CN103555715A - 扩增引物、构建表达fto重组细胞的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组扩增引物，构建FTO表达构建体的方法，构建重组细胞的方法，以及利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法。其中，所述扩增引物包括：上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′和下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′。利用该组扩增引物，能够以显著高的效率提高扩增FTO的效率。

Description

扩增引物、构建表达FTO重组细胞的方法及其用途

技术领域

本发明属于生物学领域，更具体的，涉及一组扩增引物，构建FTO表达构建体的方法，构建重组细胞的方法，以及利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法。

背景技术

目前肥胖症的发病率越来越高，肥胖和超重会导致高血压、II型糖尿病(T2D)、冠状动脉性心脏病等严重疾病，从而大量增加死亡的风险。而且，超重和肥胖的人数有不断增加的趋势。WHO预计到2015年超重人口将增长为23亿，肥胖人口为7亿。美国《保健事务》的研究报告称，中国目前肥胖人口达3.25亿人，增幅超过美国、英国和澳大利亚。目前治疗肥胖的药物主要为奥利司他，其作为强效和长效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，副作用较少，安全可靠而被广泛使用，但是也影响了脂肪的吸收，导致营养失衡。在研的一些减肥药的策略主要集中在降低饮食、抑制热量摄取、刺激产热反应、调节能量代谢和控制神经系统的信号转导上。但是只有美国Arena公司开发Belviq和Vivus公司研制的Qsymia，是近13年来首次获美国FDA批准上市的减肥药(2012年)。面对不断剧增的肥胖群体，减肥药物预示着巨大的收益前景。

全基因组关联研究表明，FTO是2007年被证实与肥胖和II型糖尿病具有很强相关性的基因，因此被称为肥胖基因，预示人们对通过它找到治疗肥胖的途径充满了强烈的渴望。动物模型研究表明，FTO是决定身体脂肪量必不可少的基因。FTO基因敲除小鼠生长滞后，体重降低，脂肪组织含量减少；FTO过表达小鼠的食物摄取量，体重和脂肪组织含量都显著增加。FTO的蛋白水平研究进一步证实，FTO是一种单链DNA和RNA的去甲基化酶，其生理底物为mRNA的m⁶A。在FTO大量存在时，m⁶A由于被FTO催化为A而降低，反之A的含量增加。针对FTO去甲基化酶的特点，已经开发出一些筛选FTO抑制剂的体外生化和细胞水平检测方法。

目前，针对FTO药靶的抑制剂研究仅见于2012年的一篇文献(Chen B，Ye F，YuL，et al.Development of Cell-Active N(6)-Methyladenosine RNA Demethylase FTOInhibitor.Journal of the American Chemical Society 2012Oct；134(43)：17963-71)。该报道证实大黄酸(rhein)是FTO的竞争性底物抑制剂，提示可能具有潜在的药用前景。体外的化学研究通过合成FTO作用的底物ssDNA和ssRNA，采用HPLC方法筛选FTO的底物抑制剂；在细胞水平，采用高表达FTO的BE(2)-C细胞，经抑制剂处理后通过LC-MS／MS方法检测mRNA水平m⁶A／A的比值，确定抑制剂的效果。

由此可见，FTO药靶的筛选方法还处于比较初期阶段，主要是针对其去甲基化酶活性开展的一些体外生化实验，以及FTO表达较高的神经细胞内对mRNA的m⁶A水平评估。还没有针对FTO的其他功能检测方法。本发明针对FTO促进脂肪分化的功能提供了一种细胞水平筛选肥胖药物的方法；另外，由于LC-MS／MS方法对仪器设别要求较高，本发明采用FTO稳定转染细胞株提供一种采用mRNA免疫斑点杂交通过检测m⁶A水平筛选药物的方法。

然而，目前筛选抗肥胖药物的手段仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

为此，本发明的一个方面提供了一组扩增引物。根据本发明的实施例，该组扩增引物包括：

上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′，

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′。

发明人经过大量的筛选工作，惊奇地意外发现，利用该组扩增引物，能够显著高效率的提高扩增FTO的效率。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建FTO表达构建体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

1)、利用扩增引物对，对FTO基因进行扩增，以便获得FTO扩增片段；

2)、将所述FTO扩增片段与表达载体进行连接，以便获得所述FTO表达载体，

其中，

所述扩增引物包括：

上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′，

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′。

如前所述，利用该扩增引物能够提高扩增FTO的效率，进而可以进一步提高利用该方法构建FTO表达构建体的方法。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中与宿主细胞的基因组发生同源重组以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，既可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。根据本发明的一个实施例，所述表达载体为真核表达载体。具体的，所述表达载体可以为pcDNA3.1或pEGFPN1。

根据本发明的实施例，构建体还可以存在其他的元件，以便于构建重组细胞，或者便于提高重组细胞表达FTO的效率和筛选重组细胞的效率。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包含FTO基因的特异性表达启动子，所述启动子与所述FTO扩增片段可操纵地连接。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和／或翻译。由此，可以直接通过构建体在宿主细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动FTO基因的转录和表达，并且扩大了宿主细胞的选择范围。

根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选重组细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加抗生素例如青霉素、卡那霉素、新霉素例如G418等，则相应连同载体接受并表达抗生素抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为新霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选重组细胞的效率。

在本发明第三方面，本发明提出了一种用于构建重组细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述的方法，构建FTO表达构建体；利用所述FTO表达构建体转化宿主细胞，以便获得表达FTO的重组细胞。

在本发明中所使用的术语“重组细胞”应做广义理解，其是指相对于天然存在的细胞，基因组发生改变的细胞，可以是完整细胞，也可以是亚细胞组分，可以是天然细胞，也可以是人工构建的细胞，只要能够在外加芳香族化合物的调控下表达活性报告蛋白。根据本发明的实施例，重组细胞的种类并不受特别限制，根据本发明的一个实施例，所述重组细胞为选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞的至少一种。

利用构建体转化宿主细胞的方法在本发明中不受特别限制，包括但不限于：显微注射、脂质体融合、基因枪、磷酸钙法、电穿孔、病毒转染法。本领域技术人员可以根据具体情况选择适宜的转化方法。根据本发明的实施例，还可以包括借助构建体上所包含的筛选标记基因，从经过转化的细胞中筛选发生同源重组的宿主细胞，从而可以提高获得重组细胞的效率。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过重组细胞的抗药性来进行筛选。由此，根据本发明的一个实施例，进一步包括利用抗生素对所获得的转化产物进行筛选，以便获得稳定表达FTO的重组细胞。根据本发明的实施例，所述抗生素为G418。根据本发明的实施例，可以借助脂质体，实现利用所述FTO表达构建体转化宿主细胞。

但利用G418进行筛选时，G418的浓度对于筛选效率是至关重要的。根据本发明的一个实施例，所述宿主细胞为3T3-L1或HEK293，其中，当所述宿主细胞为3T3-L1时，所述G418的浓度为600微克／ml，当所述宿主细胞为HEK293时，所述G418的浓度为200微克／ml。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法，其中，所述重组细胞是通过前面所述的方法获得的，并且所述方法包括：

测定所述重组细胞的FTO表达水平，得到第一表达水平；以及

将所述重组细胞与药物候选物接触，并测定接触所述药物候选物后的重组细胞的FTO表达水平，以便得到第二表达水平；

其中，所述第二表达水平低于所述第一表达水平是所述药物候选物具有抗肥胖活性的指示。

在本发明的第五方面，本发明提出了另一种利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法，其中，所述重组细胞是通过前面所述的方法获得的，并且所述方法包括：

测定所述重组细胞的FTO表达水平，得到第一表达水平；以及

将所述重组细胞与药物候选物接触，并测定接触所述药物候选物后的重组细胞的FTO表达水平，以便得到第二表达水平；

其中，所述第二表达水平高于所述第一表达水平是所述药物候选物具有抗肥胖活性的指示。

由此，根据本发明的实施例，本发明通过设计出特殊的引物组，并以FTO质粒为模板对其进行扩增，从而构建出FTO过表达载体；通过将该FTO过表达载体导入宿主细胞，经筛选后即可得到稳定转染的细胞株，经相关实验证明，该FTO稳定转染细胞株能高效筛选肥胖药物及保健品添加剂，应用前景广阔。

附图说明

本发明的上述和／或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1(A)RT-PCR扩增FTO编码区全长电泳检测图；图中：M---DNAmarker、1、2、3---FTO的扩增产物；(B)FTO过表达载体的示意图；(C)阳性克隆PCR产物电泳检测图；图中：M---DNAmarker、1、2、3、4、5---阳性克隆PCR产物电泳结果；

图2(A)HEK293细胞的G418最佳浓度筛选结果；(B)3T3-L1细胞的G418最佳浓度筛选结果；(C)重组表达质粒对HEK293细胞的FTO表达影响的Western bloting检测结果；(D)重组表达质粒对3T3-L1细胞的FTO表达影响的Western bloting检测结果；

图3(A)siFTO对3T3-L1细胞FTO mRNA表达的影响；(B)siFTO对3T3-L1细胞FTO蛋白表达的影响；(C)siFTO对3T3-L1细胞脂滴形成的影响图；(D)重组表达质粒对3T3-L1细胞脂滴形成的影响图；

图4重组表达质粒对FTO去甲基化酶活性的影响。

实施例

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.FTO过表达载体的构建与鉴定

1、根据GenBank上登录的FTO基因序列设计并合成PCR引物：

上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′，

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′，

其中，下划线为在引物中添加的酶切位点，上游引物加入XhoI酶切位点，下游引物加入HindIII的酶切位点。

2、目的基因的扩增及纯化

FTO的目的片段长度为1508bp，均含启动编码序列ATG及终止编码序列TGA，并保证阅读框的完整。以FTO质粒(pcDNA3.1-3Myc-6his-hFTO载体，清华大学赠送)为模板扩增FTO，反应体系为：质粒1μl，10×PCRbuffer5μl，MgSO₄(25mM)2μl，dNTP(10mM)4μl，上下游引物(10μM)各1.75μl，Taq酶1μl，DEPC水30.5μl；PCR反应条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30sec，60℃30sec，68℃2min，共30个循环；(3)68℃10min，4℃保存。由引物扩增得到的PCR产物命名为FTO如图1A所示。

3、FTO过表达质粒构建

将纯化后的目的基因片段FTO与pcDNA3.1载体相连(重组质粒命名为pcDNA3.1-FTO)，4℃过夜，热激转化至感受态细胞DH5α中，加入500μlLB培养基，37℃振荡培养1h，取200μl涂于Amp／IPTG／X-Gal／LB平板上，37℃恒温培养箱过夜。质粒构建示意图如图1B所示。

4、重组质粒的鉴定

将步骤3构建所得的质粒的菌液经抗性初步筛选后(初步筛选具体为：Amp／IPTG／X-Gal／LB，Amp是抗生素筛选，IPTG／X-Gal是蓝白斑筛选)，挑取白色单菌落(经Amp／IPTG／X-Gal／LB筛选得来)接种于4ml液体LB培养基中(含Amp100ng／ml)，37℃振荡培养16h，进行PCR和克隆测序鉴定。菌液PCR反应体系为：菌液1μl，2×PCRMix12.5μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，DEPC水10.5μl；PCR反应条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30sec，60℃30sec，72℃2min，共30个循环；(3)72℃10min，4℃保存。

特异性引物序列：

上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′，

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAG。

阳性克隆菌液PCR鉴定结果表明，用特异性上下游引物PCR扩增的片段大小与本实验预期结果相符，如图1C所示。阳性克隆测序及序列比对鉴定结果表明，与插入的序列完全一致，证明FTO过表达质粒构建成功。

实施例2重组质粒转染3T3-L1和HEK293细胞与鉴定

1、G418最佳浓度筛选

为了获得过表达FTO基因的稳定细胞株，利用不同浓度的G418分别处理3T3-L1和HEK293细胞7天，观察细胞生长情况。图2A是分别用125μg／ml、250μg／ml、500μg／ml、600μg/ml、1000μg／mlG418处理3T3-L17天的生长情况；图2B是分别用100μg／ml、200μg／ml、400μg／mlG418处理HEK293细胞7天的生长情况。7天后600μg／ml G418培养的3T3-L1细胞和200μg／mlG418培养的HEK293细胞全部死亡。由此确定G418对3T3-L1细胞的最佳筛选浓度为600μg／ml，对HEK293细胞的最佳筛选浓度为200μg／ml。

2、重组质粒转染3T3-L1和HEK293细胞

利用脂质体Lipofectamine^TM2000或X-tremeGENE HP DNA介导将构建筛选得到的FTO重组表达质粒pcDNA3.1-FTO及阴性对照分别转染HEK293和3T3-L1细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并计数铺板，培养基为DMEM高糖培养基(含4.5g／L葡萄糖、L-谷氨酰胺、110mg／L丙酮酸钠、1％双抗以及10％胎牛血清或10％小牛血清)，细胞融合率达到70％～90％时，更换培养基为OPTI-MEM并转染，质粒DNA(4μg)和脂质体Lipofectamine^TM2000(10μL)比例为4：10或质粒DNA(1μg)和X-tremeGENE HPDNA(3μL)比例为1：3。实验分成两组：pcDNA3.1-FTO组，阴性对照组转染空载体，每组三个重复。对于每孔细胞，各使用250μlOPTI-MEMI培养基稀释试剂。稀释至少5min后，同已稀释的DNA混匀，在室温放置20min；直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀；37℃，5％CO₂中培养4～6h后更换不含抗生素的完全培养基；转染48h后用600μg／ml和200μg／mIG418分别筛选转染了pcDNA3.1-FTO和空载体的3T3-L1和HEK293细胞，获得4株过表达FTO基因的克隆细胞株命名为3T3-FTO-3、3T3-FTO-4和293-FTO-2、293-FTO-3。

3、FTO稳定转染细胞株的鉴定

3T3-L1和HEK293细胞，以及3T3-FTO和293-FTO稳定细胞株分别培养72h后，利用Western blot检测FTO蛋白表达如图2所示。293-FTO细胞的FTO表达明显高于HEK293细胞如图2C；3T3-FTO细胞的FTO表达明显高于3T3-L1细胞如图2D；结果表明，与对照组相比，转染pcDNA3.1-FTO组显著的提高了3T3-L1和HEK293细胞的FTO蛋白表达水平。构建的FTO稳定转染细胞株成功。

实施例3FTO对3T3-L1细胞脂肪分化的影响

1、siFTO抑制了3T3-L1脂肪分化

(1)筛选最适的siFTO

在invitrogen公司合成2个siFTO，它们的序列分别为UUAAGGUCCACUUCAUCAUCGCAGG和CAGGCACCUUGGA UUAUAUTT。利用Lipofectamine^TM2000将siFTO及阴性对照转染3T3-L1细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并计数以3×10⁵／孔铺板，培养基为DMEM高糖培养基(含4.5g／L葡萄糖、L-谷氨酰胺、110mg／L丙酮酸钠、1％双抗以及10％小牛血清)，细胞融合率达到70％～90％时，更换培养基为OPTI-MEM并转染，siFTO和neg(1μl)和Lipofectamine^TM2000(0.4μl)比例为10：4。实验分成两组：siFTO组，阴性序列组，每组三个重复。对于每孔细胞，各使用250μl OPTI-MEMI培养基稀释试剂。稀释至少5min后，同已稀释的siFTO和neg混匀，在室温保温20min；直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀；37℃，5％CO₂中保温4～6h后更换不含抗生素的完全培养基；转染48h后用蛋白裂解液和RNAlater收集细胞，分别用QPCR和Western blot检测FTO表达如图3A，B所示。加入siFTO的细胞FTO蛋白和mRNA的表达明显低于阴性对照组。结果表明，与对照组相比，转染siFTO组显著的抑制了3T3-L1细胞的FTO蛋白和mRNA的表达水平。获得的2个抑制FTO表达的siFTO命名为siFTO-1和siFTO-2。

(2)siFTO对3T3-L1脂肪分化的抑制作用

6孔板中以5×10⁵密度接种3T3-L1细胞，实验分成三组：siFTO组，阴性对照组，空白对照组，每组三个重复。加入2ml完全培养基(DMEM高糖培养基、1％双抗以及10％小牛血清)于37℃，5％CO₂培养箱里培养细胞。细胞融合率达到100％后，再培养2天后开始诱导分化作为分化起点第零天(d0)，分化前一天(d-1)完成siFTO的瞬时转染。d0开始诱导分化，加入2ml MDI培养基(含0.5μM IBMX、1μM DEX和1μg／mlInsulin)于37℃，5％CO2培养箱里培养细胞。分化d2换液，加入2ml Insulin培养基(含1μg／mlInsulin)于37℃，5％CO2培养箱里培养细胞。分化d4换液，加入2ml完全培养基于37℃，5％CO2培养箱里培养细胞。分化d6换液，加入2ml完全培养基于37℃，5％CO2培养箱里培养细胞。分化d8将细胞培养板中的培养液弃去，每孔加入2mlD-PBS前后轻轻摇匀，洗板一次。弃去D-PBS，每孔加入2ml10％中性甲醛室温固定10min。弃去固定液，每孔加入2ml D-PBS前后轻轻摇匀，洗板一次。每孔加入2ml油红O工作液进行染色，室温下孵育30min(37℃，孵育5min)。弃去染色液，每孔加入2ml D-PBS前后轻轻摇匀，洗板3次，直至没有油红残液。每孔加入0.5ml异丙醇萃取出含有油红的脂滴，转移至酶标板中上酶标仪检测540nm的读数如图3C。结果表明，与对照组相比，siFTO明显抑制3T3-L1细胞的脂肪分化，抑制率高达40％左右。

2、FTO过表达能够促进3T3-L1细胞的脂肪分化

6孔板中以5×10⁵密度接种pcDNA3.1-FTO细胞，实验分成两组：pcDNA3.1-FTO组，空白对照组，每组三个重复。加入2ml完全培养基于37℃，5％CO₂培养箱里培养细胞。细胞融合率达到100％后，再培养2天后开始诱导分化作为分化起点第零天(d0)，加入2mlMDI培养基(含0.5μM IBMX、1μM DEX和1μg／mlInsulin)于37℃，5％CO2培养箱里培养细胞。分化d2换液，加入2mlInsulin培养基(含1μg／ml Insulin)于37℃，5％CO2培养箱里培养细胞。分化d4换液，加入2ml完全培养基于37℃，5％CO₂培养箱里培养细胞。分化d6换液，加入2ml完全培养基于37℃，5％CO₂培养箱里培养细胞。分化d8将细胞培养板中的培养液弃去，每孔加入2ml D-PBS前后轻轻摇匀，洗板一次。弃去D-PBS，每孔加入2ml10％中性甲醛室温固定10min。弃去固定液，每孔加入2mlD-PBS前后轻轻摇匀，洗板一次。每孔加入2ml油红O工作液进行染色，室温下孵育30min(37℃，孵育5min)。弃去染色液，每孔加入2ml D-PBS前后轻轻摇匀，洗板3次，直至没有油红残液。每孔加入0.5ml异丙醇萃取出含有油红的脂滴，转移至酶标板中上酶标仪检测540nm的读数如图3D。结果表明，与对照组相比，pcDNA3.1-FTO明显促进3T3-L1细胞的脂肪分化，诱导分化率为30-40％。

实施例4FTO稳定转染3T3-L1细胞株筛选药物的方法

1、采用CCK-8试剂盒检测药物的毒性和使用剂量

实验分组：不同浓度的抑制剂组、抑制剂的溶剂对照组和空白对照组。

3T3-FTO细胞用血清培养基调整细胞浓度接种于48或96孔板中。过夜培养后换用各个实验分组的试剂，其中溶剂对照组中溶剂的用量以最高抑制剂浓度为标准，各抑制剂组的溶剂量按溶剂对照组的量补足。处理48h或72h，除去培养液，用PBS洗一次，加入200μL含10％CCK-8检测试剂的低血清培养基，37℃，5％CO₂培养箱孵育50min左右，再将孵育后的培养液转入96孔板中，用酶标仪检测，检测波长450nm。

结果评价：检测结果抑制剂组明显低于溶剂对照组，即可确定该浓度的抑制剂有毒性。进行功效筛选时可以选择低于毒性的剂量。

2、分化模型检测脂肪分化的抑制程度

实验分组：无毒性的不同浓度抑制剂组、抑制剂的溶剂对照组和空白对照组。

3T3-FTO细胞用血清培养基调整细胞浓度接种于48或96孔板中。细胞融合率达到100％后，再培养2天后开始诱导分化作为分化起点第零天(d0)，换用各个实验分组的试剂和诱导分化培养基，其中溶剂对照组中溶剂的用量以最高抑制剂浓度为标准，各抑制剂组的溶剂量按溶剂对照组的量补足。分化d2换液，将诱导分化培养基换成Insulin培养基，分化d4换成完全培养液，之后没2天更换一次液直到d8。将细胞培养板中的培养液弃去，每孔加入2ml D-PBS前后轻轻摇匀，洗板一次。弃去D-PBS，每孔加入2ml10％中性甲醛室温固定10min。弃去固定液，每孔加入2ml D-PBS前后轻轻摇匀，洗板一次。每孔加入2ml油红O工作液进行染色，室温下孵育30min(37℃，孵育5min)。弃去染色液，每孔加入2ml D-PBS前后轻轻摇匀，洗板3次，直至没有油红残液。每孔加入0.5ml异丙醇萃取出含有油红的脂滴，转移至酶标板中上酶标仪检测540nm的读数。

结果评价：由于FTO能够促进脂肪细胞分化，因此其抑制剂将抑制脂肪细胞的分化。检测结果某浓度的抑制剂组值明显低于溶剂对照组，即可确定该浓度的抑制剂具有抑制效果。抑制剂的最佳浓度做好在微克级。

实施例5FTO稳定转染HEK293细胞株筛选药物的方法

1、mRNA斑点免疫杂交检测FTO过表达HEK293细胞中m⁶A水平降低

实验分组：FTO过表达HEK293细胞和空载体转染的HEK293细胞对照组。

进行该实验的细胞量约需2个T75培养瓶的数量。293细胞的培养液为MEM培养基。Trizol法提取各实验组细胞的总RNA，再采用Poly(A)Purist^TM试剂盒(Ambion，USA)分离总RNA中的mRNAs，接着用RiboMinus Transcriptom Isolation试剂盒(invitrogen，USA)去除rRNA，从而获得较纯的mRNA。mRNA的浓度和质量可以分别通过NanoDrop和Aglient2100生物分析仪进行检测。

将纯化的mRNA样品在95℃加热10min后立即置冰中，完成变性。再将经两倍稀释的mRNA样品按2ul滴加到Amersham Hybond-N+membrane(GE Healthcare，Germany)上，室温下风干后，于烤箱中80℃烘烤1-2h。TBST洗涤后，将膜移入5％脱脂奶粉室温60min，加入1：2000稀释的m⁶A单克隆抗体(SySy，Germany)，4℃孵育过夜；以TBST洗膜，洗涤3次每次5min；然后加入1：10000稀释的IgG标记的抗体室温孵育60min。以TBST洗膜，洗涤2次每次10min；将化学发光剂A液、B液等体积混合，滴加于膜上孵育5min，然后用保鲜膜覆盖，于暗室压片。用ImageJ软件进行灰度分析。

结果评价：FTO过表达组的m⁶A水平明显低于对照组，结果参见图4。

2、筛选方法

(1)采用CCK-8检测药物的毒性和使用剂量

实验分组：不同浓度的抑制剂组、抑制剂的溶剂对照组和空白对照组。

293-FTO细胞用血清培养基调整细胞浓度接种于48或96孔板中。过夜培养后换用各个实验分组的试剂，其中溶剂对照组中溶剂的用量以最高抑制剂浓度为标准，各抑制剂组的溶剂量按溶剂对照组的量补足。处理48h或72h，除去培养液，用PBS洗一次，加入200μL含10％CCK-8检测试剂的低血清培养基，37℃，5％CO₂培养箱孵育50min左右，再将孵育后的培养液转入96孔板中，用酶标仪检测，检测波长450nm。

结果评价：检测结果抑制剂组明显低于溶剂对照组，即可确定该浓度的抑制剂有毒性。进行功效筛选时可以选择低于毒性的剂量。

(2)FTO过表达HEK293细胞株的筛选方法

实验分组：无毒性的不同浓度抑制剂组、抑制剂的溶剂对照组和空白对照组。

FTO过表达HEK293细胞接种到T75的培养瓶中，第二天细胞融合率达70-80％，加入个实验分组的试剂处理48h或72h。之后Trizol法提取各实验组细胞的总RNA，再采用Poly(A)Purist^TM试剂盒(Ambion，USA)分离总RNA中的mRNAs，接着用RiboMinusTranscriptom Isol ation试剂盒(invitrogen，USA)去除rRNA，从而获得较纯的mRNA。mRNA的浓度和质量可以分别通过NanoDrop和Aglient2100生物分析仪进行检测。

将纯化的mRNA样品在95℃加热10min后立即置冰中，完成变性。再将经两倍稀释的mRNA样品按2ul滴加到Amersham Hybond-N+membrane(GE Healthcare，Germany)上，室温下风干后，于烤箱中80℃烘烤1-2h。TBST洗涤后，将膜移入5％脱脂奶粉室温60min，加入1：2000稀释的m⁶A单克隆抗体(SySy，Germany)，4℃孵育过夜；以TBST洗膜，洗涤3次每次5min；然后加入1：10000稀释的IgG标记的抗体室温孵育60min。以TBST洗膜，洗涤2次每次10min；将化学发光剂A液、B液等体积混合，滴加于膜上孵育5min，然后用保鲜膜覆盖，于暗室压片。用ImageJ软件进行灰度分析。

结果评价：FTO抑制剂将提高m⁶A水平，检测结果中某浓度的抑制剂组值明显高于溶剂对照组，即可确定该浓度的抑制剂具有抑制效果。抑制剂的最佳浓度做好在微克级。

Claims (10)

1.一组扩增引物，其特征在于，包括：

上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′，

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′。

2.一种构建FTO表达构建体的方法，其特征在于，包括：

1)、利用扩增引物对，对FTO基因进行扩增，以便获得FTO扩增片段；

2)、将所述FTO扩增片段与表达载体进行连接，以便获得所述FTO表达载体，

其中，

所述扩增引物包括：

上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′，

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pcDNA3.1或pEGFPN1真核表达载体。

4.一种用于构建重组细胞的方法，其特征在于，包括：

利用根据权利要求2～4任一项所述的方法，构建FTO表达构建体；

利用所述FTO表达构建体转化宿主细胞，以便获得表达FTO的重组细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括利用抗生素对所获得的转化产物进行筛选，以便获得稳定表达FTO的重组细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗生素为G418。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，借助脂质体，实现利用所述FTO表达构建体转化宿主细胞。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为3T3-L1或HEK293，其中，当所述宿主细胞为3T3-L1时，所述G418的浓度为600微克／ml；当所述宿主细胞为HEK293时，所述G418的浓度为200微克／ml。

9.一种利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法，其中，所述重组细胞是通过权利要求4～8任一项所述的方法获得的，并且所述方法包括：

测定所述重组细胞的FTO表达水平，得到第一表达水平；以及

将所述重组细胞与药物候选物接触，并测定接触所述药物候选物后的重组细胞的FTO表达水平，以便得到第二表达水平；

其中，所述第二表达水平低于所述第一表达水平是所述药物候选物具有抗肥胖活性的指示。

10.一种利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法，其中，所述重组细胞是通过权利要求4～8任一项所述的方法获得的，并且所述方法包括：

测定所述重组细胞的FTO表达水平，得到第一表达水平；以及

将所述重组细胞与药物候选物接触，并测定接触所述药物候选物后的重组细胞的FTO表达水平，以便得到第二表达水平；

其中，所述第二表达水平高于所述第一表达水平是所述药物候选物具有抗肥胖活性的指示。

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