CN116334241A - Snp标记在小鼠亚系鉴定中的应用及引物序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SNP标记在小鼠亚系鉴定中的应用及引物序列。本发明提供的SNP标记为包括至少3个SNP位点的组合,能够对包括C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6‑bg在内的3个C57BL/6小鼠亚系,和/或包括BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的2个BALB/c小鼠亚系进行鉴定,提高了小鼠亚系鉴定的范围,还可节约鉴定成本。
Description
技术领域
本发明属于小鼠品系鉴定的技术领域,具体涉及一种SNP标记在小鼠亚系鉴定中的应用及引物序列。
背景技术
实验动物是指经人工饲育且对其携带的微生物实行控制、遗传背景明确或者来源清楚、用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。常见的实验动物有实验大鼠和实验小鼠,包括有数千种封闭群、近交系、重组同类系、重组近交系和突变系等品系。
在常见的、历史比较久的多种小鼠亚系中,在诸多方面都存在差异,而这些差异在表观遗传学性状上表现不明显,几乎无法单纯从外观上来鉴定小鼠亚系,且这些差异会导致实验数据的偏差。随着生命医学的发展,科研人员和商业对实验动物质量的要求越来越高。因此,对小鼠亚系的鉴定成了亟待解决的问题。
专利文献CN114317767A(以下称文献1)公开一种区别C57BL/6亚系小鼠的引物、试剂盒和方法,其采用3组至少3个SNP位点(例如rs244794780、rs260260338和rs224344563,或rs226310424、rs260260338和rs239219835等)能够区分出C57BL/6N亚系、C57BL/6J亚系及C57BL/6By亚系,同时也可鉴定到C57BL/6N亚系中的C57BL/6NJ、或C57BL/6NCrl与C57BL/6NTac的组合。然而,该文献1公开的SNP位点的组合只能区分C57BL/6亚系小鼠,而无法区分BALB/c亚系小鼠,更是无法同时区分C57BL/6亚系小鼠和BALB/c亚系小鼠,因此该文献1公开的SNP位点的组合的通用性较差。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个,本发明一个方面提供一种SNP标记在小鼠亚系鉴定中的应用,其利用至少包括3个SNP位点的SNP标记组合对3个C57BL/6小鼠亚系或2个BALB/c小鼠亚系进行鉴定,其中所述3个C57BL/6小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg,所述2个BALB/c小鼠亚系选自BALB/cJ和BALB/cCrSlc;所述SNP标记组合至少包括选自以下1)-18)中任一组的3个SNP位点:
1)命名为SNP1、SNP8和SNP3的3个SNP位点;
2)命名为SNP1、SNP8和SNP2的3个SNP位点;
3)命名为SNP1、SNP8和SNP4的3个SNP位点;
4)命名为SNP1、SNP6和SNP3的3个SNP位点;
5)命名为SNP1、SNP6和SNP2的3个SNP位点;
6)命名为SNP1、SNP6和SNP4的3个SNP位点;
7)命名为SNP1、SNP7和SNP3的3个SNP位点;
8)命名为SNP1、SNP7和SNP2的3个SNP位点;
9)命名为SNP1、SNP7和SNP4的3个SNP位点;
10)命名为SNP6、SNP2和SNP5的3个SNP位点;
11)命名为SNP6、SNP3和SNP5的3个SNP位点;
12)命名为SNP6、SNP4和SNP5的3个SNP位点;
13)命名为SNP7、SNP2和SNP5的3个SNP位点;
14)命名为SNP7、SNP3和SNP5的3个SNP位点;
15)命名为SNP7、SNP4和SNP5的3个SNP位点;
16)命名为SNP8、SNP2和SNP5的3个SNP位点;
17)命名为SNP8、SNP3和SNP5的3个SNP位点;
18)命名为SNP8、SNP4和SNP5的3个SNP位点;
其中:
所述SNP1的Ensembl rs编号为rs3709624,其等位基因为T或C;
所述SNP2的Ensembl rs编号为rs3659787,其等位基因为T或C;
所述SNP3的Ensembl rs编号为rs3722313,其等位基因为T或C;
所述SNP4的Ensembl rs编号为rs3702158,其等位基因为A或G;
所述SNP5的Ensembl rs编号为rs3724876,其等位基因为G或T;
所述SNP6的Ensembl rs编号为rs3712692,其等位基因为G或T;
所述SNP7的Ensembl rs编号为rs3706082,其等位基因为T或C;
所述SNP8的Ensembl rs编号为rs3656801,其等位基因为G或A。
在一些实施方式中,所述SNP标记组合为包括SNP1-SNP8这8个SNP位点的组合。
在一些实施方式中,所述SNP标记组合为还包括选自命名为SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个位点的至少包括4个SNP位点的组合,所述应用为利用该组合同时对5个小鼠亚系进行鉴定,其中所述5个小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc;其中:
所述SNP9的Ensembl rs编号为rs3023251,其等位基因为T或C;
所述SNP10的Ensembl rs编号为rs3088673,其等位基因为T或G;
所述SNP14的Ensembl rs编号为rs3023177,其等位基因为C或A;
所述SNP16的Ensembl rs编号为rs3089984,其等位基因为A或C。
本发明另一方面提供了上述的SNP标记组合在制备用于鉴定小鼠亚系的试剂盒或液相芯片中的应用,其中所述试剂盒或液相芯片用于检测所述小鼠亚系的至少3个SNP位点的等位基因,其中所述3个SNP位点为上述1)-18)中任一组提及的那些,所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg,或所述小鼠亚系选自BALB/cJ和BALB/cCrSlc;或所述试剂盒或液相芯片用于检测所述小鼠亚系的至少4个SNP位点的等位基因,其中所述4个SNP位点为上述1)-18)中任一组提及的那些以及SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的任一个;所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc。
本发明另一方面提供一种用于扩增上述的SNP标记组合的引物组合,其用于鉴定小鼠亚系,包括用于扩增上述1)-18)中任一组提及的3个SNP位点的引物,且所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg,或所述小鼠亚系选自BALB/cJ和BALB/cCrSlc;或所述引物组合包括用于扩增上述1)-18)中任一组提及的3个SNP位点的引物和用于扩增SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个SNP位点的引物,且所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc。
在一些实施方式中,用于扩增SNP1位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示;用于扩增SNP2位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示;用于扩增SNP3位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示;用于扩增SNP4位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示;用于扩增SNP5位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示;用于扩增SNP6位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示;用于扩增SNP7位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示;用于扩增SNP8位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所示;用于扩增SNP9位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18所示;用于扩增SNP10位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO:19和SEQ ID NO:20所示;用于扩增SNP14位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:27和SEQ ID NO:28所示;用于扩增SNP16位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:31和SEQ ID NO:32所示。
上述的引物组合在制备用于鉴定小鼠亚系的试剂盒或液相芯片中的应用也属于本发明的内容,其中所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc。
本发明再一方面提供一种用于鉴定小鼠亚系的试剂盒或液相芯片,其包括:A.上述的引物组合;
可选地,所述试剂盒或液相芯片还包括:
B.分别针对上述1)-18)中任一组提及的3个SNP位点,以及任选的SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个SNP位点的野生型和突变型特异性ASPE引物中的一条或多条,其中每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成;可选地,所述特异性引物序列为选自SEQ ID NO:33-52、SEQ ID NO:59-60、和SEQ IDNO:63-64中的序列;进一步可选地,所述tag序列为选自SEQ ID NO:65-80中的序列;和
C.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球,所述anti-tag序列相应地与B中所述tag序列互补配对;可选地,所述anti-tag序列为选自SEQ ID NO:81-96中的序列。
本发明再一方面提供一种小鼠亚系SNP位点的检测方法,其使用上述的试剂盒或液相芯片对待测小鼠的DNA进行检测,所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc。
在一些实施方式中,所述检测方法包括以下步骤:
(1)PCR扩增待测小鼠的DNA样品,获得PCR扩增产物;
(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理,获得纯化产物;
(3)用所述特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,获得带有多个生物素标记的反应后产物;
(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应,获得杂交产物;
(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应,得到反应产物;
(6)检测所述反应产物,获得该待测小鼠的SNP位点的等位基因信息。
本发明再一方面还提供一种鉴定小鼠亚系的方法,其在上述的检测方法的基础上还包括以下步骤:
(7)利用获得的待测小鼠的SNP位点的等位基因信息鉴定小鼠亚系;
当使用上述1)-18)中任一组提及的3个SNP位点的等位基因信息鉴定小鼠亚系时,鉴定过程包括:利用SNP1或SNP5位点的等位基因信息将C57BL/6J与C57BL/6小鼠亚系中的另2个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP2、SNP3或SNP4位点的等位基因信息将C57BL/6N和C57BL/6-bg鉴别开来;同时利用SNP6、SNP7或SNP8位点的等位基因信息将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来;进而实现将包括C57BL/6J、C57BL/6N和C57BL/6-bg在内的3个C57BL/6小鼠亚系相互鉴别开来,或将包括BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的2个BALB/c小鼠亚系鉴别开来;
当使用上述1)-18)中任一组提及的3个SNP位点和SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个SNP位点的等位基因信息鉴定小鼠亚系时,鉴定过程包括:利用SNP1或SNP5位点的等位基因信息将C57BL/6J与其他4个小鼠亚系鉴别开来,随后利用SNP6、SNP7或SNP8位点的等位基因信息将BALB/cJ与剩下的3个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP2、SNP3或SNP4位点的等位基因信息将C57BL/6-bg与剩下的2个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP9、SNP10、SNP14或SNP16位点的等位基因信息将C57BL/6N和BALB/cCrSlc鉴别开来,进而实现同时将包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的5个小鼠亚系相互鉴别开来。
基于以上技术方案提供的用于鉴定小鼠亚系的SNP标记为至少包括3个SNP位点的组合,利用该SNP标记组合可以同时对3个C57BL/6小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg)和/或2个BALB/c小鼠亚系(BALB/cJ、BALB/cCrSlc)进行鉴定,因此相对于上述文献1公开的方法(能够区分出C57BL/6N亚系、C57BL/6J亚系及C57BL/6By亚系),本发明鉴定的小鼠亚系更丰富,且可以同时区分C57BL/6亚系小鼠和BALB/c亚系小鼠。另一方面,在本发明提供的用于扩增各组SNP位点的引物中,可以将其分成一组,同时对小鼠亚系的DNA样品进行多重PCR扩增,因此针对每个样本只需要一次PCR扩增反应即可,可以有效简化操作,节约时间,从而提高小鼠亚系的鉴定效率。
附图说明
图1为使用针对SNP1-16位点的PCR引物分别对5个小鼠亚系的基因组DNA进行PCR扩增的产物的凝胶电泳图像;其中A幅表示使用针对SNP1-8位点的PCR引物的凝胶电泳图像,B幅表示使用针对SNP9-16位点的PCR引物的凝胶电泳图像。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中,仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样,在不脱离本发明的精神或范围的情况下,可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此,附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见:《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook,J.,Russell,DavidW.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的,不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上,所用到的生物材料的来源是广泛的,任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例1:用于鉴定小鼠亚系的SNP标记的确定及扩增SNP位点的引物设计
1.1、用于鉴定小鼠亚系的SNP标记的筛选
PETKOV P M等人(PETKOV P M,CASSELL M A,SARGENT E E,et al.Developmentof a SNP genotyping panel for genetic monitoring of the laboratory mouse[J].Genomics,2004,83(5):902-911)已经公开多个可用于实验小鼠遗传质量检测的SNP位点,本发明人从中筛选出多个SNP位点,如下表1所示的16个SNP位点,以从中确定可用于对5个小鼠亚系(包括3个C57BL/6小鼠亚系和2个BALB/c小鼠亚系,其中3个C57BL/6小鼠亚系具体为C57BL/6NNifdc(本文简称为C57BL/6N)、C57BL/6JNifdc(本文简称为C57BL/6J)和C57BL/6-bgNifdc(本文简称为C57BL/6-bg),2个BALB/c小鼠亚系具体为BALB/cJNifdc(本文简称为BALB/cJ)和BALB/cCrSlcNifdc(本文简称为BALB/cCrSlc))进行鉴定的SNP组合,如下表2所示,示例性示出了其中的22组SNP位点(分别命名为第1组、第2组、第3组、…、第22组SNP位点)。
表1:16个SNP位点及其位置和等位基因信息
位点编号 | Ensembl rs编号 | 染色体定位 | 等位基因 |
SNP1 | rs3709624 | Chromosome 8:15241287 | T/C |
SNP2 | rs3659787 | Chromosome 11:4458730 | T/C |
SNP3 | rs3722313 | Chromosome 13:41596262 | T/C |
SNP4 | rs3702158 | Chromosome 15:57023882 | A/G |
SNP5 | rs3724876 | Chromosome 19:49964593 | G/T |
SNP6 | rs3712692 | Chromosome 1:31763467 | G/T |
SNP7 | rs3706082 | Chromosome 4:65725485 | T/C |
SNP8 | rs3656801 | Chromosome 18:64593498 | G/A |
SNP9 | rs3023251 | Chromosome 11:20903301 | T/C |
SNP10 | rs3088673 | Chromosome 11:8452194 | T/G |
SNP11 | rs3089604 | Chromosome X:68706245 | T/C |
SNP12 | rs3089109 | Chromosome 10:87601155 | C/G |
SNP13 | rs3023203 | Chromosome 9:29034302 | A/G |
SNP14 | rs3023177 | Chromosome 8:14809100 | C/A |
SNP15 | rs3022953 | Chromosome 15:32696333 | A/G |
SNP16 | rs3089984 | Chromosome 10:8813751 | A/C |
表2:SNP位点的组合
1.2、针对SNP位点的PCR引物的设计
根据上述步骤1.1中筛选的16个SNP位点的信息(表1所示),分别在UCSC数据库中查找各SNP位点附近的碱基序列,用primer 6.0软件设计能扩增含SNP位点的PCR引物,并使其扩增产物的片段大小最好相差20-100bp左右,以便用电泳的方法进行区分,具体引物序列见表3所示,引物是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。
表3:针对SNP1-16位点的PCR引物
发明人分别利用上述表2所示的SNP位点的组合(第1组-第22组)按照以下实施例2中的方法同时对3个C57BL/6小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg)和2个BALB/c小鼠亚系(BALB/cJ和BALB/cCrSlc)进行鉴定,以使3个C57BL/6小鼠亚系相互区分,并同时使2个BALB/c小鼠亚系相互区分,结果表明表2所示的第1组-第18组,和第21组SNP位点能够实现上述目的,而第19组、第20组和第22组SNP位点不能实现上述目的(以下实施例2详述)。因此本发明确定可使用表2所示的第1组-第18组,和第21组SNP位点对3个C57BL/6小鼠亚系进行鉴定,并同时可对2个BALB/c小鼠亚系进行鉴定,具有良好的通用性。
实施例2:3个C57BL/6小鼠亚系和2个BALB/c小鼠亚系的鉴定
该实施例利用上述实施例1确定的表2所示的SNP位点的组合(第1组-第22组)以及表3所示的针对SNP1-16位点的PCR引物对3个C57BL/6小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg)和2个BALB/c小鼠亚系(BALB/cJ和BALB/cCrSlc)进行鉴定,鉴定方法具体包括以下操作。
2.1、小鼠亚系的DNA样品的提取
该步骤中使用市售血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对小鼠的基因组DNA进行提取,参照试剂盒说明书具体包括以下步骤:
(1)剪取鼠尾1-2cm,放入1.5mL的EP管中。先加入50μL蛋白酶K,再向EP管中加入500μL提取缓冲液。用封口膜封闭好,混合均匀后置于浮漂上,53.5℃水浴锅中过夜,期间上下混匀几次。注意水浴锅中放足量纯化水,盖好盖子。
(2)第二天,从水浴锅中取出浮漂,将EP管从浮漂上取下,加入500μL Tris-酚溶液,混匀后离心12000rpm/min,2min,取上清放入新的EP管中,吸取上清时要注意将枪头紧贴EP管壁不要将下层油状物吸起。
(3)在步骤(2)的新的EP管中加入与吸取的上清溶液等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液,注意通风。充分颠倒混匀后置于离心机中离心12000rpm/min,2min,取上清放入新的EP管中。
(4)在步骤(3)的新的EP管中加入25μL醋酸铵,750μL异丙醇,轻轻上下适当混匀,可以看到明显的絮状沉淀。离心12000rpm,5min。
(5)一次性倾倒EP管中液体,加入70%乙醇500μL,上下轻晃混匀后离心12000rpm,5min,弃上清。
(6)将弃完上清的EP管放在滤纸上置于室温30min左右,待完全除去乙醇后,加入200μL已配制好的TE溶液溶解。于-20℃保存备用。
(7)待提取的DNA溶液在4℃冰箱稳定1-2天后,使用1.6%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
按照上述步骤(1)-(7)分别提取获得5种小鼠亚系的基因组DNA样品。
2.2、小鼠亚系的基因组DNA的PCR扩增
该步骤中分别使用上述实施例1中表3的PCR引物按照表2的SNP位点的组合对上述步骤2.1提取获得的5种小鼠亚系的基因组DNA样品进行PCR扩增(人工合成的质粒作为阳性对照,无菌水作为阴性对照),得到每个小鼠亚系的PCR扩增产物,其中PCR反应体系和程序分别如下表4和表5所示。在使用表3所示的PCR引物对小鼠亚系的基因组DNA进行PCR扩增时,按照表2所示的SNP位点的组合进行多重检测,例如针对第1组-第20组SNP位点,分别进行三重PCR扩增,针对第21组和第22组SNP位点,分别进行八重PCR扩增。
表4:多重PCR反应体系
表5:多重PCR反应程序
2.3、多重PCR产物的电泳检测
配制2.5%的琼脂糖凝胶:在40mL的1×TAE溶液中加入1.0g琼脂糖,加入Ex Red染液(注意:染液与琼脂糖凝胶的比例为1:10000),混匀后放入微波炉,加热数次后至溶液透明无气泡,过程中要随时注意琼脂糖凝胶是否从三角瓶冒出,若冒出应立即停止加热,将加热时间变短,随后将溶解好的溶液倒入胶板,插上梳子,室温放置20-30min。
取5μL PCR扩增产物加入1μL 6×DNA loading buffer混匀加入电泳槽进行电泳检测,使用50bp的DNA marker作为条带的位置参照。在130V电泳30min,之后使用紫外凝胶成像系统扫描拍照。如图1所示,示例性示出了凝胶电泳胶图,其中A幅表示使用针对第21组SNP位点(即SNP1-SNP8)的PCR引物分别对5个小鼠亚系的基因组DNA进行PCR扩增的结果,B幅表示使用针对第22组SNP位点(即SNP9-SNP16)的PCR引物分别对5个小鼠亚系的基因组DNA进行PCR扩增的结果,可见针对SNP1-SNP16的PCR引物都能很好地对5个小鼠亚系的基因组DNA进行PCR扩增,各条带清晰且能够明显区分。
2.4、多重PCR产物的纯化
多重PCR反应结束后会有扩增剩余的dNTP、引物、单链产物等,会影响后续的ASPE延伸反应,使用ExoⅠ可除去扩增剩余的引物和单链产物,SAP酶除去PCR产物中剩余的引物、单链DNA以及剩余的dNTPs,尤其是dCTP。该步骤使用ExoSAP-IT试剂盒(购自美国USB公司)在每10μL多重PCR产物中加入1μL的Exo-SAP混合液,随后在37℃反应30min,在80℃15min使酶灭活,获得纯化的多重PCR产物。
2.5、位点特异性引物延伸反应(ASPE)
该步骤利用设计的位点特异性引物对上述步骤2.4纯化的多重PCR产物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP(购自上海生工生物工程技术服务有限公司),从而使反应后的产物带上多个生物素标记。
2.5.1、位点特异性引物(ASPE引物)的设计
每条ASPE引物(退火温度应位于51-56℃之间)包括两个部分,5’端为针对相应磁球上anti-tag序列的特异性tag序列,3’端为突变型或野生型特异性引物序列。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该步骤设计的分别针对SNP1-16位点的ASPE引物如下表6所示。
表6:分别针对SNP1-16位点的TAG序列和ASPE引物序列信息
2.5.2、ASPE反应体系和反应程序
ASPE反应体系选择Luminex公司操作指南上推荐的20μL体系,具体如下表7所示。
表7:ASPE反应体系
将PCR扩增仪按照下表8的反应程序进行设置后,将配好的ASPE反应体系放进去进行ASPE反应,得到ASPE延伸的反应产物。
表8:ASPE反应程序
2.6、杂交反应
2.6.1、磁球的选择以及anti-tag序列包被
该步骤根据上述表6设计的ASPE引物,选择相应的磁球(磁球浓度均为2.5×105个/ml)。每种磁球分别带有不同颜色编码,同时每种磁球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag序列,由海生工生物工程技术服务有限公司合成;anti-tag序列与磁球之间连接有5-10个T的间隔臂序列,即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列),这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合。相应的磁球的颜色编码以及携带的anti-tag序列如下表9所示。
表9:磁球的颜色编码以及携带的anti-tag序列
磁球编号 | 磁球偶合的Anti-tag序列 | SEQ ID |
MTAG-A019 | GTGTGTTATTTGTTTGTAAAGTAT | NO:81 |
MTAG-B083 | GAAAGTTTAAGTGATGTATATTGT | NO:82 |
MTAG-A073 | GTTGAGAATTAGAATTTGATAAAG | NO:83 |
MTAG-B094 | TAGATAATGTGAAGTAATAAGTGA | NO:84 |
MTAG-A027 | AAGATGATAGTTAAGTGTAAGTTA | NO:85 |
MTAG-A065 | TGAGTAAGTTTGTATGTTTAAGTA | NO:86 |
MTAG-A013 | AGTGAATGTAAGATTATGTATTTG | NO:87 |
MTAG-A039 | TTGTGATAGTAGTTAGATATTTGT | NO:88 |
MTAG-A030 | GTGTTATAGAAGTTAAATGTTAAG | NO:89 |
MTAG-A053 | GTTTGTGTTTGTATAAGTTGTTAA | NO:90 |
MTAG-A015 | GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA | NO:91 |
MTAG-A061 | TATTAGAGAGAAATTGTAGAGATT | NO:92 |
MTAG-A025 | GTATGTTGTAATGTATTAAGAAAG | NO:93 |
MTAG-B058 | TGAGAATGTAAAGAATGTTTATTG | NO:94 |
MTAG-B089 | GTTATGAAAGAGTATGTGTTAAAT | NO:95 |
MTAG-B098 | TATGTGTATGAAGATTATAGTTAG | NO:96 |
磁球包被anti-tag序列的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的磁球(购自Luminex公司)悬浮于50μL0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10μL合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往磁球悬液中加入2.5μL的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5μL的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的磁球重悬于100μL的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0),1mmol/L EDTA]中,2-8℃避光保存。
2.6.2、ASPE延伸的PCR产物与包被有anti-tag序列的磁球的杂交反应
Luminex用户指南上推荐的杂交方法分为两种,清洗磁球的方法和不清洗磁球的方法,本实施例采取不清洗磁球的方法:
(1)在使用前将磁球使用涡旋振荡器振荡30-60s,防止无法吸到沉淀到瓶底的磁球,每种编码的磁球吸取10μL,配制成为磁球原液,随后将原液稀释成为工作液,工作液浓度大约为50个/μL,吸取22.5μL的磁球工作液至PCR八连排的反应管中;
(2)向反应管中加入2.5μL待测的ASPE延伸的反应产物,使得总反应体积为25μL;
(3)阴性对照加入2.5μLddH2O,阳性对照加入2.5μL合成的质粒的ASPE延伸的反应产物;
(4)做好标记后将PCR八连排管放在涡旋振荡仪上混匀后放入微型离心机中离心10s左右,随后放入PCR扩增仪,反应条件为:96℃变性90sec,之后在37℃反应30min;
(5)取100μL含有8μg/mL链霉亲和素藻红蛋白和0.01%BSA的1×杂交缓冲液添加到PCR八连排反应管中,使用移液器缓慢吹打,切记不可使用涡旋振荡仪振荡混匀,将沉淀的磁球进行重悬;
(6)再次将PCR八连排反应管放入PCR扩增仪中进行链霉亲和素藻红蛋白杂交。将温度调节至37℃,在此温度下反应20min,反应结束后即可使用Luminex200仪器进行检测,系统输出数值为中位数荧光值(median fluorescence intensity,MFI);
(7)使用Luminex仪器检测样品前要先打开机器预热30min,随后进行仪器的验证,验证结束后方可进行样品检测,注意要随时调整探针的高度;
(8)样品检测结束之后需要对检测探针进行清洗,在校正板的相应位置加入去离子水和84消毒液来进行探针清洗,清洗结束之后则可关闭软件,注意要定期清理废液桶中的废液。
2.7、数据分析
经上述步骤2.6.2的杂交反应后,使用Luminex200阅读系统分别激发红色激光和绿色激光对磁球体系进行检测,输出数值为中位数荧光值(median fluorescenceintensity,MFI),以此来计算等位基因MFI比率,等位基因MFI比率=MFI目标碱基/(MIF野生型+MFI突变型)。分型原则遵守的是:等位基因MFI比率>0.75或者<0.25为纯合野生型或者纯合突变型,0.25<等位基因MFI比率<0.75则为杂合突变型,采用Excel 2019软件进行CV等统计学分析。
使用表2所示的第21组SNP位点的Luminex检测结果和计算的等位基因MFI比率分别如下表10和表11所示,使用表2所示的第22组SNP位点的Luminex检测结果和计算的等位基因MFI比率分别如下表12和表13所示。使用表2所示的第1组-第20组SNP位点的等位基因MFI比率如下表14所示。
由上述表11所示的等位基因MFI比率计算结果可知,根据SNP1-SNP8中的部分SNP位点(至少3个SNP位点)或全部SNP位点可以将3个C57BL/6小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg)相互鉴别开来,并可以同时将2个BALB/c小鼠亚系(BALB/cJ和BALB/cCrSlc)相互鉴别开来。具体可参见表14所示的第1组-第18组SNP位点的等位基因信息,例如:在第1组SNP位点的等位基因结果中,可根据SNP1位点的分型结果将C57BL/6小鼠亚系中的C57BL/6J与其他2个亚系鉴别开来,再根据SNP3位点的分型结果将C57BL/6N和C57BL/6-bg鉴别开来;同时可根据SNP8位点的分型结果将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来。在第2组SNP位点的等位基因结果中,可根据SNP1位点的分型结果将C57BL/6小鼠亚系中的C57BL/6J与其他2个亚系鉴别开来,再根据SNP2位点的分型结果将C57BL/6N和C57BL/6-bg鉴别开来;同时可根据SNP8位点的分型结果将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来。在第3组SNP位点的等位基因结果中,可根据SNP1位点的分型结果将C57BL/6小鼠亚系中的C57BL/6J与其他2个亚系鉴别开来,再根据SNP4位点的分型结果将C57BL/6N和C57BL/6-bg鉴别开来;同时可根据SNP8位点的分型结果将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来。同理,也可利用第4组-第18组SNP位点的分型结果将3个C57BL/6小鼠亚系相互鉴别开来,并同时将2个BALB/c小鼠亚系相互鉴别开来。然而,由上表14也可知,在第19组SNP位点的等位基因结果中,只能根据SNP1位点的分型结果将C57BL/6小鼠亚系中的C57BL/6J与其他2个亚系鉴别开来,以及根据SNP8或SNP6位点的分型结果将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来,然而却不能进一步将C57BL/6N和C57BL/6-bg鉴别开来。在第20组SNP位点的等位基因结果中,只能根据SNP3、或SNP2、或SNP4位点的分型结果将C57BL/6小鼠亚系中的C57BL/6N与其他2个亚系鉴别开来,然而却不能进一步将C57BL/6J和C57BL/6-bg鉴别开来,也不能将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来。
由上表13所示的等位基因MFI比率计算结果可知,虽然第22组SNP位点由SNP9-SNP16这8个SNP位点组成,但是这些SNP位点的等位基因信息在3个C57BL/6小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg)和在2个BALB/c小鼠亚系(BALB/cJ和BALB/cCrSlc)中均分别完全相同,因此该组SNP位点不能将3个C57BL/6小鼠亚系相互鉴别开来,也不能将2个BALB/c小鼠亚系相互鉴别开来。
综上结果可知,本发明提供的第1组-第18组的3个SNP位点即可用来鉴别包括C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg在内的3个C57BL/6小鼠亚系,并同时可用来区分包括BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的2个BALB/c小鼠亚系,因此相对于上述文献1,本发明提供的SNP位点组合的通用性更好。另外,为了区分C57BL/6小鼠亚系和/或BALB/c小鼠亚系中更多个变种亚系,可优选使用包括第1组-第18组的3个SNP位点在内的更多个SNP位点(即至少3个SNP位点)的组合,例如本发明提供的第21组SNP位点,其由SNP1-SNP8这8个SNP位点组成,因此具有更多的SNP位点等位基因信息,可用于鉴别更多的变种亚系。
实施例3:5个小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc)的鉴定
根据以上实施例2的结果可知,第1组-第18组SNP位点可用来鉴别包括C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg在内的3个C57BL/6小鼠亚系,并同时可用来鉴别包括BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的2个BALB/c小鼠亚系,并且当使用第1组-第18组SNP位点来鉴别同时包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc的5个小鼠亚系时,可以根据SNP1或SNP5位点的分型结果将C57BL/6J与其他4个小鼠亚系鉴别开来,随后可根据SNP6、或SNP7、或SNP8位点的分型结果将BALB/cJ与剩下的3个小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6-bg和BALB/cCrSlc)鉴别开来,再根据SNP2、SNP3或SNP4位点的分型结果将C57BL/6-bg与剩下的2个小鼠亚系(C57BL/6N和BALB/cCrSlc)分区开来,然而不能进一步鉴别C57BL/6N和BALB/cCrSlc。可见,实施例2中提供的第1组-第18组SNP位点在鉴别同时包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc的5个小鼠亚系时,仅不能鉴别C57BL/6N和BALB/cCrSlc。然而,根据上表13的结果可知,C57BL/6N和BALB/cCrSlc在SNP9、SNP10、SNP14和SNP16位点处的等位基因信息均不同,因此可以进一步将第1组-第18组中各组的SNP位点与SNP9、SNP10、SNP14和SNP16位点之一或多个进一步组合,所得的至少包括4个SNP位点的组合即可以同时将包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc的5个小鼠亚系相互鉴别开来。
为了验证第1组-第18组中各组的SNP位点与SNP9、SNP10、SNP14和SNP16位点之一或多个进一步组合的SNP标记组合能够用于同时鉴别包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc在内的5个小鼠亚系,如下表15所示,示例性列出了其中部分包括4个SNP位点的组合(第23组-第40组),并按照上述实施例2的方法检测获得这些位点分别在5个小鼠亚系中的等位基因信息,检测结果如下表15所示。可见,当使用上述实施例2提供的第1组-第18组SNP位点的分型结果将C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ与剩下的2个小鼠亚系(C57BL/6N和BALB/cCrSlc)鉴别开来后,确实可根据SNP9、SNP10、SNP14或SNP16位点的分型结果进一步将C57BL/6N和BALB/cCrSlc鉴别开来,进而可以实现将包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc的5个小鼠亚系相互鉴别开来。该实施例的结果证明了将第1组-第18组中各组的SNP位点与SNP9、SNP10、SNP14和SNP16位点之一或多个进一步组合而成的SNP标记组合能够用来同时鉴别包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc在内的5个小鼠亚系。
表15:根据第23组-第40组SNP位点的Luminex检测结果计算的等位基因
实施例4:用于鉴定小鼠亚系的试剂盒或液相芯片
该实施例提供了一种用于鉴定3个C57BL/6小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg)或2个BALB/c小鼠亚系(BALB/cJ、BALB/cCrSlc)的试剂盒或液相芯片,命名为第一试剂盒或第一液相芯片,提供的第一试剂盒或第一液相芯片包括以下组分:
A1.实施例1中表3所示的分别用于扩增以下(1)-(19)中任一组的SNP位点的PCR引物:(1)SNP1、SNP8和SNP3;(2)SNP1、SNP8和SNP2;(3)SNP1、SNP8和SNP4;(4)SNP1、SNP6和SNP3;(5)SNP1、SNP6和SNP2;(6)SNP1、SNP6和SNP4;(7)SNP1、SNP7和SNP3;(8)SNP1、SNP7和SNP2;(9)SNP1、SNP7和SNP4;(10)SNP6、SNP2和SNP5;(11)SNP6、SNP3和SNP5;(12)SNP6、SNP4和SNP5;(13)SNP7、SNP2和SNP5;(14)SNP7、SNP3和SNP5;(15)SNP7、SNP4和SNP5;(16)SNP8、SNP2和SNP5;(17)SNP8、SNP3和SNP5;(18)SNP8、SNP4和SNP5;(19)SNP1-SNP8;
B1.分别针对A1中(1)-(19)中任一组提及的SNP位点的野生型和突变型特异性ASPE引物中的一条或多条,其中每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成;可选地,所述特异性引物序列为选自表6中的SEQ ID NO:33-48中的序列;进一步可选地,所述tag序列为选自表6中的SEQ ID NO:65-80中的序列;和
C1.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球,所述anti-tag序列能相应地与B1中所述tag序列互补配对;可选地,所述anti-tag序列为选自表9中的SEQ ID NO:81-96中的序列。
该实施例还提供了一种用于同时鉴定5个小鼠亚系(C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ、BALB/cCrSlc)的试剂盒或液相芯片,命名为第二试剂盒或第二液相芯片,提供的第二试剂盒或第二液相芯片包括以下组分:
A2.在上述A1的分别用于扩增(1)-(19)中任一组的SNP位点的PCR引物的基础上,每一组还可包括用于扩增SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中一个或多个SNP位点的PCR引物;
B2.在上述B1的基础上,还包括分别针对SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中一个或多个SNP位点的野生型和突变型特异性ASPE引物中的一条或多条,其中每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成;可选地,所述特异性引物序列为选自表6中的SEQ ID NO:49-52、SEQ ID NO:59-60、SEQ ID NO:63-64中的序列;进一步可选地,所述tag序列为选自表6中的SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:71-72、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:80中的序列;和
C2.在上述C1的基础上,还包括分别包被有其他特异性anti-tag序列的磁球,所述其他anti-tag序列能相应地与B2中所述tag序列互补配对;可选地,所述其他anti-tag序列为选自表9中的SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87-88、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:95-96、SEQ ID NO:91中的序列。
另外,在本发明提供的试剂盒或液相芯片(第一和第二)中还包括使用该试剂盒或液相芯片检测小鼠亚系的SNP位点的方法或鉴定小鼠亚系的方法,其中:
检测小鼠亚系的SNP位点的方法包括以下步骤:
(1)使用试剂盒或液相芯片中提供的PCR引物分别扩增(可以采用多重PCR扩增的方式)获自待测小鼠的DNA样品,获得PCR扩增产物;
(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理,获得纯化产物;
(3)用试剂盒或液相芯片中提供的特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,获得带有多个生物素标记的反应后产物;
(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应,获得杂交产物;
(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应,得到反应产物;
(6)检测(例如通过荧光检测仪)所述反应产物,获得待测小鼠的SNP位点的等位基因信息。
鉴定小鼠亚系的方法在上述提供的检测小鼠亚系的SNP位点的方法的基础上还包括以下步骤:(7)利用获得的待测小鼠的SNP位点的等位基因信息鉴定小鼠亚系;
当使用第一试剂盒或第一液相芯片鉴定小鼠亚系时,鉴定过程包括:利用SNP1或SNP5位点的等位基因信息将C57BL/6J与C57BL/6小鼠亚系中的另2个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP2、SNP3或SNP4位点的等位基因信息将C57BL/6N和C57BL/6-bg鉴别开来;同时利用SNP6、SNP7或SNP8位点的等位基因信息将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来;进而实现将包括C57BL/6J、C57BL/6N和C57BL/6-bg在内的3个C57BL/6小鼠亚系相互鉴别开来,或将包括BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的2个BALB/c小鼠亚系鉴别开来;
当使用第二试剂盒或第二液相芯片鉴定小鼠亚系时,鉴定过程包括:利用SNP1或SNP5位点的等位基因信息将C57BL/6J与其他4个小鼠亚系鉴别开来,随后利用SNP6、SNP7或SNP8位点的等位基因信息将BALB/cJ与剩下的3个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP2、SNP3或SNP4位点的等位基因信息将C57BL/6-bg与剩下的2个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP9、SNP10、SNP14或SNP16位点的等位基因信息将C57BL/6N和BALB/cCrSlc鉴别开来,进而实现同时将包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的5个小鼠亚系相互鉴别开来。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应属于本发明的内容。
Claims (10)
1.一种SNP标记在小鼠亚系鉴定中的应用,其特征在于,利用至少包括3个SNP位点的SNP标记组合对3个C57BL/6小鼠亚系或2个BALB/c小鼠亚系进行鉴定,其中所述3个C57BL/6小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg,所述2个BALB/c小鼠亚系选自BALB/cJ和BALB/cCrSlc;所述SNP标记组合至少包括选自以下1)-18)中任一组的3个SNP位点:
1)命名为SNP1、SNP8和SNP3的3个SNP位点;
2)命名为SNP1、SNP8和SNP2的3个SNP位点;
3)命名为SNP1、SNP8和SNP4的3个SNP位点;
4)命名为SNP1、SNP6和SNP3的3个SNP位点;
5)命名为SNP1、SNP6和SNP2的3个SNP位点;
6)命名为SNP1、SNP6和SNP4的3个SNP位点;
7)命名为SNP1、SNP7和SNP3的3个SNP位点;
8)命名为SNP1、SNP7和SNP2的3个SNP位点;
9)命名为SNP1、SNP7和SNP4的3个SNP位点;
10)命名为SNP6、SNP2和SNP5的3个SNP位点;
11)命名为SNP6、SNP3和SNP5的3个SNP位点;
12)命名为SNP6、SNP4和SNP5的3个SNP位点;
13)命名为SNP7、SNP2和SNP5的3个SNP位点;
14)命名为SNP7、SNP3和SNP5的3个SNP位点;
15)命名为SNP7、SNP4和SNP5的3个SNP位点;
16)命名为SNP8、SNP2和SNP5的3个SNP位点;
17)命名为SNP8、SNP3和SNP5的3个SNP位点;
18)命名为SNP8、SNP4和SNP5的3个SNP位点;
其中:
所述SNP1的Ensembl rs编号为rs3709624,其等位基因为T或C;
所述SNP2的Ensembl rs编号为rs3659787,其等位基因为T或C;
所述SNP3的Ensembl rs编号为rs3722313,其等位基因为T或C;
所述SNP4的Ensembl rs编号为rs3702158,其等位基因为A或G;
所述SNP5的Ensembl rs编号为rs3724876,其等位基因为G或T;
所述SNP6的Ensembl rs编号为rs3712692,其等位基因为G或T;
所述SNP7的Ensembl rs编号为rs3706082,其等位基因为T或C;
所述SNP8的Ensembl rs编号为rs3656801,其等位基因为G或A。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述SNP标记组合为包括SNP1-SNP8这8个SNP位点的组合。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述SNP标记组合为还包括选自命名为SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个位点的至少包括4个SNP位点的组合,所述应用为利用该组合同时对5个小鼠亚系进行鉴定,其中所述5个小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc;其中:
所述SNP9的Ensembl rs编号为rs3023251,其等位基因为T或C;
所述SNP10的Ensembl rs编号为rs3088673,其等位基因为T或G;
所述SNP14的Ensembl rs编号为rs3023177,其等位基因为C或A;
所述SNP16的Ensembl rs编号为rs3089984,其等位基因为A或C。
4.权利要求1-3中任一项所述的SNP标记组合在制备用于鉴定小鼠亚系的试剂盒或液相芯片中的应用,其特征在于,所述试剂盒或液相芯片用于检测所述小鼠亚系的至少3个SNP位点的等位基因,其中所述3个SNP位点为权利要求1中1)-18)中任一组提及的那些,所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg,或所述小鼠亚系选自BALB/cJ和BALB/cCrSlc;或
所述试剂盒或液相芯片用于检测所述小鼠亚系的至少4个SNP位点的等位基因,其中所述4个SNP位点为权利要求1中1)-18)中任一组提及的那些以及SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的任一个;所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc。
5.一种用于扩增权利要求1-4中任一项所述的SNP标记组合的引物组合,其特征在于,所述引物组合用于鉴定小鼠亚系,包括用于扩增权利要求1中1)-18)中任一组提及的3个SNP位点的引物,且所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J和C57BL/6-bg,或所述小鼠亚系选自BALB/cJ和BALB/cCrSlc;或
所述引物组合包括用于扩增权利要求1中1)-18)中任一组提及的3个SNP位点的引物和用于扩增SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个SNP位点的引物,且所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc;
可选地,
用于扩增SNP1位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;
用于扩增SNP2位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
用于扩增SNP3位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;
用于扩增SNP4位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;
用于扩增SNP5位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;
用于扩增SNP6位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;
用于扩增SNP7位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示;
用于扩增SNP8位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示;
用于扩增SNP9位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示;
用于扩增SNP10位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示;
用于扩增SNP14位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示;
用于扩增SNP16位点的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示。
6.权利要求5所述的引物组合在制备用于鉴定小鼠亚系的试剂盒或液相芯片中的应用,其特征在于,所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc。
7.一种用于鉴定小鼠亚系的试剂盒或液相芯片,其特征在于,所述试剂盒或液相芯片包括:A.权利要求5所述的引物组合;
可选地,所述试剂盒或液相芯片还包括:
B.分别针对权利要求1中1)-18)中任一组提及的3个SNP位点,以及任选的SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个SNP位点的野生型和突变型特异性ASPE引物中的一条或多条,其中每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成;可选地,所述特异性引物序列为选自SEQ ID NO:33-52、SEQ ID NO:59-60、和SEQID NO:63-64中的序列;进一步可选地,所述tag序列为选自SEQ ID NO:65-80中的序列;和
C.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球,所述anti-tag序列相应地与B中所述tag序列互补配对;可选地,所述anti-tag序列为选自SEQ ID NO:81-96中的序列。
8.一种小鼠亚系SNP位点的检测方法,其特征在于,使用权利要求7所述的试剂盒或液相芯片对待测小鼠的DNA进行检测,所述小鼠亚系选自C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,使用权利要求7所述的试剂盒或液相芯片,所述检测方法包括以下步骤:
(1)PCR扩增待测小鼠的DNA样品,获得PCR扩增产物;
(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理,获得纯化产物;
(3)用所述特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,获得带有多个生物素标记的反应后产物;
(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应,获得杂交产物;
(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应,得到反应产物;
(6)检测所述反应产物,获得该待测小鼠的SNP位点的等位基因信息。
10.一种鉴定小鼠亚系的方法,其特征在于,所述方法在权利要求9所述的检测方法的基础上还包括以下步骤:
(7)利用获得的待测小鼠的SNP位点的等位基因信息鉴定小鼠亚系;
当使用权利要求1中1)-18)中任一组提及的3个SNP位点的等位基因信息鉴定小鼠亚系时,鉴定过程包括:利用SNP1或SNP5位点的等位基因信息将C57BL/6J与C57BL/6小鼠亚系中的另2个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP2、SNP3或SNP4位点的等位基因信息将C57BL/6N和C57BL/6-bg鉴别开来;同时利用SNP6、SNP7或SNP8位点的等位基因信息将BALB/c小鼠亚系中的BALB/cJ和BALB/cCrSlc鉴别开来;进而实现将包括C57BL/6J、C57BL/6N和C57BL/6-bg在内的3个C57BL/6小鼠亚系相互鉴别开来,或将包括BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的2个BALB/c小鼠亚系鉴别开来;
当使用权利要求1中1)-18)中任一组提及的3个SNP位点和SNP9、SNP10、SNP14和SNP16中的一个或多个SNP位点的等位基因信息鉴定小鼠亚系时,鉴定过程包括:利用SNP1或SNP5位点的等位基因信息将C57BL/6J与其他4个小鼠亚系鉴别开来,随后利用SNP6、SNP7或SNP8位点的等位基因信息将BALB/cJ与剩下的3个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP2、SNP3或SNP4位点的等位基因信息将C57BL/6-bg与剩下的2个小鼠亚系鉴别开来,再利用SNP9、SNP10、SNP14或SNP16位点的等位基因信息将C57BL/6N和BALB/cCrSlc鉴别开来,进而实现同时将包括C57BL/6N、C57BL/6J、C57BL/6-bg、BALB/cJ和BALB/cCrSlc在内的5个小鼠亚系相互鉴别开来。
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CN202310216604.9A Pending CN116334241A (zh) | 2023-03-08 | 2023-03-08 | Snp标记在小鼠亚系鉴定中的应用及引物序列 |
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CN (1) | CN116334241A (zh) |
-
2023
- 2023-03-08 CN CN202310216604.9A patent/CN116334241A/zh active Pending
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