CN113308438A - Fto基因修饰的猪脂肪干细胞及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种FTO基因修饰的猪脂肪干细胞及其构建方法与应用。构建方法步骤包括：1）猪脂肪干细胞（pADSCs）分离；2）脂质体法瞬时超表达FTO基因，构建FTO基因修饰的猪脂肪干细胞。pADSCs超表达FTO增加了细胞周期蛋白CDK2和CDK4蛋白表达；促进细胞周期G1期向S期过渡；增加成脂分化关键基因PPARγ、FABP4和C/EBPα的mRNA表达水平。接种在胶原海绵支架中可构建组织工程皮肤。

Description

FTO基因修饰的猪脂肪干细胞及其构建方法与应用
技术领域
本发明在猪脂肪干细胞中瞬时超表达FTO，增强其增殖分化能力，并结合胶原海绵支架制备组织工程皮肤，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
背景技术
如何促进皮肤创伤快速修复是创伤研究的重要方向。利用组织工程技术构建皮肤替代物是促进创伤修复的重要方法，其关键是找到理想的种子细胞。胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞等虽然具有自我更新和分化多能性，但由于细胞数量少、获取难度大、对供体损伤大以及伦理学等问题而限制了其广泛使用。脂肪干细胞（ADSCs）由于来源广泛、数量丰富、具有增殖速度快以及免疫原性低等优点，是较为理想的组织工程种子细胞。最新研究表明，通过基因修饰干细胞可改善干细胞功能，从而增强其临床治疗效果。因此筛选合适的基因进行干细胞修饰，可作为皮肤创伤快速修复的新策略。
本申请人前期研究（Wu等，2018，BBA-MOL CELL BIOL L）发现，FTO基因可显著促进细胞增殖和分化，但构建成组织工程皮肤尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种FTO基因修饰的猪脂肪干细胞及其构建方法与应用。
一种FTO基因修饰的猪脂肪干细胞的构建方法，
1）猪脂肪干细胞（pADSCs）分离；
2）脂质体法瞬时超表达FTO基因，构建FTO基因修饰的猪脂肪干细胞。
所述的1）猪脂肪干细胞分离：
1.1）选取3日龄仔猪, 按10 mg/kg体重颈部注射麻醉剂麻醉，人道处死后用新洁尔灭和75％酒精全身消毒；
1.2）在无菌操作环境下，采集仔猪颈、肩胛、背部脂肪组织，用含5%青霉素/链霉素双抗的PBS（磷酸缓冲盐溶液）冲洗三次，转移至无菌培养皿中，在超净工作台内用眼科剪将组织剪碎；
1.3）将剪碎的脂肪组织转移至50 mL无菌离心管中，加入等体积0.2% Ⅱ型胶原酶消化1 h，消化反应在37℃恒温摇床上进行，每隔10 min吹打一次，直至组织消化成絮状，消化结束后用等体积完全培养基终止消化；所述的完全培养基为DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗；
1.4） 将消化好的组织悬液依次用无菌纱布、无菌150目尼龙网以及无菌200目尼龙网过滤，收集滤液于1200 rpm，室温离心5 min弃上清，加入完全培养基重悬细胞；
1.5） 细胞计数后，以l×l06个细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，加入5 mL完全培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养；
1.6）培养6 h后进行半换液，随后继续培养1天，根据细胞密度进行传代。
所述的2）脂质体法瞬时超表达FTO基因，构建FTO基因修饰的猪脂肪干细胞：
2.1）转染前12 h将pADSCs按l × l05密度铺入12孔板，至转染时细胞密度达70％；
2.2）用100 μL Opti-MEM培养基稀释4 μL Lipofectamine 2000转染试剂，同时用100 μL Opti-MEM培养基稀释1 μg FTO超表达质粒，所述的FTO超表达质粒为FTO基因全长序列和PCDNA3.1载体的重组产物；
将稀释好的超表达质粒加入稀释好的转染试剂中，轻轻吹打混匀，室温静置5min；
2.3） 吸弃12孔板中旧的细胞培养基，无菌PBS洗2次后，加入800 μL新的无抗培养基，即DMEM培养基+10%胎牛血清；
2.4） 将步骤2.2）孵育好的Lipfectamine 2000和超表达质粒复合物小心加入培养板中，边加边轻轻晃动，转染完成后置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养；
2.5）转染4-6小时后，吸弃12孔板中细胞培养基和转染试剂，用无菌含1%双抗PBS冲洗2次后更换为l mL完全培养基，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
一种采用所述的方法构建得到的FTO基因修饰的猪脂肪干细胞， pADSCs超表达FTO增加了细胞周期蛋白CDK2和CDK4蛋白表达；促进细胞周期G1期向S期过渡；增加成脂分化关键基因PPARγ、FABP4和C/EBPα的mRNA表达水平。
一种采用所述的FTO基因修饰的猪脂肪干细胞制备组织工程皮肤的方法， 1）采用Ⅰ型胶原蛋白用0.01 M醋酸溶液制备8 mg/mL胶原悬液，将胶原悬液注入24孔细胞培养板中，-80℃冷冻2 h，冻干机中冷冻干燥48 h制备胶原海绵支架；
2）将超表达FTO的猪脂肪干细胞用胰酶消化制备成细胞悬液；以1×106个细胞数量接种于胶原海绵支架上，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养3天制备组织工程皮肤。
本发明的有益效果：相比于在临床中应用病毒载体改造细胞功能的方法，本发明所采用的瞬时超表达技术为非基因组整合型方法，无需病毒载体即可进行转移，从而消除了病毒载体带来感染风险并降低载体生产成本。此外，利用该方法构建的FTO增强型脂肪干细胞，具有增殖速度快且分化能力强等特点，将该种子细胞接种在胶原海绵支架中制备组织工程皮肤，可减轻创伤部位炎症反应，促进创伤部位表皮和真皮形成，增强血管生成以及胶原沉积，并加速创伤愈合速率。本发明利用FTO基因修饰猪脂肪干细胞进行皮肤损伤修复的新技术，通过基因修饰猪脂肪干细胞可改善猪脂肪干细胞功能，从而增强其临床治疗效果具有非常广泛的应用前景。另外，组织工程皮肤还具有多种产业及研究用途。
附图说明
图1是 pADSCs的分离与鉴定；
其中各部分如下：（A）pADSCs培养3天光镜照片（40×）；（B）ORO染色结果（NM：未诱导组，AIM：成脂诱导组）；（C）成脂标志基因mRNA表达量qPCR检测结果。
图2是FTO对pADSCs增殖和分化的影响；
其中各部分如下：（A）western blot检测结果；（B）流式分析和定量结果；（C）ORO染色结果；（D）成脂分化关键基因qPCR结果。
图3是“pADSCs-FTO-胶原海绵支架”组织工程皮肤构建；
其中各部分如下：（A）胶原海绵支架普通视野图和扫描电镜图（500 ×和2000×）；（B）pADSCs复合胶原海绵支架培养普通视野图和DAPI染色图（40 ×）；（C）pADSCs复合胶原海绵支架培养扫描电影图（500 ×和2000 ×）；（D）细胞增殖速率。
图4是皮肤割伤模型构建图。
图5是“FEO-pADSCs-胶原海绵支架”组织工程皮肤对创伤修复的影响；
其中各部分如下：（A）第0、7、14和21创面修复结果。（B）移植后第0、7、14、21天Ctl、CSS、CSS/normal-pADSCs和CSS/OE-FTO-pADSCs组创面大小的统计分析。(C）移植后第7天和第14天对Ctl、CSS、CSS/ normal-pADSCs和CSS/OE-FTO-pADSCs伤口切片进行H&E染色染色结果。（D）IL1α和IL6的qPCR分析（E） 移植后第21天对Ctl、CSS、CSS/normal-pADSCs和CSS/OE-FTO-pADSCs伤口切片进行H&E染色。（F）移植后第21天Ctl、CSS、CSS/normal-pADSCs和CSS/OE-FTO-pADSCs胶原沉积分析。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
（一）猪脂肪干细胞分离和鉴定
1. 选取3日龄仔猪, 按10 mg/kg体重颈部注射舒泰50麻醉剂麻醉，人道处死后用新洁尔灭和75％酒精全身消毒；
2. 在无菌操作环境下，采集仔猪颈、肩胛、背部脂肪组织，用含5%双抗（青霉素/链霉素）的PBS（磷酸缓冲盐溶液）冲洗三次，转移至无菌培养皿中，在超净工作台内用眼科剪将组织剪碎；
3. 将剪碎的脂肪组织转移至50 mL无菌离心管中，加入等体积0.2% （w/v） Ⅱ型胶原酶消化1 h，消化反应在37℃恒温摇床上进行，约每隔10 min吹打一次，直至组织消化成絮状。消化结束后用等体积完全培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗）终止消化；
4. 将消化好的组织悬液依次用无菌纱布、无菌150目尼龙网以及无菌200目尼龙网过滤，收集滤液于1200 rpm，室温离心5 min弃上清，加入完全培养基重悬细胞；
5. 细胞计数，以l×l06个细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，加入5 mL完全培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养；
6. 培养6 h后进行半换液，随后继续培养1天，根据细胞密度进行传代；
7. 取pADSCs铺板，待细胞完全接触后换新鲜完全培养基，记为第-2天（D-2）；继续培养48h后，更换MDI诱导培养基（insulin：5 μg/mL、Dex：l μM、IMBX：50 mM），记为第0天（D0）；诱导2天后更换Insulin诱导培养基（insulin：5 μg/m）继续诱导2天，此后每隔两天更换一次Insulin诱导液，至第10天左右，进行油红O染色及成脂相关基因表达检测；
8. 实时荧光定量PCR（qPCR）：在StepOneTMPlus实时荧光定量PCR仪中进行，反应体系为10μL：5 μL SYBR染料、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、4 μL cDNA；反应条件为a．95℃预变性2 min；b．95℃变性10 s，60℃退火和延伸采集荧光信号30 s，共40个循环；c．溶解曲线分析，60℃升至95℃，15 s；60℃持续l min；95℃持续15 s，自动采集荧光；
成脂标志基因引物为：
GAPDH-F：ACACTCACTCTTCTACCTTTG
GAPDH-R：GAAATTCATTGTCGTACCAG
PPARγ-F：TGGGTGAAACTCTGGGAGATTC
PPARγ-R：TGGGTGAAACTCTGGGAGATTC
C/EBPα-F：GGTTTCGGGTCGCTGGATCTCTAG
C/EBPα-R：ACGGCCTGACTCCCTCATCTTAGAC
FABP4-F：GACGACAGGAAGGTGAAGAG
FABP4-R：ACATTCCACCACCAGCTTGT
9. 油红O（ORO）染色：弃去细胞培养液，用无菌PBS洗3次，加入10％甲醛溶液，室温下固定l h，弃去固定液，用60％异丙醇洗2次，通风橱内晾干；加入油红O溶液室温下染色30min，弃去染色液，用无菌PBS洗去未着色的染色液，倒置显微镜下观察染色情况。
10. 分离得到的 pADSCs在培养3天后，细胞呈纺锤形态（图1A），并能正常增殖。pADSCs细胞经成脂诱导分化后，提取RNA样品检测成脂标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），脂肪酸结合蛋白4（FABP4）和CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）的mRNA表达，并通过ORO染色鉴定成脂效果。结果表明，与未经诱导的pADSCs相比，pADSCs经成脂诱导后，PPARγ、FABP4和C/EBPα的mRNA水平显著增加（图1 B）。ORO染色可见成熟脂滴（图1 C）。
（二）瞬时超表达FTO基因，构建FTO基因修饰的猪脂肪干细胞
1. 转染前12 h将pADSCs按l x l05密度铺入12孔板，至转染时细胞密度达70％左右；
2. 用100 μL Opti-MEM培养基稀释4 μL Lipofectamine 2000转染试剂，同时用100 μL Opti-MEM培养基稀释1 μg FTO超表达质粒，将稀释好的质粒加入稀释好的转染试剂中，轻轻吹打混匀，室温静置5 min。所述的FTO超表达质粒构建如下：1）FTO基因序列获取：Trizol法提取猪脂肪组织总RNA进行反转录获得cDNA，并经PCR扩增获取FTO基因全长序列；2）质粒构建：利用XbaI和EcoRI酶切PCDNA3.1载体和FTO基因PCR产物，并进行无缝重组反应；3）将上述重组产物进行转化，PCR检测转化子，挑取阳性克隆菌落，并抽提获取FTO超表达质粒。
3. 吸弃12孔板中旧的细胞培养基，无菌PBS洗2次后，加入800 μL新的无抗培养基；
4. 将孵育好的Lipfectamine 2000和超表达质粒复合物小心加入培养板中，边加边轻轻晃动，转染完成后置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养；
5. 转染4-6小时后，吸弃12孔板中细胞培养基和转染试剂，用无菌PBS（含1%双抗）冲洗2次后更换为l mL完全培养基，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养；
6. 转染48小时后收集蛋白样品，通过Western Blot检测FTO超表达效果。
7. 流式技术检测细胞周期：将细胞用胰酶消化，1000 g离心5 min后用预冷的70％乙醇重悬细胞，-20℃固定过夜。取固定好的细胞，1000 g离心5 min去除乙醇，用PBS洗涤并离心重新沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于0.5 mL FxCycleTM PI/RNase溶液中，避光室温下孵育15分钟，然后用流式细胞仪器进行上机分析。下机结果用ModFit LT 5.0软件（Becton Dickinson）进行细胞周期分析；
8. qPCR检测成脂基因表达和油红O（ORO）染色方法同步骤（一）。
9. 结果显示，FTO超表达效率显著（图2 A）；与对照组相比，pADSCs超表达FTO可增加细胞周期蛋白CDK2和CDK4蛋白表达（图2 A）。流式分析结果表明，与对照组相比，pADSCs超表达FTO可促进细胞周期G1期向S期过渡（P < 0.05），加速细胞周期进程（图2 B）。ORO染色结果表明，与对照组相比，pADSCs超表达FTO可促进脂滴形成（图2 C）；荧光定量PCR结果表明，与对照组相比，pADSCs超表达FTO可显著增加成脂分化关键基因PPARγ、FABP4和C/EBPα的mRNA表达水平（P < 0.05）（图2 D）。
（三）胶原海绵支架制备
1. 采用Ⅰ型胶原蛋白用0.01 M醋酸溶液制备8 mg/mL胶原悬液。将胶原悬液注入24孔细胞培养板中，-80℃冷冻2 h，冻干机中冷冻干燥48 h制备胶原海绵支架，并扫描电镜进行表征。胶原海绵支架灭菌方法为：70%乙醇中浸泡4 h，然后用PBS洗涤3次，紫外照射灭菌2 h。
2. 胶原海绵支架制备扫描电镜表征
固定：将“猪脂肪干细胞-FTO-胶原海绵支架”组织工程皮肤用2.5％的戊二醛4℃固定过夜；倒掉固定液，用0.0lM、pH7．0的PBS缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；在通风橱中加入l％的锇酸固定样品60 min；小心取出锇酸废液，用PBS漂洗样品3次，每次15 min。脱水：分别用30％、50％、70％、80％、90％和95％的乙醇溶液对样品进行梯度脱水处理，每种浓度处理15 rain；再用100％的乙醇处理两次样品，每次20 min。干燥及观察：在HitachiHCP-2型临界点干燥仪中进行干燥；处理好的样品进行镀膜，在HitachiSU-8010型扫描电镜下观察胶原海绵支架结构以及猪脂肪干细胞在胶原海绵支架中的生长情况，选择合适视野拍照。
3. 胶原海绵支架对猪脂肪干细胞的毒性检测
3.1）将胶原海绵支架（CSS）浸泡在含有1%双抗和10％FBS的全培养基中24小时，将胶原海绵支架浸提液用于细胞培养检测胶原支架对猪脂肪干细胞的毒性。具体步骤如下：a. 将100 μL密度为5×104个/mL的pADSCs悬浮液接种到96孔细胞培养板中，培养24小时使细胞贴壁；b. 将细胞培养基替换为100 μL正常培养基或胶原海绵支架浸液并加入10 μLCCK-8试剂（意不要产生气泡）；c. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度；d. 根据吸光值计算胶原海绵支架浸提液对细胞的毒性。
3.2）利用冷冻干燥法制备胶原海绵支架，通过扫电镜表征，发现制备得到的胶原海绵支架呈现多孔性质（图3 A）。将细胞复合胶原海绵支架培养3天后进行DAPI染色，结果发现细胞核形态正常，被深染成蓝色（图3 B），表明细胞可在胶原海绵支架中正常生长。扫描电镜观察细胞接种在胶原海绵支架中培养3天后的细胞状态，结果发现pADSCs可较好的附着在胶原海绵支架孔隙中（图3 C）。细胞增殖实验结果表明，与正常培养基相比，胶原海绵支架浸提液对细胞增殖速率无显著影响（图3 D）。
（四）利用FTO基因修饰的猪脂肪干细胞和胶原海绵支架制备组织工程皮肤
将超表达FTO的pADSCs用胰酶消化制备成细胞悬液；以1×106个细胞数量接种于胶原海绵支架上，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养3天制备“猪脂肪干细胞-FTO-胶原海绵支架”组织工程皮肤。
（五）猪割伤模型构建
选取32日龄杜长大三元杂交仔猪，手术前禁食12 h，按10 mg/kg体重颈部注射舒泰50麻醉剂麻醉。用不锈钢环钻（直径16 mm）在仔猪背部脊柱两侧对称制备8个直径为16mm的圆形创面。配合手术剪和手术刀除去圆形创面部位的表皮和真皮组织，制备全层皮肤缺损模型。所有伤口均用碘伏消毒，用无菌凡士林纱布、普通纱布和海绵垫覆盖，包扎后，用弹力绷带固定。
（六）将组织工程皮肤移植到猪割伤模型中检测皮肤损伤修复作用。
1. 试验供选用8头32日龄杜长大三元杂交仔猪，每头猪制备8个创口，分为4组：对照组（Ctl）、胶原海绵支架组（CSS）、pADSCS复合胶原海绵支架组（CSS/pADSCs）以及pADSCS超表达FTO并复合胶原海绵支架组（CSS/OE-FTO-pADSCs），每组2个重复，合计每组共16个重复。
2. 皮肤组织切片、H&E染色和Masson染色
组织固定：取仔猪背部皮肤组织浸没于4％多聚甲醛溶液中，固定24 h以上；用0.01 M PBS缓冲液浸润漂洗样品后放置于脱水盒中；脱水：分别用75％、85％、95％、100％的乙醇溶液对组织样品进行梯度脱水；透明：依次用二甲苯浸渍样品2次，每次15 min；浸蜡与包埋：石蜡处理3次，每次60 min，用包埋机将石蜡中的皮肤组织进行包埋；切片：修整蜡块，使用切片机将蜡块切片，展平置于载玻片上，在60℃烘箱内烤片；H&E染色：苏木精染色10 min，伊红染色1 min，脱水封片；Masson染色：Masson 丽春红酸性复红液处理5-10 min，苯胺蓝染5 min，脱水封片；在显微镜下观察皮肤切片，选择合适的视野利用Leica相机自带软件ImagePlusPro 6.0进行观察和拍照，记录数据用于统计分析。
3. qPCR检测成脂基因表达和油红O（ORO）染色方法同步骤（一）。
炎症相关基因引物为：
18s-F：CCCACGGAATCGAGAAAGAG
18s-R：TTGACGGAAGGGCACCA
IL1-A-F：CAGCCAGCACAGAAGTGAAGA
IL1-A-R：AATTTATCCATGCCGTCCCC
IL6-F：TGGCTACTGCCTТCCCTACC
IL6-R：CAGAGATTTTGCCGAGGATG
4. 观察记录21天创伤愈合情况（图5 A），统计分析创伤愈合速率，结果表明，移植后第7，14和21天，与对照组、CSS组和CSS/pADSCs组相比，CSS/OE-FTO-pADSCs组创伤愈合速率均显著提高（P < 0.05），愈合率提高了约15%（图5 B）。观察创伤部位组皮H&E染色结果发现，移植后第7天，对照组、CSS组、CSS/ pADSCs组和CSS/OE-FTO-pADSCs组损伤部位均产生了不同程度的慢性炎症，伴有淋巴细胞和巨噬细胞等炎症细胞浸润，与第7天相比，移植后第14天，对照组、CSS组、CSS/ pADSCs组和CSS/OE-FTO-pADSCs组损伤部位炎症细胞浸润程度减轻，且出现新生毛细血管和中小血管（图5 C）。实时荧光定量PCR结果表明，移植后第7天和14天，与对照组和CSS组相比，CSS/OE-FTO-pADSCs组创伤部位促炎基因IL-1a和IL6的mRNA水平均显著降低（图5 D）。移植后第21天观察表皮与真皮修复情况，结果显示，与对照组、CSS组和CSS/pADSCs组相比，CSS/OE-FTO-pADSCs组创伤部位真皮乳头层形成完整，且表皮厚度显著增加（图5 E）。移植后第21天，取创伤部位皮肤组织进行Masson染色，结果表明，与对照组、CSS组和CSS/pADSCs组相比，CSS/OE-FTO-pADSCs组胶原沉积量显著增加（图5F）。以上结果表明，利用“FEO-pADSCs-胶原海绵支架”组织工程皮肤进行创伤治疗，可减轻创伤部位炎症反应，改善创伤部位表皮和真皮形成，促进血管生成以及胶原沉积，并加速创伤愈合速率，改善了创伤愈合效果。
对于本领域的普通技术人员来说，组织工程皮肤的其它应用还包括：模拟人或者猪的皮肤，用于化妆品、药物等的测试，还可以用于作为仿真机器人的皮肤等。
上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (5)

1.一种FTO基因修饰的猪脂肪干细胞的构建方法，其特征是，步骤包括：
1）猪脂肪干细胞（pADSCs）分离；
2）脂质体法瞬时超表达FTO基因，构建FTO基因修饰的猪脂肪干细胞。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是，所述的1）猪脂肪干细胞分离：
1.1）选取3日龄仔猪, 按10 mg/kg体重颈部注射麻醉剂麻醉，人道处死后用新洁尔灭和75％酒精全身消毒；
1.2）在无菌操作环境下，采集仔猪颈、肩胛、背部脂肪组织，用含5%青霉素/链霉素双抗的PBS（磷酸缓冲盐溶液）冲洗三次，转移至无菌培养皿中，在超净工作台内用眼科剪将组织剪碎；
1.3）将剪碎的脂肪组织转移至50 mL无菌离心管中，加入等体积0.2% Ⅱ型胶原酶消化1 h，消化反应在37℃恒温摇床上进行，每隔10 min吹打一次，直至组织消化成絮状，消化结束后用等体积完全培养基终止消化；所述的完全培养基为DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗；
1.4） 将消化好的组织悬液依次用无菌纱布、无菌150目尼龙网以及无菌200目尼龙网过滤，收集滤液于1200 rpm，室温离心5 min弃上清，加入完全培养基重悬细胞；
1.5） 细胞计数后，以l×l06个细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，加入5 mL完全培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养；
1.6）培养6 h后进行半换液，随后继续培养1天，根据细胞密度进行传代。
3.如权利要求1或者２所述的构建方法，其特征是，所述的2）脂质体法瞬时超表达FTO基因，构建FTO基因修饰的猪脂肪干细胞：
2.1）转染前12 h将pADSCs按l × l05密度铺入12孔板，至转染时细胞密度达70％；
2.2）用100 μL Opti-MEM培养基稀释4 μL Lipofectamine 2000转染试剂，同时用100μL Opti-MEM培养基稀释1 μg FTO超表达质粒，所述的FTO超表达质粒为FTO基因全长序列和PCDNA3.1载体的重组产物；
将稀释好的超表达质粒加入稀释好的转染试剂中，轻轻吹打混匀，室温静置5 min；
2.3） 吸弃12孔板中旧的细胞培养基，无菌PBS洗2次后，加入800 μL新的无抗培养基，即DMEM培养基+10%胎牛血清；
2.4） 将步骤2.2）孵育好的Lipfectamine 2000和超表达质粒复合物小心加入培养板中，边加边轻轻晃动，转染完成后置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养；
2.5）转染4-6小时后，吸弃12孔板中细胞培养基和转染试剂，用无菌含1%双抗PBS冲洗2次后更换为l mL完全培养基，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
4.一种采用如权利要求1所述的方法构建得到的FTO基因修饰的猪脂肪干细胞，其特征是，pADSCs超表达FTO增加了细胞周期蛋白CDK2和CDK4蛋白表达；促进细胞周期G1期向S期过渡；增加成脂分化关键基因PPARγ、FABP4和C/EBPα的mRNA表达水平。
5.一种采用如权利要求3所述的FTO基因修饰的猪脂肪干细胞制备组织工程皮肤的方法，其特征是，
1）采用Ⅰ型胶原蛋白用0.01 M醋酸溶液制备8 mg/mL胶原悬液，将胶原悬液注入24孔细胞培养板中，-80℃冷冻2 h，冻干机中冷冻干燥48 h制备胶原海绵支架；
2）将超表达FTO的猪脂肪干细胞用胰酶消化制备成细胞悬液；以1×106个细胞数量接种于胶原海绵支架上，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养3天制备组织工程皮肤。
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