CN102552231A - 草氨酸钠在制备fto酶抑制剂和减肥药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及草氨酸钠的新用途，具体设计草氨酸钠作为FTO酶抑制剂在减肥药物制备中的新用途。发明人通过体外细胞实验首次发现，草氨酸钠可以显著抑制FTO基因的表达；而FTO基因表达受到抑制后，动物的体重和脂肪组织会明显下降，其作用机制与FTO基因调节机体食物摄入和控制能量代谢平衡有关。由于本发明采用草氨酸钠作为新的减肥药物，可以有效降低体重和脂肪组织，并且可预防肥胖相关疾病，如糖尿病、心血管疾病及相关肿瘤的发生。

Description

草氨酸钠在制备FTO酶抑制剂和减肥药物中的应用

技术领域

本发明涉及草氨酸钠的新用途，具体设计草氨酸钠作为FTO酶抑制剂在减肥药物制备中的新用途。

背景技术

近年来，全球肥胖人数不断增加，已经成为一个严重的社会问题和医学问题。不仅如此，肥胖还是II型糖尿病、心脏病、癌症等疾病的发病危险因素。目前常用的减肥方法有饮食控制、增加运动、服用减肥药物甚至手术治疗等，然而这些方法通常需要较多的时间投入，不易坚持，或者副作用较大，减肥效果不佳且易反弹，因此开发新型减肥药物一直是医学领域研究的热点(参见：Haslaμ and Jaμes，Obesity，2005)。

许多科学研究表明，肥胖和基因存在着广泛的联系，其中一种名为“FTO”(fat mass and obesity associated)的基因在肥胖的发生中发挥着重要作用。Frayling等研究表明，FTO基因携带者其肥胖的发生几率比正常人高出70％之多(参见：Frayling，Timpson et al.Science，2007)。FTO基因导致肥胖的机制可能与其抑制新陈代谢，降低能量消耗效率有关，另有报道FTO基因还可以引起病态的饥饿感，导致肥胖(参见：Larder，Cheung et al.Trends in Endocrinology &Metabolism，2011)。2009年德国科学家Julia Fischer等在《自然》杂志上发表文章称，通过基因敲除抑制小鼠体内FTO基因的表达后，将这些小鼠与FTO基因正常的老鼠进行对比，结果发现虽然这些小鼠的饮食相对增加，且运动量也较少，但这些小鼠的体重和脂肪组织含量均明显低于正常小鼠(参见：Fischer Kochet al.Nature，2009)(如图1～3所示，其中图1表示FTO基因抑制前后不同组织中FTO蛋白表达量的改变；图2表示FTO基因抑制前后对小鼠体重和脂肪分布的影响；图3表示FTO基因抑制前后小鼠脂肪组织切片的病理变化)。不仅如此，研究表明抑制FTO肥胖基因还可以使代谢相关疾病如糖尿病、心血管疾病和某些肿瘤的发病率下降(参见：Han Niu et al.Nature，2010)。因此，抑制FTO基因的表达将有助于肥胖的控制。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种草氨酸钠的新用途，即草氨酸钠作为FTO酶抑制剂的应用以及草氨酸钠在制备减肥药物中的应用。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：草氨酸钠在制备FTO酶抑制剂的应用，所述草氨酸钠的化学结构式为：

发明人通过体外细胞实验首次发现，草氨酸钠可以显著抑制FTO基因的表达；而FTO基因表达受到抑制后，动物的体重和脂肪组织会明显下降，其作用机制与FTO基因调节机体食物摄入和控制能量代谢平衡有关。

因此，本发明同时要求保护草氨酸钠在制备减肥药物中的应用。

上述技术方案中，所述减肥药物除了包括主要成分草氨酸钠外，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等；所述药物的剂型包括：胶囊、片剂或注射剂，均可按照药学领域的常规方法制备。

上述技术方案中，所述减肥药物适用的对象包括：肥胖患者及体重超标者，尤其是FTO基因携带者，可以有效地减轻体重和降低身体内脂肪组织含量。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

由于本发明采用草氨酸钠作为新的减肥药物，可以有效降低体重和脂肪组织，并且可预防肥胖相关疾病，如糖尿病、心血管疾病及相关肿瘤的发生。

附图说明

图1为现有文献中FTO基因抑制前后不同组织中FTO表达量的改变；

图2为现有文献中FTO基因抑制前后对小鼠体重和脂肪分布的影响；

图3为现有文献中FTO基因抑制前后小鼠脂肪组织切片的病理变化；

图4为实施例中不同浓度草氨酸钠对A549细胞生长的影响；

图5为实施例中不同浓度草氨酸钠对FTO基因mRNA的影响；

图6为实施例中加入草氨酸钠(40mmol/L)后不同时间FTO的mRNA表达变化；

图7为实施例中草氨酸钠对细胞内ATP浓度的影响。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

1.1材料：人A549细胞购于美国细胞收藏中心(ATCC)，并由本实验室保存和培养；D-MEM培养基干粉，小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公司；标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、10×转膜液、30％Acry-Bis、Tris-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司。

1.2细胞培养：A549细胞培养含10％小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的D-MEM培养基。细胞置于5％CO₂，37℃培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3在A549细胞培养液中加入不同浓度草氨酸钠24h后，MTT法测定细胞的生长活性：取对数期生长的A549细胞，用0.25％的胰酶消化打匀细胞计数后，按每孔5×10³个细胞接种于96孔板中，每孔200μL，于CO2培养箱中培养24h后，分别加入0、10、20、40、80mmol/L的草氨酸钠，继续培养20h后，每孔加入20μL质量浓度为5mg/mL的MTT，继续处理4h后弃上清，加入150μL的DMSO，混匀10min后，在酶标仪上测量波长为570/630nm处的吸光度值(OD值)。

结果如图4所示，随着草氨酸钠浓度的增加，细胞生长受到明显的抑制，其IC₅₀(抑制50％细胞生长的浓度)为65mmol/L；图4中，*与对照组比较，p＜0.05；#与前一组比较，p＜0.05。

1.4在A549细胞培养液中加入不同浓度的草氨酸钠处理24h后，收样后进行RT-PCR分析；所述RT-PCR方法为：

1)提取总RNA：采用1μl Trizol试剂裂解待测细胞。加入200μl氯仿，剧烈振摇15s后室温静置15分钟。离心收集上清，加入500μl异丙醇并混匀，室温静置10min后离心获取RNA沉淀。以70％乙醇洗涤2次，真空干燥RNA沉淀，最后溶于

DEPC水中。紫外分光光度计测定OD₂₆₀值并计算RNA浓度。

2)合成cDNA：进行cDNA合成的反应条件为：总RNA 5μg、oligo dT引物1μl、逆转录酶1μl、dNTP混合物

RNaseA抑制剂1μl，总反应体系为

剩余体积由无RNA酶的ddH₂O补足；上述混合物于37℃反应60min，然后以70℃作用10min结束反应，置于冰上待用。

3)RT-PCR反应：以合成的cDNA为模板，使用FTO引物和作为阳性对照的GAPDH引物扩增相应基因。其中FTO的引物为：SEQ ID No.1上游引物5′-CTGTGA CGA TGT GGA CAA TGA T-3′，SEQ ID No.2下游引物5′-ACC TCT GAGTTC TGA AAC GAT G-3′，共460bp。GAPDH的引物为：SEQ ID No.3上游引物5′-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3′，SEQ ID No.4下游引物5′-CAACCT GGT CCT CAG TGT AG-3′，共724bp。PCR反应总体系为：25μl反应体系中，

Green Master Mix反应缓冲液12.5μl，cDNA模板0.5μl，正向、反向引物均为0.5μl(10μM)，剩余体积以ddH₂O补足。

4)PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火40s，72℃延伸45s，共30个循环，最后于72℃延伸8min结束反应。将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，经0.5μg/ml溴乙锭染色后在凝胶成像分析仪上进行观察。

结果如图5所示，随着草氨酸钠的浓度增加，FTO基因的mRNA水平逐渐下降，并且呈现剂量依赖性；图5中，*与对照组比较，p＜0.05；#与前一组比较，p＜0.05。

结果如图6所示，结果提示FTO的表达存在着时间依赖性，当加入草氨酸钠4h后，FTO的mRNA水平开始显著下降；图6中，*与对照组比较，p＜0.05；#与前一组比较，p＜0.05。

1.5为进一步探讨草氨酸钠对细胞内能量代谢的影响，采用ATP检测试剂盒对加入不同浓度草氨酸钠后细胞内ATP的含量进行测定，ATP浓度的测量方法为：采用碧云天ATP检测试剂盒检测，取处于对数生长期的细胞加入不同浓度草氨酸钠24h后，按照说明书加入活细胞裂解液并放置在冰上裂解10min，在每个检测孔内加入100μl的ATP检测试剂，然后每孔加上100μl样品，迅速混匀，立即用luminometer测定RLU值。最后与标准曲线比对，计算出细胞内ATP浓度。为消除检测时细胞总数对结果的影响，对细胞进行MTT检测细胞活性和BCA测量蛋白质浓度，取两者平均值对ATP浓度进行校正，最终以细胞个数为1×10⁶个计算ATP浓度。

结果如图7所示，随着草氨酸钠的浓度增加，细胞内的ATP浓度逐渐下降；图7中，*与对照组比较，p＜0.05；#与前一组比较，p＜0.05。

1.6统计学处理：所有实验均重复3次，取平均值，结果用

表示。灰度值采用Bandscan 5.0计算，每个条带重复3次。所有数据分析采用SAS 8.0统计软件，两组均数比较应用t检验，多组均数比较应用方差分析，p＜0.05认为差异有统计学意义。

核苷酸和/或氨基酸序列表

 

<110> 苏州大学

<120> 草氨酸钠在制备FTO酶抑制剂和减肥药物中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

 

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 1

ctgtgacgat gtggacaatg at                                                 22

 

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 2

acctctgagt tctgaaacga tg                                                 22

 

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 3

caactacatg gtctacatgt tcc                                                23

 

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 4

caacctggtc ctcagtgtag                                                    20

Claims (2)

1.草氨酸钠在制备FTO酶抑制剂中的应用。

2.草氨酸钠在制备减肥药物中的应用。

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