MXPA00007131A - Genes relacionados con el asma - Google Patents

Abstract

Se identifica una porción genética asociada con el asma. Se caracteriza a los genes dentro de la posición, ASTH1I y ASTH1J, y las secuencias reguladoras de la posición. Los genes se utilizan para producir las proteínas codificadas;en la selección de composiciones que modulan la expresión o función de porteínas ASTH1;y en el estudio de las trayectorias fisiológicas asociadas. El ADN se utiliza además como un diagnóstico para la predisposición genética al asma.

Description

GENES RELACIONADOS CON EL ASMA Introducción El asma es una enfermedad de obstrucción bronquial reversible, caracterizada por la inflamación de las vías respiratorias, daño epitelial, hipertrofia muscular suave de las vías respiratorias e hiperreactividad bronquial. Muchos síntomas del asma pueden controlarse mediante la intervención médica, pero la incidencia de muerte y enfermedades severas relacionadas con asma continúa elevándose en los Estados Unidos. Las aproximadamente 4,800 muertes en 1 989 marcaron un 46 por ciento de incremento desde 1980. Casi 12 millones de personas en los Estados Unidos tienen asma, hasta 66 por ciento desde 1980 y, anualmente, los costos médicos e indirectos de la enfermedad se estiman sobre $6 mil millones. Dos subdivisiones comunes de asma son asma atópico (alérgico o extrínseco) y asma no atópico (intrínseco) . La atopía se caracteriza por una predisposición a elevar una respuesta de anticuerpos IgE a los antígenos ambientales comunes . En el asma atópico, se presentan tanto síntomas de asma como evidencia de alergia, tal como una prueba dérmica positiva a alérgenos comunes. El asma no-atópico puede definirse como una limitación reversible de las vías respiratorias en la ausencia de alergias. Los músculos suaves que rodean a los bronquios son capaces de alterar rápidamente el diámetro de las vías respiratorias en respuesta a los estímulos. Cuando la respuesta es excesiva, se llama hiperreactividad bronquial, una característica del asma que se considera tiene un componente hereditario. Los estudios han demostrado una predisposición genética al asma al mostrar, por ejemplo, una mayor concordancia de esta característica entre gemelos monozigóticos que entre gemelos dizigóticos. Sin embargo, la genética del asma es compleja y no muestra un patrón simple de herencia. El ambiente también juega un papel en el desarrollo del asma, por ejemplo, los hijos de fumadores son más propensos a desarrollar asma que los hijos de no fumadores. En años recientes, se han clonado miles de genes humanos. En muchos casos, el descubrimiento genético se ha basado en el conocimiento previo acerca de la proteína correspondiente, tal como la secuencia aminoácida, la reactividad inmunológica, etc. Este enfoque ha sido muy exitoso, pero limitado en ciertas maneras importantes. Una limitación es que los genes en estos casos se identifican en base al conocimiento de las propiedades de la proteína a nivel molecular. Sin embargo, para un gran número de genes humanos importantes, existen muy pocos o ningún dato bioquímico concerniente al producto codificado. Por ejemplo, los genes que predisponen a los humanos a las enfermedades, tales como la fibrosis cística, la enfermedad de Huntington, etc. , son de interés debido a su efecto fenotípico. La caracterización bioquímica de tales genes puede ser secundaria a la caracterización genética. Se ha encontrado una solución a este obstáculo al combinar la representación genética clásica con la habilidad para identificar los genes y, sí es necesario, para ordenar por secuencia grandes regiones de cromosomas. Los estudios poblacionales y familiares permiten que los genes asociados con una característica de interés se localicen en una región relativamente pequeña de un cromosoma. En este punto, la representación física puede utilizarse para identificar los genes candidatos y se utilizan diversas técnicas de biología molecular para seleccionar los genes mutados en individuos afectados. Este enfoque de "lo general a lo particular" para el descubrimiento de genes se ha llamado clonación posicional, debido a que los genes se identifican en base a la posición en el genoma. La clonación posicional se aplica ahora a complejas enfermedades genéticas, las cuales afectan a una mayor fracción de la . humanidad que los desórdenes genéticos individuales normalmente más raros y más simples. Tales estudios deben tomar en cuenta la contribución de factores tanto ambientales como genéticos en el desarrollo de la enfermedad y deben permitir contribuciones al componente genético en más de uno, y potencialmente muchos, genes. La importancia clínica del asma lo hace de interés considerable para caracterizar genes que experimentan una predisposición genética a esta enfermedad. La clonación posicional proporciona un enfoque para este propósito.

LITERATURA RELEVANTE Los síntomas y biolog ía del asma se revisan en Chanez et al. (1994) Odyssey 1:24-33. Una revisión de la hiperreactividad bronquial puede encontrarse en Smith y McFadden (1995) Ann. Allergy. Asthma and Immunol. 74: 454. Moss (1989) Annals of Allergy 63: 566 revisó la etiología alérgica y la inmunología del asma. La disección genética de características complejas se discute en Lander y Schork (1994) Science 265: 2037-2048. La representación genética de genes candidatos para la atopía y/o hiperreactividad bronquial se describe en Postma eí al. (1995) N.E. J.M.333: 894; Marsh eí al. (1994) Science 264: 1152; y Meyers eí al. (1994) Genomics 23: 464. Lawrence eí al. (1994) Ann. Hum. Genet. 58: 359 discute un enfoque hacia el análisis genético de la atopía y el asma. El enlace genético entre la subunidad alfa del receptor de célula T y las reacciones de IgE se ha observado por Moffat eí al. (1994) The Lancet 343: 1597. Caraballo y Hernández (1990) Tissue Antigens 35: 182 observaron una asociación entre los alelos de HLA y el asma alérgico. La evidencia de enlace de la atopía con marcadores en el cromosoma 11q se ha observado en algunas familias británicas con asma (Cookson eí al. (1989) Lancet i' 1292-1295; Young eí al. (1991) J_, Med. Genet.29: 236, pero no en otras familias británicas (Lympany eí al. (1992) Clin. Exp. Allergy 22: 1085-1092) o en familias de Minnesota o Japón (Rich eí al. (1992) Clin. Exp. Allergy 22: 1070-1076; y Hizawa eí al. (1992) Clin. Exp. Allergy 22:~1065). La asociación de un polimorfismo para el gen FceRI-ß y el riesgo de atopía se describe en Hill eí al. (1995) B.M.J. 311: 776; Hill y Cookson (1996) human Mol. Genet. 5: 959; y Shirakawa eí al. (1994) Nature Genetics 7: 125; una asociación de FceRI-ß con hiperreactivídad bronquial se describe en van Herwerden (1 995) The Lancet 346: 1262. Se ha examinado el enlace de las recolecciones de marcadores polimórficos a través de todo el genoma humano con el asma, descrito en Meyers eí al. (1996) Am. J . Hum . Genet. 59: A228 y Daniels eí al. (1996) Nature 383: 247-250. No se detectó ningún enlace con el cromosoma humano 1 1 p en estos estudios.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LA I NVENCIÓN Se proporcionan genes humanos asociados con una predisposición genética al asma. Los genes, llamados en la presente ASTH1I y ASTH1J, se localizan muy cerca entre sí en el cromosoma humano 1 1 p, tienen patrones de expresión similares y motivos de secuencia comunes. Las composiciones de ácido nucleico se utilizan para producir las proteínas codificadas, las cuales pueden emplearse para estudios funcionales, como terapéuticas, y en el estudio de trayectorias fisiológicas asociadas. Las composiciones de ácido nucleico y los anticuerpos específicos para la proteína son útiles como diagnósticos para identificar una predisposición hereditaria al asma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Organización genómica de los genes ASTH1 I y ASTH1J. Las dimensiones de los exones no se encuentran a escala Los exones alternativos se incuban. La dirección de la transcripción se indica debajo de cada gen.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECÍFICAS Los genes ASTH1 y fragmentos de los mismos, proteína codificada, regiones reguladoras genómicas de ASTH1 y anticuerpos de ant\-ASTH1 , proporcionados, son útiles en la identificación de individuos predispuestos al desarrollo de asma y para la modulación de la actividad del gen in vivo con propósitos profilácticos y terapéuticos. La proteína ASTH1 codificada es útil como un inmunogen para elevar anticuerpos específicos, en la selección de fármacos para composiciones que imitan o modulan la actividad o la expresión del ASTH1, incluyendo formas alteradas de la proteína de ASTH1 y como terapéutica. El asma, según se define en la presente, es la limitación reversible del flujo de aire en un paciente durante un periodo de tiempo. La enfermedad se caracteriza por una capacidad de respuesta incrementada de las vías respiratorias a una variedad de estímulos y la inflamación de las vías respiratorias. Un paciente diagnosticado como asmático generalmente tendrá m últiples indicaciones con el tiempo, incluyendo resuello asmático, ataques asmáticos y una respuesta positiva a la señal de identificación de metacolina, es decir, un PC20 en la señal de identificación de metacolina de menos de aproximadamente 4 mg/ml. Las gu ías para el diagnóstico pueden encontrarse en el National Asthma Education Program Expert Panel. Guidelines for diagnosis and management of asthma. National Institutes of Health, 1991; Pub. #91-3042. También puede presentarse atopía, infección respiratoria y factores ambientales de predisposición, pero no son elementos necesarios de un diagnóstico de asma. Las condiciones de asma estrictamente relacionadas con la atopía son referidas como asma atópico. Se proporcionan las secuencias genéticas humanas ASTH1I y ASTH1J, ya que son las secuencias genómicas 5' para ASTH1J. Las principales secuencias de interés proporcionadas en el listado de secuencias, son las siguientes: Región Genómica ASTH1J5' ADN (SEQ ID NO. 1) ASTH1Ja\f cADN (SEQ ID NO: 2) ASTH1Ja\t2 cADN (SEQ ID NO: 3) ASTH1Ja\t3 cADN (SEQ ID NO: 4) Proteína de ASTH1J proteína (SEQ ID NO: 5) ASTH1la\f cADN (SEQ ID NO: 6) Proteína de ASTH1I altl proteína (SEQ ID NO: 7) ASTH1la\\2 cADN (SEQ ID NO: 8) Proteína de ASTH11 alt2 proteína (SEQ ID NO: 9) ASTH1la\t3 cADN (SEQ ID NO: 10) Proteína de ASTH1I alt3 proteína (SEQ ID NO: 11) Forma "A" de caja CAAT ADN (SEQ ID NO: 12) Forma "G" de caja CAAT ADN (SEQ ID NO: 13) Región Promotora ASTH1J5' ADN (SEQ ID NO: 14) asth lj de Ratón cADN (SEQ I D NO:338) asthlj de Ratón proteína (SEQ I D NO:339) Polimorfismos ADN (SEQ I D NO: 16-1 59) Secuencias identificadoras ADN (SEQ I D NO: 160-281 ) de Microsatélite Repeticiones de microsatélite ADN (SEQ I D NO:282-292) Límites de I ntrón-Exón ADN (SEQ ¡ D NO:293-335) La posición de ASTH1 se ha representado para el cromosoma humano 1 1 p. Las características para una respuesta ' positiva a la señal de identificación de metacoiina y una historia clínica de asma demostraron relacionarse genéticamente en una expíoración de genoma de la población de Tristan da Cunha, una sola familia enormemente expandida con una elevada incidencia de asma (discutido en Zamel eí al. ( 1 996) Am . J . Respir. Crit. Care Med. 1 53: 1902-1 906) . El hallazgo de ia relación se duplicó en un conjunto de familias asmáticas canadienses. La región de relación más fuerte fue el marcador D 1 1 S907 en el brazo corto del cromosoma 1 1 . Se identificaron marcadores adicionales de las cuatro regiones megabase q ue rodean a D 1 1 S907 a partir de bases de datos públicas y mediante la clonación original de nuevos marcadores de microsatélite polimórfícos. El refinamiento de la región de interés se obtuvo mediante la genotipíficación de nuevos marcadores en las poblaciones estudiadas y la aplicación de la prueba de desequilibrio de transmisión (TDT) , la cual refleja el nivel de asociación entre los alelos del marcador y el estado de la enfermedad. Se sobrepusieron curvas de TDT en el mapa físico. Se aplicaron técnicas genéticas moleculares a la región de interés. Una región genómica de una megabase de ordenó por secuencia con elevada exactitud y los datos resultantes se utilizaron para la predicción de genes en base a la secuencia y la determinación de la estructura de intrón/exón de genes en la región.

Composiciones de Ácido Nucleico El ASTH1I produce un mARN de 2.8 kb expresado a niveles elevados en la tráquea y la próstata y a niveles inferiores en el pulmón y el hígado y posiblemente en otros tejidos. También se han identificado clones de cADN de ASTH1I en bibliotecas de la próstata, testículos y pulmón. Los polimorfismos de secuencia se muestran en la Tabla 3. El ASTH1I tiene al menos tres formas alternas denotadas como altl, alt2 y alt3. Los codones alternativos de partición e inicio dan las tres formas diferentes de términos amino de proteínas ASTH1I. Las proteínas ASTH1I, altl, alt2 y alt3 son aminoácidos de longitud 265, 255 y 164, respectivamente. Un dominio de las proteínas ASTH1I y ASTH1J es similar en secuencia a los factores de transcripción de la familia ets. La familia ets es un grupo de factores de transcripción que activan los genes involucrados en una variedad de procesos inmunológicos y otros. Los miembros de la familia más similares al ASTH1I y ASTH1J son: ETS1, ETS2, ESX, ELF, ELK1, TEL, NET, SAP-1, NERF y FLI. Las proteínas de ASTH1I y ASTH1J muestra similitud entre sí. Sobre el dominio de ets son 66% similares (es decir, tienen aminoácidos con propiedades similares en las mismas posiciones) y 46% idénticas entre sí. Todas las formas de ASTH 1 I y ASTH 1 J tienen un motivo de hélice de giro helicoidal, característico de algunos factores de transcripción, localizado cerca del extremo de terminal carboxi de la proteína. El ASTH 1 J produce un mARN de aproximadamente 6 kb a niveles elevados en la tráquea, próstata y páncreas y a niveles inferiores en colon, intestino delgado, pulmón y estómago. El ASTH1J tiene al menos tres formas, que consisten en las formas altl , alt2 y alt3. La estructura de lectura abierta es idéntica para las tres formas , las cuales difieren solamente en 5'UTR. La proteína codificada por ASTH 1 J es de 300 aminoácidos de longitud. La secuencia de la región codificadora del ratón de asth lj se proporciona en SEQ I D NO: 326 y la secuencia aminoácida se proporciona en SEQ I D NO: 327. Las proteínas de ratón y humanas tienen 88.4% de identidad a través de toda su longitud . La concordancia en el dominio de ets es del 1 00% . El cADN del ratón se identificó mediante la hibridización de un cADN de humano de long itud completa con una biblioteca de cADN de pulmón de ratón (Stratagene). Según se utiliza en la presente, el término "genes de ASTH1" designa genéricamente a los genes ASTH1I y ASTH1J y sus formas alternas. Los dos genes yacen en orientaciones opuestas sobre un cromosoma nativo, con las secuencias reguladoras 5' entre ellos. Parte de la secuencia genómica entre las dos regiones codificadoras se proporciona como SEQ I D NO: 1 . Según se utiliza en la presente, el término "posición de ASTH1" se refiere a los dos genes en todas las formas alternas y a la secuencia genóm ica que yace entre los dos genes. Las formas alternas incluyen variantes de partición y polimorfismos en la secuencia. Las secuencias polimórficas específicas se proporcionan en SEQ I D Nos- 16- 159. Para algunos propósitos, las secuencias de EST previamente conocidas, aqu í descritas, pueden excluirse de las secuencias definidas como la posición de ASTH 1 . La secuencia de ADN que codifica a ASTH 1 puede ser cADN o ADN genómico o un fragmento de los mismos. Se intenta que el término "gen de ASTH1" se entienda como la estructura de lectura abierta que codifica polipéptidos específicos de ASTH 1 , intrones, así como también las secuencias nucleótidas adyacentes 5' y no codificadoras 3' involucradas en la regulación de la expresión , hasta aproximadamente 1 kb más allá de la región codificadora, pero posiblemente más en cualquier dirección . El gen puede introducirse en un vector apropiado para el mantenim iento extracromosomal o para su integración en el huésped . Según se utiliza en la presente, el término "cADN" intenta incluir todos los ácidos nucleicos que comparten la instalación de elementos de la secuencia encontrados en las especies de mARN maduras, nativas, en donde los elementos de la secuencia son exones y regiones no codificadoras 3' y 5'. Normalmente, las especies de mARN tienen exones contiguos, retirándose los intrones interventores mediante la partición nuclear de ARN, a fin de crear una estructura de lectura abierta continua que codifica a la proteína de ASTH 1 . La secuencia genómica de ASTH1 tiene estructuras de lectura abierta no contiguas, donde los intrones interrumpen las regiones codificadoras de proteína. Una secuencia genómica de interés comprende al ácido nucleico presente entre el codon de inicio y el codon de tope, según se define en las secuencias listadas, incluyendo todos los intrones que se presentan normalmente en un cromosoma nativo. Puede incluir además las regiones 3' y 5' no traducidas, encontradas en el mARN maduro. Puede incluir además secuencias reguladoras, transcripcionales y traslacionales, específicas, tales como promotoras, mejoradoras , etc. , incluyendo aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, de ADN genómico identífícador en cualquier extremo 5' o 3' de la región transcrita . El ADN genómico puede aislarse como un fragmento de 1 00 kbp o más pequeño; y substancialmente libre de secuencias cromosomales identificadoras. Las regiones genómicas de interés incluyen las secuencias no transcritas 5' para ASTH1J, como se proporciona en la SEQ I D NO: 1 . Esta región de ADN contiene los elementos promotores nativos q ue dirigen la expresión del gen de ASTH1J enlazado. Normalmente, una región promotora tendrá al menos aproximadamente 140 nt de secuencia localizada en 5' para el gen de AS TH1 y comprendiendo además una secuencia de motivo de caja TATA y de caja CAAT (SEQ I D NO: 14, nt. 597-736) . La región promotora puede comprender además un motivo de unión de ets por consenso, (C/A)GGA(A/T) (SEQ ID NO: 14, nt 1 -5) . Se proporciona en SEQ I D NO. 14 una región de interés particular, que contiene el motivo de unión a eís, los motivos de caja TATA y caja CAAT 5' para el gen ASTH1J. La posición de SEQ I D NO: 14 dentro de la secuencia mayor es SEQ I D NO: 1 , nt 60359-61095. La secuencia promotora puede comprender polimorfismos dentro de la región de caja CAAT, por ejemplo, aquellos mostrados en SEQ I D NO: 1 2 y SEQ I D NO: 1 3, los cuales se ha demostrado que afectan la función del promotor. La región promotora de interés puede extender 5' a SEQ ID NO: 14 dentro de la secuencia mayor, por ejemplo SEQ I D NO: 1 , nt 59000-61095; SEQ I D NO: 1 , nt 5700-61 095, etc. La secuencia de esta región 5' y, además , las secuencias corriente arriba 5' y las secuencias corriente abajo 3', pueden utilizarse como elementos promotores, incluyendo sitios de unión al mejorador, que proporcionan su expresión en tejidos donde se expresa A STH1J. La expresión específica del tejido es útil en la determinación del patrón de expresión y para la proporción de promotores que imiten el patrón nativo de expresión . Los polimorfismos que ocurren de manera natural en la región promotora son útiles para determ inar las variaciones naturales en la expresión , particularmente aquellas que pueden asociarse con enfermedades. Ver, por ejemplo, SEQ I D NO: 12 y 1 3. De manera alternativa , las m utaciones pueden introducirse en la región promotora para determinar el efecto de alterar la expresión en sistemas experimentalmente definidos. Los métodos para la identificación de motivos específicos de ADN involucrados en la unión de factores transcripcionales, son conocidos en la materia , por ejemplo, la similitud de secuencia con motivos de unión conocidos, estudios de retardo de gel, etc. Por ejemplo, ver Blackwell eí al. ( 1 995) Mol Med 1 : 194-205; Mortlock eí al. (1996) Genome Res. 6: 327-33; y Joulin y Richard-Foy (1 995) Eur J Biochem 232: 620-626. Las secuencias reguladoras pueden utilizarse para identificar secuencias de actuación cis requeridas para la regulación transcrípcional o traslacional de la expresión de ASTH 1 , especialmente en diferentes tejidos o etapas de desarrollo y para identificar las secuencias de actuación cis y los factores de actuación trans que regulan o median la expresión de ASTH 1 . Tales regiones de control de la transcripción o traslacionales pueden enlazarse de manera operable a un gen de ASTH 1 con objeto de promover la expresión de ASTH 1 de tipo silvestre o alterada u otras proteínas de interés en células, cultivadas o en tejidos embrión icos, fetales o adultos y para la terapia genética . Las composiciones de ácido nucleico de la invención sujeto pueden codificar todo o parte de los polipéptidos sujeto. Los fragmentos pueden obtenerse de la secuencia de ADN mediante oligonucléotidos de sintetización química de acuerdo con métodos convencionales, mediante digestión de enzima por restricción, mediante amplificación de PCR, etc. Para la mayor parte, los fragmentos de ADN serán de al menos 15 nt, normalmente de al menos 18 nt, más normalmente de al menos aproximadamente 50 nt. Tales fragmentos pequeños de ADN son útiles como cargas iniciadoras para PCR, selección por hibridización, etc. Los fragmentos de ADN mayores, es decir, mayores de 100 nt, son útiles en la producción del polipéptido codificado. Para utilizarse en reacciones de amplificación, tales como PCR, se utilizará un par de cargas iniciadoras. La composición exacta de las secuencias de la carga iniciadora no es crítica para la invención, pero para la mayoría de las aplicaciones las cargas iniciadoras hibridizarán a la secuencia sujeto bajo condiciones rigurosas, como se conoce en la materia . Es preferible elegir un par de cargas iniciadoras que generarán un producto de amplificación de al menos aproximadamente 50 nt, preferentemente al menos aproximadamente 1 00 nt. Generalmente se conocen los algoritmos para la selección de las secuencias de la carga iniciadora y se encuentran disponibles en paquetes de software comerciales. Las cargas iniciadoras de amplificación hibridizan a filamentos complementarios de ADN y pondrán la carga iniciadora entre sí. Los genes de ASTH1 se separan y obtienen en substancial pureza, generalmente como algo diferente a un cromosoma mam ífero intacto. Normalmente, el ADN se obtendrá substancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico que no incluyen una secuencia de ASTH1 o fragmento de la misma, siendo generalmente de al menos aproximadamente 50%, normalmente de al menos aproximadamente 90% de pureza y son típicamente "recombinantes" , es decir, se identifican por uno o más nucleótidos con los cuales no se asocian normalmente en un cromosoma naturalmente ocurrente. Las secuencias de ADN se utilizan en una variedad de maneras. Pueden utilizarse como sondas para identificar los genes relacionados con ASTH1. Los homólogos mamíferos tienen una similitud de secuencia substancial con las secuencias sujeto, es decir, al menos 75% , normalmente al menos 90% , más normalmente al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia nucleótida de la secuencia de ADN sujeto. La similitud de secuencia se calcula en base a una secuencia de referencia, la cual puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, tal como un motivo conservado , una región de codificación , una región de identificación , etc. Una secuencia de referencia será normalmente de al menos aproximadamente 1 8 nt de largo, más normalmente de al menos aproximadamente 30 nt de largo y puede extenderse hasta la secuencia completa que se está comparando. En la materia se conocen los algoritmos para el análisis de secuencia, tales como BLAST, descrito en Altschul eí al. ( 1 990) J Mol Biol 21 5: 403-1 0. Los ácidos nucleicos que tienen similitud de secuencia se detectan mediante hibridización bajo condiciones de baja austeridad , por ejem plo, a 50°C y 1 0XSSC (0.9 M de solución salina/0.09 M de citrato de sodio) y permanecen unidos cuando se sujetan a enjuague a 55°C en 1 XSSC. La identidad de secuencia puede determinarse mediante hibridización bajo condiciones rigurosas , por ejem plo, a 50°C o más y 0. 1 XSSC (9 mM de solución salina/O.9 mM de citrato de sodio) . Mediante el uso de sondas, particularmente sondas de secuencias de ADN etiquetadas , uno puede separar los genes homólogos o relacionados. La fuente de genes homólogos puede ser de cualquier especie, por ejemplo, especies de primates, particularmente humanos; roedores, tales como ratas y ratones, caninos, felinos, bovinos, ovinos , equinos, levadura, Drosophila, Caenhorabditis, etc. El ADN también puede utilizarse para identificar la expresión del gen en un espécimen biológico. La manera en la cual una comprueba en las células la presencia de secuencias nucleótidas particulares, como ADN genómico o ARN, está bien establecida en la literatura y no requiere aquí de elaboración. El mARN se separa de una muestra celular. El mARN puede amplificarse mediante RT-PCR, mediante el uso de transcriptasa inversa para formar un filamento de ADN complementario, seguido por una amplificación de reacción en cadena de polimerasa mediante el uso de cargas iniciadoras específicas para las secuencias de ADN sujeto. De manera alternativa , la muestra de mARN se separa mediante electroforesis de gel, se transfiere a un soporte adecuado, por ejemplo, nitrocelulosa, nylon, etc. , y después se sondearon con un fragmento del ADN sujeto como una sonda. También pueden encontrar uso otras técnicas, tales como los ensayos de ligación de oligonucléotidos, hibridizaciones in situ, e hibridización de las sondas de ADN instaladas sobre una plaqueta sólida. La detección de mARN mediante la hibridización de la secuencia sujeto indica la expresión del gen ASTH1 en la muestra. Las secuencias de p acido nucleico sujeto pueden modificarse para varios propósitos, particularmente cuando se utilizarán de manera intracelular, por ejemplo, al unirse a un agente de separación de ácido nucleico, por ejemplo, un ion metálico quelado, tal como hierro o cromo para la partición del gen; o lo similar. La secuencia de la posición de ASTH1 , incluyendo las regiones promotoras de identificación y las regiones codificadoras, puede mutarse de diversas maneras conocidas en la materia para generar cambios dirigidos en la resistencia promotora, la secuencia de la proteína codificada, etc. La secuencia de ADN o producto de tal mutación será substancialmente similar a las secuencias aquí proporcionadas, es decir, diferirán en al menos un nucléotido o aminoácido, respectivamente, y pueden diferir en al menos dos pero no más de aproximadamente diez nucleótidos o aminoácidos. Los cambios de la secuencia pueden ser substituciones, inserciones u omisiones. Las omisiones pueden incluir además cam bios mayores , tales como omisiones de un dominio o exón . Otras modificaciones de interés incluyen la marca de epítope, por ejemplo, con el sistema FLAG , HA, etc. Para los estudios de localización subcelular, pueden utilizarse proteínas de fusión con proteínas fluorescentes verdes (GFP) Tales genes mutados pueden utilizarse para estudiar las relaciones de estructura-función de los polipéptidos de ASTH 1 , o para alterar las propiedades de la proteína que afecta su función o regulación. Por ejemplo, de esta manera pueden crearse los factores de transcripción constitutivamente activos o una proteína negativamente activa, dominante, que se une al sitio señalado de ADN de ASTH1 sin activar la transcripción. Se conocen las técnicas para la mutagénesis in vitro de genes clonados. Los ejemplos de protocolos para explorar mutaciones pueden encontrarse en Gustin eí al., Biotechniques 14: 22 (1993); Barany, Gene 37: 111-23 (1985); Colicelli et al., Mol Gen Genet 199: 537-9 (1985); y Prentki eí al., Gene 29: 303-13 (1984). Los métodos para la mutagénesis de un sitio específico pueden encontrarse en Sambrook eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108; Weiner eí al., Gene 126: 35-41 (1993); Sayers eí al., Biotechniques 13: 592-6 (1992); Jones y Winistorfer, Biotechniques 12: 528-30 (1992); Barton eí al., Nucleic Acids Res 18: 7349-55 (1990); Marotti y Tomich, Gene Anal Tech 6: 67-70 (1989); y Zhu Anal Biochem 177: 120-4 (1989).

Síntesis de Proteínas de ASTH1 El gen sujeto puede emplearse para la síntesis de una prote?na completa de ASTH1, o fragmentos polipéptidos de la misma, particularmente fragmentos correspondientes a dominios funcionales; sitios de unión, etc.; e incluir las fusiones de los polipéptidos sujeto a otras proteínas o partes de las mismas. Para la expresión, puede emplearse un chasis de expresión, proporcionando una región de inicio transcripcional y traslacional, la cual puede ser inducible o constitutiva, donde la región codificadora se una de manera operable bajo el control transcripcional de la región de iniciación transcripcional, y una región de terminación transcripcional y traslacional. Pueden emplearse diversas regiones de iniciación transcripcional que sean funcionales en el huésped de la expresión. Los polipéptidos pueden expresarse en procariotas o eucariotas, de acuerdo con maneras convencionales, dependiendo del propósito de la expresión . Para una producción de la proteína a gran escala , puede utilizarse un organismo unicelular, tal como E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae o células de un organismo mayor tales como vertebrados, particularmente mam íferos, por ejemplo, células COS 7, como las células huésped de la expresión. En muchas situaciones, puede ser deseable expresar el gen de ASTH1 en células mam íferas, donde el gen de ASTH1 se beneficiará del doblez nativo y de las modificaciones post-traslacionales. También pueden sintetizarse péptidos pequeños en el laboratorio. Con la disponibilidad de los péptidos en grandes cantidades, al emplear un huésped de la expresión , los polipéptidos pueden aislarse y purificarse de acuerdo con maneras convencionales. Puede prepararse un lisato del h uésped de la expresión y purificarse el lisato mediante el uso de HPLC, cromatografía por exclusión , electroforesis de gel , cromatografía por afinidad u otras técnicas de purificación . El polipéptido purificado generalmente será al menos aproximadamente 80% puro, preferentemente al menos aproximadamente 90% puro y puede ser hasta e incluir una pureza del 100% . Se intenta que pureza se entienda como libre de otras proteínas, así como residuos celulares. El polipéptido se utiliza para la producción de anticuerpos, donde los fragmentos pequeños proporcionan anticuerpos específicos para el polipéptido en particular y los fragmentos mayores o la proteína entera permiten la producción de anticuerpos sobre la superficie del polipéptido. Los anticuerpos pueden elevarse a las formas de tipo silvestre o variantes de ASTH 1 . Los anticuerpos pueden elevarse a péptidos aislados, correspondientes a estos dominios, o a la proteína nativa, por ejemplo, mediante la inmunización con células que expresan ASTH 1 , inmunización con liposomas que tienen ASTH 1 insertado en la membrana, etc. Los anticuerpos se preparan de acuerdo con maneras convencionales, donde el polipéptido o la proteína expresada se utilizan como un inmunogen, por sí solos o conjugados con vehículos inmunogénicos conocidos, por ejemplo, KLH , pre-S H BsAg , otras proteínas virales o eucarióticas o lo similar. Pueden emplearse varios adyuvantes, con una serie de inyecciones, según sea apropiado Para los anticuerpos monoclonales, después de una o más inyecciones de fundente, se aisla el bazo, los linfocitos se inmortalizan mediante fusión celular y después se seleccionan por unión al anticuerpo de elevada afinidad . Pueden entonces expandirse las células inmortalizadas, es decir, hibridomas, que producen los anticuerpos deseados Para una descripción adicional , ver Monoclonal Antibodies: A Laboratorv Manual, Harlow y Lañe eds. , Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1 988. Si se desea, puede aislarse el mARN que codifica las cadenas pesadas y ligeras y mutagenizarse mediante clonación en E. coli, y mezclarse las cadenas pesadas y ligeras para mejorar aún más la afinidad con el anticuerpo. Las alternativas a la inmunización in vivo como un método para elevar los anticuerpos incluye la unión a las bibliotecas de "exhibición" de fagos, normalmente en conjunto con una maduración de afinidad in vitro.

Detección de Asma Asociado con ASTH 1 El diagnóstico de asma asociado con ASTH 1 se lleva a cabo mediante la proteína, la secuencia de ADN o de ARN y/o análisis por hibridización de cualquier muestra conveniente proveniente de un paciente, por ejemplo, material de biopsia, m uestra sanguínea, raspados de mejilla, etc. Una muestra de ácido nucleico de un paciente que tienen asma que puede asociarse con ASTH1 , se analiza con respecto a la presencia de un polimorfismo de predisposición en ASTH1. Un genotipo de paciente típico tendrá al menos una mutación de predisposición en al menos un cromosoma . Se considera un polimorfismo de predisposición la presencia de una secuencia polimórfica de ASTH1 que afecta la actividad o expresión del producto genético y otorga una creciente susceptibilidad al asma . Los individuos se seleccionan al analizar su ADN o mARN respecto a la presencia de un polimorfismo de predisposición , en comparación con una secuencia neutral de asma. Las secuencias específicas de interés incluyen cualquier polimorfismo que conduzca a la hiperreactividad bronquial clínica o se asocie de otro modo con el asma, incluyendo pero sin limitarse, inserciones, substituciones y omisiones en la secuencia de la región codificadora , secuencias de intrón que afectan la partición o secuencias promotoras o mejoradoras que afectan la actividad y expresión de la proteína . Los ejemplos de polimorfismos de ASTH1 específicos en pacientes de asma , se enlistan en las Tablas 3-8. El polimorfismo de caja CAAT de la SEQ I D NO : 1 2 y 1 3 (el cual se localiza dentro de la SEQ I D NO: 14) es de particular interés. La forma "G", SEQ I D NO: 1 3, puede asociarse con una propensión a desarrollar hiperreactividad bronquial o asma. Otros polimorfismos en la región circundante afectan esta asociación. Se ha encontrado que la substitución de "G" por "A" da como resulta una unión decreciente de las proteínas nucleares al motivo de ADN . El efecto de un polimorfismo de predisposición de ASTH 1 puede modularse mediante el genotipo del paciente en otros genes relacionados con el asma y la atopía , incluyendo pero sin limitarse, el receptor de Fce, antígenos de HLA de Clase I y Clase I I , el receptor celular T y genes de inmunog lobulina, citocinas y receptores de citocina y lo similar. La selección también puede hacerse en base a las características funcionales o antigénicas de la proteína. Los inm unoensayos diseñados para detectar polimorfismos de predisposición en proteínas de ASTH 1 pueden utilizarse en la selección. Cuando muchas mutaciones diversas conducen a un fenotipo de enfermedad en particular, los ensayos de proteína funcional han demostrado ser efectivos en la selección de herramientas. Pueden llevarse a cabo estudios bioquímicos para determinar si un polimorfismo de secuencia candidato en la reg ión codificadora de ASTH1 o regiones de control, se asocia con la enfermedad. Por ejemplo, un cambio en la secuencia promotora o mejoradora que afecta la expresión del ASTH1 puede dar como resultado la predisposición al asma. Los niveles de expresión de un alelo variante candidato se comparan con los niveles de expresión del alelo normal, mediante diversos métodos conocidos en la materia . Los métodos para determinar la resistencia promotora o mejoradora incluyen la cuantificación de la proteína natural expresada ; la inserción del elemento de control variante en un vector con un gen de reporte tal como ß-galactosidasa, luciferasa, acetiltransferasa de cloranfenicol, etc. , que proporcione una cuantificación conveniente; y lo similar. La actividad de la proteína de ASTH 1 codificada puede determ inarse mediante la comparación con la proteína de tipo silvestre. Varios métodos se encuentran disponibles para el análisis de ácidos nucleicos respecto a la presencia de una secuencia específica. Cuando se encuentran disponibles grandes cantidades de ADN , se utiliza directamente el ADN genómico. De manera alternativa, la región de interés se clona en un vector adecuado y se desarrolla en suficiente cantidad para su análisis Las células que expresan los genes de ASTH1 , tales como células de la tráquea , pueden utilizarse como una fuente de mARN, el cual puede ensayarse directamente o transcribirse de manera inversa en cADN para su análisis. El ácido nucleico puede amplificarse mediante técnicas convencionales, tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , a fin de proporcionar cantidades suficientes para el análisis. El uso de la reacción en cadena de polimerasa se describe en Saiki eí al. (1 985) Science 239: 487, y una revisión de las técnicas actuales puede encontrarse en Sambrook, eí al. Molecular Cloning : A Laboratorv Manual. CSH Press 1 989, pp. 14.2-14.33. La amplificación también puede utilizarse para determinar si se presenta un polimorfismo, mediante el uso de una carga iniciadora que es específica para el polimorfismo. De manera alternativa, se conocen diversos métodos en la materia que utilizan la ligación oligonucleótida como medio para detectar polimorfismos, ver por ejemplo Riley eí al. (1 990) N .A.R. 1 8: 2887-2890; y Delahunty eí al. ( 1 996) Am . J . Hum . Genet. 58: 1 239-1246. Puede incluirse una etiqueta detectable en una reacción de amplificación Las etiquetas adecuadas incluyen fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, Rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , 2' , 7'-dimetoxi-4' ,5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE) , 6-carboxi-X-rodamina (ROX) , 6-carboxi-2',4' , 7' ,4, 7-hexaclorofluoresceína (H EX) , 5-carboxifIuoresceína (5-FAM) o N , N , N' , N '-tetrametil-6- carboxirodamina (TAMRA), etiquetas radioactivas, por ejemplo 32 p 35S, 3H ; etc. La etiqueta puede ser un sistema de dos etapas, donde el ADN amplificado se conjugue con biotina, haptenos, etc. , que tienen un patrón de unión de elevada afinidad, por ejemplo, avidina , anticuerpos específicos, etc. , donde el patrón de unión se conjuga con una etiqueta detectable. La etiqueta puede conjugarse con uno o ambos de las cargas iniciadoras . De manera alternativa, se etiqueta el grupo de nucleótidos utilizados en la amplificación , a fin de incorporar la etiqueta en el producto de amplificación . La muestra de ácido nucleico, por ejemplo, el fragmento amplificado o clonado, se analiza mediante uno de los diversos métodos conocidos en la materia. El ácido nucleico puede ordenarse en secuencia mediante dideoxi u otros métodos, y la secuencia de las bases puede compararse con una secuencia de ASTH1 neutral . La hibridización con la secuencia variante también puede utilizarse para determinar su presencia, mediante manchado Southern, manchado de puntos, etc. El patrón de hibridización de una secuencia de control y variante para una instalación de sondas de oligonucleótido inmovilizado sobre un soporte sólido, como se describe en la EU 5,446, 934 o en la WO95/35505 , también puede utilizarse como un medio para detectar la presencia de secuencias variantes. El análisis de polimorfismo conformacional de un solo filamento (SSCP), la electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), la detección de partición no concordante y el análisis heterodúplex en las matrices de gel se utilizan para detectar cambios conformacíonales creados por la variación de la secuencia de ADN como alteraciones en la movilidad electroforética . De manera alternativa, cuando un polimorfismo crea o destruye un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción (polimorfismo de longitud del fragmento de restricción, RFLP), la muestra se digiere con esa endonucleasa y el tamaño de los productos se fracciona para determinar si se digirió el fragmento. El fraccionamiento se lleva a cabo mediante electroforesis capilar o de gel, particularmente geles de acrilamida o agarosa. El patrón de hibridización de una secuencia de control y variante para una instalación de sondas de oligonucleótido inmovilizada sobre un soporte , según se describe en la US 5,445,934 o en la WO95/35505, puede utilizarse como un medio para la detección de la presencia de secuencias variantes. En una modalidad de la invención, se proporciona una instalación de oligonucléotidos, donde las posiciones discretas en la instalación son complementarias con al menos una porción de mARN o ADN genómico de la posición de ASTH1. Tal instalación puede comprender una serie de oligonucfeótídos, cada uno de los cuales puede hibridízarse específicamente para un ácido nucleico, por ejemplo , mARN , cADN , ADN genómico, etc. , de la posición de AS TH1. Una instalación puede incluir todos o un subconjunto de los polimorfismos listados en la Tabla 3 (SEQ I D Nos: 1 6- 1 26) . Una o ambas formas polimórficas pueden presentarse en la instalación, por ejemplo, el polimorfismo de la SEQ I D NO: 12 y 1 3 puede representarse por cualq uiera o ambas secuencias listadas .

Normalmente, tal instalación incluirá al menos dos secuencias polimórficas diferentes, es decir, polimorfismos localizados en posiciones únicas dentro de la posición, normalmente de al menos aproximadamente 5, más normalmente de al menos aproximadamente 10 y puede incluir tantos como 50 hasta 1 00 polimorfismos diferentes. La secuencia oligonucleótida en la instalación normalmente será de al menos aproximadamente 12 nt de longitud , puede ser de la longitud de las secuencias polimórficas proporcionadas o puede extenderse hacia las regiones identificadoras para generar fragmentos de 1 00 hasta 200 nt de longitud. Para ejemplos de instalaciones, ver Hacia eí al. (1 996) Nature Genetics 14. 441 -447; Lockhart eí al. ( 1 996) Nature Biotechnol. 14: 1 675-1680; y De Risi eí al. ( 1 996) Nature Genetics 14. 457-460. Los anticuerpos específicos para los polimorfismos de ASTH 1 pueden utilizarse en inmunoensayos de selección . Una reducción o incremento en el ASTH 1 neutral y/o la presencia de polimorfismos asociados con asma, son indicativos de q ue el asma se asocia con ASTH 1 . Se toma una muestra de un paciente sospechoso de tener asma asociado con ASTH 1 . Seg ún se utiliza en la presente, las muestras incluyen fluidos biológicos tales como lavado traqueal , sangre, fluido cerebroespinal, lágrimas, saliva, linfo, fluido de diálisis y lo similar; fluidos derivados de cultivos de órgano o de tejido; y fluidos extraídos de tejidos fisiológicos. También se incluyen en este término los derivados y fracciones de tales fluidos. Las muestras de biopsia son de particular interés, por ejemplo , raspados traqueales , etc. El número de células en una muestra generalmente será de al menos aproximadamente 1 03, normalmente de al menos 1 04, más normalmente de al menos aproximadamente 1 05. Las células pueden disociarse, en el caso de tejidos sólidos o pueden analizarse secciones de tejido. De manera alternativa, puede prepararse un lisato de las células. El diag nóstico puede llevarse a cabo mediante varios métodos. Todos los diferentes métodos determinan la ausencia o presencia o cantidades alteradas de ASTH 1 normal o anormal en células de pacientes sospechosos de tener un polimorfismo de predisposición en ASTH 1 . Por ejemplo, la detección puede utilizar el teñido de células o secciones histológicas, llevado a cabo de acuerdo con métodos convencionales. Los anticuerpos de interés se agregan a la muestra celular y se incuban por un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión al epítope, normalmente de al menos aproximadamente 10 minutos. El anticuerpo puede etiquetarse con radioisótopos, enzimas, materia fluorescente, materia quimioluminiscente u otras etiquetas para la detección directa. De manera alternativa, se utiliza una segunda etapa de anticuerpo o reactivo para amplificar la señal . Tales reactivos son muy conocidos en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo primario puede conjugarse con biotina, ag regándose avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante como un reactivo de segunda etapa. La detección final utiliza un substrato que experimenta un cambio de color en presencia de la peroxidasa . La ausencia o presencia de unión de anticuerpos puede determinarse mediante diversos métodos, incluyendo citometría de flujo de las células disociadas , microscopía, radiografía, conteo de escintilación , etc. Un método alternativo para el diagnóstico depende de la detección in vitro de la unión entre anticuerpos y ASTH 1 en un lisato. La medición de la concentración de unión de ASTH 1 en una m uestra o fracción del mismo, puede llevarse a cabo mediante una variedad de ensayos específicos. Puede utilizarse un ensayo de tipo emparedado convencional. Por ejemplo, un ensayo de emparedado puede unir primero los anticuerpos específicos de ASTH-1 a una superficie o soporte ?nsoluble. La manera particular de la unión no es crucial mientras sea compatible con los reactivos y métodos totales de la invención. Pueden unirse a las placas de manera covalente o no covalente, preferentemente de manera no covalente. Los soportes insolubles pueden ser cualquier composición a la cual puedan unirse los polipéptidos, ia cual se separe fácilmente del material soluble y la cual sea compatible de otro modo con todo el método. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualq uier forma conveniente. Los ejemplos de soportes insolubles adecuados a los cuales se une el receptor incluyen g lóbulos, por ejemplo, glóbulos magnéticos, membranas y placas de microtítulo . Estos se hacen típicamente de vidrio, plástico (por ejem plo, poliestireno) , polisacáridos, nylon o nitrocelulosa. Las placas de microtítulo son especialmente convenientes debido a que un gran número de ensayos pueden llevarse a cabo de manera simultánea , mediante el uso de pequeñas cantidades de reactivos y muestras. Los lisatos de muestra del paciente se agregan entonces a soportes que se ensayan por separado (por ejemplo, perforaciones separadas de una placa de microtítulo) que contienen anticuerpos. Preferentemente, una serie de estándares, que contienen concentraciones conocidas de ASTH 1 normal y/o anormal , se ensaya en paralelo con las muestras o alícuotas del mismo para servir como controles. Preferentemente, cada muestra y estándar se agregará a múltiples perforaciones a fin de que puedan obtenerse valores medios para cada uno. El tiempo de incubación debe ser suficiente para la unión , generalmente, desde aproximadamente 0. 1 hasta 3 hr es suficiente. Después de la incubación, el soporte insoluble generalmente se enjuaga de los componentes no unidos. Generalmente, un medio de detergente no iónico diluido a un pH apropiado, generalmente de 7-8, se utiliza como un medio de enjuague. Pueden emplearse desde uno hasta seis enjuagues, con suficiente volumen para enjuagar concienzudamente las proteínas no específicamente unidas, presentes en la muestra. Después del enjuague, se aplica una solución que contiene un segundo anticuerpo. El anticuerpo se unirá a ASTH 1 con suficiente especificidad, de tal manera que pueda distinguirse de otros componentes presentes. Los seg undos anticuerpos pueden etiquetarse para facilitar la cuantificación directa o indirecta de la unión . Los ejemplos de etiquetas que permiten la medición directa de la unión del segundo receptor incluyen radioetiquetas , tales como 3H o 125|, materia fluorescente, tinturas, glóbulos, materia quimloluminiscente, partículas coloidales y lo similar. Los ejemplos de etiquetas que permiten la medición indirecta de la unión incluyen enzimas donde el substrato puede proporcionar un producto fluorescente o colorido. En una modalidad preferida, los anticuerpos se etiquetan con una enzima unida de manera covalente capaz de proporcionar una señal de producto detectable después de la adición del substrato adecuado. Los ejemplos de enzimas adecuadas para utilizarse en conjugados incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, deshidrogenasa de malato y lo similar. Cuando no se encuentran comercialmente disponibles, tales conjugados de anticuerpo-enzima se producen fácilmente mediante técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. El tiempo de incubación debe ser suficiente para que el ligando etiquetado se una a las moléculas disponibles. Generalmente, desde aproximadamente 0.1 hasta 3 hr es suficiente, normalmente 1 hr es suficiente. Después de la segunda etapa de unión, el soporte insoluble se enjuaga nuevamente hasta quedar libre de material no específicamente unido. La señal producida por el conjugado unido se detecta mediante medios convencionales. Cuando se utiliza un conjugado de enzima, se proporciona un substrato de enzima apropiado a fin de que se forme un producto detectable. Se conocen otros inmunoensayos en la materia y pueden encontrar uso como diagnósticos. Las placas de Ouchterlony proporcionan una determinación simple de la unión de anticuerpos.

Los análisis Western pueden llevarse a cabo sobre geles de proteína o machas de proteína sobre filtros, mediante el uso de un sistema de detección específico para el ASTH 1 según se desee, convenientemente mediante el uso de un método de etiquetado según se describe para el ensayo de emparedado. Otros ensayos de diagnóstico de interés se basan en las propiedades funcionales de las proteínas de ASTH 1 . Tales ensayos son particularmente útiles cuando un gran número de cambios de secuencia diferentes conducen a un fenotipo común, es decir, una función alterada de la proteína que conduce a hiperreactividad bronquial. Por ejemplo, un ensayo funcional puede basarse en los cambios transcripcionales mediados por los productos genéticos de ASTH1. Otros ensayos pueden detectar, por ejemplo, cambios conformacíonales, cambios de tamaño q ue resultan de inserciones, omisiones o truncamientos, o cambios en la localización subcelular de las proteínas de ASTH 1 . En una prueba de truncamiento de la proteína , los fragmentos de PCR amplificados a partir del gen de ASTH1 o su transcripción se utilizan como templados para las reacciones de transcripción/traslación in vivo a fin de generar productos de proteína . La separación mediante electroforesis de gel se lleva a cabo para determ inar si el gen polimórfico codifica una proteína trunca , donde las truncaciones pueden asociarse con una pérdida de función . La selección del diagnóstico también puede llevarse a cabo para los polimorfismos que se enlazan genéticamente a una predisposición a la hiperreactividad bronquial, particularmente a través del uso de marcadores de microsatélite o polimorfismos de un solo nucleótido. Con frecuencia, el polimorfismo de microsatélite en sí no se expresa de manera fenotípica, pero se enlaza a secuencias que dan como resultado una predisposición a la enfermedad. Sin embargo, en algunos casos, la secuencia de microsatélite en sí puede afectar la expresión genética. El análisis de enlace por microsatélite puede llevarse a cabo solo o en combinación con la detección directa de polimorfismos, como se describe arriba. El uso de marcadores de microsatélite para la genotipificación está bien documentado. Para ejemplos, ver Mansfield eí al. (1 994) Genomics 24: 225-233; Ziegle eí al. (1992) Genomics 14: 1 026- 1 031 ; Dib eí al. , supra. Las posiciones de microsatélite que son útiles en los métodos sujeto, tienen la fórmula general: U(R)nU' , donde U y U' son secuencias identificadoras no repetitivas que identifican de manera única a la posición en particular, R es un motivo de repetición y n es el número de repeticiones. El motivo de repetición es de al menos 2 nucleótidos de longitud, hasta 7, normalmente de 2-4 nucleótidos de longitud. Las repeticiones pueden ser simples o complejas. Las secuencias identificadores U y U' identifican de manera única a la posición de microsatélite dentro del genoma humano. U y U' son de al menos aproximadamente 1 8 nucleótidos de longitud y pueden extender varios cientos de bases hasta aproximadamente 1 kb sobre cualquier lado de la repetición . Dentro de U y U', las secuencias se seleccionan respecto a las cargas iniciadoras de amplificación. La composición exacta de las secuencias de carga iniciadora no son críticas para la invención , pero deben hibridizarse a las secuencias hibridizadoras U y U', respectivamente, bajo condiciones rigurosas. Los criterios de selección para las cargas iniciadoras de amplificación son los previamente tratados. Para maximizar la resolución de diferencias de tamaño en la posición, es preferible elegir una secuencia de carga iniciadora que sea cercana a la secuencia de repetición, de tal manera que el producto de amplificación total se encuentre entre 1 00-500 nucleótidos de longitud. El número de repeticiones en una posición específico, n , es polimórfico en una población, generando mediante ésto diferencias individuales de longitud del ADN que yace entre las cargas iniciadoras de amplificación . El número variará desde al menos 1 repetición hasta tantas como 1 00 repeticiones o más. Las cargas iniciadoras se utilizan para amplificar la reg ión del ADN genómico q ue contiene las repeticiones . De manera conveniente, se incluirá una etiqueta detectable en la reacción de amplificación, según se describe previamente. Puede llevarse a cabo la amplificación de transmisión múltiple, en la cual se com binan varios conjuntos de cargas iniciadoras en el mismo tubo de reacción. Esto es particularmente ventajoso cuando se encuentran disponibles para el análisis cantidades limitadas de muestra de ADN . De manera conveniente, cada uno de estos conj untos de cargas iniciadoras se etiquetan con un fluorocromo diferente. Después de la amplificación, los productos se fraccionan por tamaño. El fraccionamiento puede llevarse a cabo mediante electroforesis de gel, particularmente geles desnaturalizantes de acrilamida o agarosa. Un sistema conveniente utiliza geles de poliacrilamida desnaturalizantes en combinación con un secuenciador de ADN automatizado, ver Hunkapillar eí al. (1991 ) Science 254: 59-74. El secuenciador automatizado es particularmente útil con la amplificación en transmisión múltiple o los productos agrupados de reacciones de PCR separadas. La electroforesis capilar también puede utilizarse para el fraccionamiento. Una revisión de electroforesis capilar puede encontrarse en Landers eí al. (1 993) BioTechnJques 14: 98-1 1 1 . El tamaño del producto de amplificación es proporcional al número de repeticiones (n) que se presentan en la posición especificado por las cargas iniciadoras. El tamaño será polimórfico en la población y, por consiguiente, es un marcador alélico para esa posición. Se han identificado varios marcadores en la región de la posición de ASTH 1 y se enlistan en la Tabla 1 en la sección Experimental (SEQ I D Nos: 1 60-273) . El marcador D 1 1 S2008 es de particular interés para propósitos de diagnóstico, en el cual los individuos tienen alelos Co F en esta posición, particularmente en combinación con el polimorfismo de caja CAAT y otros polimorfismos, predisponiéndose para desarrollar hiperreactividad bronquial o asma . La asociación de alelos D 1 1 S2008 es como sigue: Alelo Asociación con asma Número de repeticiones TATC con relación al alelo C (SEQ ID NO: 15) A no -2 B no -1 C sí equivalente D no +1 E no +2 F sí +3 G no +4 H no +5 Una secuencia de ADN de interés para el diagnóstico comprende las secuencias de carga iniciadora D11S2008 mostradas en la tabla 1 (SEQ ID NO: 242 y 243), identificando una o tres repeticiones de la SEQ ID NO: 15. Otros marcadores de microsatélite de interés para propósitos de diagnóstico son CA39_2; 774F; 774J; 7740; L19PENTA1; 65P14TE1, AFM205YG5; D11S907; D11S4200; 774N; CA11-11; 774L; AFM283WH9; ASMI14 y D11S1900 (las secuencias de carga iniciadora se proporcionan en la Tabla 1, las repeticiones se proporcionan en la Tabla 1B).

Regulación de la Expresión de ASTH1 Los genes de ASTH1 son útiles para el análisis de la expresión de ASTH 1 , por ejemplo, en la determinación de patrones de expresión específicos de desarrollo y de tejido y para la modulación de la expresión in vitro e in vivo. La región reguladora de la SEQ I D NO: 1 también puede utilizarse para investigar el análisis de la expresión de ASTH1. Los vectores útiles para la introducción del gen incluyen plásmidos y vectores virales. De particular interés son los vectores en base a retrovirus, por ejemplo, el virus de la leucemia murina de Moloney y los virus de inmunodeficiencia humana modificados; los vectores de adenovirus, etc. , que se mantienen de manera transitoria o estable en las células mamíferas. Pueden emplearse una amplia variedad de vectores para la transfección y/o integración del gen en el genóma de las células. De manera alternativa, puede emplearse la micro-inyección , fusión o lo similar para la introducción de genes es una célula huésped adecuada. Ver, por ejemplo, Dhawan eí al. (1 991 ) Science 254: 1 509-1 51 2 y Smith eí al. (1990) Molecular and Cellular Biology 3268-3271 . La administración de vectores para los pulmones es de particular interés. Con frecuencia, tales métodos utilizan formulaciones liposomales, como se describe en Eastman eí al. (1 997) Hum Gene Ther 8. 765-773; Oudrhiri ef al. (1 997) P. N .A. S. 94: 1651 -1 656; McDonald eí al. ( 1 997) Hum Gene Ther 8: 41 1 -422. El vector de expresión tendrá una reg ión de inicio transcripc?onal orientada para producir mARN funcional . Puede emplearse la región de inicio transcripcional nativa , por ejemplo , la SEQ I D NO ' 14, o una región de inicio transcripcional exógena. El promotor puede introducirse mediante métodos recombinantes in vitro o como resultado de la integración homologa de la secuencia en un cromosoma. Se conocen muchos promotores fuertes en la materia , incluyendo el promotor de ß-actina, los promotores tempranos y tardíos de SV40, el promotor de citomegalovirus humano, LTRs retrovirales, un elemento de respuesta a la metalotioneína (MRE) , construcciones promotoras inducibles por tetraciclina, etc. Los vectores de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico. Los chasises de transcripción pueden prepararse comprendiendo una región de inicio de transcripción, el gen objeto o fragmentos del mismo, y una región de terminación transcripcional . Los chasises de transcripción pueden introducirse en una variedad de vectores, por ejemplo, plásmido; retrovirus, por ejemplo, lentivirus; adenovirus y lo similar, donde los vectores son capaces de mantenerse de manera transitoria o estable en las células, normalmente durante un periodo de al menos aproximadamente un día , más normalmente durante un periodo de al menos aproximadamente varios días hasta varias semanas. Las moléculas de anti-detección se utilizan para sub-reg ular la expresión de ASTH1 en las células . Ei reactivo de anti-deteccíón pueden ser oligonucleótidos de anti-detección (ODN), particularmente ODN sintético que tiene modificaciones químicas a partir de ácidos nucleicos nativos, o construcciones de ácido nucleico que expresan tales moléculas de antí-detección como ARN . La secuencia de anti-detección es complementaria al mARN del gen objetivo e inhibe la expresión de los productos de gen objetivo . Las moléculas de antí-detección inhiben la expresión del gen a través de diversos mecanismos, por ejemplo, mediante la reducción de la cantidad de mARN disponible para su traslación , a través de la activación de H de ARNasa u obstáculo estérico. Puede administrarse una o una combinación de moléculas de anti-detección, donde una combinación puede comprender múltiples secuencias diferentes. Las moléculas de anti-detección pueden producirse mediante la expresión de toda o parte de la secuencia genética objetivo en un vector apropiado, donde el inicio transcripcional se orienta de tal manera que se produzca un filamento de anti-detección como una molécula de ARN. De manera alternativa, la molécula de ant?-detección es un oligonucleótido sintético. Los oligonucléotidos de anti-detección generalmente serán de al menos aproximadamente 7, normalmente de al menos aproximadamente 12, más normalmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, y no más de aproximadamente 500, normalmente no más de aproximadamente 50, más normalmente no más de aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, donde la long itud se determina por la eficiencia de inhibición , especificidad, incluyendo la ausencia de reactividad de cruce, y lo similar. Se ha encontrado que los oligonucleótido cortos , de desde 7 hasta 8 bases de longitud, pueden ser inhibidores fuertes y selectivos de la expresión del gen (ver Wagner eí al. (1 996) Nature Biotechnology 14: 840-844) . Una región o regiones específicas de la secuencia de mARN del filamento de detección endógeno se elige para complementarse por la secuencia de anti-detección. La selección de una secuencia específica para el oligonucleótido puede utilizar un método empírico, donde varias secuencias candidato se ensayan respecto a la inhibición de la expresión del gen objetivo en un modelo animal o in vitro. También puede utilizarse una combinación de secuencias, donde varias regiones de la secuencia de mARN se seleccionan para la complementación de anti-detección. Los oligonucleótidos de anti-detección pueden sintetizarse de manera química mediante métodos conocidos en la materia (ver Wagner eí al. (1 993) supra y Milligan eí al. , supra). Los oligonucleótidos preferidos se modifican de manera química a partir de la estructura de fosfodiéster nativo, con objeto de incrementar su estabilidad intracelular y la afinidad de unión . Se han descrito varias de tales modificaciones en la literatura, las cuales alteran la q u ím ica de la estructura principal , los azúcares o bases heterocíclicas. Entre los cambios útiles en la química de la estructura principal se encuentran los fosforotioatos ; fósforo ditioatos, donde ambos oxígenos sin puente se substituyen con azufre; fosforoamiditas; fosfotriésteres de alquilo y boranofosfatos. Los derivados de fosfato aquirales incluyen 3'-0'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-0-fosforotioato, 3'-CH2-5'-0-fosfonato y 3'-NH-5'-O-fosforoamidato . Los ácidos nucleicos péptidos reem plazan toda la estructura principal de fosforodiéster de ribosa con un enlace péptido. Las modificaciones de azúcar también se utilizan para mejorar la estabilidad y afinidad . Puede utilizarse el a-anómero de deoxiribosa , donde la base se invierte con respecto al ß-anómero natural. El 2'-OH de la azúcar de ribosa puede alterarse para formar azúcares de 2'-0-metilo o 2'-0-alilo, los cuales proporcionan resistencia a la degradación sin comprender afinidad. La modificación de las bases heterocíclicas debe mantener un apareamiento base apropiado. Algunas substituciones útiles incluyen deoxiuridina para deoxitimidina; 5-metil-2'-deoxicitidina y 5-bromo-2'-deoxicitidina para deoxicitidina. 5-propinil-2'-deoxiuridina y 5-propinil-2'-deoxic¡tidina han demostrado incrementar la afinidad y actividad biológica cuando se substituyen por deoxitimidina y deoxicitidina, respectivamente. Como una alternativa a los inhibidores de anti-detección , pueden utilizarse compuestos de ácido nucleico catalíticos, por ejemplo ribozimas, conjugados de anti-detección , etc. , para inhibir la expresión del gen . Las ribozimas pueden sintetizarse in vitro y administrarse al paciente, o pueden codificarse sobre un vector de expresión , a partir del cual la ribozima se sintetiza en la célula objetivo (por ejemplo, ver la Solicitud de Patente I nternacional WO 9523225 y Beigelman eí al. ( 1995)' Nucí . Acids Res 23: 4434-42) . Los ejemplos de oligonucleótidos con actividad catal ítica se describen en WO 9506764. Los conjugados de ODN de anti-detección con un complejo metálico, por ejemplo, terpiridilCu(ll) , capaz de mediar la hidrólisis de mARN, se describen en Bashkin eí al. ( 1 995) Appl Biochem Biotechnol 54: 43-56.

Uso Terapéutico de la Proteína de ASTH 1 Un huésped puede tratarse con proteína intacta de ASTH 1 o un fragmento activo de la misma para modular o reducir la híperreactividad bronquial. De manera deseable, los péptidos no inducirán una respuesta inmune, particularmente una respuesta de anticuerpo. Los análogos xenogénicos pueden seleccionarse por su habilidad para proporcionar un efecto terapéutico sin elevar una respuesta inmune. La proteína o péptidos también pueden administrarse a cultivos celulares in vitro. Pueden emplearse diversos métodos para su administración . La formulación polipéptida puede darse de manera oral o puede inyectarse de manera ¡ntravascular, subcutánea , peritoneal, etc. Los métodos de administración mediante inhalación son muy conocidos en la materia. La dosis de la formulación terapéutica variará ampliamente, dependiendo de la naturaleza de la enfermedad , la frecuencia de adm inistración , la manera de administración, la eliminación del agente en el huésped y lo similar. La dosis inicial puede ser mayor, seguida por dosis de mantenimiento más pequeñas. La dosis puede administrarse de manera tan poco frecuente como una vez a la semana o dos veces a la semana , o dividirse en dosis más peq ueñas y administrarse diariamente, semi-semanalmente, etc. , para mantener un nivel de dosis efectivo. En muchos casos, la administración oral requerirá de una dosis mayor que si se administrara de manera intravenosa. Las uniones de amida, así como también los términos amino y carboxi, pueden modificarse para una mayor estabilidad en la adm inistración oral. Los péptidos sujeto pueden prepararse como formulaciones a una dosis farmacológicamente efectiva en un medio farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina normal, PBS, etc. Los aditivos pueden incluir agentes bactericidas, estabilizadores, reguladores o lo similar. Con objeto de mejorar la vida media del péptido sujeto o conjugados de péptido sujeto, los péptidos pueden encapsularse, introducirse en el lumen de liposomas, prepararse como un coloide o puede emplearse otra técnica convencional que proporcione una vida útil prolongada de los péptidos. Los péptidos pueden administrarse como una terapia de combinación con otros agentes farmacológicamente activos. Los fármacos adicionales pueden administrarse por separado o en conjunto con las composiciones péptidas y pueden incluirse en la misma formulación . lodelos de Asma Los ácidos nucleicos sujeto pueden utilizarse para generar animales no-humanos genéticamente modificados o modificaciones genéticas de sitio específico en líneas celulares. El término "transgénico" intenta abarcar los animales genéticamente modificados que tienen una omisión u otro eliminación de actividad del gen ASTH1 , que tienen un gen exógeno de ASTH1 que se transmite de manera estable en las células huésped o que tienen un promotor exógeno de ASTH1 que se enlaza de manera operable a un gen reportero. Los animales transgénicos pueden hacerse a través de la recombinación homologa, donde se altera la posición de ASTH1. De manera alternativa, una construcción de ácido nucleico se integra de manera aleatoria en el genoma. Los vectores para la integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YACs y lo similar. Son de interés los mam íferos transgénicos, por ejemplo, vacas, cerdos, cabras, caballos, etc. , y particularmente los roedores, por ejemplo, ratas, ratones, etc. Un animal "de eliminación" se manipula genéticamente para reducir substancialmente o elim inar la función endógena de ASTH1. Pueden utilizarse diferentes enfoques para lograr la "eliminación". Puede inducirse una omisión cromosomática de todo o parte del homólogo del ASTH1 nativo. Las omisiones de las regiones no codificadoras, particularmente la región promotora, secuencias reguladoras 3', mejoradoras u omisiones del gen que activa la expresión de genes de ATH 1 . U na eliminación funcional también puede lograrse mediante la introducción de una construcción de antidetección q ue bloquea la expresión de los genes nativos de ASTH1 (por ejemplo, ver Li y Cohén ( 1 996) Cell 85: 31 9-329) . Los animales transgénicos pueden hacerse teniendo genes exógenos de ASTH1. Los genes exógenos son normalmente de una especie diferente al animal huésped , o se alteran de otro modo en su secuencia codificadora o no codificadora. El gen introducido puede ser un gen de tipo silvestre, un polimorfismo naturalmente ocurrente, 0 una secuencia genéticamente manipulada, por ejemplo, aquellos previamente descritos con omisiones, substituciones o inserciones en las regiones codificadoras o no codificadoras. La secuencia introducida puede codificar un polipéptido de ASTH 1 , o puede utilizar el promotor de ASTH1 operablemente enlazado a un gen reportero. Cuando el gen introducido es una secuencia codificadora , normalmente se enlaza de manera operable a un promotor, el cual puede ser constitutivo o inducíble, y a otras secuencias reg uladoras requeridas para la expresión en el animal huésped. Las construcciones específicas de interés incluyen , pero sin limitarse a, ASTH1 de anti-detección, el cual bloqueará la expresión de ASTH 1 , la expresión de las mutaciones negativas dominantes de ASTH 1 y la sobre-expresión de un gen de ASTH 1 . Un marcador detectable, tal como lac Z puede introducirse en la posición de ASTH1 , donde la sobrereg ulación de la expresión de AS TH1 dará como resultado un cambio fácilmente detectado en el fenotipo . También son de interés las construcciones que utilizan la reg ión promotora de ASTHl , por ejemplo, la SEQ I D NO: 1 ; SEQ I D NO: 14, en combinación con un gen reportero o con la región codificadora de ASTH1J o ASTH1I. Las células o animales modificados son útiles en el estudio de la función y regulación de ASTH1. Los animales pueden utilizarse en estudios funcionales , selección de fármacos, etc. , por ejemplo, para determinar el efecto de un fármaco candidato en el asma. Puede hacerse una serie de pequeñas omisiones y/o substituciones en el gen de ASTH1 para determinar el papel de los diferentes exones en la unión de ADN , la regulación transcripcional , etc. Al proporcionar la expresión de la proteína de ASTH 1 en las células en las cuales no se produce normalmente de otro modo, uno puede inducir cambios en el comportamiento celular. Estos animales también son útiles en la exploración de modelos de herencia de asma , por ejemplo, dominante vs. recesivo; los efectos relacionados de los diferentes alelos y los efectos sinergísticos entre el ASTH1 I y ASTH1J y otros genes de asma en cualquier lugar del genoma . Las construcciones de ADN para la recombinación homologa comprenderán al menos una porción del gen de ASTH1 con la modificación genética deseada e incluirán regiones de homolog ía con la posición objeto. Las construcciones de ADN para la integración aleatoria no necesitan incluir regiones de homolog ía para mediar la recombinación. De manera conveniente, se incluyen los marcadores de selección positiva y negativa. Se conocen en la materia los métodos para la generación de células que tienen modificaciones genéticas seleccionadas a través de la recom binación homologa. Para las diversas técnicas de transfección de células mam íferas, ver Keown eí al. (1 990) Methods in Enzymoloqy 1 85: 527-537. Para las células de vastago embriónico (ES) , puede emplearse una línea celular de ES o las células embriónicas pueden obtenerse recientemente de un huésped , por ejemplo, un ratón, rata , conejillo de Indias, etc. Tales células se desarrollan en una capa alimentadora de fibroblastos apropiada o se desarrollan en la presencia de factores de crecimiento apropiados, tales como el factor de inhibición de leucemia (LI F) . Cuando las células de ES se han transformado, pueden utilizarse para producir animales transgénicos. Después de la transformación, las células se colocan sobre placas en una capa alimentadora en un medio apropiado. Las células que contienen la construcción pueden detectarse mediante el empleo de un medio selectivo. Después del tiempo suficiente para que las colonias se desarrollen, se recolectan y analizan respecto a la ocurrencia de recombinación o integración homologa de la construcción. Esas colonias que son positivas pueden utilizarse entonces para la manipulación del embrión y la inyección de blastocistos. Los blastocistos se obtienen de hem bras superovuladas de 4 a 6 semanas de edad . Las células de ES se tripsinizan y las células modificadas se inyectan en el blastocoelo del blastocisto. Después de la inyección, los blastocistos se regresan a cada cuerno uterino de las hembras pseudopreñadas. Se permite entonces q ue las hembras lleg uen al término y se seleccionan las carnadas resultantes de las células mutantes q ue tienen la construcción. Al proporcionar un fenotipo diferente del blastocisto y las células de ES, puede detectarse fácilmente la progenie quimérica. Los animales quiméricos se seleccionan por la presencia del gen modificado y los machos y hem bras que tienen la modificación se acoplan para producir progenies homozigosas Sí las alteraciones del gen originan letalidad en cierto punto del desarrollo, los tejidos u órganos pueden mantenerse como injertos o transplantes alogénicos o congénicos, o en un cultivo in vitro. La investigación de la función genética puede utilizar modelos no mamíferos, utilizando particularmente aquellos organismos que se encuentran biológicamente y genéticamente bien caracterizados, tales como C. elegans, D. melanogaster y S. cerevisiae. Por ejemplo, pueden hacerse las inserciones de transposón (Tc1 ) en el homólogo nemátodo de un gen de ASTH1 o región promotora . Las secuencias genéticas sujeto pueden utilizarse para eliminar o para complementar lesiones genéticas definidas con objeto de determinar las trayectorias fisiológicas y bioquímicas involucradas en la función de ASTH1. Se ha mostrado que varios genes humanos complementan las mutaciones en eucariotas inferiores. La selección del fármaco puede llevarse a cabo en combinación con los modelos animales sujeto. Muchos genes mamíferos tienen homólogos en levadura y animales inferiores. El estudio de las interacciones con otras proteínas y papeles fisiológicos de tales homólogos, puede facilitar el entendimiento de la función biológica. Además de los modelos en base a la complementación genética, la levadura ha demostrado ser una poderosa herramienta en el estudio de las interacciones de proteína-proteína a través de los dos sistemas híbridos descritos en Chien et al. (1 991 ) P. N .A. S . 88 : 9578-9582. El análisis de los dos sistemas h íbridos es de particular interés en la exploración de la activación transcripcional mediante proteínas de ASTH1.

Ensayos de Selección del Fármaco Al proporcionar la producción de grandes cantidades de proteína de ASTH 1 , uno puede identificar ligandos o substratos que se unen a, modulan o imitan la acción del ASTH 1 . Las áreas de investigación son el desarrollo de tratamientos de asma. La selección de fármacos identifica agentes que proporcionan un reemplazo o mejora de la función de ASTH 1 en las células afectadas. Por el contrario, Jos agentes que invierten o inhiben la función del ASTH 1 pueden simular la reactividad bronquial . Son de particular interés los ensayos de selección de agentes que tienen una baja toxicidad en células humanas. Pueden utilizarse una amplia variedad de ensayos para este propósito, incluyendo ensayos de unión de proteína-proteína, in vitro, etiq uetados, ensayos de unión de proteína-ADN , ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética, inmunoensayos para la unión de la proteína y lo similar. La proteína purificada también puede utilizarse para la determinación de la estructura de cristal tri-dimensional, la cual puede utilizarse para modelar interacciones intermoleculares, regulación transcrípcional , etc. Según se utiliza en la presente, el término "agente" describe cualquier molécula , por ejemplo, proteína o farmacéutico , con la capacidad de alterar o imitar la función fisiológ ica del ASTH 1 .

Generalmente, se realiza una pluralidad de mezclas de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a concentración nula o por debajo del nivel de detección. Los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferentemente pequeños compuestos orgánicos que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de aproximadamente 2,500 daltones. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente de unión a hidrógeno, y típicamente incluyen al menos una amina, carbonilo, grupo hidróxilo o carbóxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos con frecuencia comprenden estructuras heterocíclicas o de carbono cíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas substituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas que incluyen, pero no se lim itan a: péptidos, sacáridos, ácidos g rasos, esteroides, purinas, pirim idinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, existen numerosos medios disponibles para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. De manera alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de bacterias, hongos, extractos de plantas y animales, se encuentran disponibles o se producen fácilmente. De manera adicional, las bibliotecas y compuestos naturales o sintéticamente producidos, se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales y pueden utilizarse para producir bibliotecas combinatoriales. Los agentes farmacológicos conocidos pueden sujetarse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación , esteríficación, amídificación, etc. , para producir análogos estructurales. Cuando el ensayo de selección es un ensayo de unión , una o más de las moléculas pueden unirse a una etiqueta, donde la etiqueta puede proporcionar, de manera directa o indirecta, una señal detectable. Las diversas etiquetas incluyen radioisótopos, materia fluorescente, materia quimiluminiscente, enzimas, moléculas de unión específicas, partículas, por ejemplo, partículas magnéticas y lo similar. Las moléculas de unión específicas incluyen pares, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de unión específica, el miembro complementario normalmente se etiquetaría con una molécula que proporciona la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos. Puede incluirse una variedad de otros reactivos en el ensayo de selección . Estos incluyen reactivos como sales, proteínas neutrales, por ejemplo, albúmina , detergentes, etc , que se han utilizado para optimizar la óptima unión de proteína-proteína y/o para reducir las interacciones no específicas o de fondo. Pueden utilizarse reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes anti-m icrobianos, etc. La mezcla de componentes se agrega en cualquier orden que proporcione la unión solicitada. Las incubaciones se llevan a cabo a cualquier temperatura adecuada, típicamente entre 4 y 40°C. Los períodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero también pueden optimizarse para facilitar la rápida selección de elevado rendimiento. Típicamente entre 0.1 y 1 hora será suficiente. Otros ensayos de interés detectan agentes que imitan la función del ASTH 1 . Por ejemplo, los agentes candidatos se agregan a una célula que carece de ASTH 1 funcional y se seleccionan por su habilidad para reproducir ASTH 1 en un ensayo funcional. Los compuestos que tienen la actividad farmacológica deseada pueden administrarse en un vehículo fisiológicamente aceptable a un huésped para el tratam iento de asma atribuible a un defecto en la función de ASTH 1 . Los compuestos también pueden utilizarse para mejorar la función de ASTH 1 . Los agentes terapéuticos pueden administrarse en una variedad de maneras, oralmente, tópicamente, parenteralmente, por ejemplo, subcutáneamente, ?ntraper?tonealmente, mediante infección viral, intravascularmente, etc. Los tratamientos inhalados son de particular interés.

Dependiendo de la manera de introducción, los compuestos pueden formularse en una variedad de maneras. La concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar desde aproximadamente 0.1 -100% en peso. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse de diversas formas, tales como granulos, tabletas, pildoras, supositorios , cápsulas, suspensiones, ungüentos, lociones y lo similar. Los vehículos y/o diluyentes orgánicos o inorgánicos de grado farmacéutico adecuados para su uso oral y tópico pueden utilizarse para elaborar composiciones que contienen los compuestos terapéuticamente activos. Los díluyentes conocidos en la materia incluyen medios acuosos, aceites y grasas vegetales y animales. Pueden utilizarse como agentes auxiliares agentes de estabilización, agentes humectantes y emulsificadores , sales parar variar la presión osmótica o reguladores para asegurar un valor de pH adecuado y mejoradores de penetración de la piel.

Farmacogenética La farmacogenética es el enlace entre el genotipo de un individuo y esa habilidad del individuo para metabohzar o reaccionar a un agente terapéutico. Las diferencias de metabolismo la sensibilidad objeto pueden conducir a una severa toxicidad o a una falla terapéutica al alterar la relación entre la dosis bioactiva y la concentración sanguínea del fármaco En los últimos años , numerosos estudios han establecido buenas relaciones entre polimorfismos en enzimas metabólicas o fármacos objeto y tanto en respuesta como en toxicidad. Estas relaciones pueden utilizarse para individualizar la administración de dosis terapéutica . La genotipificación de los alelps se utiliza para evaluar si un individuo responderá bien a un régimen terapéutico en particular. Las secuencias polimórficas también se utilizan en los ensayos de selección de fármacos para determinar la dosis y especificidad de un agente terapéutico candidato. Un polimorfismo de ASTH 1 candidato se selecciona con una terapia objeto para determinar si existe una influencia en la eficacia en el tratamiento de asma. Los ensayos de selección de fármacos se llevan a cabo como se describe arriba. Típicamente, se prueba la respuesta a una terapia de dos o más polimorfismos de secuencia diferente. Los fármacos actualmente utilizados para tratar el asma incluyen beta 2-agonistas, glucocortícoides, teofilina , cromonas, y agentes anticolergénicos. Para un asma severo, agudo, los beta 2-agonistas inhalados son los broncodilatadores más efectivos. Las formas de corta actuación dan un rápido alivio; los agentes de actuación prolongada proporcionan el alivio sostenido y ayudan al asma nocturno. La terapia de primera línea para el asma crónico son los glucocorticoides inhalados, los únicos agentes actualmente disponibles que reducen la inflamación de las vías respiratorias. La teofilina es un broncodilatador que útil para el asma severo y nocturno, pero los estudios recientes sugieren que puede tener un efecto inmunomodulador. Las cromonas funcionan mejor en pacientes que tienen asma medio: tienen unos cuantos efectos adversos pero su actividad es breve, por lo que deben darse frecuentemente. Los leucotrienos de cisteinilo son mediadores importantes de asma y la inhibición de sus efectos puede representar un avance potencial en la terapia de rinitis alérgica y asma. Cuando un polimorfismo de secuencia en particular se correlaciona con eficacias de fármacos diferenciales, puede llevarse a cabo la sejección del diagnóstico. Los métodos diagnósticos se han descrito en detalle en una sección precedente. La presencia de un polimorfismo en particular se detecta y utiliza para desarrollar una estrategia terapéutica efectiva para el individuo afectado.

EXPERIMENTOS Los siguientes ejemplos se establecen a fin de proporcionar a aquellos de experiencia ordinaria en la materia una exposición y descripción completas de la manera de elaborar y utilizar la invención sujeto y no intentan limitar el alcance de lo que se considera como la invención. Se han hecho esfuerzos por asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc. ) , pero deben permitirse alg unos errores y desviaciones experimentales A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio; la temperatura se encuentra en grados centígrados; y la presión se encuentra a o cerca de la atmosférica.

MATERIALES Y MÉTODOS Familias de asma para los estudios de representación genética Las mediciones de fenotipo de asma y muestras sanguíneas se obtuvieron de los habitantes de Tristan de Cunha, una isla separada en el Atlántico Sur y de las familias de asma en Toronto, Canadá (ver Zamel eí al. , (1 996) supra) . Los 282 habitantes de Tristan de Cunha forman una sola familia grande extendida que desciende de 28 fundadores originales. El asentamiento de Tristan da Cunha ocurrió a inicios de 1 81 7 con los soldados que permanecieron detrás cuando un joven británico fue separado de la isla, seguido por los sobrevivientes de varios hundimientos de barcos. En 1827, cinco mujeres de Santa Helena, una con niños, emigraron a Tristan da Cuhna y se casaron con los hombres de la isla. Se dice que una de estas mujeres era asmática y podría ser el origen de un efecto fundador genético de asma en esta población . El cruzamiento consanguíneo ha dado como resultado semejanzas de parentesco de al menos cinco niveles de primos para todos los individuos. Los árboles genealógicos de la familia de Tristan da Cunha se determinaron a través de la revisión de registros de bautizos, bodas y registros médicos, así como tam bién registros históricos confiablemente exactos de los primeros habitantes (Zamel (1995) Can. Respir. J . 2: 18). La prevaiescencia de asma en Tristan da Cunha es elevada; 23% tuvo un diagnóstico definitivo de asma. La corte de Toronto incluyó a 59 pequeñas familias que tienen al menos un individuo afectado. Estos se determ inaron en base a los siguientes criterios : (i) un probando afectado; (ii) la disponibilidad de al menos un fraterno del probando, ya sea afectado o no afectado; (iii) al menos un pariente vivo de quien pudiera obtenerse ADN. Un conjunto de 156 familias "de elemento trivalente" consistentes en un probando afectado y sus parientes también se recolectaron. Se obtuvieron formas de consentimiento por escrito para cada individuo antes del comienzo de la fenotipificación y la recolección de muestras sanguíneas. Los pacientes de Toronto fueron principalmente de ascendencia europea mezclada.

Caracterización clínica Un cuestionario estandarizado en base al de la American Thoracic Society (la American Lung Association recomendó el cuestionario de enfermedades respiratorias a utilizarse con adultos y niños en la investigación epidemiológica, 1978, American Review of Respiratory Disease 118 (2): 7-53) se utilizó para registrar la presencia de síntomas respiratorios tales como tos, flemas y resuello asmático; la presencia de otros desórdenes del pecho, incluyendo la reciente infección del tracto respiratorio superior, la historia alérgica; los ataques asmáticos incluyendo el inicio, el término, la confirmación por un médico, la prevalescencia, los factores de severidad y precipitación; otras enfermedades e historias de fumadores; y todos los medicamentos utilizados dentro de los últimos 3 meses. Un ataque asmático confirmado por un médico fue el principal criterio de diagnóstico de asma. La atopía de la piel se determinó mediante pruebas de punzada dérmica a alérgenos comunes: A. fumigatus, Cladosporium, Alternaría, huevo, leche, trigo, árboles, perros, pasto, caballos, polvo casero, gatos, píeles, acáridos de polvo casero D. farinae y acáridos de polvo casero D. pteronyssinus. La prueba de atopía de los sujetos de Toronto omitió al D. pteronyssinus y agregó alérgenos de cucaracha y ambrosía. Los controles de solución salina e hístamina también se llevaron a cabo (Bencard Laboratories, Missisauga, Ontario). Las antihistaminas se separaron durante al menos 48 horas antes de la examinación. Los diámetros del trigo se corrigieron mediante la substracción del diámetro de roncha de control de la solución salina y un tamaño de roncha corregido de >3 mm se registró 1 0 min después de que la aplicación se consideró una respuesta positiva. La capacidad de respuesta de las vías respiratorias se determinó mediante una prueba de señal de identificación de metacolina en aquellos sujetos con una línea de base FEV1 (volumen de exhalación forzado en un segundo) > 70% del predicho (Crapo eí al. (1 981 ) Am . Rev. Respir. Dis. 123: 659) . La respuesta de señal de identificación de metacolina se determinó mediante el uso del método de respiración mareal (Cockcroft eí al. ( 1 977) Clin Allergy 7. 235) Las dosis dobles de metacolina desde 0.03 hasta 16 mg/ml se admin istraron mediante el uso de un nebulizador Wright a intervalos de 4 min para medir la concentración provocativa de metacolina que produce un 20% de caída en FEV1 (PC20). Si FEV1 fue <70% de lo predicho, se utilizó una respuesta de broncodilatador a 400 mg de aerosol de salbutamol para determinar la capacidad de respuesta de las vías respiratorias. Tanto las señales de identificación de metacolina como las respuestas al broncodilatador se midieron mediante el uso de un sistema de señal de identificación bronquial computarizado (S&M Instrument Co. I nc. , Doyleston, PA) consistente en un paquete de software y tablero de interfase instalado en una computadora portátil Tishuba T1 850C y conectada a un sensor de flujo (RS232FS). Se ha descrito la fuente de energía para los instrumentos utilizados en Tristan da Cunha (zamel eí al. (1996) supra) . Una creciente capacidad de respuesta de las vías respiratorias se definió como PC20 < 4.0 mg/ml o una mejora de > 1 5% en FEV1 15 min después del broncodilatador. Se pidió a los participantes sostener los broncodilatadores al menos 8 h antes de la examinación; se mantuvieron esteroides inhalados o sistémicos en la dosis usual. Los sujetos con una historia de una infección de tracto respiratorio superior dentro de un mes de examinación se volvieron a identificar en un fecha posterior.

Genotipificación Los pares de carga iniciadora de PCR se sintetizaron mediante el uso de un oligosintetizador automatizado 394 de Applied Biosystems. La carga iniciadora de avance de cada par se etiquetó con fosforamiditas ya sea FAM, HEX, o TET (Applied Biosystems). No se llevó a cabo ninguna etapa de oligopurificación . El ADN genómico se extrajo de sangre completa, el PCR se llevó a cabo mediante el uso de termociclos PTC 100 (MJ Research). Las reacciones contuvieron 10 mM de Tris-HCl, pH 8.3; 1 .5-3.0 mM de MgCI2; 50 mM de KCl; 0.01 % de gelatina; 250 µM de cada dGTP, dATP, dTTP, dCTP; 20 µM de cada carga iniciadora de PCR; 20 ng de ADN genómico; y 0.75 U de Polimerasa de Taq (Perkin Elmer Cetus) en un volumen final de 20 µl. Las reacciones se llevaron a cabo en placas de microtítulo de polipropileno de 96 perforaciones (Robbins Scientific) con 94°C iniciales, 3 min . de desnaturalización seguidos por 35 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg . a la temperatura de reasociación y 30 seg. a 72°C, con una extensión final de 2 min. a 72°C después del último ciclo. La etiqueta de tintura, la temperatura de reasociación y la concentración final de magnesio fueron específicas para el marcador individual. La intensidad de la etiqueta de tintura y la cantidad de producto de PCR (determinados sobre geles de agarosa) se utilizaron para determinar la cantidad por agrupamiento para cada posición de marcador. Los productos agrupados se precipitaron y las bolitas del producto se mezclaron con 0.4 µl de Genescan 500 tamaño Tamra estándar, 2 µl de formamida, y 1 µl de tintura de carga ABI . Las placas de grupos de producto de PCR se calentaron hasta 80°C durante 5 minutos e inmediatamente se colocaron en hielo antes de la carga de gel. Los productos de PCR se electroforetizaron en 6% de geles de poliacrilamida desnaturalizantes a 1 000 voltios constantes mediante el uso de instrumentos AB I 373a . La detección del pico, la dimensión y la filtración de banda exacta se lograron mediante el uso de software Genescan 1 .2 y Genotyper 1 .1 (Applied Biosystems) . Los datos del genotipo se sometieron subsecuentemente a verificaciones de consistencia y control de calidad (Hall eí al. (1996) Genome Res. 6: 781 ). La genotipificación de marcadores de 'saturación' en la región del ASTH 1 se hizo mediante el método arriba descrito con varias excepciones. En la mayoría de los casos, la carga iniciadora no etiquetada de cada par se modificó con la secuencia GTTTCTT en el extremo 5' (Smith eí al. 1995 Genome Res. 5: 312). En el PCR se utilizaron Amplitaq Gold (Perkin Elmer Cetus) y regulador D (2.5 m M de MgCI2, 33.5 mM de Tris-HCl pH 8.0, 8.3 mM de (NH4)2S04, 25 mM de KCl, 85 µg/ml de BSA). Se empleó un perfil de amplificación de 'toque' en el cual la temperatura de reasociación comenzó a 66°C y disminuyó un grado por ciclo hasta un final de 20 ciclos a 56°C. Los productos se pasaron sobre 4.25% de geles de poliacrilamida mediante el uso de instrumentos ABI 377. Los datos se procesaron con software Genescan 2. 1 y Genotyper 1 . 1 .

La Exploración del Genoma Se llevó a cabo una exploración del genoma en la población de Tristan da Cunha mediante el uso de 274 marcadores de mícrosatélite polimórficos elegidos de entre aquellos desarrollados en Oxford (Reed eí al. (1 994) Nature Genetics 7: 390) , Genethon (Dib ef al. (1 996) Nature 380: 1 52) y el Cooperative Hu man Linkage Center (CHLC, Murray eí al. (1 994) Science 265: 2049). Los marcadores con valores de heterozigocidad de 0.75 o mayores se seleccionaron para cubrir todos los cromosomas humanos, así como también para una fácil genotipificación y dimensión del producto de PCR para la transmisión en múltiple de marcadores en gel. Se utilizaron quince conjuntos multiplexados para proporcionar una sucesión de productos de PCR en cada una de las tres tinturas cuando se separaron por tamaño. Las distancias publicadas se utilizaron inicialmente para estimar la resolución de mapeo. Se calcularon distancias genéticas más exactas mediante el uso del estudio de población a medida que se generaron los datos. Los 274 marcadores dieron un intervalo promedio de 14 cM para la exploración del genoma.

Análisis de Enlace Los análisis paramétricos de enlace de los datos marcadores se condujeron mediante el uso de los métodos de Haseman y Elston (1 972) Behav. Genet. 2: 3, y FASTLI N K (Schaffer eí al. (1 996) Hum . Hered . 46 : 226) , suponiendo un modo de transm isión dominante con penetración incompleta. Se examinó el enlace a tres fenotipos primarios, incluyendo diagnóstico de asma (historia) , capacidad de respuesta de las vías respiratorias (PC20 < 4 mg 7ml para la señal de identificación de metacolina) y atopía (una o más pruebas de punzada dérmica que produjeron un diámetro de roncha > 3 mm) y las combinaciones de estos.

Preparación de ADN de cromosoma artificial de levadura (YA C) a pequeña escala El aislamiento a pequeña escala del ADN de YAC para la representación de STS se hizo mediante un procedimiento que utiliza glóbulos de vidrio y el cizallamiento físico para dañar la pared celular de la levadura (Scherer y Tsui ( 1 991 ) Cloning and analysis of lar e DNA molecules. en Advanced Techniques in Chromosome Research . (K.W. Adolph, ed.) pp. 33-72. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel , Hong Kong).

Preparación de bloqueo de YAC y electroforesis de gel de campo impulsado (PFGE) Se desarrollaron 50 ml de cultivo de cada YAC en 2 x AHC a 30°C. Las células se conformaron en bolitas mediante centrifugación y se enjuagaron dos veces en agua estéril . Después de la resuspensión de las células en 4 ml de SCEM (1 M de sorbitol, 0.1 M de citrato de sodio (pH 5.8), 10 mM de EDTA, 30 mM de ß-mercaptoetanol), se agregaron 5 ml de 1 .2% de agarosa de baja temperatura de fusión en SCEM, se mezclaron, se vaciaron en moldes de enclave de 1 00 m l y se dejaron solidificar. Los enclaves se incubaron durante la noche en 50 ml de SCEM que contiene 30 U/ml de liticasa (Sigma) . Los enclaves se enjuagaron 3 veces en TE (10 mM de Tris pH 8.0, 1 mM de EDTA) y se incubaron dos veces durante 12 horas cada vez a 50°C en solución de lisis (0.5 M de EDTA, pH 8.0; 1 % en peso/volumen de sarcosina de lauril de sodio; 0.5 mg/ml de proteinasa K) . Se enjuagaron 5 veces con TE y se almacenaron en 0.5 M de EDTA (pH 8.0) a 4°C . Los YACs y cromosomas de levadura se separaron en geles de campo impulsado mediante el uso de un Mapeador CHEF (BIO-RAD) y de acuerdo a métodos suministrados por el fabricante, después se transfirieron a nitrocelulosa. Los YACs que comigraron con cromosomas de levadura se visualizaron mediante hibridización de la mancha con secuencias de vector YAC radioetiquetadas (Scherer y Tsui (1 991 ) supra).

Hibridización de ADN de YAC para cromosomas artificiales bacterianos (BA C) y rejillas cósmidas El ADN de YAC purificado por tamaño se preparó mediante electroforésis de gel de campo impulsado sobre un gel de agarosa (FMC) de GTG Seaplaque a baja temperatura de fusión , purificado por GeneClean (BIO 101 ) y radioetiquetado durante 30 mins. con 3 P-dCTP mediante el uso del equipo Prime-lt I I (Stratagene) Se agregaron 50 µl de agua y el nucleótido no incorporado se retiró mediante Quick Spin Column (Boehringer Mannheim) . 23 µl de 1 1 .2 mg/ml de ADN de placenta humana (Sigma) y 36 µl de 0.5 M de Na2HP0 , pH 6.0 se ag regaron a los aproximadamente 1 50 µl de eluyente. La sonda se hirvió durante 5 mins y se incubó a 65°C durante exactamente 3 horas, después se agregó al BAC en rejilla prehibridizado (Schizuya ef al. ( 1992) proc. Nati. Acad . Sci. 89: 8794; adq u irido en Research Genetics) o el cósm ido de cromosoma 1 1 [Resource Center/Primary Datábase of the Germán Human Genome Project, Berlín; Lehrach ef al. ( 1990) , En Davies, K. E. y Tilghman , S. M. (eds.), Genome Analysis Volumen 1 : Genetic and Physical mapping . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp. 39-81 ] se filtró en una mezcla de hibrídización de sulfato de dextrano (sulfato de dextrano al 1 0%, 1 % de SDS, 1 M de NaCI) . Las hibridizaciones se hicieron a 65°C durante 12 - 48 horas, seguidas por 2 enjuagues a temperatura ambiente en 2 x SSC durante 1 0 min cada uno y 3 enjuagues a 65°C en 0.2X SSC, 0.2% de SDS durante 20 min cada uno.

Hibridización in situ de fluorescencia de metafase (FISH) e hibridización in situ visual directa (DIRVISH) La FISH de metafase se llevó a cabo mediante métodos estándares (Heng y Tsui (1994) de detección de FISH en cromosomas con banda DAPI . En Methods of Molecular Biology: I n situ Hybridisation Protocols (K. H.A. Choo, ed.) pp. 35-49. Human Press , Clifton, N .J .). Se utilizó FISH, o DIRVISH, de resolución elevada para representar las posiciones relativas de dos o más clonas en ADN genómico. El protocolo utilizado fue como el descrito por Parra y Windle (1993) Nature Genet. 5: 17. En resumen, se prepararon pliegues que contienen ADN estirado mediante la adición de 2 µl de una suspensión de células de linfoblasto humano normales en un extremo de un pliegue de vidrio y se dejaron secar. Se agregaron 8 µl de regulador de lisis (0.5% de SDS , 50 mM de EDTA) , 200 m M de Tris-HCl, pH 7.4) y el pliegue se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. El pliegue se inclinó a fin de que el ADN pasara por debajo del pliegue, después se secó. El ADN se fijó mediante la adición de 400 µl de 3: 1 de metanol/ácido acético. Las sondas se etiquetaron ya sea con biotina o con digoxigenina mediante traslación de nombre estándar (Rigby ef al. (1 977) J . Mol. Biol. 1 13 : 237) . La hibridización y detecciones se llevaron a cabo mediante el uso de técnicas de hibridización in situ de fluorescencia estándares (Heng y Tsui (1994) supra). Los resultados se visualizaron mediante el uso de un microscopio de Mikrophot SA (Nikon) equipado con una cámara de CCD (Photometrics) . Las imágenes se registraron mediante el uso de software Smartcapture (Vysis) .

Llenado de Espacios Los espacios identificadores de clonas en el mapa se clonaron al final medíante digestión con enzimas que no cortan las secuencias de vector respectivas (Nsil para clonas BAC y Xbal para clonas PAC), seguida por la re-ligación y transformación en DH5a competente. Las clonas que produjeron dos fragmentos terminales y el vector plásmido tras la digestión con Notl y Nsil o Xbal se ordenaron en secuencia. Los espacios en la trayectoria de titulación se llenaron mediante la selección de una biblioteca de PAC genómico humano (Loannou eí al. (1994) Nature Genetics 6: 84; obtenido por Health Research, Inc.) por PCR mediante el uso de cargas iniciadoras diseñadas a partir de secuencias terminales de clona.

Selección Directa de cADN La selección directa de cADN (Lovett ef al. , ( 1 991 ) Proc. Nati . Acad. Sci. 88: 9628) se llevó a cabo mediante el uso del cADN derivado tanto de tejido de pulmón completo adulto como de tejido de pulmón completo fetal (Clontech). 5 µg de Poli(A) + ARN se convirtieron en cADN de doble filamento mediante el uso del Superscript Choice System para la síntesis de ADN y el protocolo suministrado (Gibco BRL). La puesta de la carga iniciadora de filamento se logró tanto mediante oligo(dT) como mediante hexámeros aleatorios. El cADN resultante se dividió en 2 alícuotas iguales y se digirió ya sea con Mbol o con Taql antes de la adición de cargas iniciadoras enlazadoras específicas. Las cargas iniciadoras enlazadoras para el ADN digerido por Mbol fueron según se describe por Morgan et al. (1 992) Nucleic Acid Res. 20: 51 73. Las cargas iniciadoras enlazadoras para el ADN digerido por Taql fueron una modificación de estos: (SEQ I D NO: 336) Taq l a: 5'-CGAGAATTCACTCGAGCATCAGG ; (SEQ I D NO: 337) Taql b: 5'-CCTGATGCTCGAGTGAATTCT. El cADN modificado fue etanol precipitado y resuspendido en 200 µl de H20 Se amplificó 1 µl de cADN con la carga iniciadora enlazadora Mbo l b en una reacción de 1 00 µl de PCR. Los productos de cADN resultantes, aproximadamente 1 µg , se bloquearon con 1 µg de ADN de COT1 (Gibco BRL) durante 4 horas a 60°C en 120 mM de regulador de NaP04, pH 7 0.

Aproximadamente 1 µg de las clonas genómicas apropiadas se bioestañó mediante el uso del BioNick Labeling System (Gibco BRL). La biotina no incorporada se retiró mediante cromatografía de columna rotacional . Aproximadamente 1 00 ng de ADN genómíco bioestañado se desnaturalizaron y dejaron hibrídizar para 1 µg de cADN bloqueado en un volumen total de 20 µl en 120 mM de NaP04 durante 60 horas a 60°C bajo aceite mineral . Después de la híbridización, el ADN bioestañado se capturó en glóbulos magnéticos cubiertos por estreptavidina (Dynal) en 100 µl de regulador de unión (1 M de NaCI, 1 0 mM de Tris, pH 7.4, 1 mM de EDTA) durante 20 minutos a temperatura ambiente con rotación constante. Dos enjuagues de 15 minutos a temperatura ambiente con 500 µl de 1 X SSC/0.1 % de SDS fueron seguidos por cuatro enjuagues durante 20 minutos a 65°C con 500 ul de 0.1 X SSC/0. 1 % de SDS con rotación constante. Después de cada enjuague, los glóbulos se recolectaron al lado del tubo mediante el uso de separación por imán y el sobrenadante se retiró con una pipeta . Después del último enjuague, los glóbulos se enjuagaron brevemente una vez con solución de enjuague antes de levigar el cADN unido con 50 µl de 0. 1 M de NaOH durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró y neutralizó con 50 µl de 1 M de Tris pH 7.4 El cADN primario seleccionado se desaló mediante el uso de una columna Sephadex G-50 (Boehringer Mannheim) . El PCR se llevó a cabo en 1 , 2 , 5 y 10 µl de levigado con cargas iniciadoras de Mbo l b. Los productos amplificados se analizaron en un gel de agarosa al 1 4% . La reacción con las bandas más limpias y el último fondo se escalaron para producir aproximadamente 1 µg de cADN primario seleccionado Este cADN primario seleccionado, amplificado, se bloqueó con 1 µg de COT1 a 60°C durante 1 hora, seguido por una segunda vuelta de hibridización para 100 ng del ADN genómico apropiado bajo las mismas condiciones que la primer vuelta de selección. El enjuague del cADN de unión, la levigación y el PCR del cADN seleccionado fueron idénticos a la primer vuelta. 1 µl de cADN secundario, amplificado por PCR, se clonó mediante el uso del sistema de clonación TA de acuerdo al protocolo de los fabricantes (Invitrogen). Las colonias se recolectaron en placas de microtítulo de 96 perforaciones y se desarrollaron durante la noche anterior al ordenamiento en secuencia.

Captura de Exón La captura de exón se llevó a cabo mediante el método de Buckler eí al. (1 991 , Proc Nati. Acad . Sci. USA 88: 4005) con modificaciones descritas en Church eí al. (1 994) Nature Genetics 6 98. Cada clona de BAC del conjunto m ínimo de clonas requeridas para la cubierta de la región de ASTH 1 (es decir, la trayectoria de titulación) se sujetó a una captura de exón por separado. En resumen, los fragmentos de restricción (Pstl o BamHI/BglII) de cada cósmido se subclonaron por disparo en pSPL3B digerido por Pstl- o BamHl- y tratado con fosfatasa, el cual había sido modificado como en Burns ef al. ( 1 995) Gene 161 : 1 83 (GI BCO BRL). Las ligaciones se electroporaron en células ElectroMax HB 101 (Gibco BRL) y se colocaron en placas sobre placas de ampicilina LB de 20 cm de diámetro. El ADN se preparó a partir de placas con >2000 colonias mediante la recolección de las bacterias en la purificación de ADN líquido y plásmido de ampicilina LB mediante un protocolo estándar de lisis alcalina (Sambrook ef al. (1 989) supra). 5 µg de ADN de cada preparación de grupo plásmido se electroporaron en células Cos 7 (ATCC) y el ARN se recolectó mediante el uso de TRIZOL (Gibco BRL) después de 48 horas de crecimiento. Los productos de RT-PCR se digirieron con BstXI antes de una segunda amplificación de PCR. Los productos se clonaron en pAMPI O (Gibco BRL) y se transformaron en células DH5 (Gibco BRL). Se recolectaron 96 colonias por BAC y se analizaron respecto al tamaño de inserción mediante PCR.

Hibridización sanguínea Northern La hibridización sanguínea Northern se llevó a cabo mediante el uso de manchas de Múltiple Tissue Northern (MTN) (Clontech) . Las sondas de ADN se etiquetaron de manera radioactiva mediante la puesta de la carga iniciadora aleatoria [Feinberg y Vogelstein ( 1 984) Anal. Biochem . 1 37: 266] mediante el uso del equipo Prime-lt I I (Stratagene). Las hibridízaciones se llevaron a cabo en la solución de hibridización ExpressHyb (Clontech) de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Los filtros se expusieron a la película autoradiográfica durante la noche o durante 3 días.

Selección de la biblioteca de cADN Las bibliotecas de cADN de fago se colocaron en placas y se seleccionaron con sondas radioetiquetadas (captura de exón o productos de selección de cADN ampl ificados por PCR a pa rtir de plásmidos que contienen estas secuencias) mediante métodos estándares (Sambrook eí al (1 989) supra).

Amplificación rápida de extremos de cADN (RA CE) Las bibliotecas de RACE se construyeron mediante el uso de pol¡A+ ARN y el eq u ipo de am plificación de cADN Marathón (Clontech) . Los conjuntos de carga iniciadora de RACE jerarquizados se diseñaron para cada cADN o frag mento genético potencial (exón capturadOj exón predicho, fragmento conservado , etc.) . Las bibliotecas de RACE se examinaron por PCR mediante el uso de un par de carga iniciadora para cada fragmento genético potencial ; las dos bibliotecas fuertemente positivas se elig ieron para experimentos de RACE.

Ordenamiento en Secuencia Genómica El ADN de las clonas cósm idas , PAC y BAC se preparó mediante ei uso de eq uipos de preparación de ADN Qiagen y se purificó adem ás mediante la gradiente de CsCI . El ADN se sonificó y los frag mentos de ADN se repa ra ron mediante el uso de n ucleasa BAL-31 y polimerasa de ADN T4. Los frag mentos de ADN de 0.8-2.2 kb se fraccionaron por tam año medíante electroforesis de gel de agarosa y se ligaron en el vector pUC9. Los insertos de las clonas plásmidas se amplificaron por PCR y se ordenaron en secuencia mediante el uso de química estándar de tintura ABI-carga iniciadora. Los datos de archivo de muestra ABI se reanalizaron mediante el uso de Phred (Phil Green, University of Washington) respecto a la llamada de base y el análisis de calidad. El ensamble de secuencia de los datos de secuencia reanalizados se llevó a cabo mediante el uso de Phrap (Phil Green , University of Washington) . Los espacios físicos entre los contiguos ensamblados y los contiguos no unidos pero sobrepuestos se identificaron mediante la inspección de ios datos ensamblados mediante el uso de GFP (obtenido por Baylor College of Medicine) y Consed (Phil Green, University of Washington). El material para la generación de datos de secuencia a través de espacios se obtuvo mediante amplificación por PCR. Las regiones de cobertura baja se volvieron a ordenar en secuencia mediante el uso de químicas de tintura-carga iniciadora y tintura-terminador (ABI). La edición perfecta de la base final (hasta > 99% de exactitud) se llevó a cabo mediante el uso de Consed.

Análisis de polimorfismo conformacional de un solo filamento (SSCP) Las cargas iniciadoras de PCR que identifican a cada exón de los genes de ASTH 1 I y ASTH 1 J , o más de un par de carga iniciadora para exones grandes, se diseñaron a partir de la secuencia genómica generada mediante el uso del Primer (públicamente disponible en Whitehead I nstitute for Biomedical Research) u Oligo 4.0 (obtenido por National Biosciences) . El SSCP radioactivo se llevó a cabo mediante el método de Orita et al. (1989, Proc. Nati. Acad. Sci. 86: 2766). En resumen, los productos de PCR etiquetados de manera radioactiva entre 1 50 y 300 bp y exones de extendimiento de los genes de ASTH 1 I y ASTH 1 J, se generaron a partir de un conjunto de pacientes con asma y ADNs templados genómicos de control , mediante la incorporación de a-32P dCTP en el PCR. Las reacciones de PCR (20 µl) incluyeron regulador de reacción 1 x, 1 00 µM de dNTPs, 1 µM de cada carga iniciadora de avance e inverso y 1 unidad de polimerasa de ADN de Taq (Perkin-Elmer) y 1 µCi de a-32P dCTP. Una breve desnaturalización a 94°C fue seguida por 30-32 ciclos de 94°C durante 30 seg, 30 seg a la temperatura de reasociación, y 72°C durante 30 seg, seguidos por 5 minutos a 72°C. Los productos de PCR radioetiquetados se diluyeron en 1 : 20 en agua, se mezclaron con un volumen igual de tintura de carga desnaturalizante (95% de formamida, 0.25% de azul de bromofenol) y se desnaturalizaron durante 10 minutos a 80°C inmediatamente antes de la electroforesis. 0.5x de geles de MDE (FMC) con y sin 8% de glicerol en 1 x de TBE se pasaron a 8-12 Watts durante 1 6-20 horas a temperatura am biente. Los geles secos se expusieron a una película autoradiográfica (Kodak XAR) durante 1 -2 días a -80°C. Los productos de PCR provenientes de individuos que portan variantes de SSCP se subclonaron en el PCR2. 1 o vector plásmido pZeroBlunt (Invitrogen) . Los insertos de las clonas plásmidas se amplificaron por PCR y ordenaron en secuencia mediante el uso de química estándar de tintura ABI-carga iniciadora para determinar la naturaleza de la variante de secuencia responsable de los cambios conformac?onales detectados por SSCP. El SSCP fluorescente se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de ABI recomendado (ABI User Bulletin titulado 'Multi Color Fluorescent SSCP'). Las cargas iniciadoras de PCR no etiquetadas se utilizaron para amplificar los segmentos de ADN genómicos que contienen diferentes exones de los genes de ASTH 1 I y ASTH 1 J , en el paciente o ADN de control. Las cargas iniciadoras jerarquizadas, etiquetadas de manera fluorescente (TET, FAM o HEX) se utilizaron entonces para amplificar los productos más pequeños, de 1 50 a 300 bp que contienen el exón o región de interés. La amplificación se hizo mediante el uso de un protocolo de PCR de 'toque', en el cual la temperatura de reasociación disminuyó desde 57°C hasta 42°C y polimerasa de Amplitaq Gold (Perkin Elmer, Cetus). En muchos de los casos, las cargas iniciadoras etiquetadas de manera fluorescente fueron idénticas en secuencia a aquellos utilizados para el SSCP radioactivo convencional. Los productos de PCR fluorescentes se diluyeron y mezclaron con agentes desnaturalizantes, tintura estándar de tamaño GeneScan (Genescan 500 etiquetado con Tam ra) y de dextrano Azul. Las muestras se calentaron a 90°C y se enfriaron rápidamente en hielo antes de cargarse en 6.5% de geles de poliacrilamida estándares o de 0.5X MDE (fabricante) que contienen 2.5% de glícerol y pasan mediante el uso de instrumentos ABI 377 modificados, de temperatura externamente controlada. Los geles pasaron a 1 240V y 20°C durante 7-9 hrs y se analizaron mediante el uso de software GeneScan (ABI) .

Ordenamiento en secuencia comparativo (detección de heterozigotas) Las cargas iniciadoras de PCR no etiquetadas se utilizaron para amplificar los segmentos de ADN genómicos que contienen diferentes exones de los genes de ASTH 1 I y ASTH 1 J , de ADNs de paciente o de control. Un conjunto de cargas iniciadoras de PCR jerarquizadas se utilizó entonces para reamplificar el fragmento. Las cargas iniciadoras no incorporadas se retiraron del producto de PCR mediante columna Centricon-1 00 (Amicon) , o mediante columna Centricon-30 para los productos menores a 130 bp. Las cargas iniciadoras jerarquizadas y la química de ordenamiento en secuencia del terminador de tintura (equipo de rápida reacción de ordenamiento en secuencia del ciclo terminador de tintura ABI PRI SM) se utilizaron entonces para ordenar por secuencia el ciclo del exón y la región ¡dentificadora. Los volúmenes se disminuyeron hasta 5 µl y se agregó 10% de DMSO para incrementar la uniformidad de la altura pico. Las secuencias se compararon entre las muestras y posiciones heterozigosas detectadas mediante inspección visual de los cromatogramas y mediante el uso de un Sequence Navigator (obtenido por ABI). Para algunos exones, los productos de PCR también se compararon mediante subclonación y ordenamiento en secuencia y la comparación de secuencias para diez o más clonas .

RESULTADOS . Exploración del genoma y análisis del enlace Una exploración de genoma se llevó a cabo mediante el uso de marcadores de microsatélite polimórficos a través de todo el genoma humano y el ADN se aisló de las muestras sanguíneas tomadas de los habitantes de Tristan da Cunha. El análisis de enlace, un método estadístico establecido utilizado para representar las ubicaciones de genes y marcadores con relación a otros marcadores, se aplicó para verificar los órdenes del marcador y las distancias relativas entre los marcadores en todos los cromosomas humanos, en la población de Tristan da Cunha . El análisis de enlace puede detectar la cosegregación de un marcador con enfermedad y se utilizó como un medio para detectar genes que tienen influencia en el desarrollo de asma en esta población. El enlace más altamente sig nificativo en la exploración del genoma (p = 0.0001 para la historia del asma y p = 0.0009 para la señal de identificación de metacolina) se obtuvo en D1 1 S907, un marcador en el brazo corto del cromosoma 1 1 . Este resultado de enlace significativo indicó que una predisposición de influencia genética al asma en la población de Tristan da Cunha se localizó cerca de D 1 1 S907. La duplicación de este hallazgo se obtuvo en una recolección de familias de asma de Toronto, en las cuales se examinó el enlace de D 1 1 S907 y varios marcadores cercanos. El enlace significativo observado (p = 0.001 para la historia del asma y p = 0.05 para la señal de identificación de metacolina) dio soporte a la representación de un gen de asma cercano a D 1 1 S907 e indicó q ue el gen era probablemente relevante en el grupo de Toronto más diverso exógamo, así como también en la población endógama de Tristan da Cunha. La ubicación genética aproximada del gen de ASTH 1 en la población de Tristan da Cunha se confirmó mediante la genotipificación y el análisis de datos de diversos marcadores cercanos a D1 1 S907, separados a intervalos no mayores de 5 cM a través de una posible región enlazada de aproximadamente 30 cM. Los análisis de par-Sib y de enlace de miembros en el árbol genealógico afectado, de estos marcadores, produjeron evidencia confirmatoria para el enlace y refinaron el intervalo genético.

Representación Física en una construcción contigua de ASTH1: YAC Las clonas del cromosoma artificial de la levadura (YAC) se derivaron de la biblioteca megaYAC de CEPH (Cohén et al. 1 993 Nature 366: 698) . Las direcciones de YAC individuales se obtuvieron a partir de un mapa físico público de STS de megaYAC de CEPH (sitio objetivo de secuencia; Olson ef al. (1989) Science 245: 1434) representando datos mantenidos por el Whítehead I nstitute y accesibles a través de la página web a nivel mundial (Cohén eí al. 1993 supra; http://www-genome.wi. mit.edu/cgi-bin/contig/phys_map) .

Las clonas de YAC que se enciman o sobreponen a otros YACs que contienen D 1 1 S907 se eligieron para la construcción del mapa ; la representación de STSs para estos YACs se utilizó para la verificación del mapa y las clonas. Algunos YACs anotados en la base de datos pública como quiméricos se excluyeron de los análisis. Múltiples colonias de cada YAC, obtenidas a partir de una placa recientemente estriada, inoculada a partir de la masterplaca de biblioteca de megaYAC de CEPH , se anotaron mediante el uso de marcadores de STS de la región de ASTH 1 . Estos marcadores incluyeron repeticiones de microsatélite polimórficas, expresaron identificadores de secuencia (ESTs) y STSs. La comparación de los datos de representación de STS para cada clona con el mapa público permitió la elección de la clona individual que retenía el mayor número de STSs de la región de ASTH 1 y fue, por consiguiente, menos probable de omitirse. Las direcciones de YAC para las cuales las clonas difirieron en contenido de STS se interpretaron como propensas a la omisión; aquellas para las cuales un subconjunto de clonas no contuvo ninguna región de ASTH 1 , los STSs se presumieron contaminados con células de levadura que contienen un YAC de otra región del genoma. El quimerismo de las clonas elegidas se determinó mediante hibridización in situ de fluorescencia de metafase (FISH) Sus dimensiones se determinaron mediante electroforesis de gel de cam po impulsado (PFGE) , manchado Southern e hibridización con una sonda de vector YAC. Los análisis de PFGE también mostraron que ninguna clona de YAC elegida contenía más de un cromosoma artificial de levadura . Se generó un mapa de STS en base a la suposición del número inferior de omisiones en las clonas de YAC. El orden del marcador de STS estuvo de acuerdo con el del mapa de Whitehead. Sin embargo, el patrón de retención de STS de YACs individuales fue ligeramente diferente al de los datos publicados. En general, las clonas elegidas fueron positivas para un mayor número de marcadores de la región de ASTH 1 , demostrando que era probable que los datos establecidos tuvieran menos negativos falsos que el mapa público. Las clonas de YAC no quiméricas que se encontraban en la región de mayor interés se eligieron para utilizarse como sondas de hibridización para la identificación de BAC, PAC, P 1 o clonas cósmidas menores de la región.

Conversión a un mapa de clonas en base a plásmidos El mapa YAC en ASTH1 proporcionó una cobertura continua de una región de 4 Mb, el 1 Mb central de la cual fue el de mayor interés. Se eligieron las clonas de YAC que comprenden una trayectoria de alicatado mínima y los cromosomas artificiales purificados por tamaño se utilizaron como sondas de hibridización para identificar las clonas cósmidas y de BAC. Los filtros en rejilla de una biblioteca de BAC genómica humano 3x y de una biblioteca cósm?da específica de cromosoma 1 1 humano, se hibridizaron con YAC purificado radioetiquetado. Las clonas correspondientes a los coordinados de la rejilla de los positivos se estrían para la pureza de la colonia, y los filtros se colocaron en rejillas con cuatro clonas de cada BAC o cósmido. Estos filtros secundarios se hibridizaron con ADNs de YAC purificados por tamaño. Una proporción de ambos BACs y cósmidos se encontró no clona! por estos análisis. Se eligió una clona de hibridización positiva de cada uno para su análisis posterior. Las clonas de BAC y cósmidas se representaron por STS para establecer las sobreposiciones entre las clonas. Los BACs se localizaron además por DIRVISH . Los BACs que no contenían un marcador de STS se representaron de manera por pares mediante DIRVISH simultáneo de doble color con otro BAC. El mapa producido tuvo tres espacios que se llenaron subsecuentemente mediante clonación terminal e hibridización de las clonas terminales hacia una biblioteca de pAC genómico humano. El refinamiento genético de la región de ASTH1 ocurrió de manera concurrente con la representación, volviendo innecesario el extender la región contigua de BAC. Los datos de la representación se registraron en ACeDB (Eeckman y Durbin (1 995) Methods Cell Biol. 48: 583).

Ordenamiento en secuencia genómica y predicción genética Se eligió una trayectoria de alicatado m ínimo de BAC y clonas cósmidas para el ordenamiento en secuencia genómica Se generó más de 1 Mb de secuencia genómica en AS TH1. En promedio , el ordenamiento en secuencia se hizo para una cobertura de 12x (12 veces de redundancia en las secuencias) . El orden del marcador se verificó en relación al mapa de STS. Las búsquedas de BLAST (Altschul eí al. ( 1 990) supra) se llevaron a cabo para identificar las secuencias en bases de datos públicas que se relacionaron con aquellas en la región de ASTH1. La predicción genética en base a secuencias se hizo con los programas GRAI L [Roberts (1 991 ) Science 254: 805] y Geneparser [Snyder y Stormo (1993) Nucleic Acids Res. 21 : 607] . La secuencia genómica y los datos de la configuración se almacenaron en ACeBD.

Desarrollo de nuevos marcadores de microsatélite para el refinamiento genético de la región de AS TH1 Los marcadores polimórficos informativos adicionales fueron importantes en el refinamiento genético de la región de ASTH1. Se llevó a cabo la clonación por 'saturación' de cada microsatélite en 1 Mb de la región circundante a D 1 1 S907. Las bibliotecas plásmidas se construyeron a partir de ADN purificado por PFGE de cada YAC, se preseleccionaron con una carga iniciadora de cada marcador de microsatélite conocido, después se seleccionaron con (CA) 15 radioetiq uetado o un grupo de oligonucleótidos de repetición trinucleótida o tetranucleótida. Los insertos de plásmido se ordenaron en secuencia, el conjunto de secuencias se comparó con las de los marcadores de microsatélite conocidos en la región , mediante el uso de un ensamblador de Energ ía (ABl ) o Secuenciador (AIsbyte) . Se designaron los pares de carga iniciadora que identifican cada repetición de microsatélite novedosa y la heterozígosidad de cada nuevo marcador se examinó mediante Análisis Discontinuo de Genotipos (BAGs; LeDuc ef al. , 1 995, PCR Methods and Applications 4: 331 ) Los microsatélites adicionales se encontraron por análisis de la secuencia genómica en AceDB. La Tabla 1 enlista todos los marcadores de microsatélite utilizados en la genotipificación en la región de ASTH 1 y su tipo de repetición, origen y cargas iniciadoras . La Tabla 1 B enlista algunas de las secuencias de repetición. TABLA 1 Marcadores de microsatélite polimórficos en la región de ASTH 1 SEQ ID MARCADOR PRIMER 1 160. 110O5GT1 CTGCTGTGGACGAATAGG 161. TCAATATAATCTTGCTTAACTTGG 162. 139C7GT1 GACCTGTTTGGGTTGAT TCAG 163. GTTTCTTACAGTGTCTTGCTATCACATCACC 164. 1 1L24AT1 GAGGACTGGCAGTACCAAGTAAAC 165. GTTTCTTTGGTTCATTCTAAGATGGCTGG 166. 2S3E6GT1 GCTGAGGCAGGAGAAAAGACAAG 167. GTTTCTTCATGCAAAGGTCAGGAGGTAGG 168. 253E6TE1 GTTGCTTCCAGACGAGGTACATG 16S. GTTTCtTCAATGGCTCCACAAACATCTCTG 170. 253E6TR1 AGGTTTAGGGGACAGGGTTTGG 171. GTTTCTTTCCTGGCTAACACGGTGAAATC 172. 65P14 GTTTCTTATTGCCTCCTCCCAAAATTC 173. AGAGGCCACTGGAAGACGAA 174. 65P14GT1 AACTGGAGTCAGGCAAAACGTG 175. GTTTCTTTGGCTGGTAAGGAAAGAAACCAC 176. 65P14TE1 GGCTAGGTTCATAAACTCTGTGCTG 177. GTTTCTTGATTGTTTGAGATCCTTGACCCAG 178. 65P14TE2 GCCGAAATCACAACACTGCATC 179. GTttcTTGATTCTGctcTTActcTTGCccc 180. S5P14T-R1 GTAATAGAACCAAAGGGCTGAGAC 181. GTTTCTTCGG-A3TCAGACCTTACATTGT GAG 182. 774F AXCTCCCTGCTACCCACCTT 183. GTTTCTrGTTtTCAGTG-AGTTTCrGTTGGG 184. 774J GTGTGCCAAACAACATTTGC 185. GXTTC?TCAAGCCATCAAGCTAGAGTGG 18B- 774L GGGCTTT AAACCCTTATTTAACC 187. GTTTCTTAGGTGATCTCAGAGCCACTCA ?aa. 774N AGGGCAGGTGGGAACTTACT 189. GTTTCTTTGGAGTCAGTTGAGCTTTCTACC ISO. 774Q TGAACTTGCCTACCTCCCAG 191. GTTTCTTAGCATATATCCTTACACAAGCACA 192. 774T CATGGTGCCAAAGGCAAGTT 193. - GT TCTTTTQAGGCGGAATGAGCTGTG 194- 86J5A.T2 ACAGGTGGGAAGACTGAATGTC 195. GTTTCTTGCAGTACACATCACATGACCrTs 196. 8SJSCA1 GAAATAGGCGGAAAC GG TC 197. GTXTCTTCGTTGTGGTTGT CñGAAAGG 198. 86J5GT1 GGTCAAGTGTTCAGAACGC-ArC 199. GTTTCTTGCAGGGATTATGCTAGGTCTGTAG 200. 8SJ5GT2 AGCACTTCTGAGGAAGGGACAC 201. GTTrcTTAGGsCñGGCAGACATACAAAC 202. 8SJ5TE1 GCCAATGTGTTCCTAGAGCGAC 203. GTTTCTTTXAAAGGGGGTAGGGTGTCACC 204. 8E.PE TA1 GGAAGGGAAAAGGACAAGGTTTTG 205. GT TC TAGCAAGAGCACTGGTGTAGGAGTC 206. 8EPQ4D05 GCTTTTCAAGCACTTGTCTC 207. TGGGATTGTGACTTACCATG 208. 8016GT1 ACTTGGGGXCTTATAGAAAGGTG 209. ÓTTTCITAGCTGTGTTTGCTGCATC 210. 8016GT2 AGATGTGTGATOAGATGCAG 211. GTTTCTTC-AAATAGTGC-AACAAACCC 215. AFM198YB1¡ TGTOiTTCTGiAAAGTGC TCC 213 . GXTXCTTCTGTAACXAACGAXCTGXA6TGGXG 214. AFM205YG5 <G} TATCAAGGTAATATAGTAGCCACGG ¿15. AGGTCTTTCATGCSGAGTSG 316. AFM206XB2 ÍG) ATTGCCAAAACTTGGAAGC 217. AGGTGACATATCAAGACCCTG 218. AFM283 H9 (G) TTGTCAACGAAGCCCAC 219. GTTTGGTGCAAGATTGTGTGTATGGATG 220. A M324YH5 (G) GCTCXCTATGTGTTTGGGXG 221. AAGAGTACGCTAGTGGATGG 222. AFMA154 ZDKG) XCCATTAGACCCAGAAAGG 223. GT TCTTCACCAGGCTGAGATGTTACG 224 . ASMI 14 AATCGTTCCTTATCAGGTAATGTGG 225. G?TTCTTCAAAGAAAGCAATTCCATCATAACA 225. ASMI14T GCATGTGTTGAAGCAAGCGG 327. CTTTGTTCCT GGCTGATGG 228. CA11_11 AATAGTACCAGACACACGXG 229 . CÑATGGTTCACAGCCCTTTT 230. CA39_2 AGCCTGGGAGACAGAGTGAG 231 . GTTTCTTGCACTTTTTGGGGAAGGTG -232. CDS 3 (1-4 GTTCCXCCCTTCCCTC CC 233. GXGXCIXXCAGGGACTGGAXTGTAG 234 . D11S130KU) GXGTXCXTXATGXGXAGTXC 235. GXXXCXXGGCAACAGAGTGAGACXCA 23ff . D1XS175KG} GTGACATCCAGXGXTGGGAG 237. GXTTCXTCCIAAGCAAGCAAGCAATCA 238. _ D11S177S (G} AAAGGCAATTGGTGGACA 239. GTXTCTTTTCAATCCRTGAXGCAAAGT 240. D11S1900 (U) GGXGACAGAGCAAGATTTCG 241. GTrrcrTGTAGAGTTGAGGGAGCAGC 242 . D11S2008/D11S. 392 CAXCCATCXCATCCCATCAT ÍC) 243. GTTX XTTTCACCCTACTGCC-AACTTC 244. D11S2014 .C) CCGCCATXTXAGAGAGCATA 245. GTXXCTTTTCTGGGAC-AATTGGTAGGA 246. D11S4200{G) TTTGTGTTATTATTTCAGGTGC 247. G TTC TsT TTrott cA GITXAGGAAC 248. D11S907(G) C-AXACCCAAATCGXTCXCXXCCTC 249. GTTTCTTGGAAAA-3CAAAG GCAXCGTAGAG 250. D11S935 (G) XACTAACCAAAA.GAGXTGGGG 251. CTAXCAXXCAGAAAAXGXXGGC 252. GATA-P184S2 GrAXGG ñ-5TW3AGGGCAXG 253. AAGGXTACAXTTCAAG?AATAAAGT 254. GATA-P6915{ CTGTTCAGGCCXCAATAXATACC 255. AAGAGGATAGGTGGGGXTTG 256. L19CA3 CCICCCACCTAGACACAAT 257. ATATGATCITTGCAT CCTG 258. - 19PEHTA1 AAGAAAGACCTGGAAGGAAT 259. AAACAGCAAAACCXCAXCTC 250. 19TETRA5 CCACCACTTATTACCTGCAT 261. TGAATGAATGAATGAACGAA 262. L P2 AACTGTGAXXGTGCCACTGCACTC 263. GXTTCTTCACCGCCTTTATCCCTCAAATG 264. LMP3 GATGGGTGGAG--GCAGTTAAAG 265. GTC-ñAGOUlCTrGTCCAAC-GCTAC 2S6. MP4 CAGGCTATCAGTTTCCTTTGGAG 267. GGCAGGTAATACTGGAGAATTAGG 268. M 7 GACGGATCTCAGAGCCACTC 2S9- - GTTTCTTAAAAGATAAGGGCTTTTAAACC 270. T18_5 AGTTTCACAGCTTGTTATGG 271. GGTTGAT--AAsTGAGACTTT 272. T29_9 ATGGTGGATGCATCCTGTG 273. GTTTCTTGTATTGACTCCTCCTCTGC 274. 774L CAGTAAACAT 275. TGTTGAGTGG 276. 774-í TCTCCTCAATGTGCATGT 277. ATTCTACATA 278. ASMI14 GTGTTTGCAT 279. , ACAAGTTGGC 280. CA11_11 TAGTACCAGA 281. TACATCCAAGAAAA La fuente del marcador fue Seguana Therapeutics, Inc a menos gue se indigue una letra entre paréntesis después del nombre, donde G = Genethon; L = Nothen y Dewald (1995) Clin. Genet 47: 165; U = el centro de genomas de Utah, ver: The Utah Marker Development Group (1995) Am. J. Hum. Genet. 57: 619; c = el Human Lineage Center cooperativo. TABLA 1B SEQ ID MARCADOR PRIMER 1 282. CA39 _2 GAGACTCTG A ( CA ) nAATATATATA 283. 774F TGTTGATCGC (CA) nAACCAAAATC 284. 774 J AATGCATGT (TG) 2TATA (TG) nGTGTGGTATG (TG) 3TACATATG CG 285. 774? CCTCCCAGAA(CA)n ATCATGATAA 286. L19PÉNT AGACAGTCTCAAAAAAT (ATTTT) pAAAGAAAAAGCTGGATAAAT Al 287. 65P14TE AACTAGCTTTAAGAAAATAAGAAGAAAAAGAAAGAAG (AAAG) 2TAA 1 G (AAAG) nAGAAAGAAAAG (AAAG) riAAAAG (AAAG) nAGGAATGAT TGAC 288. 65P14 CGCGCACATA ( CA) nCCCTTTCTCT 289. 774L CAGTAAACAT(CA)n TGTTGAGTGG 230. 774N TCTCCTCAATGTGCATGT (GTGC) 2 ATGA (GTGC) 2 (AC)n ATTCTACATA 291. ASMI14 GTGTTTGCAT (GT)n T (GT) 3 ACAAGTTGGC 2S2. CA11_11 TAGTACCAGA (CA)2 CG(TG)2 (CA) 2 GGCAAGCG (CA)n C (CA)3 T CATCCAAGAAAA Refinamiento genético de la región de ASTH1 Los marcadores de microsatélite aislados de YACs de la región de ASTH 1 se genotipificaron en ambos grupos de Tristan da Cunha y Toronto. El refinamiento genético de la región de ASTH1 se llevó a cabo mediante la aplicación de la prueba de transmisíón/deseguilibrio (TDT; Spielman eí al. (1993) Am . J. Hum:Genet. 52: 506) a los datos genéticos provenientes de las poblaciones de Tristan y Toronto, en los marcadores a través de toda la región de ASTH 1 . La estadística de TDT refleja el nivel de asociación entre un alelo de marcador y el estado de la enfermedad. Una versión de múltiples puntos de la prueba de TDT controla la variabilidad en los heterozigocitos entre las posiciones y da como resultado una curva de TDT regional más suave gue la gráfica de los datos de TDT de una sola posición. El significado de un valor de TDT se determina por medio de la prueba de ?2; un valor de ?2 de 3.84 o mayor se considera estadísticamente significativo a un nivel de probabilidad de 0.05. La figura 1 muestra gráficas de valores de ?2 para los marcadores clave de la región de ASTH 1 para la historia de asma con señal de identificación de metacolina positiva, para las familias de elemento trivalente de Toronto. ?2 se gráfica contra la ubicación genómica del marcador en el mapa físico. El pico de TDT de Toronto se localiza en el marcador D1 1 S2008 (?2= 1 1 .6, p<.0001 ). El alelo de marcador en desequilibrio es casi raro (frec = 6%), representando el cuarto alelo más común en este marcador. El riesgo relativo de afección contra normal para este alelo es de 5.25. Este también es el marcador pico para el enlace y desequilibrio de enlace en Tristan da Cunha, indicando que el gen de ASTH 1 es muy cercano a este marcador. Los marcadores que definieron los límites de desequilibrio de enlace fueron D 1 1 S907 y 65P 14TE 1 . El tamaño físico de la región refinada es de aproximadamente 1 00 kb. La prueba de TDT significativa refleja la tendencia de los alelos de marcadores localizados cerca de una posición de enfermedad (también se dice que se encuentran en "desequilibrio de enlace" con la enfermedad) a segregarse con la posición de la enfermedad, mientras que los alelos de los marcadores localizados más allá de la posición de la enfermedad se segregan de manera independiente al estado de la afección. Una expectación que se deriva de ésto es que una población para la cual se introdujo recientemente un gen de enfermedad (es decir, un polimorfismo de predisposición a la enfermedad) debiera mostrar un TDT estadísticamente significativo sobre una región mayor circundante al gen que una población en la cual el gen mutante se ha segregado por una longitud de tiempo mayor. En el último caso, el tiempo habría permitido una mayor oportunidad de que los marcadores en la inmediación del gen de la enfermedad se recombinen con ésta. Esta expectación se cumple en nuestras poblaciones. La población de Tristan da Cunha, fundada solamente hace 1 0 generaciones, muestra una curva de TDT más amplia que el conjunto de familias de Toronto, las cuales son una mezcla europea en derivación y por lo tanto representan una población menos recientemente establecida, más antigua y más diversa.

Aislamiento y caracterización genética La trayectoria de alicatado de clonas de BACs, cósmidas y de PAC se sujetó a captura de exón y selección de cADN para aislar secuencias derivadas de los genes de la región de ASTH1. Las clonas de captura de exón se aislaron sobre la base de tamaño y habilidad para trans-hibridizarse. Se ordenaron en secuencia aproximadamente 300 clonas putativamente no idénticas. La selección de ADN se llevó a cabo con ARN de pulmón fetal y adulto medíante el uso de grupos de clonas de trayectoria de alicatado. Las clonas de selección de cADN se ordenaron en secuencia y las secuencias se ensamblaron con aquellas de las clonas de captura de exón. Las clonas representativas de captura de exón que se extienden cada ensamble se seleccionaron e instalaron como "masterplacas" (discos de microtítulo de 96 perforaciones) de clonas. Las clonas de masterplaca de captura de exón y las clonas de selección de cADN se sujetaron a estudios de expresión. Las manchas Northern de múltiple tejido humano se sondearon con productos de PCR de clonas de masterplaca. En algunos casos, las clonas de captura de exón no detectaron especies de ARN, ya sea debido a que no representaron secuencias expresadas o los genes se representaron con patrones muy estrictos de expresión, o debido a un tamaño pequeño de la sonda de exón.

Las clonas de masterplaca que detectan especies discretas de ARN en manchados Northern se utilizaron para seleccionar bibliotecas de cADN en base a lambda fagos, elegidas sobre la base del patrón de expresión de la clona. Las secuencias de los cADNs se determinaron mediante el ordenamiento en secuencia terminal y el recorrido de la secuencia. Los cADNs también se aislaron o extendieron mediante amplificación rápida 5' y 3' de los extremos de cADN (RACE). En muchos casos, el 5'RACE fue necesario para obtener el extremo 5' del cADN. Se detectaron ASTH1I y ASTH1J mediante captura de exón. Los exones de ASTH1I detectaron un mARN de 2.8 kb expresado a niveles elevados en la tráquea y la próstata y en niveles inferiores en el pulmón e hígado. Los exones de ASTH1I se utilizaron como sondas para seleccionar las bibliotecas de cADN de la próstata, pulmón y testículos; se obtuvieron clonas positivas de cada una de estas bibliotecas. El aislamiento de la clona de cADN de ASTH1I de los testículos demostró que este gen se expresa en este tejido y posiblemente otros a un nivel no detectable por análisis sanguíneo Northern. Los exones de ASTH1J detectaron un mARN de 6.0 kb expresado en niveles elevados en la tráquea, próstata y páncreas y a niveles inferiores en el colon, intestino delgado, pulmón y estómago. Las bibliotecas del páncreas y la próstata se seleccionaron con clonas de exón de ASTH1J. Las secuencias terminales de la clona de cADN se ensamblaron mediante el uso de un Sequencher (AIsbyte) con las secuencias de las clonas capturadas por exón, produciendo contiguos de secuencia utilizados para designar el recorrido de la secuencia y cargas iniciadoras de RACE. Las secuencias adicionales producidas mediante estos métodos se ensamblaron con las secuencias originales para producir contiguos más largos de secuencias de cADN . Fue evidente a partir de los ensamblajes de secuencia que ambos ASTH 1 I y ASTH 1 J se separan de manera alternativa y/o tienen sitios de inicio de transcripción alternativos en sus extremos 5', ya que no todas las clonas de cualquier gen contuvieron la misma secuencia 5'. El ASTH 1 J tiene tres formas de separación que consisten en la forma altl , encontrada en las clonas de cADN de próstata y pulmón y en las cuales los exones (¡lustrados en la figura 1 ) se encuentran en el orden : 5' a, b, c, d, e, f, g, h, i , 3'. Una segunda forma, alt2, en la cual el orden del exón es: 5' a2, b, c, d, e, f, g, h , i, 3' observado en una clona de cADN de páncreas. Una tercer forma, a!t3, contiene un exón alterno, a3, entre los exones a2 y b. El codon de inicio se encuentra dentro del exón b, a fin de que la estructura de lectura abierta sea idéntica para las tres formas , lo cual difiere solamente en el UTR 5' . Los cADNs de ASTH 1 J mostrados como SEQ I D NO: 2 (forma altl ); SEQ I D NO: 3 (forma alt2); SEQ I D NO: 4 (forma alt3) son de 5427, 551 0 y 5667 bp de longitud, respectivamente. Se proporciona la secuencia de la región codificadora de toda la proteína y los UTRs 5' alternos. Los términos 3', donde se agrega la cola poliA, varían por 7 bp entre las clonas. Las secuencias proporcionadas son las más largas de estas variantes.

El producto de la proteína codificada se proporciona como SEQ ID NO: 5. El ASTH1I se observó en tres isoformas denotadas como altl, alt2 y alt3. A los exones de ASTH1I y ASTH1J se dieron designaciones de letras antes de que se conociera la direccionalidad del cADN, el orden en diferente para los dos genes. En la forma altl de ASTH1I, los exones se encuentran ene I siguiente orden; 5' i, f, e, d, c, b, a3'. En la forma alt2 de ASTH1I, un exón alternativo 5', j, substituye al exón i, con la siguiente instalación de exón: 5' j, f, e, d, c, b, a3'. La forma alt3 del gen tiene el orden de exón: 5' f, k, h, g, e, d, c, b, a3'. La separación alternativa y los codones de inicio en cada uno de los exones i, f y e dan las tres formas de términos amínodiferentes de proteína de ASTH1I. El codon de detención común se localiza en el exón a, el cual también contiene un UTR 3' de largo. Se presentan dos señales de poliadenilacíón en el UTR 3'; algunas clonas de cADN terminan con un tracto políA justo después de la primer señal de poliA y para otras el tracto de poliA se encuentra al final de la secuencia mostrada. Ya que las secuencias mostradas para las formas de altl, alt2 y alt3 de ASTH1I (2428 bp; 2280 bp y 2498 bp; respectivamente) se cierran al tamaño de transcripción de manchado Northern estimado de 2.8 kb, estas secuencias son de longitud esencialmente completa.

Acoplamientos de EST Las secuencias nucleótidas de las formas altl, alt2 y alt3 de ASTH 1 J y las formas altl , alt2 y alt3 de ASTH 1 I se utilizaron en las búsquedas de BLÁST contra dbEST con objeto de identificar las secuencias de EST que representan estos genes. Se tomaron acoplamientos perfectos o casi perfectos para representar la identidad de la secuencia en vez de la capacidad de relación. Los números de acceso T65960, T64537, AA055924 y AA055327 representan las secuencias de avance e inversas de las dos clonas que se extienden juntas los últimos 546 bp (excluyendo la cola poliA) del UTR 3' del ASTH 1 I . Ningún EST se extiende en ninguna parte de la región codificadora de este gen. Una clona de cADN de colon (número de acceso AA 149006) que se extiende 402 bp, incluyendo los últimos 21 bp de la región codificadora de ASTH 1 J y parte del UTR 3'.

Determinación de la estructura de intrón/exón La organización genómica de los genes en la región de ASTH 1 se determinó mediante la comparación por BLAST de las secuencias de cADN con la secuencia genómica de la región. La secuencia genómica de la región 5' de ASTH 1 y de ASTH 1 J de sobreposición, se proporciona en la SEQ I D NO 1 La estructura genómica de los genes de ASTH 1 I y ASTH 1 IJ se muestra en la figura 1 ; las secuencias de unión de intrón/exón se encuentran en la Tabla 2.

TABLA 2: Organización genómica de los genes de ASTH1I y ASTH1J.

*Las secuencias exónícas se encuentran en la casilla superior, las secuencias identificadoras en la casilla inferior. SEQ NO Exón Tamaño Secuencias en los extremos de un identificador ?xón (bp) de los exones de ASTH1I y ASTH1J* ASTH1I 293. >214 ggaggctgagCAGGGGTGCC... 294. .. -ACTCCCACAGgtacc gcag 295. >6G ...CTGCCCTCACgtaagcgcct 296. 125 gc g gcagGGTAATGTTG ... 297. ...CATCAGACAGgtgagtaca 298. 226 ggctggtgagGAGGGGCTGA... 299. .. -CGCTCTGTGGgtgag ca 300. 93 tg gaatagCCCAATTACA.. 301. ...AGGGTGCTGAgtgagtagta 302. 79 ttcttttcagGCCCTCGTGT... 303. ...TGCTGACCCGgtatggtggt 304. 232 t ggtgcagCCTGTGAC C ... 305. ...CGCACACAAGgtcagtgttc 306. 51 tctttcccagGTTACTCCTT... 307. ...ATCAAAGACTgtaagtaacc 308. 69 tctatttcagATGCTGATTC... 309. ...AGTAGAACAAgtaagtgcag 310. 196 ttttcaaaagGCCTCCAAAG 311. ...GAGCCCTGAGgtaagt at 312. 1522 gctttttcagATACTACTAT... 313. ...TARCATGTTCaactgtctgt 314. 146 tgt atatgaATTTATCTTC... 315. ...GGTAAATGAGgtaagtcctg 316. a2 229 tcctgttaagATCGCTCTCT... 317. ...CCTTGCCCAGgttctcttaa 318. a3 157 gcaatcgcacCTGCACACCC... 319. ...ACTGCCCATTtctggtaaag 20. 100 ccsctaacagATCATGATTC ... 321. ...ACGTGCAATGgfcaagagggc 322. 246 tgttttgcagTTTCCAGTGG... a23. ...AAGTGGAACGgtgactctct 324. 63 tccttCacagGCCAGTGC--G... 325. ... GAACAAACTGgtg agtagta 326. 69 ttttttgtagAGCCTTCCAT... 327. ...AGCACAGTAGgtaactaact 328. 69 atggccacagATTTGTTGGA ... 329. ...CTTCCTGTTsgtaagctgtc 330. 63 ttctccttagCAGAGTCACC... 331. . - . AAAAAGCACAgtaagttggc 332. 196 CtttcatcagACCCGAGAGG... 333. ...GAGCTATGAGgtgaggagtt 334. 4457 tttgttacagATATTACTAC... 335. - ..AGCCTGGAAAtgcgtgtttc Las proteínas de ASTH1I y ASTH1J deducidas La proteína codificada por ASTH 1 J (SEQ I D NO: 5) es de 300 amino ácidos de longitud. Una búsqueda de BLASTP de la secuencia de la proteína contra la base de datos pública de secuencias no redundantes (NCBI) reveló similitud con u n dominio de proteína de factores de transcripción de la familia de ets La familia de ets, nombrada para la oncoproteína E26 que originalmente definió este tipo de factor de transcripción, es un grupo de factores de transcripción que activan los genes involucrados en una variedad de procesos inmunológicos y otros, o implicados en el cáncer. Los miembros de la familia más similares a ASTH 1 I y ASTH 1 IJ son: ETS 1 , ESX, ETS2, ELF, ELK1 , TEL, NET, SAP-1 , NERF y FLI . El análisis de la estructura secundaria y la comparación de la secuencia de la proteína con la estructura de cristal del complejo humano de ETS 1 -ADN (Werner eí al. (1995) Cell 83: 761 ) confirmó que tenía una característica de motivo helicoidal de hélice de giro helicoidal ventilado de algunas proteínas de unión de ADN que son factores de transcripción. La alineación de múltiples secuencias de ASTH 1 I , ASTH 1 J y otras proteínas de dominio de ETS detectaron un segundo dominio de terminal N compartido por ASTH 1 I , ASTH 1 J y algunas, pero no todas, las proteínas de dominio ETS. La conservación de este motivo se ha observado (Tei eí al. (1 992) Proc. Nati . Acad. Sci. USA 89: 6856-6860) y su involucramiento en la auto-asociación de la proteína se ha documentado para TEL, una proteína de dominio ETS , tras su fusión con el receptor ß de factor de desarrollo derivado de plaquetas (Carrol eí al. (1 996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 14845-14850) . La alineación del dominio conservado en la terminal N en las proteínas de ETS se convirtió en un perfil de secuencia generalizado para explorar las bases de datos de la proteína mediante el uso del algoritmo de Sm?th-Waterman . Esta búsqueda reveló que el dominio de terminal N en ASTH Í I , ASTH 1 J y otras proteínas de dominio ETS, pertenece a la familia de dominio SAM (Schultz eí al. (1 997) Protein Science 6: 249-253) . Los dominios de SAM se encuentran en diversas proteínas de desarrollo donde se considera median las interacciones de proteína-proteína. De esta manera, se predice que ambos ASTH 1 I y ASTH 1 J contengan dos módulos conservados, el dominio de interacción de proteína de terminal N (dominio de SAM) y el dominio de unión a ADN de terminal C (dominio ETS). Los segmentos de secuencia entre estos dos dominios se predice que tiene una estructura alargada, no globular y puede articularse entre los dos dom inios funcionales en ASTH1 I y ASTH 1 J. Las formas altl (SEQ ID NO: 7), alt2 (SEQ I D NO: 9) y alt3 (SEQ I D NO: 1 1 ) de ASTH 1 I son de 265, 255 y 164 aminoácidos de longitud, respectivamente, y difieren en sus extremos 5'. Las proteínas de ASTH1 I y ASTH 1 J muestran similitud entre sí en los dominios de ets y entre el exón c de ASTH 1 J y el exón e de ASTH 1 I . Se encuentran más relacionados entre sí que con otras proteínas. Sobre el dominio de ets son 66% similares (es decir, tienen amino ácidos con propiedades similares en las mismas posiciones) y 46% idénticos entre sí. Las tres formas de ASTH 1 1 tienen el motivo de hélice de giro helicoidal localizado cerca del extremo de terminal carboxi de la proteína. Las formas alternas de la proteína de ASTH 1 I pueden diferir en función de maneras críticas. La actividad de los factores de transcripción de ets puede afectarse por la presencia de motivos estructurales de proteína de doblez independiente, que interactúan con el dominio de unión de proteína de ets (hélice de ciclo helicoidal) .

Los diferentes extremos 5' de las proteínas de ASTH 1 I pueden ayudar a modular la actividad de las proteínas en una manera de tejido específica.

Análisis del polimorfismo de ASTH1I y ASTH1J Los individuos afectados y no afectados del grupo de Toronto se utilizaron para determinar variantes de la secuencia, como lo fueron aproximadamente 25 controles derivados de poblaciones no seleccionadas por asma. Los individuos afectados y no afectados de la población de Tristan da Cunha también se eligieron; el conjunto por ensayarse también se seleccionó para representar los haplotipos principales de la región de ASTH 1 en esa población . Esto aseguró que todos los tipos de cromosomas para Tristan se incluyeran en el análisis. El análisis de polimorfismo se llevó a cabo mediante tres técnicas: secuencia comparativa (detección de heterozigoto), SSCP radioactivo y SSCP fluorescente. Los polimorfismos encontrados por SSCP se ordenaron por secuencia para determinar el cambio de secuencia exacto, involucrado. Las cargas iniciadoras de ordenamiento en secuencia y de PCR se designaron a partir de la secuencia genómica que identifica cada exón de la región codificadora y los UTRs 5' de ASTH 1 I y ASTH 1 J . para el SSCP fluorescente, las cargas iniciadoras de PCR de avance e inversos se etiquetaron con diferentes tinturas para permitir la visualización de ambos filamentos del producto de PCR.

En general, una variante observada en un filamento del producto ' también fue aparente en el otro filamento. Para el ordenamiento en secuencia comparativo, también se detectaron heterozigotas en las secuencias de ambos filamentos de ADN.

Los polimorfismos asociados con la posición de ASTH 1 I se enlistan en la Tabla 3. Se muestra la secuencia que identifica a cada variante. Los polimorfismos también se dedujeron de la comparación de secuencias de múltiples clonas de cADN independientes que se extienden la misma región de las transcripciones y la comparación con la secuencia de ADN genómica. Los polimorfismos en las regiones UTR 3' de largo de estos genes se encontraron mediante este método. Un polimorfismo en cada gen se asocia con un cambio aminoácido* en la secuencia de la proteína. Una diferencia de alanina/valina en el exón c de ASTH 1 J es un cambio de amíno ácido conservador. Una variante de serina/cisteína en el exón g de ASTH 1 I es un cambio no conservador, pero se encontraría solamente en la forma alt3 de la proteína. Los polimorfismos en las regiones transcritas de ASTH 1 I y J se genotipificaron en las regiones completas de Tristan da Cunha y Toronto, así como en una muestra mayor de controles seleccionados sin asma, mediante métodos de elevado rendimiento como OLA (ensayo de ligación oligonucleótida , Tobe et al, (1 996) Nucí . Acids Res. 24: 3728) o Taqman (Holland eí al. (1992) Clin . Chem . 38: 462) o mediante PCR y digestión de la enzima de restricción. Los datos de toda la población se utilizaron en un análisis estadístico para las diferencias significativas en las frecuencias de alelos de ASTH 1 I o ASTH 1 J entre asmáticos y no asmáticos.

TABLA 3: POLIMORFISMOS EN LOS GENES DE ASTH1I Y ASTH1J SEQ Región Transcrita de ASTH1I Secuencia de la Ubicación del Polimorfismo 16. EXON B (+.170 AC-AGAATGACRTATGAAAAGT 17. IHTRON D (+)ld GTAACCAAGCi?CAAGCCACCC 18. INTRON F (+)24 AAGGAGCCCAXCTGAGTGCAG 19. EXON G ( + )62 ser?-cys CGTTCCATCT=TGCTCTGTGC 20. EXON K (+)77 AGCGCCTCGG2TGGCTGAGGG 21. EXON A 3' ÜTR (t}1176 TGTATTCAAGXGCTATAACAC 23. EXON I (+)ß6 CCCACAGGCCEGTCCCTCCAA 24.. INTRON J <+)93 CGTCCATCTCXAGCTCCAGGG Región Transcrita de ASTH1J 25. EXON A 5' UTR (+)38 GACTTGATAAXGCCCGTGGTG 26. EXON A 5' UTR (+)39 ACTTGATAACECCCGTGGTGC 27. EXON A 5' UTR (+) 99 CTCCCCTCCASÍGAGCC-ACAGC 28. INTRON A (+) 224/225 ATTTCCTGCATT/^GTCTGGACTT 29. I TÍION A <+)48 ATCCAAACTS.CZTGAGTGGAAA 30. EXON A3 (+)28 AGTTTCCTCAETGCGGGAGCT 31. EXON C <+)l-58 GCGAGCACCT?TGCAGCATGA 32. EXON C (+)190 ala~»-val TTCACCCGGQ?sGCAGGGACG 33. BÍTRON D (-) 36/37 CTGGGGAAA ÍGA) /TGATCGCTGAC 34. INTRON F (-)22 GTCAATTAAA?GGCTCTCATT 35. INTRON G (-)27 TAGATCATTCRTAACCTGCCT 36. EXON I (3' UTR) (+}22 AAAGAGAAATííCTGGAGCGTG 37. EXON I (3' ÜTR) (+}220 ATGAGGGGAAMAAGAAACTAC 38. EXON 1 (3' OTR) (+)475 TTTTGTATGTEACATGATTTA 39. EXON I (3' UTR) (+)871 AGCTTGGTTC2TTTTTGCTCC 40. EXON I (3' ÜTR) (+)1084 TTGACACCAGSAACCCCCCAG 5' paraASTHU 41. CAAT box -165 AAATGAGCCAETGTTTGTAAT 42. 5PWlJ_P01+399 ATCCATTTTG?ATTCCTCATT 43. 5P 1J_P01+1604 CTGGAGCTCARACCAGACAGC 44. 5PW1-J_P02+1382 GCCAGTGCAGS.CATCATTACC 45. 5P 1JJP03+1 8 AGTTCAAATCETAATTTTTAT 46. 5PW1J_P03+55S ICATCAGAAT?TAAATCTCCC 47. 5PW1J_.P03.-712 GGAGATTCAG&/-TGAAGCAAGA 48. 5-? U_P03+7Bl TTTTTCCACAXCCAGCCTGGC 49. 5PW1J_P03+791 CCCAGCCTGG?GAACCCTGGC 50. 5PWlJ_P03+820 CTCTTCATCAXGGTCAAATAC 51- 5P 1J_P03+1530 CAACTTGCTG CAAAGTGCTG 52. 5PWU_P034l605 TACTATGTGC?AGATACTAAG 53. 5PW1--TJP04-.542/543 ATGCCACTTTEEACAACTTGAG 54. 5P lJ_P04+973 CGCATGCCTG£AAAGAAGAGA 55. ' SPW1J_P04+1079 GGATAAGCACMAGTGAGCCTG 56. SPW1J_P04+1153 AAAGCCAGAC^GCAACTTGTG 57. 5PW1J_P04+143Q TCTCAAAAAQRG GATAGGAG 58. SPWlJ_P05+334 TCTGAATCCTSTCTCCTCCTT 59. 5PWis_P05+749 TAGAACCAGGWTGTGGGACCA 60. 5P?ílJ_P05+915 TTCTTGTGTCRGGCGCAAAAC 61. 5PKlJ_P06+529 AACCAACATGBAGAAACCCCA 62. 5PW1J_F06+1290 AATAAACTATEGTTCACCTAG 63. 5PW1J_P06+1573 ACATATTTGTRTCTCATATGA 64. 5PW1JJP06+1661 CAAAGCAGTTXCTAATAATCC 65. SPW1JJP07+335 AGATCCTAACYGGGGCCTCCT 66. 5PH1J_P07+731 CTCTTTCTCTYTGCTTCCTCC 67. 5PW1J_P07+1024 TTAGGAATCCHCAAATATGTA 68. 5P 1J_P07+1610 GTCTGACTCCfiCCTCCCTCAT 69. 5PW1JJP08+398 GAATCACATCRTGAGAAATGT 70. 5PW13JP08+439 AATTCAATCCXTCACAGACTT 71. 5P U_P08+580 GTGTAGCCAG GTTGCTAATT 72. 5PWlJ_P08+762 CCTAGAAATAacCAAGGGCAC 73. 5P lJ_P0S+952 AAATTCTCATECCTCACCCTC 74. 5PW1J_P0S+1172 TCCCACCCCTRTCACCTTCAT 75- 5PW1J_P08+1393 CCTCATTCTCRGAAGCCAACA 76. 5PWlJ_P08-t-1 33 GA2SLGAGCCGT?CAGTCCCTTT 77. 5PW1J_P08+1670 TCCAtAGGCTyTTTATTTGGC 78. 5PW1J_P08+-1730 TCGTTTAGTA --CAGGCTTTG 79. 5PWU_P09+59 GCCTCAGTTGYCCCAGCTATA 80 5PW1J_P09+145 AGCAAAATGCgCTATGCACTG 81. 5PW1J P09+892 GTGTCCTGAC (TTGCACTCCAC) ? ACACTGCCTG 82. 5PWU__P10+1070 ATC&GATAACRCCTACACTTA 83. 5PWU_P10+lSll TCTCTCTTCT£CCTGCCCTGT 84. 5PW1J P09+1132 TGGACACAGGSAGGGGAATAT 85- 5PW1J_P09+16S8 TGTCACTTGCßCATACAAGGC 86. 5PW1J_P0--+1900 ATCATCAGAT?AGCCCAGAAT 87. 5P 1J W1R1-1060 TCAACAsAsAEAGTTAATGGT 88. 5PW1J W1R1-1831 AGCAATAATGXTTCCCTTTTC 89- 5PW1J W1R1-2355 TCTAGCTTTT?TGTGTTTTTT 90. 5PW1J W1R1-3160 GATTCCTTAAXGCTTGATACT 91. 5P 1J W1R1-3787 CCTCCTCCAG?ACCAAAGTGG 92. Wia_C-D+24 ATGGCCACAGETCAAATCCTG 93. WU_CA+564 ACTGAGTGTT?ATGCCAATTT 5' to ASTH1I 94. WI_CL+ GACAAGCCCTETCTGACACAC 95. WI_CN+13 TGAAAAGCCTiCTTGCTGCCT 96. WI_CQ-28 TCCTGGAGTT2CTTTGCTCCC 97. - WI_CQ+39 GATTCCAAATfíAACTAAAGAT 98. P14-16+191662 GACCTCAAGTCETCCACCCGCC 99. P14-16+192592 AACAAATACTMCCCCGCAACCC 100. P14 -16+192762 ATTTTTTTTTT./-AAGGAAAATA 101. P14-16+195066 AAATTTCCCCfcUUU-CAAGCAG 102. P14-16+196530 GAGAAAGGGTETGTGTGTGTG 103. P14-16+196617 GTGTGTGTGTGT - /fiXG ATGTGCGCGTG 104. P14-16+196902 ATCGGGAACCXCATACCCCAA 105. P14-16+198040 TTTGTTTCsCjfcJ&TGAGGTACG 106. P14-16+198240 TGAGGGTGTT=TGGGCTGGAC 107. P14-16+198840 TCTTCATTGG3C&TCTGAATGT 108. P14-16+200120 GCGAGCACCTXTGCAGCATGA 109. P14-16+200617 AACCCCCCCC- CACACACACA 110. J5-16+4454 TCAGTGCTCT=TAATCAGTCA 111. J5-16+4825 TCTTTGTGAAA-/ .= ATTAGTCTG* 112. J5-16+5426 GCTGCCCTGA=AGCTGGGCCA 113. J5-1É+5623 CCTTCTGATC TTGTTTGCTG 114. JS-16+7386 GGAACACTGAjSTCTTGATTAG 115. J5-16+7904 TAGGCTTCTC?TGATAATTGA 116. J5-16+8055 TCTTAAAATAM TGGCTTGTA 117. J5-16+10S95 TAGATCATTAETAACCTGCCT 118. J5-16+11140 ATGAGGGGAAMAAGAAACTAC 119. J5-16+12004 TTGACACCAG AACCCCCCAG 120. J5-16+12219 TGTTTTAAATETTAGGGACAA 1 1. J5-16+12303 GTAAGCATAG2AATGTAGCAG 122. J5-16+13504 GGCTCTTTCTJKCAACCTTTCC 123. J5-16+14120 GACCCAGGTTSTGAGTTTTCC 124- ASTH1?, exon B +169 GACAGAATGA?ATATGAAAAG 125. ASTHlI, exon r +S9 TGTGTGACAC3CGAGAAGCCCA 126 . ASTH J , exon C +56 AGTACTGGACMAAGTAC--AGG 127. 5 » ASTHl J , WI_Cg - 9 CCTGGGAGCAEGTATTGCATT ASTH1J In rop. A 128 . I-7_Ia0l +39 AGATTTGAGG_£CTCA.GGTCCC 129 . w?-r_ia?i +140 TGTCAATGTCRCATGATAAGC 130 . w?a__iao +678 TTGCCCCAGTKTTCTCCGGGC 131 - ? r_ra?i +855 TATGAGCAGCETAGGGAGTGG 132 . WlJ CaOl +929 AGTTGACTGA ÍM ¿ --AAATAAGAC 133 . WIJ_Ia 03 +362 ATT -AAATAG=CTCTAGAAAC 134 . WJ _Ia 03 +918 CCCAGAATTTfcJATATCCATTC 135 . WIJ_I 03 +943 TGACCCAACA=AAACTCACTG 136 . ?j_ia 03 +1569 CCAGAATATAHCATC-AGCCCT 137. WIJ_Ia 03 +1580 CATCAGCCCTHCTGAGGAGAT 138 . " WIJ_Ia 02 +435 CCAGAACAGA2TTTATTCTGT 139 . WIJ_Ia 02 +583 TTCAGCCATC TTCCS?TTGT 140 . WTJ_I 02 +643 TCACTAACTCHAAAACGACAT 141 . w?-r_?a 02 +648 AACTCAAAAA?GACATCCTCC 142 . wu_la 02 +1046 GAACTGCÁCAE.GTTGCACACT 143 . WIJ _Ia 02 +1061 TTGT?CCATGSACTACCTCCT 144 . I-J_Ia 02 +1142 ACAGCAGGCAVTCAACAAATT 145 . WIJ_ Ia 04 +410 GGATTTTTGG=TGTGTTTTAA 146 . WIJ_I-á 04 +1056 TAGGCTGTTCXCTGCCATCAC 147 . w?-r_ia 05 +1484 GTGCTCTGGGM--ACACAGCTC 148 . WIJ_Ia 05 +1103 AGACCCGATARGAGCTCCTTC 143. WIJ_Ia 05 + 1823 CATCTTGCGCEGTCATGTAAG ISO . WlJ_Ia 05 +1852 C?GC?I--AGCTRTTCCCTCAAA 151. WIJ_Ia 05 + 1906 TTTGGAAACAXGGTG---RAGTAT 152 . WTJ_Ia 05 + 1913 ACACGGTGAAETATTGTCrCC 153 . WU_la 06 + 754 AAAAGTGGATMCTCTGCAAAC 155 . W?J_Ia 06 + 1197 CCTGGGAGCA GGTAAATCAG 156 . WIJ_Ia 06 + 1231 TGAAAATGTCS.CTTTCTCACCT 157. WIJ_Ia 06 +1256 CCTGATATTTBCCAACAAGAA 153 . IJ_la 06 + 1535 AAAGGGTTAGGGTGTCCCCTT 159 . Wl Ca + 163 TGAAAATAAAASACAATTTTTT Las secuencias se enlistan con los residuos de variantes representados por la designación de una sola letra apropiada, es decir A o G se muestran por "R" Los residuos de la variante se subrayan Cuando el polimorfismo es una omisión, los residuos subrayados se subrayan y la forma alternativa se muestra como una "-". "Cuando el intrón 'a' es el intrón 3' para el exón 'a', etc. bPosición de los números correspondientes a la posición dentro del intrón o exón, siendo el nucleótido +1 la base principal 5' del exón o el intrón. De manera alternativa, los números negativos denotan el número de bases del extremo 3' de un intrón cLa posición en cADN=posición # para la forma a de exón de ASTH1 J o la forma i de exón de ASTH11 Las secuencias exónicas se encuentran en la casilla superior, las secuencias intrónicas en la casilla inferior. UTR = región no trasladada. N/A = no aplicable Conservación de secuencias de especies cruzadas La conservación de secuencias de especies cruzadas puede revelar la presencia de áreas de secuencias funcionalmente importantes dentro de una región mayor. Aproximadamente 90 kb de la secuencia yacen entre ASTH 1 I y ASTH 1 J, los cuales se transcriben en direcciones opuestas (figura 1 ) . La orientación transcripcional de estos genes puede permitir la regulación coordinada de su expresión. Los patrones de expresión de estos genes son similares pero no idénticos. Las secuencias encontradas en 5' para los genes son críticas para su expresión. Para buscar regiones reguladoras u otras importantes, se examinó la secuencia genómica entre ASTH 1 I y ASTH 1 J y las clonas plásmidas derivadas de los experimentos de ordenamiento en secuencia genómica se eligieron para los experimentos de hibridización de especies cruzadas Los criterios para la elección de sondas fueron una carencia de elementos de repetición tales como Alu o LI NEs. Los insertos de estas clonas se utilizaron como sondas en los análisis sanguíneas Southern de ADN genómico de humano, ratón y cerdo o vaca, digerido por EcoRI . Las sondas q ue produjeron bandas discretas en más de una especie se consideraron conservadas. Las sondas conservadas se colocaron en cuatro lugares.

Una región se localizó en 5' para ASTH 1 I y se extendió en el exón j de este gen . Una segunda región conservada se localizó en 5' para ASTH 1 IJ , extendiéndose aproximadamente 1 0 kb y comenzando con 6 kb de 5' para el exón a de ASTH 1 J (y se encuentra dentro de la secuencia SEQ I D NO: 1 ). Se observaron otros dos lugares de sondas conservadas en la región entre ASTH 1 I y J. Son de aproximadamente 10 y 6 kb de longitud. Las promotoras, mejoradoras y otras regiones de control importantes se encuentran generalmente cerca de los extremos 5' de los genes o dentro de los intrones. Los métodos para identificar y caracterizar tales regiones incluyen: ensayos de luciferasa, ensayos de transferasa de acetilo de cloranfenicol (CAT) , ensayos de desplazamiento de gel, ensayos de protección del ADNsel (impresión de pie) , ensayos de interferencia de metilación , ensayos de hipersens?bilidad al ADNsel para detectar regiones de cromatina-ree funcionalmente relevantes, otros tipos de ensayos de protección química, ratones transgénicos con regiones promotoras putativas enlazadas a un gen reportero tal como ß-galactosidasa, etc. Tales estudios definen las promotoras y otras regiones de control críticas de ASTH 1 I y ASTH 1 J y establecen el significado funcional de las secuencias evolucionalmente conservadas entre estos genes.

Discusión La posición de ASTH 1 se asocia con el asma y la hiperreactividad bronquial. ASTH 1 I y ASTH 1 J son factores de transcripción expresados en la tráquea, pulmón y otros diversos tejidos. Por consiguiente, el sitio principal de su efecto después del asma puede encontrarse en la tráquea y tejidos del pulmón. Ya que los genes de la familia de ets son factores transcripcionales, una función del ASTH 1 I y ASTH 1 J es la activación de la transcripción de conjuntos particulares de genes dentro de células de la tráquea y el pulmón. Las citocinas son proteínas de señalización extracelular importantes en la inflamación, una característica común del asma. Varios factores de transcripción de la familia de ets activan la expresión de citocinas o receptores de citocina en respuesta a su propia activación mediante señales corriente arriba. ELF, por ejemplo, activa IL-2, I L-3, receptor a de lL-2 y GM-CSF, factores involucrados en la señalización entre los tipos de células importantes en el asma. NET activa la transcripción del gen antagonista receptor de I L-1 . ETS1 activa el gen a receptor de célula T, el cual se enlazado al asma atópico en algunas familias (Moffat eí al. (1 994) supra) . La activación de los genes involucrados en la inflamación por otros miembros de la familia de ets, sugiere que el efecto de estos genes de ASTH 1 en el desarrollo de asma se ejerza a través de la influencia de citocina o de la expresión del receptor en la tráquea y/o pulmón. Las citocinas se producen mediante estructuras celulares dentro de las vías respiratorias, incluyendo las células epiteliales, células endoteliales y fibroblastos, conduciendo a la exasperación de las células inflamatorias en las vías respiratorias Un modelo del papel de ASTH 1 I y ASTH 1 J en el asma que es consistente con el fenotipo enlazado a ASTH 1 , el patrón de expresión de estos genes, la naturaleza de los genes de ASTH 1 /J y la función conocida de genes similares, es que la función aberrante del ASTH 1 I y/o ÁSTH 1 J en la tráquea o el pulmón conduce a la expresión alterada de los factores involucrados en el proceso inflamatorio, conduciendo a la inflamación crónica y al asma.

Análisis funcional de una variante de secuencia promotora de ASTHUy ubicación del promotor de ASTH1 J Los análisis de extensión de la carga iniciadora llevados a cabo mediante el uso del ARN total aislado de ambas células epiteliales de los bronquios y la próstata, han revelado un sitio principal y cinco sitios menores de inicio de transcripción para ASTH 1 J . El sitio principal cuenta con más de 90% de la iniciación transcripcional del gend e ASTH IJ . Ninguno de estos sitios se encuentra cuando se lleva a cabo el análisis de extensión de la carga iniciadora mediante el uso del mARN aislado de fibroblastos de pulmón humano que no expresan ASTH 1 J . La identificación del sitio de inicio transcripcional de ASTH 1 J ha permitido la localización de una caja TATA putativa (TTTAAAA) entre las posiciones -24 y -30 (24 hasta 30 bp 5' para el sitio de inicio de transcripción) . Aunque la secuencia no es la una caja TATA típica, es conforme a secuencia del consenso (TATAAAA) para la unión de proteína de la caja TATA en comparación con los 389 elementos TATA (Base de datos de transfac: http://transfac.gbf-braunscheweig .de/, ID: V$TATA_01 ) .

Análisis del polimorfismo "G" de caja CAAT mediante ensavo de desplazamiento de gel La unión de proteínas nucleares a un polimorfismo en el motivo GCCAAT (GCCAAT o GCCAGT) se encontró en la posición -140 (140 bp 5' para el inicio de transcripción de ASTH 1 J según se definió por los experimentos de extensión de la carga iniciadora, previamente referida como "-165 bp", habiéndose determinado mediante el uso de ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética. Estos experimentos mostraron claramente una notable diferencia cuando se examinó la unión de las proteínas nucleares a oligonucleótidos de doble filamento, radioetiquetados, que contienen el nucleótido normal "A" contra el mutante "G". Un conjunto específico de proteínas nucleares era capaz de unirse al oligonucleótido normal , pero no de unirse al oligonucleótido "G" . La especificidad de los complejos de unión de ADN s dirigió aún más mediante la competencia con cualquier oligonucleótido no etiquetado, normal o mutante. La adición de cantidades crecientes de oligonucleótido normal no etiquetado compitió de manera efectiva con la unión de proteínas nucleares al oligonucleótido normal etiquetado, mientras que la adición de cantidades crecientes de oligonucleótido "G" no etiquetado no lo hizo. Los c?s-elementos de GCCAAT se encuentran en muchos promotores en diversas ubicaciones con relación a los genes, así como también en elementos mejoradores distantes. No existe correlación conocida entre la ubicación y actividad de estos elementos. Ambos factores de trans-acción reguladores, positivos y negativos, se sabe se unen a esta clase de cis-elementos. Estos factores pueden agruparse en las familias NF-1 y C/EBP. La familia de factor-1 (NF-1 ) nuclear de los factores de transcripción, comprende un gran grupo de proteínas de unión de ADN eucarióticas. Se contribuye a la diversidad dentro de esta familia de genes por múltiples genes (incluyendo: NF-1 A, NF-1 B, NF-1 C Y NF-1 X), la división diferencial y la heterodimerización. El factor de transcripción C/EBP (proteína de unión mejoradora CCAAT) es una proteína de unión de ADN , de secuencia específica, termoestable, purificada primero a partir de núcleos de hígado de rata. El C/EBP se une a ADN a través de un motivo estructural bipartita y aparece como si funcionara exclusivamente en células arrestadas por crecimiento, terminalmente diferenciadas. C/EBP a se describió originalmente como NF-I L-6; se indujo por I L-6 en el hígado, donde es el componente de unión principal de C/EBP. Tres miembros más recientemente descritos de esta familia de genes, designados CRP 1 , C/EBP ß y C/EBP d exhiben espcificidades y afinidades de unión de ADN a C/EBP , similares. Además, C/EBP ß y C/EBP d forman fácilmente heterod ímeros entre s í, así como también con C/EBP a. Los miembros de la familia de C/EBP de factores de transcripción, pero no miembros de la familia N F-1 , se unen a la región promotora de ASTH 1 J, según se determine por el uso de anticuerpos comercialmente disponibles (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) que reconocen todos los miembros de la familia NF-1 y C/EBP conocidos a la fecha, en ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética.

Fabricación de una instalación de ADN de secuencias polimórficas Instalación de ADN: se elabora mediante la colocación de fragmentos de ADN sobre pliegues microscópicos de vidrio que se pre-calientan con poli-L-lisina. La colocación de la instalación se lleva a cabo mediante un instalador robótico. El ADN se degrada con el vidrio mediante irradiación ultravioleta y los grupos libres de poli-L-lisina se bloquean mediante tratamiento con 0.05% de anhídrido succínico, 50% de 1 -metil-2-pirrolidinona y 50% de regulador de borato. Las machas en la instalación son oligonucleótidos sintetizados en un sintetizador automatizado de ABl . Cada mancha es una de las secuencias polimórficas alternativas indicadas en las Tablas 3 a 8. Para cada par de polimorfismos se incluyen ambas formas. Los subconjuntos incluyen ( 1 ) los polimorfismos ASTH1J de la Tabla 3, (2) los polimorfismos de ASTH1I de la Tabla 3; y (3) los polimorfismos de la Tabla 4. Se incluyen algunos estándares internos y manchas de control negativo que incluyen secuencias de región codificadora no polimórfica y controles bacterianos.

Se aisla el ADN genómico de muestras de pacientes, se amplifica y subsecuentemente se etiqueta con nucléotidos fluorescentes como sigue: el ADN aisiado se agrega a una reacción de PCR estándard que contiene cargas iniciadoras (de 1 00pmoles cada una), 250uM de nucleótidos, y 5 Unidades de polimerasa Taq (Perkin Elmer) . Además, los nucleótidos fluorescentes (Cy3-dUTP (fluorescencia verde) o Cy5-dUTP (fluorescencia roja) , vendidos por Amersham) se agregan a una concentración final de 60 uM . La reacción se lleva a cabo en un termociclador Perkin Elmer (PE9600) durante 30 ciclos que utilizan el siguiente perfil de ciclo: 92°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos. Los nucleótidos fluorescentes no incorporados se retiran mediante cromatografía de exclusión por tamaño (dispositivos de concentración Microcon-30, vendidos por Amicon) . El reemplazo del regulador, el retiro de pequeños nucleótidos y la concentración de cargas iniciadoras y muestras se lleva a cabo mediante ultrafiltración sobre un microconcentrador-30 de Amicon (mwco = 30,000 Da) con tres cambios de 0.45 ml de TE . La muestra se reduce a 5 µl y se complementa con 1 .4 µl de 20X SSC y 5 µg de tARN de levadura. Las partículas se retiran de esta mezcla mediante filtración a través de un filtro de microrotación de 0.45µ prehumedecido (Ultrafree-MC , Millipore, Bedford , Ma) . Se agrega SDS a una concentración final de 0.28% . La mezcla de cADN fluorescentemente etiquetada se calienta entonces hasta 98°C durante 2 mín, se enfría rápidamente y se aplica a la instalación de ADN sobre un pliegue microscópico. La hibridización procede bajo una tapa de cubierta y el ensamblaje del pliegue se mantiene en una cámara humidificada a 65°C durante 1 5 horas. El pliegue se enjuagua brevemente en 1 X SSC y 0.03% de SDS, seguido por un enjuague en 0.06% de SSC. El pliegue se mantiene en una cámara humidificada hasta que se realiza la exploración por fluorescencia.

Exploración por fluorescencia y adquisición de datos La exploración por fluorescencia se establece en 20 micrones/pixel y se toman dos lecturas por pixel. Los datos para el canal 1 se fijan a fin de recolectar la fluorescencia de Cy3 con excitación a 520 nm y emisión a 550-600 nm. El canal 2 recolecta señales excitadas a 647 nm y emitidas a 660-705 nm , apropiadas para Cy5. No se aplican filtros de densidad neutral a la señal de cualquier canal y el tubo fotomultiplicador se fija en 5. Se hacen entonces los ajustes finos a la ganancia del fotomultiplicador a fin de que las señales recolectadas a partir de las dos manchas sean eqivalentes.

Construcción de un Ratón Transgénico de asth U Aislamiento de fragmento genómico de asth 1-J de ratón El fago MW1 -J se aisló mediante selección de una biblioteca de fago genómica de 129Sv de ratón (Stratagene) con el fragmento BamHI-Smal de 443bp de la región 5' de la clona de cADN de asth 1 -J humana PA1 001 A como sonda . Se ordenó por secuencia el injerto de 23 kb en MW1-J.

Ensamblaje de la construcción de direccionamiento de asthl-Jexb Se aisló un fragmento de Sacl de 2.65kb (bp7115-bp9765) de MW1-J, se clonó en el sitio Sacl de pUC19, se aisló de la plásmida resultante como un fragmento de EcoRI-Xbal, se insertó en los sitios de EcoRI-Xbal de pBIuescriptlI KX+ (Stratagene), y se aisló el fragmento de Xhol-Mlul de 2.5kb. Se aisló un fragmento de Hindlll de 5.4kb (bp 11515-bp16909) de MW1-J, se insertó en el sitio Hindlll de pBluescriptlI KS+, se volvió a aislar como un fragmento de Xhol-Notl, se insertó en los sitios de Xhol-Notl de pPNT, y se aisló el fragmento de Xhol-Mlul de 9.5kb. Los dos fragmentos de Xhol-Mlul se ligaron juntos para producir la plásmida de construcción de direccionamiento final, asthlexb. Astglexb se linealizó mediante digestión con Notl y se purificó mediante banda de CsCI.

Identificación de clonas de ES objetivo: Aproximadamente 10 millones de células de RW4 ES (Genome Systems) se electroporaron con 20 µg de asthlexb linealizado y crecieron en MEFs (Fibroblastos de Embrión de Ratón) inactivados desarrollados en mitomicina C en un medio celular de ES (DMEM + 15% de suero fetal bovino + 1000U/ml .de LIF (Life Technologies)) y 400 µg/ml de G418. Después de 24-48 horas, las células se realimentaron con un medio celular de ES. Después de 7-10 días en cultivo de selección, se recolectaron aproximadamente 200 colonias, se tripsinizaron, se desarrollaron en placas de microtítulo de 96 perforaciones y se expandieron por duplicado en placas de microtítulo de 24 perforaciones. Las células de un conjunto de placas se tripsin?zaron , se resuspendieron en un medio de congelamiento (Joyner, A. , ed. , Gene Targeting, A Practical Approach. 1 993. Oxford University Press) y se almacenaron a -85°C. El ADN genómico se aisló del otro conjunto de placas mediante métodos estándares (Joyner, supra). Aprosimadamente 10 µg de ADN genómico por clona se digirieron con Ndel y se seleccionaron mediante manchado Southern mediante el uso de un fragmento de 1 00 bp (bp61 64-bp6260) como sonda. Un patrón de banda consistente con el reemplazo objetivo mediante recombinación homologa en la posición asth 1 -J se detectó en 10 de 1 1 3 clonas seleccionadas.

Producción de ratones extractores de asth 1-J: Dos de las clonas objetivo, cl#1 1 7 y cl#58, se expandieron e inyectaron en blastocistos C57BL/6 de acuerdo a métodos estándares (Joyner, supra). Los ratones fundadores quiméricos machos de elevado porcentaje (según se determinó por el grado de contribución de color a la cubierta) se cruzaron con ratones hembra A/J y C57BL/6. La transmisión de la línea germinal se determinó por la producción de color de cubierta de chinchilla o albino de cruces A/J y mediante la producción de color de cubierta agouti de cruce C57BL/6. En ensayo sanguíneo Southerh de Ndel empleado para la selección de células ES se utilizó para identificar ia producción de la línea germinal que porta el alelo objeto de Asth 1 -J. La producción de la línea germinal de ambos cruces de A/J y C57BL/6 se identifió y cruzó con compañeros A/J y C57BL/6, respectivamente. Los ratones heterozigosos del alelo objeyo Asth 1 -J se intercruzaron para obtener ratones homozigosos para el alelo objeto de asth1 -J. Las homozigotas se identificaron por selección de análisis sanguíneo Southern de Ndel, arriba descrita. La producción de la línea germinal de los fundadores quiméricos es 50% de A/J o C57BL6 y 50% de 129SvJ en el antecedente genético. Las generaciones subsecuentes al cruce anterior con parejas de tipo silvestre A/J o C57BL/6, dará como resultado que tengan la contribución de 129SvJ al antecedente. El porcentaje de antecedente de A/J o C57BL/6 se calcula para cada ratón homozigoso a partir de su historia de cruce.

Análisis molecular y celular de ratones homozigosos: Se aislaron y procesaron diversos tejidos de homozigotas, heterozigotas y carnadas de tipo silvestre en diversas etapas de desarrollo, desde etapas embriónicas hasta adultos maduros, para obtener ARN y proteína. Los análisis de expresión Northern y Western así como también las hibridizaciones in situ y los análisis ?nmunohistoquímicos sellevan a cabo mediante el uso de sondas de cADN y anticuerpos policlonales y/o monoclonales específicos para la proteína de asth 1 -J .

Análisis fenotípico de ratones homozigosos: Los ratones de A/J, C57BL/6, de tipo silvestre, heterozigosos y homozigosos en ambos antecedentes de A/J y C57BL/6 en diversas etapas de desarrollo, se determinan por patología y diferencias fenotípicas de comportamiento tales como peso, desempeño de cruza, capacidad de alerta y nivel de actividad, etc. Las pruebas de señal de identificación de metacolina se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos publicados (De Sanctis eí al. (1 995). Quantitative Locus Analysis of Airway Hyperresponsiveness en A/J and C57BL/6J mice. Nat. Genet. 1 1 : 1 50-1 54).

Direccionamiento en el exón C de asth 1-J: Ensamble de la construcción de direccionamiento de exón C: Se aisló un fragmento de Hindl l l-Xbal de 3.2kb (bp1 151 5-bp14752) de MW1 -J , se clonó en el sitio Hindl i l-Xbal de pUC19, se aisló de la plásmida resultante como un fragmento de Kpnl-Xbal, se insertó en los sitios de Kpnl-Xbal de pBluescriptl I KS+ (Stratagene) , y se aisló el fragmento Rsrl l-Mlul de 4.5kb. Se aisló un fragmento de Hindl l l de 3.4kb (bp1721 7-bp20622) de MW1 -J , se insertó en el sitio Xhol-Notl de pPNT, y se aisló el fragmento Rsrl l-Mlul de 9.5kb Los dos fragmentos de Rsrll-Mlul se ligaron juntos para producir la plásmida de construcción de direccionamiento final , Asth l exc. Asth l exc se linealizó mediante digestión con Notl y se purificó mediante banda de CsCI.

Identificación de clonas de ES objeto: Aproximadamente 10 millones de células de RW4 de ES (Genome Systems) se electroporaron con 20 µg de asth l exc y se desarrollaron en MEFs (Fibroblastos de Embrión de Ratón) inactivados de mitomicina C en el medio celular de ES (DMEM + 1 5% de suero bovino fetal + 1000U/ml de LI F (Life Technolog ies) y 400 µg/ml de G418. Después de 24-48 horas, las células se realimentaron con un medio celular de ES. Después de 7-10 días en cultivo de selección , se recolectaron aproximadamente 200 colonias, se tripsinizaron, se desarrollaron en placas de microtítulo de 96 perforaciones y se expandieron por duplicado en placas de microtítulo de 24 perforaciones. Las células de un conjunto de placas se tripsinizaron, se resuspendieron en un medio de congelamiento (Joyner, supra) y se almacenaron a -85°C. El ADN genómico se aisló del otro conjunto de placas mediante métodos estándares (Joyner, supra) Aproximadamente 1 0 µg de ADN genómico por clona se digirieron con Ncol y se seleccionaron mediante manchado Southern mediante el uso de un fragmento de 51 8bp (bp8043-bp8560) como sonda. Un patrón de banda consistente con el reemplazo objetivo mediante recombinación homologa en la posición Asth 1 -J se detectó en 3 de 46 clonas seleccionadas. Las clonas objetivo se inyectaron en blastocistos y las quimeras de porcentaje elevado se cruzaron con parejas A/J y C57BL/6, de manera análoga a la realizada para los ratones extractores de asth l -Jexb. Las heterozigotas, homozigotas y carnadas de tipo silvestre se obtienen y analizan de manera análoga a la realizada para los ratones extractores de asth l -Jexb.

Los datos arriba presentados demuestran que el ASTH 1 I y ASTH 1 J son genes humanos novedosos enlazados a una historia de asma clínico e hiperreactividad bronquial en dos grupos de asma, la población de Tristan da Cunha y un conjunto de familias asmáticas Canadienses. Una curva de TDT en la región de ASTH 1 indica que el ASTH 1 I y ASTH 1 J se localizan en la región más altamente asociada con la enfermedad. Se han caracterizado los genes y se ha determinado su estructura genética. Se reporta una secuencia de cADN de longitud completa para tres isoformas de ASTH 1 I y tres isoformas de ASTH 1 J. Los genes son miembros novedosos de la familia de ets de factores de transcripción, los cuales se han implicado en la activación de una variedad de genes que incluyen el gen TCRa y los genes de citocina que se saben importantes en la etiología del asma. Se describen los polimorfismos en los genes de ASTH 1 I y ASTH 1 J . Estos polimorfismos son útiles en el diagnóstico presintomático de susceptibilidad al asma y en la confirmación de diagnósticos de asma y de subtipos de asma. Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan en la presente para referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara de manera específica e individual a incorporarse para referencia . La cita de cualquier publicación es por su exposición antes de la fecha de presentación y no debe considerarse como una admisión de que la presente invención no se encuentre autorizada a antefechar tal publicación en virtud de invención anterior. Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplos con propósitos de claridad de entendimiento, a la luz de las enseñanzas de esta invención, será fácilmente aparente para aquellos de experiencia ordinaria en la materia que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES 1 . Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia dentro de una posición de ASTH 1 mamífero, o una variante polimórfica del mismo.
2. 2. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de ASTH 1 .
3. 3. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicho ácido nucleico comprende una región promotora o reguladora. 4. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende una sonda para la detección de un polimorfismo de posición de ASTH1. 5. Una instalación de oligonucleótidos caracterizada porque comprende: dos o más sondas de acuerdo a la reivindicación
4. 4. 6. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una repetición de microsatélite asociada con una predisposición al asma. 7. Un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha posición de ASTH 1 es humano. 8. Una célula que comprende una composición de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 9. Una composición polipéptida purificada caracterizada porque comprende al menos 50% en peso de la proteína presente como el producto de ácido nucleico según la reivindicación 1 . 10. Un método para detectar una predisposición al asma en un individuo, comprendiendo el método: analizar el ADN o mARN genómico de dicho individuo respecto a la presencia de al menos un polimorfismo de posición de ASTH1 de predisposición o una secuencia enlazada a un polimorfismo de predisposición ; en donde la presencia de dicho polimorfismo de predisposición es indicativa de una creciente susceptibilidad al asma. 1 1 . Un método según la reivindicación 1 0, caracterizado porque dicha etapa de análisis comprende la detección de la unión específica entre el ADN o mARN genómico de dicho individuo con una sonda o sondas según cualquiera de las reivindicaciones 4 o
5. 5. 12. Un método según la reivindicación 1 0, caracterizado porque dicha etapa de análisis comprende la detección de la unión específica entre el ADN o mARN genómico de dicho individuo con un marcador de microsatélite enlistado en la Tabla 1 . 13. Un modelo animal transgénico no humano para la función genética de ASTH1 q ue comprende uno de (a) un extractor de un gen de ASTH1; (b) una secuencia genética de ASTH1 mam ífera, exógena y establemente transmitida; o (c) una secuencia promotora de ASTH1 operablemente enlazada a un gen reportero. 14. Un método para seleccionar agentes biológicamente activos que modulan la función de ASTH 1 , comprendiendo el método: la combinación de un agente candidato biológicamente activo con cualquiera de: (a) un polipéptido de ASTH 1 mamífero; (b) una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ASTH 1 mamífero; o (c) un modelo animal transgénico no humano para la función de gen de ASTH1 que comprende uno de(a) un extractor de un gen de ASTH1; (b) una secuencia genética de ASTH1 mamífera, exógena y establemente transmitida; o (c) una secuencia promotora de ASTH1 operablemente enlazada a un gen reportero; y la determinación del efecto de dicho agente en la función de ASTH 1 . 15. Un ácido nucleico aislado que se hibridiza bajo condiciones rigurosas hacia cualquiera de: SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ I D NO: 4, SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 8, SEQ ID NO: 10, o SEQ I D NO: 328. 1
6. 6. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido o fragmento del mismo que tiene una secuencia aminoácida substancialmente idéntica a la secuencia que se establece dentro de cualquiera de la SEQ I D NO: 5, SEQ I D NO: 7, SEQ I D NO: 9, SEQ I D NO: 1 1 o SEQ I D NO: 339.