验限定的末期。在末期，在RK35-治疗和PBS-治疗的SODG93A小鼠中观察到腿肌肉损耗(图2E)。与对88-天小鼠组织的观察相反，末期时PBS-治疗的SODG93A小鼠显示相对于野生型动物的隔肌肌肉质量的明显减少(图2E)。然而，治疗的SODG93A小鼠中观察到的RK35-诱导的隔肌质量增加在末期仍然显著，表明抑肌素抑制减缓SODG93A小鼠中隔肌的萎缩。 
还调查了SODG93A大鼠中抗-抑肌素抗体对肌肉质量的作用。类似于小鼠中的观察，用RK35治疗的～95-天大小的SODG93A大鼠比PBS- 治疗的SODG93A大鼠显示明显增加的质量，腓肠肌(+17％)，颅胫骨肌(+30％)，四头肌(+30％)和隔肌(+17％)肌肉(图2D)。疾病末期，腿肌肉萎缩在PBS-和RK35-治疗的SODG93A大鼠都是明显的(图2F)。SODG93A大鼠中作为RK35治疗结果的增加腿肌肉质量的倾向持续至末期，但这些作用没有达到显著性。然而，RK35-治疗的SODG93A大鼠比PBS-治疗的对照隔肌质量实在的和显著的35％的增加(～35％)在疾病末期仍然明显，与SODG93A小鼠观察到的一致(图2E)。 
为了检验抑肌素抑制对肌肉功能的作用，对RK35和PBS-治疗小鼠进行定量握力测定。RK35-治疗和PBS-治疗的SODG93A小鼠在出生后28和56天之间显示下肢握力的提高。出生后56天，PBS-治疗的SODG93A小鼠变得明显弱于年龄-匹配的对照小鼠(图3A)(p＜0.0001)。虽然出生后63天RK35-治疗的SODG93A小鼠中握力下降还是明显的，RK35-治疗的小鼠仍然比出生后49至88天的PBS-治疗的SODG93A小鼠明显更强壮(或倾向于更强壮)(p＜0.05)。前肢握力的分析显示类似的模式(图3B)。分别观察出生后～49和56天PBS-和RK35-治疗的SODG93A小鼠中前肢力量的峰值。出生后56天PBS-治疗的SODG93A小鼠变得明显弱于野生型动物(p＜0.05)并且此后持续下降。从56至88天，RK35-治疗的SODG93A小鼠比PBS-治疗的SODG93A小鼠更强壮(56d；p＝0.08；63d：p＝0.06；70-88d；p＜0.001)。这些数据表明抑肌素抑制在SODG93A小鼠中整个疾病早期阶段减缓肌肉功能的丧失。然而，100天后，治疗和未治疗的SODG93A小鼠中握力的下降类似。 
为了确定RK35治疗是否诱导SODG93A大鼠类似的变化，疾病早期阶段还分析了RK35和PBS-治疗的SODG93A大鼠和年龄匹配的野生型同窝中的前肢握力(图3C)。PBS-治疗的SODG93A大鼠明显弱于野生型对照，证实SODG93A大鼠还在明显的运动缺乏和失重之前以类似小鼠的方式呈现早期的疾病期。RK35-治疗的SODG93A大鼠的握力测量通常低于PBS-治疗的野生型大鼠，虽然组并无明显不同。当在该年龄间隔与PBS-治疗的SODG93A大鼠相比时，SODG93A大鼠中的抑肌素抑制明显提高握力。 
实施例3.2.3：抑肌素抑制减缓SODG93A小鼠和大鼠中四肢肌肉和隔肌 的退化。 
还检查了RK35治疗对肌肉形态的作用。检查来自88天(疾病早期阶段)和～134天(疾病末期)SODG93A小鼠的隔肌和中间腓肠肌肌肉，与来自年龄-匹配的野生型对照的组织同时，将RK35治疗与PBS的作用相比。每个组织中萎缩和增生的程度如表4中所示以盲分析计分(0，无；1，少量的；2，轻微的；3，中等的；4，明显的；5，严重的)。PBS-治疗的SODG93A小鼠在疾病早期阶段显示腓肠肌的显著萎缩(2.0的平均分；以及图4B)。观察到的肌纤维的收缩，集中的细胞核和染色质-致密的细胞核与经受活性去神经支配的肌肉一致；也有相比野生型小鼠的炎症证据(图4A和B)。相反，用RK35治疗的早期阶段SODG93A小鼠的腓肠肌显示几乎没有至没有萎缩(表4；0.3的平均分)。这些结果支持肌肉质量数据，表明疾病早期(出生后88天)SODG93A小鼠中骨胳腿肌肉萎缩通过抑肌素抑制明显降低。 
来自末期SODG93A小鼠的腓肠肌的检查证实野生型肌肉(图4D)中没有退行性迹象的PBS(表4；3.0的平均分)和RK35治疗的(表4；3.3的平均分)(图4E和F)组中的中等肌肉萎缩。这些结果与肌肉质量数据一致，表明SODG93A小鼠中疾病早期抑肌素抑制的保护作用没有持续至疾病末期。 
相比88天的野生型小鼠，PBS-治疗或RK35-治疗的SODG93A小鼠的隔肌显示几乎没有至没有萎缩(表4；0.6的平均分)。然而在末期，PBS-治疗的SODG93A小鼠隔肌中观察到轻微至中度的萎缩(图4H；表4；2.3的平均分)。相反，类似于年龄-匹配的野生型小鼠的隔肌(图4G)，疾病末期时分析的RK35-治疗的SODG93A小鼠的隔肌相比PBS-治疗的SODG93A动物没有呈现显著的萎缩迹象(表4；比较图4H和4I)。合起来，肌肉质量和组织评估表明抑肌素通过RK35的抑制保持隔肌而不是骨胳腿肌肉在整个疾病时期的完整性。 
表4：与年龄-匹配的野生型对照小鼠相比，用PBS或RK35治疗的SODG93A小鼠中观察到的肌肉病变的概要。 
Figure BDA00003346823700591
计分：0，无；1，微小的；2，轻微的；3，中度的；4，明显的；5，严重的 
腓肠肌和隔肌肌肉中肌纤维大小的分析呈现类似的模式。来自88-天腓肠肌的纤维直径测量的频率分布显示与野生型对照小鼠相比(图5C)，SODG93A小鼠(图5A)中呈现向细纤维的转变。RK35-治疗的SODG93A小鼠的纤维直径分布(图5B)处于疾病早期阶段未治疗的SODG93A小鼠和野生型小鼠之间。然而在末期，RK35-治疗的SODG93A小鼠腓肠肌中纤维平均直径与PBS-治疗的SODG93A小鼠没有很大的差别(数据未示出)。RK35-治疗和PBS-治疗的SODG93A小鼠腓肠肌中纤维平均直径明显不同于末期的野生型，与通过组织学观察到的明显的肌肉萎缩一致。野生型和PBS-治疗的SODG93A小鼠之间末期时纤维大小的显著差异在隔肌肌肉中也很明显。RK35-治疗的SODG93A小鼠的隔肌肌纤维大小呈现平均纤维直径的显著转变，产生野生型和PBS-治疗的SODG93A小鼠之间的居间大小分布(图5D)。 
紧接着利用大鼠模型在相当于临床发作(～112天；Howland等 (2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：1604-09)的时间检查SODG93A表达对隔肌肌肉电活性的作用(图4J和4K)。PBS-治疗的SODG93A大鼠组所示的EMG呈现稀少的峰值活性以及某些异常自发活性的存在(图4J)。用RK35治疗的SODG93A大鼠的峰值活性类似于野生型大鼠观察到的，没有异常自发活性的迹象。如图4K所示，来自转基因SODG93A大鼠的隔肌肌肉呈现受损功能指示的EMG脉冲峰值速率统计学意义的降低。相反，用RK35治疗的SODG93A大鼠呈现比PBS-治疗的SODG93A大鼠明显高的脉冲峰值速率，并且其并不明显不同于年龄-匹配的野生型对照。因此，通过RK35的抑肌素抑制在保持隔肌结构和隔肌功能中都是有效的。 
实施例3.2.4：抑肌素抑制减缓腹角运动神经元的损失 
为了确定RK35是否减缓脊髓中大运动神经元的损失，对来自RK35或PBS治疗的SODG93A小鼠和用PBS治疗的野生型小鼠的腰椎L3-5小鼠脊髓大运动神经元计数。在12周(84-90天龄；平均88天)，即RK35治疗导致SODG93A小鼠中增加的肌肉质量、增加的体重、增加的握力和减弱的肌肉组织病理的时间对脊髓进行计数。在这时候，SODG93A小鼠中大运动神经元存在显著的损失(25-40％)(Guo等(2003)Hum.Mol.Genet.12：2519-32；Sharp(2005)Neuroscience 130：897-910；Schutz等(2005)J.Neurosci.25：7805-12)。 
PBS-治疗的SODG93A小鼠中(图6F)大腰椎运动神经元的计数(图6A-D)相比同窝野生型对照(图6E)明显降低。RK35治疗减少疾病早期阶段运动神经元的损失(图6G)至PBS-治疗的SODG93A小鼠和野生型小鼠之间的居间水平。 
疾病末期，腰椎腹角中大运动神经元的显著损失以及神经胶质增生的增加在SODG93A小鼠中很明显，而不管在野生型小鼠中指出的无相应变化的治疗(图6I和J)。 
大运动神经元总数目的体视学计数(大于300μm2的面积)显示与野生型对照相比PBS-治疗的SODG93A小鼠中25％运动神经元损失的趋势。在RK35治疗的小鼠中观察到运动神经元损失减缓的趋势(p＝0.08)(图6A)。如果计数只限于具有可见细胞核的大运动神经元以避免计数呈现退化迹象(即不规则的膜和空泡的出现)的运动神经元，则与野 生型对照小鼠(图6B)相比，PBS-治疗的SODG93A小鼠中每一切片大运动神经元的平均数存在40％的减少，以及RK35-治疗的和PBS-治疗的SODG93A小鼠之间存在统计学意义的差异(图6B)。然而合起来，图6A和B中呈现的组合数据表明大运动神经元的损失和RK35治疗对该损失的作用在12-周(88天)龄期间都是比较微妙的。 
在末期，通过两种分析方法，RK35-治疗的和PBS-治疗的SODG93A小鼠中运动神经元的计数明显不同于野生型对照小鼠(图6C和D)。这些数据与以上呈现的骨骼肌结构和功能的数据一致，疾病早期阶段观察到的RK35-介导的改善并不维持至末期。 
实施例4 
讨论 
ALS为致死和进行性疾病，其中脊髓和脑干的运动神经元随着后续的肌肉萎缩而退化。很多关注集中于参与运动神经元细胞死亡的机制。一些最近的研究提示多种细胞类型可能通过控制神经肌肉接点胞外微环境中关键因子的产生而参与疾病的病因(Bruijn等(2004)Annu.Rev.Neurosci.27：723-49)。利用嵌合小鼠的研究表明野生型非神经元细胞的存在可延长表达突变SOD1运动神经元的生存(Clement等(2003)Science302：113-17)。这些观察已引导可能通过提供最适的生存微环境而延缓神经元退化的疗法的研究。例如，给予病毒性表达的生长因子(包括IGF-1、GDNF和VEGF)于肌肉已显示延长SODG93A小鼠模型的生存(Kaspar等(2003)Science301：839-42；Azzouz等(2004)Nature429：413-17；Wang等(2002)J.Neurosci.22：6920-28)。此外，IGF-1的肌肉-特异性表达已显示稳定神经肌肉接点，增强运动神经元的生存并且延缓SODG93A转基因小鼠模型中疾病的发作和发展，表明对肌肉的直接效应可以影响疾病的发作和发展(Dobrowolny等(2005)J.Cell.Biol.168：193-99)。肌肉代谢和运动神经元易损性的变化也在ALS小鼠中报道，进一步支持肌肉可能是疾病病理有效驱动的假设(Dupois等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：11159-64)。 
抑肌素或GDF-8为肌肉生长的内源性抑制剂，至少部分通过Activin IIb受体(ActRIIb)的活性而发挥其生物学功能，导致成肌细胞增殖和分化的抑制(Langley等(2002)J.Biol.Chem.277：49831-40； Thomas等(2000)J.Biol.Chem.275：40235-43)。利用抗-GDF-8中和抗体抑制GDF-8的功能已显示增强健康成年小鼠中的肌肉质量和力量以及提供肌营养不良的mdx小鼠模型中功能性的改善(Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300：965-71；Bogdanovich等(2002)Nature420：418-21)。为了更好地了解运动神经元疾病发展中肌肉的作用，利用GDF-8、RK35的新型中和抗体，其以比之前所述的试剂更高的亲和力结合(RK35的IC503nM对JA16的＞100nM；Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300：965-71；Bogdanovich等(2002)Nature420：418-21)，引起RK35治疗的野生型小鼠中肌肉质量的更大提高(数据未示出)。 
家族性ALS的SODG93A小鼠和大鼠模型中，用RK35治疗导致运动神经元病早期期间体重的增加和肌肉质量和力量的提高。此疾病的早期定义为SODG93A小鼠呈现显著的肌肉力量丧失的年龄(出生后56-88天)，如通过握力评估(Ligon等(2005)Neuroreport16：533-36)和步态异常(Wooley等(2005)Muscle Nerve32：43-50)所测量，并且其与神经肌肉接点的去神经化一致(Frey等(2000)J.Neurosci.20：2534-42；Fischer等(2004)Experimental Neurology185：232-40)。由RK35抑制GDF-8引起的肌肉质量提高在四头肌中最明显，但也呈现在两种所检测啮齿类模型的腓肠肌、颅胫骨肌和隔肌中。这些提高完全与增强的力量相关，如相比对照，RK35-治疗的小鼠中后肢和前肢力量的下降更缓。用RK35抗-GDF-8抗体治疗所诱导的肌肉质量的提高程度与GDF-8基因中断(disruption)的小鼠杂合体中观察到的肌肉质量25％的增加在量值上类似；纯合缺失GDF-8的小鼠的肌肉质量为野生型小鼠的约两倍(McPherron(1997)Nature387：83-90)。 
SODG93A小鼠中出生后大约84-88天，以及SODG93A大鼠中大约110天，疾病的外表迹象包括体重降低、步态异常和瘫痪变得很明显。RK35治疗没有延长SODG93A小鼠或大鼠的生存。疾病早期抗-GDF-8治疗诱导的肌肉质量和力量的提高没有延缓SODG93A小鼠和大鼠中步态异常和四肢瘫痪的出现(数据未示出)，也没有维持腿的肌肉质量。 
然而疾病早期和末期观察到RK35-治疗的SODG93A小鼠和大鼠相比介载体-治疗的SODG93A对照隔肌质量的显著提高。末期RK35-治疗的SODG93A小鼠的隔肌肌肉在质量和组织评估中均可与年龄-匹配的 野生型对照相比。末期RK35-治疗的SODG93A大鼠也维持隔肌肌肉质量的增加。与这些形态变化一致，未治疗的SODG93A大鼠隔肌的电生理分析表明突变SOD1的表达引起肌肉功能的显著抑制，而且RK35的治疗有效地保留了隔肌的肌肉功能。 
该研究中利用确定的终点(右侧反射失败检验，表明显著的四肢瘫痪)作为“末期”和安乐死的标准。因此并不清楚通过RK35治疗诱导的增强的隔肌肌肉质量、降低的萎缩和提高的电生理功能是否导致具有补给营养的啮齿类寿命的延长。然而，这些发现由于给出了呼吸机能障碍为患有ALS的患者死亡主要原因的事实而很可能是重要的(Lechtzin等(2002)Amyotroph.Lateral Scler.Other Motor Neuron Disord.3：5-13)。如设计成增强隔肌功能RK35的治疗可能具有延缓ALS患者中机械辅助呼吸的必要性的潜力。 
虽然在疾病末期似乎失去了许多治疗益处，RK35抑制GDF-8可能影响疾病早期腰段脊髓的运动神经元损失。这些数据表明直接对肌肉起作用的治疗能通过调节营养微环境而具有对运动神经元神经支配肌肉的好处，虽然该方法似乎不足以延缓疾病。这些观察因此与Dobrowolny等的结果一致((2005)J.Cell.Biol.168：193-99)，其中IGF的肌肉-特异性异构型的表达导致SODG93A小鼠模型中运动神经元损失的减缓，以及与Kaspar等的结果一致((2003)Science301：839-42)，其中IGF1的病毒性递送至肌肉导致疾病早期阶段运动神经元损失的降低。类似于Kaspar等的观察((2003)，上文)，对运动神经元生存治疗的有益作用并不维持至疾病末期。来自肌肉的提高的营养因子支持因此可能不足以预防SODG93A模型中运动神经元的损失。 
总之，家族性ALS的小鼠和大鼠模型中，抑肌素的抑制导致增强的肌肉质量和力量，其在疾病早期维持而在末期失去。疾病早期阶段抑肌素抑制减缓骨骼肌的退行性病变，但正如右侧反射失败所定义的，没有延缓瘫痪的发作也不延长生存，抑肌素抑制也不明显减缓运动神经元损失。然而相比未治疗的对照，在用抗-抑肌素抗体治疗的动物隔肌肌肉中观察到疾病晚期阶段形态学和功能差异。总的来说，此处提供的数据支持RK35治疗对肌肉构建有益作用的潜力，其可以促进病程早期“患者生命质量”的提高。考虑到抗-GDF-8抗体目前用于临床开发中，所述临床试剂在ALS中维持四肢和隔肌肌肉质量的用途保证了作为ALS治疗多 途径组分的进一步研究。抗GDF-8治疗与现有药物如谷氨酸-拮抗剂利鲁唑(riluzole)或进入临床开发的更新试剂的组合通过帮助维持肌肉质量而不仅提高效力的水平而且对患者整体的生活质量具有显著的影响。 
实施例5 
RK35表位的作图 
为了作图精确的GDF-8抗体表位，代表SEQ ID NO：1所示成熟GDF-8序列的48个重叠的13-残基肽利用点合成技术直接合成于纤维素纸上(例如Molina等(1996)Peptide Res.9：151-55；Frank等(1992)Tetrahedron48：9217-32)。肽重叠为11个氨基酸。该阵列中，半胱氨酸残基用丝氨酸取代以降低由半胱氨酸引起的化学复杂性。聚乙二醇修饰的纤维素膜和Fmoc-保护的氨基酸购自Abimed(Lagenfeld，Germany)。该阵列通过偶联β-丙氨酸间隔物而限定在膜上，并且利用之前所述的标准DIC(二异丙基碳化二亚胺)/HOBt(羟基苯并三唑)偶联化学过程合成肽(Molina等，上文；Frank等，上文)。 
利用Abimed ASP222机器点样活化的氨基酸。人工进行洗涤和脱保护步骤，并且该肽在最终的合成循环后N-末端乙酰化。肽合成后，膜在甲醇中洗涤10分钟并且在封阻剂(TBST(具有0.1％(v/v)TweenTM20的Tris-缓冲盐)和1％(w/v)酪蛋白)中洗涤10分钟。膜随后与2.5μg/ml抗-GDF-8抗体在封阻剂中温和振荡温育。在封阻剂中洗涤3次10分钟后，膜与HRP-标记的二抗温育30分钟(封阻剂中0.25μg/ml)。膜随后每次用封阻剂洗涤三次10分钟并且每次用TBST洗涤2次10分钟。利用SuperSignalTM West reagent(Pierce)和数码照相机(Alphananotech Fluoromager)显象结合的抗体。如图7所示，RK35表位作图至氨基酸30-40和84-97之间的GDF-8区域，如通过GDF-8受体序列与具有已鉴定结构域的同源TGF-β家族受体比较所预测的，其推定地与GDF-8II型受体相互作用。 
实施例6 
表征RK35抗体 
编码RK35的可变重(VH)和可变轻(VL)基因克隆自产生该抗体的杂交瘤细胞，并且测定氨基酸序列。RK35抗体的序列数据用于鉴 定重链和轻链的最接近的种系序列。RK35轻和重可变区与最紧密的人种系序列的对比在图8中显示。可利用用合适的诱变引物的标准定点诱变技术产生合适的突变。抗体突变随后通过序列分析证实。人源化RK35的例证性的氨基酸序列在SEQ ID NO：7(VH)和9(VL)中显示，其中两者都可通过本领域技术人员很容易确定的核酸序列编码，例如SEQID NO：6(VH)和8(VL)中所示的核酸序列。技术人员将认识到人源化抗体框架中任何和/或所有氨基酸可突变回到原始的鼠氨基酸，例如以维持该抗原结合片段的构象。具有某些回复-突变的SEQ ID NO：7(VH)和SEQ ID NO：9(VL)的非限制性实例分别如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示，该回复突变有助于维持抗体对GDF-8的亲和力。 
为了建立嵌合抗体，VH序列亚克隆入pED6huIgG1 mut表达载体，其编码包含两点突变(L234A和G237A)以降低结合人Fc受体和补体组分的人IgG1(Morgan等(1995)Immunology86：319-24；Shields等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-604)。RK35的VL序列可亚克隆入pED6κ表达载体。包含RK35VH和VL序列的表达载体随后共转染入COS-1细胞并且从条件培养基纯化嵌合的RK35抗体。 
实施例7 
肌肉病症的治疗 
GDF-8的抑制剂，即GDF-8拮抗剂，如抑制抗体，可用于与GDF-8有关的代谢失调的治疗，如2型糖尿病、葡萄糖耐受减低、代谢性综合症(例如X综合症)、胰岛素抵抗(例如通过创伤(如烧伤或氮不平衡)诱导的)以及脂肪组织病症(例如肥胖)。GDF-8抑制剂也可用于与GDF-8有关的骨和肌肉病症的治疗，如ALS、肌营养不良和骨关节炎。本发明的抗GDF-8抗体和抗体片段可用于治疗受试者，例如人受试者，优选患有ALS的处于疾病发作的受试者或具有确定的代谢性或骨/肌肉疾病的受试者。GDF-8的抑制抗体还可用于预防和/或降低疾病的严重程度和/或症状。可以预料抗GDF-8抗体和抗体片段例如经皮下，频繁如每天一次和偶尔如每月一次而给予。治疗持续时间约一个月(或更少)至几年。 
为了检测抗GDF-8在人中的临床效力，鉴定患有或处于ALS风险 中的受试者且随机至治疗组。治疗组包括安慰剂组和接受抗体的一至三个或更多组(当存在两个或更多组时以不同剂量接受)。个体预期进行例如一个月至三年以评估体重、肌肉质量和握力的变化。可以预料接受治疗的个体将呈现改善。 
GDF-8拮抗剂，优选抗体形式，作为唯一的活性化合物或与另一种化合物或组合物组合而给予。当作为唯一的活性化合物或与另一种化合物或组合物组合给予时，剂量优选大约1μg/kg至100mg/kg，取决于疾病症状和/或发展的严重程度。治疗临床医师可选择的合适有效剂量来自下列非限制性的范围：1μg/kg至100mg/kg、1μg/kg至50mg/kg、1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg至1mg/kg和500μg/kg至1mg/kg。例证性的非限制性治疗方式和可能的结果概括在表5中。 
表5：可能的临床病例的实例 
说明书需要根据说明书内引用的参考文献的教导最充分地理解，其所有在此通过引用整体引入。说明书内的实施方案提供本发明的例证而不应该解释为限制本发明的范围。技术人员将认识到许多其他的实施方案由权利要求所包含，并且说明书和实施例应该仅认为是例证性的。 
Figure IDA00003346824300021
Figure IDA00003346824300031
Figure IDA00003346824300041
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Figure IDA00003346824300121
Figure IDA00003346824300131

Claims (30)

1.特异性结合GDF-8的分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
    包含来自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的氨基酸序列定义的VH区的第一、第二和第三互补决定区(CDR)的抗体可变重链(VH) 区；和
    包含来自SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的氨基酸序列定义的VL区的第一、第二和第三互补决定区(CDR)的抗体可变轻链(VL) 区。
2.权利要求1的抗体或片段，其中VH CDR1包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20，VH CDR2 包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21，VH CDR3 包含12，VL CDR1包含SEQ ID NO:13，VL CDR2包含SEQ ID NO:14，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:15。
3.权利要求1的抗体或片段，其中所述VH区包含SEQ ID NO:3 或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述VL区包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
4.权利要求3的抗体或片段，其中所述VH区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述VL区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
5.权利要求1-4的任一项的抗体或片段，进一步包含来自选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE和IgM的人免疫球蛋白亚型的重链恒定结构域。
6.权利要求5的抗体或片段，其中所述抗体恒定重链结构域来自人IgG1。
7.权利要求5或6的抗体或片段，其中修饰了恒定重链结构域以改变恒定结构域效应物功能。
8.权利要求1-4的任一项的抗体或片段，进一步包含人抗体κ或λ恒定轻链结构域。
9.特异性结合GDF-8的分离的完整抗体，包含：
两条抗体重链，每条重链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列定义的VH结构域和来自人IgG1的重链恒定结构域；和
两条抗体轻链，每条轻链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列定义的VL结构域和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的轻链恒定结构域。
10.权利要求9的抗体，其中所述重链恒定结构域具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
11.权利要求10的抗体，其中SEQ ID NO:19的氨基酸序列在一个或多个改变Fc区效应物功能的残基上进行了修改。
12.权利要求11的抗体，其中至少修饰了SEQ ID NO:19的氨基酸序列的氨基酸117或120。
13.权利要求1-12的任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段是部分或完全人源化的。
14.权利要求1-12的任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段是中和性的。
15.权利要求1-12的任一项的抗体或片段，其中所述抗体以约10nM或更高的亲和力结合GDF-8。
16.权利要求1-8的任一项的抗体或片段，其中所述片段选自Fd片段、Fab片段、F(ab’)2 片段、scFv片段和Fv片段。
17.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合GDF-8，其中由所述抗体或片段识别的表位是SEQ ID NO:1的氨基酸30-40或84-97之间的氨基酸序列。
18.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-12的抗体或片段的多肽链的核酸序列或其互补序列。
19.权利要求18的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的核酸序列。
20.表达载体，其包含权利要求18或19的多核苷酸。
21.宿主细胞，其包含与调控序列可操作性连接的权利要求18或19的多核苷酸。
22.生产特异性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养权利要求21的宿主细胞和回收由其产生的抗体或片段的步骤。
23.由权利要求22的方法生产的抗体或片段。
24.组合物，其包含权利要求1-12或23的抗体或片段以及药学可接受的载体。
25.治疗哺乳动物的病症的方法，包括给予需要治疗所述病症的哺乳动物有效治疗所述病症的量的权利要求24的组合物，其中所述病症选自：肌肉病症、神经肌肉病症、骨骼退行性病症、脂肪病症、代谢性病症、诱发的骨骼病症、葡萄糖代谢病症和胰岛素-相关病症。
26.权利要求25的方法，其中所述病症进一步选自下组病症：肌营养不良、Duchenne肌营养不良、肌肉萎缩、器官萎缩、虚弱、腕管综合征、充血梗阻性肺病、运动神经元损失、肌萎缩性侧索硬化（ALS）、骨骼肌减少症、恶病质、肌肉损耗综合征、骨质疏松症、骨质疏松症相关的骨折、骨关节炎、骨质减少、低骨质量、葡萄糖耐受减低、胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖和代谢综合征。
27.权利要求26的方法，其中所述病症是Duchenne肌营养不良。
28.权利要求26的方法，其中所述病症是ALS。
29.权利要求26的方法，其中所述病症是恶病质或骨骼肌减少症。
30.增加哺乳动物的肌肉质量或强度的方法，包括给予需要增加肌肉质量或强度的哺乳动物有效增加其肌肉质量或强度的量的权利要求24的抗体组合物。
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