CN117625612A - 基于CRISPR-Cas9技术特异性靶向敲除IGF2BP1的sgRNA载体设计及其在肺腺癌应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术特异性靶向敲除IGF2BP1的sgRNA载体设计及其在肺腺癌应用，通过选择自带Cas9蛋白的慢病毒敲除载体，操作简单，慢病毒敲除系统在转染细胞时对细胞毒性小，阳性率高。双sgRNA通过靶向两个位点，比起单靶点的基因敲除方法，能降低脱靶率，提高基因敲除的效率。该sgRNA特异性强，实现了蛋白水平的完全敲除。可以通过本发明来构建不同目的基因的敲除载体，且无种属限制。本发明揭露IGF2BP1在人肺腺癌细胞中可与HNF4α的mRNA结合，并促进其m6A修饰，增加其稳定性，并促进HNF4α蛋白的表达。

Description

基于CRISPR-Cas9技术特异性靶向敲除IGF2BP1的sgRNA载体 设计及其在肺腺癌应用
技术领域
本公开涉及癌症生物研究技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas9技术特异性靶向敲除IGF2BP1的sgRNA载体设计及其在肺腺癌中的应用。
背景技术
CRISPR-Cas9系统是原核生物的一种天然免疫防御系统，经人工改造成为一种靶向特定基因组的基因编辑技术。该技术通过设计特异性sgRNA序列从而在基因特定位点进行切割引起DNA双链断裂，在细胞中通过非同源末端连接的方式对断裂的DNA进行修复，导致发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，从而实现基因的完全敲除。该技术已被广泛应用于各种领域，包括治疗遗传性疾病、农业、再生医学以及基础科学研究。
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，约占肺癌病例的85％，然而肺腺癌作为非小细胞肺癌的主要亚型之一，约占据非小细胞肺癌的55％。目前，肺腺癌的治疗仍然面临许多挑战。我们前期研究表明IGF2BP1是肺腺癌的独立预后因子，在肺腺癌中高表达并导致肺腺癌患者更短的生存时间，其在肺腺癌的发生发展中也具有非常重要的作用。抑制IGF2BP1的表达可以抑制肺腺癌细胞的进展，可能成为治疗肺腺癌的潜在靶点。
有关肺腺癌的研究表明HNF4α(肝细胞核因子4α)可以通过转录激活lncRNA BC200的表达来促进浸润性肺粘液腺癌的生长、侵袭和迁移。HNF4α在肺腺癌中差异表达且高表达能显著抑制肺腺癌患者的总体生存率。但HNF4α在肺腺癌中具体的作用机制尚不清楚。
目前，针对IGF2BP1的靶向抑制，大多采用shRNA或者siRNA进行基因抑制，但该方法的局限性在于：具有高的脱靶率以及无法完全抑制全部基因而造成假阴性结果。而CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除单个或多个基因和不可逆的优势，在基因编辑中得到非常广泛的应用。在某些研究中也用到了CRISPR-Cas9敲除方法，但基本是单靶点敲除IGF2BP1基因的模式，敲除效率比较低，同样具有较高的脱靶率。
发明内容
本申请一方面，提出一种双sgRNA靶向敲除敲除IGF2BP1的sgRNA，包含两对特异性靶向IGF2BP1的sgRNA序列，方向均为5’-3’：
第一对sgRNA序列，包含：
SequenceNO.1所示的第一正义链：IGF2BP2-sgRNA-1；
SequenceNO.2所示的第一反义链：IGF2BP2-sgRNA-2；
第二对sgRNA序列，包含：
SequenceNO.3所示的第二正义链：IGF2BP2-sgRNA-3；
SequenceNO.4所示的第二反义链：IGF2BP2-sgRNA-4。
作为本申请的一可选实施方案，可选地，合成所述第一正义链：IGF2BP2-sgRNA-1所需的两条oligo单链为：
SequenceNO.5和SequenceNO.6所示的oligo单链；
合成所述第一反义链：IGF2BP2-sgRNA-2所需的两条oligo单链为：
SequenceNO.7和SequenceNO.8所示的oligo单链。
作为本申请的一可选实施方案，可选地，合成所述第二正义链：IGF2BP2-sgRNA-3所需的两条oligo单链为：
SequenceNO.9和SequenceNO.10所示的oligo单链；
合成所述第二反义链：IGF2BP2-sgRNA-4所需的两条oligo单链为：
SequenceNO.11和SequenceNO.12所示的oligo单链。
本申请另一方面，提出一种利用所述双sgRNA靶向敲除IGF2BP1的sgRNA构建得到的靶向IGF2BP1敲除的sgRNA慢病毒敲除载体。
本申请另一方面，提出一种IGF2BP1慢病毒敲除载体，采用上述sgRNA慢病毒敲除载体，转化得到。
本申请另一方面，还提出一种所述双sgRNA靶向敲除IGF2BP1的sgRNA，在敲除IGF2BP1中基因中的应用。
本申请另一方面，还提出一种所述双sgRNA靶向敲除IGF2BP1的sgRNA，在构建IGF2BP1蛋白功能丧失的细胞系中的应用。
本申请另一方面，还提出一种经靶向敲除的IGF2BP1，在人肺腺癌敲除细胞系中与HNF4α的m6A结合机制的应用。
本发明的技术效果：
本申请通过提供一种基于CRISPR/Cas9技术特异性靶向敲除IGF2BP1的sgRNA，经慢病毒转染肺腺癌细胞系后获得稳定敲除的肺腺癌细胞株，该细胞株的转移、侵袭、克隆形成能力被显著抑制。通过，RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)和RNA甲基化免疫共沉淀-qPCR(MeRIP-qPCR)证明IGF2BP1在肺腺癌细胞系中能结合HNF4a的mRNA并促进其的表达。该细胞株的HNF4a的mRNA稳定性也显著降低。该发明为抑制IGF2BP1的表达逆转肺腺癌细胞的恶性特征提供了科学依据，为IGF2BP1的功能研究提供了一个工具和方向。比起单靶点的设计，本发明主要通过设计双靶点敲除IGF2BP1基因，具有高效，操作简单，低脱靶率的优势。
根据下面参考附图对示例性实施例的详细说明，本公开的其它特征及方面将变得清楚。
附图说明
附图1为本发明IGF2BP1在不同癌组织中的差异表达分析示意图；
附图2为本发明在IGF2BP1靶序列上设计碱基的示意图；
附图3为本发明LentiCRISPRv2载体酶切示意图；
附图4为本发明sgRNA插入到质粒载体示意图；
附图5为本发明质粒测序示意图；
附图6为本发明IGF2BP1敲除对比示意图；
附图7为本发明CCK-8：敲除IGF2BP1后细胞活力示意图；
附图8为本发明克隆形成，敲除IGF2BP1后克隆形成数示意图；
附图9为本发明敲除IGF2BP1后划痕愈合示意图；
附图10为本发明敲除IGF2BP1后细胞侵袭个数示意图；
附图11为本发明敲除IGF2BP1(KO组)后显著抑制HNF4α的mRNA半衰期示意图；
附图12为本发明Western blot验证IGF2BP1敲除后的两个单克隆的HNF4α的蛋白显著下调的示意图；
附图13为本发明RIP实验示意图；
附图14为本发明MeRIP实验示意图；
如图15为本发明Western blot验证HNF4α蛋白过表达示意图；
如图16为本发明RT-PCR实验HNF4α的mRNA水平过表达示意图；
如图17为本发明划痕实验表明HNF4α过表达示意图；
如图18为本发明CCK-8实验表明HNF4α过表达示意图；
如图19为本发明CCK-8实验表明HNF4α过表达示意图。
具体实施方式
以下将参考附图详细说明本公开的各种示例性实施例、特征和方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好的说明本公开，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本公开同样可以实施。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的、手段、未作详细描述，以便于凸显本公开的主旨。
本发明主要是提供了两对特异性靶向IGF2BP1的sgRNA序列，方向均为5’-3’：
第一对：
IGF2BP2-sgRNA-1：GAGCACAAGATCTCCTACAG(第一正义链，见SequenceNO.1)；
IGF2BP2-sgRNA-2：AGCCGGATTTGACCAAGAAC(第一反义链，见SequenceNO.2)；
对应的需要合成的oligo单链为：
sgRAN1-F:CACCGAGCACAAGATCTCCTACAG(见SequenceNO.5)；
sgRAN1-R:AAACCTGTAGGAGATCTTGTGCTC(见SequenceNO.6)；
sgRAN2-F:CACCGAGCCGGATTTGACCAAGAAC(见SequenceNO.7)；
sgRAN2-R:AAACGTTCTTGGTCAAATCCGGCTC(见SequenceNO.8)。
第二对：
IGF2BP2-sgRNA-3：CAACGAGAGCGTGACCCCCG(第二正义链，见SequenceNO.3)；
IGF2BP2-sgRNA-4：GACCAAGAACTGGCCGCTGT(第二反义链，见SequenceNO.4)；
对应的需要合成的oligo单链为：
sgRAN3-F:CACCGCAACGAGAGCGTGACCCCCG(见SequenceNO.9)；sgRAN3-R:AAACCGGGGGTCACGCTCTCGTTGC(见SequenceNO.10)；sgRAN4-F:CACCGACCAAGAACTGGCCGCTGT(见SequenceNO.11)；
SgRAN4-R:AAACACAGCGGCCAGTTCTTGGTC(见SequenceNO.12)。
本发明还提供了IGF2BP1慢病毒敲除质粒的构建及病毒包装及转染方法,包括质粒载体酶切，酶切载体和双链sgRNA片段连接，感受态细菌的转化及慢病毒包装。
IGF2BP1慢病毒敲除质粒的构建步骤主要有：
(1)sgRNA的设计
通过人工设计sgRNA靶向基因特定位点，由cas9蛋白进行切割使DNA双链断裂，在DNA修复过程中引起基因移码突变最终完成基因敲除的目的。而sgRNA设计中必须确保其特异性。
(2)IGF2BP1慢病毒敲除质粒载体的构建流程
采用双sgRNA靶向敲除的方法，首先将四条sgRNA对应的8条oligo单链进行退火变成双链sgRNA；lentiCRISPRV2慢病毒敲除载体，用BsmBI酶切成线性质粒后，通过与双链sgRNA连接后转化到Stabl3的感受态菌中，经过氨苄青霉素抗性的LB固体培养基筛选后，提取质粒进行测序验证。
LentiCRISPRv2这个慢病毒敲除载体，虽然带有嘌呤霉素筛选标签，但在病毒感染细胞这个过程中，无法得知病毒的感染效率，若带有GFP绿色荧光标签的话，会看到转染效率，并且单克隆筛选的步骤也会更加容易。
因此，本方案可以同时构建含有GFP绿色荧光标签的。
(3)基因敲除细胞系构建
将确认的质粒在293T细胞中经过质粒转染后收集细胞产出的病毒(包含于培养上清中)，进行病毒感染并进一步通过嘌呤霉素筛选阳性细胞群，对这部分细胞进行单克隆筛选及验证。
(4)细胞实验
通过CCK-8,克隆形成，细胞划痕，transwell侵袭实验等实验确认IGF2BP1敲除后对肺腺癌细胞增殖，迁移侵袭的影响。
筛选下游靶基因及验证：将成功构建的细胞(对照细胞和敲除细胞)送去转录组测序，通过RT-PCR验证筛选可能的下游靶点，并通过RIP和MeRIP-qPCR验证结合机制。
下面将具体进行描述。
实施例1：IGF2BP1在肺腺癌组织中的差异表达分析
肺腺癌组织微阵列(TMA,LUC1601，上海卓灏医药科技有限公司)，包括80对癌旁和肺腺癌肿瘤组织，通过免疫组化实验分析IGF2PB1在肿瘤和癌旁组织中的蛋白表达水平(IGF2BP1抗体，Abcam，ab184305)。Aperio ImageScope软件用于分析免疫组织化学强度。根据80个患者的生存随访数据和IGF2BP1的免疫组化强度通过Kaplan-Meier生存曲线分析肿瘤组织IGF2BP1的表达对患者预后的影响。
如图1所示，结果表明与癌旁组织(normal)相比，肺腺癌肿瘤组织(tumor)的IGF2BP1蛋白表达水平(expression)显著提高。
此外，高表达IGF2BP1的患者总体生存时间(OS)显著降低。
实施例2：sgRNA的设计
根据NCBI网页中提供的人的IGF2BP1基因序列，设计两对sgRNA(对应的DNA序列如sgRNA1-4所示)；该sgRNA序列都靶定在其第一外显子区域上，通过BLAST验证确保其靶向的唯一性。
本设计的一对sgRNA中，一条为正义链上的位点，一条为反义链上的位点，都是以5＇-3＇方向。
如附图2所示，将设计的靶序列IGF2BP1靶序列上游引物5＇端添加CACC，下游引物5＇端添加AAAC，这样退火后形成的双链DNA粘性末端与LentiCRISPRV2载体经BsmBI酶切后形成的粘性末端互补，便于后期载体的构建连接。值得注意的是，靶序列的第一位碱基需为G，便于载体上U6启动子识别，如果靶序列的第一位碱基不是G,则需要加上G,即为上游引物5’端为CACCG,下游引物5’端为AAAC,且3’端加C。
将两条sgRNA共转染到一个细胞系中，提高基因被完全敲除的效率。
实施例3：构建IGF2BP1慢病毒敲除载体(LentiCRISPRv2)
(1)oligo退火形成双链(duplex)
将设计的sgRNA片段送去公司合成，粉末状的sgRNA片段用无酶水溶解为100μM，将sgRNA单链进行变性、退火操作，退火后的单链即变成双链进行后续载体连接。
具体见下表1的配比：
表1
退火操作步骤：
PCR仪95℃5min，缓慢降温至室温1h后，1：200稀释
(2)质粒酶切步骤：加入以下表2的试剂，用BsmBI酶将环状质粒酶切为含有粘性末端的线性质粒，并进行胶回收。如图3所示，LentiCRISPRv2载体在BsmB1酶切后两条片段显示。
表2
(3)胶回收约11kb大片段，用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)。
质粒与双链sgRNA片段连接，如表3：
表3
室温连接4-6小时。将连接产物转化到100μL的stabl3感受态细胞中，涂布相应抗性抗生素平板，37℃培养过夜。挑取单菌落用通用U6引物测序验证阳性克隆。U6：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA
挑取阳性克隆37℃摇菌并过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，并进一步测序验证。结果如图4所示，显示四条sgRNA均已成功插入到质粒载体中。
实施例4：病毒包装及感染
如图5所示，提取的质粒测序验证sgRNA已插入到载体中，用转染试剂lipofectamine3000在293T细胞中进行质粒转染。敲除组转染构建好的质粒，对照组转染空白质粒。具体操作步骤如下：
(1)将293T细胞复苏并在DMEM完全培养基中培养过夜。
(2)待细胞密度90％后以1：3传代两次后，将细胞铺至6孔板中铺板密度20％左右，培养过夜后至细胞密度汇集到60％左右，按说明书加相应的试剂及质粒，培养基换成无青链霉素的培养基。
(3)质粒转染12小时后换成完全培养基，48小时后收集上清。1000g，离心3分钟弃去细胞碎片后，将收集的病毒液分装冻存至-80℃。
(4)病毒感染：将sgRNA1和sgRNA2作为一组，sgRNA3和sgRNA4作为一组，病毒液各取50μL感染肺腺癌A549细胞，24h后换液，加入嘌呤霉素2μg/ml筛选细胞株，持续到空白对照的细胞全部死亡，大概需要3-4天时间。对照组加入空白的病毒液。
实施例5：筛选稳转单克隆敲除细胞株
通过上述方法，筛选到的混合克隆细胞株，取一半扩大培养提蛋白做westernblot实验验证敲除效率高的一组，敲除效率高的一组将后续进行单克隆筛选。具体步骤为取10个左右细胞接种到一个10cm盘中，细胞贴壁后标记单个细胞，待细胞克隆团长到一定数量，取20μl胰酶滴到该克隆团下，消化后吸取克隆细胞团并进一步扩大培养。最终验证两个单克隆细胞团。
实施例6：IGF2BP1蛋白敲除验证(结合对照组进行验证描述)
将肺癌细胞A549的对照组细胞(control)和IGF2BP1两个单克隆的敲除组细胞(KO#1和KO#2)培养在6cm皿中，待细胞满盘后加入300μL裂解液冰上裂解。室温下超声处理后，加入5×loading buffer(碧云天)，100℃中放置10min将蛋白煮沸变性，在SDS-PAGE胶中，每孔上样20μL。电泳后转膜将蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后用5％脱脂奶粉封闭1小时，用PBST洗膜三次，将稀释后的一抗与膜4℃过夜。用PBST洗涤三次每次10分钟后,将稀释后的二抗与膜室温杂交1小时，用PBST洗膜三次，取出膜加入ECL显影液曝光。
如图6所示，Western blot实验表明，和对照组相比，IGF2BP1两个单克隆的敲除组显示无条带。表明IGF2BP1已完全敲除成功。
实施例7：IGF2BP1细胞功能实验(CCK-8,克隆形成，划痕，侵袭)
CCK-8的检测方法为：设置空白组，对照组，实验组，将对照组细胞和IGF2BP1敲除组细胞用胰酶消化后，每孔3000个细胞铺至96孔板中，每隔24小时，每孔加入10μL的CCK8试剂，继续在培养箱中孵育2h后，用酶标仪检测OD450值。如图7所示，CCK-8：敲除IGF2BP1后细胞活力显著抑制。
克隆形成实验检测方法：设置IGF2BP1敲除组和对照组，细胞用胰酶消化后以每孔500个细胞铺至6孔板中，两天换一次新鲜培养基，培养7-10天后，待细胞克隆团超过50个细胞，用4％多聚甲醛固定细胞30min，弃去液体后加0.5％的结晶紫染液每孔1ml染色30min后，用流水冲洗，待晾干后拍照记录实验结果。如图8所示：克隆形成，敲除IGF2BP1后克隆形成数显著减少。
细胞划痕实验方法：IGF2BP1敲除细胞组和对照组细胞以每孔106个细胞每孔铺至6孔板中，待细胞密度100％时，用200μL的黄色枪头竖直划一道划痕，用PBS冲洗漂浮及死去的细胞后，用含2％血清的完全培养基培养48h后，在显微镜下拍照记录。如图9所示，敲除IGF2BP1后划痕愈合显著抑制。
Transwell细胞侵袭实验：将BD Matrigel在冰上4度冰箱过夜融化后，用无血清培养基以1：8的比例稀释基质胶后，小心的铺至上室中，进而放到培养箱中等待3h后，弃去基质胶，在每孔中加入100μL无血清培养基后，于培养箱放置30min，水化基质膜。处理对照组和IGF2BP1敲除组细胞，用无血清培养基重悬后，在上室中加入用2×105/ml细胞悬液100μL，下室为600μL含10％血清的完全培养基，避免上室与下室之间产生气泡，放细胞培养箱中孵育24h后，弃掉上室中培养基，用棉签擦干净上室中的细胞和基质胶，在干净的孔中加入4％多聚甲醛固定细胞30min后，弃掉固定液后加入0.5％的结晶紫染液继续染色30min后显微镜下拍照记录。如图10所示，敲除IGF2BP1后细胞侵袭个数显著减少。
实施例8：RNA稳定性实验
取对数生长期细胞，胰酶消化后铺至6孔板中，待细胞密度汇合至80％左右时，加入新鲜配置的mRNA转录抑制剂放线菌素D(Act(D))(5μg/ml)，分别于0h，2h，4h和6h提RNA进行RT-qPCR实验。如图11所示，与对照组(NC)相比，敲除IGF2BP1(KO组)后显著抑制HNF4α的mRNA半衰期。
实施例9：下游基因验证
将对照组和IGF2BP1敲除组的细胞做转录组测序后，进一步通过RT-PCR和WB验证。由于IGF2BP1作为m6A结合蛋白，通过结合下游靶基因的m6A位点并以m6A依赖的方式促进靶基因的稳定性。RIP(广州吉赛生物)和MeRIP-qPCR(锐博生物)实验结果进一步证明IGF2BP1与HNF4α的m6A位点结合。具体实验步骤参考试剂盒操作说明书。RIP实验用于研究感兴趣的蛋白质可能结合的RNA，利用该蛋白的特异性抗体来捕获样本中的目标蛋白，则与该蛋白结合的RNA也一并捕获下来，通过洗脱后将蛋白和RNA分离后，进一步通过RT-PCR检测可能结合的RNA。IP组作为实验组，IgG组作为阴性对照组。MeRIP-qPCR实验则用于研究的目标RNA中的m6A修饰水平，通过设置IGF2BP1对照组(NC)和敲除组(KO)可进一步研究IGF2BP1对目标RNA的m6A修饰水平的调控。具体是将RNA片段化后用抗m6A抗体捕获具有m6A修饰的RNA片段，并设计基因上发生修饰位点区域的引物通过RT-qPCR来定量m6A修饰水平。
如图12所示：Western blot验证IGF2BP1敲除后的两个单克隆(KO#1和KO#2)的HNF4α的蛋白显著下调
如图13所示：RIP实验，IGF2BP1蛋白与HNF4αmRNA结合。
如图14所示：MeRIP实验，IGF2BP1蛋白参与调控HNF4αmRNA上的m6A位点。敲除IGF2BP1后，HNF4α上的m6A水平显著下调。
实施例10：过表达HNF4α的功能表型实验验证
在IGF2BP1敲除的和亲本的A549细胞株中分别转染HNF4α对照病毒液(NC组)和HNF4α过表达(HNF4α-OE)病毒液；经过G418抗生素筛选后收取细胞并提蛋白及提RNA做相应的Western blot和RT-PCR实验验证。提RNA实验步骤依据trizol法手工抽提说明书。反转录为cDNA(赛默飞)并进行RT-PCR检测(SYBR染料法)。
如图15所示：Western blot验证HNF4α蛋白过表达成功。
如图16所示：RT-PCR实验HNF4α的mRNA水平过表达成功。
如图17所示：划痕实验表明HNF4α过表达显著促进细胞迁移。
如图18所示：CCK-8实验表明HNF4α过表达显著促进细胞增殖。
如图19所示：CCK-8实验表明HNF4α过表达可以减弱IGF2BP1对细胞活力的抑制作用。
以上已经描述了本公开的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (8)

1.一种双sgRNA靶向敲除方式敲除IGF2BP1的sgRNA，其特征在于，包含两对特异性靶向IGF2BP1的sgRNA序列，方向均为5’-3’：
第一对sgRNA序列，包含：
SequenceNO.1所示的第一正义链：IGF2BP2-sgRNA-1；
SequenceNO.2所示的第一反义链：IGF2BP2-sgRNA-2；
第二对sgRNA序列，包含：
SequenceNO.3所示的第二正义链：IGF2BP2-sgRNA-3；
SequenceNO.4所示的第二反义链：IGF2BP2-sgRNA-4。
2.根据权利要求1所述的一种双sgRNA靶向敲除方式敲除IGF2BP1的sgRNA，其特征在于，合成所述第一正义链：IGF2BP2-sgRNA-1所需的两条寡核苷酸(oligo)单链为：
SequenceNO.5和SequenceNO.6所示的oligo单链；
合成所述第一反义链：IGF2BP2-sgRNA-2所需的两条oligo单链为：
SequenceNO.7和SequenceNO.8所示的oligo单链。
3.根据权利要求1所述的一种双sgRNA靶向敲除方式敲除IGF2BP1的sgRNA，其特征在于，合成所述第二正义链：IGF2BP2-sgRNA-3所需的两条oligo单链为：
SequenceNO.9和SequenceNO.10所示的oligo单链；
合成所述第二反义链：IGF2BP2-sgRNA-4所需的两条oligo单链为：
SequenceNO.11和SequenceNO.12所示的oligo单链。
4.一种利用权利要求1所述双sgRNA靶向敲除技术敲除IGF2BP1的sgRNA构建得到的靶向IGF2BP1敲除的sgRNA慢病毒敲除载体。
5.一种IGF2BP1慢病毒敲除载体，采用权利要求4所述sgRNA慢病毒敲除载体，转化得到。
6.一种权利要求1所述双sgRNA靶向敲除IGF2BP1的sgRNA，在敲除IGF2BP1中基因中的应用。
7.一种权利要求1所述双sgRNA靶向敲除IGF2BP1的sgRNA，在构建IGF2BP1蛋白功能丧失的细胞系中的应用。
8.一种经靶向敲除的IGF2BP1，在人肺腺癌敲除细胞系中与HNF4α的m6A结合机制的应用。
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