CN115948470A - 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents
重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115948470A CN115948470A CN202210779278.8A CN202210779278A CN115948470A CN 115948470 A CN115948470 A CN 115948470A CN 202210779278 A CN202210779278 A CN 202210779278A CN 115948470 A CN115948470 A CN 115948470A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid molecule
- tcr
- cell line
- molecule encoding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 58
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101000738413 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102100037911 T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 101000738335 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100037906 T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 10
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 8
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 8
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 6
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 claims description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 claims description 3
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 claims description 3
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108700008119 phleomycin D1 Proteins 0.000 claims description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 89
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 41
- 101000946863 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100035891 T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 54
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 3
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- -1 CD (CD 3H Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010083312 T-Cell Antigen Receptor-CD3 Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种重组慢病毒载体和293T‑CD3细胞系及其构建方法与应用。该重组慢病毒载体包含CD3D、CD3G、CD3E和CD247表达盒；其中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247各分子间以2A肽编码核酸分子相连，并在3′端连接真核抗性基因；且CD3D、CD3G、CD3E、CD247和真核抗性基因位于同一表达盒内。本发明还提供一种基因改造的293T‑CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T‑CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR‑慢病毒的滴度奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
293T细胞是由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。同时，293T细胞容易被VSV-G包膜的慢病毒转导，因此293T细胞广泛应用于慢病毒的包装。
慢病毒是细胞工程领域的主要传递载体，但目前还没有统一的慢病毒滴定的标准。目前最常规的慢病毒滴度的方法是使用qPCR来估计前病毒拷贝的数量，该前病毒已经整合到了滴定细胞的基因组中。
当293T细胞用于检测表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，如果按照传统的qPCR法通过估计前病毒拷贝的数量来测定病毒滴度的话，由于存在TCR基因可能无法表达的情况或者是TCR能够表达但无法呈递到细胞表面的情况，会导致检测到病毒滴度与实际的病毒存在较大差异，从而限制了293T细胞在该领域中的应用。
因此，有必要对滴定表达TCR的慢病毒的方法进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明提供一种基因改造的293T-CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T-CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR-慢病毒的滴度奠定了基础。
第一方面，本发明提供一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子；其中，各编码核酸分子间以2A肽编码核酸分子相连；且CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子位于同一表达盒内。
本发明中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子在所述表达盒中的连接顺序没有特别的限制，只要表达后能够组装成完整的CD3分子即可。根据本发明一种优选的实施方式，在所述表达盒中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子从5’端到3’端按顺序依次连接。
本发明中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247的核苷酸序列可以为CD3D、CD3G、CD3E和CD247的公知序列，优选分别如SEQ ID No.1-4所示。
本发明中，所述2A肽编码核酸分子可以选自F2A的编码核酸分子、T2A的编码核酸分子、E2A的编码核酸分子和P2A的编码核酸分子等中的至少一种。其中，所述F2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.6所示。所述T2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.7所示。所述E2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.8所示。所述P2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.9所示。
本发明中，尽管只要将各编码核酸分子以2A肽编码核酸分子相间隔即可实现本发明的目的，但本发明的发明人在研究中发现，当各编码核酸分子间以如下方式相连时能够进一步提高以本发明方法测定的滴度的准确性。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述表达盒包含编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247的核酸分子，更优选地，所述表达盒包含如SEQ ID NO.5所示的核酸分子。
进一步地，所述表达盒还包含抗性基因。
优选地，所述抗性基因位于所述表达盒的3’端。
优选地，所述抗性基因为真核抗性基因。更优选地，所述真核抗性基因为潮霉素抗性基因(HygR)、杀稻瘟菌素S抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或腐草霉素D1抗性基因等。
本发明中，所述表达盒优选由真核启动子驱动；所述真核启动子优选为EF-1α、CMV、SV40或PGK1等。
本发明中，所述表达盒的终止子优选为TGA、TAG或TAA。
优选地，所述表达盒包含真核抗性基因，在这种情况下，CD3D、CD3G、CD3E、CD247和真核抗性基因的顺序可以互换，各2A肽编码核酸分子也可以互换。但本发明的发明人在研究中发现，如果真核抗性基因位于CD3相关元件之间，会降低CD3各分子表达时的剪切效率(降低率在2-5％之间)，从而影响CD3分子的完整表达率，因此，优选地，CD3D、CD3G、CD3E、CD247的插入位点介于启动子(如EF-1α)之后和真核抗性基因(例如HygR)之前，以保证CD3分子在真核细胞中的完整表达。根据本发明一种优选的实施方式，所述抗性基因为潮霉素抗性基因(HygR)，所述表达盒包含编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247-P2A-HygR的核酸分子。
本发明的重组慢病毒载体中，酶切位点不是必需的，即，可以不含有酶切位点。
第二方面，本发明提供一种293T-CD3细胞系，其含有上述的重组慢病毒载体，且所述293T-CD3细胞系能够表达CD3蛋白。
本发明还提供一种293T-CD3细胞系(生物材料名称293T-CD3-3#)，其保藏编号为CGMCC NO.45185。该细胞系在表达TCR的慢病毒的滴度测定方面具有显著优势，其具有更高的准确率。
第三方面，本发明提供293T-CD3细胞系的构建方法，其包括：将上述的重组慢病毒载体和慢病毒包装载体转染293T细胞，获得包装的慢病毒颗粒，然后用所述慢病毒颗粒转染293T细胞。
第四方面，本发明提供上述293T-CD3细胞系或按照上述构建方法获得的293T-CD3细胞系在测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度中的应用。
其中，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用，例如在科研阶段用于初步测定TCR的表达，在产品生产中对制备的TCR病毒的滴度进行检测/质控等。
第五方面，本发明提供一种测定表达TCR的慢病毒的滴度的方法，其包括以下步骤：
(1)使表达TCR的慢病毒感染上述293T-CD3细胞系或按照上述构建方法获得的293T-CD3细胞系；
(2)用抗CD3的抗体对感染的293T-CD3细胞进行染色，并检测细胞阳性率；
(3)通过细胞阳性率计算所述表达TCR的慢病毒的滴度。
本发明中，所述细胞阳性率可以通过流式进行检测。
本发明中，可以通过波松分布累积阳性率(如表1所示)来反推MOI(感染复数，感染时病毒与细胞数量的比值)精确值，然后根据病毒数目计算病毒滴度。
第六方面，本发明提供一种用于测定表达TCR的慢病毒的滴度的试剂盒，所述试剂盒包含上述293T-CD3细胞系或按照上述构建方法获得的293T-CD3细胞系。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的基因改造的293T-CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，可直接通过测定CD3来间接反应TCR的表达量，为流式检测TCR的表达，进而更快更简便地判断TCR-慢病毒的滴度奠定了基础。
(二)相较于使用TCR的抗体，由于其制备困难，且不同TCR的抗体不同，使用CD3抗体对CD3进行检测来间接反应TCR的表达，一方面，可以有效控制成本，另一方面，大大简化了操作程序。
(三)由于TCR通常以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物，因此，通过测定CD3来反应TCR的表达具有理论上的可操作性，且测定的滴度更接近于真实的活性病毒数，对后续使用的指导意义更强。
(四)当293T细胞用于检测表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，如果按照传统的qPCR法通过估计前病毒拷贝的数量来测定病毒滴度的话，由于存在TCR基因可能无法表达的情况或者是TCR能够表达但无法呈递到细胞表面的情况，会导致检测到病毒滴度与实际的病毒存在较大的差异，而用本发明提供的293T-CD3细胞株测定病毒滴度，测定结果与实际结果一致性更高。
(五)本发明提供的293T-CD3细胞系CGMCC NO.45185在表达TCR的慢病毒的滴度测定方面具有显著优势，其具有更高的准确率。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中构建的重组慢病毒载体lenti-CD3-HYG质粒图谱。
图2为本发明较佳实施例中抗CD3-FITC染色流式检测结果。其中，纵坐标SSC-A即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度或复杂程度。横坐标Comp-GFP-A表示CD3-FITC抗体染色后的荧光强度，越靠右代表细胞表面结合的荧光抗体越多。
图3为lenti-T1367载体的图谱。
图4为lenti-T1405载体的图谱。
具体实施方式
本发明提供一种基因改造的293T-CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T-CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR-慢病毒的滴度提供有效技术手段。
本发明还提供一种重组慢病毒载体，其是携带全部4种类型CD3亚基表达基因的慢病毒载体。该慢病毒载体可用于包装病毒，然后使用包装获得的病毒转导293T细胞，通过抗性筛选即可获得293T-CD3细胞株。
本发明还提供一种293T-CD3细胞株的制备方法，该方法包括：
(1)使用上述重组慢病毒载体和慢病毒包装载体转染293T细胞，以进行慢病毒的包装，获得包装的慢病毒颗粒；
(2)使用步骤(1)的慢病毒颗粒转导293T细胞，并通过筛选获得293T-CD3细胞株。
本发明还提供按照上述方法获得的293T-CD3细胞株。
本发明还提供所述293T-CD3细胞株在测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度中的应用。
本发明还提供一种测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度的方法，该方法包括：
(1)使表达TCR的慢病毒感染所述的293T-CD3细胞株；
(2)使用抗CD3的抗体对感染的293T-CD3细胞株进行染色，并检测细胞阳性率；
(3)通过细胞阳性率计算表达TCR的慢病毒的滴度。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括所述的293T-CD3细胞株。
需要说明的是，本发明所提及的TCR可以为现有的以及未来可能开发的任意TCR，只要需要测定表达该TCR的慢病毒的病毒滴度，无论该TCR有没有生物学功能，皆可通过本发明的技术方案实现。例如，本发明中所述的TCR可以为HPV相关的TCR，可以为KRAS相关的TCR，可以为MAGE-A1相关的TCR，可以为gp100相关的TCR，等等。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1重组慢病毒载体的构建
本实施例在慢病毒载体lentiCas9-Blast(购自addgene，货号52962)中插入CD3-HYG表达盒，得到构建的重组慢病毒载体(lenti-CD3-HYG，如图1所示)，其中，CD3D、CD3G、CD3E、CD247(CD3H,CD3Q,CD3Z)，各分子间以F2A、T2A、E2A相连，序列为如SEQ ID NO.5所示的核酸序列，并后接P2A肽(序列SEQ ID NO.9所示核苷酸编码的肽)和HygR(本领域公知序列)表达框。
其中，启动子EF-1α可以替换为常规的真核启动子，包括但不限于CMV、SV40、PGK1。
抗性基因HygR也可以替换为其他的常规抗生素抗性基因，如杀稻瘟菌素S抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或腐草霉素D1抗性基因等。
插入基因的终止子为TGA、TAG或TAA。
此外，本发明的载体构建中酶切位点不是必需的，即，可以不含有上述酶切位点。
实施例2 293T-CD3细胞系的构建
用上述构建的lenti-CD3-HYG载体和慢病毒包装载体pCMV-VSV-G(购自addgene，货号8454)、psPAX2(购自addgene，货号12260)共同转导293T细胞，细胞内包装慢病毒，然后浓缩纯化慢病毒，最后以包装获得的慢病毒转导293T细胞，利用慢病毒载体所含抗性对应的抗生素HygR持续作用转导后的细胞，得到293T-CD3细胞。
本实施例进一步对以上述方法得到的293T-CD3细胞株进行遗传稳定性测试，以及按照实施例3的方法进行准确率测试，最终筛选出一株准确率高且遗传性能稳定的293T-CD3细胞株(生物材料名称293T-CD3-3#)，其于2022年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名：293T细胞(人肾上皮细胞)，保藏编号为CGMCCNO.45185。
实施例3TCR病毒滴度测定
本实施例提供一种TCR病毒滴度测定方法，具体包括：
1、1:50稀释的饱和I型鼠尾胶原蛋白处理12孔板，500μl/孔，包被1分钟，吸净胶原液体。
2、将293T-CD3细胞接种至12孔板，每个孔接种2×105个细胞。
3、在慢病毒载体lentiCas9-Blast(购自addgene，货号52962)中插入T1367(一个针对MAGE A1，HLA-A*0201限制性的TCR，序列如SEQ ID No.10所示)表达盒，得到重组慢病毒载体lenti-T1367，载体图谱如图3所示。用构建的lenti-T1367载体和慢病毒包装载体pCMV-VSV-G(购自addgene，货号8454)、psPAX2(购自addgene，货号12260)共同转染293T细胞，包装好的慢病毒(T1367 TCR)分泌到上清中，然后浓缩纯化慢病毒。按比例稀释浓缩的T1367 TCR慢病毒。具体为取9μl病毒，倍比稀释。取8μl稀释过的病毒液，对应含4、2、1、0.5、0.25μl病毒原液，加入到293T-CD3细胞孔中，混匀。
4、培养感染过夜，24hr后加入新的含有10％(体积)胎牛血清的DMEM培养基。
5、感染48小时后，胰蛋白酶充分消化细胞以使得细胞分散为单个细胞，抗CD3-FITC染色，流式检测细胞阳性率。取阳性率在10％～60％各孔计算得到病毒滴度的平均值。根据波松分布累积阳性率(表1)，反推MOI(感染复数，感染时病毒与细胞数量的比值)精确值，然后根据病毒数目计算病毒滴度。
例如，感染时细胞数目为2×105，1μl病毒原液孔流式阳性率45.12％，则MOI对应0.6，感染时病毒的数量为0.6×2×105＝1.2×105个TU，则病毒滴度为1.2×105TU/μl＝1.2×108TU/ml。
具体抗CD3-FITC染色流式检测结果及计算获得的病毒滴度如图2所示。
细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。因此根据细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，可对细胞进行分群和分类。
图2中，A：转导阳性率49.9％，经计算其病毒滴度为1.38×108TU/ml；B：转导阳性率13.6％，经计算其病毒滴度为2.9×107TU/ml；C：转导阳性率33.9％，经计算其病毒滴度为8.2×107TU/ml。
6、取步骤5充分消化的细胞，进行TCR染色，染色抗体分别是PE anti-human CD3(购自Biolegend，货号300308)、APC-anti-mouse TCRβchain(购自Biolegend，货号109212)，流式检测TCR阳性细胞的阳性率，并按照如下方法计算本发明方法的准确性。
准确率(％)＝CD3-FITC染色阳性率/TCR染色阳性率×100％；
结果显示，准确率在95-99％之间。
本实施例进一步通过对表达T1405 TCR(一个针对MAGE A1，HLA-A*0201限制性的TCR，序列如SEQ ID No.11所示)的病毒按照如上的方法进行病毒滴度测试(在慢病毒载体lentiCas9-Blast中插入T1405表达盒，得到的重组慢病毒载体lenti-T1405的图谱如图4所示)，并进一步计算准确率，准确率均在准确率在95-99％之间。
表1
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包含CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子；其中，各编码核酸分子间以2A肽编码核酸分子相连；且CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子位于同一表达盒内。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒还包含抗性基因；
优选地，所述抗性基因位于所述表达盒的3’端；和/或
所述抗性基因为真核抗性基因；
更优选地，所述真核抗性基因为潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素S抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或腐草霉素D1抗性基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述2A肽编码核酸分子选自F2A的编码核酸分子、T2A的编码核酸分子、E2A的编码核酸分子和P2A的编码核酸分子中的至少一种；和/或
CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子从5’端到3’端按顺序依次连接；和/或
CD3D、CD3G、CD3E和CD247的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-4所示；
优选地，所述表达盒包含编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247的核酸分子；
更优选地，所述表达盒包含如SEQ ID NO.5所示的核酸分子；和/或
所述表达盒包含编码CD3D-F2A-CD3G-T2A-CD3E-E2A-CD247-P2A-HygR的核酸分子。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒由真核启动子驱动；所述真核启动子优选为EF-1α、CMV、SV40或PGK1；和/或
所述表达盒的终止子为TGA、TAG或TAA。
5.293T-CD3细胞系，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.45185。
6.293T-CD3细胞系，其特征在于，所述293T-CD3细胞系含有权利要求1-4任一项所述的重组慢病毒载体，且所述293T-CD3细胞系能够表达CD3蛋白。
7.293T-CD3细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将权利要求1-4任一项所述的重组慢病毒载体和慢病毒包装载体转染293T细胞，获得包装的慢病毒颗粒，然后用所述慢病毒颗粒转染293T细胞。
8.权利要求5或6所述的293T-CD3细胞系或按照权利要求7所述的构建方法获得的293T-CD3细胞系在测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度中的应用。
9.一种测定表达TCR的慢病毒的滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使表达TCR的慢病毒感染权利要求5或6所述的293T-CD3细胞系或权利要求7所述的构建方法获得的293T-CD3细胞系；
(2)用抗CD3的抗体对感染的293T-CD3细胞进行染色，并检测细胞阳性率；
(3)通过细胞阳性率计算所述表达TCR的慢病毒的滴度。
10.用于测定表达TCR的慢病毒的滴度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求5或6所述293T-CD3细胞系或权利要求7所述的构建方法获得的293T-CD3细胞系。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311238070.6A CN118516410A (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 |
| CN202210779278.8A CN115948470B (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210779278.8A CN115948470B (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311238070.6A Division CN118516410A (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115948470A true CN115948470A (zh) | 2023-04-11 |
| CN115948470B CN115948470B (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=87281213
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210779278.8A Active CN115948470B (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 |
| CN202311238070.6A Pending CN118516410A (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311238070.6A Pending CN118516410A (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN115948470B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107557388A (zh) * | 2017-07-26 | 2018-01-09 | 生研医药科技（武汉）有限公司 | 一种用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用 |
| CN112111606A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-22 | 深圳普瑞金生物药业有限公司 | 检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法 |
| CN112430582A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-02 | 北京艺妙神州医药科技有限公司 | 一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法 |
-
2022
- 2022-07-01 CN CN202210779278.8A patent/CN115948470B/zh active Active
- 2022-07-01 CN CN202311238070.6A patent/CN118516410A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107557388A (zh) * | 2017-07-26 | 2018-01-09 | 生研医药科技（武汉）有限公司 | 一种用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用 |
| CN112111606A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-22 | 深圳普瑞金生物药业有限公司 | 检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法 |
| CN112430582A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-02 | 北京艺妙神州医药科技有限公司 | 一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN118516410A (zh) | 2024-08-20 |
| CN115948470B (zh) | 2023-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stove et al. | Human immunodeficiency virus Nef induces rapid internalization of the T-cell coreceptor CD8αβ | |
| Buck et al. | Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors | |
| Zhang et al. | A tumor necrosis factor receptor family protein serves as a cellular receptor for the macrophage-tropic equine lentivirus | |
| WO2022179349A1 (zh) | 新型冠状病毒抗原及其应用 | |
| Oyaizu et al. | Complementation of the function of glycoprotein H of human herpesvirus 6 variant A by glycoprotein H of variant B in the virus life cycle | |
| Li et al. | Simian virus 40 Vp1 DNA-binding domain is functionally separable from the overlapping nuclear localization signal and is required for effective virion formation and full viability | |
| EP4222269A1 (en) | Viral vectors and uses thereof | |
| CN113106094B (zh) | 增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用 | |
| Han et al. | Role of variable regions A and B in receptor binding domain of amphotropic murine leukemia virus envelope protein | |
| JP2024028802A (ja) | レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法 | |
| CN110358733B (zh) | 一株稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系及应用 | |
| Leavitt et al. | Concordant modulation of neutralization resistance and high infectivity of the primary human immunodeficiency virus type 1 MN strain and definition of a potential gp41 binding site in gp120 | |
| Kuroda et al. | Human immunodeficiency virus type 1 envelope epitope-specific CD4+ T lymphocytes in simian/human immunodeficiency virus-infected and vaccinated rhesus monkeys detected using a peptide-major histocompatibility complex class II tetramer | |
| CN115948470A (zh) | 重组慢病毒载体和293t-cd3细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN110244039B (zh) | 一种检测j亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒及其应用 | |
| Delebecque et al. | A chimeric human T-cell lymphotropic virus type 1 with the envelope glycoprotein of Moloney murine leukemia virus is infectious for murine cells | |
| KR20080108563A (ko) | 과립구 항체 검출용 패널세포 | |
| Tang et al. | Maturation of human herpesvirus 6A glycoprotein O requires coexpression of glycoprotein H and glycoprotein L | |
| CN110261599B (zh) | 一种检测a、b亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒及其应用 | |
| Stephenson et al. | Analysis of antigenic determinants of structural polypeptides of avian type C tumor viruses | |
| CN116003624B (zh) | Sirt1融合蛋白及其用途 | |
| Wakata et al. | The combination of gQ1 and gQ2 in human herpesvirus 6A and 6B regulates the viral tetramer function for their receptor recognition | |
| CN115247190B (zh) | 慢病毒包装系统、其所制得的慢病毒及经该慢病毒转导的细胞及其应用 | |
| DiFronzo et al. | Ikaros, a lymphoid-cell-specific transcription factor, contributes to the leukemogenic phenotype of a mink cell focus-inducing murine leukemia virus | |
| CN110791470B (zh) | 一种对目标蛋白的稳定性和亲和力同时进行优化的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |