KR20020065509A - 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한시스템, 방법 및 장치 - Google Patents

유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한시스템, 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 게놈 DNA의 유전자이식 스크리닝과 표적 돌연변이유발 스크리닝을 수행하기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 본 발명은 또한 DNA를 지정 유전자 서열에 대해 스크리닝하기 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 프로세서, 메모리 및 웹 브라우저를 구비한 컴퓨터와, 게놈 DNA 샘플을 지정 서열에 대해 분석하는 자동 스크리닝 장치를 포함하며, 상기 컴퓨터는 전자 통신 형태를 통해 원격 사용자로부터 지정 유전자 서열에 관한 지시와 기타 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령한다.

Description

유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 시스템, 방법 및 장치 {SYSTEM, METHOD AND APPARATUS FOR TRANSGENIC AND TARGETED MUTAGENESIS SCREENING}
관련 출원에 대한 상호 참고:
본 출원에서는, 2000년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 제60/230,371호에 기초하여 U.S.C. §119(e) 규정하에 우선권을 주장한다. 상기 가출원에서 공개된 모든 사항은 본 명세서에서 참고 인용된다.
유기체의 DNA 돌연변이를 통한 게놈 변형은, 그러한 돌연변이가 그 유기체의 생식 세포에 존재하는 경우, 즉 생식 세포계 돌연변이인 경우에는 자손에게 전해질 수 있다. 이러한 돌연변이는 재조합 DNA 기술을 이용한 DNA의 유전자 조작으로부터 일어날 수 있고, 또는 화학적 또는 물리적 수단에 의한 DNA 공격(challenging)에의하여 도입될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 통하여 도입되는 DNA는 바이러스, 미코플라스마, 박테리아, 진균류, 효모 및 인간 등의 포유동물을 비롯한 척삭 동물에서 유래한 DNA(단, 이에 한정되는 것은 아님)를 비롯하여 다수의 공급원로부터 유래될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 통하여, 유기체의 DNA를 도입, 결실 또는 치환시킬 수 있다. DNA의 세포내 임의 도입은 트랜스펙션(전기천공, 리포펙션 등), 주입(전핵내 주입, 핵내 이식) 또는 트랜스덕션(바이러스 감염)과 같은 기술을 통하여 이루어질 수 있다. 세포들을 화학 돌연변이원으로 처리하거나, X-선 조사 또는 선형 에너지 전이 조사(LET)와 같은 것으로 물리적으로 손상시킴으로써 임의 돌연변이(점 돌연변이, 결실, 증폭)를 생성시킬 수 있다. 유기체내에서 DNA의 표적 부가, 결실 또는 치환(유도성 또는 비-유도성)은 상동성 재조합을 통하여 이루어진다. 유도성 시스템은 서열-특이적 리콤비나아제, 예를 들어 Cre-LoxP(미국 특허 제5,654,182호 및 제5,677,177호) 및 FLP/FRT(미국 특허 제5,527,695호)를 사용한다(상기 문헌들은 본 명세서에 참고 인용된다).
유전자이식 유기체들은 그들의 게놈내에 안정적으로 통합된 다른 종으로부터 유래된 DNA 서열(유전자 또는 유전자 분절)을 보유하고 있는 유기체들이다. 유전자이식 포유동물들은 통상 수정란의 전핵내에 DNA를 미세주입함으로써 생산한다. 상기 기술에서는 숙주 게놈 내로 삽입되는 DNA의 통합 부위 또는 DNA 카피 수를 조절할 수 없다. 유전자이식 라인(line)은 외래 DNA 서열을 그 자손에게 전달하는 유기체를 말한다.
표적 돌연변이, 부위 지령된 돌연변이유발 또는 유전자 표적화는 DNA의 상동성 재조합을 이용하여 숙주 게놈 내의 특정 DNA 서열을 변경시키는 방법을 의미한다. 이는 유전자 불활성화[넉-아웃(knock-out) 돌연변이] 또는 유전자의 유전적 변경[넉-인(knock-in) 돌연변이]를 초래할 수 있다. 포유동물에 있어서, 상기는 클로닝된 돌연변이 유전자 분절(표적 작제물)을 배아 줄기 세포(ES 세포) 내로 트랜스펙션시킴으로써 이루어질 수 있는데, 상기 트랜스펙션에서는 상동성 재조합을 통하여 상기 ES 세포내 내생 유전자 분절을 치환시키게 된다. 이러한 ES 세포로부터 유래된 동물들은 그들의 게놈에 표적 돌연변이를 보유할 것이다. 또한, 이러한 기술의 개량은, 부위-특이적 리콤비나아제(Cre, FLP)에 대한 인식 서열(LoxP 또는 FRT 서열)을 포함하는 DNA 분절로 내생 유전자를 표적화하는 유도성 유전자 변경을 포함한다. 상기 표적 ES 세포 또는 ES-유래 동물에 있어서 리콤비나아제의 발현은 인식 부위 측부에 위치한 DNA 분절의 결실을 초래할 것이다. 표적 작제물의 배열에 따라, 상기는 표적 유전자의 불활성화, 활성화 또는 변경을 초래할 수 있다. 동물들에 있어서 유도성 시스템의 이점은 리콤비나아제를 특이적으로 활성화시키는 능력에 따라 임의의 시점 또는 임의의 조직에서 유전자 변경을 유도할 수 있다는 점이다. 이는 유도성 프로모터(화학적 또는 호르몬-유도성 프로모터)의 제어 하에 리콤비나아제를 위치시킴으로써 이루어질 수 있다.
유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 이용하여, 게놈이 내생적으로 존재하거나 변형, 돌연변이 또는 유전 공학적으로 조작된 특이적 유전자 서열을 보유하는지 여부를 측정할 수 있다. 이러한 변경 또는 돌연변이에 대하여 게놈 DNA를 스크리닝한다. 게놈 DNA는 그 크기 때문에 기판 위에 충분히 고정시키는 것이 어렵다. 상기 게놈 DNA는 암호화 및 비-암호화 영역 양자 모두를 포함한다. 따라서, 상기 게놈 DNA는 엑손 및 인트론, 프로모터 및 유전자 조절 영역, 텔로메어, 복제 개시점 및 비-기능성 유전자간 DNA를 포함한다. 상기 게놈 DNA는 메틸화되는 두가닥 분자이다. cDNA 및 PCR 앰플리콘을 고정시키는 것은 그 분자가 훨씬 작다는 점에서 다르다. 또한, 메틸화와 같은 생화학적 변경 현상은 상기 소형 분자로는 일어나지 않는다. 문헌[Shena, M (2000) DNA Microarrays A Practical Approach. Oxford University Press, New York, NY., 이 문헌은 본 명세서에 참고 인용됨]을 참조하라.
유전자이식 스크리닝은 현재 수동으로 행해지고 있다. 이러한 현재의 수동 시스템은 시간이 많이 소요되며, 실험실 및 심지어 실험실 기술자에 따라 다양한 결과가 나올 수 있다. 현재, 연구원들이 서던 블롯 기술을 이용하는 경우에, 이식유전자 또는 표적 돌연변이에 대해 조직 샘플을 스크리닝하는 데 1주일 이상이 소요될 수 있다. 대안적 기술에 있어서, 에펜도르프 마이크로튜브(등록 상표)(뉴욕 웨스트베리 소재 브링크만 인스트러먼츠) 내에서 최대 30회의 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)을 수행하고 겔 상에서 분리시킬 수 있다. 대부분의 실험실에서 상기 과정은 3∼7일이 소요된다. 당업계에는 더욱 정확하고, 더욱 신속하며, 더욱 고용량으로 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 하기 위한 시스템 및 방법의 제공이 요구되고 있다.
본 발명은 유전자이식(transgenic) 및 표적 돌연변이유발 (targeted mutagenesis) 스크리닝을 위한 시스템에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조직 샘플에서 유래한 지정 유전자 서열 또는 그 일부를 검출하거나 스크리닝하는 다양한 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 고용량 장치에 관한 것이다.
(8) 발명의 간단한 요약
본 발명에서는 자동 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 테스트를 위한 시스템 및 방법을 제공함으로써 전술한 문제들의 독특한 해법을 제공한다.
본 발명의 목적은 지정 유전자 서열에 대한 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 샘플을 종래 방법에 의하는 것보다 고용량으로 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 연구원들이 종래 방법에 의하여 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 샘플을 스크리닝하는 것보다 더욱 신속하게 스크리닝할 수 있도록 하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 본 발명의 몇몇 특징에 의하여 달성된다. 이러한 특징에는 기판 위에 원핵생물 또는 진핵생물 게놈 DNA를 침착시키는 단계 및 마이크로어레이 영상기(microarray imager)로 게놈 DNA를 검출하는 단계가 포함되어, 고용량 스크리닝을 촉진한다. 또한, 샘플 스크리닝을 수행하기 위한 원격 사용자의 선택 매개변수를 제공하고, 관련 시약을 제공하는 주문 과정은, 공조하여 지정 유전자 서열에 대한 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 샘플의 고용량 스크리닝을 촉진한다. 이러한 특징에 더하여, 자성 입자를 이용하여 세포 용해물로부터 게놈 DNA를 스크리닝하고, 원격 사용자로부터 스크리닝 실험실까지의 샘플 수송시 작용하도록 제조한 용해 완충액으로 조직 샘플을 용해시키는 것은 고용량 스크리닝을 촉진시키는 것으로 확인되었다. 지정 유전자 서열에 대한 게놈 DNA의 고용량 스크리닝을 가능하게 하는 본 명세서에 교시된 기술은 당업자가 게놈 DNA 샘플에서 유전자 서열을 검출하는 다양한 방법에 더욱 광범위하게 적용할 수 있다는 점을 이해하여야만 한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 게놈 DNA의 샘플에서 지정 유전자 서열을검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 기판 위에 게놈 DNA를 침착시키는 단계; 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지 프로브를 첨가하는 단계; 및 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대하여 특이적인 1 이상의 표지 프로브로부터 나오는 신호를 검출함으로써 게놈 DNA 샘플에서의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 샘플과 지정 대조군 샘플의 게놈 DNA를 비교하여 샘플의 게놈 DNA 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계; 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계; 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 게놈 DNA 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 조직 샘플을 지정 대조군 조직 샘플과 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계; 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계; 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2위치에 침착시키는 단계; 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 조직 샘플을 지정 대조군 조직 샘플과 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계; 자성 입자를 이용하여 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계; 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계; 지정 게놈 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 조직 샘플을 지정 대조군 조직 샘플과 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계; 자성 입자를 이용하여 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 지정 유전자 서열의 검출을 용이하게 하기 위해 게놈 DNA 농도를 조절하는 단계; 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계; 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계; 지정 게놈 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 조직 샘플을 지정 대조군 조직 샘플과 비교하여 지정 유전자 서열의 샘플을 스크리닝하는 방법으로서, 1 이상의 표지된 표적 결합 프로브와 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브를 이용하는 스크리닝 방법이 제공된다. 이 방법은 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계; 자성 입자를 이용하여 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계; 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계; 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브를 기판 위의 제1 및 제2위치에 첨가하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및 기판 위의 제1 위치와 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 지정 유전자 서열에 대해 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 지정 유전자 서열에 대해 게놈 DNA를 스크리닝하는 방법으로서, 원격 사용자가 게놈 DNA를 포함하는 조직 샘플을 스크리닝 실험실로 보내는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 용해 완충액을 원격 사용자에게 제공함으로써 조직 샘플로부터 게놈 DNA의 추출을 용이하게 하는 단계; 원격 사용자가 조직 샘플을 스크리닝 실험실로 송달하는 단계; 스크리닝 실험실에서 원격 사용자로부터 용해된 조직 샘플을 수령하는 단계; 자성 입자를 이용하여 용해된 조직 샘플에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계; 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계; 지정 게놈 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 지정 유전자 서열에 대해조직 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 비교하여 지정 유전자 서열에 대해 조직 샘플을 스크리닝하는 방법으로서, 원격 사용자가 게놈 DNA를 포함하는 조직 샘플을 스크리닝 실험실로 보내는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 용해 완충액을 원격 사용자에게 제공함으로써 조직 샘플로부터 게놈 DNA의 추출을 용이하게 하는 단계; 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계; 원격 사용자가 용해 완충액 중의 조직 샘플을 스크리닝 실험실로 송달하는 단계; 스크리닝 실험실에서 원격 사용자로부터 용해된 조직 샘플을 수령하는 단계; 자성 입자를 이용하여 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계; 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계; 지정 게놈 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계; 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 지정 유전자 서열에 대해 조직 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 원격 사용자가 스크리닝 실험실로 보낸 1 이상의 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실과 공급자에게 스크리닝매개변수를 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실로 접근 요청을 전송하는 단계; 스크리닝 실험실이 스크리닝 매개변수를 포함하는 접근 가능 응답을 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 전송하는 단계; 원격 사용자가 스크리닝 매개변수를 선택하는 단계; 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실에 선택된 스크리닝 매개변수를 전송하는 단계; 스크리닝 실험실이 통신 연계를 통해 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하는 단계; 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 의뢰서를 공급자에게 전송하여 선택된 스크리닝 매개변수에 적합한 프로브를 얻는 단계; 실험실이 상기 프로브를 수령하는 단계; 원격 사용자가 샘플을 스크리닝 실험실에 송달하는 단계; 선택된 스크리닝 매개변수에 따라 샘플을 스크리닝하여 데이타를 얻는 단계; 및 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 데이타를 전송하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 원격 사용자가 스크리닝 실험실로 보낸 1 이상의 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실에 스크리닝 매개변수를 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실로 접근 요청을 전송하는 단계; 스크리닝 실험실이 스크리닝 매개변수를 포함하는 접근 가능 응답을 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 전송하는 단계; 원격 사용자가 스크리닝 매개변수를 선택하는 단계; 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실에 선택된 스크리닝 매개변수를 전송하는 단계; 스크리닝 실험실이 통신 연계를 통해 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하는 단계; 스크리닝 실험실이 전자 통신 연계를 통해 의뢰서를 공급자에게 전송하여 선택된 스크리닝 매개변수에 적합한 프로브를 얻는 단계; 스크리닝 실험실이 프로브를 수령하는 단계; 원격 사용자가 샘플을 스크리닝 실험실에 송달하는 단계; 선택된 스크리닝 매개변수에 따라 샘플을 스크리닝하여 데이타를 얻는 단계; 및 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 데이타를 전송하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 원격 사용자가 스크리닝 실험실로 보낸 1 이상의 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실에 스크리닝 매개변수를 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실로 접근 요청을 전송하는 단계; 스크리닝 실험실이 스크리닝 매개변수를 포함하는 접근 가능 응답을 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 전송하는 단계; 원격 사용자가 스크리닝 매개변수를 선택하는 단계; 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실에 선택된 스크리닝 매개변수 선택사항을 전송하는 단계; 스크리닝 실험실이 통신 연계를 통해 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하는 단계; 스크리닝 실험실이 전자 통신 연계를 통해 의뢰서를 공급자에게 전송하여 선택된 스크리닝 매개변수에 적합한 프로브를 얻는 단계; 스크리닝 실험실이 프로브를 수령하는 단계; 원격 사용자가 용해 완충액 중의 조직 샘플을 스크리닝 실험실에 송달하는 단계로서, 상기 용해 완충액은 원격 사용자와 스크리닝 실험실간의 운송 중에 상기 샘플 중의 조직을 용해시키도록 제조되는 것인 단계; 선택된 스크리닝 매개변수에 따라 샘플을 스크리닝하여 데이타를 얻는 단계; 및 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 데이타를 전송하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 원격 사용자가 스크리닝 실험실로 보낸 조직 샘플의 고용량 스크리닝 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 자동 장치가 제공된다. 이 장치는 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 의뢰서를 스크리닝 실험실에 전송하는 수단; 스크리닝 실험실이 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 매개변수를 포함하는 접근 가능 응답을 원격 사용자에게 전송하는 수단; 원격 사용자가 스크리닝 매개변수 선택사항을 스크리닝 실험실에 전송하는 수단; 원격 사용자로부터의 샘플을 스크리닝 실험실로 송달하는 수단; 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 수단; 게놈 DNA를 기판 위에 침착시키는 수단; 게놈 DNA를 스크리닝하는 수단; 및 데이타를 원격 사용자에게 전송하는 수단을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 원격 사용자가 선택한 스크리닝 매개변수에 따라 변형 또는 돌연변이된 게놈 DNA에 대해 조직 샘플을 스크리닝하는 고용량 장치가 제공된다. 이 장치는 제1 웰 플레이트로부터 제2 웰 플레이트로의 액체 제거용 자동 접근 스테이션; 제2 웰 플레이트에서 게놈 DNA를 분리하기 위한 분리 스테이션; 제2 웰 플레이트에서 DNA 농도를 조절하기 위한 광학 표준화 스테이션; 제2 테스트 플레이트로부터 기판 위로 게놈 DNA를 침착시키기 위한 배열 스테이션; 게놈 DNA의 부분들에 결합하는 표지된 프로브를 하이브리드화하기 위한 하이브리드화 스테이션; 결합된 표지된 프로브를 검출하기 위한 검출 스테이션; 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 상기 장치와 통신하여 스크리닝 매개변수를 선택하기 위한 수단; 및 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 스크리닝 결과를 전송하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA에 대해 스크리닝하는 시스템이 제공된다. 이 시스템은 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하도록 갖추어진, 프로세서, 메모리 및 웹 브라우저를 구비한 컴퓨터; 및 마이크로어레이 영상기를 포함하는, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항에 대해 게놈 DNA의 샘플을 분석하는 워크스테이션을 포함한다.
(9) 도면의 간단한 설명
첨부하는 도면과 바람직한 구체예(들)의 하기 설명을 통해 본 발명과 그 이점을 보다 완전하게 이해할 수 있을 것이다:
도1은 본 발명의 원격 자동화 테스트 절차의 개요를 도시하고 있다.
도2는 시스템의 한 구체예의 블록 다이아그램이다.
도3은 주문 과정의 블록 다이아그램이다.
도4는 계정 등록의 블록 다이아그램이다.
도5는 작업 사정의 블록 다이아그램이다.
도6은 샘플 확인과 지정을 위한 오리엔테이션을 도시하고 있다.
도7A는 실험실 과정 시스템의 블록 다이아그램이다.
도7B는 실험실 과정 시스템의 블록 다이아그램이다.
도7C는 실험실 과정 시스템의 블록 다이아그램이다.
도7D는 실험실 과정 시스템의 블록 다이아그램이다.
도8은 표준 실험실 스테이션의 블록 다이아그램이다.
도9는 가열 카세트를 도시하고 있다.
도10은 출력 파일에 관련된 유전자이식 스크리닝 실험실의 웹 사이트상의 문서를 보여주는 스크린 화면이다.
도11은 결과를 그래프로 보여주는 것이다.
(10) 바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 고용량 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 발명은 내생으로 존재하거나, 변형, 돌연변이 또는 유전자 조작된 특정 유전자 서열을 갖는 게놈을 보유하는 유기체의 신속한 동정 방법을 제공한다. 본 명세서에서 토의되거나 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 자료들은 본 명세서에서 참고로 인용한다.
하기의 용어와 두문자어가 상세한 설명 전반에 걸쳐 사용된다.
1. 정의
상보적인 - 수소 결합의 결과로서 질소성 염기간의 화학적 친화성. 핵산 가닥간의 염기 결합이 일어나게 한다. Klug, W.S. and Cummings, M.R.(1997) Concepts of Genetics, 5th ed., Prentice-Hall, Upper Saddle River, NJ.(본 명세서에서 참고 인용됨).
카피 수 - 게놈내에 무작위로 통합된 이식유전자의 수.
결실 돌연변이 - 유전자 또는 염색체로부터 하나 이상의 뉴클레오티드가 제거되어 일어난 돌연변이.
지정 유전자 서열 - 유전자이식 삽입체, 선별가능한 마커, 재조합 부위 또는 임의의 유전자 또는 유전자 단편을 포함한다.
DNA(데옥시리보핵산) - 유전 정보를 암호하는 분자. DNA는 뉴클레오티드의 염기쌍 사이의 약한 결합에 의해 결합된 두가닥 분자이다. DNA내의 4개의 뉴클레오티드는 염기: 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T)을 포함한다. 자연에서는, 염기쌍은 단지 A와 T 사이, 그리고 G와 C 사이에서만 형성된다. 따라서 각 단일가닥의 염기 서열은 그 파트너의 서열로부터 추론될 수 있다.
전기천공 - 세포를 고압 전류의 신속한 펄스에 노출시켜 세포의 플라즈마 막이 투과성이 되도록 하여 형질감염을 허용한다.
배아 줄기 세포(ES 세포) - 무한대로 복제할 수 있고 다른 세포로 분화할 수 있는 초기 배아 세포. 줄기 세포는 새로운 세포의 연속적인 공급원으로 작용한다.
게놈 - 특정 유기체의 염색체내의 모든 유전 물질. 그 크기는 일반적으로 염기쌍의 총수로 주어진다.
게놈 DNA - 세포내에 암호화된 모든 유전 정보. Lehninger, A.L., Nelson, D.L. Cox,M.M.(1993) Principles of Biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers, New York, NY.(본 명세서에서 참고 인용함).
유전형 - 개별 세포 또는 유기체의 유전적 구성.
생식 세포계 - 배우자를 통해 후손으로 전달되는 비변형된 유전 물질.
유전자 표적화 - 상동성 재조합 또는 유전자 치환에 의해 널(null) 또는 돌연변이 대립 유전자를 생성함.
가열 카세트 - 가열동안 유리 기판을 위한 저장 기작.
영상화 카세트 - 영상화 동안 유리 기판을 위한 저장 기작.
유도성 유전자 표적화 - 약제의 투여와 같은 실험적 조작에 의해 표적화된 유전자의 유도성 불활성화(또는 활성화)를 가능하게 하는 유전자 표적화 방법. 예: Cre 재조합 효소는 lox 인식 서열에 의해 인접된 DNA의 절단을 촉매하는 부위-특이적 재조합 효소이다. Cre 발현을 위한 프로모터는 약제 인터페론에 민감하기 때문에, 표적화된 결실은 유도성이다.
인터넷 - 세계적으로 분포된 네트워크를 형성하기 위해 한 세트의 표준 프로토콜에 의해 연결된 상호연결(공공 및/또는 개인) 네트워크의 집합체. 월드 와이드 웹(이하 웹이라 함)은 상호연결된, 사용자가 볼 수 있는, 인터넷을 통해 접근가능한 하이퍼텍스트 문서(흔히 웹 페이지라 불림)와 표준 인터넷 프로토콜을 이용하여 그러한 문서에 사용자가 접근할 수 있게 하는 사용자 및 서버 소프트웨어 성분 둘다를 칭한다.
라인(line) - 라인은 유전적 조건을 위해 배양된 콜로니이다.
리포펙션 - 식균 작용에 의해 형성된 리포좀 소포를 이용하여 세포막을 가로질러 이식유전자를 도입한다. 이 방법은 조직특이적이라는 점에서 유익하다.
마이크로어레이 영상기 - 광학적으로 평평한 기판에 결합되거나 침착된 샘플로부터의 발광을 검출하기 위해 이용되는 판독기이다.
마이크로어레이 기법 - 많은 핵산 종의 동시 정량을 가능하게 하는 하이브리드화-계 과정으로 M.Schena, D.Shalon, R.W.Davis, and P.O.Brown, "Quantititative Monitoring Of Gene Expression Patterns With A Complementary DNA Microarray", Science, 270(5235), 467-70, 1995; J.DeRisi, L.Penland, P.O.Brown, M.L.Bittner, P.S.Meltzer, M.Ray, Y.Chen, Y.A.Su, and J.M.Trent, "Use Of A Cdna Microarray To Analyze Gene Expressions Patterns In Human Cancer," Nature Genetics, 14(4), 457-60("DeRisi"), 1996; M.Schena, D.Shalon, R.Heller, A Chai, P.O.Brown, and R.W.Davis, "Parallel Human Genome Analysis:Microarray-Based Expression Monitoring Of 100 Genes," Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93(20), 10614-9, 1996에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 참고 인용한다. 이 기법은 개개의 순수한 핵산 종을 소량 유리 표면 위에 자동으로 반점을 찍고, 다수의 형광 표지된 핵산을 이 배열에 하이브리드화시키고, 생성된 형광 표지된 하이브리드를 스캐닝 공초점 현미경으로 검출 및 정량한다. 이 기법은 유전자 발현 연구를 위해 개발되었다.
미세주입 - 미세한 미세모세관 피펫을 이용하여 수정란의 포배 또는 전핵내로 DNA 용액을 도입하는 기법이다.
돌연변이 - 돌연변이유발물질로부터 생성되는 DNA 서열의 유전되는 변화. 프레임-이동 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이 및 넌센스(nonsense) 돌연변이를 포함하여 다양한 유형의 돌연변이가 있다.
널(null) 돌연변이 - 주로 유전자가 물리적으로 결실됨으로 인해, 유전자의기능이 완전히 제거된다.
재조합 - 자손이 어느 한 쪽 부모의 유전자로부터의 상이한 유전자의 조합을 유도하는 과정. 고등 유기체의 경우, 이것은 교차에 의해 일어난다.
재조합 DNA - 재조합 DNA 기법을 이용하여 연결된 다른 기원의 DNA 분자의 조합.
레트로바이러스성 감염 - 재조합 DNA를 가진 레트로바이러스 벡터가 그들의 게놈을 그것이 감염시키는 세포의 염색체내로 통합시킨다.
선별가능한 마커 - 표적화 효율을 증가시키기 보다는 임의 통합체의 검출을 감소시킴으로써 표적 세포의 검출을 촉진하는 접근법이다. 2가지 유형의 선별성 유전자가 있다: 표시성 및 음성. 네오마이신 같은 표시성 선별자 유전자는 정상적으로는 세포에 치명적인 약제에 대한 내성을 부여한다. 상동성 재조합에 의해 네오마이신을 그들의 게놈에 통합한 세포는 약제 네오마이신에 내성이 된다. 반대로, 비상동성 재조합은 음성 선별자 유전자를 보유하게 된다. HSV tk와 같은 음성 선별자 유전자는 세포 사멸을 일으키는 일부 약제(HSV tk를 발현하는 세포는 간사이클로비어에 민감함)에 대한 감수성을 부여한다. 선별가능한 마커는 유전자 서열이다.
부위 특이적 재조합 효소 - 특정 DNA 서열간의 재조합을 촉진하는 효소이다.
2차 웰 플레이트 - 플레이트 DNA가 이로부터 프린트된다.
공급원 웰 플레이트 - 원격 사용자가 샘플과 동결된 제제로 채우는 플레이트.
표적화된 결실 - 게놈으로부터 유전자를 결실시킴으로써 유전자를 불활성화시키는 기법이다. 상동성 재조합 또는 유도성 유전자 표적화에 의해 이루어질 수도 있다.
표적 돌연변이유발 - 부위-특이적 돌연변이의 도입에 의해 생식세포계를 변화시킨다.
형질감염 - 진핵 세포에 의한 재조합 DNA의 흡수, 통합 및 발현.
이식유전자 - 외래 유전자 또는 DNA
유전자이식 - 이 용어는 재조합 DNA 기법을 통해 그 게놈내에 놓인 다른 유기체의 유전자를 가진 유기체를 말한다. 이들 유기체는 대개 수정란의 전핵에 DNA를 미세주사하여 DNA가 임의로 통합시켜서 제조한다.
유전자이식 라인 - 이식유전자가 안정하게 생식세포계에 통합됨으로써, 후대에 의해 멘델 방식으로 유전되는 유전자이식 마우스 또는 유기체를 말한다.
웹 사이트 - 월드 와이드 웹의 표준 프로토콜을 이용하여 네트워크에 걸쳐 정보 내용물을 제공하는 컴퓨터 시스템이다. 웹 사이트는 TransnetYX.com과 같은 구체적 인터넷 도메인 명칭에 상응한다.
시스템 구성요소와 작업의 개요
본 발명은 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 방법과 시스템을 제공한다. 본 명세서에 개시된 구성에 따라 작동하는 시스템과 방법은 1일에 약 2,000개의 샘플을 스크리닝하는 데 이용할 수 있으며(단지 자동화 배열기만을 이용하여), 또는 만일 완전히 자동화되면 1일에 약 100,000개의 샘플을 스크리닝할 수 있다. 부가적으로, 본 명세서에 개시된 특징에 따라 작동하는 시스템과 방법은 다수의 샘플에 대한 스크리닝 매개변수 선택사항을 전달받고 48시간내에 스크리닝 실험실(20)로부터 원격 사용자(1)에게 스크리닝 결과를 제공할 수 있다.
도 1∼3은 본 발명의 일부 구성의 개요를 도시한다. 본 발명은 원격 사용자(1)가 컴퓨터(5)에 접근하여, 그들이 유전자이식 또는 표적 돌연변이유발 스크리닝 웹 사이트(19)(이하 스크리닝 실험실이라 함)에 제출한 샘플들의 유전자이식 및 표적화 돌연변이 스크리닝을 주문할 수 있게 한다. 인터넷 또는 다른 통신 연계(7)를 이용하여, 원격 사용자(1)는 인터넷과 같은 전자적 통신 연계(7)를 통해 원격 사용자의 컴퓨터(5)로부터 접근 요청(7)을 스크리닝 실험실 컴퓨터(9)에 전송한다. 스크리닝 실험실 웹 사이트(16)는 인터넷과 같은 전자적 통신 연계를 통해 원격 사용자(1)에게 접근 가능 응답을 전송한다. 이 응답은 3가지 상이한 섹션을 포함한다. 3가지 섹션은 계정 등록(21), 작업 사정(23) 및 샘플 확인과 지정(25)이다.
도2에 있어서는, 원격 사용자(1)는 통신 연계(7)를 통해 스크리닝 실험실의 웹 사이트(19)에 접근할 수 있다. 웹 사이트(19)는 Dotlogix(등록상표)(테네시주 멤피스)와 같은 주문 관리자(22)에 의해 제공될 수 있다. 주문 관리자는 소프트웨어 주문 관리 시스템이다. 바람직한 구체예에서, 소프트웨어는 Spaceworks[Manugistics,Inc.,(매릴랜드주 록빌)]이다. 주문 관리자(22)는 주문을 받고 웹 사이트(19)를 관리한다. 원격 사용자(1)로부터 받은 웹 사이트(19)에 기록된 주문은, 스크리닝 실험실 컴퓨터(9)와 전자적 통신(7)으로 연결된 주문 관리자(22)에게 보고된다. 스크리닝 실험실 컴퓨터(9)는 프로세스 컨트롤러(26)에통신으로 연결된 LIMS(24)를 포함한다.
LIMS(24)는 실험실 정보 관리 시스템 소프트웨어의 일반명이다. LIMS(24)의 기능은 데이타 저장소, 실험실의 제어 자동화, 샘플 추적, 작업 흐름 차트화 및 전자적 데이타 포획을 제공하는 것이다. 다른 구체예에서 LIMS(24)는 또한 전자적 통신 연계(7)를 통해 원격 사용자(1)와 직접 통신할 수 있다. 이러한 기능을 제공하기 위해 임의의 표준 실험실 정보 시스템 소프트웨어가 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, Nautilis(등록상표) 프로그램(Thermal Lab System, Beverley, Mass.)가 이용된다.
프로세스 컨트롤러(26)는 워크스테이션(14)에 통신으로 연결된다. 프로세스 컨트롤러는 자동화 가능한 워크스테이션(14)의 임의의 일부분에 명령을 제공한다. Layne 등의 미국 특허 제5,968,731호 참고(본 명세서에서 참고 인용함). 예를 들어, 프로세스 컨트롤러(26)는 하이브리드화 스테이션(96)내에서 프로브가 기판으로 전달되도록 지시한다. 워크스테이션(14)은 LIMS(24)에 통신으로 연결되어 있다(28). 이 방식으로, 워크스테이션(14)은 결과 보고서(249)의 작성을 위해, 인터넷과 같은 전자적 통신 연계(7)를 통해 LIMS(24), 주문 관리자(22) 또는 원격 사용자(1)에게 날짜를 제공할 수 있다. 다른 구체예에서, 원격 사용자(1)는 직접적인 전화선, 케일블 또는 위성 연결을 통해 스크리닝 실험실(20)에 연결될 수 있다(7).
도4에 있어서, 사용자의 계정 등록 섹션(21)은, 원격 사용자(1)가 스크리닝 실험실의 웹 사이트로 접근하면 계정 번호(31)를 입력하여 기존 계정에 접근할 것을 요구한다. 이어서 사용자는 암호를 입력한다. 사용자는 본인이 기본 사용자(33)인지 또는 다른 인증된 사용자(35)인지 질문받게 된다. 만일 유효한 암호가 입력되면, 사용자는 새로운 주문(39)을 할 수 있다. 또한, 사용자는 주문 번호(43)를 입력함으로써 주문 상태(41)를 확인할 수 있고, 추적(45)을 진행할 수 있다. 또한, 기관명, 주요 조사자, 주소, 전화 번호, 팩스 번호, 전자 메일 주소, 요금청구 정보, 기타 인증된 사용자명(49)을 제공하여 신규 계정(47)을 개설할 수 있다. 암호가 선택되고(51), 이것이 확인되면(53), 사용자에 의해 요금청구 정보(55)가 제공된다.
작업 사정 섹션(23)은 사용자가 스크리닝 매개변수를 선택할 수 있게 하는 저하(drop down) 섹션을 보유한다. 도5에 있어서, 만일 샘플이 유전자이식(60) 또는 표적화 돌연변이(70)일 경우, 이 선택사항은 지정을 포함한다. 유전자이식 유기체는 재조합 DNA 기법을 통해 그 게놈내에 들어간 다른 유기체 유래의 유전자를 보유한다. 이들 동물은 대개 수정란의 전핵에 DNA를 미세주사하여 DNA가 임의 통합되게 함으로써 만들어진다. 게놈내로 통합하는 이식유전자의 카피 수는 조절할 수 없다. 유전자이식 라인은 이식유전자가 안정하게 생식세포계로 통합됨으로써, 후대에 의해 멘델 방식으로 유전되는 유기체를 말한다. 이식유전자는 임의의 외래 DNA 또는 유전자이다.
바람직한 구체예에서, 마우스, 예컨대Mus속을 유전자이식 및 표적화 돌연변이에 대해 스크리닝한다. 작업 사정 섹션(23)에서 지정 프로브의 일부는Mus로부터 유래된다. 부가적으로, 한 종의 모든 구성원에 존재하는 유전자 서열이 스크리닝 기준으로서 스크리닝 실험실(20)에 의해 이용된다. 예를 들어,Mus속에서는 주요 뇨 단백질 MUP가 기준 유전자 서열이 될 수 있다. Hogan,B., Beddington,R., Constantini,F. and Lacy,E.(1994) Manipulating the Mouse Embryo, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.(본 명세서에서 참고 인용함).
Mus의 모든 종은 이 방법으로 스크리닝될 수 있다. 부가적으로, 다른 종도 본 발명 방법에 따라 스크리닝될 수 있을 것으로 예상된다. 다른 종을 위한 스크리닝 매개변수를 선택하는 것, 그리고 다른 속 종을 위한 기준 유전자 서열을 스크리닝 실험실이 선택하는 것은 당업자의 능력 범위에 속한다.
샘플이 유전자이식(60)이면, 원격 사용자(1)는 유전자 서열(61), 즉 유전자이식 삽입체, 테스트할 라인의 수, 라인당 샘플의 수(62), 그리고 라인당 표적화될 표적 유전자 서열(63)을 지정하도록 요청받는다. 표적 유전자 서열은 지정 유전자 서열의 일부분이며 프로브의 서열에 해당한다. 원격 사용자(1)는 라인당 스크리닝을 위해 이용되어야 할 프로브 서열(64)(대개 17∼30 염기쌍)을 확인하도록 요청되며, 이 서열은 지정 유전자 서열의 일부분에 상보적이다. "스크리닝"이라는 용어가 이용될 때마다, 이 과정은 또한 "검출"을 칭한다. 프로브 서열은 표적 유전자 서열에 상보적이다. 원격 사용자(1)는 하이브리드화할, 즉 표적 유전자 서열(63)에 결합할 프로브 서열(64)이 샘플에 존재하는지를 확인한다. 이후 이 프로브 서열은 공급자에게 전송되고, 프로브 제공자는 이 서열을 포함하는 표적 결합 프로브를 제조할 것이다.
이후에 원격 사용자(1)는 자신이 제공한 지정 대조군에 대한 특징(65)을 확인하도록 요청받는다. 지정 대조군은 지정 유전자 서열을 갖는 것으로 알려진 게놈 DNA 샘플이다. 원격 사용자(1)는 지정 유전자를 스크리닝 실험실(20)에 제출한다. 부가적으로, 원격 사용자(1)는 지정 대조군의 접합성, 카피 수 및 모자이크 성질을 비롯한 대조군에 대해 알려진 일부 특성을 제공한다. 미지의 샘플 카피 수는 추정될 수 있으며, 지정 대조군 샘플에 대한 정량적 결과를 수반할 수도 있다.
표적 돌연변이유발 스크리닝(70)과 관련하여, 원격 사용자(1)는 라인과 샘플의 수(71)를 확인하도록 요청받는다. 원격 사용자(1)는 유전적 변형이 넉아웃(knock-out)인지 넉인(knock-in)인지(72)를 질문받는다. 만일 원격 사용자(1)가 선별가능한 마커가 존재하는 것으로(73) 지정하면, 사용자에게 마커를 선택하도록 제시될 것이다(74). 선별가능한 마커 서열은 지정 유전자 서열이다. 일반적인 선별가능한 마커는 네오마이신 내성, 히그로마이신 내성 및 퓨로마이신 내성을 위한 유전자 서열을 포함하며, 이에 한정되는 것은 않는다. 일단 원격 사용자(1)가 어느 선별가능한 마커가 존재하는지를 확인하면, 그 유전자 서열이 사용자(1)에게 제시된다.
네오마이신 서열
히그로마이신 서열
퓨로마이신 서열
원격 사용자(1)는 염기 서열 하나 하나를 검토하고 제시된 서열이 실제로 그들의 샘플(74)에 존재하는지 확인할 것을 요청받는다. 선별가능한 마커의 일부분은 표적 유전자 서열(63)로 표시된다. 프로브 서열이 지정된다(64). 프로브 서열(64)은 표적 유전자 서열에 결합한다.
원격 사용자(1)가 선별가능한 마커가 제거되었다고 표시하거나, 또는 샘플이 부위 지령된 재조합 돌연변이(75)를 일으켰다고 표시하면, 원격 사용자(1)는 어떤 재조합 기법을 이용하여 그들의 샘플을 돌연변이시켰는지를 표시하도록 지시된다. 원격 사용자(1)에게 일반적인 재조합 기법이 제시되며, 여기에는 Cre-lox 78과 효모 FLP/FRT 79를 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기법 중 하나를 선택한 후, ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT(서열 번호 4)와 GAAGTTCCTATAC TTTCTAGA GAATAGGAACTTC C GAATAGGAACTTC CTTCAAGGATATG AAAGATCT CTTATCCTTGAAG G CTTATCCTTGAAG(서열 번호 5)와 같은 서열이 원격 사용자(1)에게 제시되며, 이 서열 각각은 Lox-p 부위(78)와 FRT 부위(79)와 관련이 있다. 원격 사용자(1)는 서열의염기를 하나 하나 검토하여 제시된 서열이 실제로 그들의 샘플에 존재하는지를 확인하도록 요청받는다. 재조합 부위는 선별가능한 마커 제거를 위한 지정 유전자 서열이다. 원격 사용자(1)는 재조합 서열 (78) 또는 (79)의 일부분에 상응하는 표적 유전자 서열을 지정한다. 원격 사용자(1)는 만일 샘플에 존재할 경우 하이브리드화할, 즉 표적 유전자 서열에 결합할 프로브 서열(77)을 확인한다. 이어서 이 프로브 서열(77)을 공급자에게 전송하고, 지정에 따라 제조된다.
그러면 원격 사용자(1)는 자신이 제공한 지정 대조군에 대한 특징을 확인하도록 요청된다. 지정 대조군은 지정 유전자 서열을 갖는 것으로 알려진 게놈 DNA 샘플이다. 지정 대조군은 원격 사용자(1)에 의해 스크리닝 실험실(20)에 제출된다. 부가적으로, 원격 사용자(1)는 지정 대조군의 접합성, 카피 수 및 모자이크 성질을 비롯한 대조군에 대한 알려진 일부 특성을 제공한다. 미지의 샘플 카피 수는 추정될 수 있으며, 지정 대조군 샘플에 대한 정량적 결과를 수반할 수도 있다.
바람직한 구체예에서는, 원격 사용자(1)는 그들의 이름, 특유의 선등록된 계정 번호, 암호를 확인하고 그들의 주문서를 회사에 제출할 것이 요청된다. 유전자이식 샘플을 위한 삽입체 또는 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 선별가능한 마커의 유전자 서열을 총체적으로 지정 유전자 서열이라 칭할 수 있다. 표적은 지정 유전자 서열의 임의의 서브세트이다.
도6에 있어서, 일단 원격 사용자(1)가 작업 사정 섹션에 제출하면, 원격 사용자(1)에게 샘플 확인 및 지정 섹션(25)이 제시될 것이다. 샘플 확인 및 지정 섹션(25)은 96웰 플레이트 위치를 포함한다. 원격 사용자(1)는 어느 샘플이 각 웰에배치될지를 지정한다. 만일 원격 사용자(1)가 96개 이상의 샘플을 가지고 있으면, 96 공급원 웰 플레이트의 후속 지정이 가능하다. 도6에 관하여, 바코드 등록 번호(3)를 갖는 96웰 플레이트는 H에서 A까지 표지된 X축과 1에서 1280까지 표지된 Y축을 갖는 세로 방향으로 배향된 것으로 나타날 것이다. X축과 Y축은 A1 81과 같이 웰 위치를 나타낸다.
도6에 있어서, 원격 사용자(1)는 플레이트 등록 번호(82), 라인 수(83), 유전적 라인 확인(84), 샘플 수(85), 표적 서열(86), 프로브 서열(87) 및 웰 위치(88)를 제공하도록 요청된다. 이어서 원격 사용자(1)는 웰 A1에 배치된 물질이 대조군인지 질문받을 것이다. 그 물질이 대조군(89)이면, 원격 사용자는 그 물질(90)의 접합성, 모자이크 성질 및 카피 수를 지정한다. 만일 이들 매개변수 모두가 알려져 있지 않으면, 원격 사용자는 알려져 있는 가능한 많은 정보를 입력한다. 이어서 원격 사용자(1)는 임의의 내부 샘플 확인 번호(91)를 질문받는다.
도 1과 2에 있어서, 원격 사용자(1)는 인터넷이나 직접적인 통신선과 같은 전자적 통신(7) 형태를 통해 스크리닝 실험실(20)에 완성된 스크리닝 매개변수 선택사항을 포함하는 그의 주문을 전송한다. 원격 사용자(1)는 전자적 통신(7) 연계를 통해 스크리닝 실험실에 선택된 스크리닝 매개변수 선택사항을 전송할 수 있다. 이 연계(7)는 직접적일 수도 간접적일 수도 있다. 간접적 경로에서는 스크리닝 매개변수는 웹 사이트(19)로 전송되며, 여기서 주문 관리자(22)는 스크리닝 매개변수 선택사항을 LIMS(24)에게 제공한다. 바람직한 구체예에서, 주문은 2개의 전자적 메세지를 생성하며, 이는 서로 다른 위치로 보내질 것이다. 첫 번째 메세지는 LIMS24에서 저장된 프로브 리스트와 상호 참조되며, 만일 사용자가 지정한 프로브가 저장되어 있지 않으면, 주문 메세지는 협약된 프로브 제공자와 같은 공급자(16)에게 보내진다. 이 의뢰서는 임의의 형태의 전자적 통신을 통해 원격 사용자(1)로부터 스크리닝 실험실(20)로, 이어서 전자적 통신 형태를 통해 공급자의 컴퓨터(8)로 전달될 수 있으며, 또는 다르게는, 주문 메세지는 전자적 통신(12) 형태를 통해 사용자로부터 공급자의 컴퓨터(8)로 전송될 수 있다.
상기 공급자(11)는 원격 사용자(1)가 그들의 주문에서 지정 게놈 서열에 대해 게놈 DNA를 스크리닝하기 위해 지정한 프로브를 생성한다. 주문에 따라 제조된 프로브는 표적 결합 프로브라 칭할 수 있다. 이어서 이 공급자(11)는 바코드를 붙여 표적 결합 프로브를 스크리닝 실험실(20)로 밤새 송달할 것이다. 그 날의 스크리닝을 위한 각 주문을 대한 표적 결합 프로브가 스크리닝 실험실(20)에 의해 수령되면, 그 표적 결합 프로브 상의 바코드가 LIMS(24)로 스캐닝된다. LIMS(24)는 표적 결합 프로브가 수령된 날짜와 시간 및 프로브 공급자로부터 제공된 품질 관리 데이타를 기록한다.
바람직한 구체예에서, 하이브리드화 스테이션(96)에 대하여 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 표적 결합 프로브는 워크스테이션(14)에 배치되고, LIMS(24)는 프로브의 바코드를 기록하여 워크스테이션(14)의 데크 상의 특정 위치를 기록할 것이다. 또한, 스크리닝 실험실(20) 및 LIMS(24) 시스템은, 하이브리드화 섹션(96)에서 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이 어느 표적 결합 프로브가 어느 샘플에 사용될 것인지와 서로 관련이 있다.
바람직한 구체예에서, 원격 사용자(1)의 주문으로부터 생성되는 제2 메시지는, 사용자들이 그들의 샘플의 포장과 운송에 적절한 공급물을 보유하는지를 확인한다. 이 메시지는 사용자에게 필요한 웰 플레이트(들)의 수, 운송 라벨 및 시약 의 양을 한정한다. 이러한 의뢰서는 원격 사용자의 위치에서 LIMS(24) 내에 위치한 재고품 목록 리스트(inventory list)와 상호 참조된다. 이 의뢰서는 임의의 형태의 전자 통신(7)을 통해 원격 사용자(1)로부터 실험실(20)로 보내지고, 이어서 전자 통신(10) 형태로 공급자(11) 또는 공급자의 컴퓨터(8)에 보내지거나, 또는 대안으로 상기 의뢰서는 원격 사용자(1)로부터 임의의 형태의 전자 통신(12)을 통해 공급자(11)에게 보내질 수 있다. 적당량의 공급물이 사용자의 시설(facility) 내에 있는 경우, 메시지는 필요한 운송 재료를 조달할 수 있는 위치를 한정하는 사용자에게 보내진다. 그러나, 공지된 재고품 목록 상호 참조시 사용자의 위치에서 충분한 수의 공급물을 확인할 수 없다면, 이들 물품은 포장되어(18) 사용자에게 운송된다(14). 원격 사용자(1)는 재료들이 도착 예정 시간에 그들에게 수송될 것임을 알리는 메세지를 받을 것이다.
원격 사용자(1)가 상기 공급물을 입수 또는 수령하게 되면, 적당한 샘플을 공급원 웰 플레이트(2)내로 배치시킨다. 샘플은 원핵생물 또는 진핵생물로부터 얻을 수 있다. 샘플은 마우스(8)의 조직 샘플일 수 있으나, 다른 동물 및 식물의 조직 샘플일 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 마우스의 꼬리 또는 귀를 절단하여 조직 샘플을 얻는다. 공급원 웰 플레이트(2)는 스크리닝 실험실(20)로 운송되는 중에 조직 샘플과 조직 샘플을 덮는 데 충분한 양의 용해 완충액을 수용하는 96 웰 플레이트 등이다. 공급원 웰 플레이트(2)의 측면에는 등록 번호(3)가 첨부되어 있다. 등록 번호는 웰 플레이트(2)의 공급원을 추적하기 위해 LIMS(24)에 의해 사용된다. 원격 사용자(1)는 주문하는 중에(도 6) 미리 지정한 공급원 웰 플레이트(2) 내의 웰 위치에 적당한 샘플을 배치한다. 샘플이 공급원 웰 플레이트(2)내의 적당한 웰 내에 배치되면, 이어서 원격 사용자(1)는 피펫을 사용하여 예정된 양의 재구성된 동결건조 완충액(4)을 분주하여 각 웰내의 샘플을 덮는다. 완충액은 조직을 용해시켜서 게놈 DNA를 비롯한 세포 잔해물을 얻을 수 있도록 제조된다. 보다 구체적으로, 완충액은 원격 사용자(1)와 스크리닝 실험실(14) 사이를 운송되는 중에 샘플을 용해시키도록 제조된다. 모든 샘플은 Federal Express(미국 테네시주 멤피스)와 같은 고속 수송 서비스를 통해 수송되기 때문에, 수송 시간은 약 24시간이다. 보다 구체적으로, 예컨대 완충액은 4 M 우레아, 0.1 M 트리스-HCl(pH∼7.5), 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DDT, 및 415 mg의 프로테인아제 K와 RNase로 제조할 수 있다. 원격 사용자(1)는 공급원 웰 플레이트(2)의 각 웰에 용해 완충액(4)을 첨가한다. 완충액(4)은 샘플을 완전히 덮어야 한다. 샘플과 용해 완충액을 공급원 웰 플레이트(2)에 넣은 후에는, 공급원 웰 플레이트(2)의 상부에 덮개를 하여 샘플이 새는 것을 방지한다. 이어서, 수송용 덮개 위에 플라스틱 뚜껑을 배치시킨다. 그런 다음, 원격 사용자(1)는 공급원 웰 플레이트(2)를 익일 수송 서비스 포장(15)내에 넣는다. 이어서, 원격 사용자(1)는 포장을 밀봉하고, 스크리닝 실험실(20)로 수송하고, 바코드 수송 라벨을 붙인다.
도 7A∼7D는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타낸다. 도 7A에서, 공급원 웰플레이트(2)는 스크리닝 실험실(20)에 도달한다(101). 수송 라벨의 추적 번호는 바코드 판독기(103)로 판독된다. 수송 라벨이 판독 불가능한 경우(105), 추적 번호는 수기(手記)로 기입된다(107). 추적 번호의 스캐닝은 LIMS(24)내에 수용되고(104), 수용된 메시지는 추적 필드에 보여지는 바와 같이 사용자의 계정에 게시된다. 포장물에서 공급원 웰 플레이트(2)를 제거하고, 청정실(109)로 보낸다. 공급원 웰 플레이트(2)는 미가공 생물학적 물질과 용해 완충액을 포함한다. 바코드 판독기(111)에 의해 공급원 웰 플레이트(2) 개개의 바코드가 스캐닝되고, LIMS에 등록 번호로서 기록된다(106). LIMS(24)는 주문 관리자(22)를 통해 공급자(11)에게 프로브 주문을 보낼 수 있다(106). 공급원 웰 플레이트(2)의 개별 바코드가 스캐닝될 수 없는 경우(113), 등록 번호를 수기로 기입한다(115). 추적 번호, 등록 번호, 사용자 주문 및 작업 목록이 적절한 상관성을 갖는 경우, LIMS(24)는 플레이트에 대한 활성 기록 번호를 활성화시킨다(도시하지 않음).
청정실 내의 수송 장치로 공급원 웰 플레이트(2)를 적재한다(116). 수송 장치는 웰 플레이트를 수용하고, 워크스테이션과 도킹할 수 있는 임의의 장비이다. 바람직한 구체예에서, 수송 장치는 이동성 하우징 유닛(housing unit) 내에 수직으로 적층된 몇개의 강성 트레이를 포함한다. 상기 수송 장치는 상이한 자동화 스테이션 사이에서 이동 및 도킹될 수 있고; 강성 트레이는 자동화 방식으로 제거될 수 있고, 워크스테이션의 데크 위에서 처리될 수 있다. 각 강성 트레이는 9개의 웰 플레이트용 위치로 구성된다. 트레이당 9개의 위치 각각은 수송 모듈 내부의 특정 위치를 지정하는 특유 바코드를 보유한다.
바코드 판독기로 공급원 웰 플레이트(2)의 등록 번호(3)를 스캐닝하고, 수송 장치 내의 바코드화된 웰 플레이트 위치를 스캐닝한다. 공급원 웰 플레이트(2)의 바코드는 LIMS(24) 내에서 추적용 수송 장치 내의 특유 바코드 위치와 연결된다 (106). 공급원 웰 플레이트(2)는 수송 장치 내에 물리적으로 배치된다(117). LIMS(24)는 이 위치에 웰 플레이트를 기록하고 회합시킨다(106). 수송 장치에 공급원 웰 플레이트(2)가 적재되면, 이 수송 장치는 워크스테이션(14)내에 도킹된다(119).
LIMS(24)는 실험실 요원용 작업표를 생성한다(도시하지 않음). 작업표는 필요한 분석 플레이트의 수와 필요할 수 있는 각종 프로브를 약술한다. LIMS(24) 작업 목록은 단일 파일을 생성한다. 파일 포맷은 ASCII, XML 또는 HTML을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 파일은 네트워크 드라이브 상의 구체화된 디렉토리 내에 기록될 수 있다. 파일명은 특유한 것으로, 실행 번호와 상관 관계를 갖게 된다. 확장자는 작업목록 파일 특유의 것이다.
도 8은 워크스테이션의 일 구체예를 도시하는 블록 다이아그램을 나타낸 것이다. 표준 실험실 스테이션은 실험실 작업의 논리적인 집합이다. 상기 집합은 자동 등록 스테이션(92), 분리/정제 스테이션(93), 광학 표준화 스테이션(94), 배열 스테이션(95), 하이브리드화 스테이션(96) 및 검출 스테이션(97)을 포함한다.
하기 설명은 바람직한 구체예를 제공한다. 하지만, 당업자는 필요시 자동화 정도를 다양하게 변화시키면서 상기 방법을 수행할 수 있다.
자동 등록 스테이션(92)
자동 등록 스테이션(92)은 공급원 웰 플레이트(2)로부터 제1 마스터 웰 플레이트로 액체를 제거하는 장치를 제공한다. 제1 마스터 웰 플레이트는 DNA가 분리되는 플레이트이다. GenesisTecan(Raleigh-Durham, 노스캐롤리나주) 또는 MultimeckBeckman(Indianapolis, 인디아나주)와 같이 시판되는 임의의 자동 등록 스테이션은 이러한 기능을 수행할 수 있다. 이러한 장치를 액체 취급기(handler)라 부른다. 액체 취급기는 공급원 플레이트(121)의 강성 플라스틱 덮개를 벗긴다. 바람직한 구체예에서, 액체 검출은, 액체 취급기에 의해 차단층 메카니즘(barrier sealing mechanism)(123)을 관통시켜 수행된다. 액체 취급기는 액체 검출을 수행함으로써, 본래의 샘플(125)의 존재를 검증한다. 공급원 웰 플레이트(2)의 바코드는 재스캐닝된다(127). 이러한 측정은 LIMS(24) 내에 기록되고 게시되고(108), 결과 보고서(249)에 반영된다. 또한, LIMS(24)는 웰 플레이트가 수송 장치에서부터 자동화 등록 스테이션(92)까지 일관적이라는 것(108)을 보증한다. 불충분한 양의 미가공 테스트 재료가 이용되는 경우, 에러 코드가 생성될 수 있다. 액체 취급기는 스테인레스 강철 또는 이와 유사한 것으로 된 피펫 팁을 이용하고, 이는 각 샘플을 전달하는 사이에 세척된다.
DNA는 제1 마스터 웰 플레이트이라 칭하는 깨끗한 웰 플레이트에 전달된다 (129). 제1 마스터 웰 플레이트의 바코드는 스캐닝되고(131), LIMS(124)는 제1 웰 플레이트용 신규 바코드에 결합된다(102). 미결 상태인(pending) 샘플 모두가 제1 마스터 웰 플레이트 내에 등록될 때까지 자동 프로세스 등록은 계속된다.
분리/정제 스테이션(93)
수송 장치에 의해 제1 마스터 웰 플레이트의 트레이를 분리/정제 스테이션 (93)으로 이동시킨다. 이 스테이션에 있어서, 게놈 DNA는 자성 및 상자성 입자 등을 이용한 분리법으로 분리 및 정제할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "자성(磁性; magnetic)"은 자성 및 상자성 둘다를 의미한다. 자성 입자의 평균 직경은 0.1 미크론 내지 100 미크론 범위일 수 있다. Hawkins의 미국 특허 제5,705,628호(그 기재 내용 전부를 본 명세서에 참고로 인용함)의 칼럼 3에 나타나 있듯이 자성 입자를 작용기화할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 자성 입자는 1 미크론의 철 코어 카르복실화된 입자이나, 상이한 크기의 상이한 작용기를 갖는 다른 자성 입자를 사용할 수 있다.
예를 들어, 분리/정제 스테이션(93)에 있어서, 제1 마스터 웰 플레이트의 각 웰에 자성 입자(133)를 채운다. 주사기 펌프로 입자를 웰 내에 분주한다. 제2 주사기 펌프는 미가공 생물학적 물질 및 활성 입자(133)를 함유하는 웰 내에 결합 완충액을 분주한다. 분주 그 자체가 샘플의 혼합을 촉진시키기에 충분할 수 있다. 팁과 같이 부수적인 혼합 메카니즘으로 액체를 흡출시키고 재분주할 수 있다. 20% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000, 0.02% 아지드화나트륨 및 2.5 M 염화나트륨과 같은 결합 완충액은 자성 입자의 표면 화학물질에 게놈 DNA를 비특이적으로 결합시키는 데 사용된다. PEG는 물의 수소 결합을 가능하게 하는데, 이로써 DNA의 농축이 일어난다. 추가의 결합 매개변수는 Hawkins의 미국 특허 제5,705,628호에 기재되어 있다. 실온에서 10분 동안 상기 입자, 결합 완충액 및 미가공 생물학적 물질을 항온처리한다. 항온처리 후, 자석은 수분, 즉 2∼6분간 제1 마스터 웰 플레이트의 바닥과 접촉한다. 게놈 DNA가 부착된 자성 입자는 마스터 웰 플레이트 바닥에 자기에 의해 끌어당겨져서 입자의 펠렛을 형성한다. 상청액을 제거한다(139). 세척 완충액(예컨대, 70% 에탄올 및 30% 탈이온수)을 입자(141)를 재현탁시키는 데 사용한다. 자석(143)을 사용하여 게놈 DNA가 부착된 자성 입자를 상청액으로부터 분리시킨다. 상청액을 흡출시킨다(145). 입자 세척 단계를 2∼4회 반복한다.
펠렛화된 입자가 들어 있는 제1 마스터 웰 플레이트를 공기 건조시킨다(147). 대안의 방법으로, 펠렛화된 입자를 압축 질소로 건조시킬 수 있다. 입자가 완전히 건조되면, 자석을 제거한다(149). 게놈 DNA가 부착된 입자를 현탁 완충액(151) 중에 재현탁시킨다. 현탁 완충액은 입자로부터 결합 DNA를 용리시키도록 제조된다. 이러한 현탁 완충액의 일례로는 0.01 M 트리스(pH 7.4), 0.02% 아지드화나트륨 또는 구연산나트륨 염수(SSC), 디메틸 설폭시드(DMSO), 수크로스(20%) 또는 포름아미드(100%)가 있다. 바람직한 구체예에서, 제1 마스터 플레이트를 80℃로 2분간 가열하여(153), 입자로부터 DNA를 분리시킨다.
용액 중의 DNA를 가열하고 재현탁시킨 후, 자석(155)을 사용하여, 정제된 DNA로부터 자성 입자를 분리한다. 입자로부터 상청액을 제거하고(157), 제2 웰 플레이트(2)내로 피펫으로 상기 상청액을 옮긴다. 제2 웰 플레이트의 바코드를 판독한다. LIMS(24)는 제1 및 제2 웰 플레이트(114)의 바코드와 서로 연관이 된다. 소량(1∼10 ㎕)의 DNA 상청액을 깨끗한 바코드화된 광학 1536 웰 플레이트 내에 피펫으로 옮긴다(159).
완전 자동화 시스템이 필요한 경우, 자기 분리기는 자동화될 수 있고, 워크스테이션 바닥으로부터 상승되어, 모든 제1 웰 플레이트의 바닥과 동시에 접촉할 수 있다.
일 구체예에서, 자성 입자(161)로 분리시키기 전이나 후에 게놈 DNA를 초음파 처리할 수 있다. 바람직하게는, 세포 잔해물로부터 분리시킨 후, 게놈 DNA를 초음파 처리한다. 고정된 호온(horn) 기구와 같은 임의의 종래 수단으로 초음파 처리를 행할 수 있다. 바람직한 구체예는 5분간 게놈 DNA를 초음파 처리하여 DNA 단편을 생산하는 것이다. 약 100 bp 내지 최대 1 kb의 다양한 크기의 단편이 있을지라도, 단편의 평균 크기는 약 500 bp 정도(평균 약 50 bp)이다.
광학 표준화 및 웰 플레이트 스테이션(94)
광학 표준화는 DNA 정량화를 포함한다. 흡광도가 측정될 수 있는 바닥이 투명한 1536 웰 플레이트와 같은 광학 플레이트를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 1536 ULTRAMARK(미국 캘리포니아주 허큘리스 소재 Bio-Rad)를 사용한다. 광학 플레이트의 바코드가 스캐닝된다(161). 제2 마스터 웰 플레이트에서 취한 DNA 상청액의 소량의 분액은 LIMS(24)를 통해 DNA 농도 광학 웰 플레이트 내의 특정 웰 위치에 추적된다(110). 광학 웰 플레이트가 DNA 농도 분석에 사용된다(163). 이 분석은 당업자가 알고 있는 흡광도 스캔(260/280의 비율) 또는 형광정량을 포함한다. DNA 농도 값은 LIMS(24)에서 정량 및 기록된다(112).
제2 웰내의 게놈 DNA의 농도는, 바람직하게는 제2 마스터 웰 플레이트내에서 약 12.5∼500 ng/㎕의 유체이고, 보다 바람직하게는 제2 마스터 웰 플레이트내에서약 17∼250 ng/㎕의 유체가 되도록 조절한다.
광학 표준화 스테이션(94)은 공지의 DNA 농도를 갖는 제2 마스터 웰 플레이트내의 공지된 샘플 부피를 기초로 조절하여, 각 샘플을 탈수시키는 시간 또는 수화시키는 부피를 계산한다. 자동 액체 취급기 시스템을 이용하여 탈이온수로 제2 웰 플레이트를 수화시켜서, DNA 농도를 감소시킬 수 있다(165). 역으로, 압축 가스로 계산된 시간 체계 동안 샘플을 탈수시켜 DNA 샘플을 농축시킬 수 있다(167). DNA 농도가 0이거나 또는 정량값이 최적화를 위한 매개변수 아래로 떨어지는 경우, LIMS(24)는 결과 보고서에 기재되어질 불충분한 양의 보고서를 생성한다(도시하지 않음). 제2 마스터 웰 플레이트내의 최적화된 샘플(169)은 농도 검증(171)을 위해 재스캐닝한다.
배열 스테이션(95)
배열 스테이션(95)에서는, 제2 웰 플레이트에서 취한 게놈 DNA 샘플을 기판(229) 위에 침착시킨다. 기판은 도 9에 도시되어 있다. 기판은 광학적으로 평평하여 레이저로 스캐닝할 수 있고, 스크리닝될 게놈 DNA를 결합시키는 충분한 수의 작용기를 포함할 수 있다. 기판(229)은 유리, 플라스틱, 막 또는 이들의 조합일 수 있다. 일반적으로, 기판(229)에는 약간의 표면 화학물질물질이 부착되어 있다. 상기 표면 화학물질로는 아민기, 알데히드기 또는 폴리리신을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 반응성 기는 공유 또는 비공유적으로 기판(229)의 표면에 핵산(DNA, cDNA, EST, 앰플리콘 등)을 부착시킨다. 바람직한 구체예에서, 임의의 평평한 유리 슬라이드에 1 ㎤당 반응성 기인 알데히드 작용기를 5 ×1012개 고정시킨다. 슬라이드(SMA-1000)는 TeleChem(미국 캘리포니아주 써니베일 소재)으로부터 구입한다.
배열 스테이션(95)에서, 게놈 DNA는 자동 배열기를 이용하는 고체 핀 툴(pin tool)로 기판(229)의 표면 위에 침착된다(175). 배열기는 티탄 팁 등을 웰에 담그고, 기판 위의 프린트하는 기계이다. 자동 배열기는 특정 샘플의 위치를 기판 위의 제 위치로 추적하는 소프트웨어를 포함한다. 배열기는 LIMS(24)에 통신으로 연결되고, 각 샘플에 대한 정보는 LIMS에 전송된다(114). 통상, 자동 배열기는 고체 핀, 스플릿 핀/퀼(split pin/quill), 핀셋(tweezer), TeleChem의 극미량 점적 핀(미국 캘리포니아주 써니베일 소재), 핀 및 고리, 압전 기법과 주사기-솔레노이드 기법을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 변경하지 않고 제조업자의 작동 지시에 따른 방법으로 자동 배열기를 사용할 수 있다.
알데히드 코팅된 슬라이드의 경우, 게놈 DNA 반점은 기판으로의 부착을 위해 추가 처리될 필요가 없다. 그러나, 다른 작용기를 사용하여, 표면으로의 자외선 가교 및/또는 샘플을 부착시키는 가열에 의해 게놈 샘플을 기판(229) 위에 부착시킨다. 예를 들어, 1200 μ/j에서 30초간 기판 위에 게놈 DNA를 자외선으로 부착시킨다. 유사하게, 80℃에서 2∼4시간 가열하여 부착을 수행한다. 기판(229) 위의 반점의 크기는 1∼100 미크론 범위이다. 별개의 추적가능한 샘플에 해당하는 약 1∼130,000개 게놈 DNA 반점이 개개의 기판(229) 위에 배치된다.
도 7C의 경우, 예컨대 기판 바코드(231)는 스캐닝된다(173). LIMS(24)는 118 웰 플레이트와 기판 바코드(231)를 연결시킨다. 또한, LIMS(24)는 특정 샘플의 기판 바코드(231)과 기판 위의 특정 위치를 연결시킨다. 테스트 대상인 샘플 유래의 게놈 DNA 및 원격 사용자(1)에 의해 제공된 지정 대조군 유래의 게놈 DNA는, 할당된 위치(예컨대, 조직 샘플의 테스트만을 일컫는 경우 기판 위의 제1 및 제2 위치)의 기판 위에 침착시킨다. 기판 위에 게놈 DNA를 침착시키기 전에, 게놈 DNA를 충분한 양의 점적 완충액과 혼합하여 기판(229) 위에서의 침착을 촉진시킨다.
바람직한 구체예에서, 점적 완충액은 3 x SSC이나, DSMO, 1 x SSC 또는 시판용 점적 완충액을 비롯한 다른 완충액을 사용할 수 있다. 게놈 DNA는 기판 (229) 위에 침착된다(175). 품질 관리 목적을 위해 기판(229) 위에 게놈 DNA 샘플을 3회 침착시킨다. LIMS(24)는 자동 마이크로어레이 장치로부터 받은 정보로부터 기판(229) 위에 침착된 게놈 DNA 샘플의 정확한 위치를 기록한다(114). 대안의 구체예에서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 1 이상의 프로브 역시 각 반점에 첨가한다. 프로브는 기준 유전자 서열에 대해 특이적이다.
다른 대안의 구체예에서, 소량의 형태 서열 핵산이 제2 웰 플레이트의 각 웰에 첨가된다(177). 형태 서열은 테스트 대상인 생물학적 물질의 게놈 내에 자연적으로 발생하지 않는, 원핵생물 또는 진핵생물과 같은 임의의 공급원에서 유래된 임의의 핵산일 수 있다. 샘플 내로 스파이크(spike)된 람다 DNA를 형태 대조군으로 사용할 수 있다. 형태 서열의 예로는 외생 유전자, 부분 유전자, 직렬식 반복체, 무작위(arbitary) 서열 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 제2 웰 플레이트의 게놈 DNA 내에 형태 서열을 피펫으로 넣고, 상하로 부드럽게 피펫팅하여 혼합한다. 형태 대조군은 기판(229)에 샘플이 성공적으로 전달되었는지를 측정하는 데 사용된다.
도 7D의 경우, 바람직한 구체예에서, 기판(229) 위로의 침착이 완료된 후, 제2 웰 플레이트는 배열 스테이션(95)로부터 분리한다(197). 제2 웰 플레이트를 밀폐시키고(199), 제1 마스터 플레이트에는 다시 뚜껑을 덮고(201), 이들 플레이트의 바코드를 재스캐닝하고, 저장 유닛 위치를 할당한다(203). LIMS(24)는 마스트 플레이트와 수송 장치 위치 (204)를 연결시킨다. 이어서, 제2 웰 플레이트를 냉동기(205)로 이동시킨다. DNA 샘플을 함유하고, 임의로 형태 대조군 서열을 함유하는 제2 웰 플레이트는 차단층 밀봉재로 밀봉시킨다. 차단층 밀봉재는 샘플 분해를 방지하고, 안전한 저장 메카니즘을 제공한다. 처리 후 제2 웰 플레이트를 수용하는 수송 저장 유닛은 특정 번호 및 유닛 내의 특정 위치를 보유한다. 유닛 내부의 각 위치는 연결된 특유 바코드 번호를 보유한다. 워크스테이션(14)으로부터 제거된 각각의 제2 웰 플레이트는 수송 저장 유닛 내의 특정 위치의 바코드의 스캐닝뿐만 아니라 스캐닝된 바코드를 보유한다. LIMS(24)는 제2 웰 플레이트의 번호 및 특정 위치를 기록한다. 제2 웰 플레이트와 그 위치의 연결은 샘플이 재등록될 필요가 있는 경우에 유용하다(204). 장기간의 저장을 위해 수송 저장 유닛를 냉장 저장실로 이동시킬 수 있다.
하이브리드화 스테이션(96)
하이브리드화용 가열 카세트(177)내에 기판(229)을 배치한다. 도 9에 가열 카세트(20)의 일례가 도시되어 있다. 가열 카세트(220)는 경사면(beveled) 상부 (225), 복수의 스페이서(226), 금속 프레임(227) 및 인장 클램프로 제조된다.기판(229)을 금속 프레임(227) 아래에 넣고, 가장자리를 따라 종방향으로 가동하는 기판(229)의 상부에 플라스틱 스페이서(226)를 배치한다. 이어서, 복수의 스페이서(226)에 의해서만 분리되는 기판(229) 둘레에 경사면 상부 플레이트 (225)를 내린다. 이어서, 가열 카세트(220)에 금속 인장 클램프(230)를 가하는데, 이는 상기 카세트(220)를 단단히 고정시킨다. 기판(231)의 바코드는 가열 카세트(220) 너머로 확장되어 스캐닝을 용이하게 한다.
도 7C의 경우, 바람직한 구체예에서, 가열 카세트(220)는 조립된다 (178). 가열 블록(Gene Paint-Tecan)(미국 노스캐롤리나주 소재 Raleigh-Durham)에 가열 카세트(220) 내의 기판(229)을 전달한다. 가열 블록의 기능은 온도를 증가 및 감소시키는 것이다. 바람직한 구체예에서, 가열 블록을 90∼95℃로 2분간 가열하여 두가닥 DNA를 분리하여 하이브리드화에 보다 순응하게 한다(181). 이어서, 10∼20배 부피의 에탄올(115)로 기판(229)을 세척한다. 바람직한 구체예에서, 그 후 가열 카세트의 상부 경사면 내로 압축 N2를 주입하여 임의의 잔류 에탄올을 방출시켜서, 기판(229)을 건조시킨다. 충분한 양의 케이신(Casine), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 임의의 시판되는 차단제를 비결합 표면 화학물질, 즉 알데히드를 차단시키기 위해 가열 카세트(220)의 경사면에 분주한다(183). 가열 카세트(230)는 가열 블록 위에서 항온처리된다(184). 차단제로 표면 화학물질을 차단시킨 후, 기판(229)을 세척한다(185). 바람직한 구체예에서, 각 1분간 3회 탈이온수로 기판(229)을 세척한다.
기판(229) 위에 고정되는 게놈 DNA는 프로브와 하이브리드화된다(187). LIMS(24)는 하이브리드화 스테이션(96)에게 작업 사정(23)에서 원격 사용자(1)에 의해 선택된 프로브 등의 시약을 분주하도록 지령한다. 바람직한 구체예에서, 기판(229) 위의 각 DNA 반점에 각종 프로브를 첨가한다. 반점은 테스트 대상 샘플일 수 있거나, 또는 반점은 상응하는 대조군 DNA 샘플일 수 있다. 제1 프로브는, 표적 유전자 서열(63)이라 칭하는, 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 지정 유전자 서열의 일부에 특이적이다. 표적 유전자 서열에 특이적인 표적 프로브를 표적 결합 프로브라 칭한다.
바람직한 구체예에서, 기준 유전자 서열의 일부분에 특이적인 1 이상의 제2 프로브도 하이브리드화 완충액에 첨가한다. 이 프로브는 기준 결합 프로브라 칭할 수 있다. 기준 결합 프로브의 기능은 지정 품질 관리 검사점을 제공하는 것이다. 기준 결합 프로브는 스크리닝되는 종 내의 유전자 또는 유전자 분절에 상보적인 유전자 서열, 즉 기준 유전자 서열을 갖는다.
기준 유전자 서열로 사용되는 내생 유전자는 이식유전자의 반복 빈도와 유사한 빈도를 보유하여, 각 프로브에 대해 유사한 양의 하이브리드화 및 선형 곡선이 얻어지게 된다. 1∼10 카피의 이식유전자(임의의 단일 카피 마우스 유전자)를 보유하는 개체를 대조군 유전자 서열로서 사용할 수 있다.Mus종에 존재하는 단일 카피 마우스 유전자의 예는 표 1에 기재되어 있다.
32.MMHAP9FLC5.seq.53F ATCACAAGTACTGGGAGAGG(서열 번호 6)
MHAa67g1.seq.120F GTCTCAGAGGTTAACTCACC(서열 번호 7)
D9Mit211.1.38 TTCTTATCTTCAGCCCCACC(서열 번호 8)
X61434.129F ATAACACGGTGTGCACCACG(서열 번호 9)
U11075.95F TCCCTTCCTGTTGACTACAG(서열 번호 10)
Z49987.38F TACCCACACGGGCTTAAAAC(서열 번호 11)
32.MMHAP9FLC5.seq.53R CACTGCCAGTGTGTTTTCAC(서열 번호 12)
또한, 예컨대 마우스 주요 뇨 단백질 유전자 계통군은 반수체 게놈당 20∼30 카피를 포함한다. 주요 단백질 계통군 내에 포함되는 유전자 서열에는 다음과 같은 것이 포함된다.
mup ctgtgacgtatgatggattcaataca(서열 번호 13).
mup tcggccatagagctccatcagctgga(서열 번호 14).
mup ctgtatggataggaagggatgatgc(서열 번호 15).
mup ggctcaggccattcttcattctcgggcct(서열 번호 16).
다수의 이식유전자 통합 사건을 포함하는 개체를 평가하기 위해서, 리보좀 RNA 유전자용 프로브가 유효하게 작용한다. 리보좀 RNA 유전자는 50 내지 수백개의 카피를 적절히 밝혀낼 수 있다. Hogan, B., Beddington, R., Constantini, F. 및 Lacy, E.(1994) Manipulating the Mouse Embryo, 2nded. Cold springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, NY. (본 명세서에서 참고 인용함).
표적 결합 프로브와 기준 결합 프로브 외에, 형태 결합 프로브를 하이브리드화 완충액에 첨가할 수 있다. 형태 결합 프로브의 기능은 프린팅 과정이 성공적이 되도록 품질 관리 검사점을 제공하는 것이다. 이러한 품질 관리는 표적 샘플을 기판에 적용할 수 있는지 여부를 결정하는 데 참작할 수 있다. 또한, 이로 인하여 샘플과 기판의 재현성을 평가하기 위해서 평가하고자 하는 침착된 샘플의 형태를 예상할 수 있다.
표적 결합 프로브, 기준 결합 프로브 및 경우에 따라 형태 결합 프로브가 하이브리드화 완충액 중에 현탁되면, 프로브 증폭 분자 또는 2차 신호 발생 시약을 혼합물에 첨가한다. 수지상 프로브와 같은 증폭 분자는 표적 결합 프로브, 형태 결합 프로브 또는 기준 결합 프로브에 상보적인 핵산 포획 서열을 포함한다. 또는, 표적 결합 프로브, 형태 결합 프로브 및 기준 결합 프로브의 에피톰을 45∼50℃에서 항온처리하여 2차 신호 발생 시약과 프로브를 사전 하이브리드화시킬 수 있다.
프로브를 표지하는 데 상이한 기법을 사용할 수 있다. 직접 표지화 기법 및 간접 표지화 기법은 허용가능한 결과를 제공한다. 간접 방법은 미국 특허 제5,731,158호; 제5,583,001호; 제5,196,306호 및 제5,182,203호(본 명세서에서 참고 인용됨)에 개시된 바와 같다. 직접 표지화 기법에서 표지된 프로브를 표적 유전자 서열에 하이브리드화시킨다. 하나의 프로브가 1 이상의 형광 분자, 방사성 분자 또는 염색 분자(예, 시아닌, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 또는 임의의 기타 형광 신호 발생 시약)를 포함하도록 프로브를 직접 변형시킨다. 형광 신호 발생 시약은, 예컨대 FITC, DTAF 및 FAM을 포함한다. FAM은 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르로 만든 플루오레세인 생체접합체[예, 5-FAM(미국 오레곤주 유진의 몰리큘라 프로브스)]이다. DTAF는 플루오레세인 디클로로트리아진 생체접합체이다.
간접 표지화 방법은 선택된 유전자 표적 서열과 결합하고 특정 에피톰을 포함하도록 변형된 프로브를 사용하거나 또는 핵산 결합 서열을 보유하는 경우 2부분 프로브를 형성한다. 프로브는 원격 사용자(1)의 스크리닝 매개변수 선택을 기준으로 만들어진다. 원격 사용자(1)는 표적 유전자 서열(63)과 상관 관계가 있는 프로브 서열(64)을 제출한다. 표적 서열(63) 외에, 지정된 표적 서열(63)에 연장하여 추가의 결합 서열을 첨가한다. 이들 2개 성분의 조합으로 2부분 프로브가 생성된다.
예를 들어, 프로브의 결합 서열은 역전사 효소의 5'말단과 동일한 서열을 보유할 수 있다. 2부분 프로브는 5'CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA GAC AGG GAC G-프로브 서열 3'(서열 번호 17)의 결합 서열을 포함한다. 그러면 결합 서열은 Cy3 수지상 5' GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC C-3' (서열 번호 18)에 대한 포획 서열에 상보적이다.
표적 유전자 서열(63)은 각각 프로브 유전자 서열(64)에 대해 특이적이다. 2부분의 결합 서열은 자유 상태로서 표적 유전자 서열(64)에 결합하지 않는다. 동일한 방식으로, 기준 유전자 서열에 대하여, 기준 결합 프로브 서열은 기준 유전자 서열에 특이적이다. 2부분의 결합 서열은 자유 상태로서 관련 유전자 서열에 결합하지 않는다. 단일 카피 마우스 유전자에 상보적인 2부분 프로브의 예는 하기 표 2에 제시되어 있다.
마우스 주요 뇨 단백질에 상보적인 2부분 프로브의 예는 하기 표 3에 제시되어 있다. 이들 2부분 프로브는 MUP 유전자 서열 중 하나와 증폭 분자에 상보적인 제2의 유전자 서열로 구성된다.
덴드리머 또는 티라미드와 같은 증폭 분자를 도입한다. 증폭 분자는 핵산 결합 서열 또는 에피톰에 직접 또는 간접적으로 결합한다. 결합하지 않은 2부분 프로브와 과량의 증폭 분자를 몇몇 연속 세척 단계를 통해 제거한다. 결합된 증폭 분자는 결합된 분자의 수에 대해 1차 관계를 나타내는 신호를 방출한다.
결합 프로브의 전형적인 변형은 비오티닐화 및 플루오레세인 부착을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 2차 신호 발생 시약(예, 효소)을 에피톰에 결합시킨다. 2차 신호 발생 성분은 여기에 직접 결합된 신호 분자를 보유할 수 있다. 또는 2차 신호 발생 성분은 또 다른 신호 단위의 침착을 활성화시키거나 또는 촉진할 수 있다. 다중 신호 단위를 사용하여 표적의 신호를 증폭시킬 수 있다.
덴드리머, 티라미드 등은 유전자 발현 분석용 cDNA를 증폭시키는 데 통상적으로 사용되는 증폭 분자의 일례이며, 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, LIMS(24)는 선택된 결합 프로브 및 하이브리드화 완충액을 피펫으로 옮기는 액체 분주기를 갖는 하이브리드화 스테이션(96)이다. 여러 하이브리드화 완충액, 예컨대 물 및 구연산나트륨 염수(SSC)가 허용가능하다. 대안적으로, 0.25 NaPO4, 4.5% SDS, 1 mM EDTA, 1 × SSC 또는 40% 포름아미드, 4 × SSC, 1% SDS와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다.
그 다음 하이브리드화 용액을 가열 카세트(220)의 경사면 상부(225)에 가한다(187). 가열 카세트(22)에서 기판(229)을 항온처리한다(189). 바람직한 구체예에서, 표적 결합 프로브, 기준 결합 프로브 및 임의의 형태 결합 프로브를 각 표적에 하이브리드화한 후에 하이브리드화 혼합물을 40∼65℃ 온도에서 4∼12시간 동안 가열 블록에서 항온처리한다(189). 하이브리드화 용액은 증폭 분자 또는 2차 신호 시약을 포함할 수 있거나, 또는 2차적으로 이들을 첨가할 수 있음에 주목해야 한다.
기판(229)을 하이브리드화 용액과 함께 항온처리(189)한 다음, 기판의 표면을 수회 세척(191)하여 프로브 증폭 분자 또는 2차 신호 시약과 같은 임의의 과량의 시약을 제거한다. 바람직한 구체예에서, 기판(229)을 먼저 세척(191)하고, 수 부피의 2 ×SSC, 0.2% SDS와 함께 55℃에서 10분 동안 항온처리(189)한다. 기판을 다시 실온에서 10분 동안 수 부피의 2 ×SSC로 세척한다. 최종 세척은 0.2 ×SSC로 10분 동안 실온에서 실시한다.
기판을 건조(197)하여 영상화를 촉진한다. 바람직한 구체예에서, 압축 질소를 가열 카세트의 상부 경사면에 집중시켜 기판을 건조한다. 모든 잔류 완충액이 가열 카세트에 이송되어 기판이 건조될 때까지 압축 질소 건조를 수분 동안 계속한다.
검출 스테이션(97)
검출 스테이션(97)은 상기 기판의 제1 및 제2 위치에서 지정 유전자 서열의 일부에 특이적인, 1 이상의 표지된 프로브로부터 발생한 신호를 검출하는 것과, 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 게놈 DNA 샘플에서 지정 유전자 서열을 검출하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 기판(229)을 검출 스테이션(97)으로 옮긴다. 기판(229)을 시판용 영상화 카세트, 예컨대 GSI 루모닉스(미국 매사츄세츠주 워터타운)에 적재하고, 영상화 카세트를 제조업자의 지시에 따라 사용된 마이크로어레이 영상기 GSI 루모닉스 5000(미국 매사츄세츠주 워터타운) 내로 적재한다. 기판(229)을 여기 에너지원에 노출시켜 신호 분자로부터 정량 신호(195)를 생성한다. 더욱 구체적으로, 기판 바코드를 스캔하고 LIMS(24)로 보고한다(120). 기판 표면을 3개 이상의 상이한 채널로 스캔하고 결과를 LIMS(24)에서 기록한다(120). 개개의 기판(229)은 스캔되어 저장 위치 바코드와 결합된 고유의 바코드를 보유할 것이다. 기준 결합 프로브, 표적 결합 프로브 및 경우에 따라 형태 프로브 신호를 기록하고 분석한다.
도 10에 있어서, LIMS(24)는 이제 결과 리포트(249)를 준비한다. 일부 계산을 LIMS(24)에서 실시한 후에 결과 리포트(249)로 보낸다. 바람직한 구체예에서, 이러한 계산은 샘플당 모두 3회 반복하여 평가한다. 표적 결합 프로브로 얻은 곡선의 기울기(정량화된 하이브리드화 강도/DNA ng)를, 각 개별 샘플에 대한 지정 대조군 프로브의 곡선의 기울기로 나눈다. 이를 유도율이라 한다. 그 다음 유도율을 비교하여 대조군의 유도율과 다른 복제물의 유도율에 대한 복제물의 근사도를 결정한다. 일단 유도율이 계산되면, 정성 및 정량 결과를 결과 리포트(249)로 보낸다. 실험적 정량 신호와 지정 대조군의 정량 신호 간의 1차 관계를 계산하여 샘플의 카피 수, 접합형 또는 모자이크 성질을 밝힌다. 동형접합성 개체에 대한 비율은 이형접합성 개체에 대한 비율의 2배여야 한다. 또한, 세포수는 분리 절차로부터 회수된 게놈 DNA의 양으로부터 결정한다.
이제 도 10을 참조하면, 샘플 결과 리포트(240)는 계정 등록(250), 웰 플레이트 등록 번호(들)(252), 대조군 샘플 위치(250) 및 지정 대조군의 유전자 특성규명(252)을 포함한다. 또한, 결과 리포트(249)는 웰 위치(254), 샘플 확인(256), 액체 레벨 감지(258), DNA 농도(260), 표적 서열(262), 프로브 서열(264), 신호 정량(266), 정성 결과(268), 접합형/카피 수(270), 보정전의 웰당 흡광도 판독(274), 보정 후 흡광도 판독(276), 분석된 추정 세포수(278), 카피 수 추정, 접합형 또는 모자이크 성질을 예측하는 지정 대조군 신호 강도에 대한 비교를 통한 정량 분석(270)을 포함할 수 있다. 결과 리포트(249)는 결과의 그림 파일(전자메일) 또는 화면(272)을 포함할 수 있다(272). 또한, 원격 사용자(1)의 요청시 최적화 및 서열 확인 품질 관리 데이타 및 에러 메세지로부터 모은 정보를 결과 리포트(249)에 포함시킨다. 원격 사용자(1)는 파일을 전송하거나 또는 파일이 전자적으로 통지되도록 선택할 수 있다. 또한, 원격 사용자(1)는 하드 카피가 우편 서비스를 통해 전달되도록 하는 선택권을 갖는다.
LIMS(24)가 결과 리포트(249)에 대한 모든 데이타를 축적하면, 결과 리포트는 원격 사용자(1)에게 보내진다(7). 바람직한 구체예에서, LIMS(24)는 리포트를 원격 연계(7)를 통해 원격 사용자(1)에게 전달하거나, 또는 웹 사이트(16)에서 결과를 보내거나 또는 전자 연계(7)를 통해 결과 리포트(249)를 보낼 수 있는 주문 관리자(22)에게 리포트를 전달한다. LIMS(24 224)는 6개월 동안 결과를 이용할 수 있고, 결과는 장기간 저장 디스켓 상에 기록되어 보관된다.
다른 구체예에서, 고효율 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 Taqman(등록상표)(미국 매사츄세츠주 웰슬레이의 퍼킨 엘머 인코포레이티드)와 같은 PCR 반응의 변형 또는 IDT(아이오와주 코랄빌)가 판매하는 분자 비이콘(beacon)을 자동화된 유전자이식 및 표적 돌연변이유발 스크리닝 실시예 사용할 수 있다. 사용자의 계정 등록, 작업 사정 및 샘플 확인 및 지정은 참작되는 동일한 인자 또는 등가의 인자로 만들 수 있다. 또한, 공급, 수송 추적, 샘플 추적, 품질 관리 및 결과 소프트웨어 구성을 유사한 수법으로 재현할 수 있다. PCR 반응을 이용하기 위한 변형은 주문 프로세스, 구체적으로 작업 사정에서 나타난 추가의 정보를 필요로 한다. 이러한 등가의 화학을 이용하려면 사용자는 반응 완충액, 마그네슘 농도, 프라이머 서열, 프라이머 농도, dNTP 농도, 사이클 조건 및 반응 부피와 같은 기준을 정해야 한다. 자동화된 액체 취급은 이들 변수를 조정하고 반응 완충액을 적절한 위치로 분주한다. 자동화된 시스템에서 샘플을 추적하면서 진공 매니폴드 분리, 미세입자 분리 또는 화학 추출을 통해 자동화된 방식으로 게놈 DNA를 분리할 수 있다. 분리된 포유동물 DNA를 IAS 게노마트론(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)와 같은 고효율 써머사이클러로 적재할 수 있다. 대안적으로, 화학적으로 처리된 유리, 플라스틱, 막 또는 임의의 조합과 같은 기판을 반응 기판로서 사용할 수 있다. PCR의 열 매개변수에 따라 가열 및 냉각하는 가열 블록에 이들 기판을 둘 수 있다. 액체 취급대에서 기판의 표면을 통해 또는 웰의 각 샘플에 적절한 반응 완충액을 첨가한다. 증폭 검출은 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동을 통해 염색할 수 있다. PCR 반응 과정에서 형광 또는 방사능표지된 dNTP를 도입하거나 또는 간접적인 염색법을 이용하여 검출을 정성/정량화할 수 있다.
대안적인 PCR 검출법은 Taqman(등록상표)(미국 매사츄세츠주 웰슬레이의 퍼킨 엘머 인코포레이티드) 프로브의 사용을 포함한다. Taqman(등록상표)(미국 매사츄세츠주 웰슬레이의 퍼킨 엘머 인코포레이티드) 프로브는 신호 발생 성분(리포터 염료) 또는 정상 조건 하에서 신호 발생 성분이 검출되지 않는 소광 성분(소광 염료)으로 구성된다. 올리고뉴클레오티드 Taqman(등록상표)(미국 매사츄세츠주 웰슬레이의 퍼킨 엘머 인코포레이티드) 프로브 서열은 PCR 앰플리콘에 존재하는 내부 표적 서열과 상동성이 있다. 앰플리콘에 대한 Taqman(등록상표)(미국 매사츄세츠주 웰슬레이의 퍼킨 엘머 인코포레이티드) 프로브의 특이적 하이브리드화 반응으로 신호 발생 성분으로부터 소광 성분을 분리할 수 있다. 방출된 신호 분자는 정량가능하다. 신호 강도는 결합된 Taqman(등록상표)(미국 매사츄세츠주 웰슬레이의 퍼킨 엘머 인코포레이티드) 프라이머의 수에 비례한다.
Taqman(등록상표)(미국 매사츄세츠주 웰슬레이의 퍼킨 엘머 인코포레이티드) 방법과 유사한 방법으로 비이콘(beacon) 기법이 있다. 분자 비이콘법은 단일 염기 변화를 구별할 수 있다. 프로브에는 신호 발생 성분(예, 형광 분자)과 소광 성분이 있다. 프로브가 상보 서열에 적절히 결합하면, 소광 성분이 제거되고 형광 분자가 검출가능하다.
다음 실시예는 예시를 위해 제공한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1- 유전자이식 스크리닝
원격 사용자(1)가 테스트 서비스를 주문하기 위해 스크리닝 실험실(20)용 웹 사이트(19)에 접근한다. 원격 사용자(1)는 스크리닝 실험실(20)이 이전에 구체적으로 할당한 계정 번호(31)를 입력한다. 원격 사용자(1)가 계정 등록(21)을 완료하면, 원격 사용자(1)에게 작업 사정 섹션(23)이 제공된다. 작업 사정 섹션(23)이 원격 사용자(1)에게 요구하는 제1 지시는, 샘플이 특성상 유전자이식인지 또는 표적 돌연변이유발인지를 확인하는 것이다.
이 실시예에서, 원격 사용자(1)는 테스트하고자 하는 샘플이 유전자이식(60) 특성이 있음을 지정한다. 원격 사용자(1)는 단 하나의 유전자이식 라인이 테스트되도록 지정한다(62). 테스트하고자 하는 지정 유전자 서열(61)은 "HUPPCA"이다. 그 다음 원격 사용자(1)는 유전자이식 샘플을 이 라인으로부터 스크리닝할 필요가 있음을 지정한다(62). 원격 사용자(1)는 검출하고자 하는 표적 유전자 서열(63)을 확인한다. 원격 사용자(1)는 프로브의 염기 서열(64)이 GCA AGG ACG CAA GGA AGC AGA G(서열 번호 30)라고 제시한다. 이는 표적 유전자 서열(63)에 상보적이다. 사용자가 지정한 프로브 서열을
5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC (서열 번호 31)의 결합 서열에 연결한다.
그 결과
5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC GCA AGG ACG CAA GGA AGC AGA G(서열 번호 32)의 2부분 프로브가 생긴다.
이 결합 서열은 시아닌 3(Cy3) 덴드리머용 역전사 효소 서열의 포획 팔(arm)에 특이적으로 결합한다.
원격 사용자(1)에게 도 6에 도시된 바와 같은 샘플 확인 및 지정 스크린이제공된다. 이 스크린은 적절한 방향으로 공급원 96 웰 플레이트의 영상을 나타낸다. 화면은 정확한 공급원 96웰 위치 내로 각 샘플을 구체적으로 지정하는 과정에서 사용자를 보조한다. 도 6에 도시된 바와 같이 원격 사용자의 샘플 각각을 연관시키고, 기록한 다음 공급원 플레이트의 특정 웰로 보낸다.
원격 사용자(1)는, 도 6에 도시된 바와 같이 적절한 샘플이 정확한 위치에 있는 공급원 웰 플레이트(2)를 적재한다. 지정 대조군의 성질에 관한 정보를 확인한다. 이 정보는, 알려진 것이 있다면 접합형 및 카피 수를 포함한다(90). 사용자는 제공된 동결건조된 용해물 시약을 탈이온수로 재구성한다. 사용자는 충분한 양의 용해물 완충액(4)을 피펫으로 공급원 웰 플레이트(2)의 각 웰 내로 옮겨 샘플을 덮는다. 공급원 웰 플레이트(2)를 차단층 메카니즘으로 밀봉한다. 추가의 구조 일체성을 보강하기 위해서, 공급원 웰 플레이트(2)를 경질의 뚜껑으로 밀봉한다. 공급원 웰 플레이트(들)(2)를 제공된 포장 및 수송 재료(17)로 적재한다. 포장물을 스크리닝 실험실로 보낸다(16).
포장물을 스크리닝 실험실(20)에서 수령하여 공급원 웰 플레이트(들)(2)를 제거하고 작업 스테이션(14)으로 적재한다. 모든 샘플이 개별적으로 보내지는 동안, 샘플은 추출되고 최적화된 게놈 DNA를 보유한다. DNA 양을 기록한다. 게놈 DNA 샘플과 지정 대조군 샘플을 광학적으로 평평한 유리 슬라이드에 놓고 기준 결합 프로브인
5'-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGG GCG CTTCTTATCTTCAGCCCCACC(서열 번호 33)와 하이브리드화시킨다.
2부분 프로브의 5'-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGG GCG 성분은 시아닌 5(Cy5) 덴드리머; 및
표적 결합 프로브
5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC GCA AGG ACG CAA GGA AGC AGA G(서열 번호 32) 및 증폭 분자(Cy3 및 Cy5 덴드리머)의 고유 포획 팔에 특이적으로 결합한다.
광학적으로 평평한 유리 슬라이드에 여기 에너지 레이저를 적용하고 정량가능한 데이타를 기록한다. 결과 리포트(249)를 형성하고 인터넷(7)을 통해 원격 사용자(1)에게 전송한다. 결과 리포트(249)는 계정 등록 정보(250), 웰 플레이트 번호(252), 유전자 특성규명(254), 웰 위치 샘플 확인(256), DNA 농도(260), 표적 서열(262), 프로브 서열(264), 신호 정량(266), 결과(268), 접합형/카피 수(270), 추정 세포수(278), 화면(272), 그래프 표시(280), 에러 메세지(274) 및 품질관리 데이타(274)를 포함한다.
실시예 2-표적 돌연변이유발
원격 사용자(1)가 테스트 서비스를 주문하기 위한 스크리닝 실험실(20)용 웹 사이트(19)에 접근한다. 원격 사용자(1)는 스크리닝 실험실(20)이 이전에 구체적으로 할당한 계정 번호(31)를 입력한다. 원격 사용자(1)가 계정 등록(21)을 완성하면, 원격 사용자(1)에게 작업 사정 섹션(23)이 제공된다. 작업 사정 섹션(23)이 원격 사용자(1)에게 요구하는 제1 지시는, 샘플이 특성상 유전자이식인지 또는 표적 돌연변이유발인지를 확인하는 것이다.
이 실시예에서, 원격 사용자(1)는 테스트할 샘플이 표적 돌연변이유발 성질(70)이 있음을 지정한다. 원격 사용자(1)는 단 하나의(71) 넉-아웃 라인(72) NSE-PPCA(뉴런 특이적 에놀라제)이 테스트되어야 한다고 지정한다. 넉-아웃 라인인 테스트하고자 하는 지정된 유전자 서열은 선별가능한 마커 히그로마이신(서열 번호 2)에 대한 것이다. 그 다음 원격 사용자(1)는 47 NSE-PPCA 샘플을 라인으로부터 스크리닝할 필요가 있음을 지정한다. 원격 사용자(1)는 검출하고자 하는 히그로마이신의 선별가능한 마커 표적 서열을 확인한다(74). 원격 사용자(1)는 이 선별가능한 마커가 Cre-lox 또는 FLP/FRT와 같은 재조합 기법으로 제거되지 않음(75)을 구체적으로 지시한다. 선별가능한 마커 표적 유전자 서열이 제공된다(63). CAG GAT TTG GGC AAC ATC TT(서열 번호 34)인 히그로마이신 프로브의 프로브 서열(64)을 지정한다. 원격 사용자(1)가 지정한 프로브 서열(64)을 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC(서열 번호 31)의 결합 서열에 연결한다.
이 결합 서열은 시아닌 3(Cy3) 덴드리머용 역전사 효소 서열의 포획 팔에 특이적으로 커플링한다.
원격 사용자(1)에게 샘플 확인 및 지정 스크린이 제공된다. 이 스크린은 도 6에 도시된 바와 같이 적절한 방향으로 공급원 웰 플레이트(2)의 영상을 나타낸다. 화면은 정확한 공급물 웰 플레이트(2) 위치 내로 각 샘플을 구체적으로 지정하는 과정에서 원격 사용자(1)를 보조한다. 원격 사용자(1)의 샘플 각각을 연관시키고, 기록한 다음 공급원 플레이트의 특정 웰로 보낸다. 사용자는 공급원 플레이트의 바코드로부터 등록 번호(3)를 확인한다.
원격 사용자(1)는, 도 6에 도시된 바와 같이 적절한 샘플이 정확한 위치에 있는 공급원 웰 플레이트(2)를 샘플 확인 섹션(25)에 적재한다. 지정 대조군의 성질에 관한 정보를 확인한다(90). 원격 사용자(1)는 제공된 동결건조된 용해물 시약을 탈이온수로 재구성한다. 사용자는 충분한 양의 용해물 완충액(4)을 피펫으로 공급원 플레이트(2)의 각 웰 내로 옮겨 샘플을 덮는다. 공급원 웰 플레이트(2)를 차단층 메카니즘으로 밀봉한다. 추가의 구조 일체성을 부가하기 위해서, 경질의 뚜껑으로 공급원 웰 플레이트(2)를 밀봉한다. 공급원 웰 플레이트(들)를 제공된 포장 및 수송 재료로 적재한다. 원격 사용자(1)는 수송 포장물(15)을 확인하고 스크리닝 실험실(20)로 수송한다(16).
포장물(15)을 스크리닝 실험실(20)에서 수령하여 공급원 웰 플레이트(들)(2)를 제거하고 작업 스테이션(14)으로 적재한다. 모든 샘플이 개별적으로 보내지는 동안, 샘플은 자동화된 방식으로 추출되고 최적화된 게놈 DNA를 보유하게 된다. DNA 양을 기록한다. DNA를 기판에 프린팅하고, 기준 프로브인
5'-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGG GCG CTTCTTATCTTCAGCCCCACC(서열 번호 35)와 하이브리드화시킨다.
2부분 프로브의 5'-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGG GCG 성분은 시아닌 5(Cy5) 덴드리머; 및
표적 결합 프로브
5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC CAG GAT TTG GGC AAC ATC TT(서열 번호 36) 및 증폭 분자(Cy3 및 Cy5 덴드리머)의 고유 포획 팔에 특이적으로결합한다.
광학적으로 평평한 유리 슬라이드에 여기 에너지 레이저를 적용하고 정량가능한 데이타를 기록한다. 결과 리포트(249)를 형성하고 인터넷(7)을 통해 원격 사용자(1)에게 전송한다. 결과 리포트(249)는 계정 등록 정보(250), 웰 플레이트 번호(252), 유전자 특성 규명(254), 웰 위치 샘플 확인(256), DNA 농도(260), 표적 서열(262), 프로브 서열(264), 신호 정량(266), 결과(268), 접합형/카피 수(270), 추정 세포수(278), 화면(272), 그래프 표시(280), 에러 메세지(274) 및 품질관리 데이타(274)를 포함한다.
실시예 3-진핵생물 게놈 DNA의 자성 입자 분리법
St. Jude Children's Hospital로부터 얻은 여러개의 마우스 꼬리로 테스트하였다. 샘플을 용해시켜 염색체 DNA를 비롯한 세포 내용물을 방출시켰다. 이 용해 완충액은 4 M 우레아, 0.1 M Tris-HCl(pH ~7.5), 180 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DDT , 415 mg의 프로테인아제 K 및 Rnase로 제조하였다. 이 샘플을 수송 중에 24시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 용해물은 원핵생물의 가공으로부터 얻은 클로닝된 DNA 인자가 없는 게놈 DNA를 함유하는 용액을 생성하였다. 게놈 DNA를 분리하였다. 용해물을 카르복실 말단의 산화철 입자에 결합시켰다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000, 0.02% 나트륨 아지드, 2.5 M NaCl을 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 상기 샘플을 실온에서 10분간 항온처리하였다. 샘플을 상청액이 투명해질 때까지 몇분간 자기장에 노출시켰다. 상청액을 흡출하여 폐기하였다. 미소입자를 세척하고 70% 에탄올 및 30% 탈이온수로 재현탁시켜 염을 제거하였다. 샘플을 상청액이투명해질 때까지 자기장에 노출시켰다. 이어서 상청액을 흡출하여 폐기하였다. 에탄올 세척을 반복하였다. 미소입자들을 수분간 공기 건조하였다. 미소 입자를 0.01 M Tris(pH 7.4), 0.02% 나트륨 아지드 중에 재현탁시켰다. Tris-미소입자 용액을 80℃에서 수분간 항온처리하였다. 샘플을 상청액이 투명해질 때까지 자기장에 재노출시켰다. 상청액을 흡출하여 깨끗한 튜브에 담아두었다. 게놈 DNA의 회수율을 측정하기 위하여, 피코그린 정량 분석을 수행하였다. 피코그린(Molecular Probes, Eugene, OR)은 두가닥 DNA에만 결합하는 시판 염료이다. 샘플을 큐벳에 장입하고 480 nm에서 여기시켰다. 형광 방출 강도를 형광분광계를 사용하여 520 nm에서 측정하고 DNA 농도의 함수로 도표를 작성하였다.
마우스 꼬리 조직의 게놈 DNA
1A 450 ng
1B 430 ng
2 584 ng
3 2070 ng
4 1944 ng
상기 결과는 조직이나 세포의 포유동물 게놈 DNA가 실온에서 성공적으로 용해되고 게놈 DNA는 자성 입자로 회수된다는 것을 나타낸다.
실시예 4-포유동물 게놈 DNA의 고정, 하이브리드화, 검출
차이점을 평가하기 위하여, 그리고 마우스 게놈 DNA가 기판에 결합하고 프로브에 하이브리드화되고 정량가능한 신호를 가질 수 있도록 하는 최적 조건을 결정하기 위하여, 수회의 반복된 검출을 수행하였다. 실험시에 마우스 게놈 DNA는 초음파 처리된 것과 초음파 처리되지 않은 것인 2가지의 다른 유형이 있었다. 마우스 게놈 DNA의 이들 유형 모두는 4종의 상이한 완충액으로 일련의 희석액을 만드는 데 사용되었다. 마우스 게놈 DNA 유형 모두를 538 ng/㎕ 내지 17 ng/㎕의 6개의 일련의 희석액으로 만들었다. 마우스의 모든 종에 편재하는 7개의 내생 유전자 서열을 대조군으로 제공하기 위하여 PCR로 증폭하였다.
마우스 게놈에서 자연적으로 발생하는 7개의 마우스 마커를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이들 마커는 미지 게놈 DNA 원료에 대한 대조군으로서 작용한다. 마커는 다음과 같다.
32.MMHAP9FLC5.seq.53F ATCACAAGTACTGGGAGAGG(서열 번호:6)
MHAa67g1.seq.120F GTCTCAGAGGTTAACTCACC(서열 번호:7)
D9Mit211.1.38 TTCTTATCTTCAGCCCCACC(서열 번호:8)
X61434.129F ATAACACGGTGTGCACCACG(서열 번호:9)
U11075.95F TCCCTTCCTGTTGACTACAG(서열 번호:10)
Z49987.38F TACCCACACGGGCTTAAAAC(서열 번호:11)
32.MMHAP9FLC5.seq.53R CACTGCCAGTGTGTTTTCAC(서열 번호:12)
PCR 단편은 아가로스 겔상에서 분리하고 앰플리콘은 Hawkins의 '628 특허에서 기술된 과정에 따라 자성 입자를 이용하여 분리하였다. PCR 앰플리콘 DNA의 구체적 농도를 결정하기 위하여 정량 분석(Molecular Probes, Eugene, OR)을 이용하였다. 기지의 농도를 갖는 PCR 앰플리콘 대조군의 일련의 희석액 및 초음파 처리된 원료 내생 마우스 게놈 DNA와 초음파 처리되지 않은 원료 내생 마우스 게놈 DNA 둘다의 일련의 희석액이 기판 위에 프린트되었다. 앰플리콘(증폭된 DNA의 유전자 서열 부분에 대한 일반 명칭)과 게놈 DNA를 공유 결합 및/또는 비공유결합을 통하여기판에 고정시켰다.
대조군의 정량 결과
웰# 겔 레인 PG5_원액 PG5, ng/㎕ ng 수득량 ug 수득량 앰플리콘
A1 1 0 0.020434
A2 3 51.6 6.2 2976 2.98 U11075.95
A3 5 26.0 3.1 1502 1.50 q.120F
A4 7 33.6 4.0 1940 1.94 D9Mi211.1.38
47.mmhap5flh
A5 9 20.3 2.5 1177 1.18 5.seq.85
A6 11 28.5 3.4 1648 1.65 LC5.seq.53F
A7 13 22.5 2.7 1305 1.31 Z49987.38F
A8 15 11.2 1.4 655 0.65 X61434.129F
A9 17 15.4 1.9 894 0.89 Actb-pA
대조군 게놈 DNA 신호를 가지는 일련의 희석액의 결과
PCR 앰플리콘을 기판 위에 프린트하고, 프로브 첨가하고, 검출하는 것에 대해서는 문헌에 잘 기록되어 있다. PCR 앰플리콘은 일반적으로 유전자 발현 작업을 위하여 사용된다. 이들 PCR 앰플리콘 대조군은 마우스 게놈 DNA(538 ng/㎕ 내지 17 ng/㎕)의 농도 구배와 동등한 농도 구배로 4종의 상이한 완충액에서 6개의 일련의 희석액으로 만들어졌다. PCR 앰플리콘 대조군의 일련의 희석액 뿐만 아니라 초음파 처리된 마우스 게놈 DNA와 초음파 처리되지 않은 마우스 게놈 DNA의 일련의 희석액을 6종의 상이한 기판 위에 함께 프린트하였다. 이들 기판은 2종의 상이한 프로브, 즉 덴드리머와 함께 증폭되는 FAM 프로브(직접 표지함) 및 2부분 프로브로 프로빙하였다.
일련의 희석액을 담고 있는 웰 플레이트가 다음과 같이 형성되었다.
초음파 처리된 원핵생물 및 진핵생물 DNA와 초음파 처리되지 않은 원핵생물 및 진핵생물 DNA 둘다를 4종의 상이한 완충액에서 상이한 농도로 현탁시켰다. 4종의 완충액은 3 x SSC, 50% DMSO, 5.5 M NaSCN을 포함하고, 네번째 완충액은 시판되는 텔켐(Tel-Chem, 캘리포니아주에 소재한 Sunnyvale) 프린팅 완충액이다. 마우스 게놈 DNA는 반씩 6번 희석되었다(538 ng/㎕, 269 ng/㎕, 135 ng/㎕, 68 ng/㎕, 34 ng/㎕ 및 17 ng/㎕). 또한, PCR 대조군의 일련의 희석액을 생성하였다. 대조군 희석액은 이미 증폭되어 있는 내생 마우스 유전자의 PCR 앰플리콘으로부터 만들었다. PCR 대조군은 다음과 같이 만들어졌다: 처음 4개의 대조군인 일련의 희석액을 3 x SSC 완충액, 5.5 M NaSCN, 50% DMSO 및 텔켐(캘리포니아주에 소재한 Sunnyvale) 시판 완충액으로 만들었다. PCR 앰플리콘 DNA의 시작 농도는 538 ng/㎕이었다. PCR 앰플리콘의 6종의 희석액(538 ng/㎕, 269 ng/㎕, 135 ng/㎕, 68 ng/㎕, 34 ng/㎕ 및 17 ng/㎕)이 있었다. 또한, 다섯번째와 여섯번째 대조군은 별개의 웰 플레이트 상에서 출발 양을 538 ng/㎕으로 하여 희석하였다. 다시, 이들을 3 x SSC, 5.5 M NaSCN, 50% DMSO 및 텔켐(캘리포니아주에 소재한 Sunnyvale) 시판 완충액에 현탁시켰다.
하기의 2부분 프로브가 사용되었다.
AAA32.MMHAP9FLC5.seq.53F 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGCCATCACAAGTACTGGGAGAGG (서열 번호:19)
AAAMHAa67g1.seq.120F 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGCCGTCTCAGAGGTTAACTCACC (서열 번호:20)
AAAD9Mit211.1.38 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGCCTTCTTATCTTCAGCCCCACC(서열 번호:21)
AAAX61434.129F 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGCCATAACACGGTGTGCACCACG (서열 번호:22)
AAAU11075.95F 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGCCTCCCTTCCTGTTGACTACAG (서열 번호:23)
AAAZ49987.38F 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGCCTACCCACACGGGCTTAAAAC (서열 번호:24)
AAA32.MMHAP9FLC5.seq.53R 5'-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGCCCACTGCCAGTGTGTTTTCAC (서열 번호:25)
FAM 변형된 프로브(직접 표지함)가 사용되었다.
CCC32.MMHAP9FLC5.seq.53F ATCACAAGTACTGGGAGAGG (서열 번호:37)
CCCMHAa67g1.seq.120F GTCTCAGAGGTTAACTCACC (서열 번호:38)
CCCD9Mit211.1.38 TTCTTATCTTCAGCCCCACC (서열 번호:39)
CCCX61434.129F ATAACACGGTGTGCACCACG (서열 번호:40)
마우스 게놈 DNA의 초음파 처리
마우스 게놈 DNA를 혼 소니케이터(horn sonicator)를 이용하여 고정된 세팅으로 5분간 초음파 처리하였다.
어레이(array) 구성
어레이 구성은 다음과 같다. 6개의 팔레트 각각은 어레이 장치를 위한 14개의 슬라이드를 보유하였다. 각 팔레트에는 우측 상단의 4분역을 제외하고 하나의 포맷의 슬라이드를 담았다. 각 팔레트에는 하나의 포맷의 슬라이드를 담았다. 좌측상단의 4분역 팔레트에는 14개의 수퍼 알데히드 슬라이드를 담았다. 중간 상단의 4분역 팔레트에는 14개의 슐리허 슈엘(Schliecher Schuell, Dassel, 독일) 슬라이드를 담았다. 우측 상단의 4분역에는 9개의 수퍼 아민 슬라이드와 5개의 시그마 슬라이드를 담았다. 하단 좌측의 사분역에는 14개의 수퍼 아민 슬라이드를 담았다. 중간 하단의 4분역에는 폴리 리신 슬라이드를 담았고 우측 아래쪽 4분역에는 아미노 실린화된 슬라이드(SCA 슬라이드)를 담았다.
384 웰 플레이트를 어레이 장치 위에 배치하였다. 스플릿-핀 팁(split-pin tip)을 사용하여 각 기판 위에 정확한 양의 샘플을 정확하게 넣기 위하여 어레이 장치를 조정하였다. 이 어레이 장치는 84개의 슬라이드에 걸쳐서 384 웰 플레이트의 내용물을 플레이트 플레이팅하였다. 이 과정은 전체 프린팅을 완료하기 위하여 약 40분이 소요되었다. 프린팅 후에, 니트로셀룰로스 막이 손상되었기 때문에 슐리허 슈엘(Dassel, 독일)에서 입수한 패스트 슬라이드(Fast Slides, 등록 상표)를 제거하였다.
DNA 교차결합
이들 슬라이드는 알데히드 슬라이드를 제외하고 1200 μJ에서 UV 교차결합을 하였다. 모든 슬라이드를 5분간 끓여서 기판 표면 위에서 두가닥 DNA를 분리하였다. 기판의 비등은 슬라이드 받침대와 물에서 일어났다. 기판을 물에서 5분간 끓인 후에, 이들을 100% 에탄올에 1분간 담궈서 슬라이드의 건조를 촉진시켰다.
FAM 프로브를 재현탁시켜서 각 프로브 종류의 원액을 만들었다. 279 mM/279 ㎕는 1 μM과 같다. 각 원료는 1 μM이었다.
직접 표지된 FAM 프로브를 하나의 하이브리드화 완충액에 모두 혼합(다중화)하였다. 이 하이브리드화 완충액을 상이한 기판에 대하여 도포하였다. 프로브 1 μM 또는 30 ㎕ 중의 0.3 pM. 하이브리드화 완충액은 다음과 같이 제조하였다. 각 기판에 대해 용액 약 30 ㎕가 요구되었다. 하이브리드화 완충액의 총 부피는 180 ㎕이었다. 이 하이브리드화 완충액은 20 x SSC 18 ㎕, 프로브-1 0.2 ㎕, 프로브-2 0.2 ㎕, 프로브-3 0.2㎕, 프로브-4 0.2㎕, 10% SDS 1.2 ㎕, BSA 6 ㎕, 물 154 ㎕을 포함하며, 이 완충액의 총량은 180 ㎕이다. 전통적으로 FAM은 높은 백그라운드와 낮은 신호를 갖는다는 점에 주목해야 한다. FAM 하이브리드화 완충액을 적절한 혼합을 위해 수초간 볼텍싱한 후에 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)에서 수초간 회전시켰다. FAM 혼합물을 수퍼아민 슬라이드 012320, 폴리리신 슬라이드 012370, 시그마 슬라이드 012800, 수퍼알데히드 기판 012850 및 CSA 기판 012440에 도포하였다. 하이브리드화 완충액 30 ㎕을 상기 슬라이드에 도포하였다. 이어서 하이브리드화 완충액을 포함하는 기판을 슐리허 슈엘(Dassel, 독일)로부터 입수한 커버슬립(coverslip)으로 덮고 슬라이드 커버 아래로부터 불량한 하이브리드화를 초래할 수 있는 공기 방울을 제거하도록 조작하였다. 슬라이드가 마르지 않게 하기 위하여 상기 기판을 물수건을 넣은 하이브리드화 챔버내에 놓았다. 상기 챔버를 45.1℃의 항온기에 30분간 놓아두었다. 기판 표면 위의 화학기를 적절히 가리기 위하여 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하였다. 하이브리드화 과정이 완료된 후에, 상기 슬라이드를 1% SDS를 포함하는 2 x SSC로 약 5분간 세척하였다. 상기 슬라이드를 2 x SSC로 5분간 더 세척하였다. 이어서, 슬라이드를 0.6 x SSC로 5분간 세척한 후100% 에탄올로 세척하였다. FAM 슬라이드는 프로빙 후 7일째에 상이 만들어졌고 검출가능한 신호가 정량될 수 있었다.
바람직한 구체예에서, 표 7에서 나타낸 바와 같이 2부분 프로브를 모두 하나의 하이브리드화 완충액에 혼합하였다. 이 하이브리드화 완충액을 상이한 기판에 대하여 도포하고 항온처리하였다. 이어서 시아닌 3(Cy3) 덴드리머를 이용하여 상기 프로브에 결합시켰다. 도 11을 참고하여 보면, Y 축 282는 표지된 프로브의 형광 강도를 나타내고, X축 284는 샘플 확인 슬라이드이다. 하나의 슬라이드로부터 얻은 데이타는 도 11에 나타낸 결과의 그래프를 표현하는 데 사용되었다. 상기 슬라이드를 스캔하여 정량가능한 데이타를 기록하였다. 도 11은 게놈 DNA가 마이크로어레이 영상기를 사용하여 검출될 수 있다는 것을 나타낸다.
보다 구체적으로, 상기 결과는 표 10에 기재되어 있다.
초음파 처리된 마우스 게놈 DNA와 초음파 처리되지 않은 마우스 게놈 DNA의 PCR 대조군에 상대적인 정량 결과
마우스게놈 PCR대조군 마우스게놈 PCR대조군
초음파 처리된 것3 x SSC #1 3 x SSC 초음파 처리되지 않은 것3 x SSC #5 3 x SSC
Cy3 웰 Cy3 웰 Cy3 웰 Cy3 웰
덴드리머 레벨 삽입됨 덴드리머 레벨 삽입됨 덴드리머 레벨 삽입됨 덴드리머 레벨 삽입됨
1608.88 A01 913.87 A13 12717 I01 1029.33 I13
1829.92 A01 1418.65 A13 15406.2 I01 532.73 I13
10838.3 A02 1442.54 A14 27048.1 I02 1165.44 I14
17623.8 A02 1683.92 A14 24489.3 I02 1499.83 I14
1499.88 A03 971.92 A15 14616.8 I03 513.25 I15
1346.29 A03 781.81 A15 19646.3 I03 868.75 I15
694.9 A04 637.83 A16 1207.77 I04 595.54 I16
1481.81 A04 496.44 A16 999.29 I04 468.33 I16
5819.92 A05 741.6 A17 9708.62 I05 738.31 I17
6805.9 A05 1056.92 A17 9224.71 I05 607.25 I17
1481.29 A06 719.58 A18 745.94 I06 1118.46 I18
1629.08 A06 1244.08 A18 1431.6 I06 891.85 I18
11949.7 A07 32821.2 A19 6173.75 I07 14934.1 I19
9454.98 A07 34354.4 A19 6054.54 I07 15255.2 I19
16005.6 A08 12853.5 A20 23767.1 I08 33108.4 I20
21630 A08 4668.19 A20 17812.3 I08 31512.9 I20
11463.3 A09 1513.67 A21 3185.6 I09 18818.8 I21
10900.2 A09 1343.58 A21 3039.54 I09 22902.9 I21
4657.04 A10 4713.79 A22 3636.42 I10 15394.6 I22
5670.4 A10 2990.83 A22 4685.83 I10 24232.1 I22
10906.7 A11 633.38 A23 8357.56 I11 1493.71 I23
9271.25 A11 805.77 A23 5246.52 I11 13973.6 I23
713.48 A12 1075.42 A24 1381.31 I12 14037 I24
738.46 A12 904.88 A24 2326.31 I12 16366.9 I24
이 결과는 초음파 처리된 게놈 DNA나 초음파 처리되지 않은 게놈 DNA 둘 중의 어느 것이나 광학적으로 평평한 기판에 고정시켰을 때 기록가능한 신호를 생성하고 마이크로어레이 영상기로 판독될 수 있음을 나타낸다.
본 발명을 바람직한 구체예와 바람직한 용도에 대하여 설명하고 예시하였지만, 본 발명에 가해질 수 있는 변형이나 변경은 본 발명의 전체 범위에 속하는 것이기 때문에 그들에 한정되지는 않는다.

Claims (195)

  1. (a) 게놈 DNA를 기판 위에 침착시키는 단계;
    (b) 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 첨가하는 단계; 및
    (c) 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하여 게놈 DNA 샘플 중의 상기 지정 유전자 서열을 검출하는 단계
    를 포함하는 게놈 DNA 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지정 게놈 서열이 유전자이식 삽입체인 것이 특징인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 선별가능한 마커인 것이 특징인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 선별가능한 마커는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 1 이상의 프로브는 표적 유전자 서열과 증폭 분자에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 상기 기판에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 기준 유전자 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 상기 기판 위에 침착시키기 전에 상기 게놈 DNA와 함께 형태 대조군을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 형태 대조군은 람다 DNA인 것이 특징인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 기판이 유리인 것이 특징인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 기판이 플라스틱인 것이 특징인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 기판이 막인 것이 특징인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 기판이 상기 게놈 DNA와 결합하는 화학적 부위로 작용기화되어 있는 것이 특징인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 게놈 DNA가 자외선 가교에 의해 상기 기판 위에 고정되는 것이 특징인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 게놈 DNA가 가열에 의해 상기 기판 위에 고정되는 것이 특징인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 기판은 상기 게놈 DNA를 고정시키기에 충분한 수의 알데히드기를 갖는 광학적으로 평평한 유리 슬라이드인 것이 특징인 방법.
  19. 게놈 DNA 샘플과 지정 대조군 게놈 DNA 샘플을 비교하여 게놈 DNA 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계;
    (b) 상기 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계;
    (c) 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계;
    (d) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및
    (e) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 상기 게놈 DNA 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 유전자이식 삽입체인 것이 특징인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 선별가능한 마커인 것이 특징인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 선별가능한 마커는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 1 이상의 프로브는 표적 유전자 서열과 증폭 분자에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  26. 제19항에 있어서, 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 상기 샘플에 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 표지된 프로브를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 상기 1 이상의 프로브는 상기 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 상기 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어진 것이 특징인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 기준 유전자 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 것이특징인 방법.
  29. 제19항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 상기 기판 위에 침착시키기 전에 상기 게놈 DNA와 함께 형태 대조군을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 형태 대조군이 람다 DNA인 것이 특징인 방법.
  31. 제19항에 있어서, 상기 기판이 유리인 것이 특징인 방법.
  32. 제19항에 있어서, 상기 기판이 플라스틱인 것이 특징인 방법.
  33. 제19항에 있어서, 상기 기판이 막인 것이 특징인 방법.
  34. 제19항에 있어서, 상기 기판이 상기 게놈 DNA와 결합하는 화학적 부위로 작용기화되어 있는 것이 특징인 방법.
  35. 제19항에 있어서, 상기 게놈 DNA가 자외선 가교에 의해 상기 기판 위에 고정되는 것이 특징인 방법.
  36. 제19항에 있어서, 상기 게놈 DNA가 가열에 의해 상기 기판 위에 고정되는 것이 특징인 방법.
  37. 제19항에 있어서, 상기 기판은 상기 게놈 DNA를 고정시키기에 충분한 수의 알데히드기를 갖는 광학적으로 평평한 유리 슬라이드인 것이 특징인 방법.
  38. 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계;
    (b) 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (c) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계;
    (d) 상기 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계;
    (e) 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계;
    (f) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및
    (g) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 상기 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 자성 입자를 이용하여 세포 잔해물로부터 분리하는 것이 특징인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 자성 입자를 이용하여 세포 잔해물로부터 분리하고, 이 방법은 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 약 100 bp 내지 1 kb의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 자성 입자를 이용하여 세포 잔해물로부터 분리하고, 이 방법은 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 평균 크기 약 500 bp의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 용해 완충액은 원격 사용자로부터 스크리닝 실험실로 밤새 운송되는 중에 상기 샘플을 용해시키는 구성성분으로부터 형성되는 것이 특징인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 상기 용해 완충액은 4 M 우레아, 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5), 180 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DDT 및 415 mg의 프로테인아제 K 및 Rnase로 구성되는 것이 특징인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 웰 플레이트의 웰내의 상기 샘플과 상기 지정 대조군 샘플을 덮도록 상기 원격 사용자가 상기 샘플과 상기 지정 대조군 샘플에 충분한 양의 상기 용해 완충액을 첨가하는 것이 특징인 방법.
  45. 제38항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  46. 제38항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 유전자이식 삽입체인 것이 특징인 방법.
  47. 제38항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 선별가능한 마커인 것이 특징인 방법.
  48. 제38항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 넉인(knock-in)인 것이 특징인 방법.
  49. 제38항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 넉아웃(knock-out)인 것이 특징인 방법.
  50. 제38항에 있어서, 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 프로브는 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  53. 제38항에 있어서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 상기 샘플에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 상기 1 이상의 프로브는 상기 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 상기 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어진 것이 특징인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 기준 유전자 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  56. 제38항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 상기 기판 위에 침착시키기 전에 상기 게놈 DNA와 함께 형태 대조군을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 형태 대조군이 람다 DNA인 것이 특징인 방법.
  58. 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계;
    (b) 자성 입자를 이용하여 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (c) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계;
    (d) 상기 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계;
    (e) 상기 지정 게놈 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계;
    (f) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및
    (g) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 상기 조직 샘플 중의 상기 지정 유전자 서열을 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 약 100 bp 내지 1 kb의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 평균 크기 약 500 bp의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 용해 완충액은 원격 사용자로부터 스크리닝 실험실로 밤새 운송되는 중에 상기 샘플을 용해시키는 구성성분으로부터 형성되는 것이 특징인 방법.
  62. 제58항에 있어서, 상기 용해 완충액은 4 M 우레아, 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5), 180 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DDT 및 415 mg의 프로테인아제 K 및 Rnase로 구성되는 것이 특징인 방법.
  63. 제58항에 있어서, 웰 플레이트의 웰내의 상기 샘플과 상기 지정 대조군 샘플을 덮도록 상기 원격 사용자가 상기 샘플과 상기 지정 대조군 샘플에 충분한 양의 상기 용해 완충액을 첨가하는 것이 특징인 방법.
  64. 제58항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  65. 제58항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 유전자이식 삽입체인 것이 특징인 방법.
  66. 제58항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 선별가능한 마커인 것이 특징인 방법.
  67. 제58항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 넉인(knock-in)인 것이 특징인 방법.
  68. 제58항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 넉아웃(knock-out)인 것이 특징인 방법.
  69. 제58항에 있어서, 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 프로브는 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  72. 제58항에 있어서, 기판 위의 제1 위치와 제2 위치에 있는 상기 샘플에 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 표지된 프로브를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 상기 1 이상의 프로브는 상기 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 상기 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어진 것이 특징인 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 기준 유전자 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  75. 제58항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 상기 기판 위에 침착시키기 전에 상기 게놈 DNA와 함께 형태 대조군을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 형태 대조군이 람다 DNA인 것이 특징인 방법.
  77. 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 비교하여 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계;
    (b) 자성 입자를 이용하여 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (c) 상기 지정 유전자 서열의 검출을 용이하게 하기 위해 게놈 DNA 농도를 조절하는 단계;
    (d) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계;
    (e) 상기 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계;
    (f) 상기 지정 게놈 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계;
    (g) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및
    (h) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 상기 조직 샘플 중의 지정 유전자 서열을 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 약 100 bp 내지 1 kb의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 평균 크기 약 500 bp의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  80. 제77항에 있어서, 상기 용해 완충액은 원격 사용자로부터 스크리닝 실험실로 밤새 운송되는 중에 상기 샘플을 용해시키는 구성성분으로부터 형성되는 것이 특징인 방법.
  81. 제77항에 있어서, 상기 용해 완충액은 4 M 우레아, 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5), 180 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DDT 및 415 mg의 프로테인아제 K 및 Rnase로 구성되는 것이 특징인 방법.
  82. 제77항에 있어서, 상기 용해 완충액은 상기 원격 사용자에 의해 상기 샘플에 첨가되는 것이 특징인 방법.
  83. 제77항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 유전자이식 삽입체인 것이 특징인 방법.
  84. 제77항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 선별가능한 마커인 것이 특징인 방법.
  85. 제77항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  86. 제77항에 있어서, 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 프로브는상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  88. 제86항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  89. 제77항에 있어서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 위치와 제2 위치에 있는 샘플에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 상기 1 이상의 프로브는 상기 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어진 것이 특징인 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 기준 유전자 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  92. 제77항에 있어서, 상기 자성 입자는 1 미크론의 철 코어 카르복실화된 입자인 것이 특징인 방법.
  93. 제77항에 있어서, 상기 기판 위에 침착시키기 전의 상기 DNA 농도는 17∼250 ng/㎕의 유체인 것이 특징인 방법.
  94. 제77항에 있어서, 상기 기판 위에 침착시키기 전의 상기 DNA 농도는 12.5∼500 ng/㎕의 유체인 것이 특징인 방법.
  95. 제77항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 상기 기판 위에 침착시키기 전에 상기 게놈 DNA와 함께 형태 대조군을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 형태 대조군이 람다 DNA인 것이 특징인 방법.
  97. 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 비교하여 조직 샘플을 지정 유전자 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 이 스크리닝 방법은 1 이상의 표지된 표적 결합 프로브와 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브를 이용하고,
    (a) 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계;
    (b) 자성 입자를 이용하여 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플의세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (c) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계;
    (d) 상기 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제2 위치에 침착시키는 단계;
    (e) 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계;
    (f) 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계;
    (g) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계;
    (h) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 있는 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및
    (i) 상기 기판 위의 상기 제1 위치와 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 샘플을 상기 지정 유전자 서열에 대해 스크리닝하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 1 이상의 표지된 표적 결합 프로브가 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  99. 제97항에 있어서, 상기 1 이상의 표지된 표적 결합 프로브가 유전자이식 삽입체의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  100. 제97항에 있어서, 상기 1 이상의 표지된 표적 결합 프로브가 재조합 변형체 또는 이의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  101. 제97항에 있어서, 상기 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브가 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  102. 제97항에 있어서, 상기 기준 유전자 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  103. 제97항에 있어서, 기준 결합 프로브는 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  104. 제97항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 선별가능한 마커인 것이 특징인방법.
  105. 제97항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 유전자이식 삽입체인 것이 특징인 방법.
  106. 제97항에 있어서, 상기 표지는 직접적인 것이 특징인 방법.
  107. 제97항에 있어서, 표지는 간접적인 것이 특징인 방법.
  108. 제97항에 있어서, 상기 1 이상의 표지된 표적 결합 프로브는 상기 표적 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  109. 제106항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  110. 제106항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  111. 제97항에 있어서, 상기 1 이상의 표지된 기준 결합 프로브는 상기 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어진 것이 특징인 방법.
  112. 제109항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  113. 제109항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  114. 조직 샘플과 지정 대조군 조직 샘플을 비교하여 조직 샘플을 지정 유전자 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 게놈 DNA를 포함하는 상기 조직 샘플은 원격 사용자에 의해 스크리닝 실험실로 보내지고,
    (a) 용해 완충액을 원격 사용자에게 제공함으로써 조직 샘플로부터 게놈 DNA의 추출을 용이하게 하는 단계;
    (b) 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플을 충분한 양의 상기 용해 완충액으로 처리하여 게놈 DNA를 포함하는 세포 잔해물을 얻는 단계;
    (c) 상기 용해 완충액 중의 상기 조직 샘플을 상기 원격 사용자로부터 상기 스크리닝 실험실로 송달하는 단계;
    (d) 상기 스크리닝 실험실에서 원격 사용자로부터 용해된 조직 샘플을 수령하는 단계;
    (e) 자성 입자를 이용하여 상기 조직 샘플과 상기 지정 대조군 조직 샘플의 세포 잔해물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (f) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 기판 위의 제1 위치에 침착시키는 단계;
    (g) 상기 지정 대조군 샘플로부터의 게놈 DNA를 상기 기판 위의 제2 위치에침착시키는 단계;
    (h) 상기 지정 게놈 서열의 일부분에 대해 특이적인 1 이상의 표지된 프로브를 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치에 첨가하는 단계;
    (i) 상기 기판 위의 상기 제1 및 제2 위치에 있는 상기 지정 유전자 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 1 이상의 표지된 프로브로부터 나오는 신호를 검출하는 단계; 및
    (j) 상기 기판 위의 제1 및 제2 위치로부터 나오는 신호를 비교하여 상기 조직 샘플을 상기 지정 유전자 서열에 대해 스크리닝하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  115. 제114항에 있어서, 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 약 100 bp 내지 1 kb의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  116. 제114항에 있어서, 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 평균 크기 약 500 bp의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  117. 제114항에 있어서, 상기 용해 완충액은 원격 사용자로부터 스크리닝 실험실로 밤새 운송되는 중에 상기 샘플을 용해시키는 구성성분으로부터 형성되는 것이특징인 방법.
  118. 제114항에 있어서, 상기 완충액은 4 M 우레아, 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5), 180 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DDT 및 415 mg의 프로테인아제 K 및 Rnase로 구성되는 것이 특징인 방법.
  119. 제114항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 선별가능한 마커인 것이 특징인 방법.
  120. 제114항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열이 유전자이식 삽입체인 것이 특징인 방법.
  121. 제114항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  122. 제114항에 있어서, 자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 약 100 bp 내지 1 kb의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  123. 제114항에 있어서, 상자성 입자로 상기 게놈 DNA를 분리한 후 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하여 평균 크기 약 500 bp의 게놈 DNA 단편을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  124. 제114항에 있어서, 상기 기판은 광학적으로 평평한 유리 슬라이드인 것이 특징인 방법.
  125. 제114항에 있어서, 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 상기 프로브는 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  126. 제125항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  127. 제125항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  128. 제114항에 있어서, 상기 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 상기 프로브는 상기 기준 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역으로 이루어진 것이 특징인 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 증폭 분자는 덴드리머인 것이 특징인 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 증폭 분자는 티라미드인 것이 특징인 방법.
  131. 제114항에 있어서, 상기 기판 위에 1∼130,000개의 게놈 DNA 반점이 침착되는 것이 특징인 방법.
  132. 제114항에 있어서, 상기 자성 입자는 1 미크론의 철 코어 카르복실화된 입자인 것이 특징인 방법.
  133. 제114항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 상기 기판 위에 침착시키기 전에 상기 게놈 DNA와 함께 형태 대조군을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  134. 제133항에 있어서, 상기 형태 대조군이 람다 DNA인 것이 특징인 방법.
  135. 원격 사용자에 의해 스크리닝 실험실로 보내진 1 이상의 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 원격 사용자는 전자 통신 연계를 통해 상기 스크리닝 실험실과 공급자에게 스크리닝 매개변수를 제공하고,
    (a) 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실로 접근 요청을전송하는 단계;
    (b) 상기 스크리닝 실험실이 상기 스크리닝 매개변수를 비롯한 접근 가능 응답을 전자 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자에게 전송하는 단계;
    (c) 상기 원격 사용자가 스크리닝 매개변수를 선택하는 단계;
    (d) 상기 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 상기 스크리닝 실험실로 선택된 스크리닝 매개변수 선택사항을 전송하는 단계;
    (e) 상기 스크리닝 실험실이 상기 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하는 단계;
    (f) 상기 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 의뢰서를 공급자에게 전달하여 선택된 스크리닝 매개변수에 적합한 프로브를 얻는 단계;
    (g) 상기 실험실이 상기 프로브를 수령하는 단계;
    (h) 상기 원격 사용자가 상기 샘플을 상기 스크리닝 실험실로 송달하는 단계;
    (i) 상기 선택된 스크리닝 매개변수에 따라 상기 샘플을 스크리닝하여 데이타를 얻는 단계; 및
    (j) 전자 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자에게 상기 데이타를 전송하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 전자 통신 연계는 인터넷인 것이 특징인 방법.
  137. 제135항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  138. 제135항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 티라미드에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  139. 제135항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 덴드리머에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  140. 제135항에 있어서, 상기 스크리닝 실험실에 의해 1일에 2,000개 이상의 샘플이 스크리닝되는 것이 특징인 방법.
  141. 제135항에 있어서, 상기 공급물은 용해 완충액을 포함하고, 이 용해 완충액은 상기 샘플이 상기 원격 사용자와 상기 스크리닝 실험실간에 운송되는 중에 상기 샘플을 용해시키도록 제조되는 것이 특징인 방법.
  142. 제135항에 있어서, 상기 데이타는 상기 선택된 스크리닝 매개변수를 상기 스크리닝 실험실에 전송한지 43시간 내에 원격 의뢰인에게 보고되는 것이 특징인 방법.
  143. 원격 사용자에 의해 스크리닝 실험실로 보내진 1 이상의 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 원격 사용자는 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실에 스크리닝 매개변수를 제공하고,
    (a) 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실로 접근 요청을 전송하는 단계;
    (b) 상기 스크리닝 실험실이 상기 스크리닝 매개변수를 비롯한 접근 가능 응답을 전자 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자에게 전송하는 단계;
    (c) 상기 원격 사용자가 스크리닝 매개변수를 선택하는 단계;
    (d) 상기 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 상기 스크리닝 실험실로 선택된 스크리닝 매개변수 선택사항을 전송하는 단계;
    (e) 상기 스크리닝 실험실이 상기 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하는 단계;
    (f) 상기 스크리닝 실험실이 전자 통신 연계를 통해 의뢰서를 공급자에게 전달하여 선택된 스크리닝 매개변수에 적합한 프로브를 얻는 단계;
    (g) 상기 스크리닝 실험실이 상기 프로브를 수령하는 단계;
    (h) 상기 원격 사용자가 상기 샘플을 상기 스크리닝 실험실로 송달하는 단계;
    (i) 상기 선택된 스크리닝 매개변수에 따라 상기 샘플을 스크리닝하여 데이타를 얻는 단계; 및
    (j) 전자 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자에게 상기 데이타를 전송하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 전자 통신 연계는 인터넷인 것이 특징인 방법.
  145. 제143항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  146. 제143항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 티라미드에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  147. 제143항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 덴드리머에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  148. 제134항에 있어서, 스크리닝 실험실에 의해 1일에 2,000개 이상의 샘플이 스크리닝되는 것이 특징인 방법.
  149. 제143항에 있어서, 상기 공급물은 용해 완충액을 포함하고, 이 용해 완충액은 상기 샘플이 상기 원격 사용자와 상기 스크리닝 실험실간에 송달되는 중에 상기 샘플을 용해시키도록 제조되는 것이 특징인 방법.
  150. 제143항에 있어서, 상기 데이타는 상기 선택된 스크리닝 매개변수를 상기 시크리닝 실험실에 전송한지 43시간 내에 원격 의뢰인에게 보고되는 것이 특징인 방법.
  151. 제143항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 선별가능한 마커를 포함하는 것이 특징인 방법.
  152. 제143항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 테스트할 라인(line)의 수를 확인하는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  153. 제143항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 프로브 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  154. 제134항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 지정 대조군을 포함하는 것이 특징인 방법.
  155. 제143항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 지정 유전자 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  156. 제143항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수는 표적 유전자 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  157. 원격 사용자에 의해 스크리닝 실험실로 보내진 1 이상의 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA 서열에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 상기 원격 사용자는 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실에 스크리닝 매개변수를 제공하고,
    (a) 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실로 접근 요청을 전송하는 단계;
    (b) 상기 스크리닝 실험실이 상기 스크리닝 매개변수를 비롯한 접근 가능 응답을 전자 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자에게 전송하는 단계;
    (c) 상기 원격 사용자가 스크리닝 매개변수를 선택하는 단계;
    (d) 상기 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 상기 스크리닝 실험실로 선택된 스크리닝 매개변수 선택사항을 전송하는 단계;
    (e) 상기 스크리닝 실험실이 상기 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하는 단계;
    (f) 상기 스크리닝 실험실이 전자 통신 연계를 통해 의뢰서를 공급자에게 전송하여 선택된 스크리닝 매개변수에 적합한 프로브를 얻는 단계;
    (g) 상기 스크리닝 실험실이 상기 프로브를 수령하는 단계;
    (h) 상기 원격 사용자가 용해 완충액 중의 조직 샘플을 상기 스크리닝 실험실에 송달하는 단계로서, 상기 용해 완충액은 상기 원격 사용자와 상기 스크리닝 실험실간의 운송 중에 상기 샘플 중의 조직을 용해시키도록 제조되는 것인 단계;
    (i) 상기 선택된 스크리닝 매개변수에 따라 상기 샘플을 스크리닝하여 데이타를 얻는 단계; 및
    (j) 전자 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자에게 상기 데이타를 전송하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  158. 제157항에 있어서, 상기 전자 통신 연계는 인터넷인 것이 특징인 방법.
  159. 제157항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 증폭 분자에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  160. 제157항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 티라미드에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  161. 제157항에 있어서, 상기 지정 유전자 서열에 대해 특이적인 제1 영역과 덴드리머에 대해 특이적인 제2 영역의 2 이상의 결합 영역을 보유하는 프로브는 상기 지정 서열의 일부분에 대해 특이적인 것이 특징인 방법.
  162. 제157항에 있어서, 상기 스크리닝 실험실에 의해 1일에 2,000개 이상의 샘플이 스크리닝되는 것이 특징인 방법.
  163. 제157항에 있어서, 상기 전자 통신 연계가 인터넷인 것이 특징인 방법.
  164. 제157항에 있어서, 상기 완충액은 4 M 우레아, 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5), 180 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 5 mM DDT 및 415 mg의 프로테인아제 K 및 Rnase로 구성되는 것이 특징인 방법.
  165. 제157항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 선별가능한 마커를 포함하는 것이 특징인 방법.
  166. 제157항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 테스트할 라인의 수를 확인하는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  167. 제157항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 프로브 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  168. 제157항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 지정 대조군을 포함하는 것이 특징인 방법.
  169. 제157항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 지정 유전자 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  170. 제157항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 표적 유전자 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  171. 제157항에 있어서, 상기 공급물은 프로브를 포함하고, 이 프로브는 유전자 표적과 증폭 분자에 대해 특이적인 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
  172. 원격 사용자에 의해 스크리닝 실험실로 보내진 조직 샘플의 고용량 스크리닝과 표적 돌연변이유발 스크리닝을 위한 자동 장치로서,
    (a) 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 스크리닝 실험실로 접근 요청을 전송하기 위한 수단;
    (b) 상기 스크리닝 실험실이 스크리닝 매개변수와 접근 가능 응답을 전자 통신 연계를 통해 상기 원격 사용자에게 전송하기 위한 수단;
    (c) 상기 원격 사용자가 스크리닝 매개변수 선택사항을 스크리닝 실험실로 전송하기 위한 수단;
    (d) 상기 원격 사용자가 상기 샘플을 상기 스크리닝 실험실로 송달하기 위한 수단;
    (e) 상기 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하기 위한 수단;
    (f) 상기 게놈 DNA를 기판 위에 침착시키기 위한 수단;
    (g) 게놈 DNA를 스크리닝하기 위한 수단;
    (h) 상기 데이타를 상기 원격 사용자에게 전송하기 위한 수단
    을 포함하는 것인 장치.
  173. 제172항에 있어서, 상기 샘플을 송달하기 위한 상기 수단이 익일배달의 포장 배달 서비스인 것이 특징인 장치.
  174. 제172항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 분리하기 위한 상기 수단이 자성 분리기인 것이 특징인 장치.
  175. 제172항에 있어서, 상기 데이타 전송 수단은 인터넷인 것이 특징인 장치.
  176. 제172항에 있어서, 상기 장치는 1일에 2,000개 이상의 샘플을 스크리닝할 수 있는 것이 특징인 장치.
  177. 제172항에 있어서, 상기 게놈 DNA를 침착시키기 위한 상기 수단은 자동 배열기인 것이 특징인 장치.
  178. 원격 사용자가 제시한 스크리닝 매개변수 선택사항에 따라 조직 샘플을 변형된 또는 돌연변이된 게놈 DNA에 대해 스크리닝하는 고용량 장치로서,
    (a) 제1 웰 플레이트로부터 제2 웰 플레이트로 액체를 제거하기 위한 자동 접근 스테이션;
    (b) 상기 제2 웰 플레이트에서 게놈 DNA를 분리하기 위한 분리 스테이션;
    (c) 상기 제2 웰 플레이트에서 DNA 농도를 조절하기 위한 광학 표준화 스테이션;
    (d) 상기 제2 테스트 플레이트로부터 기판 위로 상기 게놈 DNA를 침착시키기 위한 배열 스테이션;
    (e) 게놈 DNA의 부분들에 결합하는 표지된 프로브를 하이브리드화하기 위한 하이브리드화 스테이션;
    (f) 결합된 표지된 프로브를 검출하기 위한 검출 스테이션;
    (g) 원격 사용자가 전자 통신 연계를 통해 장치와 통신하여 스크리닝 매개변수를 선택하기 위한 수단; 및
    (h) 전자 통신 연계를 통해 원격 사용자에게 스크리닝 결과를 전송하기 위한 수단
    을 포함하는 것인 장치.
  179. 제178항에 있어서, 상기 검출 스테이션은 마이크로어레이 영상기를 포함하는 것이 특징인 장치.
  180. 제178항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수는 선별가능한 마커를 포함하는 것이 특징인 장치.
  181. 제178항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수는 테스트할 라인의 수를 확인하는 것을 포함하는 것이 특징인 장치.
  182. 제178항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수는 프로브 서열을 포함하는 것이 특징인 장치.
  183. 제178항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수는 표적 유전자 서열을 포함하는 것이 특징인 장치.
  184. 제178항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수는 지정 대조군을 포함하는 것이 특징인 장치.
  185. 제178항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 지정 유전자 서열을 포함하는 것이 특징인 장치.
  186. 제178항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 표적 유전자 서열을 포함하는 것이 특징인 장치.
  187. 제178항에 있어서, 상기 제2 웰 플레이트내의 DNA 농도는 17∼250 ng/㎕의 유체인 것이 특징인 장치.
  188. 제178항에 있어서, 상기 제2 웰 플레이트내의 DNA 농도는 12.5∼500 ng/㎕의 유체인 것이 특징인 장치.
  189. 제178항에 있어서, 상기 장치는 1일에 2,000개 이상의 샘플을 스크리닝할 수 있는 것이 특징인 장치.
  190. (a) 원격 사용자로부터 스크리닝 매개변수 선택사항을 수령하도록 갖추어진,프로세서, 메모리 및 웹 브라우저를 구비한 컴퓨터; 및
    (b) 마이크로어레이 영상기를 포함하는, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항에 대해 게놈 DNA 샘플을 분석하는 워크스테이션
    을 포함하는, 샘플 중의 게놈 DNA를 지정 게놈 DNA에 대해 스크리닝하는 시스템.
  191. 제190항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 지정 유전자 서열, 선별가능한 마커, 표적 유전자 서열, 지정 대조군의 유전자 서열, 테스트할 라인의 수 및 프로브 서열로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 시스템.
  192. 제190항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수 선택사항은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 시스템.
  193. 제190항에 있어서, 상기 스크리닝 매개변수는 인터넷을 통해 수령되는 것이 특징인 시스템.
  194. 제190항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 원핵생물 유래인 것이 특징인 시스템.
  195. 제190항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 진핵생물 유래인 것이 특징인 시스템.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100668307B1 (ko) * 2004-10-22 2007-01-12 삼성전자주식회사 유전자형 검사에서 오염 발생 기준 결정 방법 및 오염발생 파악 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109661274A (zh) * 2016-04-04 2019-04-19 卡尤迪生物科技（北京）有限公司 用于加热生物样品的系统和方法
CN109266511A (zh) * 2018-08-14 2019-01-25 上海常仁信息科技有限公司 一种基于机器人的基因检测系统
CN110047562B (zh) * 2019-05-14 2021-04-27 上海上药第一生化药业有限公司 一种基于酶活力测定法的效价检测的信息化结构和方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6192320B1 (en) * 1991-07-30 2001-02-20 The University Of Virginia Patent Foundation Interactive remote sample analysis system
US6055487A (en) * 1991-07-30 2000-04-25 Margery; Keith S. Interactive remote sample analysis system
US5366896A (en) * 1991-07-30 1994-11-22 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Robotically operated laboratory system
EP0555449A1 (en) * 1991-07-31 1993-08-18 Amoco Corporation Simultaneous shear and denaturation of nucleic acids
US5527695A (en) * 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
GB9323305D0 (en) * 1993-11-11 1994-01-05 Medinnova Sf Isoaltion of nucleic acid
GB9425138D0 (en) * 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
US6027945A (en) * 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
EP1002068B1 (en) * 1997-07-14 2009-09-09 University of Liège Mutations in the myostatin gene cause double-muscling in mammals
US6465178B2 (en) * 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
US6410231B1 (en) * 1999-02-26 2002-06-25 Incyte Genomics, Inc. SNP detection
JPWO2002025289A1 (ja) * 2000-09-18 2004-09-16 有限会社アイカード マイクロウェルアレイと同マイクロウェルアレイを用いた液体の密閉方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100668307B1 (ko) * 2004-10-22 2007-01-12 삼성전자주식회사 유전자형 검사에서 오염 발생 기준 결정 방법 및 오염발생 파악 방법

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