CN116115616A - 氟班色林在制备治疗白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，提供了氟班色林在制备治疗白血病药物中的应用，本发明首次发现氟班色林对白血病细胞具有优异的细胞选择性，对伊马替尼耐药的Ba/F3BCR‑ABLT315I细胞表现出了显著的细胞杀伤作用；氟班色林对NDUFB3、NDUFS3、NDUFV3、NDUFA6、NDUFS6和NDUFA9等基因均表现出抑制效果，表明氟班色林能够显著抑制白血病细胞线粒体复合体I的活性，从而影响线粒体中ATP的产量，达到抑制细胞呼吸过程杀死白血病细胞的目的；氟班色林还可以显著抑制肿瘤的生长，因此，氟班色林可以作为治疗白血病的药物，对伊马替尼耐药细胞也具有显著的杀伤作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及氟班色林在制备治疗白血病药物中的应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病(CML)是一种骨髓造血干细胞的克隆性增殖形成的血液系统恶性肿瘤，表现为骨髓细胞过度积聚。CML占成人白血病的15％，全球年发病率为每10万人中有1-2例。目前，酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是治疗CML的一线药物，伊马替尼(IM)是用于治疗CML的TKI，它可以阻断ABL蛋白激酶的活化，但是会出现激酶BCR-ABL激酶结构域的点突变引起对IM的耐药性。第二代TKI尼洛替尼和达沙替尼能够对大多数激酶结构域突变有效，但是对于T315I突变无效，并且T315I突变在耐药突变中比例最高。第三代TKI普钠替尼对广泛的激酶结构域突变有效，特别是T315I突变，但在治疗过程中具有肝毒性、心律失常、心肌梗死和高血压等严重的不良反应。因此，寻找与TKI不同作用机制的治疗白血病的药物尤为重要，以避免长期用药导致耐药的发生。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出氟班色林在制备治疗白血病药物中的应用，本发明首次发现氟班色林对白血病细胞具有优异的细胞选择性，对伊马替尼耐药的Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞表现出了显著的细胞杀伤作用，能够显著抑制白血病细胞线粒体复合体I的活性，从而影响线粒体中ATP的产量，达到抑制细胞呼吸过程杀死白血病细胞的目的，还可以显著抑制肿瘤的生长，与TKI作用机制完全不同。
本发明的第一方面提供一种氟班色林的应用。
具体地，氟班色林(Flibanserin)在制备治疗白血病药物中的应用。
氟班色林在制备抑制白血病细胞呼吸药物中的应用。
氟班色林在制备抑制白血病细胞线粒体复合体I的活性药物中的应用。
氟班色林在制备杀伤对伊马替尼耐药的Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞药物中的应用。
癌细胞的能量需求与正常细胞有很大的区别，表现出不同的代谢表型，线粒体复合体Ⅰ在癌细胞中的增殖与转移过程发挥重要作用，尤其是生物合成和氧化还原过程。本发明首次发现氟班色林(Flibanserin)对白血病细胞线粒体复合体I具有显著的抑制作用，可作为线粒体复合体Ⅰ的抑制剂，而且对伊马替尼耐药细胞系Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞具有显著的抑制作用，有望成为新型抗白血病药物，且有效缓解耐药的发生。
优选地，所述氟班色林具有如下式(Ⅰ)所示分子结构：
优选地，所述氟班色林的浓度为0.01-15μM。
更优选地，所述氟班色林的浓度为0.03-10μM。
进一步优选地，所述氟班色林的浓度为1-10μM。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物的剂型为药学上可接受的剂型。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明首次发现氟班色林对白血病细胞的细胞选择性好，对伊马替尼耐药的Ba/F3BCR-ABLT315I细胞表现出了显著的细胞杀伤作用，氟班色林对NDUFB3、NDUFS3、NDUFV3、NDUFA6、NDUFS6和NDUFA9等6个基因均表现出抑制效果，表明氟班色林能够显著抑制白血病细胞线粒体复合体I的活性，从而影响线粒体中ATP的产量，达到抑制细胞呼吸从而杀死白血病细胞的目的；氟班色林还可以显著抑制肿瘤的生长，因此，氟班色林有望作为治疗白血病的药物；
(2)本发明发现当氟班色林浓度为0.01-15μM时，对白血病细胞的毒性强，随着氟班色林浓度增加，白血病细胞线粒体复合体I的活性显著降低。
附图说明
图1为不同浓度Flibanserin和IM作用48h后K562细胞(人类髓性白血病人工培养的细胞)的细胞存活率图；
图2为不同浓度Flibanserin和普纳替尼(Po)作用48h后Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞的细胞存活率图；
图3为不同浓度Flibanserin和鱼藤酮(Rot)作用48h后HepG2细胞的细胞存活率图；
图4为不同浓度Flibanserin和Rot作用48h后A549细胞的细胞存活率图；
图5为不同浓度Flibanserin和阿霉素(Dox)作用48h后H9c2细胞的细胞存活率图；
图6为用不同浓度Flibanserin和Rot作用24h后K562细胞的线粒体复合体I活性值图；
图7为使用3μM Flibanserin处理K562细胞后在不同时间的K562细胞内的ATP含量图；
图8为Rot和不同浓度Flibanserin处理K562细胞24h后NDUFB3、NDUFS3、NDUFV3、NDUFA6、NDUFS6和NDUFA9的mRNA水平图；
图9为Flibanserin对裸鼠体重变化的影响图；
图10为Flibanserin对肿瘤的体积影响图；
图11为Flibanserin对肿瘤的形态大小影响图；
图12为Flibanserin对肿瘤的质量影响图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1氟班色林对K562细胞(人类髓性白血病人工培养的细胞)的毒性检测以及对伊马替尼(IM)耐药的Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞的耐药性检测
(1)MTT法检测
分别使用100μM的IM、不同浓度氟班色林(分别是0.03、0.1、0.3、1、3、10μM)处理K562细胞48h，然后更换1mg/mL噻唑蓝(MTT)溶液处理4h，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)以溶解甲瓒，通过多功能酶标仪在490nm测定吸光度值，细胞存活率即为对照组的相对值。对照组不添加氟班色林。
采用0.3μM的Po代替上述的IM，重复上述实验，以进行耐药性检测。
(2)实验结果
氟班色林对K562细胞毒性检测结果如图1所示(作用48h后与对照组相比，*P<0.05)，氟班色林处理后的K562细胞的细胞存活率相对于对照组下降，说明Flibanserin对白血病细胞的杀伤作用强，并且具有浓度依赖性，当Flibanserin浓度达到10μM时，其效果甚至优于Po。Flibanserin对伊马替尼耐药的Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞耐药性检测结果如图2所示(作用48h后与对照组相比，*P<0.05)，Flibanserin表现出了对Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞显著的杀伤作用，表明氟班色林可以应用于杀伤对伊马替尼耐药的白血病细胞，并且能产生优异的治疗效果。其中，图1中，IM为伊马替尼，Fli为Flibanserin即氟班色林，Cellviability为细胞存活率，％of control为与对照组的相对值，K562 cells为K562细胞，图2中Po为普纳替尼。普纳替尼是一种激酶抑制剂，适用于治疗对既往酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药或不能耐受的CML。
实施例2氟班色林对HepG2(肝癌细胞)、A549(肺癌人类肺泡基底上皮细胞)和H9c2(大鼠心肌细胞)细胞系的选择性实验
(1)采用不同浓度Flibanserin(分别是0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μM)分别处理HepG2、A549和H9c2细胞系，培养48h后，检测Flibanserin对不同细胞系的毒性。
(2)实验结果
结果如图3-图5所示，与对照组相比，当Flibanserin浓度大于30μM时，才表现出明显的细胞毒性。对实验结果进行细胞选择系数(SI)计算(细胞选择系数SI＝IC50其他细胞/IC50白血病细胞)，结果如表1所示，SI值均＞3，显示出氟班色林对白血病细胞具有极强的细胞选择性。浓度小于等于30μM的Flibanserin对HepG2、A549和H9c2细胞系的毒性较弱，而在相同浓度范围下Flibanserin对K562细胞和Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞的毒性极强，证明Flibanserin可以针对性地、有效地杀死K562等白血病细胞，而对HepG2、A549、H9c2等细胞系的毒性极小，Flibanserin具有极强的细胞选择性。
其中，图3-图4中，Rot为鱼藤酮，鱼藤酮是线粒体复合物I的抑制剂，作为阳性对照。(图3-5中作用48h后与对照组相比，*P<0.05)。
表1氟班色林对不同细胞的选择性实验结果
| 细胞系 | 细胞选择系数(SI) |
| HepG2 | 47 |
| A549 | 46 |
| H9c2 | ＞140 |
实施例3氟班色林对白血病细胞线粒体复合体I活性与ATP含量的关系
(1)白血病细胞线粒体复合体I活性测定
使用1μM、3μM和10μM的Flibanserin分别处理K562细胞，培养24h后收集细胞。然后使用线粒体复合体Ⅰ试剂盒测量线粒体复合体I的活性。
(2)ATP含量的测定
使用3μM的Flibanserin处理不同的时间的K562细胞，收集细胞，加入ATP检测裂解液裂解细胞，离心，收集上清液转移至预冷的1.5mL离心管中。分别将不同浓度的ATP标准溶液和上述样品加入到已有ATP检测工作液的孔中，混匀，间隔5s后，用多功能酶标仪测定相对光单位值。根据ATP标准溶液绘制标准曲线，根据样品相对光单位值计算ATP浓度。
(3)实验结果
结果如图6所示，随着Flibanserin浓度增加，线粒体复合体I的活性显著降低且呈浓度依赖关系(P<0.05)，差异具有统计学意义。使用3μM Flibanserin处理K562细胞，在6h、12h、24h和48h后收集细胞，测定K562细胞内的ATP含量，结果如图7所示，随着时间的延长，细胞中ATP的含量随时间递进而降低。结果显示本发明药物不仅可以降低复合体I的活性还可以降低细胞内ATP的含量，导致细胞内ATP的含量减少从而影响白血病细胞的代谢和增殖功能。图6中，Complex I specific activity为复合体I比活性，protein为蛋白质，veh为空白对照组。图7中，Incubation time为培养时间，ATP content为ATP含量。
实施例4氟班色林对线粒体复合体I潜在蛋白靶点的网络预测，测定相关基因表达结果
(1)qRT-PCR检测
使用带吸附柱的UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，提取不同浓度药物处理后的细胞的总RNA，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒制备cDNA，使用BeyoFastTMSYBRGreen qPCR混合物进行实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)。反应程序如下：第一步先在95℃处理进行预变性2min，第二步95℃处理15s后，在60℃处理30s，重复40个循环。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)用作内参对照。
(2)实验方法
试验Flibanserin对线粒体复合体I潜在蛋白靶点的相互作用。将不同浓度Flibanserin(分别为1、3、10μM)处理K562细胞，24h后分别对K562细胞进行NDUFB3、NDUFS3、NDUFV3、NDUFA6、NDUFS6和NDUFA9的mRNA水平qRT-PCR检测。
(3)实验结果
结果图8所示，其中图8A-F为氟班色林、Rot分别处理K562细胞后，线粒体复合体I上NDUFB3、NDUFS3、NDUFV3、NDUFA6、NDUFS6和NDUFA9基因的mRNA水平图，结果表明氟班色林对白血病细胞线粒体复合体I上的NDUFB3、NDUFS3、NDUFV3、NDUFA6、NDUFS6和NDUFA9等6个基因均表现出抑制作用，且呈浓度梯度依赖关系。以上结果证明Flibanserin可以抑制线粒体复合体I上蛋白基因的表达，从而减少相应mRNA水平的表达量。图8中，Rot为鱼藤酮，作用24h后与空白组相比，*P<0.05。
实施例5氟班色林对裸鼠体内K562细胞移植瘤生长进行影响实验测试
(1)采用同一生长时期的裸鼠进行K562细胞小鼠荷瘤实验，选取个体形态相似、活跃度相近、以及移植瘤生长状况良好的裸鼠个体，随机分为个体数相同两组，分别命名为模型组和实验组。
实验组：注射2.5mg/kg的Flibanserin溶液；模型组：注射等量安慰剂，其中安慰剂组成为：DMSO 1wt％、PEG400 40wt％、吐温80 5wt％、生理盐水54wt％。
每三天一次分别对模型组和实验组进行裸鼠体重和肿瘤体积的测量，具体测量方法是在裸鼠皮下接种区域采用肿瘤用游标卡尺测量肿瘤的最长直径(L)和垂直于L的直径(W)，然后根据公式：体积(V)＝L×W2/2来计算肿瘤体积。
第18天，小鼠进行禁食不禁水12h，对裸鼠进行解刨，称量肿瘤质量，测量肿瘤体积。
(2)实验结果
如图9所示，进行药物注射实验前模型组和实验组裸鼠体重相近(实验组略低于模型组)，为期18天的实验后，实验组略重于模型组，差异具有统计学意义。由图10(与模型组相比，*P<0.05)可知，在中后期模型组的肿瘤体积远大于实验组，随时间递进关系差异。解刨出的肿瘤组织如图11所示(每方格边长0.5mm)，模型组的肿瘤远大于实验组，模型组与实验组在肿瘤形态大小上存在显著差异。如图12(与模型组相比，*P<0.05)根据模型组和实验组所称量的肿瘤质量对比，可知模型组肿瘤的质量远高于实验组肿瘤的质量。根据以上结果可知，浓度在1-10μM范围的Flibanserin对裸鼠肿瘤组织生长抑制效果明显，具有显著的统计学意义。其中，图9中，Before treatment为用药治疗前，After treatment为用药治疗后，Body weight为体重。图10中，treatment time为治疗时间，Tumor volume为肿瘤体积。图12中，Tumor weight为肿瘤质量。
Claims (10)
1.氟班色林在制备治疗白血病药物中的应用。
2.氟班色林在制备抑制白血病细胞呼吸药物中的应用。
3.氟班色林在制备抑制白血病细胞线粒体复合体I的活性药物中的应用。
4.氟班色林在制备杀伤对伊马替尼耐药的Ba/F3 BCR-ABLT315I细胞药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氟班色林具有如下式(Ⅰ)所示分子结构：
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氟班色林的浓度为0.01-15μM。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氟班色林的浓度为0.03-10μM。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氟班色林的浓度为1-10μM。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为药学上可接受的剂型。
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