CN112891346B - 黄柏碱作为治疗肝纤维化药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开了黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用。本发明提供了黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的新应用，经研究发现黄柏碱治疗肝纤维化的主要作用机制是其可以降低肝星状细胞LX‑2中肝纤维化主要标志物基因转录生成的mRNA的水平，进而降低肝星状细胞LX‑2中肝纤维化主要标志物的表达。同时，黄柏碱能够降低肝星状细胞LX‑2存活率，抑制肝星状细胞LX‑2的活性，且针对性强，不会对肝星状细胞LX‑2以外的肝细胞Heparg产生影响。本发明提供的黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的新应用对突破肝纤维化治疗瓶颈具有重大意义。

Description

黄柏碱作为治疗肝纤维化药物的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及黄柏碱作为治疗肝纤维化药物的应用。
背景技术
肝纤维化作为慢性肝脏疾病的结局，其中心环节是肝细胞损伤引起的肝星状细胞的激活。肝星状细胞的激活可破坏肝脏细胞外基质(Extracellular Membr ane，ECM)生成和降解之间的平衡，使ECM蛋白过多沉积于肝脏，从而引起肝纤维化，甚至肝硬化。肝纤维化既是一种代偿修复反应，又是肝损伤的促进因素。各种病因引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化的发生，其中25％-40％最终发展为肝硬化甚至肝癌。
我国是肝病大国，约有4亿肝病患者，肝病发病率和死亡率均高于世界平均水平。在肝纤维化的治疗方面，消除病因治疗是阻止和逆转肝纤维化进展的主要方法。因此，针对肝纤维化发生发展机制及其治疗方法的研究将有可能为治疗大部分肝脏疾病带来希望。目前世界上尚无有效药物来治疗肝纤维化，突破肝纤维化治疗瓶颈将产生极大的社会效益和经济效益。
发明内容
针对现有肝纤维化治疗中存在的上述问题，本发明提供黄柏碱作为治疗肝纤维化药物的应用。黄柏碱能够降低肝星状细胞LX-2存活率，且对肝细胞Heparg存活率没有明显影响。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
本发明提供了黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
黄柏碱具有较好的降血压、抗肾炎、抑制细胞免疫和抑制中枢神经的作用。本发明提供了黄柏碱作为治疗肝纤维化药物的新的应用，经研究发现黄柏碱治疗肝纤维化的主要作用机制是：其可以通过降低肝星状细胞LX-2中肝纤维化主要标志物基因转录生成的mRNA的水平，进而降低肝星状细胞LX-2中肝纤维化主要标志物的表达。同时，黄柏碱能够降低肝星状细胞LX-2存活率，抑制肝星状细胞LX-2的活性，且针对性强，不会对肝星状细胞LX-2以外的肝细胞Heparg产生影响。本发明提供的黄柏碱作为治疗肝纤维化药物的新的应用对突破肝纤维化治疗瓶颈具有重大意义。
所述黄柏碱的结构式为：
Figure BDA0003003785120000021
黄柏碱为黄柏的单体组分之一，CAS号：6873-13-8，分子式：C20H24NO4，分子量342.414。
优选的，所述治疗肝纤维化药物为肝星状细胞LX-2存活抑制剂。
优选的，所述治疗肝纤维化药物为肝星状细胞LX-2增殖抑制剂。
优选的，所述治疗肝纤维化药物为肝星状细胞LX-2凋亡促进剂。
优选的，所述治疗肝纤维化药物为肝星状细胞LX-2中肝纤维化标志物基因的转录抑制剂。
优选的，所述治疗肝纤维化药物中所述黄柏碱的浓度为1-5mg/mL。
优选的，所述治疗肝纤维化药物中所述黄柏碱的浓度为2-5mg/mL。
优选的，所述治疗肝纤维化药物中所述黄柏碱的浓度为5mg/mL。
优选的，所述治疗肝纤维化药物的剂型包括口服制剂和注射给药剂。
本发明提供了黄柏碱在体外降低肝星状细胞LX-2存活率中的应用。
本发明提供的黄柏碱在体外降低肝星状细胞LX-2存活率中的应用，促进了治疗肝纤维化药物的研究和开发。
附图说明
图1是本发明实施例1中不同浓度的黄柏碱对LX-2细胞存活率影响的柱形图；
图2是本发明实施例2中不同浓度的黄柏碱对肝细胞Heparg存活率影响的柱形图；
图3是本发明实施例2中在不同浓度的黄柏碱处理下通过倒置显微镜观察的肝Heparg细胞的形态；
图4是本发明实施例3中不同浓度的黄柏碱对COL1A1、ACTA2基因的mRNA表达水平影响的柱形图；
图5是本发明实施例4中检测的处理组中小鼠肝组织的HYP含量柱形图；
图6是本发明实施例4中检测的处理组中小鼠血清中透明质酸含量柱形图；
图7是本发明实施例4中检测的处理组中小鼠血清中层粘连蛋白含量柱形图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
黄柏碱能够降低肝星状细胞LX-2存活率
试验方法：
将人肝星状细胞LX-2培养于含10％胎牛血清、青霉素(10万U/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。按照每孔5×103个细胞铺于96孔板，加入不同浓度梯度的黄柏碱，其中，40个孔添加1μL浓度为25μM的黄柏碱，40个孔添加1μL浓度为50μM的黄柏碱，剩余的16个孔设置成对照组(不加黄柏碱，加入等体积的去离子水)，待48h后，加入CCK-8，放置于培养箱4h后置于酶标仪，读取450nm处的吸光度值(OD)。
给药组与对照组的绝对吸光度值(平均值)百分比定为细胞存活率，按下述公式计算：细胞存活率(％)＝给药组平均OD值/对照组平均OD×100％。结果如图1所示，不同浓度的黄柏碱与LX-2细胞孵育48h后，检测细胞存活率发现黄柏碱(25μM和50μM)能明显降低LX-2细胞存活率。
实施例2
黄柏碱对人肝细胞Heparg存活率无明显影响
将人正常肝Heparg细胞培养于含10％灭活胎牛血清、10万U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，细胞在37℃、5％的CO2的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。按照每孔5×103个细胞铺于96孔板，加入不同浓度梯度的黄柏碱，其中，40个孔添加1μL浓度为25μM的黄柏碱，40个孔添加1μL浓度为50μM的黄柏碱，剩余的16个孔设置成对照组(不加黄柏碱，加入等体积的去离子水)，待48h后，加入CCK-8，放置于37℃、5％的CO2的培养箱，4h后置于酶标仪，读取450nm处的吸光度(OD)。给药组与空白组的绝对吸光度值(平均值)百分比定为细胞存活率，按下述公式计算：
细胞存活率(％)＝给药组平均OD值/对照组平均OD×100％。结果如图2所示，不同浓度的黄柏碱与肝Heparg细胞孵育48h后，检测细胞存活率发现黄柏碱(25μM和50μM)对肝细胞Heparg的存活率没有影响。同时在倒置显微镜下观察细胞的形态，结果如图3所示，进一步说明黄柏碱(25μM和50μM)对肝细胞Heparg的存活率没有明显影响。
实施例3
黄柏碱在mRNA水平上抑制LX-2细胞中肝纤维化主要标志物的表达
1.1黄柏碱给药处理LX-2细胞：LX-2在含10％(体积)胎牛血清、1％(体积)青链霉素混合液的DMEM，High Glucose，GlutaMAX TM(Gibco 10566016)培养基中，37℃，5％CO2条件下培养。按照每孔1×105个细胞铺于96孔板，培养24h后使用真空泵去除96孔板内原有的培养基并加入不同浓度梯度的黄柏碱，其中，40个孔添加1μL浓度为25μM的黄柏碱，40个孔添加1μL浓度为50μM的黄柏碱，剩余的16个孔设置成对照组(不加黄柏碱，加入等体积的去离子水)，孵育48h后，收集细胞沉淀备用。
1.2按照AZfresh TM总RNA小量/微量提取试剂盒说明书操作步骤提取1.1收集得到的LX-2细胞的总RNA。按照Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作步骤将LX-2的总RNA逆转录为cDNA。所述cDNA的量是由0.5μg的RNA经过逆转录反应所得的量。将所得的cDNA与无菌水、Roche FastStartUniversal Probe Master(Rox)(0.2μL)以及ABI TaqManprobes(COL1A1，ACTA2)(1μL)配制成10μL反应体系。使用ABI7500Fast Real-Time PCR System(PCR仪)对上述反应体系进行检测，反应条件为：95℃10min；95℃15s，56℃15s，30个循环；60℃30s。检测得到的不同的黄柏碱浓度下COL1A1和ACTA2的mRNA水平(相对于对照组中的mRNA水平)，结果如图4所示，黄柏碱在25μM和50μM时可在mRNA水平上显著抑制COL1A1、ACTA2的表达。由实施例1-3的试验结果可知，黄柏碱能够降低肝星状细胞LX-2的存活率，且对人正常肝细胞Heparg无毒性，其能在mRNA水平上抑制LX-2细胞中肝纤维化主要标志物的表达。因此，黄柏碱能够应用于抗肝纤维化药物的制备，并达到抗纤维化效果。
实施例4
黄柏碱缓解CCl4诱导小鼠肝纤维化
15只C57BL/6小鼠随机分为3组：(1)溶媒对照组(n＝5)，(2)CCl4模型组(n＝5)，(3)CCl4+黄柏碱(50mg/kg)(n＝5)。黄柏碱溶解在0.5％CMC-Na溶液中，使黄柏碱的浓度分别为5mg/ml和1mg/ml，每天给予小鼠黄柏碱，剂量分别为25mg/kg和50mg/kg。CCl4(腹腔注射，CCl4与橄榄油的体积比为1:3，橄榄油的体积为3ml，注射量2ml/kg)，每周2次，共4周。溶媒对照组给予橄榄油和0.5％CMC-Na。实验结束后处死小鼠，收集血浆和肝组织。
用南京建成羟脯氨酸试剂盒中说明书描述的碱性水解法测定肝组织中羟脯氨酸的含量。结果如图5所示。
血清中透明质酸(hyaluronic acid，HA)和层粘连蛋白(laminin，LN)含量按照ELISA试剂盒说明书所述进行测定。结果如图6和图7所示。
肝脏羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是肝纤维化的金指标，由图5可知，黄柏碱(50mg/kg)可显著降低CCl4诱导的小鼠肝脏羟脯氨酸(HYP)含量；透明质酸(hyaluronicacid，HA)和层粘连蛋白(laminin，LN)，是指示肝纤维化发生的两个主要血清标记物。在CCl4模型组小鼠血清中，HA和LN的含量明显升高，由图6和图7可知，黄柏碱(50mg/kg)能显著降低CCl4诱导的小鼠血清HA和LN的含量。因此，黄柏碱能够应用于抗肝纤维化药物的制备，具有抗纤维化效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
2.如权利要求1所述的黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述治疗肝纤维化药物为肝星状细胞LX-2存活抑制剂。
3.如权利要求1所述的黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述治疗肝纤维化药物为肝星状细胞LX-2中肝纤维化标志物基因的转录抑制剂。
4.如权利要求1所述的黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述治疗肝纤维化药物中所述黄柏碱的浓度为1-5mg/mL。
5.如权利要求4所述的黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述治疗肝纤维化药物中所述黄柏碱的浓度为2-5mg/mL。
6.如权利要求5所述的黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述治疗肝纤维化药物中所述黄柏碱的浓度为5mg/mL。
7.如权利要求1所述的黄柏碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述治疗肝纤维化药物的剂型包括口服制剂和注射给药剂。
8.黄柏碱在体外降低肝星状细胞LX-2存活率中的应用。
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