KR20110105439A

KR20110105439A - 항비만 또는 체지방감소를 위한 조성물

Info

Publication number: KR20110105439A
Application number: KR1020100024551A
Authority: KR
Inventors: 김기탁
Original assignee: 주식회사 동일팜텍
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2011-09-27
Also published as: KR101213174B1

Abstract

본 발명은 안전하면서도 항비만 및 체지방감소 효과가 뛰어난 조성물에 관한 것으로서, 루페온, 모노아실글리세롤, 3-O-[α-D-갈락토파이라노실-(1"→6')-O-β-D-갈락토파이라노실]디글리세롤 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 조성물은 항비만 또는 체지방감소를 위한 의약품 또는 기능성 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항비만 또는 체지방감소를 위한 조성물{Composition for anti-obesity or reducing body-fat}

본 발명은 항비만 또는 체지방감소용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항비만 또는 체지방감소 방법에 관한 것이다.

에너지 항상성(homeostasis)은 흡수한 에너지와 소비된 에너지 사이의 균형을 나타낸다. 과도한 에너지의 섭취로 인하여 균형이 깨지게 되면 비만이나 당뇨병과 같은 대사질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 비만으로 인한 체중을 감소시키기 위한 약물로서는 식욕을 억제하는 약물인 시부트라민(sibutramine)과 체내의 리파제(lipase)를 억제하여 음식물에 포함된 지방질의 흡수를 감소시키는 올리스타트(orlistat)가 대표적이다.

그러나 시부트라민의 경우 혈압상승, 불면증, 구강건조, 어지러움 등의 부작용이 비교적 흔하다. 또한 시부트라민은 심혈관질환, 조절되지 않는 고혈압을 가진 환자에게는 사용할 수 없는 단점이 있다. 또 올리스타트의 경우에는 설사, 지방변, 분실금 등의 부작용이 흔하고 한국인과 같이 지방 섭취가 서양인에 비해 적은 경우에는 약물의 효과가 뚜렷하지 않다.

따라서 보다 안전하면서도 항비만 효과 및 체지방감소 효과가 탁월한 약물에 대한 꾸준한 연구의 필요성이 제기되고 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 부작용이 적어 안전하면서도 항비만 및/또는 체지방감소 효과가 뛰어난 조성물 및 이를 함유하는 의약품 또는 기능성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 안전하면서도 효과적인 항비만 및/또는 체지방감소 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 루페온, 하기 화학식 2의 모노아실글리세롤, 하기 화학식 3의 3-O-[α-D-갈락토파이라노실-(1"→6')-O-β-D-갈락토파이라노실]디글리세롤 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 또는 체지방감소용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 및/또는 체지방감소용 의약품 또는 기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 체중감소 또는 체지방감소가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 항비만 및/또는 체지방감소 방법을 제공한다.

본 발명자들은 오랫동안 사용되어 안전성이 입증된 천연물 중에서 항비만 및 체지방감소 효과를 가지는 화합물을 얻고자 노력하였고, 사삼으로부터 분리된 상기 화학식 1 내지 3의 화합물이 뛰어난 항비만 및 체지방감소 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였으며, 특히 상기 화학식 1 내지 3의 화합물들 중에서 루페온의 항비만 및 체지방감소 효과가 탁월하였다.

본 발명의 항비만 또는 체지방감소용 조성물에서 유효성분으로 포함되는 상기 화학식 1 내지 3의 화합물들은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 화학적 합성법을 통해 제조하여 얻을 수 있으며, 또한 사삼(Adenophorae Radix)으로부터 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 추출 및 분리 방법을 통해서도 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1 내지 3의 화합물들은 화합물에 따라 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"은 독성이 없거나 적은 산 또는 염기로 제조된 염들을 말한다. 본 발명의 화합물들이 상대적으로 산성일 경우 염기(base) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 염기와 적당한 비활성(inert) 용매로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 마그네슘 또는 유기 아미노로 이루어진 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물들이 상대적으로 염기성일 경우 산(acid) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 산과 적당한 비활성 용매로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 프로피온산, 이소부틸산, 옥살산, 사과산, 말론산, 안식향산, 호박산, 수버릭(suberic), 푸마르산, 만데릭산, 프탈릭산, 벤젠설폰산, p-토릴설폰산, 구연산, 주석산, 메탄설폰산, 염산, 브롬산, 질산, 탄산, 일수소탄산(monohydrogencarbonic), 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소, 아인산(phosphorous acid) 등으로 형성된 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 알지네이트(arginate) 같은 아미노산의 염 및 글루쿠로닉(glucuronic) 또는 갈락투노릭(galactunoric) 산들과 같은 유기산의 유사체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물들은 화합물에 따라 수화물 형태를 포함하여 용매화된 형태뿐만 아니라 비-용매화된(unsolvated) 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명의 화합물들은 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 물리적 형태는 본 발명의 범위에 포함된다. 또한 본 발명의 화합물들은 화합물에 따라 광학 중심인 비대칭 탄소원자 또는 이중 결합을 가질 수 있어 라세미체, 에난치오머, 디아스테레오머, 기하 이성질체 등이 존재할 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 항비만 또는 체지방감소용 조성물은 의약품 및 기능성 식품의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 의약품 및 기능성 식품은 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 항비만 또는 체지방감소용 조성물은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.

본 발명의 항비만 또는 체지방감소용 조성물을 포함하는 의약품 또는 기능성 식품은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 산제는 본 발명의 루페온과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 루페온; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 항비만 또는 체지방감소용 조성물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

항비만 또는 체지방감소라는 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 매일 약 0.01 mg/kg 내지 약 4 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1 내지 3의 화합물 중 어느 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는 항비만, 체중유지 또는 체지방감소 방법을 제공한다.

본 발명은 화학식 1의 루페온, 하기 화학식 2의 모노아실글리세롤, 하기 화학식 3의 3-O-[α-D-갈락토파이라노실-(1"→6')-O-β-D-갈락토파이라노실]디글리세롤의 항비만 또는 체지방감소 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 의약품 또는 기능성 식품은 항비만 또는 체지방감소 효과가 탁월하다.

도 1은 3T3-L1 지방전구세포를 이용한 본 발명에 따른 화합물들의 항비만 효과 평가 결과로, 분화된 세포 내의 지방 양을 보여주는 그래프이다.
도 2는 3T3-L1 지방전구세포를 이용한 루페온의 항비만 효과 평가 결과로, 지방세포의 분화 정도를 보여주는 오일 레드 O 염색 결과 사진이다.
도 3은 루페온이 PPAR-γ의 전사 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 4는 지방세포로 분화하는 단계에서 C/EBPα와 PPARγ의 발현에 미치는 루페온의 영향을 보여주는 그래프이다.
도 5는 지방세포로 분화하는 단계에서 아디포카인(adipokine)의 발현에 미치는 루페온의 영향을 보여주는 그래프이다.
도 6은 루페온이 농도의존적으로 PPARγ 및 C/EBPα의 생성을 억제하는 것을 보여주는 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 사삼으로부터 본 발명에 따른 화합물들의 분리

하기 분리도에 따라 사삼(Adenophorae Radix)으로부터 본 발명에 따른 화합물들을 분리 및 동정하였다.

보다 구체적으로 다음과 같이 하기 화학식 1 내지 3의 화합물을 얻었다. 건조분말 사삼 1.5 kg에 80% 에탄올을 가하고 24시간 2회 냉침 추출 하였다. 추출액을 감압 상태에서 농축시켜 에탄올 추출물을 얻었다. 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 용매 분획하였다. 디클로로메탄 분획층을 감압상태에서 증발시켜 16 g의 추출물을 얻었고, 추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래프하였다. 용출액은 헥산-아세톤(1:0, 90:1, 70:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1)의 조성을 바꾸어 단계적으로 용출시켰다. 총 12개의 소분획(G22JC-72-1~12)으로 나누었고, 이 중 G22JC-72-2 분획을 아세토니트릴-물(70, 80, 90, 100% 아세토니트릴) 용출액으로 재차 RP-18 칼럼 크로마토그래프하여 4개의 소분획으로 다시 나누었으며, 4번 분획에 대하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래프(헥산-디클로로메탄 = 10:1, 5:1, 1:1)를 실시하여 화합물 1(루페온(lupeone))을 얻었다. 또한 G22JC-72-9 소분획에 대하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래프(디클로로메탄-아세톤 = 90:1, 70:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1)를 실시하였으며, 9개의 소분획으로 구분하였으며, 5번과 6번 분획을 합하여 prep. HPLC (80% 아세토니트릴; 20ml/min; ODS 컬럼)을 진행하여 화합물 2(모노아실글리세롤)를 얻었다. G22JC-72-12 소분획에 대하여 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래프(CM=3:1)를 실시하여 5개의 분획으로 분류하였으며, 2번 분획에 대하여 연속적인 실리카겔 칼럼 크로마토그래프를 이동상 디클로로메탄-메탄올-물(20:2:1, 10:2:1) 용출액으로 화합물 3(3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1"→6')-O-β-D-galactopyranosyl]diglycerol)을 분리하였다. 순수하게 분리된 화합물들은 UV, NMR, 질량분석 등을 실시하여 해당 구조를 결정하였다. 이러한 과정을 통하여 하기 화학식 1의 루페온, 하기 화학식 2의 모노아실글리세롤(monoacylglycerol(glycerol moiety : linolenate (18:3)), 및 하기 화학식 3의 3-O-[α-D-갈락토파이라노실-(1"→6')-O-β-D-갈락토파이라노실]디글리세롤(glycerol moiety : 1 = linoleate (18:2), 2 = palmitate (16:0))를 얻었다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

<실시예 2> 3T3-L1 지방전구세포를 이용한 항비만 효과의 평가

3 T3 - L1 지방전구세포의 준비

3T3-L1 지방전구세포는 미국세포주은행(ATCC)으로부터 구매하여 실험에 사용하였다. 3T3-L1은 지방세포의 대사과정을 연구하는 데에 널리 이용되는 세포주로서, 상기 세포의 분화가 활발할수록 지방세포 내의 지방 축적이 활발하여 비만을 유도하게 된다. 따라서 항비만 효과를 가질 것으로 생각되는 물질을 상기 세포에 처리하였을 때, 세포의 분화가 적을수록 항비만 효과가 큰 물질인 것으로 볼 수 있다.

3 T3 - L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 유도

마우스 전구지방세포인 3T3-L1을 10% BCS DMEM 배지를 넣고 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 3T3-L1 전구지방세포를 24 well plate에 5×10⁴/well의 세포 수로 분주한 후, 100% confluency 시점이 되자 2일 동안 더 유지시켰다. 전구지방세포는 MDI(0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 1 uM dexamethasone, 1 ug/ml 인슐린)를 포함하는 10% FBS DMEM 배지로 지방세포 분화를 2일 동안 유도하였고, 배양 48시간 후, 1 ug/ml 인슐린이 함유된 10% FBS DMEM으로 이틀 동안 배양하였다. 그 후 2일 마다 4일 동안 10% FBS DMEM 배양액으로 교체하였다. 지방세포 분화를 유도하는 동안 본 발명에 따른 화학식 1의 루페온(lupeone), 화학식 2의 모노아실글리세롤 및 화학식 3의 디글리세롤 시료를 각각 표시된 농도로 각 배양에 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다.

오일 레드 O ( Oil red O) 염색 및 분석

지방의 축적 정도를 확인하기 위해 오일 레드 O 염색을 하였다. 상기 실험에서 유도한 지방세포의 분화 정도를 오일 레드 O 염색을 통해 1차적으로 현미경을 통해 확인하였고, 지방세포 염색 정도는 510 nm 흡광도에서 세포의 분화된 지방의 양을 측정하였다.

그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 도 1 및 2에 나타나는 것과 같이, 본 발명에 따른 화합물들은 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 농도의존적으로 억제하였고, 결과적으로 지방의 양도 감소시켰다. 따라서 본 발명에 따른 화합물들은 항비만 효과 및 체지방감소 효과가 있을 것으로 생각되며, 특히 루페온의 효과가 가장 탁월하였다.

<실시예 3> PPAR-γ의 전사 활성 분석

지방세포로 분화 단계에서 PPARγ는 발현 양이 증가한다. 따라서 PPARγ의 발현에 대한 루페온의 영향을 평가하여 루페온의 항비만 효과를 평가하였다.

HEK 293T 세포에 pGL3-PPRE 루시퍼라제 수용체(reporter) 유전자와 PPARγ, pRL-SV-40 플라스미드를 트렌스펙션(transfection)하였다. 유전자들을 하루 동안 발현시킨 후, 세포에 본 발명에 따른 루페온 50 uM, 100 uM 또는 200 uM과 PPARγ 유도물질인 10 uM 트로그리타존(troglitazone)을 24시간 동안 함께 처리하였다. 그 후, 루페온 시료에 의한 PPARγ의 전사 활성 정도를 루시퍼라제 발현 강도를 통해 관찰하였으며, 그 결과를 보면 트로그리타존에 의해 활성화된 PPAR-γ의 전사 활성을 루페온 시료가 농도의존적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

<실시예 4> 실시간(Real-time) PCR 이용 평가

지방세포로 분화 단계에서 C/EBPα와 PPARγ는 분화된 지방세포에서 발현 양이 증가한다. 대부분의 아디포카인(adipokine)들의 발현도 증가하게 된다. 지방세포 분화 유도 방법과 같이 루페온 시료를 100 uM 또는 200 uM 농도로 처리한 후 8일 동안 분화시켜 C/EBPα와 PPARγ, 지방세포 분화에 관여하는 유전자들의 발현 정도를 실시간 PCR로 확인하였다. 분화가 완벽히 된 3T3-L1 세포를 PBS로 두 번 세척한 후, 세포 펠렛을 모아 RNA prep kit를 사용하여 RNA만 분리하였다. 추출된 RNA를 1 ug 사용하여 cDNA를 합성한 후 SYBR green과 primer를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였으며, 대조군 유전자로는 GAPDH를 사용하였다. 사용된 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머는 하기 표 1과 같다. 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.

Gene name	Forward primer	Reverse primer
GAPDH	GAGTCAACGGATTTGGTCGT	GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
PPARγ	CGCTGATGCACTGCCTATGA	AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC
C/EBPα	AGGTGCTGGAGTTGACCAGT	CAGCCTAGAGATCCAGCGAC
aP2	CATGGCCAAGCCCAACAT	CGCCCAGTTTGAAGGAAATC
Resistin	TCAACTCCCTGTTTCCAAATGC	TCTTCACGAATGTCCCACGA

도 4 및 5에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 루페온은 지방세포 분화 단계에서 발현 양이 증가하는 C/EBPα 및 PPARγ와 아디포카인(adipokine)들의 발현을 획기적으로 감소시켰다.

<실시예 5> 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 이용 평가

지방세포 분화 유도 방법과 같이 3T3-L1 세포에 루페온 시료를 이틀 간격으로 처리한 후 세포를 PBS로 두 번 세척하였으며, RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM sodium chloride, 1 % NP-40, 0.5 % sodium dexycholate, 0.1 % sodium dodecyl sulfate, protease inhibitor)을 이용하여 세포를 용해시켰다. 13000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 단백질을 추출 정량하여, 8% SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동된 단백질들을 막에 이동시킨 후 5% skim milk를 포함하는 TBST로 블로킹(blocking)하였다. 1차 항체(PPARγ, C/EBPα)와 2차 항체로 반응시킨 후 ECL을 통해 PPARγ 및 C/EBPα 단백질을 규명하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 루페온은 농도의존적으로 PPARγ 및 C/EBPα의 생성을 억제하였다.

Claims

하기 화학식 1의 루페온, 하기 화학식 2의 모노아실글리세롤, 하기 화학식 3의 3-O-[α-D-갈락토파이라노실-(1"→6')-O-β-D-갈락토파이라노실]디글리세롤 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 또는 체지방감소용 조성물.
<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>
제 1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 또는 체지방감소용 의약품.
제 1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만 또는 체지방감소용 기능성 식품.