CN110129366A - 一种载体组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种载体组合及其应用，属于基因工程技术领域。所述载体组合包括pCpf1‑sgRNA和pY010‑RR；所述pCpf1‑sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述pY010‑RR的构建方法包括：将CPF4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010‑RR；所述CPF4077基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的载体组合，可以识别48bp的靶标DNA序列并开展特异性切割，从而使得基因编辑的特异性大大提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种载体组合及其应用。
背景技术
文献:Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-CasSystem.Zetsche B,Gootenberg JS,Abudayyeh OO,Slaymaker IM,Makarova KS,Essletzbichler P,Volz SE,Joung J,van der Oost J,Regev A,Koonin EV,Zhang FCell.2015 Sep23.pii:S0092-8674(15)01200-3.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038)中记载了CRISPR/Cpf1双链断裂基因敲除技术。传统的CRISPR/Cpf1系统识别的PAM序列是5’-TTTV，这种靶点在基因组中比较稀少，从而导致它的应用范围狭窄。CRISPR/Cpf1-RR突变体将识别范围扩展到了3’-TYCV，这种靶点在基因组中相对较多，显著扩展了CRISPR/Cpf1基因敲除的靶标范围。
虽然CRISPR/Cpf1-RR突变体扩展了CRISPR/Cpf1基因敲除的靶标范围，但是由于它仅仅识别24nt左右的碱基，这就决定了它仍然会存在一定的潜在脱靶效应。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种载体组合和应用，采用本发明提供的载体组合在基因编辑时，可识别48nt的靶标DNA序列。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种载体组合，所述载体组合包括pCpf1-sgRNA和pY010-RR；
所述pCpf1-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述pY010-RR的构建方法包括：将CPF4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010-RR；
所述CPF4077基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述pCpf1-sgRNA中的sgRNA表达框的序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述pCpf1-sgRNA的构建方法包括：将上述技术方案中的sgRNA表达框插入到pUC57载体中，得到pCpf1-sgRNA。
本发明还提供了上述技术方案所述的载体组合在在哺乳动物的基因编辑中的应用。
优选的，包括以下步骤：
1)根据哺乳动物的基因组上的基因设计两对单链DNA寡核苷酸，将所述两对单链DNA寡核苷酸分别退火，得到两个双链DNA片段；
2)将所述步骤1)得到的两个双链DNA片段分别插入到上述技术方案所述的pCpf1-sgRNA的sgRNA表达框中，得到两个载体；
3)将所述步骤2)得到的两个载体与上述技术方案所述的pY010-RR共转染到哺乳动物细胞中，实现对哺乳动物的基因编辑。
优选的，所述步骤3)两个载体与pY010-RR的质量比为(1～5):(1～5):(1～5)。
优选的，所述步骤1)单链DNA寡核苷酸的长度为20～30nt。
本发明一种载体组合和应用，所述载体组合包括pCpf1-sgRNA和pY010-RR；所述pCpf1-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述pY010-RR的构建方法包括：将CFP4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010-RR；所述CFP4077基因片段的核苷酸序列如SEQID No.2所示。采用本发明提供的载体组合在基因编辑时，可识别48nt的靶标DNA序列。在本发明中，所述pY010-RR需要和一对(即2个)pCpf1-sgRNA靶标表达载体组合才能够发挥DNA双链断裂的功能，一个靶标载体识别24个碱基，一对靶标载体自然就识别48个的碱基序列。
本发明的有益效果：采用本发明提供的载体组合，可以识别48bp的靶标DNA序列并开展特异性切割，从而使得基因编辑的特异性大大提高。
附图说明
图1为pY010-RR质粒双酶切鉴定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种载体组合，所述载体组合包括pCpf1-sgRNA和pY010-RR；所述pCpf1-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述pY010-RR的构建方法包括：将CPF4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010-RR；
所述CPF4077基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述pCpf1-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgtaatttctactcttgtagatgggtcttcgagaagacctgcttttttctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaatcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc。
在本发明中，所述pCpf1-sgRNA的构建方法优选包括：将sgRNA表达框插入到pUC57载体中，得到pCpf1-sgRNA。本发明对所述sgRNA插入到pUC57载体的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
在本发明中，所述pCpf1-sgRNA中的sgRNA表达框的序列如SEQ IDNo.3所示，具体序列如下所示：
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgtaatttctactcttgtagatgggtcttcgagaagacctgcttttttctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctgggga。
在本发明中，所述pCpf1-sgRNA包括氨苄青霉素抗性的载体骨架和sgRNA表达框，所述氨苄青霉素抗性的载体骨架来自pUC57载体，所述sgRNA表达框的序列如SEQ ID No.3所示。在本发明中，所述pCpf1-sgRNA为向导RNA表达载体。
在本发明中，所述pY010-RR的构建方法包括：将CPF4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010-RR。
本发明对所述将CPF4077基因片段插入到pY010载体中的方法没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述CPF4077基因片段取代pY010载体中原有的Cpf1编码序列，实现Cpf1蛋白的RR突变。
在本发明中，所述CPF4077基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
ggtaccgccaccatgacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgcggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggacaaggcccgcaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgatcggatctacaagacctatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatcgactcctatagaaaggagaaaaccgaggagacaaggaacgccctgatcgaggagcaggccacatatcgcaatgccatccacgactacttcatcggccggacagacaacctgaccgatgccatcaataagagacacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggcaaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcggagcttcgacaagtttacaacctacttctccggcttttatgagaacaggaagaacgtgttcagcgccgaggatatcagcacagccatcccacaccgcatcgtgcaggacaacttccccaagtttaaggagaattgtcacatcttcacacgcctgatcaccgccgtgcccagcctgcgggagcactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtgttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtataaccagctgctgggaggaatctctcgggaggcaggcaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtgctgaatctggccatccagaagaatgatgagacagcccacatcatcgcctccctgccacacagattcatccccctgtttaagcagatcctgtccgataggaacaccctgtctttcatcctggaggagtttaagagcgacgaggaagtgatccagtccttctgcaagtacaagacactgctgagaaacgagaacgtgctggagacagccgaggccctgtttaacgagctgaacagcatcgacctgacacacatcttcatcagccacaagaagctggagacaatcagcagcgccctgtgcgaccactgggatacactgaggaatgccctgtatgagcggagaatctccgagctgacaggcaagatcaccaagtctgccaaggagaaggtgcagcgcagcctgaagcacgaggatatcaacctgcaggagatcatctctgccgcaggcaaggagctgagcgaggccttcaagcagaaaaccagcgagatcctgtcccacgcacacgccgccctggatcagccactgcctacaaccctgaagaagcaggaggagaaggagatcctgaagtctcagctggacagcctgctgggcctgtaccacctgctggactggtttgccgtggatgagtccaacgaggtggaccccgagttctctgcccggctgaccggcatcaagctggagatggagccttctctgagcttctacaacaaggccagaaattatgccaccaagaagccctactccgtggagaagttcaagctgaactttcagatgcctacactggcccggggctgggacgtgaataaggagaagaacaatggcgccatcctgtttgtgaagaacggcctgtactatctgggcatcatgccaaagcagaagggcaggtataaggccctgagcttcgagcccacagagaaaaccagcgagggctttgataagatgtactatgactacttccctgatgccgccaagatgatcccacggtgcagcacccagctgaaggccgtgacagcccactttcagacccacacaacccccatcctgctgtccaacaatttcatcgagcctctggagatcacaaaggagatctacgacctgaacaatcctgagaaggagccaaagaagtttcagacagcctacgccaagaaaaccggcgaccagaagggctacagagaggccctgtgcaagtggatcgacttcacaagggattttctgtccaagtataccaagacaacctctatcgatctgtctagcctgcggccatcctctcagtataaggacctgggcgagtactatgccgagctgaatcccctgctgtaccacatcagcttccagagaatcgccgagaaggagatcatggatgccgtggagacaggcaagctgtacctgttccagatctataacaaggactttgccaagggccaccacggcaagcctaatctgcacacactgtattggaccggcctgttttctccagagaacctggccaagacaagcatcaagctgaatggccaggccgagctgttctaccgccctaagtccaggatgaagaggatggcacaccggctgggagagaagatgctgaacaagaagctgaaggatcagaaaaccccaatccccgacaccctgtaccaggagctgtacgactatgtgaatcacagactgtcccacgacctgtctgatgaggccagggccctgctgcccaacgtgatcaccaaggaggtgtctcacgagatcatcaaggataggcgctttaccagcgacaagttctttttccacgtgcctatcacactgaactatcaggccgccaattccccatctaagttcaaccagagggtgaatgcctacctgaaggagcaccccgagacacctatcatcggcatcgatcggggcgagagaaacctgatctatatcacagtgatcgactccaccggcaagatcctggagcagcggagcctgaacaccatccagcagtttgattaccagaagaagctggacaacagggaggccgagagggtggcagcaaggcaggcctggtctgtggtgggcacaatcaaggatctgaagcagggctatctgagccaggtcatccacgagatcgtggacctgatgatccactaccaggccgtggtggtgctggagaacctgaatttcggctttaagagcaagaggaccggcatcgccgagaaggccgtgtaccagcagttcgagaagatgctgatcgataagctgaattgcctggtgctgaaggactatccagcagagaaagtgggaggcgtgctgaacccataccagctgacagaccagttcacctcctttgccaagatgggcacccagtctggcttcctgttttacgtgcctgccccatatacatctaagatcgatcccctgaccggcttcgtggaccccttcgtgtggaaaaccatcaagaatcacgagagccgcaagcacttcctggagggcttcgactttctgcactacgacgtgaaaaccggcgacttcatcctgcactttaagatgaacagaaatctgtccttccagaggggcctgcccggctttatgcctgcatgggatatcgtgttcgagaagaacgagacacagtttgacgccaagggcacccctttcatcgccggcaagagaatcgtgccagtgatcgagaatcacagattcaccggcagataccgggacctgtatcctgccaacgagctgatcgccctgctggaggagaagggcatcgtgttcagggatggctccaacatcctgccaaagctgctggagaatgacgattctcacgccatcgacaccatggtggccctgatccgcagcgtgctgcagatggccaactccaatgccgccacaggcgaggactatatcaacagccccgtgcgcgatctgaatggcgtgtgcttcgactcccggtttcagaacccagagtggcccatggacgccgatgccaatggcgcctaccacatcgccctgaagggccagctgctgctgaatcacctgaaggagagcaaggatctgaagctgcagaacggcatctccaatcaggactggctggcctacatccaggagctgcgcaacaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggatcctacccatacgatgttccagattacgcttatccctacgacgtgcctgattatgcatacccatatgatgtccccgactatgcctaagaattc。
在本发明中，所述pY010-RR包括氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的载体骨架、Cpf1-RR蛋白的表达框(部分序列来自pY010载体，部分序列为生物公司合成)。在本发明中，所述pY010-RR表达Cpf1蛋白的RR突变体(Cpf1-RR)。在本发明中，所述Cpf1-RR蛋白是由Cpf1基因的RR突变体表达的，可以与sgRNA合作识别并切割靶标DNA双链。
在本发明中，所述Cpf1-RR蛋白的表达框包括CMV启动子和bGHpA终止信号，分别位于pY010载体全序列的235-614和5334-5762区段，所述生物公司合成的序列为CPF4077基因片段，序列如SEQ ID No.2，CPF4077基因编码Cpf1-RR蛋白。
本发明还提供了上述技术方案所述的载体组合在在哺乳动物的基因编辑中的应用。
在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：
1)根据哺乳动物的基因组上的基因设计两对单链DNA寡核苷酸，将所述两对单链DNA寡核苷酸分别退火，得到两个双链DNA片段；
2)将所述步骤1)得到的两个双链DNA片段分别插入到上述技术方案所述的pCpf1-sgRNA的sgRNA表达框中，得到两个载体；
3)将所述步骤2)得到的两个载体与上述技术方案所述的pY010-RR共转染到哺乳动物细胞中，实现对哺乳动物的基因编辑。
本发明根据哺乳动物的基因组上的基因设计两对单链DNA寡核苷酸，将所述两对单链DNA寡核苷酸分别退火，得到两个双链DNA片段。本发明对所述设计单链DNA寡核苷酸的原则没有特殊限定，采用常规设计寡核苷酸的原则即可。
本发明将得到的两个双链DNA片段分别插入到上述技术方案所述的pCpf1-sgRNA的sgRNA表达框中，得到两个载体。本发明对所述双链DNA片段插入到pCpf1-sgRNA的sgRNA表达框中的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
在本发明中，所述两个载体与pY010-RR的质量比优选为(1～5):(1～5):(1～5)。在本发明中，所述单链DNA寡核苷酸的长度优选为20～30nt。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
向导RNA表达载体pCpf1-sgRNA的构建及效率
1、向导RNA通用表达载体pCpf1-sgRNA的构建
将sgRNA的序列(SEQ ID No.3)交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆到pUC57载体上，得到pCpf1-sgRNA(SEQ ID No.1)。
靶向特定靶标的sgRNA表达载体pCpf1-T1、pCpf1-T2和pCpf1-T3的构建：
针对绵羊DKK2基因第一外显子区域(SEQ ID No.4)设计三个Cpf1sgRNA靶标。
SEQ ID No.4：
agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagtgcagggcccc gtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatggccgcactgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaaggactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtagggacccg。
合成6条寡核苷酸如下:
T1F(SEQ IDNo.5):AGATTATCCGTATCCTTGCGGGCTTTG；
T1R(SEQ ID No.6):AAGCCAAAGCCCGCAAGGATACGGATA；
T2F(SEQ IDNo.7):AGATGGCGGCAGTAAGAAGGGCAAAAA；
T2R(SEQ ID No.8):AAGCTTTTTGCCCTTCTTACTGCCGCC；
T3F(SEQ IDNo.9):AGATGCCCGCGAGCTGCCGAACTGTGA；
T3R(SEQ ID No.10):AAGCTCACAGTTCGGCAGCTCGCGGGC。
T1-F与T1-R、T2-F与T2-R、T3-F与T3-R两两退火(95℃5min，72℃10min，置冰上)，获得三条双链DNA寡核苷酸(T1、T2、T3)，同时使用BbsⅠ内切酶切割pCpf1-sgRNA载体并纯化，将T1、T2、T3分别与切割后的pCpf1-sgRNA载体连接并转化，经PCR检测、测序(检测和测序采用常规方法即可)获得pCpf1-T1、pCpf1-T2、pCpf1-T3载体。
PCR检测引物(阳性片段120bp):
正向引物用T1F、T2F、T3F。
反向引物用X2sgRNA-R(SEQ ID No.11):
5'CAGTGGGAGTGGCACCTT 3'。
双荧光素酶报告基因活性检测：
使用pCpf1-T1、pCpf1-T2和pCpf1-T3载体分别与pY010质粒、双荧光素酶报告载SSA-DKK2(SEQ ID No.12)以1:1:1的比例共转染猪血管内皮细胞系PIEC，48小时后使用试剂盒检测双荧光素酶报告基因活性(结果如表1)。结果说明，pCpf1-T1、pCpf1-T2、pCpf1-T3载体表达的sgRNA确实具有识别并结合特定DNA靶标的活性，即证明pCpf1-sgRNA通用表达载体是有效的。
表1 双荧光素酶报告基因活性检测(R1是萤火虫荧光素酶的活性值、R2是海肾荧光素酶的活性值)
从表1中可以得出，3个试验组的海肾荧光素酶报告基因的活性显著高于对照组，表明sgRNA可以特异性识别、结合并切割靶标DNA片段，因为唯有如此，SSA-DKK2载体中原本失活的海肾荧光素酶基因才能通过分子内部的同源重组重新获得活性，具体表现为海肾荧光素酶报告基因的活性检测值显著升高。
SEQ ID No.12：
agatctgcgcagcaccatggcctgaaataacctctgaaagaggaacttggttaggtaccttctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgattcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggctagccaccatggcttccaaggtgtacgaccccgagcaacgcaaacgcatgatcactgggcctcagtggtgggctcgctgcaagcaaatgaacgtgctggactccttcatcaactactatgattccgagaagcacgccgagaacgccgtgatttttctgcatggtaacgctgcctccagctacctgtggaggcacgtcgtgcctcacatcgagcccgtggctagatgcatcatccctgatctgatcggaatgggtaagtccggcaagagcgggaatggctcatatcgcctcctggatcactacaagtacctcaccgcttggttcgagctgctgaaccttccaaagaaaatcatctttgtgggccacgactggggggcttgtctggcctttcactactcctacgagcaccaagacaagatcaaggccatcgtccatgctgagagtgtcgtggacgtgatcgagtcctgggacgagtggcctgacatcgaggaggatatcgccctgatcaagagcgaagagggcgagaaaatggtgcttgagaataacttcttcgtcgagaccatgctcccaagcaagatcatgcggaaactggagcctgaggagttcgctgcctacctggagccattcaaggagaagggcgaggttagacggcctaccctctcctggcctcgcgagatccctctcgttaagggaggcaagcccgacgtcaccggtaaaggcgcgccagactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagtgcagggccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatggccgcactgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaaggactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtagggacccggtcgacaaacctgcaggaaaactagtcctcaccgcttggttcgagctgctgaaccttccaaagaaaatcatctttgtgggccacgactggggggcttgtctggcctttcactactcctacgagcaccaagacaagatcaaggccatcgtccatgctgagagtgtcgtggacgtgatcgagtcctgggacgagtggcctgacatcgaggaggatatcgccctgatcaagagcgaagagggcgagaaaatggtgcttgagaataacttcttcgtcgagaccatgctcccaagcaagatcatgcggaaactggagcctgaggagttcgctgcctacctggagccattcaaggagaagggcgaggttagacggcctaccctctcctggcctcgcgagatccctctcgttaagggaggcaagcccgacgtcgtccagattgtccgcaactacaacgcctaccttcgggccagcgacgatctgcctaagatgttcatcgagtccgaccctgggttcttttccaacgctattgtcgagggagctaagaagttccctaacaccgagttcgtgaaggtgaagggcctccacttcagccaggaggacgctccagatgaaatgggtaagtacatcaagagcttcgtggagcgcgtgctgaagaacgagcagtaattctaggcgatcgctcgagcccgggaattcgtttaaacctagagcggccgctggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaggatctaaatgagtcttcggacctcgcgggggccgcttaagcggtggttagggtttgtctgacgcggggggagggggaaggaacgaaacactctcattcggaggcggctcggggtttggtcttggtggccacgggcacgcagaagagcgccgcgatcctcttaagcacccccccgccctccgtggaggcgggggtttggtcggcgggtggtaactggcgggccgctgactcgggcgggtcgcgcgccccagagtgtgaccttttcggtctgctcgcagacccccgggcggcgccgccgcggcggcgacgggctcgctgggtcctaggctccatggggaccgtatacgtggacaggctctggagcatccgcacgactgcggtgatattaccggagaccttctgcgggacgagccgggtcacgcggctgacgcggagcgtccgttgggcgacaaacaccaggacggggcacaggtacactatcttgtcacccggaggcgcgagggactgcaggagcttcagggagtggcgcagctgcttcatccccgtggcccgttgctcgcgtttgctggcggtgtccccggaagaaatatatttgcatgtctttagttctatgatgacacaaaccccgcccagcgtcttgtcattggcgaattcgaacacgcagatgcagtcggggcggcgcggtcccaggtccacttcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcagcgacccgcttaaaagcttggcattccggtactgttggtaaagccaccatggccgatgctaagaacattaagaagggccctgctcccttctaccctctggaggatggcaccgctggcgagcagctgcacaaggccatgaagaggtatgccctggtgcctggcaccattgccttcaccgatgcccacattgaggtggacatcacctatgccgagtacttcgagatgtctgtgcgcctggccgaggccatgaagaggtacggcctgaacaccaaccaccgcatcgtggtgtgctctgagaactctctgcagttcttcatgccagtgctgggcgccctgttcatcggagtggccgtggcccctgctaacgacatttacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatttctcagcctaccgtggtgttcgtgtctaagaagggcctgcagaagatcctgaacgtgcagaagaagctgcctatcatccagaagatcatcatcatggactctaagaccgactaccagggcttccagagcatgtacacattcgtgacatctcatctgcctcctggcttcaacgagtacgacttcgtgccagagtctttcgacagggacaaaaccattgccctgatcatgaacagctctgggtctaccggcctgcctaagggcgtggccctgcctcatcgcaccgcctgtgtgcgcttctctcacgcccgcgaccctattttcggcaaccagatcatccccgacaccgctattctgagcgtggtgccattccaccacggcttcggcatgttcaccaccctgggctacctgatttgcggctttcgggtggtgctgatgtaccgcttcgaggaggagctgttcctgcgcagcctgcaagactacaaaattcagtctgccctgctggtgccaaccctgttcagcttcttcgctaagagcaccctgatcgacaagtacgacctgtctaacctgcacgagattgcctctggcggcgccccactgtctaaggaggtgggcgaagccgtggccaagcgctttcatctgccaggcatccgccagggctacggcctgaccgagacaaccagcgccattctgattaccccagagggcgacgacaagcctggcgccgtgggcaaggtggtgccattcttcgaggccaaggtggtggacctggacaccggcaagaccctgggagtgaaccagcgcggcgagctgtgtgtgcgcggccctatgattatgtccggctacgtgaataaccctgaggccacaaacgccctgatcgacaaggacggctggctgcactctggcgacattgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccgcctgaagtctctgatcaagtacaagggctaccaggtggccccagccgagctggagtctatcctgctgcagcaccctaacattttcgacgccggagtggccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcctgccgccgtcgtcgtgctggaacacggcaagaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggtgacaaccgccaagaagctgcgcggcggagtggtgttcgtggacgaggtgcccaagggcctgaccggcaagctggacgcccgcaagatccgcgagatcctgatcaaggctaagaaaggcggcaagatcgccgtgtaataattctagagtcggggcggccggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcgataaggatccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctgg。
实施例2
质粒载体pY010-RR的构建：
合成4077bp的DNA片段CFP4077(SEQ ID No.2)，通过KpnⅠ与EcoRⅠ双酶切插入到pY010载体中，通过KpnⅠ与EcoRⅠ双酶切鉴定(如图1)并测序验证，获得pY010-RR载体。从图1中可以得出，使用KpnⅠ与EcoRⅠ两种内切酶同时切割质粒载体，获得5.4kb和4.1kb两个条带，说明载体构建成功。
实施例3
实施例1制备的pCpf1-sgRNA和实施例2制备的pY010-RR载体在猪细胞系PIEC中的基因修饰效率：
猪血管内皮细胞系PIEC，购自中国科学院上海细胞库，目录号：GNO15。
1、针对绵羊DKK2基因第一外显子区域(SEQ ID No.4)设计sgRNA靶标的CRISPR/Cpf1sgRNA表达载体的构建：
合成寡核苷酸如下:
RRF1F(SEQ ID No.13):
AGAT CACGGTGCTGGGCCCCCAAAGCCA(13-36)，13-36表示靶标在绵羊DKK2基因第一外显子区域中的位置，以下括号中的数字表明是在基因第一外显子中的位置，不再解释说明；
RRF1R(SEQ ID No.14):AAGC TGGCTTTGGGGGCCCAGCACCGTG
RRF2F(SEQ ID No.15):
AGAT GGCGCCCCGAGTGCAGGGCCCCGT(70-93)
RRF2R(SEQ ID No.16):AAGCACGGGGCCCTGCACTCGGGGCGCC
RRF3F(SEQ ID No.17):
AGAT CATTTGTATCCGTATCCTTGCGGG(111-134)
RRF3R(SEQ IDNo.18):AAGC CCCGCAAGGATACGGATACAAATG
RRF4F(SEQ ID No.19):
AGATTATCCTTGCGGGCTTTGCGCCTCC(123-146)
RRF4R(SEQ IDNo.20):AAGC GGAGGCGCAAAGCCCGCAAGGATA
RRF6F(SEQ ID No.21):
AGAT GCTGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG(203-226)
RRF6R(SEQ IDNo.22):AAGC CCGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAGC
RRF9F(SEQ ID No.23):
AGAT GCGGCAGTAAGAAGGGCAAAAACC(359-382)
RRF9R(SEQ ID No.24):AAGC GGTTTTTGCCCTTCTTACTGCCGC
RRF10F(SEQ ID No.25):
AGATACCAGAAGAGGTAGGGACCCG(420-440)
RRF10R(SEQ ID No.26):AAGC CGGGTCCCTACCTCTTCTGGT
RRR1F(SEQ ID No.27):AGAT CCAACCCCACTTGGCTTTGGGGGC
RRR1R(SEQ ID No.28):
AAGC GCCCCCAAAGCCAAGTGGGGTTGG(24-47)
RRR3F(SEQ ID No.29):AGAT CCGGGGAGGCGCAAAGCCCGCAAG
RRR3R(SEQ ID No.30):
AAGC CTTGCGGGCTTTGCGCCTCCCCGG(127-150)
RRR5F(SEQ ID No.31):AGAT CCATCAGCACCGCGGCCAGTAGGA
RRR5R(SEQ ID No.32):
AAGC TCCTACTGGCCGCGGTGCTGATGG(212-235)
RRR7F(SEQ ID No.33):AGATTACCTGCCCCAGGTTTTTGCCCTT
RRR7R(SEQ ID No.34):
AAGCAAGGGCAAAAACCTGGGGCAGGTA(370-393)。
以上寡核苷酸两两退火(95℃5min，72℃10min，置冰上)，获得11条双链DNA寡核苷酸，分别得到RRF1、RRR1、RRF2、RRR3、RRF3、RRR3、RRF4、RRR5、RRF6、RRR7、RRF9、RRR7、RRF10和RRR7，同时使用BbsⅠ内切酶切割pCpf1-sgRNA载体并纯化，将11条双链DNA寡核苷酸分别与切割后的pCpf1-sgRNA载体连接并转化，经PCR检测、测序(检测和测序采用常规方法即可)获得11个sgRNA表达载体。
PCR检测引物：11对寡核苷酸的正向单链分别与反向引物X2sgRNA-R配对，检测相应载体。
反向引物用X2sgRNA-R(SEQ ID No.35):5'cagtgggagtggcacctt 3'(兼做测序引物)
2、双荧光素酶报告基因检测
使用上一步所得载体两两配对，分别与pY010-RR质粒、双荧光素酶报告载SSA-DKK2(SEQ ID No.14)以1:1:1的比例共转染猪血管内皮细胞系PIEC(购自中国科学院上海细胞库，目录号：GNO15)，48小时后使用试剂盒检测双荧光素酶报告基因活性(结果如表2)。结果说明，本发明构建的pCpf1-sgRNA和pY010-RR载体是有效的，该载体组合可以识别48bp的靶标DNA序列并开展特异性切割，从而使得基因编辑的特异性大大提高(一般的CRISPR/Cpf1系统仅能识别24bp左右的靶标DNA序列，存在一定的脱靶风险)。
载体两两配对方案(根据靶标的方向和相互之间的距离，设计标准是距离较近的靶标尽量组成一对)：
RRF1与RRR1、RRF2与RRR3、RRF3与RRR3、RRF4与RRR5、RRF6与RRR7、RRF9与RRR7、RRF10与RRR7分别两两组合配对。
表2 双荧光素酶报告基因活性检测(R1是萤火虫荧光素酶的活性值、R2是海肾荧光素酶的活性值)
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的载体组合，可以识别48bp的靶标DNA序列并开展特异性切割，从而使得基因编辑的特异性大大提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种载体组合及其应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3238
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 480
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 540
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 600
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 660
tgtggaaagg acgaaacacc gtaatttcta ctcttgtaga tgggtcttcg agaagacctg 720
cttttttcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 780
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 840
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 900
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga atagcaggca tgctggggaa 960
tcggatcccg ggcccgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca 1020
tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 1080
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 1140
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 1200
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 1260
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 1320
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 1380
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 1440
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 1500
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 1560
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 1620
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 1680
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 1740
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 1800
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 1860
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 1920
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 1980
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 2040
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 2100
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 2160
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 2220
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 2280
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 2340
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 2400
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 2460
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 2520
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 2580
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 2640
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 2700
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 2760
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 2820
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 2880
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 2940
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 3000
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 3060
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 3120
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 3180
accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 3238
<210> 2
<211> 4077
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaccgcca ccatgacaca gttcgagggc tttaccaacc tgtatcaggt gagcaagaca 60
ctgcggtttg agctgatccc acagggcaag accctgaagc acatccagga gcagggcttc 120
atcgaggagg acaaggcccg caatgatcac tacaaggagc tgaagcccat catcgatcgg 180
atctacaaga cctatgccga ccagtgcctg cagctggtgc agctggattg ggagaacctg 240
agcgccgcca tcgactccta tagaaaggag aaaaccgagg agacaaggaa cgccctgatc 300
gaggagcagg ccacatatcg caatgccatc cacgactact tcatcggccg gacagacaac 360
ctgaccgatg ccatcaataa gagacacgcc gagatctaca agggcctgtt caaggccgag 420
ctgtttaatg gcaaggtgct gaagcagctg ggcaccgtga ccacaaccga gcacgagaac 480
gccctgctgc ggagcttcga caagtttaca acctacttct ccggctttta tgagaacagg 540
aagaacgtgt tcagcgccga ggatatcagc acagccatcc cacaccgcat cgtgcaggac 600
aacttcccca agtttaagga gaattgtcac atcttcacac gcctgatcac cgccgtgccc 660
agcctgcggg agcactttga gaacgtgaag aaggccatcg gcatcttcgt gagcacctcc 720
atcgaggagg tgttttcctt ccctttttat aaccagctgc tgacacagac ccagatcgac 780
ctgtataacc agctgctggg aggaatctct cgggaggcag gcaccgagaa gatcaagggc 840
ctgaacgagg tgctgaatct ggccatccag aagaatgatg agacagccca catcatcgcc 900
tccctgccac acagattcat ccccctgttt aagcagatcc tgtccgatag gaacaccctg 960
tctttcatcc tggaggagtt taagagcgac gaggaagtga tccagtcctt ctgcaagtac 1020
aagacactgc tgagaaacga gaacgtgctg gagacagccg aggccctgtt taacgagctg 1080
aacagcatcg acctgacaca catcttcatc agccacaaga agctggagac aatcagcagc 1140
gccctgtgcg accactggga tacactgagg aatgccctgt atgagcggag aatctccgag 1200
ctgacaggca agatcaccaa gtctgccaag gagaaggtgc agcgcagcct gaagcacgag 1260
gatatcaacc tgcaggagat catctctgcc gcaggcaagg agctgagcga ggccttcaag 1320
cagaaaacca gcgagatcct gtcccacgca cacgccgccc tggatcagcc actgcctaca 1380
accctgaaga agcaggagga gaaggagatc ctgaagtctc agctggacag cctgctgggc 1440
ctgtaccacc tgctggactg gtttgccgtg gatgagtcca acgaggtgga ccccgagttc 1500
tctgcccggc tgaccggcat caagctggag atggagcctt ctctgagctt ctacaacaag 1560
gccagaaatt atgccaccaa gaagccctac tccgtggaga agttcaagct gaactttcag 1620
atgcctacac tggcccgggg ctgggacgtg aataaggaga agaacaatgg cgccatcctg 1680
tttgtgaaga acggcctgta ctatctgggc atcatgccaa agcagaaggg caggtataag 1740
gccctgagct tcgagcccac agagaaaacc agcgagggct ttgataagat gtactatgac 1800
tacttccctg atgccgccaa gatgatccca cggtgcagca cccagctgaa ggccgtgaca 1860
gcccactttc agacccacac aacccccatc ctgctgtcca acaatttcat cgagcctctg 1920
gagatcacaa aggagatcta cgacctgaac aatcctgaga aggagccaaa gaagtttcag 1980
acagcctacg ccaagaaaac cggcgaccag aagggctaca gagaggccct gtgcaagtgg 2040
atcgacttca caagggattt tctgtccaag tataccaaga caacctctat cgatctgtct 2100
agcctgcggc catcctctca gtataaggac ctgggcgagt actatgccga gctgaatccc 2160
ctgctgtacc acatcagctt ccagagaatc gccgagaagg agatcatgga tgccgtggag 2220
acaggcaagc tgtacctgtt ccagatctat aacaaggact ttgccaaggg ccaccacggc 2280
aagcctaatc tgcacacact gtattggacc ggcctgtttt ctccagagaa cctggccaag 2340
acaagcatca agctgaatgg ccaggccgag ctgttctacc gccctaagtc caggatgaag 2400
aggatggcac accggctggg agagaagatg ctgaacaaga agctgaagga tcagaaaacc 2460
ccaatccccg acaccctgta ccaggagctg tacgactatg tgaatcacag actgtcccac 2520
gacctgtctg atgaggccag ggccctgctg cccaacgtga tcaccaagga ggtgtctcac 2580
gagatcatca aggataggcg ctttaccagc gacaagttct ttttccacgt gcctatcaca 2640
ctgaactatc aggccgccaa ttccccatct aagttcaacc agagggtgaa tgcctacctg 2700
aaggagcacc ccgagacacc tatcatcggc atcgatcggg gcgagagaaa cctgatctat 2760
atcacagtga tcgactccac cggcaagatc ctggagcagc ggagcctgaa caccatccag 2820
cagtttgatt accagaagaa gctggacaac agggaggccg agagggtggc agcaaggcag 2880
gcctggtctg tggtgggcac aatcaaggat ctgaagcagg gctatctgag ccaggtcatc 2940
cacgagatcg tggacctgat gatccactac caggccgtgg tggtgctgga gaacctgaat 3000
ttcggcttta agagcaagag gaccggcatc gccgagaagg ccgtgtacca gcagttcgag 3060
aagatgctga tcgataagct gaattgcctg gtgctgaagg actatccagc agagaaagtg 3120
ggaggcgtgc tgaacccata ccagctgaca gaccagttca cctcctttgc caagatgggc 3180
acccagtctg gcttcctgtt ttacgtgcct gccccatata catctaagat cgatcccctg 3240
accggcttcg tggacccctt cgtgtggaaa accatcaaga atcacgagag ccgcaagcac 3300
ttcctggagg gcttcgactt tctgcactac gacgtgaaaa ccggcgactt catcctgcac 3360
tttaagatga acagaaatct gtccttccag aggggcctgc ccggctttat gcctgcatgg 3420
gatatcgtgt tcgagaagaa cgagacacag tttgacgcca agggcacccc tttcatcgcc 3480
ggcaagagaa tcgtgccagt gatcgagaat cacagattca ccggcagata ccgggacctg 3540
tatcctgcca acgagctgat cgccctgctg gaggagaagg gcatcgtgtt cagggatggc 3600
tccaacatcc tgccaaagct gctggagaat gacgattctc acgccatcga caccatggtg 3660
gccctgatcc gcagcgtgct gcagatggcc aactccaatg ccgccacagg cgaggactat 3720
atcaacagcc ccgtgcgcga tctgaatggc gtgtgcttcg actcccggtt tcagaaccca 3780
gagtggccca tggacgccga tgccaatggc gcctaccaca tcgccctgaa gggccagctg 3840
ctgctgaatc acctgaagga gagcaaggat ctgaagctgc agaacggcat ctccaatcag 3900
gactggctgg cctacatcca ggagctgcgc aacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc 3960
ggccaggcaa aaaagaaaaa gggatcctac ccatacgatg ttccagatta cgcttatccc 4020
tacgacgtgc ctgattatgc atacccatat gatgtccccg actatgccta agaattc 4077
<210> 3
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg taatttctac tcttgtagat gggtcttcga gaagacctgc ttttttctag 300
agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 360
ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 420
ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 480
ggacagcaag ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctgggga 528
<210> 4
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agactgagtt cacacggtgc tgggccccca aagccaagtg gggttggggg aacagagtct 60
gcgagtcccg gcgccccgag tgcagggccc cgtgttgggg tcctccttcc catttgtatc 120
cgtatccttg cgggctttgc gcctccccgg gggacccctc gccgggagat ggccgcactg 180
atgcggggca aggactcctc ccgctgcctg ctcctactgg ccgcggtgct gatggtggag 240
agctcacagt tcggcagctc gcgggccaaa ctcaactcca tcaagtcctc tctgggcggg 300
gagacgcctg cccaggccgc caatcgatct gcgggcactt accaaggact ggctttcggc 360
ggcagtaaga agggcaaaaa cctggggcag gtaggaaaat acccccaata cactcttcaa 420
ccagaagagg tagggacccg 440
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agattatccg tatccttgcg ggctttg 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagccaaagc ccgcaaggat acggata 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatggcggc agtaagaagg gcaaaaa 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagctttttg cccttcttac tgccgcc 27
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agatgcccgc gagctgccga actgtga 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagctcacag ttcggcagct cgcgggc 27
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagtgggagt ggcacctt 18
<210> 12
<211> 7123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agatctgcgc agcaccatgg cctgaaataa cctctgaaag aggaacttgg ttaggtacct 60
tctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag 120
gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg 180
gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 240
caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 300
attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 360
cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa 420
agcttgattc ttctgacaca acagtctcga acttaagctg cagaagttgg tcgtgaggca 480
ctgggcaggt aagtatcaag gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct 540
tgtcgagaca gagaagactc ttgcgtttct gataggcacc tattggtctt actgacatcc 600
actttgcctt tctctccaca ggtgtccact cccagttcaa ttacagctct taaggctaga 660
gtacttaata cgactcacta taggctagcc accatggctt ccaaggtgta cgaccccgag 720
caacgcaaac gcatgatcac tgggcctcag tggtgggctc gctgcaagca aatgaacgtg 780
ctggactcct tcatcaacta ctatgattcc gagaagcacg ccgagaacgc cgtgattttt 840
ctgcatggta acgctgcctc cagctacctg tggaggcacg tcgtgcctca catcgagccc 900
gtggctagat gcatcatccc tgatctgatc ggaatgggta agtccggcaa gagcgggaat 960
ggctcatatc gcctcctgga tcactacaag tacctcaccg cttggttcga gctgctgaac 1020
cttccaaaga aaatcatctt tgtgggccac gactgggggg cttgtctggc ctttcactac 1080
tcctacgagc accaagacaa gatcaaggcc atcgtccatg ctgagagtgt cgtggacgtg 1140
atcgagtcct gggacgagtg gcctgacatc gaggaggata tcgccctgat caagagcgaa 1200
gagggcgaga aaatggtgct tgagaataac ttcttcgtcg agaccatgct cccaagcaag 1260
atcatgcgga aactggagcc tgaggagttc gctgcctacc tggagccatt caaggagaag 1320
ggcgaggtta gacggcctac cctctcctgg cctcgcgaga tccctctcgt taagggaggc 1380
aagcccgacg tcaccggtaa aggcgcgcca gactgagttc acacggtgct gggcccccaa 1440
agccaagtgg ggttggggga acagagtctg cgagtcccgg cgccccgagt gcagggcccc 1500
gtgttggggt cctccttccc atttgtatcc gtatccttgc gggctttgcg cctccccggg 1560
ggacccctcg ccgggagatg gccgcactga tgcggggcaa ggactcctcc cgctgcctgc 1620
tcctactggc cgcggtgctg atggtggaga gctcacagtt cggcagctcg cgggccaaac 1680
tcaactccat caagtcctct ctgggcgggg agacgcctgc ccaggccgcc aatcgatctg 1740
cgggcactta ccaaggactg gctttcggcg gcagtaagaa gggcaaaaac ctggggcagg 1800
taggaaaata cccccaatac actcttcaac cagaagaggt agggacccgg tcgacaaacc 1860
tgcaggaaaa ctagtcctca ccgcttggtt cgagctgctg aaccttccaa agaaaatcat 1920
ctttgtgggc cacgactggg gggcttgtct ggcctttcac tactcctacg agcaccaaga 1980
caagatcaag gccatcgtcc atgctgagag tgtcgtggac gtgatcgagt cctgggacga 2040
gtggcctgac atcgaggagg atatcgccct gatcaagagc gaagagggcg agaaaatggt 2100
gcttgagaat aacttcttcg tcgagaccat gctcccaagc aagatcatgc ggaaactgga 2160
gcctgaggag ttcgctgcct acctggagcc attcaaggag aagggcgagg ttagacggcc 2220
taccctctcc tggcctcgcg agatccctct cgttaaggga ggcaagcccg acgtcgtcca 2280
gattgtccgc aactacaacg cctaccttcg ggccagcgac gatctgccta agatgttcat 2340
cgagtccgac cctgggttct tttccaacgc tattgtcgag ggagctaaga agttccctaa 2400
caccgagttc gtgaaggtga agggcctcca cttcagccag gaggacgctc cagatgaaat 2460
gggtaagtac atcaagagct tcgtggagcg cgtgctgaag aacgagcagt aattctaggc 2520
gatcgctcga gcccgggaat tcgtttaaac ctagagcggc cgctggccgc aataaaatat 2580
ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga ggatctaaat gagtcttcgg 2640
acctcgcggg ggccgcttaa gcggtggtta gggtttgtct gacgcggggg gagggggaag 2700
gaacgaaaca ctctcattcg gaggcggctc ggggtttggt cttggtggcc acgggcacgc 2760
agaagagcgc cgcgatcctc ttaagcaccc ccccgccctc cgtggaggcg ggggtttggt 2820
cggcgggtgg taactggcgg gccgctgact cgggcgggtc gcgcgcccca gagtgtgacc 2880
ttttcggtct gctcgcagac ccccgggcgg cgccgccgcg gcggcgacgg gctcgctggg 2940
tcctaggctc catggggacc gtatacgtgg acaggctctg gagcatccgc acgactgcgg 3000
tgatattacc ggagaccttc tgcgggacga gccgggtcac gcggctgacg cggagcgtcc 3060
gttgggcgac aaacaccagg acggggcaca ggtacactat cttgtcaccc ggaggcgcga 3120
gggactgcag gagcttcagg gagtggcgca gctgcttcat ccccgtggcc cgttgctcgc 3180
gtttgctggc ggtgtccccg gaagaaatat atttgcatgt ctttagttct atgatgacac 3240
aaaccccgcc cagcgtcttg tcattggcga attcgaacac gcagatgcag tcggggcggc 3300
gcggtcccag gtccacttcg catattaagg tgacgcgtgt ggcctcgaac accgagcgac 3360
cctgcagcga cccgcttaaa agcttggcat tccggtactg ttggtaaagc caccatggcc 3420
gatgctaaga acattaagaa gggccctgct cccttctacc ctctggagga tggcaccgct 3480
ggcgagcagc tgcacaaggc catgaagagg tatgccctgg tgcctggcac cattgccttc 3540
accgatgccc acattgaggt ggacatcacc tatgccgagt acttcgagat gtctgtgcgc 3600
ctggccgagg ccatgaagag gtacggcctg aacaccaacc accgcatcgt ggtgtgctct 3660
gagaactctc tgcagttctt catgccagtg ctgggcgccc tgttcatcgg agtggccgtg 3720
gcccctgcta acgacattta caacgagcgc gagctgctga acagcatggg catttctcag 3780
cctaccgtgg tgttcgtgtc taagaagggc ctgcagaaga tcctgaacgt gcagaagaag 3840
ctgcctatca tccagaagat catcatcatg gactctaaga ccgactacca gggcttccag 3900
agcatgtaca cattcgtgac atctcatctg cctcctggct tcaacgagta cgacttcgtg 3960
ccagagtctt tcgacaggga caaaaccatt gccctgatca tgaacagctc tgggtctacc 4020
ggcctgccta agggcgtggc cctgcctcat cgcaccgcct gtgtgcgctt ctctcacgcc 4080
cgcgacccta ttttcggcaa ccagatcatc cccgacaccg ctattctgag cgtggtgcca 4140
ttccaccacg gcttcggcat gttcaccacc ctgggctacc tgatttgcgg ctttcgggtg 4200
gtgctgatgt accgcttcga ggaggagctg ttcctgcgca gcctgcaaga ctacaaaatt 4260
cagtctgccc tgctggtgcc aaccctgttc agcttcttcg ctaagagcac cctgatcgac 4320
aagtacgacc tgtctaacct gcacgagatt gcctctggcg gcgccccact gtctaaggag 4380
gtgggcgaag ccgtggccaa gcgctttcat ctgccaggca tccgccaggg ctacggcctg 4440
accgagacaa ccagcgccat tctgattacc ccagagggcg acgacaagcc tggcgccgtg 4500
ggcaaggtgg tgccattctt cgaggccaag gtggtggacc tggacaccgg caagaccctg 4560
ggagtgaacc agcgcggcga gctgtgtgtg cgcggcccta tgattatgtc cggctacgtg 4620
aataaccctg aggccacaaa cgccctgatc gacaaggacg gctggctgca ctctggcgac 4680
attgcctact gggacgagga cgagcacttc ttcatcgtgg accgcctgaa gtctctgatc 4740
aagtacaagg gctaccaggt ggccccagcc gagctggagt ctatcctgct gcagcaccct 4800
aacattttcg acgccggagt ggccggcctg cccgacgacg atgccggcga gctgcctgcc 4860
gccgtcgtcg tgctggaaca cggcaagacc atgaccgaga aggagatcgt ggactatgtg 4920
gccagccagg tgacaaccgc caagaagctg cgcggcggag tggtgttcgt ggacgaggtg 4980
cccaagggcc tgaccggcaa gctggacgcc cgcaagatcc gcgagatcct gatcaaggct 5040
aagaaaggcg gcaagatcgc cgtgtaataa ttctagagtc ggggcggccg gccgcttcga 5100
gcagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa 5160
aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc 5220
aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg 5280
tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatcca 5340
ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 5400
tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 5460
aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 5520
tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 5580
ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 5640
tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 5700
gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 5760
aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 5820
agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 5880
acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 5940
actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 6000
accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 6060
actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 6120
cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 6180
cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 6240
gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 6300
ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 6360
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 6420
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 6480
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 6540
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 6600
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 6660
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 6720
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 6780
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 6840
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 6900
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 6960
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 7020
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 7080
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tgg 7123
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agatcacggt gctgggcccc caaagcca 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagctggctt tgggggccca gcaccgtg 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agatggcgcc ccgagtgcag ggccccgt 28
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagcacgggg ccctgcactc ggggcgcc 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agatcatttg tatccgtatc cttgcggg 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagccccgca aggatacgga tacaaatg 28
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agattatcct tgcgggcttt gcgcctcc 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aagcggaggc gcaaagcccg caaggata 28
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agatgctgcc tgctcctact ggccgcgg 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aagcccgcgg ccagtaggag caggcagc 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agatgcggca gtaagaaggg caaaaacc 28
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aagcggtttt tgcccttctt actgccgc 28
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agataccaga agaggtaggg acccg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aagccgggtc cctacctctt ctggt 25
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agatccaacc ccacttggct ttgggggc 28
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagcgccccc aaagccaagt ggggttgg 28
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agatccgggg aggcgcaaag cccgcaag 28
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagccttgcg ggctttgcgc ctccccgg 28
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agatccatca gcaccgcggc cagtagga 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aagctcctac tggccgcggt gctgatgg 28
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agattacctg ccccaggttt ttgccctt 28
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aagcaagggc aaaaacctgg ggcaggta 28
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cagtgggagt ggcacctt 18
Claims (7)
1.一种载体组合，其特征在于，所述载体组合包括pCpf1-sgRNA和pY010-RR；
所述pCpf1-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述pY010-RR的构建方法包括：将CPF4077基因片段插入到pY010载体中，得到pY010-RR；
所述CPF4077基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的载体组合，其特征在于，所述pCpf1-sgRNA中的sgRNA表达框的序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1或2所述的载体组合，其特征在于，所述pCpf1-sgRNA的构建方法包括：将权利要求2中的sgRNA表达框插入到pUC57载体中，得到pCpf1-sgRNA。
4.权利要求1～3任一项所述的载体组合在在哺乳动物的基因编辑中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据哺乳动物的基因组上的基因设计两对单链DNA寡核苷酸，将所述两对单链DNA寡核苷酸分别退火，得到两个双链DNA片段；
2)将所述步骤1)得到的两个双链DNA片段分别插入到权利要求1所述的pCpf1-sgRNA的sgRNA表达框中，得到两个载体；
3)将所述步骤2)得到的两个载体与权利要求1所述的pY010-RR共转染到哺乳动物细胞中，实现对哺乳动物的基因编辑。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤3)两个载体与pY010-RR的质量比为(1～5):(1～5):(1～5)。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤1)单链DNA寡核苷酸的长度为20～30nt。
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