ES2752175T3

ES2752175T3 - Método de modificación de la secuencia genómica para convertir específicamente bases de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana, y complejo molecular para su uso en el mismo

Info

Publication number: ES2752175T3
Application number: ES15758734T
Authority: ES
Inventors: Keiji Nishida; Akihiko Kondo; Satomi Kojima
Original assignee: Kobe University NUC
Current assignee: Kobe University NUC
Priority date: 2014-03-05
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2035-03-04
Also published as: CN111471674A; JP2020167998A; JP2018019705A; PT3115457T; US11718846B2; EP3115457A4; JP6462069B2; CA2947941C; US20170073670A1; JP2022191368A; DK3115457T3; CN106459957A; EP3115457B1; CN111500570A; EP3613854A1; US20200248174A1; JPWO2015133554A1; JP6206893B2; CN111471675A; US20200208138A1

Abstract

Método de modificación de un sitio seleccionado como diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo que comprende un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario dado unido a una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, con dicho ADN bicatenario, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en uno o más de otros nucleótidos o delecionar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio seleccionado como diana, en el que el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas, en el que el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas que tiene actividad nickasa capaz de escindir sólo una de las cadenas del ADN bicatenario, en el que el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, y en el que el método no es un método para modificar la identidad genética de línea germinal de seres humanos.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de modificación de la secuencia genómica para convertir específicamente bases de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana, y complejo molecular para su uso en el mismo

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un método de modificación de una secuencia genómica, que permite la modificación de una base de ácido nucleico en una región particular de un genoma, sin escindir el ADN bicatenario (sin escisión o escisión de cadena sencilla), y sin insertar un fragmento de ADN foráneo, y a un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y a una enzima convertidora de bases de ácido nucleico usada para eso.

[Antecedentes de la técnica]

En los últimos años, la edición genómica está atrayendo la atención como una técnica para modificar el gen y la región genómica de interés en diversas especies. De manera convencional, como método de edición genómica, se ha propuesto un método que utiliza una nucleasa artificial que comprende una combinación de una molécula que tiene una capacidad de escisión del ADN independiente de la secuencia y una molécula que tiene una capacidad de reconocimiento de secuencia (documento no de patente 1).

Por ejemplo, se han notificado un método de realización de recombinación en un locus génico diana en el ADN en una célula vegetal o célula de insecto como huésped, usando una nucleasa con dedos de cinc (ZFN) en el que se unen un dominio de unión al ADN con dedos de cinc y un dominio de escisión de ADN no específico (documento de patente 1); un método de escisión o modificación de un gen diana en una secuencia de nucleótidos particular o un sitio adyacente al mismo usando TALEN, en el que un efector similar al activador de transcripción (TAL), que es un módulo de unión al ADN que tiene la bacteria patógena vegetal Xanthomonas, y una endonucleasa de ADN se unen (documento de patente 2); un método que utiliza un sistema CRISPR-Cas9 en el que la secuencia de ADN CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas), que funciona en un sistema inmunitario adquirido poseído por eubacterium y archaebacterium, y la familia de proteínas nucleasa Cas (asociada a CRISPR) que tiene una función importante junto con CRISPR se combinan (documento de patente 3) y similares. Además, también se ha notificado un método de escisión de un gen diana en la proximidad de una secuencia particular, usando nucleasa artificial en el que una proteína PPR configurada para reconocer una secuencia de nucleótidos particular mediante una serie de motivos PPR que consiste cada uno en 35 aminoácidos y que reconoce una base de ácido nucleico, y nucleasa se unen (documento de patente 4).

El documento WO 2010/132092 A2 se refiere a fusiones de citidina desaminasa y a métodos relacionados. El documento US 2011/0104787 A1 se refiere a péptidos de fusión que se unen a y modifican secuencias de ácido nucleico diana.

[Lista de documentos]

[Documentos de patente]

Documento de patente 1: JP-B-4968498

Documento de patente 2: publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2013-513389

Documento de patente 3: publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2010-519929

Documento de patente 4: JP-A-2013-128413

[Documento no de patente]

Documento no de patente 1: Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641

[Sumario de la invención]

[Problemas que van a resolverse mediante la invención]

Las técnicas de edición genómica que se han propuesto hasta ahora presuponen básicamente roturas de ADN bicatenario (DSB). Sin embargo, ya que implican modificaciones genómicas inesperadas, se producen efectos secundarios tales como fuerte citotoxicidad, reordenamiento cromosómico y similares, y tienen problemas comunes de fiabilidad deteriorada en terapia génica, un número sumamente pequeño de células supervivientes mediante modificación de nucleótidos, y dificultad en la propia modificación genética en un óvulo de primate y microorganismos unicelulares.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo método de edición genómica para modificar una base de ácido nucleico de una secuencia particular de un gen sin DSB o la inserción de un fragmento de ADN foráneo, es decir, sin escisión de un ADN bicatenario ni escisión de cadena sencilla, y un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico del mismo. [Medios para resolver los problemas]

La presente invención se define, entre otros, mediante los siguientes puntos:

1. Un método de modificación de un sitio seleccionado como diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo que comprende un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en una ADN bicatenario dado unido a una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, con dicho ADN bicatenario, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en uno o más de otros nucleótidos o delecionar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio seleccionado como diana, en el que el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas, en el que el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas que tiene actividad nickasa capaz de escindir sólo una de las cadenas del ADN bicatenario, en el que el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, y en el que el método no es un método para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.

2. El método según el punto 1, en el que la Cas es una Cas9 en la que el 10° residuo de Asp se convierte en un residuo de Ala o el 840° residuo de His se convierte en un residuo de Ala.

3. El método según el punto 1 ó 2, que usa dos o más clases de módulos de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une cada uno específicamente a una secuencia de nucleótidos diana diferente.

4. El método según el punto 3, en el que las secuencias de nucleótidos diana diferentes están presentes en genes diferentes.

5. El método según uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es una desaminasa, preferiblemente una citidina desaminasa.

6. El método según uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo introduciendo un ácido nucleico que codifica para el complejo en una célula que tiene el ADN bicatenario.

7. El método según el punto 6, en el que la célula es una célula procariota.

8. El método según el punto 6, en el que la célula es una célula microbiana.

9. El método según el punto 6, en el que la célula es una célula eucariota, preferiblemente una célula vegetal, una célula de insecto o una célula animal.

10. El método según el punto 9, en el que la célula animal es una célula de vertebrado, preferiblemente una célula de mamífero.

11. El método según uno cualquiera de los puntos 6 a 10, en el que la célula es una célula poliploide, y se modifican todos los sitios seleccionados como diana en alelos en cromosomas homólogos.

12. El método según uno cualquiera de los puntos 6 a 11, que comprende una etapa de introducir un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para el complejo en una forma que permite el control de un periodo de expresión en la célula, y una etapa de inducir la expresión del ácido nucleico durante un periodo necesario para fijar la modificación del sitio seleccionado como diana en el ADN bicatenario.

13. El método según el punto 12, en el que la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario está presente en un gen esencial para la célula.

14. Un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico que comprende un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario dado unido a una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en el que el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas que tiene actividad nickasa capaz de escindir sólo una de las cadenas del ADN bicatenario, complejo que convierte uno o más nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en uno o más de otros nucleótidos o deleciona uno o más nucleótidos, o inserta uno o más nucleótidos en dicho sitio seleccionado como diana.

15. Un ácido nucleico que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico según el punto 14. Los presentes inventores han realizado intensos estudios en un intento por resolver los problemas mencionados anteriormente y han tomado nota de la adopción de una conversión de bases mediante una reacción de conversión de base de ADN, sin acompañar al DSB. La reacción de conversión de bases mediante una reacción de desaminación de base de ADN ya se conoce; sin embargo, la selección como diana de cualquier sitio reconociendo una secuencia particular de ADN, y específicamente la modificación del ADN seleccionado como diana mediante la conversión de bases de bases de ADN aún no se ha realizado.

Por tanto, se usó desaminasa, que cataliza una reacción de desaminación, como enzima para tal conversión de bases de ácido nucleico, y se unió a una molécula que tenía una capacidad de reconocimiento de secuencia de ADN, de ese modo se modificó una secuencia genómica mediante conversión de bases de ácido nucleico en una región que contiene una secuencia de ADN particular.

Específicamente, se usó el sistema CRISPR-Cas (CRISPR-Cas mutante). Es decir, se produce un ADN que codifica para una molécula de ARN, en el que CRISPR-ARN:ARNcr (ARNg) específico de genoma que contiene una secuencia complementaria a una secuencia diana de un gen que va a modificarse se une a un ARN para reclutar la proteína Cas (ARNcr de transactivación: ARNtracr). Por otro lado, se produjo un ADN en el que un a Dn que codifica para una proteína Cas mutante (dCas), en el que la capacidad de escisión de una o ambas cadenas de un ADN bicatenario se inactivan y un gen de desaminasa se unen. Estos ADN se introdujeron en una célula huésped de levadura que comprende un gen que va a modificarse. Como resultado, pudo introducirse una mutación de manera aleatoria dentro del intervalo de varios cientos de nucleótidos del gen de interés que incluye la secuencia diana. En comparación a cuando se usó proteína Cas doble mutante, que no escinde ambas cadenas de ADN en el ADN bicatenario, la eficiencia de la introducción de la mutación aumentó cuando se usó una proteína Cas mutante que escinde cualquiera de las dos cadenas. Además, se clarificó que el área de la región de mutación y la variedad de mutación varía dependiendo de qué cadena doble del ADN se escinde. Además, pudo introducirse una mutación de manera extremadamente eficaz seleccionando como diana una pluralidad de regiones en el gen de interés. Es decir, se sembró una célula huésped introducida con ADN en un medio no selectivo, y se examinó la secuencia del gen de interés en colonias seleccionadas de manera aleatoria. Como resultado, se confirmó la introducción de mutación en casi todas las colonias. Además, se confirmó que la edición genómica puede realizarse simultáneamente en una pluralidad de sitios seleccionando como diana una determinada región en dos o más genes de interés. Se demostró adicionalmente que el método puede introducir simultáneamente una mutación en alelos de genomas diploides o poliploides, que puede introducir una mutación no sólo en células eucariotas sino también células procariotas tales como Escherichia coli, y que es ampliamente aplicable independientemente de la especie. Además, se encontró que la edición de un gen esencial, que mostró baja eficiencia hasta ahora, puede realizarse de manera eficaz realizando de manera transitoria una reacción de conversión de bases de ácido nucleico en una fase deseada.

El presente inventor ha realizado estudios adicionales basándose en estos hallazgos y ha completado la presente invención.

Por consiguiente, la presente divulgación es tal como se describe a continuación.

[1] Un método de modificación de un sitio seleccionado como diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en el que un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario seleccionado y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se unen, con dicho ADN bicatenario, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en uno o más de otros nucleótidos o delecionar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio seleccionado como diana, sin escindir al menos una cadena de dicho ADN bicatenario en el sitio seleccionado como diana.

[2] El método según [1], en el que el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en un sistema CRISPR-Cas en el que al menos se inactiva una capacidad de escisión de ADN de Cas, un motivo de dedos de cinc, un efector TAL y un motivo PPR.

[3] El método según [1], en el que el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas en el que al menos se inactiva una capacidad de escisión de ADN de Cas.

[4] El método según cualquiera de [1] -[3], que usa dos o más clases de módulos de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une cada uno específicamente a una secuencia de nucleótidos diana diferente.

[5] El método según [4], en el que la secuencia de nucleótidos diana diferente está presente en un gen diferente.

[6] El método de cualquiera de [1] -[5], en el que la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es desaminasa.

[7] El método según [6], en el que la desaminasa es AID (AICDA).

[8] El método según cualquiera de [1] -[7], en el que el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo introduciendo un ácido nucleico que codifica para el complejo en una célula que tiene el ADN bicatenario.

[9] El método según [8], en el que la célula es una célula procariota.

[10] El método según [8], en el que la célula es una célula eucariota.

[11] El método según [8], en el que la célula es una célula de un microorganismo.

[12] El método según [8], en el que la célula es una célula vegetal.

[13] El método según [8], en el que la célula es una célula de insecto.

[14] El método según [8], en el que la célula es una célula animal.

[15] El método según [8], en el que la célula es una célula de un vertebrado.

[16] El método según [8], en el que la célula es una célula de mamífero.

[17] El método según cualquiera de [9] -[16], en el que la célula es una célula poliploide, y se modifica un sitio en cualquier alelo seleccionado como diana en un cromosoma homólogo.

[18] El método según cualquiera de [8] -[17], que comprende una etapa de introducir un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para el complejo en una forma que permite el control de un periodo de expresión en la célula, y una etapa de inducir la expresión del ácido nucleico durante un periodo necesario para estabilizar la modificación del sitio seleccionado como diana en el ADN bicatenario.

[19] El método según [18], en el que la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario está presente en un gen esencial para la célula.

[20] Un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico en el que un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario seleccionado y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se unen, lo que convierte uno o más nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en uno o más de otros nucleótidos o deleciona uno o más nucleótidos, o inserta uno o más nucleótidos en dicho sitio seleccionado como diana, sin escindir al menos una cadena de dicho ADN bicatenario en el sitio seleccionado como diana.

[21] Un ácido nucleico que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico según [20].

[Efecto de la invención]

Según la técnica de edición genómica de la presente invención, debido a que no se asocia con la inserción de un ADN foráneo o roturas de ADN bicatenario, la técnica es superior en cuanto a seguridad. La técnica tiene alguna posibilidad de proporcionar una solución en casos en los que los métodos convencionales se consideraron como una recombinación de genes, y por tanto biológica o legalmente controvertidos. Además, es teóricamente posible establecer una amplia gama de introducción de mutación desde una posición identificada de una base hasta varios cientos de bases, y la técnica también puede aplicarse a la inducción de evolución local mediante la introducción de una mutación aleatoria en una región limitada particular, que ha sido casi imposible hasta ahora.

[Breve descripción de los dibujos]

La figura 1 es una ilustración esquemática que muestra un mecanismo del método de modificación genética de la presente invención usando el sistema CRISPR-Cas.

La figura 2 muestra los resultados de verificación, usando una levadura en gemación, del efecto del método de modificación genética de la presente invención que comprende una combinación de un sistema CRISPR-Cas y desaminasa PmCDA1 de Petromyzon marinus.

La figura 3 muestra los cambios en el número de células supervivientes después de la inducción de la expresión cuando un sistema CRISPR-Cas9 que usa un mutante de D10A de Cas9 que tiene una actividad nickasa y una desaminasa, PmCDA1, se usan en combinación (nCas9 D10A-PmCDA1), y cuando se usa Cas9 convencional que tiene una capacidad de escisión de la doble cadena del ADN.

La figura 4 muestra los resultados cuando se construye una pluralidad de constructos de expresión de manera que las desaminasa AID humana y dCas9 se unen a través de un dominio SH3 y un ligando de unión del mismo, en la que los constructos expresos se introducen en una levadura en gemación junto con dos clases de ARNg (secuencias de selección como diana de diana 4 y diana 5).

La figura 5 muestra que la eficiencia de la introducción de mutación se aumenta mediante el uso de Cas9 que escinde cualquier cadena sencilla del ADN.

La figura 6 muestra que en el caso en el que un ADN bicatenario no se escinde, el área de la región de introducción de mutación y la frecuencia de la misma cambian dependiendo de qué cadena sencilla se escinda.

La figura 7 muestra que puede conseguirse una eficiencia de la introducción de mutación sumamente alta seleccionado como diana dos regiones en la proximidad.

La figura 8 muestra que el método de modificación genética de la presente invención no requiere la selección mediante un marcador. Se encontró que la mutación se introdujo en todas las colonias secuenciadas.

La figura 9 muestra que pueden editarse una pluralidad de sitios en un genoma simultáneamente mediante el método de modificación genética de la presente invención. El panel superior muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del sitio diana de cada gen, y una flecha en la secuencia de nucleótidos muestra la secuencia de nucleótidos diana. El número en el extremo de la flecha o en la punta de la flecha indica la posición del extremo terminal de la secuencia de nucleótidos diana en ORF. El panel inferior muestra los resultados de secuenciación del sitio diana en cada uno de los 5 clones de las colonias roja (R) y blanca (B). En las secuencias, los nucleótidos indicados con caracteres subrayados muestran la aparición de conversión de bases. En cuanto a la receptividad a canavanina (CanR), R muestra resistencia, y S muestra sensibilidad.

La figura 10 muestra que puede introducirse una mutación simultáneamente en ambos alelos en el cromosoma homólogo del genoma diploide mediante el método de modificación genética de la presente invención. La figura 10A muestra la eficiencia de la introducción de mutación homóloga del gen ade1 (panel superior) y el gen can1 respectivamente. La figura 10B muestra que la mutación homóloga se introdujo realmente en la colonia roja (panel inferior). Además, se demostró la aparición de mutación heteróloga en la colonia blanca (panel superior).

La figura 11 muestra que es posible la edición genómica de Escherichia coli, una célula procariota, mediante el método de modificación genética de la presente invención. La figura 11A es una ilustración esquemática que muestra el plásmido usado. La figura 1lB muestra que puede introducirse una mutación (CAA^^tA^a) de manera eficaz seleccionando como diana una región en el gen galK. La figura 11C muestra los resultados del análisis de secuencia de cada uno de los dos clones de las respectivas colonias en un medio no selectivo (ninguno), un medio que contiene rifampicina 25 |ig/ml (Rif25) o un medio que contiene rifampicina 50 |ig/ml (Rif50). Se confirmó la introducción de una mutación que confiere resistencia a la rifampicina (panel superior). La frecuencia de aparición de la cepa resistente a la rifampicina se estimó que era aproximadamente del 10% (panel inferior).

La figura 12 muestra el control de los sitios de bases editados por la longitud del ARN guía. La figura 12A es una figura conceptual del sitio de bases de edición cuando la longitud de la secuencia de nucleótidos diana es de 20 bases o de 24 bases. La figura 12B muestra los resultados de la edición seleccionando como diana el gen gsiA y cambiando la longitud de la secuencia de nucleótidos diana. Los sitios mutados se muestran con letras en negrita, “T” y “A” muestran la introducción de una mutación completa (C ^T o G ^A ) en el clon, “t” muestra que se introduce no menos del 50% de mutación (C ^T) en el clon (clonación incompleta), y “c” muestra que la eficiencia de la introducción de la mutación (C^T) en el clon es de menos del 50%.

La figura 13 es una ilustración esquemática que muestra un plásmido sensible a la temperatura para la introducción de mutación, que se usó en el ejemplo 11.

La figura 14 muestra el protocolo de introducción de mutación en el ejemplo 11.

La figura 15 muestra los resultados de introducción de mutación en el gen rpoB en el ejemplo 11.

La figura 16 muestra los resultados de introducción de mutación en el gen galK en el ejemplo 11.

[Descripción de las realizaciones]

La presente descripción proporciona un método de modificación de un sitio seleccionado como diana de un ADN bicatenario convirtiendo la secuencia de nucleótidos diana y nucleótidos en la proximidad del mismo en el ADN bicatenario en otros nucleótidos, sin escindir al menos una cadena del ADN bicatenario que va a modificarse. El método comprende de manera característica una etapa de poner en contacto un complejo en el que se unen un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, con el ADN bicatenario para convertir el sitio seleccionado como diana, es decir, la secuencia de nucleótidos diana y nucleótidos en la proximidad del mismo, en otros nucleótidos.

En la presente invención, la “modificación” de un ADN bicatenario significa que un nucleótido (por ejemplo, dC) en una cadena de ADN se convierte en otro nucleótido (por ejemplo, dT, dA o dG), o se deleciona, o se inserta un nucleótido o una secuencia de nucleótidos entre determinados nucleótidos en la cadena de ADN. Mientras que el ADN bicatenario que va a modificarse no está particularmente limitado, es preferiblemente un ADN genómico. El “sitio seleccionado como diana” de un ADN bicatenario significa que la “secuencia de nucleótidos diana” completa o parcial, en la que un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico reconoce y se une específicamente a, o la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana (una o ambas en el sentido de 5' y en el sentido de 3'), y la longitud de la misma puede ajustarse de manera apropiada entre 1 base y varios cientos de bases según el objeto. En la presente invención, el “módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico” significa una molécula o complejo de moléculas que tiene una capacidad para reconocer y unirse específicamente a una secuencia de nucleótidos particular (es decir, secuencia de nucleótidos diana) en una cadena de ADN. La unión del módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico a una secuencia de nucleótidos diana permite que una enzima convertidora de bases de ácido nucleico unida al módulo actúe específicamente en un sitio seleccionado como diana de un ADN bicatenario.

En la presente invención, la “enzima convertidora de bases de ácido nucleico” significa una enzima capaz de convertir un nucleótido diana en otro nucleótido catalizando una reacción para convertir un sustituyente en un anillo de purina o pirimidina en una base de ADN en otro grupo o átomo, sin escindir la cadena de ADN.

En la presente invención, el “complejo enzimático de modificación de ácido nucleico” significa un complejo molecular que comprende un complejo del módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico mencionado anteriormente unido con una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, en el que el complejo tiene actividad enzimática convertidora de bases de ácido nucleico y se confiere con una capacidad de reconocimiento de secuencia de nucleótidos particular. El “complejo” usado en el presente documento abarca no sólo uno compuesto de una pluralidad de moléculas, sino también una molécula sencilla que tiene un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico tal como una proteína de fusión. La enzima convertidora de bases de ácido nucleico usada en la presente invención no está particularmente limitada siempre que pueda catalizar la reacción mencionada anteriormente, y los ejemplos de la misma incluyen desaminasa que pertenece a la superfamilia de desaminasas de ácido nucleico/nucleótido, que cataliza una reacción de desaminación que convierte un grupo amino en un grupo carbonilo. Los ejemplos preferibles de la misma incluyen citidina desaminasa capaz de convertir citosina o 5-metilcitosina en uracilo o timina, respectivamente, adenosina desaminasa capaz de convertir adenina en hipoxantina, guanosina desaminasa capaz de convertir guanina en xantina y similares. Como citidina desaminasa, se prefiere más citidina desaminasa inducida por activación (a continuación en el presente documento también denominada AID), que es una enzima que introduce una mutación en un gen de la inmunoglobulina en la inmunidad adquirida de un vertebrado o similar.

Mientras que el origen de la enzima convertidora de bases de ácido nucleico no está particularmente limitado, por ejemplo, puede usarse PmCDA1 (citosina desaminasa 1 de Petromyzon marinus) de Petromyzon marinus, o AID (citidina desaminasa inducida por activación; AICDA) de mamífero (por ejemplo, humano, porcino, bovino, de caballo, de mono, etc.). La secuencia de bases y secuencia de aminoácidos de CDS de PmCDA1 se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, y la secuencia de bases y secuencia de aminoácidos de CDS de AID humana se muestran en las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente.

Una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario que va a ser reconocida por el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico en el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención no está particularmente limitada siempre que el módulo se una específicamente a cualquier secuencia en el ADN bicatenario. La longitud de la secuencia de nucleótidos diana sólo es necesario que sea suficiente para la unión específica del módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando se introduce mutación en un sitio particular en el ADN genómico de un mamífero, no es menos de 12 nucleótidos, preferiblemente no menos de 15 nucleótidos, más preferiblemente no menos de 17 nucleótidos, según el tamaño del genoma del mismo. Mientras que el límite superior de la longitud no está particularmente limitado, es preferiblemente no más de 25 nucleótidos, más preferiblemente no más de 22 nucleótidos.

Como el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico en el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente descripción, puede usarse un sistema CRISPR-Cas en el que al menos se inactiva una capacidad de escisión de ADN de Cas (CRISPR-Cas mutante), motivo de dedos de cinc, efector TAL y motivo PPR y similares, así como un fragmento que contiene un dominio de unión al ADN de una proteína que se une específicamente al ADN tal como una enzima de restricción, un factor de transcripción, una ARN polimerasa o similares, y que no tiene una capacidad de escisión de la doble cadena del ADN y similares, pero el módulo no se limita al mismo. Preferiblemente, los módulos incluyen CRISPR-Cas mutante, motivo de dedos de cinc, efector TAL, motivo PPR y similares.

Un motivo de dedos de cinc se construye uniendo 3 - 6 unidades de dedos de cinc de tipo Cys2His2 diferentes (1 dedo reconoce aproximadamente 3 bases), y puede reconocer una secuencia de nucleótidos diana de 9 -18 bases. Un motivo de dedos de cinc puede producirse mediante un método conocido tal como un método de ensamblaje modular (Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141), método OPEN (Mol Cell (2008) 31: 294-301), método CoDA (Nat Methods (2011) 8: 67-69), método de un híbrido de Escherichia coli (Nat Biotechnol (2008) 26:695-701) y similares. Puede referirse al documento de patente 1 mencionado anteriormente para el detalle de la producción de motivos de dedos de cinc.

Un efector TAL tiene una estructura de repetición de módulos con aproximadamente 34 aminoácidos como una unidad, y los residuos de aminoácido 12° y 13° (denominados RVD) de un módulo determinan la estabilidad de la unión y la especificidad de bases. Debido a que cada módulo es altamente independiente, el efector TAL específico para una secuencia de nucleótidos diana puede producirse simplemente uniendo los módulos. Para el efector TAL, se han establecido métodos de producción que utilizan un recurso abierto (método REAL (Curr Protoc Mol Biol (2012) capítulo 12: unidad 12.15), método FLASH (Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465) y método Golden Gate (Nucleic Acids Res (2011) 39: e82), etc.), y puede diseñarse de manera relativamente fácil un efector TAL para una secuencia de nucleótidos diana. Puede referirse al documento de patente 2 mencionado anteriormente para el detalle de la producción de un efector TAL.

Un motivo PPR se construye de manera que una secuencia de nucleótidos particular se reconoce por una serie de motivos PPR que consiste cada uno en 35 aminoácidos y que reconoce una base de ácido nucleico, y reconoce una base diana sólo por los aminoácidos 1,4 y ii(-2) de cada motivo. La configuración del motivo no tiene dependencia, y está libre de interferencia de motivos en ambos lados. Por tanto, similar al efector TAL, puede producirse una proteína PPR específica para la secuencia de nucleótidos diana simplemente uniendo motivos PPR. Puede referirse al documento de patente 4 mencionado anteriormente para el detalle de la producción de un motivo PPR.

Cuando se usa un fragmento de enzima de restricción, un factor de transcripción, una ARN polimerasa o similares, debido a que los dominios de unión al ADN de estas proteínas se conocen bien, puede diseñarse y construirse fácilmente un fragmento que contiene dicho dominio y que no tiene una capacidad de escisión de la doble cadena del ADN.

Cualquier módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico mencionado anteriormente puede proporcionarse como una proteína de fusión con la enzima convertidora de bases de ácido nucleico mencionada anteriormente, o un dominio de unión a proteína tal como un dominio SH3, dominio PDZ, dominio GK, dominio GB y similares y un componente de unión del mismo pueden fusionarse con un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, respectivamente, y proporcionarse como un complejo de proteínas a través de una interacción del dominio y un componente de unión del mismo. Alternativamente, un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden fusionarse cada uno con inteína, y pueden unirse mediante ligación después de la síntesis de proteínas.

El complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención que contiene un complejo (incluyendo una proteína de fusión), en el que se unen un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, puede ponerse en contacto con un ADN bicatenario como una reacción enzimática en un sistema libre de células. En vista del objeto principal de la presente invención, es deseable realizar el contacto introduciendo un ácido nucleico que codifica para el complejo en una célula que tiene el ADN bicatenario de interés (por ejemplo, ADN genómico).

Por tanto, el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y la enzima convertidora de bases de ácido nucleico se preparan preferiblemente como un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión del mismo, o como ácidos nucleicos que codifican para cada uno de ellos en una forma capaz de formar un complejo en una célula huésped después de la traducción para dar una proteína utilizando un dominio de unión, inteína o similar. El ácido nucleico puede ser en el presente documento un ADN o un ARN. Cuando es un ADN, es preferiblemente un ADN bicatenario, y se proporciona en forma de un vector de expresión dispuesto bajo la regulación de un promotor funcional en una célula huésped. Cuando es un ARN, es preferiblemente un ARN monocatenario.

Debido a que el complejo de la presente invención en el que se unen un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, no está asociado con roturas de ADN bicatenario (DSB), es posible la edición genómica con baja toxicidad, y el método de modificación genética de la presente invención puede aplicarse a una amplia gama de materiales biológicos. Por tanto, las células en las que se introduce el ácido nucleico que codifica para el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y/o la enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede abarcar células de cualquier especie, desde células de microorganismos, tales como bacterias, tal como Escherichia coli y similares que son procariotas, tales como levadura y similares que son eucariotas inferiores, hasta células de eucariotas superiores tales como insecto, planta y similares, y células de vertebrado que incluyen mamíferos tales como humano y similares.

Un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico tal como un motivo de dedos de cinc, un efector TAL, un motivo PPR y similares puede obtenerse mediante cualquier método mencionado anteriormente para cada módulo. Un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de enzima de restricción, un factor de transcripción, una ARN polimerasa y similares pueden clonarse, por ejemplo, sintetizando un cebador de oligoADN que cubre una región que codifica para una parte deseada de la proteína (una parte que contiene un dominio de unión al ADN) basándose en la información de secuencia de ADNc del mismo, y amplificando mediante el método de RT-PCR usando, el ARN total o la fracción de ARNm preparada a partir de las células productoras de proteínas como molde.

Un ADN que codifica para una enzima convertidora de bases de ácido nucleico también puede clonarse de manera similar sintetizando un cebador de oligoADN basándose en la información de secuencia de ADNc del mismo, y amplificando mediante el método de RT-PCR usando, el ARN total o la fracción de ARNm preparada a partir de las células productoras de enzimas como molde. Por ejemplo puede clonarse, un ADN que codifica para PmCDA1 de Petromyzon marinus diseñando cebadores adecuados para el sentido de 5' y el sentido de 3' de CDS basándose en la secuencia de ADNc (n.° de registro EF094822) registrada en la base de datos del NCBI, y clonando a partir de ARNm de Petromyzon marinus mediante el método de RT-PCR. Un ADN que codifica para la AID humana puede clonarse diseñando cebadores adecuados para el sentido de 5' y el sentido de 3' de CDS basándose en la secuencia de ADNc (n.° de registro AB040431) registrada en la base de datos del NCBI, y clonando a partir de, por ejemplo, ARNm de ganglio linfático humano mediante el método de RT-PCR.

El ADN clonado puede unirse directamente, o después de la digestión con una enzima de restricción si se desea, o después de la adición de un ligador y/o una señal de localización nuclear adecuados (cada organelo transfiere señal cuando el ADN bicatenario de interés es ADN de mitocondria o cloroplasto), con un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico para preparar un ADN que codifica para una proteína de fusión. Alternativamente, un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico, y un ADN que codifica para una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden fusionarse cada uno con un ADN que codifica para un dominio de unión o un componente de unión del mismo, o ambos ADN pueden fusionarse con un ADN que codifica para una inteína de separación, mediante lo cual el módulo de conversión de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y la enzima convertidora de bases de ácido nucleico se traducen en una célula huésped para formar un complejo. En estos casos, un ligador y/o una señal de localización nuclear pueden unirse en una posición adecuada de uno o ambos ADN si se desea.

Un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y un ADN que codifica para una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden obtenerse sintetizando químicamente la cadena de ADN, o uniendo cadenas cortas de oligoADN sintetizadas parcialmente solapadas utilizando el método de PCR y el método de ensamblaje de Gibson para construir un ADN que codifica para la longitud completa del mismo. La ventaja de la construcción de un ADN de longitud completa mediante síntesis química o una combinación del método de PCR o el método de ensamblaje de Gibson es que puede diseñarse el codón usado en CDS de longitud completa según el huésped en el que se introduce el ADN. En la expresión de un ADN heterólogo, se espera que el nivel de expresión de proteínas aumente convirtiendo la secuencia de ADN del mismo en un codón que se usa de manera muy frecuente en el organismo huésped. Como datos de frecuencia de uso del codón en el huésped usado, por ejemplo, puede usarse la base de datos de frecuencia de uso de códigos genéticos (http://www.kazusa.o.jp/codon/index.html) divulgada en página web principal de Kazusa ADN Research Institute, o pueden referirse a documentos que muestran la frecuencia de uso del codón en cada huésped. Con referencia a los datos obtenidos y la secuencia de ADN que va a introducirse, los codones que muestran baja frecuencia de uso en el huésped a partir de los usados para la secuencia de ADN pueden convertirse en un codón que codifica para el mismo aminoácido y que muestra alta frecuencia de uso.

Un vector de expresión que contiene un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede producirse, por ejemplo, uniendo el ADN en el sentido de 3' de un promotor en un vector de expresión adecuado.

Como vector de expresión, se usan plásmidos de Escherichia coli (por ejemplo, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); plásmidos de Bacillus subtilis (por ejemplo, pUB110, pTP5, pC194); plásmidos de levadura (por ejemplo, pSH19, pSH15); plásmidos de expresión de células de insecto (por ejemplo, pFast-Bac); plásmidos de expresión de células animales (por ejemplo, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); bacteriófagos tales como fago X y similares; vectores de virus de insecto tales como baculovirus y similares (por ejemplo, BmNPV, AcNPV); vectores de virus animales tales como retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y similares.

Como promotor, puede usarse cualquier promotor apropiado para un huésped usado para expresión génica. En un método convencional que implica dSb , debido a que la tasa de supervivencia de la célula huésped algunas veces disminuye de manera pronunciada debido a la toxicidad, es deseable aumentar el número de células al inicio de la inducción usando un promotor inductivo. Sin embargo, ya que también puede alcanzarse una proliferación celular suficiente expresando el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención, también puede usarse un promotor constitutivo sin limitación.

Por ejemplo, cuando el huésped es una célula animal, promotor de SRa, promotor de VS40, promotor de LTR, promotor de CMV (citomegalovirus), promotor de VSR (virus del sarcoma de Rous), LTR de MoMuLV (virus de la leucemina murina de Moloney), promotor de VHS-TK (timidina cinasa del virus del herpes simple) y similares. De éstos, son preferibles el promotor de CMV, el promotor de SRa y similares.

Cuando el huésped es Escherichia coli, son preferibles el promotor de trp, el promotor de lac, el promotor de recA, el promotor de XPL, el promotor de lpp, el promotor de T7 y similares.

Cuando el huésped es del género Bacillus, son preferibles el promotor de SPO1, el promotor de SPO2, el promotor de penP y similares.

Cuando el huésped es una levadura, son preferibles el promotor de Gal1/10, el promotor de PHO5, el promotor de PGK, el promotor de GAP, el promotor de ADH y similares.

Cuando el huésped es una célula de insecto, son preferibles el promotor de polihedrina, el promotor de P10 y similares.

Cuando el huésped es una célula vegetal, son preferibles el promotor de CaMV35S, el promotor de CaMV19S, el promotor de NOS y similares.

Como vector de expresión, junto con los mencionados anteriormente, puede usarse uno que contenga un potenciador, una señal de corte y empalme, un terminador, una señal de adición de poliA, un marcador de selección tal como un gen resistente al fármaco, un gen complementario auxotrófico y similares, un origen de replicación y similares según demanda.

Un ARN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede prepararse, por ejemplo, mediante transcripción a ARNm en un sistema de transcripción in vitro conocido per se usando un vector que codifica para ADN que codifica para el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico mencionados anteriormente como molde.

Un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede expresarse de manera intracelular introduciendo un vector de expresión que contiene un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico en una célula huésped, y cultivando la célula huésped.

Como huésped, se usan género Escherichia, género Bacillus, levadura, célula de insecto, insecto, célula animal y similares.

Como género Escherichia, se usan Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], Escherichia coli JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], Escherichia coli JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], Escherichia coli HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] y similares.

Como género Bacillus, se usan Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], Bacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] y similares.

Como levadura, se usan Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 y similares.

Como célula de insecto cuando el virus es AcNPV, se usan células de una línea establecida a partir de larva del noctuido de la col (célula de Spodoptera frugiperda; célula de Sf), células de MG1 del intestino medio de Trichoplusia ni, células High Five™ de un huevo de Trichoplusia ni, células de Mamestra brassicae, células de Estigmena acrea y similares. Cuando el virus es BmNPV, se usan células de línea establecida de Bombyx mori (célula N de Bombyx mori; célula de BmN) y similares como células de insecto. Como célula de Sf, por ejemplo, célula de Sf9 (ATCC CRL1711), célula de SÍ21 [todas las anteriores, In vivo, 13, 213-217 (1977)] y similares.

Como insecto, por ejemplo, se usan larva de Bombyx mori, Drosophila, grillo y similares [Nature, 315, 592 (1985)]. Como célula animal, se usan líneas celulares tales como célula de mono COS-7, célula de mono Vero, célula de ovario de hámster chino (CHO), célula de CHO deficiente en gen dhfr, célula L de ratón, célula de ratón AtT-20, célula de mieloma de ratón, célula de rata GH3, célula humana FL y similares, células madre pluripotentes tales como célula iPS, célula ES y similares de humano y otros mamíferos, y células cultivadas primarias preparadas a partir de diversos tejidos. Además, también pueden usarse embrión de pez cebra, Xenopus oocyte y similares. Como célula vegetal, se usan células cultivadas suspendidas, callo, protoplasto, segmento de hojas, segmento de raíces y similares preparados a partir de diversas plantas (por ejemplo, cereales tales como arroz, trigo, maíz y similares, cultivos de productos tales como tomate, pepino, berenjena y similares, plantas de jardín tales como clavel, Eustoma russellianum y similares, plantas de ensayo tales como tabaco, arabidopsis thaliana y similares). Todas las células huésped mencionadas anteriormente pueden ser haploides (monoploides), o poliploides (por ejemplo, diploides, triploides, tetraploides y similares). En los métodos de introducción de mutación convencional, la mutación se introduce, en principio, en un sólo cromosoma homólogo para producir un genotipo heterólogo. Por tanto, la característica deseada no se expresa a menos que sea una mutación dominante, y hacerla homóloga requiere de manera inoportuna trabajo y tiempo. Por el contrario, según la presente invención, debido a que pueden introducirse mutaciones en todos los alelos en el cromosoma homólogo en el genoma, la característica deseada puede expresarse en una única generación incluso en el caso de mutación recesiva (figura 10), que es extremadamente útil ya que puede resolverse el problema del método convencional.

Un vector de expresión puede introducirse mediante un método conocido (por ejemplo, método de lisozima, método competente, método PEG, método de coprecipitación de CaCl2, método de electroporación, el método de microinyección, método de pistola de partículas, método de lipofección, método de Agrobacterium y similares) según la clase del huésped.

Escherichia coli puede transformarse según los métodos descritos en, por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) y similares.

Un vector puede introducirse en el género Bacillus según los métodos descritos en, por ejemplo, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) y similares.

Un vector puede introducirse en una levadura según los métodos descritos en, por ejemplo, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) y similares.

Un vector puede introducirse en una célula de insecto y en un insecto según los métodos descritos en, por ejemplo, Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) y similares.

Un vector puede introducirse en una célula animal según los métodos descritos en, por ejemplo, Cell Engineering volumen adicional 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (publicado por Shujunsha), y Virology, 52, 456 (1973).

Una célula introducida con un vector puede cultivarse según un método conocido según la clase del huésped.

Por ejemplo, cuando se cultiva Escherichia coli o género Bacillus, es preferible un medio líquido como medio usado para el cultivo. El medio contiene preferiblemente una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sustancia inorgánica y similares necesarios para el crecimiento del transformante. Los ejemplos de la fuente de carbono incluyen glucosa, dextrina, almidón soluble, sacarosa y similares; los ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen sustancias inorgánicas u orgánicas tales como sales de amonio, sales de nitrato, licor de maíz macerado, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soja, extracto de patata y similares; y los ejemplos de la sustancia inorgánica incluyen cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio, cloruro de magnesio y similares. El medio puede contener extracto de levadura, vitaminas, factor promotor del crecimiento y similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 5 - aproximadamente 8.

Como medio para cultivar Escherichia coli, por ejemplo, es preferible un medio M9 que contiene glucosa, casaminoácido [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1972]. En caso necesario, por ejemplo, pueden añadirse agentes tales como ácido 3p-indolilacrílico al medio para asegurar una función eficiente de un promotor. Escherichia coli se cultiva generalmente a aproximadamente 15 -aproximadamente 43°C. En caso necesario, puede realizarse aireación y agitación.

El género Bacillus se cultiva generalmente a aproximadamente 30 - aproximadamente 40°C. En caso necesario, puede realizarse aireación y agitación.

Los ejemplos del medio para cultivar levadura incluyen medio mínimo de Burkholder [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)], medio SD que contiene casaminoácido al 0,5% [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)] y similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 5 - aproximadamente 8. El cultivo se realiza generalmente a aproximadamente 20°C - aproximadamente 35°C. En caso necesario, puede realizarse aireación y agitación.

Como medio para cultivar una célula de insecto o un insecto, por ejemplo, se usan medio para insectos de Grace [Nature, 195, 788 (1962)] que contiene un aditivo tal como suero bovino al 10% inactivado y similares como sea apropiado y similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 6,2 - aproximadamente 6,4. El cultivo se realiza generalmente a aproximadamente 27°C. En caso necesario, puede realizarse aireación y agitación. Como medio para cultivar una célula animal se usan, por ejemplo, medio esencial mínimo (MEM) que contiene aproximadamente el 5 - aproximadamente el 20% de suero bovino fetal [Science, 122, 501 (1952)], medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) [Virology, 8, 396 (1959)], medio RPMI 1640 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] y similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 6 - aproximadamente 8. El cultivo se realiza generalmente a aproximadamente 30°C - aproximadamente 40°C. En caso necesario, puede realizarse aireación y agitación.

Como medio para cultivar una célula vegetal se usan, por ejemplo, medio MS, medio LS, medio B5 y similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 5 - aproximadamente 8. El cultivo se realiza generalmente a aproximadamente 20°C - aproximadamente 30°C. En caso necesario, puede realizarse aireación y agitación.

Tal como se mencionó anteriormente, puede expresarse de manera intracelular un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, es decir, un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico.

Un ARN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede introducirse en una célula huésped mediante un método de microinyección, método de lipofección y similares. La introducción de ARN puede realizarse una o múltiples veces (por ejemplo, 2 - 5 veces) en intervalos adecuados.

Cuando un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se expresan mediante un vector de expresión o una molécula de ARN introducidos en la célula, el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico reconoce y se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario (por ejemplo, ADN genómico) de interés y, debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácido nucleico unida al módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico, se produce la conversión de bases en la cadena sentido o cadena antisentido del sitio seleccionado como diana (secuencia de nucleótidos diana completa o parcial o ajustada de manera apropiada con varios cientos de bases incluyendo la proximidad de la misma) y se produce un apareamiento erróneo en el ADN bicatenario (por ejemplo, cuando se usa citidina desaminasa tal como PmCDA1, AID y similares como enzima convertidora de bases de ácido nucleico, la citosina en la cadena sentido o cadena antisentido en el sitio seleccionado como diana se convierte en uracilo para producir apareamiento erróneo U:G o G:U). Cuando el apareamiento erróneo no se repara de manera correcta, y cuando se repara de manera que una base de la cadena opuesta forma un par con una base de la cadena convertida (T-A o A-T en el ejemplo mencionado anteriormente), o cuando otro nucleótido se sustituye adicionalmente (por ejemplo, U^A, G) o cuando se delecionan o se insertan de una a varias docenas de bases durante la reparación, se insertan diversas mutaciones.

En cuanto al motivo de dedos de cinc, la producción de muchos motivos de dedos de cinc realmente funcionales no es fácil, debido a que la eficiencia de producción de un dedo de cinc que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana no es alta y la selección de un dedo de cinc que tenga alta especificidad de unión no es fácil. Mientras que el efector TAL y el motivo PPR tienen un alto grado de libertad de reconocimiento de secuencias diana de ácido nucleico en comparación con el motivo de dedos de cinc, permanece un problema en la eficiencia debido a que es necesario diseñar y construir una proteína grande cada vez según la secuencia de nucleótidos diana.

Por el contrario, ya que el sistema CRISPR-Cas reconoce la secuencia de ADN bicatenario de interés mediante un ARN guía complementario a la secuencia de nucleótidos diana, cualquier secuencia puede seleccionarse como diana sintetizando simplemente un oligoADN capaz de formar específicamente un híbrido con la secuencia de nucleótidos diana.

Por tanto, en una realización más preferible de la presente invención, un sistema CRISPR-Cas en el que al menos se inactiva una capacidad de escisión de ADN de Cas (CRISPR-Cas mutante) se usa como módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico.

La figura 1 es una ilustración esquemática que muestra el método de modificación del ADN bicatenario de la presente invención usando CRISPR-Cas mutante como módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico. El módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico de la presente invención usando CRISPR-Cas mutante se proporciona como un complejo de una molécula de ARN que consiste en un ARN guía complementario a la secuencia de nucleótidos diana y ARNtracr necesarios para reclutar una proteína Cas mutante, y una proteína Cas mutante.

La proteína Cas usada en la presente invención no está particularmente limitada siempre que pertenezca al sistema CRISPR, y preferiblemente Cas9. Los ejemplos de Cas9 incluyen, pero no se limitan a, Cas9 (SpCas9) de Streptococcus pyogenes, Cas9 (StCas9) de Streptococcus thermophilus y similares, preferiblemente SpCas9. Como Cas mutante usada en la presente descripción, puede usarse o bien una Cas que tiene capacidad de escisión de ambas cadenas del ADN bicatenario, o bien una Cas que tiene actividad nickasa en la que sólo se inactiva una de la capacidad de escisión de sólo una de las cadenas. Por ejemplo, en el caso de SpCas9, puede usarse un mutante de D10A en el que el 10° residuo de Asp se convierte en un residuo de Ala y que carece de capacidad de escisión de una cadena opuesta a la cadena que forma una cadena complementaria con un ARN guía, o un mutante de H840A en el que el 840° residuo de His se convierte en un residuo de Ala y que carece de capacidad de escisión de cadena complementaria al ARN guía, o un mutante doble del mismo, y puede usarse de manera similar otra Cas mutante. Una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se proporciona como un complejo con Cas mutante mediante un método similar al esquema de unión con el dedo de cinc mencionado anteriormente y similares. Alternativamente, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y una Cas mutante también pueden unirse utilizando un armazón proteínico de ARN con aptómeros de ARN MS2F6, PP7 y similares y proteínas de unión de los mismos. El ARN guía forma una cadena complementaria con la secuencia de nucleótidos diana, se recluta la Cas mutante por el ARNtracr unido y la Cas mutante reconoce la secuencia de reconocimiento del sitio de escisión del ADN PAM (motivo adyacente de protoespaciador) (cuando se usa SpCas9, PAM es 3 bases de NGG (N es cualquier base), y, teóricamente, puede seleccionar como diana cualquier posición en el genoma). Uno o ambos ADN no pueden escindirse, y, debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácido nucleico unida a la Cas mutante, se produce la conversión de bases en el sitio seleccionado como diana (ajustada de manera apropiada con varios cientos de bases incluyendo la secuencia de nucleótidos diana completa o parcial) y se produce un apareamiento erróneo en el ADN bicatenario. Cuando el apareamiento erróneo no se repara de manera correcta, y cuando se repara de manera que una base de la cadena opuesta forma un par con una base de la cadena convertida, o cuando otro nucleótido se convierte adicionalmente o cuando se delecionan o insertan de una a varias docenas de bases durante la reparación, se introducen diversas mutaciones (véase, por ejemplo, la figura 2).

Incluso cuando se usa CRISPR-Cas mutante como módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico, se introducen de manera deseable un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, en forma de un ácido nucleico que codifica para los mismos, en una célula que tiene un ADN bicatenario de interés, similar a cuando se usan dedo de cinc y similares como módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico.

Un ADN que codifica para Cas puede clonarse mediante un método similar al método mencionado anteriormente para un ADN que codifica para una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, a partir de una célula que produce la enzima. Una Cas mutante puede obtenerse introduciendo una mutación para convertir un residuo de aminoácido de la parte importante para la actividad de escisión de ADN (por ejemplo, el 10° residuo de Asp y el 840° residuo de His para Cas9, aunque no se limitan a los mismos) en otro aminoácido, en un ADN que codifica para la Cas clonada, mediante un método de inducción de la mutación específica del sitio conocido per se.

Alternativamente, también puede construirse un ADN que codifica para Cas mutante como un ADN que tiene un uso de codón adecuado para la expresión en una célula huésped que va a usarse, mediante un método similar a los mencionados anteriormente para un ADN que codifica para un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y un ADN que codifica para una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, y en una combinación con síntesis química o método de PCR o método de ensamblaje de Gibson. Por ejemplo, la secuencia de CDS y la secuencia de aminoácidos optimizada para la expresión de SpCas9 en células eucariotas se muestran en las SEQ ID NO: 5 y 6. En la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, cuando “A” se convierte en “C” en la base n.° 29, puede obtenerse un ADN que codifica para un mutante de D10A, y cuando “CA” se convierte en “GC” en las bases nos 2518-2519, puede obtenerse un ADN que codifica para un mutante de H840A.

Un ADN que codifica para una Cas mutante y un ADN que codifica para una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden unirse para permitir la expresión como una proteína de fusión, o diseñarse para expresarse por separado usando un dominio de unión, inteína o similar, y formar un complejo en una célula huésped a través de interacción proteína-proteína o ligación de proteínas.

El ADN obtenido que codifica para una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden insertarse en el sentido de 3' de un promotor de un vector de expresión similar al mencionado anteriormente, según el huésped.

Por otro lado, un ADN que codifica para ARN guía y ARNtracr puede obtenerse diseñando una secuencia de oligoADN que se une a una secuencia de ARN guía complementaria a la secuencia de nucleótidos diana y la secuencia de ARNtracr conocida (por ejemplo, gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctttt; SEQ ID NO: 7) y sintetizando químicamente usando un sintetizador de ADN/ARN.

Aunque la longitud de la secuencia de ARN guía no está particularmente limitada siempre que pueda unirse específicamente a una secuencia de nucleótidos diana, por ejemplo, es de 15 - 30 nucleótidos, preferiblemente de 18 - 24 nucleótidos.

Aunque un ADN que codifica para ARN guía y ARNtracr también puede insertarse en un vector de expresión similar al mencionado anteriormente, según el huésped. Como promotor, se usan preferiblemente promotor de pol III (por ejemplo, promotor de SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U6, H1. etc.) y terminador (por ejemplo, secuencia T6).

Un ARN que codifica para una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede prepararse, por ejemplo, mediante transcripción a ARNm en un sistema de transcripción in vitro conocido per se usando un vector que codifica para la Cas mutante mencionada anteriormente y/o el ADN que codifica para una enzima convertidora de bases de ácido nucleico como molde.

Puede obtenerse ARN-ARNtracr guía diseñando una secuencia de oligoADN en la que se unen una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos diana y la secuencia de ARNtracr conocida, y sintetizando químicamente un sintetizador de ADN/ARN.

Un ADN o ARN que codifica para una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, un ARN-ARNtracr guía o un ADN que codifica para el mismo pueden introducirse en una célula huésped mediante un método similar al anterior, según el huésped.

Debido a que la nucleasa artificial convencional acompaña a las roturas de ADN bicatenario (DSB), la inhibición del crecimiento y la muerte celular probablemente producida por la escisión alterada (escisión fuera de diana) del cromosoma se producen seleccionando como diana una secuencia en el genoma. El efecto de la misma es particularmente mortal para muchos microorganismos y procariotas, e impide su aplicabilidad. En la presente invención, la mutación no se introduce por escisión de ADN sino por una reacción de conversión del sustituyente en la base de ADN (particularmente reacción de desaminación), y por tanto, puede realizarse una reducción drástica de la toxicidad. De hecho, tal como se muestra en las pruebas de comparación usando una levadura en gemación como huésped en los ejemplos mencionados a continuación, cuando se usa Cas9 que tiene un tipo convencional de actividad de DSB, el número de células supervivientes disminuye por la inducción de expresión, mientras que se confirmó que las células continuaron creciendo y el número de células supervivientes aumentó mediante la técnica de la presente invención usando Cas mutante y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico en combinación (figura 3).

La modificación del ADN bicatenario en la presente invención no evita la aparición de escisión del ADN bicatenario en un sitio distinto del sitio seleccionado como diana (ajustado de manera apropiada dentro de varios cientos de bases incluyendo la secuencia de nucleótidos diana completa o parcial). Sin embargo, una de las mayores ventajas de la presente invención es evasión de la toxicidad por escisión fuera de diana, que es generalmente aplicable a cualquier especie. En una realización preferible, por tanto, la modificación del ADN bicatenario en la presente invención no se asocia con la escisión de cadena de ADN no sólo en un sitio seleccionado como diana de un ADN bicatenario seleccionado sino en otros sitios.

Tal como se muestra en los ejemplos mencionados a continuación, cuando se usa una Cas que tiene una actividad nickasa capaz de escindir sólo una de las cadenas del ADN bicatenario como Cas mutante (figura 5), la eficiencia de la introducción de mutación aumenta en comparación a cuando se usa Cas mutante que no es capaz de escindir ambas cadenas. Por tanto, por ejemplo, junto a un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, que se unen a una proteína que tiene una actividad nickasa, escindiendo de ese modo sólo una cadena sencilla de ADN en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana, la eficiencia de la introducción de mutación puede mejorarse mientras que se evita la fuerte toxicidad de DSB.

Además, una comparación de los efectos de Cas mutante que tiene dos clases de actividad nickasa de escisión de cadena diferente revela que usando una de la Cas mutante da como resultado sitios mutados que se acumulan cerca del centro de la secuencia de nucleótidos diana, y usando otra Cas mutante da como resultado diversas mutaciones que se introducen de manera aleatoria en una región de varios cientos de bases de la secuencia de nucleótidos diana (figura 6). Por tanto, seleccionando una cadena que va a escindirse por la nickasa, puede introducirse una mutación en un nucleótido o una región de nucleótidos particular en una posición identificada, o pueden introducirse de manera aleatoria diversas mutaciones en un intervalo comparativamente amplio, que puede adoptarse de manera apropiada según el objeto. Por ejemplo, cuando la primera técnica se aplica a una célula iPS genéticamente enferma, puede producirse agente terapéutico de trasplante celular con un menor riesgo de rechazo reparando la mutación del gen patógeno en una célula iPS producida a partir de la propia célula de los pacientes, y diferenciando la célula en la célula somática de interés.

El ejemplo 7 y los ejemplos posteriores mencionados a continuación muestran que puede introducirse una mutación en un nucleótido particular casi en una posición identificada. Para la introducción de una posición identificada de una mutación en un nucleótido deseado, la secuencia de nucleótidos diana debe establecerse para mostrar una determinada regularidad en la relación posicional entre un nucleótido deseado que va a introducirse con una mutación y la secuencia de nucleótidos diana. Se usa un sistema CRISPR-Cas como módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y se usa AID como enzima convertidora de bases de ácido nucleico, la secuencia de nucleótidos diana puede diseñarse de manera que C (o G en la cadena opuesta) en la que se desea una mutación se introducirá en 2 - 5 nucleótidos desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos diana. Tal como se mencionó anteriormente, la longitud de la secuencia de ARN guía puede determinarse de manera apropiada para que esté dentro de entre 15 - 30 nucleótidos, preferiblemente 18 - 24 nucleótidos. Debido a que la secuencia de ARN guía es una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos diana, la longitud de la secuencia de nucleótidos diana cambia cuando se cambia la longitud de la secuencia de ARN guía; sin embargo, se mantiene la regularidad de que es probable que se introduzca una mutación en C o G en 2 - 5 nucleótidos desde el extremo 5' independientemente de la longitud del nucleótido (figura 12). Por tanto, determinando de manera apropiada la longitud de la secuencia de nucleótidos diana (ARN guía como una cadena complementaria de la misma), el sitio de una base en el que puede introducirse una mutación puede desplazarse. Como resultado, la restricción por secuencia de reconocimiento del sitio de escisión del ADN PAM (NGG) también puede eliminarse, y el grado de libertad de la introducción de mutación se vuelve mayor.

Tal como se muestra en los ejemplos mencionados a continuación, cuando se producen módulos de reconocimiento de secuencias correspondientes a una pluralidad de secuencias de nucleótidos diana en la proximidad, y se usan simultáneamente, la eficiencia de la introducción de mutación aumenta de manera drástica con relación a cuando se usa una secuencia de nucleótidos sencilla como diana (figura 7). Como efecto del mismo, se consigue una inducción de la mutación similar incluso cuando ambas secuencias de nucleótidos diana se solapan parcialmente cuando ambas están separadas por aproximadamente 600 pb. Puede producirse cuando ambas secuencias de nucleótidos diana están en la misma dirección (las secuencias de nucleótidos diana están presentes en la misma cadena) (figura 7), y cuando son opuestas (las secuencias de nucleótidos diana están presentes en cada cadena del ADN bicatenario) (figura 4).

Tal como se muestran en los ejemplos mencionados a continuación, el método de modificación de secuencia genómica de la presente invención puede introducir mutación en casi todas las células en las que se ha expresado el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención, seleccionando una secuencia de nucleótidos diana adecuada (figura 8). Por tanto, la inserción y selección de un gen marcador de selección, que son esenciales en la edición genómica convencional, no son necesarias. Esto facilita y simplifica de manera drástica la manipulación génica y extiende la aplicabilidad a la reproducción de cultivos y similares debido a que no se produce un organismo recombinante con ADN foráneo.

Debido a que el método de modificación de secuencia genómica de la presente invención muestra una eficiencia de introducción de mutación muy alta, y no requiere selección por marcadores, pueden modificarse una pluralidad de regiones de ADN en posiciones completamente diferentes como dianas (figura 9). Por tanto, en una realización preferible de la presente invención, pueden usarse dos o más clases de módulos de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se unen específicamente a diferentes secuencias de nucleótidos diana (que pueden estar presentes en un gen de interés, o dos o más genes de interés diferentes, que pueden estar presentes en el mismo cromosoma o diferentes cromosomas). En este caso, cada uno de estos módulos de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico y enzima convertidora de bases de ácido nucleico forman un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico. En el presente documento, puede usarse una enzima convertidora de bases de ácido nucleico habitual. Por ejemplo, cuando se usa un sistema CRISPR-Cas como módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico, se usa un complejo habitual de una proteína Cas y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico (incluyendo una proteína de fusión), y se producen dos o más clases de ARN quimérico de ARNtracr y cada uno de los dos o más ARN guía que forman respectivamente una cadena complementaria con diferentes secuencias de nucleótidos diana y se usan como ARN-ARNtracr guías. Por otro lado, cuando se usan motivo de dedos de cinc, efector TAL y similares como módulos de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, puede fusionarse una enzima convertidora de bases de ácido nucleico con un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a un nucleótido diana diferente.

Para expresar el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped, tal como se mencionó anteriormente, se introduce un vector de expresión que contiene un ADN que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico, o un ARN que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico en una célula huésped. Para la introducción de mutación eficiente, es deseable mantener la expresión del complejo enzimático de modificación de ácido nucleico en un nivel dado o superior durante no menos que un periodo dado. A partir de tal aspecto, la introducción de un vector de expresión que puede replicarse de manera autónoma en una célula huésped (plásmido, etc.) es fiable. Sin embargo, debido a que el plásmido, etc. son ADN foráneos, se retiran preferiblemente de manera rápida después de la introducción exitosa de mutación. Por tanto, aunque varía dependiendo de la clase de célula huésped y similares, por ejemplo, el plásmido introducido se retira de manera deseable de la célula huésped después de un lapso de 6 h - 2 días desde la introducción de un vector de expresión usando diversos métodos de retirada de plásmidos que se conocen bien en la técnica.

Alternativamente, siempre que se logre suficiente expresión de un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico para la introducción de mutación, es también preferible introducir una mutación en el ADN bicatenario de interés mediante expresión transitoria usando un vector de expresión sin capacidad de replicación autónoma en una célula huésped (por ejemplo, un vector que carece de origen de replicación que funciona en una célula huésped y/o un gen que codifica para la proteína necesaria para la replicación, etc.) o ARN.

La expresión del gen diana se suprime mientras que el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención se expresa en una célula huésped para realizar una reacción de conversión de bases de ácido nucleico. Por tanto, fue difícil editar directamente un gen esencial para la supervivencia de la célula huésped como gen diana (da como resultado efectos secundarios tales como inhibición del crecimiento del huésped, eficiencia de la introducción de mutación inestable, mutación de un sitio diferente de la diana y similares). En la presente invención, la edición directa de un gen esencial se ha conseguido de manera exitosa y eficiente produciendo una reacción de conversión de bases de ácido nucleico en una fase deseada, y expresando de manera transitoria el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped durante un periodo necesario para estabilizar la modificación del sitio seleccionado como diana. Aunque el periodo necesario para una reacción de conversión de bases de ácido nucleico y la estabilización de la modificación del sitio seleccionado como diana varía dependiendo de la clase de célula huésped, las condiciones de cultivo y similares, se considera que son necesarias generalmente 2 - 20 generaciones. Por ejemplo, cuando la célula huésped es una levadura o bacteria (por ejemplo, Escherichia coli), la expresión de un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico necesita inducirse durante 5 - 10 generaciones. Los expertos habituales en la técnica pueden determinar de manera apropiada un periodo de inducción de la expresión preferible basándose en el tiempo de duplicación de la célula huésped en las condiciones de cultivo usadas. Por ejemplo, cuando una levadura en gemación se somete a cultivo líquido en un medio inductor de galactosa al 0,02%, el periodo de inducción de la expresión es de, por ejemplo, 20 -40 h. El periodo de inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención puede extenderse más allá del “periodo necesario para establecer la modificación del sitio seleccionado como diana” mencionado anteriormente en la medida que no cause efectos secundarios a la célula huésped.

Como medio para expresar de manera transitoria el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención en una fase deseada durante un periodo deseado, puede usarse un método que comprende producir un constructo (vector de expresión) que contiene un ácido nucleico que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico (un ADN que codifica para un ARN-ARNtracr guía y un ADN que codifica para una Cas mutante y enzima de sustitución de bases de ácido nucleico en el caso del sistema CRISPR-Cas), de manera que el periodo de expresión pueda controlarse, e introducir el constructo en una célula huésped. La “manera en la que el periodo de expresión puede controlarse” es específicamente, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención colocado bajo regulación de una región reguladora inducible. Aunque la “región reguladora inducible” no está particularmente limitada, es, por ejemplo, un operón de un represor de mutación sensible a la temperatura (ts) y un operador regulado de ese modo en células de microorganismos de bacteria (por ejemplo, Escherichia coli), levadura y similares. Los ejemplos del represor de mutación ts incluyen, pero no se limitan a, mutación ts del represor de cI del fago X. En el caso del represor de cI (ts) del fago X, se une a un operador para suprimir la expresión del gen en el sentido de 3' a no más de 30°C (por ejemplo, 28°C). A una temperatura alta de no menos de 37°C (por ejemplo, 42°C), se disocia del operador para permitir la inducción de la expresión génica (figuras 13 y 14). Por tanto, el periodo cuando se suprime la expresión del gen diana puede minimizarse cultivando una célula huésped introducida con un ácido nucleico que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico generalmente a no más de 30°C, elevando la temperatura a no menos de 37°C en una fase apropiada, realizando un cultivo durante un periodo dado para llevar a cabo una reacción de conversión de bases de ácido nucleico y, después la introducción de la mutación en el gen diana, disminuyendo rápidamente la temperatura a no más de 30°C. Por tanto, incluso cuando se selecciona como diana un gen esencial para la célula huésped, puede editarse de manera eficaz mientras que se suprimen los efectos secundarios (figura 15).

Cuando se utiliza una mutación sensible a la temperatura, por ejemplo, se incluye un mutante sensible a la temperatura de una proteína necesaria para la replicación autónoma de un vector en un vector que contiene un ADN que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención. Como resultado, la replicación autónoma se vuelve rápidamente imposible después de la expresión del complejo enzimático de modificación de ácido nucleico, y el vector decae de manera natural durante la división celular. Los ejemplos de proteína mutante sensible a la temperatura incluyen, pero no se limitan a, un mutante sensible a la temperatura de Rep101 ori necesario para la replicación de pSC101 ori. Rep101 ori (ts) actúa sobre pSC101 ori para permitir la replicación autónoma del plásmido a no más de 30°C (por ejemplo, 28°C), pero pierde la función a no menos de 37°C (por ejemplo, 42°C), y el plásmido no puede replicarse de manera autónoma. Por tanto, un uso combinado con el represor de cI (ts) del fago X mencionado anteriormente de manera simultánea permite la expresión transitoria del complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención, y la retirada del plásmido.

Por otro lado, cuando se usa una célula eucariota superior tal como una célula animal, célula de insecto, célula vegetal y similares como célula huésped, un ADN que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención que se introduce en una célula huésped bajo regulación de un promotor inducible (por ejemplo, un promotor de metalotioneína (inducido por un ion de metal pesado), promotor de proteína de choque térmico (inducido por choque térmico), promotor del sistema Tet-ON/Tet-OFF (inducido por la adición o retirada de tetraciclina o un derivado del mismo), promotor sensible a compuestos esteroideos (inducido por la hormona esteroidea o un derivado de la misma), etc.), la sustancia de inducción se añade al medio (o se retira del medio) en una fase apropiada para inducir la expresión del complejo enzimático de modificación de ácido nucleico, el cultivo se realiza durante un periodo dado para llevar a cabo una reacción de conversión de bases de ácido nucleico y, la introducción de la mutación en el gen diana, puede realizarse una expresión transitoria del complejo enzimático de modificación de ácido nucleico.

En células procariotas tales como Escherichia coli y similares, también pueden usarse promotores inducibles. Los ejemplos de tales promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotor de lac (inducido por IPTG), promotor de cspA (inducido por choque frío), promotor de araBAD (inducido por arabinosa) y similares.

Alternativamente, los promotores inducibles mencionados anteriormente también pueden utilizarse como un mecanismo de retirada de vectores cuando se usan células eucariotas superiores tales como una célula animal, célula de insecto, célula vegetal y similares como célula huésped. Es decir, se carga un vector con un origen de replicación que puede funcionar en una célula huésped, y un ácido nucleico que codifica para una proteína necesaria para la replicación del mismo (por ejemplo, VS40 ori y antígeno T grande, oriP y EBNA-1, etc., para células animales), y la expresión del ácido nucleico que codifica para la proteína se regula por el promotor inducible mencionado anteriormente. Como resultado, aunque el vector puede replicarse de manera autónoma en presencia de una sustancia de inducción, cuando se retira la sustancia de inducción, no se produce la replicación autónoma, y el vector de manera natural decae durante la división celular (por otro lado, la replicación autónoma se vuelve imposible por la adición de tetraciclina y doxiciclina en el caso del vector del sistema Tet-OFF).

La presente invención se explica a continuación mediante referencia a los siguientes ejemplos, que no se interpretan como limitativos.

[Ejemplos]

En los ejemplos mencionados a continuación 1 - 6, se realizaron ensayos de la siguiente manera.

<Línea celular, cultivo, transformación e inducción de la expresión>

Se cultivó levadura en gemación de Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741 (que requiere leucina y uracilo) en un medio YPDA o medio SD convencional con una composición de abandono que satisface la auxotroficidad. El cultivo realizado fue cultivo fijo en una placa de agar o cultivo en agitación en un medio líquido entre 25°C y 30°C. Se realizó la transformación mediante un método de acetato de litio, y se realizó la selección en medio SD que corresponde a auxotroficidad apropiada. Para determinar la inducción de la expresión por galactosa, después del cultivo previo durante la noche en un medio SD apropiado, se realizaron el cultivo en medio SR durante la noche con fuente de carbono cambiada desde el 2% de glucosa hasta el 2% de rafinosa, y un cultivo adicional en medio SGal durante de 3 h a aproximadamente dos noches con fuente de carbono cambiada del0,2 - 2% de galactosa para determinar la inducción de la expresión.

Para la medición del número de células supervivientes y la tasa de mutación de Can1, se diluyó de manera apropiada una suspensión celular, y se aplicó sobre un medio de placa con SD y medio de placa con SD-Arg+canavanina 60 mg/l o medio de placa con SD+canavanina 300 mg/l, y se contó el número de colonias que surgieron 3 días más tarde como el número células supervivientes. Usando el número de colonias supervivientes en placa con SD como el número total de células, y el número de colonias supervivientes en placa con canavanina como el número de cepa mutante resistente, se calculó y se evaluó la tasa de mutación. Se identificó el sitio de la introducción de mutación amplificando fragmentos de ADN que contenían la región del gen diana de cada cepa mediante un método de PCR de colonias, realizando secuenciación de ADN, y realizando un análisis de alineación basándose en la secuencia de la base de datos de genomas de Saccharomyces (http://www.yeastgenome.org/). <Manejo del ácido nucleico>

Se procesó o construyó ADN mediante cualquiera de método de PCR, tratamiento de enzimas de restricción, ligación, método de ensamblaje de Gibson y síntesis química artificial. Para el plásmido, se usaron como levadura vector lanzadera de Escherichia coli, pRS3l5 para la selección de leucina y pRS426 para la selección de uracilo como la estructura principal. Se amplificó el plásmido por Escherichia coli línea XL-10 gold o DH5a, y se introdujo en una levadura mediante el método de acetato de litio.

Para determinar la expresión inducible, se usó levadura en gemación pGal1/10 (SEQ ID NO: 8), que es un promotor inducible bidireccional por galactosa. En el sentido de 3' de un promotor, se añadió una señal de localización nuclear (ccc aag agg aag gtg; SEQ ID NO: 9 (PKKKRV; que codifica SEQ ID NO: 10)) al ORF del gen Cas9 de Streptococcus pyogenes que tiene un codón optimizado para expresión en eucariontes (SEQ ID NO: 5) y se unió el ORF (SEQ ID NO: 1 ó 3) del gen de desaminasa (PmCDAI de Petromyzon marinus o hAID de humano) a través de una secuencia de ligador, y se expresó como una proteína de fusión. Como secuencia de ligador, se seleccionaron y usaron en combinación ligador g S (repetición de ggt gga ggt tct; SEQ ID NO: 11 (que codifica para GGGGS; SEQ ID NO: 12)), etiqueta Flag (gac tat aag gac cacgac gga gac tac aag gat cat gat att gat tac aaa gac gat gac gat aag; SEQ ID NO: 13 (que codifica para DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK; SEQ ID NO: 14)), etiqueta Strep (tgg agc cac ccg cag ttc gaa aaa; SEQ ID NO: 15 (que codifica para WSHPQFEK; SEQ ID NO: 16)), y otros dominios. En el presente documento, particularmente, se unieron y se usaron 2xGS, dominio SH3 (SEQ ID NO: 17 y 18) y etiqueta Flag. Como terminador, se unieron terminador ADH1 de levadura en gemación (SEQ ID NO: 19) yterminador Top2 (SEQ ID NO: 20). En el método de integración de dominios, se unió el ORF del gen Cas9 al dominio SH3 a través de ligador 2xGS para proporcionar una proteína, se añadió desaminasa con secuencia de ligando de SH3 (las SEQ ID NO: 21 y 22) como otra proteína, y se unieron al promotor de Gal1/10 en ambos lados. Y se expresaron simultáneamente. Se incorporaron en el plásmido pRS315.

En Cas9, se introdujeron la mutación para convertir el 10° ácido aspártico en alanina (D10A, que corresponde a la mutación de secuencia de ADN a29c) y la mutación para convertir la 840° histidina en alanina (H840A, que corresponde a la mutación de secuencia de ADN ca2518gc) para eliminar la capacidad de escisión de cualquier lado de la cadena de ADN.

Se dispuso el ARNg como una estructura quimérica con ARNtracr (de Streptococcus pyogenes; SEQ ID NO: 7) entre el promotor de SNR52 (SEQ ID NO: 23) y el terminador Sup4 (SEQ ID NO: 24), y se incorporó en el plásmido pRS426. Como secuencia de bases diana de ARNg, se usaron el O^rF del gen CAN1, 187-206 (gatacgttctctatggagga; SEQ ID NO: 25) (diana 1), 786-805 (ttggagaaacccaggtgcct; SEQ ID NO: 26) (diana 3), 793 812 (aacccaggtgcctggggtcc; SEQ ID NO: 27) (diana 4), 563-582 (ttggccaagtcattcaattt; SEQ ID NO: 28) (diana 2) y secuencia de cadena complementaria de 767-786 (ataacggaatccaactgggc; SEQ ID NO: 29) (diana 5r). Para la determinación de la expresión simultánea de una pluralidad de dianas, usando una secuencia desde un promotor a un terminador como un conjunto, y una pluralidad de los conjuntos se incorporaron en el mismo plásmido. Se introdujeron en células junto con un plásmido de expresión de Cas9-desaminasa, se expresaron de manera intracelular, y se formó un complejo de ARNg-ARNtracr y Cas9-desaminasa.

Ejemplo 1: modificación de secuencia genómica uniendo la capacidad de reconocimiento de secuencia de ADN de CRISPR-Cas a desaminasa PmCDA1

Para someter a prueba el efecto de la técnica de modificación de secuencia genómica de la presente invención utilizando desaminasa y la capacidad de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico de CRISPR-Cas, se intentó la introducción de mutación en el gen CAN1 que codifica para el transportador de canavanina, cuyo déficit génico da como resultado una resistencia a la canavanina. Como ARNg, se usó una secuencia complementaria a 187-206 (diana 1) del ORF del gen CAN1, se construyeron un vector de expresión de ARN quimérico obtenido uniendo al mismo ARNtracr de Streptococcus pyogenes, y un vector que expresa una proteína obtenida fusionando dCas9 con actividad nucleasa alterada introduciendo mutaciones (D10A y H840A) en Cas9 (SpCas9) de Streptococcus pyogenes con PmCDA1 de Petromyzon marinus como desaminasa, se introdujeron en la levadura en gemación mediante el método de acetato de litio, y se expresaron de manera conjunta. Los resultados se muestran en la figura 2. Cuando se cultivaron sobre una placa con SD que contenía canavanina, sólo las células sometidas a introducción y expresión de ARNg-ARNtracr y dCas9-PmCDA1 formaron colonia. Se recogió la colonia resistente y se determinó la secuencia de región del gen CAN1. Como resultado, se confirmó que una mutación se introdujo en la secuencia de nucleótidos diana (diana 1) y la proximidad de la misma.

Ejemplo 2: reducción drástica de efectos secundarios-toxicidad

En la Cas9 convencional y otras nucleasas artificiales (ZFN, TALEN), la inhibición del crecimiento y la muerte celular producida probablemente por la escisión alterada del cromosoma se produce seleccionando como diana una secuencia en el genoma. El efecto de la misma es particularmente mortal para muchos microorganismos y procariotas, e impide su aplicabilidad.

Por tanto, para verificar la seguridad y la toxicidad celular de la técnica de modificación de secuencia genómica de la presente invención, se realizó una prueba comparativa con CRISPR-Cas9 convencional. Usando secuencias (dianas 3, 4) en el gen CAN1 como diana de ARNg, las células supervivientes se contaron de manera inmediata después del inicio de la inducción de la expresión por galactosa y a las 6 h después de la inducción basándose en la capacidad de formación de colonias sobre una placa con SD. Los resultados se muestran en la figura 3. En Cas9 convencional, se inhibió el crecimiento y se indujo la muerte celular, lo que disminuyó el número de células supervivientes. Por el contrario, mediante la presente técnica (nCas9 D10A-PmCDA1), las células podían continuar creciendo, y el número de células supervivientes aumentó de manera drástica.

Ejemplo 3: uso de un esquema de unión diferente

Se examinó si la mutación puede introducirse en un gen seleccionado como diana incluso cuando no se usan Cas9 y desaminasa como proteína de fusión pero cuando se forma un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico a través de un dominio de unión y un ligando del mismo. Como Cas9, se usó dCas9 usada en el ejemplo 1 y se usó AID humana en vez de PmCDA1 como desaminasa. Se fusionó el dominio SH3 con la primera, y un ligando de unión del mismo se fusionó con la última para producir diversos constructos conocidos en la figura 4. Además, se usaron las secuencias (diana 4, 5r) en el gen CAN1 como dianas de ARNg. Se introdujeron estos constructos en una levadura en gemación. Como resultado, incluso cuando se unieron dCas9 y desaminasa a través del dominio de unión, la mutación se introdujo de manera eficaz en el sitio seleccionado como diana del gen CAN1 (figura 4). La eficiencia de la introducción de mutación se mejoró de manera notable introduciendo una pluralidad de dominios de unión en dCas9. El sitio principal de introducción de mutación fue el 782° (g782c) de ORF.

Ejemplo 4: alta eficiencia y cambios en el patrón de mutación mediante el uso de nickasa

De la misma manera que en el ejemplo 1 excepto que se usó un mutante de D10A nCas9 (D10A) que escinde sólo una cadena complementaria a ARNg, o un mutante de H840A nCas9 (H840A) que escinde sólo una cadena opuesta a una cadena complementaria a ARNg en vez de dCas9, se introdujo una mutación en el gen CAN1, y se examinó la secuencia en la región del gen CAN1 de la colonia generada sobre una placa con SD que contenía canavanina. Se encontró que la eficiencia aumenta en el primero (nCas9 (D10A)) en comparación con dCas9 (figura 5), y la mutación se reúne en el centro de la secuencia diana (figura 6). Por tanto, este método permite la introducción de una posición identificada de mutación. Por otro lado, se encontró en el último (nCas9 (H840A)) que se introdujeron una pluralidad de mutaciones aleatorias en una región de varios cientos de bases del nucleótido seleccionado como diana (figura 6) junto con un aumento en la eficiencia en comparación con dCas9 (figura 5).

Una introducción similar notable de mutación pudo confirmarse incluso cuando se cambió la secuencia de nucleótidos diana. En este sistema de edición genómica usando un sistema CRISPR-Cas9 y citidina desaminasa, se confirmó tal como se muestra en la tabla 1 que la citosina presente dentro del intervalo de aproximadamente 2 - 5 pb desde el lado de 5' de la secuencia de nucleótidos diana (20 pb) se desaminó de manera preferente. Por tanto, ajustando la secuencia de nucleótidos diana basándose en esta regularidad y combinando además con nCas9 (D10A), es posible la edición genómica precisa de 1 unidad de nucleótido. Por otro lado, puede insertarse una pluralidad de mutaciones simultáneamente dentro del intervalo de aproximadamente varios cientos de pb en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana usando nCas9 (H840A). Además, la especificidad de sitio posiblemente puede variarse adicionalmente cambiando el esquema de unión de desaminasa.

Estos resultados muestran que la clase de proteína Cas9 puede cambiarse de manera apropiada según el objeto. Tabla 1

Ejemplo 5: la eficiencia aumenta de manera sinérgica seleccionando como diana una pluralidad de secuencias de ADN en la proximidad

La eficiencia aumentó de manera drástica usando simultáneamente una pluralidad de dianas en la proximidad en vez de una única diana (figura 7). De hecho, el 10 - 20% de células tenían una mutación resistente a la canavanina (dianas 3, 4). En la figura, ARNg1 y ARNg2 seleccionan como diana la diana 3 y diana 4, respectivamente. Como desaminasa, se usó PmCDA1. El efecto de la misma se confirmó que se producía no sólo cuando las secuencias se solaparon de manera parcial (dianas 3, 4), sino también cuando estaban separadas por aproximadamente 600 pb (dianas 1, 3). El efecto se encontró tanto cuando las secuencias de ADN estaban en la misma dirección (dianas 3, 4) como opuestas (dianas 4, 5) (figura 4).

Ejemplo 6: modificación genética que no requiere un marcador de selección

En cuanto a las células (dianas 3, 4) en las que se seleccionaron como diana la diana 3 y la diana 4 en el ejemplo 5, se seleccionaron de manera aleatoria 10 colonias de las que se hicieron crecer sobre una placa no seleccionada (libre de canavanina) (placa con SD que no contiene ni Leu ni Ura) y se determinaron las secuencias de la región del gen CAN1. Como resultado, se introdujo una mutación en el sitio seleccionado como diana del gen CAN1 en todas las colonias examinadas (figura 8). Es decir, puede esperarse la edición en casi todas las células expresadas seleccionando una secuencia diana adecuada según la presente invención. Por tanto, la inserción de un gen marcador y la selección, que son esenciales para la manipulación génica convencional, no son necesarias. Esto facilita y simplifica de manera drástica la manipulación génica y amplia la aplicabilidad a reproducción de cultivos y similares debido a que no se produce un organismo recombinante con ADN foráneo.

En los siguientes ejemplos, se realizaron las técnicas de ensayo compartidas en los ejemplos 1 - 6 de la misma manera que anteriormente.

Ejemplo 7: edición simultánea de una pluralidad de sitios (gen diferente)

En un método de manipulación génica general, la mutación de sólo un sitio se logra generalmente mediante un manejo debido a diversas restricciones. Por tanto, se sometió a prueba si un manejo de mutación simultánea de una pluralidad de sitios es posible usando el método de la presente invención.

Usando el ORF de las posiciones 3 a 22 del gen Ade1 de la cepa BY4741 de levadura en gemación como la primera secuencia de nucleótidos diana (Ade1, diana 5: GTCAATTACGAAGACTGAAC; SEQ ID NO: 30), y el ORF de las posiciones 767-786 (cadena complementaria) del gen Can1 como la segunda secuencia de nucleótidos diana (Can1, diana 8 (786-767; ATAACGGAATCCAACTGGGC; SEQ ID NO: 29), codificando ambos ADN para ARN quiméricos de dos clases de ARNg que contienen cada uno una secuencia de nucleótidos complementaria al mismo y ARNtracr (SEQ ID NO: 7) se colocaron en el mismo plásmido (pRS426), y se introdujeron en la cepa BY4741 junto con el plásmido nCas9 D10A-PmCDA1 que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de Cas9 mutante y PmCDA1, y se expresaron, y se verificó la introducción de mutación en ambos genes. Se cultivaron las células en un medio SD de abandono (deficiencia de uracilo y leucina; SD-UL) como base, que mantiene el plásmido. Se diluyeron de manera apropiada las células, se aplicaron sobre medio de adición con SD-UL y canavanina y se dejó que formaran una colonia. Después de 2 días de cultivo a 28°C, se observaron colonias, y se contaron la incidencia de la colonia roja debido a la mutación adel, y la tasa de supervivencia en un medio con canavanina respectivamente. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

Como fenotipo, la proporción de introducción de mutación tanto en el gen Adel como en el gen Can1 fue alta y aproximadamente del 3l%.

Luego, se sometió una colonia sobre un medio SD-UL a amplificación por PCR seguido por secuenciación. Se amplificaron las regiones que contenían el ORF de cada uno de Adel y Can1, y se obtuvo una información de secuencia de aproximadamente secuencias de 500 b que rodean la secuencia diana. Para ser específico, se analizaron 5 colonias rojas y 5 colonias blancas para encontrar la conversión de la 5° C del ORF del gen Adel en G en todas las colonias rojas y la 5° C en T en todas las colonias blancas (figura 9). Aunque la tasa de mutación de la diana es del 100%, como la tasa de mutación según el objeto de la destrucción génica, la tasa de mutación deseada es del 50% ya que es necesario que la 5° C se cambie por G para ser un codón de parada. De manera similar, en cuanto al gen Can1, se confirmó la mutación en la 782° G del ORF en todos los clones (figura 9); sin embargo, ya que sólo la mutación en C proporciona resistencia a la canavanina, la tasa de mutación deseada es del 70%. Las mutaciones deseadas en ambos genes se obtuvieron simultáneamente en el 40% de los clones (4 clones de cada 10 clones) mediante investigación, y se obtuvo prácticamente una alta eficiencia.

Ejemplo 8: edición de genoma poliploide

Muchos organismos tienen genoma diploide o poliploide. En los métodos de introducción de mutación convencionales, se introduce la mutación, en principio, en un único cromosoma homólogo para producir un genotipo heterólogo. Por tanto, no se obtiene una característica deseada a menos que no sea una mutación dominante, y hacerla homóloga requiere trabajo y tiempo. Por tanto, se sometió a prueba si la técnica de la presente invención puede introducir mutación en todos los alelos diana en el cromosoma homólogo en el genoma.

Es decir, se realizó la edición simultánea de los genes Adel y Can1 en una cepa YPH501 de levadura en gemación como cepa diploide. El fenotipo de estas mutaciones génicas (colonia roja y resistente a canavanina) es un fenotipo recesivo, y por tanto, estos fenotipos no aparecen a menos que se introduzcan ambas mutaciones del gen homólogo (mutación homóloga).

Usando el ORF de la posiciones 1173-1154 (cadena complementaria) del gen Adel (Adel, diana 1: GTCAATAGGATCCCCTTTT; SEQ ID NO: 31) o de las posiciones 3-22 (Ade1, diana 5: GTCAATTACGAAGACTGAAC; SEQ ID NO: 30) como la primera secuencia de nucleótidos diana, y el ORF de las posiciones 767-786 (cadena complementaria) del gen Can1 como la segunda secuencia de nucleótidos diana (Can1, diana 8: ATAACGGAATCCAACTGGGC; SEQ ID NO: 29), se colocaron ambos ADN que codifican para ARN quiméricos de dos clases de ARNg que contienen cada uno una secuencia de nucleótidos complementaria al mismo y ARNtracr (SEQ ID NO: 7) en el mismo plásmido (pRS426), y se introdujeron en la cepa BY4741 junto con el plásmido nCas9 D10A-PmCDA1 que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de Cas9 mutante y PmCDA1, y se expresaron, y se verificó la introducción de mutación en cada gen.

Como resultado del recuento de colonias, se encontró que cada característica de fenotipo podía obtenerse a una alta probabilidad (40% - 70%) (figura 10A).

Para confirmar la mutación, se secuenciaron la región diana de Ade1 de cada una de la colonia blanca y la colonia roja para confirmar el solapamiento de las señales de secuencia que indican una mutación heteróloga en el sitio diana de la colonia blanca (figura 10B, panel superior, las señales de G y T solapan en j). Se confirmó que estaba ausente el fenotipo en la colonia con mutación heteróloga. Por otro lado, se confirmó la mutación homóloga libre de señal de solapamiento en la colonia roja (figura 10B, panel inferior, señal de T en j).

Ejemplo 9: edición genómica en Escherichia coli

En este ejemplo, se demuestra que esta técnica funciona de manera eficaz en Escherichia coli, que es un organismo modelo de bacteria representativo. Particularmente, la técnica de edición genómica de tipo nucleasa convencional es mortal para las bacterias, y la aplicación es difícil. Por tanto, se destaca la superioridad de esta técnica. En combinación con levadura, que es una célula modelo de eucariota, se demuestra que esta técnica es ampliamente aplicable a cualquier especie independientemente de procarionte y eucarionte.

Se introdujo mutación de aminoácido de D10A y H840A (dCas9) en el gen Cas9 de Streptococcus pyogenes que contiene una región promotora bidireccional, y se construyó un constructo que va a expresarse como una proteína de fusión con PmCDAI a través de una secuencia de ligador, se incluyeron simultáneamente ARN quiméricos que codifican para una secuencia complementaria a cada una de las secuencias de nucleótidos diana en un plásmido (la secuencia de nucleótidos de longitud completa se muestra en SEQ ID NO: 32, en cuya secuencia, se introduce una secuencia complementaria a cada una de las secuencias diana en el sitio de n2o) (figura 11A).

En primer lugar, el ORF de las posiciones 426-445 (T CAA TGG GCT AAC TAC GTT C; SEQ ID NO: 33) del gen galK de Escherichia coli se introdujo como secuencia de nucleótidos diana en un plásmido, se transformaron diversas cepas de Escherichia coli (XL10-gold, DH5a, MG1655, BW25113) con el plásmido mediante el método de calcio o el método de electroporación, se añadió medio SOC, se realizó un cultivo de recuperación durante la noche, se seleccionaron células que portan plásmido del medio LB que contiene ampicilina, y se formó la colonia. Se verificó la introducción de mutación mediante secuencia directa a partir de la PCR de la colonia. Los resultados se muestran en la figura 11B.

Se seleccionó de manera aleatoria una colonia independiente (1 - 3), y se analizó la secuencia. Como resultado, la posición 427 de C del ORF se convirtió en T (clones 2, 3) a una probabilidad de no menos del 60%, y se confirmó la aparición de destrucción génica que genera un codón de parada (TAA).

Luego, con una secuencia complementaria (5-GGTCCATAAACTGAGACAGC-3'; SEQ ID NO: 34) de la región de bases 1530-1549 del ORF del gen rpoB, que es un gen esencial, como diana, se introdujo una mutación puntual particular mediante un método similar al método mencionado anteriormente para tratar de conferir una función resistente a la rifampicina para Escherichia coli. Las secuencias de colonias seleccionadas se analizaron en un medio no selectivo (ninguno), un medio que contenía rifampicina 25 |ig/ml (Rif25) y rifampicina 50 |ig/ml (Rif50). Como resultado, se confirmó que la conversión de la posición 1546 de G del ORF en A introdujo una mutación de aminoácidos desde Asp(GAC) hasta Asn(AAC), y se confirió la resistencia a la rifampicina (figura 11C, panel superior). Se añadió gota a gota una serie de diluciones de 10 veces de la suspensión celular después del tratamiento de transformación en un medio no selectivo (ninguno), un medio que contenía rifampicina 25 |ig/ml (Rif25) y rifampicina 50 |ig/ml (Rif50) y se cultivó. Como resultado, se estimó que la cepa resistente a la rifampicina se obtuvo a aproximadamente el 10% de frecuencia (figura 11C, panel inferior).

Tal como se muestra a continuación, mediante esta técnica, puede añadirse una nueva función mediante una mutación puntual particular, en vez de una destrucción génica simple. Esta técnica es superior ya que se edita directamente un gen esencial.

Ejemplo 10: ajuste del de sitio de bases de edición por la longitud del ARNg

De manera convencional, la longitud del ARNg en relación con una secuencia de nucleótidos diana era de 20 b como básica, y se usó citosina (o guanina en la cadena opuesta) en un sitio de 2 - 5 b desde el extremo 5' terminal de la misma (15 -19 b en el sentido 5' de la secuencia PAM) como diana de mutación. Se examinó si la expresión de una longitud de ARNg diferente puede desplazar el sitio de la base que va a ser la diana (figura 12A).

El ejemplo experimental realizado en Escherichia coli se muestra en la figura 12B. Se buscó un sitio que contiene muchas citosinas en el genoma de Escherichia coli, y se realizó el ensayo usando el gen gsiA, que es un supuesto transportador de ABC. Se examinó la citosina sustituida mientras que se cambiaba la longitud de la diana a 24 pb, 22 pb, 20 pb, 18 pb para encontrar que la citosina 898a, 899a se sustituyó por timina en el caso de 20 pb (longitud habitual). Cuando el sitio diana es más largo que 20 pb, las citosinas 896a y 897a también se sustituyeron, y cuando el sitio diana era más corto, las citosinas 900a y 901a también se sustituyeron. De hecho, el sitio diana pudo desplazarse cambiando la longitud del ARNg.

Ejemplo 11: desarrollo de un plásmido de edición genómica dependiente de la temperatura

Se diseño un plásmido que induce la expresión del complejo enzimático de modificación de ácido nucleico de la presente invención en condiciones de alta temperatura. Mientras se optimizaba la eficiencia controlando de manera limitativa el estado de la expresión, se aspiró a la reducción de los efectos secundarios (inhibición del crecimiento del huésped, eficiencia de la introducción de mutación inestable, mutación de un sitio diferente de la diana y similares). Simultáneamente, se pretendía una retirada simultánea y fácil del plásmido después de la edición combinando un mecanismo para cesar la replicación de plásmido a una alta temperatura. El detalle del ensayo se muestra a continuación.

Con un sistema de plásmido sensible a la temperatura pSC101-Rep101 (la secuencia de pSC101 ori se muestra en SEQ ID NO: 35, y la secuencia de Rep 101 sensible a la temperatura Rep101 se muestra en SEQ ID NO: 36) como estructura principal, se usó un sistema de represor de X sensible a la temperatura (cI857) para determinar la inducción de la expresión. Para determinar la edición genómica, se introdujo una mutación G113E que confiere resistencia a RecA en el represor deX, para asegurar la función normal incluso bajo la respuesta SOS (SEQ ID NO: 37). Se unió dCas9-PmCDA1 (SEQ ID N^o: 38) al operador derecho (SEQ ID NO: 39), y se unió ARNg (SEQ ID NO: 40) en el sentido de 3' en el operador izquierdo (SEQ ID NO: 41) para regular la expresión (la secuencia de nucleótidos de longitud completa del vector de expresión construido se muestra en SEQ ID NO: 42). Durante el cultivo a no más de 30°C, se suprimió la transcripción de ARNg y la expresión de dCas9-PmCDA1, y las células pueden crecer normalmente. Cuando se cultivó a no menos de 37°C, se indujo la transcripción de ARNg y la expresión de dCas9-PmCDA1, y se suprimió la replicación del plásmido simultáneamente. Por tanto, se suministró de manera transitoria un complejo enzimático de modificación de ácido nucleico necesario para la edición genómica, y el plásmido puede retirarse fácilmente después de la edición (figura 13).

El protocolo específico de la sustitución de bases se muestra en la figura 14.

La temperatura del cultivo para la construcción del plásmido se establece a aproximadamente 28°C, y se establece en primer lugar una colonia de Escherichia coli que retiene el plásmido deseado. Luego, se usa directamente la colonia, o después de la extracción del plásmido cuando se cambia la cepa, se realiza la transformación con la cepa diana de nuevo, y se usa la colonia. Se realiza el cultivo líquido a 28°C durante la noche. Después de eso, se diluye la colonia con el medio, se realiza el cultivo de inducción a 42°C durante de 1 ha durante la noche, se diluye de manera apropiada la suspensión celular y se siembra en superficie o se añade gota a gota sobre una placa para conseguir una única colonia.

Como ensayo de verificación, se realizó la introducción de mutación puntual en un gen rpoB esencial. Cuando rpoB, que es uno de los factores que constituyen la ARN polimerasa, se deleciona o se pierde su función, la Escherichia coli no sobrevivirá. Por otro lado, se sabe que la resistencia al antibiótico rifampicina (Rif) se consigue cuando la mutación puntual se introduce en un sitio particular. Por tanto, con el objetivo de dicha introducción de la mutación puntual, se selecciona un sitio diana y se realiza el ensayo.

Los resultados se muestran en la figura 15. En el panel izquierdo superior, la parte izquierda muestra una placa con LB (adición de cloramfenicol), y la parte derecha muestra una placa con ^lB con rifampicina añadida (adición de cloramfenicol), y se prepararon muestras con o sin cloramfenicol y se cultivaron a 28°C o 42°C. Cuando se cultivan a 28°C, la tasa de resistencia a Rif es menor; sin embargo, cuando se cultivan a 42°C, se obtuvo resistencia a la rifampicina con una eficiencia muy alta. Cuando se secuenciaron las colonias (sin selección) obtenidas sobre LB mediante 8 colonias, se sustituyó la 1546° guanina (G) por adenina (A) en no menos del 60% de la cepa cultivada a 42°C (paneles izquierdos inferior y superior). Está claro que la base también se sustituye de manera completa en el espectro de secuencias real (panel derecho inferior).

De manera similar, se realizó la sustitución de bases de galK, que es uno de los factores implicados en el metabolismo de la galactosa. Debido a que el metabolismo de la 2-desoxi-galactosa (2DOG), que es un análogo de la galactosa, por galK es mortal para Escherichia coli, ésta se usó como método de selección. Se estableció el sitio diana de manera que se induce una mutación de cambio de sentido en la diana 8, y se introduce el codón de parada en la diana 12 (figura 16, parte inferior derecha).

Los resultados se muestran en la figura 16. En los paneles superior izquierdo e inferior izquierdo, la parte izquierda muestra una placa con LB (adición de cloramfenicol), y la parte derecha muestra una placa con LB con 2-DOG añadida (adición de cloramfenicol), y se prepararon muestras con o sin cloramfenicol y se cultivaron a 28°C o 42°C. En la diana 8, se produjo ligeramente sólo una colonia sobre una placa con adición de 2-DOG (panel superior izquierdo), se secuenciaron 3 colonias sobre LB (marco rojo) para determinar que la 61a citosina (C) se sustituyó por timina (T) en todas las colonias (parte superior derecha). Esta mutación se supone que es insuficiente para perder la función de galK. Por otro lado, en la diana 12, se obtuvo la colonia sobre una placa con adición de 2-DOG mediante cultivo a 28°C y 42°C (panel inferior izquierdo). Se secuenciaron 3 colonias sobre LB para determinar que la 271a citosina se sustituyó por timina en todas las colonias (parte inferior derecha). Se demostró que la mutación también puede introducirse de manera estable y muy eficaz en dichas diferentes dianas.

[Aplicabilidad industrial]

La presente invención hace posible introducir de manera segura una mutación específica de sitio en cualquier

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de modificación de un sitio seleccionado como diana de un ADN bicatenario, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo que comprende un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario dado unido a una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, con dicho ADN bicatenario, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en uno o más de otros nucleótidos o delecionar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en dicho sitio seleccionado como diana, en el que el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas, en el que el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas que tiene actividad nickasa capaz de escindir sólo una de las cadenas del ADN bicatenario, en el que el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, y en el que el método no es un método para modificar la identidad genética de línea germinal de seres humanos.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la Cas es una Cas9 en el que el 10° residuo de Asp se convierte en un residuo de Ala o el 840° residuo de His se convierte en un residuo de Ala.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, que usa dos o más clases de módulos de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une cada uno específicamente a una secuencia de nucleótidos diana diferente.

4. Método según la reivindicación 3, en el que las secuencias de nucleótidos diana diferentes están presentes en genes diferentes.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enzima convertidora de bases de ácido nucleico es una desaminasa, preferiblemente una citidina desaminasa.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo introduciendo un ácido nucleico que codifica para el complejo en una célula que tiene el ADN bicatenario.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la célula es una célula procariota.

8. Método según la reivindicación 6, en el que la célula es una célula microbiana.

9. Método según la reivindicación 6, en el que la célula es una célula eucariota, preferiblemente una célula vegetal, una célula de insecto o una célula animal.

Método según la reivindicación 9, en el que la célula animal es una célula de vertebrado, preferiblemente una célula de mamífero.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la célula es una célula poliploide, y se modifican todos los sitios seleccionados como diana en alelos en cromosomas homólogos.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, que comprende una etapa de introducir un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para el complejo en una forma que permite el control de un periodo de expresión en la célula, y una etapa de inducir la expresión del ácido nucleico durante un periodo necesario para fijar la modificación del sitio seleccionado como diana en el ADN bicatenario.

13. Método según la reivindicación 12, en el que la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario está presente en un gen esencial para la célula.

Complejo enzimático de modificación de ácido nucleico que comprende un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario dado unido a una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y el módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas, en el que el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas que tiene actividad nickasa capaz de escindir sólo una de las cadenas del ADN bicatenario, complejo que convierte uno o más nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en uno o más de otros nucleótidos o deleciona uno o más nucleótidos, o inserta uno o más nucleótidos en dicho sitio seleccionado como diana.

15. Ácido nucleico que codifica para el complejo enzimático de modificación de ácido nucleico según la reivindicación 14.