KR20210121092A - 유전자 편집 방법 - Google Patents

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KR20210121092A
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데이비드 더블유. 러셀
프랑수아즈 제이. 해셀러
다와닐 달와디
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유니버시티 오브 워싱턴
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Abstract

본원에는 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계를 수반하는 세포에서 유전자를 편집하는 방법, 뿐만 아니라 편집된 세포 및 그의 사용 방법이 개시된다.

Description

유전자 편집 방법
상호 참조
본 출원은 2019년 1월 29일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/798357호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 자금 후원서
본 발명은 미국 국립보건원(NIH)에서 수여한 보조금 번호 R01 DK055759 하에 정부 지원으로 이루어졌다.　 정부는 발명에 대한 특정 권리가 있다.
발명의 분야
본 발명은 유전자 편집 방법, 편집된 세포의 생산 및 이들의 사용 방법에 관한 것이다.
복제 분기점(RF)은 헬리카제 및 DNA 합성 활성을 갖는 다중단백질 복합체이다. 복제 분기점은 2 개의 분지 "갈래"를 가지며, 각각은 DNA의 단일 가닥을 구성한다. 이들 두 가닥은 선도(leading) 및 지연(lagging) 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 역할을 한다. 복제 헬리카제는 2 개의 ssDNA 주형을 노출시키는 모체 듀플렉스 DNA를 풀어준다. DNA 폴리머라제는 DNA 합성을 수행한다. 듀플렉스 DNA의 역평행 성질 때문에, DNA 복제는 복제 분기점에서 2 개의 새로운 가닥 사이에 반대 방향으로 발생한다. DNA 합성은 DNA 폴리머라제에 의해 매개된다. 이동 복제 분기점과 동일한 방향으로 합성된 가닥인 선도 가닥은 연속적으로 복제되는 반면, 반대 방향으로 합성된 가닥인 지연 가닥은 불연속적으로 복제된다. 복제 분기점과 연관된 수많은 단백질의 조정되고 조절된 활성은 DNA 복제를 매개한다. (Waga and Stillman, 1998, Annu. Rev. Biochem. 67:721-51 및 Burgers and Kunkel, 2017 Annu.Rev. Biochem. 86: 417-438에서 검토됨)
본 발명은 세포에서 복제 분기점 기능을 조절하는 단계, 및 세포에서 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 세포에서 유전자를 편입하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 방법은 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 방법은 세포를 유전자 편집 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 유전자 편집 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴이다. 특정 구현예에서, 에메틴은 1 nM 내지 100,000 nM, 예를 들어, 10 nM 내지 10,000 nM, 100 nM - 10,000 nM, 200 nM -10,000 nM, 300 nM - 10,000 nM, 400 nM - 10,000 nM, 500 nM 내지 10,000 nM, 또는 100 nM 내지 10,000 nM, 또는 100 nM 내지 1000 nM, 예를 들어, 100 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM 또는 950 nM, 또는 1000 nM 내지 10,000 nM, 예를 들어, 1000 nM, 2000 nM, 3000 nM, 4000 nM, 5000 nM, 6000 nM, 7000 nM, 8000 nM, 9000 nM 및 10,000 nM의 농도로 사용된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 siRNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 shRNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 기능은 DNA 합성이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 방법은 복제 분기점 단백질의 기능 또는 발현 수준을 조절하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 DNA 폴리머라제 α, DNA 프리마제, RNA 프리마제, DNA 폴리머라제 ε, DNA 폴리머라제 δ, 분기점 보호 복합체(FPC) 성분 Timeless, Tipin, Claspin 및 And1, Cdc45, MCM 2-7(미니 염색체 유지) 헬리카제 2-7 육량체 단백질(Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6 및 Mcm7), GINS(go-ichi-ni-san) 복합 단백질(Sld5, Psf1, Psf2 및 Psf3), 복제 단백질 A(RPA), 복제 인자 C 클램프 로더(RFC) 단백질(Rfc1, Rfc2, Rfc3, Rfc4, 및 Rfc5), RMI1 단백질, ATR 키나제, ATR-상호작용 단백질(ATRIP), RecQ 헬리카제 단백질(RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5), 불일치 복구(MMR) 단백질(PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6), 증식 세포 핵 항원(PCNA), DNA 리가제, Flap 엔도뉴클레아제 1(FEN1), 후기 촉진 복합체 서브유닛 5, RecQ-매개된 게놈 불안정성 단백질 1, 기원 인식 복합체 서브유닛 1, 호메오박스 단백질 Meis2, DNA 토포이소머라제 III 알파, DNA 폴리머라제 엡실론 4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 방법은 DNA 복제에 수반되는 단백질, 예를 들어, FANCM 단백질의 기능 또는 발현 수준을 조절하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RecQ 헬리카제 단백질(RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5), MMR 단백질(PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6), 및 PCNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PCNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 에메틴이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 siRNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 shRNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 에메틴이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 siRNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 shRNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 복제 분기점 조절제는 에메틴이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PCNA이고 복제 분기점 조절제는 siRNA이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PCNA이고 복제 분기점 조절제는 shRNA이다.
또 다른 구현예에서, 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 및 배아 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 세포는 영장류 세포이다.
또 다른 구현예에서, 세포는 분화된 세포이다.
또 다른 구현예에서, 세포에서의 유전자 편집 효율은 복제 분기점 조절제와 접촉되지 않은 세포에서의 유전자 편집 효율보다 더 크다.
본 발명은 또한 세포에서 유전자를 편집하기 전에 일정 기간 동안 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계, 및 세포에서 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 세포에서 유전자를 편집하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 일정 기간은 약 8 시간 내지 약 7 일이다.
본 발명은 또한 유전자 편집 동안 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 유전자를 편집하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포에서 유전자를 편집한 후에 일정 기간 동안 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계, 및 세포에서 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 세포에서 유전자를 편집하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 방법은 세포를 유전자 편집 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 유전자 편집 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다.
본 발명은 또한 유전자 편집 벡터를 대상체에게 투여하는 단계; 및 복제 분기점 조절제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 세포에서 유전자를 편집하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 유전자 편집 벡터가 투여된 후에 투여된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 유전자 편집 벡터가 투여되기 전에 투여된다.
또 다른 구현예에서, 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 합성 조절제는 동시에 투여된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 유전자 편집 벡터는 AAV 벡터이다.
본 발명은 또한 세포에서 유전자를 편집하는 단계; 및 일정 기간 동안 유전자 편집된 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 유전자를 편집하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 방법은 세포를 유전자 편집 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 유전자 편집 벡터는 AAV 벡터이다.
본 발명은 또한 유전자 편집된 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공하며 여기서 세포의 집단은 세포에서의 복제 분기점 기능을 복제 분기점 조절제로 조절함으로써 수득된다.
일 구현예에서, 세포의 집단에서 유전자 편집 효율은 세포에서 복제 분기점 기능을 조절하지 않은 채로 유전자 편집된 제2 세포의 집단에서 보다 더 크다.
일 구현예에서, 방법은 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성 억제제이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RecQ 헬리카제 단백질(RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5), MMR 단백질(PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6), 및 PCNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PCNA이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 에메틴이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 siRNA이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 shRNA이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 에메틴이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 siRNA이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMR 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 shRNA이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PCNA이고 복제 분기점 조절제는 에메틴이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PCNA이고 복제 분기점 조절제는 siRNA이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PCNA이고 복제 분기점 조절제는 shRNA이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 세포는 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 및 배아 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 세포는 영장류 세포이다.
또 다른 구현예에서, 세포는 분화된 세포이다.
또 다른 구현예에서, 방법은 하나 이상의 복제 분기점 조절제, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 개 이상을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 복제 분기점 조절제 예를 들어, shRNA와 조합된 에메틴, 또는 siRNA와 조합된 에메틴, 또는 shRNA 및 siRNA와 조합된 에메틴 또는 siRNA와 조합된 shRNA를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 하나 이상의 복제 분기점 조절제, 예를 들어 shRNA와 조합된 선도 가닥 합성 억제제, siRNA와 조합된 선도 가닥 합성 억제제, shRNA 및 siRNA와 조합된 선도 가닥 합성 억제제, 또는 지연 가닥 합성 억제제와 조합된 선도 가닥 합성 억제제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 하나 이상의 복제 분기점 조절제, 예를 들어 shRNA와 조합된 지연 가닥 합성 억제제, siRNA와 조합된 지연 가닥 합성 억제제 또는 shRNA 및 siRNA와 조합된 지연 가닥 합성 억제제를 포함한다.
본 발명은 또한 유전자 편집 벡터 및 외인성 복제 분기점 조절제를 포함하는 세포, 및 이로부터 유래되거나 또는 분화된 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 유전자 편집 벡터는 AAV 벡터이다.
본 발명은 또한 유전자 변형 및 외인성 복제 분기점 조절제를 포함하는 세포, 및 이로부터 유래되거나 또는 분화된 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성 활성제 또는 선도 가닥 합성 억제제이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성 활성제 또는 지연 가닥 합성 억제제이다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 이식하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 비제한적인 예 및 하기 도면을 참조하여 하기에 추가로 기재된다.
도 1은 인간 복제 분기점의 개략도이다.
도 2는 마우스 Hepa1-6 세포에서 유전자 편집에 대한 에메틴의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 마우스 간에서 생체내 유전자 편집에 대한 에메틴의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 유전자 편집에 대한 siRNA에 의한 RecQ 헬리카제 단백질의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 유전자 편집에 대한 shRNA에 의한 RecQ 헬리카제 단백질의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 유전자 편집에 대한 shRNA에 의한 RecQ 헬리카제 단백질의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 유전자 편집에 대한 siRNA에 의한 불일치 복구(MMR) 단백질의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 유전자 편집에 대한 siRNA에 의한 불일치 복구(MMR) 단백질 조합의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 유전자 편집에 대한 shRNA에 의한 PCNA의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따라 유용한 벡터((A) shRNA 벡터, (B) AAV-mAlb-GFP, (C) AAV-mAlb-루시퍼라제), (D) AAV-HPe3(AAV2-HPe3) 및 (E) AAV2-HSN5' 및 MLV-LHSN63Δ530을 나타낸다.
본 발명은 적어도 부분적으로 복제 분기점 조절제의 사용에 의해 복제 분기점과 연관된 단백질, 또는 복제 분기점과 연관된 단백질을 암호화하는 유전자의 활성 또는 발현을 조절하거나, 또는 유전자 편집을 조절하는 단계를 포함하는 유전자 편집 방법에 관한 것이다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "유전자 편집" 또는 "유전적 조작"은 예를 들어, 특정 질환 또는 장애와 연관된 바람직하지 않은 유전적 돌연변이를 복구하기 위해 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환, 대체 또는 변경에 의한 표적 DNA 서열의 변형을 의미한다. 유전자를 편집하면 발현되지 않거나, 편집되지 않은 유전자의 발현 수준보다 더 크거나 또는 더 낮은 수준으로 발현되거나, 야생형 단백질을 생산하지 못하거나, 단백질의 돌연변이체 형태를 생산하거나 또는 편집되지 않은 유전자와 비교하여 상이한 시간 또는 상이한 환경에서 발현되는 유전자를 초래할 수 있다. 유전자 편집 벡터는 세포에서 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있다.
"편집된 세포"는 편집 이벤트가 발생한 세포이다. 구현예에서, "편집된 세포"는 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제와 접촉된 세포를 포함한다. 구현예에서, "편집된 세포"는 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제를 포함하는 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, "편집된 세포"는 또한 복제 분기점 조절제 또는 유전자 편집 벡터를 포함하는 세포를 포함한다. 추가 구현예에서, "편집된 세포"는 또한 편집 이벤트가 발생한 세포로부터 유래되거나 또는 분화된 세포이다. 세포는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 편집 벡터의 도입에 의해 유전자 편집될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "복제 분기점 조절제"는 복제 분기점 기능, 예를 들어, DNA 합성 또는 DNA 이중 나선의 풀림을 조절하는 제제를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "조절"은 증가 또는 감소를 의미한다. 구현예에서, "복제 분기점 조절제"는 단백질, 또는 상응하는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 조절하는 제제를 포함하며, 여기서 단백질은 복제 분기점과 연관되어 있다. 복제 분기점 조절제는 단백질, 또는 상응하는 유전자의 발현 수준, 또는 단백질의 활성 수준을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 발현 또는 활성 수준을 직접적으로 조절한다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 예를 들어, 단백질을 직접적으로 조절하여 결과적으로 복제 분기점과 연관된 단백질의 발현 또는 활성 수준을 직접적으로 조절함으로써 발현 또는 활성 수준을 간접적으로 조절한다.
구현예에서, 복제 분기점 조절제는 세포에서 유전자 편집 활성을 조절한다. 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 세포에 들어가는 유전자 편집 벡터의 양을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 세포에서 유전자 편집 벡터의 안정성을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 표적 유전자좌에서 벡터 및 상동 염색체 서열 사이의 상동 쌍형성 수준을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 벡터 및 표적 유전자좌 사이의 재조합을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 DNA 복구 합성 과정을 증가 또는 감소시키며 여기서 벡터 서열은 염색체의 반대 가닥으로 카피된다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 염색체 표적 유전자좌에서 부위 특이적 이중 가닥 절단의 형성을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 이중 가닥 절단에서 상동성 지정 복구 및/또는 비-상동 말단 연결을 증가 또는 감소시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "활성화시키다" 또는 "증가시키다"는 발현 또는 활성 수준을 지칭할 때 대조군 활성 또는 발현 수준과 비교하여 예를 들어 2-배 이상, 예를 들어, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배 이상 증가를 의미한다. 활성화시키다 또는 증가시키다는 또한 대조군 활성 또는 발현 수준과 비교하여 5% 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 증가를 의미한다. 예를 들어, 복제 분기점 활성 수준은 복제 분기점 조절제의 부재 하에 복제 분기점 활성 수준과 비교하여 복제 분기점 조절제의 존재 하에 증가될 수 있다. 또 다른 예에서, 세포에서 유전자 편집 활성 수준은 복제 분기점 조절제의 부재 하에 세포에서 유전자 편집 활성 수준과 비교하여 복제 분기점 조절제의 존재 하에 증가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "억제하다" 또는 "감소시키다"는 발현 또는 활성 수준을 지칭할 때 대조군 활성 또는 발현 수준과 비교하여 예를 들어 2-배 이상, 예를 들어, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배 이상 감소를 의미한다. 억제하다는 또한 대조군 활성 또는 발현 수준과 비교하여 5% 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 15% 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 감소를 의미한다. 억제는 또한 발현 또는 활성이 검출가능하지 않도록 하는 완전 억제를 의미한다. 예를 들어, 복제 분기점 활성 수준은 복제 분기점 조절제의 부재 하에 복제 분기점 활성 수준과 비교하여 복제 분기점 조절제의 존재 하에 억제될 수 있다. 또 다른 예에서, 유전자 편집 활성 수준은 복제 분기점 조절제의 존재 하에 세포에서 유전자 편집 활성 수준과 비교하여 복제 분기점 조절제의 부재 하에 억제될 수 있다.
특정 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 발현 또는 활성 수준을 "특이적으로 조절한다". 특이적으로 조절하는 복제 분기점 조절제는 특정한 발현 또는 활성 수준을 증가 또는 감소시키지만 또 다른 발현 또는 활성 수준에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 구현예에서, 복제 분기점와 연관된 활성, 예를 들어 지연 가닥 합성을 특이적으로 억제하는 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성을 억제하지만 선도 가닥 합성에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, 복제 분기점과 연관된 활성, 예를 들어 지연 가닥 합성을 특이적으로 증가시키는 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성을 증가시키지만 선도 가닥 합성에 유의하게 영향을 미치지 않는다.
특정 구현예에서, 복제 분기점와 연관된 유전자 또는 단백질, 예를 들어, DNA pol δ의 발현 수준을 "특이적으로 조절하는" 복제 분기점 조절제는 DNA pol δ의 수준을 조절하고 복제 분기점와 연관된 또 다른 유전자 또는 단백질의 발현 수준에 유의하게 영향을 미치지 않는다.
본 발명에 따라 유용한 복제 분기점 조절제는 소분자, 단백질, 펩티드 및 핵산, 예를 들어, 앱타머, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 신호 간섭 DNA(siDNA)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 RecQ 헬리카제 단백질, 증식 세포 핵 항원 또는 불일치 복구 단백질에 특이적인 siRNA 또는 shRNA이다. 일 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염이다. 본 발명에 따라 유용한 추가의 복제 분기점 조절제는 복제 분기점 활성에 수반되는 복제 분기점과 연관된 단백질에 대해 지정된 단클론 항체, 이중특이적 T-세포 관여제, 서열 특이적 후생적 조절제, 예를 들어, 염색질 변형제에 연결된 Cas9-기반 분자, 표적화된 단백질 분해 시스템(예를 들어, 유비퀴틴 시스템), 및 복제 분기점 단백질 유전자를 제어하기 위한 유도성 조절 발현 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구현예에서, "조성물"은 유전자 편집 벡터 및/또는 복제 분기점 조절제를 포함한다. 구체적 구현예에서, 조성물은 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 복제 분기점 조절제 또는 유전자 편집 벡터를 포함하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 편집된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서 조성물은 편집된 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 편집된 세포로부터 유래되거나 또는 분화된 세포를 포함한다. "조성물"은 본 발명의 조성물을 포함하는 제형을 포함할 수 있다.
세포를 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "접촉시키는" 또는 "접촉시키다"는 본 발명의 조성물이 세포와 충분히 근접하게 하고/하거나 직접 접촉하게 하는 임의의 수단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 접촉시키다는 본 발명의 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 것을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 접촉시키다는 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포의 집단"은 2 개 이상의 세포(들)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자 편집 효율"은 유전자 편집의 수준, 예를 들어, 세포에서 편집 이벤트의 수, 편집 이벤트의 빈도, 세포의 집단에서 편집된 세포의 수, 또는 세포 또는 세포의 집단에서 발생하는 편집 속도를 의미한다.
유전자 편집 효율에서의 증가는 대조군 유전자 편집 수준과 비교하여 2-배 이상, 예를 들어, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배 이상의 증가일 수 있다. 증가는 또한 대조군 유전자 편집 수준과 비교하여 5% 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 15% 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 증가를 의미한다.
일 구현예에서, 유전자 편집 효율에서의 증가는 복제 분기점 조절제 및 유전자 편집 벡터와 접촉되지 않은 대조군 세포, 유전자 편집 벡터와 접촉되지만 복제 분기점 조절제와 접촉되지 않은 세포, 복제 분기점 조절제와 접촉되지만 유전자 편집 벡터와 접촉되지 않은 세포에서의 유전자 편집 효율과 비교하거나 또는, 미리 결정된 대조군 유전자 편집 수준과 비교하여 증가된다.
"대상체"란 유기체를 의미한다. 구현예에서, 대상체는 본 발명의 조성물의 공여자 또는 수용자, 또는 이로부터 유래되거나 또는 분화된 자손이다. "대상체"는 또한 유전자 편집을 필요로 하는 유기체를 지칭한다. "대상체"는 또한 본 발명의 세포가 투여될 수 있는 유기체를 지칭한다. "대상체"는 또한 복제 분기점 조절제 및/또는 유전자 편집 벡터가 투여되는 유기체를 지칭한다. 대상체는 인간 또는 인간 세포를 포함한 포유동물 또는 포유류 세포일 수 있다. 용어 "대상체"는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. "대상체"는 본 발명의 방법에 따라 치료되거나 또는 약제학적 약물 개발 목적을 위해 스크리닝될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에 따른 대상체는 본 발명에 따른 질환에 대한 치료적 또는 예방적 치료를 필요로 하거나, 또는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 또는 다른 환자를 포함한다.
본 발명의 다양한 방법론은 값, 수준, 특징, 특성, 및/또는 속성을 "대조군과 비교하는 것을 수반하는 단계를 포함한다. "대조군"은 비교 목적에 유용한 당업자에게 친숙한 임의의 대조군 또는 표준일 수 있다. 일 구현예에서, "대조군"은 본원에 기재된 바와 같이, 세포에서 유전자를 편집하는 방법을 수행하기 전에 결정된 값, 수준, 특징, 특성, 속성 등이다. 예를 들어, 세포의 집단에서 편집의 발생, 편집 이벤트의 수, 편집의 효율 및 편집된 세포의 수는 복제 분기점 조절제 및/또는 유전자 편집 벡터를 세포에 도입하기 전에, 또는 복제 분기점 조절제 및/또는 유전자 편집 벡터의 부재 하에 결정될 수 있다. "대조군"은 또한 복제 분기점 조절제의 부재 하에 편집된 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, "대조군"은 예를 들어, 정상 형질을 나타내는 세포 또는 유기체, 예를 들어 대조군 또는 정상 세포 또는 유기체에서 결정된 값, 수준, 특징, 특성, 속성 등이다. 또한 또 다른 구현예에서, "대조군"은 복제 분기점 조절제 및/또는 유전자 편집 벡터의 첨가 전에 결정된 미리 정의된 값, 수준, 특징, 특성, 속성 등이다.
따라서, "대조군 대상체"는 본 발명에 따라 치료받은 대상체와 비교되는 대상체를 지칭할 수 있다. "대조군 대상체"는 질환 또는 병태로 진단되거나 또는 질환 또는 병태에 대해 치료되지 않을 수 있다. "대조군 대상체"는 또한 질환 또는 병태가 발생할 위험이 없는 대상체를 지칭할 수 있다. "대조군 대상체"는 또한 본 발명에 따른 세포가 투여되지 않은 대상체를 지칭할 수 있다. "대조군 대상체"는 또한 복제 분기점 조절제 및/또는 편집 벡터로 치료받지 않은 대상체를 지칭할 수 있다.
"대조군 세포"는 유전자 편집 벡터 및/또는 복제 분기점 조절제와 접촉된 세포와 비교되는 세포를 지칭할 수 있다. "대조군 세포"는 유전자 편집 벡터 및/또는 복제 분기점 조절제와 접촉되지 않았을 수 있다. "대조군 세포"는 대조군인 세포와 비교하여, 투여량, 시간 길이 등을 포함한 상이한 조건 하에 유전자 편집 벡터 및/또는 복제 분기점 조절제와 접촉되었을 수 있다.
본 발명의 방법은 편집 이벤트가 발생한 세포 뿐만 아니라 편집 이벤트가 발생한 세포로부터 유래되거나 또는 분화된 세포를 제공하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 편집된 세포는 복제 분기점 조절제 또는 유전자 편집 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 복제 분기점 조절제 및 유전자 편집 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 방법은 유전자 편집 이벤트의 빈도가 증가된 세포의 집단, 및 편집된 세포의 수가 증가된 세포의 집단을 제공한다. 방법은 또한 편집된 세포를 생성하는 보다 효율적인 수단을 제공한다. 본 발명의 세포는 증상의 완화, 또는 질환의 치료 또는 이식에 유용하다.
유전자 편집
세포는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 편집 벡터의 도입에 의해 유전자 편집될 수 있다. 본 발명에 따른 유용한 유전자 편집 벡터는 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 파보바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
비-바이러스 벡터는 플라스미드 벡터, 예를 들어, pORT, pCOR, pFAR, 미니서클 플라스미드, 미니벡터 플라스미드, 미니노트 플라스미드, 및 MIDGE, MiLV 및 미니스트링 플라스미드를 포함하나 이에 제한되지 않는다(Hardee 등 2017, Genes, 8: 65 참조). 유전자 편집을 위해 유전적 물질을 세포에 도입하기 위한 추가의 비-바이러스 벡터 시스템/방법은 물리적 방법(바늘 투여, 발사체성 DNA, 전기천공, 초음파천공, 광천공, 자기주입, 수소천공, 기계적 마사지), 화학적 담체(인산칼슘, 실리카, 금, 양이온성 지질, 지질 나노 에멀젼, 고체 지질 나노입자 및 펩티드 기반 전달 방법) 및 중합체 기반 벡터(폴리에틸렌이민, 키토산, 폴리(DL-락티드) 및 폴리(DL-락티드-co-글리코시드), 덴드리머 및 폴리메타크릴레이트)를 포함한다(Ramamoorth 등 J. Clinical and Diagnostic Res., 2015, 9: 1-6 참조). DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드가 또한 유전자 전달에 유용하다.
CRISPR 기반 방법이 또한 유전자 편집에 유용하다.
유전자 편집은 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 유전자 표적화 방법(Inoue 등, 1999, J. Virology, 73: 7376-7380 및 Khan 등, 2011, Nature Protocols, 6: 482-501 참조), 예를 들어, AAV-mAlb-GFP, AAV-HPe3, AAV2-HSN5', 및 AAV-Alb-루시퍼라제를 사용하여 수행될 수 있다(도 10 참조). 본 발명에 따라 유용한 다른 AAV 벡터가 당업계에 알려져 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 유전자를 편집하는 생체내 방법을 제공한다.
적절한 대상체는 복제 분기점 조절제 및 유전자 편집 벡터로 별도로 또는 동시에 치료될 수 있다.
본 발명은 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제를 둘 다 포함하는 단일 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 유전자를 편집하는 생체내 방법을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 유전자 편집 벡터를 포함하는 제1 조성물 및 복제 분기점 조절제를 포함하는 제2 조성물을 동시에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 유전자를 편집하는 생체내 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 편집 벡터를 포함하는 제1 조성물을 대상체에게 순차적으로 투여하고, 복제 분기점 조절제를 포함하는 제2 조성물을 별도로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 유전자를 편집하는 생체내 방법을 제공한다. 일 구현예에서 유전자 편집 벡터를 포함하는 조성물은 복제 분기점 조절제를 포함하는 조성물의 투여 전에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제를 포함하는 조성물은 유전자 편집 벡터를 포함하는 조성물의 투여 전에 투여된다. 구현예에서 유전자 편집 벡터를 포함하는 조성물이 투여될 수 있고, 일정 기간 후에, 복제 분기점 조절제를 포함하는 조성물이 투여된다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제를 포함하는 조성물이 투여되고, 일정 기간 후에, 유전자 편집 벡터를 포함하는 조성물이 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, "일정 기간"은 15 분 이상, 예를 들어, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간 내지 24 시간, 예를 들어, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24 시간 이상일 수 있다. 일정 기간은 또한 10-20 시간, 12-18 시간, 12-15 시간, 15 내지 18 시간, 8-10 시간 또는 10-12 시간을 포함한다. 특정 구현예에서, 일정 기간은 2 일 이상, 예를 들어, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 20 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 30 일 또는 31 일 이상이다.
복제 분기점 조절제 및/또는 유전자 편집 벡터는 한 번 또는 여러 번 투여될 수 있다. 복제 분기점 조절제 및 유전자 편집 벡터는 임의의 알려진 방법, 예를 들어 "투여량 및 투여 방식"이라는 제목의 섹션에서 하기 기재된 바와 같이 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 유전자 편집 벡터 및/또는 복제 분기점 조절제는 세포에서 투여된다. 다른 구현예에서, 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제는 세포에서 투여되지 않는다.
본 발명의 방법은 임의의 관심 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있다.
주요 조직적합성 복합체(MHC)는 백혈구와 다른 백혈구 또는 다른 세포의 상호작용을 매개하는 모든 척추동물에서 발견되는 세포 표면 다중 성분 분자이다. MHC 유전자 계열은 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III의 세 그룹으로 나눠진다. 인간에서, MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로서 지칭된다. 클래스 I 분자는 α 쇄(또는 중쇄) 및 β2 마이크로글로불린(B2M)으로 이루어지는 반면, 클래스 II 분자는 2 개의 상동 서브유닛인 알파 서브유닛 및 베타 서브유닛으로 이루어진다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 또는 클래스 II- 관련 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 B2M 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있다.
HLA 클래스 I(HLA-I) 단백질은 모든 유핵 세포에서 발현되고 HLA 클래스 I 중쇄(또는 α 쇄) 및 B2M으로 이루어진다. HLA 클래스 I 단백질은 세포 표면 상의 펩티드를 CD8+ 세포독성 T 세포에 제시한다. 3 개의 고전적(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C) 및 3 개의 비고전적(HLA-E, HLA-F 및 HLA-G) α 쇄를 포함한 6 개의 HLA 클래스 I α 쇄가 현재까지 식별되었다. HLA 클래스 I 분자 펩티드 결합 틈에 대한 펩티드 결합의 특이성은 α 쇄에 의해 결정된다. HLA 클래스 I 분자에 의해 제시된 펩티드의 CD8+ T 세포에 의한 인식은 세포 면역을 매개한다.
HLA 클래스 II 분자(HLA-II)는 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포를 포함한 전문 항원-제시 세포(APC)에서만 발견되는 막관통 단백질이다. 또한, 고형 장기는 때때로 면역 거부에 참여하는 HLA 클래스 II 유전자를 발현할 수 있다. HLA 클래스 II(HLA-II) 분자 또는 단백질은 세포외 병원체의 단백질을 포함한 세포외 단백질로부터의 세포 표면 펩티드 항원 상에 제시되는 반면, HLA 클래스 I 단백질은 세포내 단백질 또는 병원체로부터의 펩티드를 제시한다. 세포 표면 상에 로딩된 HLA 클래스 II 단백질은 CD4+ 헬퍼 T 세포와 상호작용한다. 상호작용은 B 세포의 활성화를 통한 식세포의 동원, 국부 염증, 및/또는 호르몬 반응으로 이어진다. HLA-DM(각각 HLA-DM α 쇄 및 HLA-DM β 쇄를 암호화하는 HLA-DMA 및 HLA-DMB), HLA-DO(각각 HLA-DO α 쇄 및 HLA-DO β 쇄를 암호화하는 HLA-DOA 및 HLA-DOB), HLA-DP(각각 HLA-DP α 쇄 및 HLA-DP β 쇄를 암호화하는 HLA-DPA 및 HLA-DPB), HLA-DQ(각각 HLA-DQ α 쇄 및 HLA-DQ β 쇄를 암호화하는 HLA-DQA 및 HLA-DQB), 및 HLA-DR(각각 HLA-DR α 쇄 및 HLA-DR β 쇄를 암호화하는 HLA-DRA 및 HLA-DRB)를 포함한 여러 HLA 클래스 II 유전자 유전자좌가 현재까지 식별되었다.
동종이계 공급원으로부터의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 단백질은 이식의 맥락에서 외래 항원을 구성한다. 비-자기 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 단백질의 인식은 이식 또는 대체 요법을 위해 다능성 세포를 사용하는 데 있어서 주요 장애물이다. 편집된 HLA 클래스 I 또는 클래스 II- 관련 유전자, 및/또는 B2M 유전자를 포함하는 본 발명의 세포는 세포-기반 요법에 특히 유용할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 다음 유전자 중 임의의 하나를 편집하는 데 사용될 수 있다: RFXANK, RFXAP, RFX5, CIITA, CD1d, HPRT1 및 알부민. 본 발명의 방법은 임의의 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있다.
세포
본 발명의 방법에 따라 편집에 유용한 세포는 임의의 세포, 예를 들어 포유류 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 유전자를 편집하는 방법은 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 간 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포로 이루어진 세포로부터 선택된 줄기 세포에서 수행된다. "만능 줄기 세포"는 3 개의 배엽층인 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 중 임의의 것으로 분화할 가능성이 있는 줄기 세포를 지칭한다. "성체 줄기 세포"는 제한된 수의 세포 유형만 생산할 수 있다는 점에서 다능성이다. "배아 줄기(ES) 세포"는 초기 배아인 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 만능 줄기 세포를 지칭한다. "유도 만능 줄기 세포(iPS 세포)"는 특정 유전자의 발현을 인공적으로 유도함으로써, 비-만능 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 인공적으로 유래된 만능 줄기 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 유전자를 편집하는 방법은 수지상 세포, 림프구, 적혈구, 혈소판, 조혈 세포, 췌장 섬 세포, 간 세포, 근육 세포, 각질세포, 심근세포, 신경 세포, 골격근 세포, 안구 세포, 간엽 세포, 섬유모세포, 폐 세포, 위장관 세포, 혈관 세포, 내분비 세포, 피부 세포, 지방세포 및 자연 살해 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 분화된 세포에서 수행된다.
따라서 본 발명은 줄기 세포 또는 분화된 세포에서 유전자를 편집하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 복제 분기점 조절제 및/또는 유전자 편집 벡터를 포함하는 세포를 포함하는, 편집된 줄기 세포 및 이로부터 유래되거나 또는 분화된 자손, 및 편집된 분화된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 제공한다. 본 발명의 세포는 또한 대상체에게 투여하기 전에 편집되지 않았지만, 대상체에게 투여한 후에 편집된 복제 분기점 조절제 및 유전자 편집 벡터를 포함하는 세포를 포함한다.
복제 분기점 조절제
복제 분기점 조절제는 복제 분기점과 연관된/복제 분기점에서 발생하는 활성, 예를 들어, DNA 합성 또는 DNA 이중 나선의 풀림을 직접적으로 또는 간접적으로 조절할 수 있다. 복제 분기점 조절제는 복제 분기점과 연관된 단백질 또는 복제 분기점과 연관된 단백질을 암호화하는 상응하는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 조절할 수 있다.
본 발명에 따라 유용한 복제 분기점 조절제는 소분자, 단백질, 펩티드 및 핵산, 예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 신호 간섭 DNA(siDNA)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RecQ 헬리카제 단백질(들), 증식 세포 핵 항원 또는 불일치 복구 단백질(들)에 특이적인 shRNA이다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염이다. 복제 분기점 조절제는 복제 분기점에서 DNA 합성을 특이적으로 조절할 수 있으며, 예를 들어, 선도 가닥 합성을 증가 및/또는 감소시키거나, 또는 지연 가닥 합성을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.
구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성을 특이적으로 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성을 특이적으로 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성을 특이적으로 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성을 특이적으로 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 및 지연 가닥 합성을 증가 또는 감소시킨다.
구현예에서, 복제 분기점 조절제는 선도 가닥 합성을 특이적으로 증가시키거나 또는 특이적으로 감소시키지만, 지연 가닥 합성을 유의하게 증가 또는 감소시키지 않는다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 지연 가닥 합성을 특이적으로 증가시키거나 또는 특이적으로 감소시키지만, 선도 가닥 합성을 유의하게 증가 또는 감소시키지 않는다. 복제 분기점에서 선도 및 지연 가닥 합성은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어, Burhans 등, 1991, The EMBO Journal, 10: 4351-4360 및 Schauer 등, 2017, Bio. Protoc. 7: 1-23)에 기재된 바와 같이 측정/검출된다.
특정 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 복제 분기점에서 지연 가닥을 억제한다. 복제 분기점에서 지연 가닥 합성의 특이적 억제에 유용한 제제는 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; 또는 siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 지연 가닥 합성을 조절하는 분자에 특이적인 shRNA, 예를 들어, DNA 폴리머라제 δ(Pol δ) 또는 DNA 폴리머라제 α, DNA 폴리머라제 β, DNA 프리마제 및 DNA 리가제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 복제 분기점에서 선도 가닥 합성을 억제한다. 복제 분기점에서 선도 가닥 합성의 특이적 억제에 유용한 제제는 선도 가닥 합성을 조절하는 분자에 특이적인 siRNA 또는 shRNA, 예를 들어, DNA 폴리머라제 ε(Pol ε)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "억제하다" 또는 "감소시키다"는 복제 분기점에서 지연 가닥의 합성을 지칭하거나 또는 복제 분기점에서 선도 가닥의 합성을 지칭할 때, 각각 대조군 지연 가닥 합성 또는 선도 가닥 합성 수준과 비교하여 예를 들어 2-배 이상, 예를 들어, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배 이상 감소를 의미한다. 억제하다는 또한 각각 대조군 지연 가닥 합성 또는 선도 가닥 합성 수준과 비교하여 5% 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 감소를 의미한다. 억제는 또한 지연 가닥의 검출가능한 합성이 검출가능하지 않도록 완전 억제를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "활성화시키다" 또는 "증가시키다"는 복제 분기점에서 지연 가닥의 합성을 지칭하거나 또는 복제 분기점에서 선도 가닥의 합성을 지칭할 때, 각각 대조군 지연 가닥 합성 또는 선도 가닥 합성 수준과 비교하여 예를 들어 2-배 이상, 예를 들어, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배 이상 증가를 의미한다. 활성화시키다 또는 증가시키다는 또한 각각 대조군 지연 가닥 합성 또는 선도 가닥 합성 수준과 비교하여 5% 이상, 예를 들어, 5% 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 증가를 의미한다.
일 구현예에서, 지연 가닥 합성의 억제는 지연 가닥 합성 억제제와 접촉되지 않은 대조군 세포, 지연 가닥 합성 억제제와 접촉하기 전의 세포에서 지연 가닥 합성의 수준과 비교할 때 또는, 지연 가닥 합성의 미리 결정된 대조군 수준과 비교할 때 억제이다.
일 구현예에서, 선도 가닥 합성의 억제는 선도 가닥 합성 억제제와 접촉되지 않은 대조군 세포, 선도 가닥 합성 억제제와 접촉하기 전의 세포에서 선도 가닥 합성의 수준과 비교할 때 또는, 선도 가닥 합성의 미리 결정된 대조군 수준과 비교할 때 억제이다.
복제 분기점 조절제는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는, 복제 분기점 기능 또는 활성과 연관된 단백질 또는 단백질을 발현하는 유전자의 발현 수준 또는 활성을 조절할 수 있다: DNA 폴리머라제 α, DNA 프리마제, RNA 프리마제, DNA 폴리머라제 α1, DNA 폴리머라제 ε, DNA 폴리머라제 ε4, DNA 폴리머라제 δ, 분기점 보호 복합체(FPC) 성분 Timeless, Tipin, Claspin 및 And1, Cdc45, MCM 2-7(미니 염색체 유지) 헬리카제 2-7 육량체 단백질(Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6 및 Mcm7), GINS(go-ichi-ni-san) 복합체 단백질(Sld5, Psf1, Psf2 및 Psf3), 복제 단백질 A(RPA), 복제 인자 C 클램프 로더(RFC) 단백질(Rfc1, Rfc2, Rfc3, Rfc4, 및 Rfc5), RMI1 단백질, ATR 키나제, ATR-상호작용 단백질(ATRIP), RecQ 헬리카제 단백질(RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5), 불일치 복구(MMR) 단백질(PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6), 및 증식 세포 핵 항원(PCNA), DNA 리가제 및 Flap 엔도뉴클레아제 1(Flap1). 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 후기 촉진 복합체 서브유닛 5, RecQ-매개된 게놈 불안정성 단백질 1, 기원 인식 복합체 서브유닛 1, 호메오박스 단백질 Meis2, DNA 토포이소머라제 III 알파, DNA 폴리머라제 엡실론 4 및 FANCM 단백질의 발현 수준 및 또는 활성을 조절한다. 이들 단백질 중 임의의 하나가 선도 및/또는 지연 가닥 합성에 수반될 수 있다.
복제 분기점 기능와 연관된 단백질은 DNA 합성, 프라이머 합성, DNA 나선의 풀림을 포함하나 이에 제한되지 않는 복제 분기점의 기능 또는 활성을 증가 또는 감소시키거나, 복제 분기점에서 발생하거나, 또는 복제 분기점과 연관되거나 또는 그 자체가 복제 분기점 기능을 조절하는 단백질, 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 임의의 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 발현 또는 활성 수준을 직접적으로 조절한다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 예를 들어, 단백질을 직접적으로 조절하여 결과적으로 복제 분기점과 연관된 단백질의 발현 또는 활성 수준을 직접적으로 조절함으로써 발현 또는 활성 수준을 간접적으로 조절한다.
복제 분기점 조절제는 세포에서 유전자 편집 활성을 조절할 수 있다. 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 세포에 들어가는 유전자 편집 벡터의 양을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 세포에서 유전자 편집 벡터의 안정성을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 표적 유전자좌에서 벡터 및 상동 염색체 서열 사이의 상동 쌍형성 수준을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 벡터 및 표적 유전자좌 사이의 재조합을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 DNA 복구 합성 과정을 증가 또는 감소시키며 여기서 벡터 서열은 염색체의 반대 방향으로 카피된다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 염색체 표적 유전자좌에서 부위 특이적 이중 가닥 절단의 형성을 증가 또는 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 복제 분기점 조절제는 이중 가닥 절단에서 상동성 지정 복구 및/또는 비-상동 말단 연결을 증가 또는 감소시킨다.
일 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 복제 분기점 조절제 억제제는 에메틴, 예를 들어 표 2에 제공된 바와 같은 RecQ 헬리카제 단백질을 암호화하는 유전자에 상응하는 siRNA, 또는 예를 들어 표 3에 제공된 바와 같은 RecQ 헬리카제 단백질을 암호화하는 유전자에 상응하는 shRNA 중 하나 이상이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질이고, 복제 분기점 조절제는 에메틴, 예를 들어 표 4에 제공된 바와 같은 불일치 복구 단백질을 암호화하는 유전자에 상응하는 siRNA, 또는 불일치 복구 단백질을 암호화하는 유전자에 상응하는 shRNA 중 하나 이상이다.
또 다른 구현예에서, 복제 분기점 단백질은 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 복제 분기점 조절제는 에메틴, PCNA를 암호화하는 유전자에 상응하는 siRNA, 또는 PCNA를 암호화하는 유전자에 상응하는 shRNA 중 하나 이상이다.
투여량 및 투여 방식
본 발명은 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태의 치료 및/또는 이식 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는"은 본 발명의 조성물을 대상체에게 이송, 전달, 도입, 또는 수송하는 임의의 방식을 지칭한다. 투여 방식은 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 피내, 비강내, 경피성 및 피하 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 대상체의 정맥, 동맥, 모세혈관, 심장, 또는 조직, 뿐만 아니라 세포의 특이적 집단, 또는 하위집단에 전달될 수 있다. 구현예에서, 투여는 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제를 대상체에게 복강내로 전달하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여는 추적제를 첨가함으로써 평가될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 대상체에서 질환의 검출, 또는 질환 또는 장애의 특징적인 증상의 징후 전에 발생할 수 있어서, 질환 또는 장애가 예방되거나, 또는 대안적으로, 진행이 지연되도록 한다. 일 구현예에서, 세포는 주사기 또는 카테터를 포함하나 이에 제한되지 않는 전달 장치를 통해 투여된다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"이란 질환 또는 병태의 증상을 개선하거나, 또는 세포에서 유전자 편집을 야기하기에 충분한 본 발명의 조성물의 양을 의미한다. "유효량" 또는 "치료 유효량"이란 또한 본 발명에 따른 질환 또는 병태를 치료하는 요법에 사용하기 위한 치료적 또는 예방적 효과를 유도하기 위한 본 발명의 조성물의 양을 의미한다. "유효량" 또는 "치료 유효량"이란 또한 원하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 조성물의 유효량, 투여 방식 및 치료 레지멘은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
"개선하다"란 질환의 발달 또는 진행을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나, 저하시키거나, 막거나, 발병을 지연시키거나, 또는 안정화시키는 것을 의미한다.
본 발명의 세포의 치료 유효량은 대상체에 의해 안전하게 수용되는 세포의 최대 수에서 치료에 필요한 세포의 최소 수까지 범위일 수 있으며, 예를 들어, 약 10,000 개 세포/kg, 약 20,000 개 세포/kg, 약 30,000 개 세포/kg, 약 40,000 개 세포/kg, 약 50,000 개 세포/kg, 약 100,000 개 세포/kg, 약 200,000 개 세포/kg, 약 300,000 개 세포/kg, 약 400,000 개 세포/kg, 약 500,000 개 세포/kg, 약 600,000 개 세포/kg, 약 700,000 개 세포/kg, 약 800,000 개 세포/kg, 약 900,000 개 세포/kg, 약 1.1 x 106 개 세포/kg, 약 1.2 x 106 개 세포/kg, 약 1.3 x 106 개 세포/kg, 약 1.4 x 106 개 세포/kg, 약 1.5 x 106 개 세포/kg, 약 1.6 x 106 개 세포/kg, 약 1.7 x 106 개 세포/kg, 약 1.8 x 106 개 세포/kg, 약 1.9 x 106 개 세포/kg, 약 2.1 x 106 개 세포/kg, 약 2.1 x 106 개 세포/kg, 약 1.2 x 106 개 세포/kg, 약 2.3 x 106 개 세포/kg, 약 2.4 x 106 개 세포/kg, 약 2.5 x 106 개 세포/kg, 약 2.6 x 106 개 세포/kg, 약 2.7 x 106 개 세포/kg, 약 2.8 x 106 개 세포/kg, 약 2.9 x 106 개 세포/kg, 약 3 x 106 개 세포/kg, 약 3.1 x 106 개 세포/kg, 약 3.2 x 106 개 세포/kg, 약 3.3 x 106 개 세포/kg, 약 3.4 x 106 개 세포/kg, 약 3.5 x 106 개 세포/kg, 약 3.6 x 106 개 세포/kg, 약 3.7 x 106 개 세포/kg, 약 3.8 x 106 개 세포/kg, 약 3.9 x 106 개 세포/kg, 약 4 x 106 개 세포/kg, 약 4.1 x 106 개 세포/kg, 약 4.2 x 106 개 세포/kg, 약 4.3 x 106 개 세포/kg, 약 4.4 x 106 개 세포/kg, 약 4.5 x 106 개 세포/kg, 약 4.6 x 106 개 세포/kg, 약 4.7 x 106 개 세포/kg, 약 4.8 x 106 개 세포/kg, 약 4.9 x 106 개 세포/kg, 또는 약 5 x 106 개 세포/kg의 투여량을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 본 발명의 세포의 치료 유효량은 100 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 예를 들어, 10,000 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 100,000 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 500,000 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 1 x 106 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 2 x 106 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 5 x 106 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 1 x 107 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, 1 x 108 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg, a x 109 개 세포/kg 내지 약 1011 개 세포/kg 또는 1 x 1010 개 세포 내지 약 1011 개 세포/kg 범위일 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 세포의 치료 유효량은 약 50,000 개 세포/kg - 150,000 개 세포/kg, 예를 들어, 50,000 개 세포/kg - 100 개 세포/kg, 60,000 개 세포/kg - 100, 000 개 세포/kg, 75,000 개 세포/kg- 150,000 개 세포/kg, 90,000 개 세포/kg - 150,000 개 세포/kg 범위이다. 또 다른 구현예에서, 대상체에 대한 세포의 투여량은 단일 투여량 또는 단일 투여량 + 추가의 투여량일 수 있다. 대상체는 본 발명의 세포의 투여 후, 또는 복제 분기점 조절제 및/또는 유전자 편집 벡터의 투여 후, 질환의 하나 이상의 증상이 감소되거나 또는 제거되는 경우, 질환에 대한 치료를 받는다고 한다.
구현예에서, 본 발명의 세포는 안와후 주사 또는 외과적 슬릿 이식을 통해 건성 황반 변성 또는 스타르가르트 황반이양증을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
약제학적 조성물
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 희석제 및/또는 다른 성분을 포함하는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 약제학적 조성물은 본 발명의 조성물 및 생리학적으로 호환가능한 완충제 및, 특정 구현예에서, 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있으며, 여기서 본 발명의 조성물은 활성을 보유하고 여기서 본 발명의 세포는 생존 가능하게 남아있다. 이러한 조성물은 중성 완충 염수, 인산염 완충 염수 등과 같은 완충제; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 만니톨; 덱스트로서, 물 글리세롤, 에탄올, 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 산화방지제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 애주번트(adjuvant)(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 이의 조합, 및 보존제를 포함할 수 있다.
본 발명의 세포를 포함하는 조성물은 생존력을 잃지 않고 단기간 저장 동안 용액 또는 약제학적 조성물에서 유지될 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 당업계에 잘 알려진 동결보존 방법에 따라 생존력을 잃지 않고 장기간 저장을 위해 동결된다.
치료 및 이식 방법
본 발명은 본 발명의 조성물의 투여를 통해 치료가능한 질환 또는 장애의 위험이 있는 대상체를 치료하는 예방적 및 치료적 방법을 둘 다 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료", 또는 "치료하는"은 질환 또는 장애, 또는 질환 또는 장애의 증상을 치유하거나, 고치거나, 완화하거나, 줄이거나, 변경하거나, 교정하거나, 개선하거나, 향상시키거나 또는 낫게 하기 위해 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 것으로 정의된다. 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 또한 본 발명의 조성물을 예방적으로 투여하는 맥락에서 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "진단하는" 또는 "이를 갖는 환자 또는 대상체를 식별하는"은 개인이 질환 또는 질병, 예를 들어 본원에 제공된 질환을 앓고 있는지 여부를 결정하는 과정을 지칭한다. 질환에 대한 위험이 있는 대상체는 예를 들어, 당업계에 알려진 진단 또는 예후 검정 중 임의의 것 또는 조합에 의해 식별될 수 있다. "질환," "장애," 및 "병태"는 당업계에서 통상적으로 인식되며 일반적으로 비정상 및/또는 바람직하지 않은 것으로 인식되는 대상체에서의 징후 및/또는 증상의 존재를 지정한다. 질환 또는 병태는 병리학적 변화에 기초하여 진단되고 분류될 수 있다.
구현예에서, "질환"은 암, 종양 성장, 결장암, 유방암, 골암, 뇌암 및 기타의 암(예를 들어, 골육종, 신경모세포종, 결장 선암종), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수성 백혈병(APL), 심장암(예를 들어, 육종, 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종); 폐암(예를 들어, 기관지원성 암종, 폐포성 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골성 과오종, 중피종); 다양한 위장관암(예를 들어, 식도, 위장, 췌장, 소장, 및 대장의 암); 비뇨생식관암(예를 들어, 신장, 방광 및 요도, 전립선, 고환; 간암(예를 들어, 간종양, 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 선암종, 혈관종)); 골암(예를 들어, 골육종, 섬유육종, 악성 섬유 조직구종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 림프종, 다발성 골수종, 악성 거대 세포종 연골종, 골연골종, 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골 골종및 거대 세포종); 신경계의 암(예를 들어, 두개골, 수막, 뇌, 및 척수의 암); 부인암(예를 들어, 자궁, 자궁경관, 난소, 음문, 질); 혈액암(예를 들어, 혈액과 관련한 암, 호지킨병, 비호지킨 림프종); 피부암(예를 들어, 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 기태 이형성 모반, 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선); 및 부신의 암(예를 들어, 신경모세포종) 중 임의의 하나를 지칭한다.
"질환"은 또한 류마티스 척추염; 허혈후 관류 손상; 염증성 장 질환; 만성 염증성 폐 질환, 습진, 천식, 허혈/재관류 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 감염성 관절염, 진행성 만성 관절염, 기형성 관절염, 외상 관절염, 통풍 관절염, 라이터 증후군, 급성 활액막염 및 척추염, 사구체신염, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 호중구감소증, 숙주 편대 이식 질환, 동종이식편 거부반응, 만성 갑상선염, 그레이브스 병, 원발성 이산형 간경화증, 접촉성 피부염, 피부 일광화상, 만성 신부전, 길랭-바레 증후군, 포도막염, 중이염, 치주질환, 폐 간질 섬유증, 기관지염, 비염, 부비강염, 진폐증, 폐 기능부전 증후군, 폐기종, 폐 섬유증, 규폐증, 또는 만성 염증성 폐 질환 중 임의의 하나를 포함한다.
추가 구현예에서, 용어 "질환"은 다음 자가면역 질환 또는 장애 중 임의의 하나 이상을 포함한다: 진성 당뇨병, 관절염(류마티스 관절염, 청소년 류마티스 관절염, 골관절염, 건성성 관절염 포함), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역성 갑상샘염, 피부염(아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 건선, 쇼그렌 증후군에 대한 부차적인 건성각 결막염을 포함한 쇼그렌 증후군, 원형 탈모증, 절지동물 물림 반응으로 인한 알레르기 반응, 크론병, 아프타성 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 루푸스, 피부경화증, 질염, 직장염, 약물 발진, 한센병 역전 반응, 나성결절 홍반, 자가면역성 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사성 출혈성 뇌병증, 특발성 양측 진행성 감각신경성 청력 손실, 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 무형성, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활동 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스프루, 편평 태선, 그레이브스 안증, 사르코이드증, 원발성 담즙성 간경변증, 후방 포도막염, 및 간질성 폐 섬유증.
또 다른 구현예에서, 질환은 윌슨병, 척수소뇌성 운동실조증, 프리온병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭경화증, 아밀로이드증, 알츠하이머병, 알렉산더병, 알코올성 간 질환, 낭포성 섬유증, 픽병, 척수성 근위축증 또는 루이소체 치매 중 임의의 하나를 지칭한다. 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여함으로써 상기 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 대상체에서 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여함으로써, 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 적절한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 조성물을 사용한 치료의 효능, 독성, 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물(예를 들어, 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제, 예를 들어, 에메틴)은 이러한 조성물의 작용 메커니즘을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다.
키트
본 발명은 키트를 제공한다. 구현예에서, 키트는 운반 수단, 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제, 예를 들어 에메틴을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 운반 수단 및 유전자 편집 벡터 또는 복제 분기점 조절제를 포함한다. 유전자 편집 벡터 및/또는 복제 분기점 조절제는 별개의 세포에서 또는 단일 세포에서 함께 세포에 제공될 수 있다. 바람직한 경우, 키트는 편집된 세포를 생산하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 또 다른 구현예에서, 키트는 본 발명의 세포, 또는 이로부터 유래된 유도체 또는 분화된 세포, 및 세포의 성장 및 유지에 적합한 적절한 배양 배지를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 유전자 편집 벡터 및, 제2 성분으로서 복제 분기점 조절제를 포함하는, 본 발명의 세포, 또는 이로부터 유래된 유도체 또는 분화된 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 복제 분기점 조절제 및, 별도로, 유전자 편집 벡터를 포함하는, 본 발명의 세포, 또는 이로부터 유래된 유도체 또는 분화된 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서 키트는 유전자 편집 벡터를 갖는 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 복제 분기점 조절제를 갖는 세포를 포함하다. 또 다른 구현예에서, 키트는 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제를 둘 다 갖는 세포를 포함한다.
운반 수단은 박스, 상자, 튜브 등 중 임의의 하나를 포함할 수 있으며, 그 안에 용량 제한이 있는 바이알, 튜브, 앰플, 병 등과 같은 하나 이상의 용기 수단을 가지고 있다.
다른 구현예에서, 설명서는 조성물의 설명; 경고; 표시; 반대 표시; 동물 연구 데이터; 임상 연구 데이터; 및/또는 참고문헌 중 적어도 하나를 포함하며 일반적으로 질환이 있는 대상체를 치료하거나 또는 대상체에서 세포를 편집하기 위한 세포, 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제의 사용에 대한 정보를 포함하는 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 용기 위에 직접적으로 인쇄되거나(존재하는 경우), 용기에 적용된 라벨로서, 또는 용기 내부에 또는 용기와 함께 공급된 별개의 시트, 팜플렛, 카드, 또는 홀더로서 있을 수 있다. 키트는 또한 유전자 편집 벡터 및/또는 복제 분기점 조절제의 효과를 향상시키는 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 초과의 복제 분기점 조절제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 대상체의 치료에 기여하는 화합물, 예를 들어, 면역억제제를 포함할 수 있다.
동물 모델
본 발명의 편집된 세포는 또한 동물에게 적용가능하고, 또한 다양한 동물 모델 시스템에서 질환의 생물의학적 연구를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다.
용도
본 발명의 방법은 질환 치료 및 예방을 포함한 임상 적용을 위해 사용될 수 있는 편집된 세포의 시험관내 및 생체내 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 세포 및 이의 분화된 자손은 또한 특정 기능, 예를 들어, 질환을 치료 또는 예방하는 화합물을 식별하고 하거나, 관심 화합물의 활성을 결정하고 하거나 관심 화합물의 독성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 편집된 세포 또는 편집된 세포로부터 분화된 세포를 환자에게 이식하는 것을 포함하는 세포 요법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다양한 편집된 세포를 사용하여 화합물, 약물, 독성 제제의 생리학적 효과 또는 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실행은 달리 지시되지 않는 한 당업계의 기술 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학, 면역학, 세포 생물학, 세포 배양 및 유전자이식 생물학의 통상적인 기술을 이용한다. 예를 들어, Maniatis 등, 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook 및 Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel 등, 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 주기적 업데이트 포함); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie 및 Fink, 1991; Harlow 및 Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 및 M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 및 155 (Wu 등 eds.), Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan 등, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000) 참조.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시이며 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 기재되며, 예시로서 제공되고 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
에메틴은 인간 HT-1080 세포에서 유전자 편집을 증가시킨다
뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 벡터 LHSN63Δ53O는 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 63에서 53-bp 결실을 갖는 비기능성 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 표적 유전자(neo), 선택을 위한 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 및 표적 부위를 회복하기 위한 플라스미드 복제 기원을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포를 HT-1080(인간 섬유육종 세포) 유전자 편집 검정을 사용하여 유전자 편집한다. 이 방법은 LHSN63Δ53O로 형질도입된 HT-1080 neo/HPRT 편집 세포를 사용한다. HT-1080 세포는 MLV LHSN63Δ53O 표적화 유전자좌의 통합된 카피 및 엑손 3에서 단일 카피 X-연결된 HPRT 유전자에서 4 bp 결실을 함유한다. 세포를 AAV2-HSN5'으로 형질도입하고 G418에서 배양하여 neo 유전자-편집된 세포를 식별한다. AAV2-HSN5' 유전자 표적화 벡터는 53 bp 결실이 없는 절두된 neo 유전자를 갖는 MLV-LHSN63Δ53O에 상동인 서열을 함유한다. 대안적으로, HT-1080 세포를 AAV2-HPe3 표적화 벡터로 형질도입하고 HAT 배지로 선택하여 HPRT 유전자-편집된 세포를 식별한다(Russell 등, 2008, Human Gene Therapy, 19: 907-914 및 Deyle 등, 2014, Nature Structural & Molecular Biol., 21: 969-975 참조). 표적화된 클론을 다클론 집단으로 확장한다. HT-1080 세포를 기능적 neo 유전자를 함유한다는 점을 제외하고 LHSN63Δ53O와 동일한 MLV 벡터 LHSNO로 형질도입함으로써 비표적화된 대조군 세포를 생성한다.
또 다른 구현예에서, 세포를 HT-1080 GFP 돌연변이체 편집 라인 및 AAVDJ-mAlb-GFP 벡터를 사용하여 유전자 편집한다. 이 벡터의 존재 하에 유전자 편집은 알부민 녹인(knock-in)을 초래하여 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 초래한다. GFP 양성 세포는 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다.
유전자 편집에 대한 에메틴의 효과를 결정하기 위해, AAV2-HSN5' 또는 AAV2-HPe3으로 감염된, LHSN63Δ53O 프로바이러스 및 HPRT 엑손 3Δ4가 있는 인간 HT-1080 세포를 사용하여 실험을 수행하였다. 세포의 복제 샘플을 다음 조건 하에 처리하였다:
ㆍ 24 시간 동안 AAV(MOI 2 x 104) 단독;
ㆍ 8 시간 동안 0.125 μM 에메틴 이어서 AAV(MOI 2 x 104) 첨가 및 24 시간 동안 배양;
ㆍ 24 시간 동안 0.25 μM 에메틴 이어서 AAV(MOI 2 x 104) 첨가 및 24 시간 동안 배양;
ㆍ 24 시간 동안 0.25 μM 에메틴 이어서 AAV(MOI 2 x 104) 첨가 및 AAV와 함께 24 시간 동안 배양;
ㆍ 24 시간 동안 AAV(MOI 2 x 104)의 존재 하에 0.25 μM 에메틴;
ㆍ 8 시간 동안 AAV(MOI- 2 x 104) 이어서 0.25 μM 에메틴 첨가 및 에메틴과 함께 23 시간 동안 배양;
ㆍ 24 시간 동안 AAV(MOI- 2 x 104) 이어서 0.25 μM 에메틴 첨가 및 에메틴과 함께 8 시간 동안 배양;
ㆍ 8 시간 동안 AAV(MOI- 2 x 104) 이어서 에메틴(0.25 μM ) 첨가 및 에메틴과 함께 18 시간 동안 배양, 에메틴 제거, 이어서 제2 투여량의 에메틴(0.25 μM ) 첨가 및 16 시간 동안 배양; 또는
ㆍ 24 시간 동안 AAV(MOI 2 x 104) 이어서 에메틴(0.25 μM) 첨가 및 7 시간 동안 배양, 에메틴 제거, 이어서 2 시간 동안 제2 투여량의 에메틴(0.25 μM) 첨가.
각 실험을 위해, 2 x 104 개 세포를 시딩하고 4 x 108 개 AAV의 존재 하에 배양하였다. 모든 실험은 DMEM +10% FBS + pen/strep에서 수행하였다. 에메틴 디하이드로클로라이드 수화물: E2375(Sigma)를 물에서 제조하고 0.22uM 필터에서 여과함으로써 멸균시켰다.
실험 결과는 하기 표 1에 제공되어 있다. 이들 데이터는 에메틴의 존재 하에 유전자 편집이 증가한다는 것을 나타낸다.
표 1
Figure pct00001
실시예 2
에메틴은 마우스 Hepa1-6 세포에서 유전자 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한 에메틴의 효과를 결정하기 위해, 벡터 AAVDJ-mAlb-GFP를 사용한 마우스 Hepa1-6 간종양 세포를 사용하여 실험을 수행하였다. 이 벡터의 존재 하에 유전자 편집은 알부민 녹인을 초래하여 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 초래한다.
0 일째에, 100,000 개 세포를 10% FBS, 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 1.5 ml DMEM에 플레이팅하였다. 1 일째에, 배지를 제거하고 원하는 MOI의 AAVDJ-mAlb-GFP 바이러스를 함유하는 신선한 배지(10% FBS, 100 유닛/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM) 1.5 ml를 세포에 첨가하여 세포를 AAVDJ-mAlb-GFP(다중도(MOI) - 50,000)로 형질도입하였다. 100,000 개 세포의 경우, 50,000의 MOI를 달성하기 위해, 5x106 개 벡터 게놈을 첨가하였다.
2 일째에, 에메틴이 있거나 없는 신선한 배지(10% FBS, 100 유닛/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 1.5 ml)를 첨가하였다. 복제 샘플을 에메틴 없음, 또는 30 nM 에메틴, 100 nM 에메틴 또는 1000 nM 에메틴으로 처리하였다. 대조군 샘플은 AAV가 없었다. 3 일째에, 배지를 제거하였고 10% FBS, 100 유닛/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 1.5 ml를 세포에 첨가하였다. GFP의 발현을 6, 7 및 10 일째에 측정하였다.
유세포 분석을 사용하여 GFP 발현을 측정하였다. 검정 일에(6, 7 및 10 일) 세포를 트립신 처리하였고 생성된 세포 펠릿을 FACS 완충액(Ca2+, Mg2+가 없고, 2% FBS, 1 mM EDTA가 보충된 DPBS(듈베코 인산염 완충 염수)) 500 μL에 재현탁하였다. 생성된 세포 현탁액을 BD FACScanto II에서 GFP 양성 세포에 대해 분석하였다. AAV 없음, 0 nM 에메틴, 30 nM 에메틴, 및 100 nM 에메틴으로 처리된 샘플의 경우, 100,000 개 세포를 분석하였고, 1000 nM 에메틴으로 처리된 샘플의 경우, 70,000 개 세포를 분석하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 1000 nM 에메틴의 존재 하에 GFP의 발현이 증가하였다(6 일에 22-배, 7 일에 12-배 및 10 일에 3-배). 결과는 에메틴이 마우스 간종양 세포주에서 유전자 편집을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 3
에메틴은 마우스 간의 생체내 편집을 증가시킨다
생체내에서 유전자 편집에 대한 에메틴의 효과를 결정하기 위해, C57BL/6 마우스를 사용하여 실험을 수행하였다.
10 마리 마우스를 활용하였다. 0 일째에, 5 마리 마우스(그룹 I)에 안와후 주사에 의해 마우스 당 3x1011 vg의 양으로 AAVDj-mALB-루시퍼라제 벡터를 주입하였다. AAVDj-mALB-루시퍼라제 벡터의 유전자 편집은 알부민 유전자좌 녹인 및 루시퍼라제 발현을 초래한다. 5 마리 마우스(그룹 2)에 안와후 주사에 의해 마우스 당 3x1011vg의 양으로 AAVDj-mALB-루시퍼라제 벡터를 주입하고, 복강내 주사에 의해 5mg/kg의 농도로 DPBS 중 에메틴을 주입하였다. 5 마리 마우스(그룹 3)에 복강내 주사에 의해 5mg/kg의 농도 에메틴만을 주입하였다.
에메틴을 1-5 일째에 그룹 2 및 3에 투여하였다. 8, 11 및 22 일째에, 복강내 주사에 의해 투여된 15 mg/kg D-루시페린의 존재 하에 생체내 영상화를 수행하여 편집의 발생을 결정하였다. D-루시페린 투여 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 IVIS 영상 장치에 배치하고 피크 생물발광을 기록하였다(Gornalusse 등, 2017, Nature Biotech, 35(8): 765-772). 도 3에 나타낸 바와 같이, 에메틴은 마우스 간에서 생체내 유전자 편집 수준을 증가시킨다. AAV 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 8 일째에 2.3 배 증가를 관찰하였다. 15 및 22 일째에, 각각 1.6 및 1.4 배 증가를 관찰하였다.
실시예 4
편집된 세포의 투여에 의한 대상체의 치료
구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 실시예 1 및 2에 따라 제조된 편집된 세포의 투여에 의해 치료된다.
본 발명의 편집된 세포는 대상체의 다양한 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용된다. 투여량, 전달 경로 및 부형제는 치료되는 질환 또는 병태에 따라 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 편집된 세포로부터 유래된 망막 색소 상피 세포(RPE)는 건성 황반 변성 또는 스타르가르트 황반이양증을 치료하는 데 사용된다. 0 일째에, 환자는 안와후 주사 또는 외과적 슬릿 이식을 통해 다수의 생리학적으로 적합한 완충액 중 임의의 하나에서 50,000 개 세포; 100,000 개 세포, 150,000 개 세포, 500,000 개 세포 또는 그 이상으로 치료된다. 환자를 다음에 대해 검정함으로써 안전성에 대해 모니터링한다: 세포 생성물과 관련된 임의의 등급 2(NCI 등급화 시스템) 또는 그 이상의 이상 반응; 세포가 감염성 제제로 오염되었다는 임의의 증거; 및 세포가 종양형성 가능성을 나타낸다는 임의의 증거. 세포의 성공적인 생착 및 기능은 세포가 정확한 위치에서 이식되었다는 구조적 증거(OCT 이미징, 형광안저 혈관조영술, 자가형광 촬영술, 안저 촬영에 의한 세극등 검사); 및 이식 위치에서 향상된 활성 및 시력의 개선을 나타내는 망막전위도 증거(mfERG)의 수득을 포함하는 당업계에 알려진 일상적인 시험에 의해 모니터링한다.
실시예 5
siRNA에 의한 RecQ 헬리카제의 억제는 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한, RecQ 헬리카제 단백질 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5를 암호화하는 RecQ 헬리카제 유전자에 상응하는 siRNA의 효과를 결정하기 위해, HT-1080 neo/HPRT 편집 라인을 사용하여 실험을 수행하였다. 각 헬리카제 유전자를 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5 각각에 대해 특이적인 siRNA로 처리하였다.
각 헬리카제 유전자를 3 개의 상이한 siRNA 쌍(RECQL1 253/254, RECQL1 255/256, RECQL1 257/258, RECQL2 BLM 259/260, RECQL2 BLM 261/262, RECQL2 BLM 263/264, RECQL3 WRN 265/266, RECQL3 WRN 267/268, RECQL3 WRN 269/270, RECQL4 271/272, RECQL4 273/274, RECQL4 275/276, RECQL4 277/278, RECQL5 279/2806 및 RECQL4 281/282)으로 처리하였다.
표 2
Figure pct00002
Figure pct00003
HPRT 및 neo 편집 빈도를 G418 또는 HAT 선택에 의해 측정하고, 스크램블된 siRNA 대조군으로 정규화하였다.
105　개 HT-1080 세포를 1 일째에 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다. 2 일째에, 세포를 104의 MOI로 AAV-HSN 또는 AAV-HPe3으로 형질도입하였다. 그런 다음 리포펙타민 RNAiMAX 시약과 혼합된 3nM siRNA를 세포에 첨가하였다. 4 일째에, 세포를 트립신으로 처리하고, 세포 중 0.1%를 선택 없이 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하여 콜로니 형성 단위의 수를 결정하였다. 나머지 세포는 유전자 편집 빈도의 추가 분석을 위해 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다.
5 일째에, G418(700ug/ml)을 실험 플레이트에 첨가하여 neo 유전자 보정 실험을 수행하였다. 15 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. neo　유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 G418-내성 CFU의 수로 계산하였다.
5 일째에, 1X HAT(하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 배지)를 실험 플레이트에 첨가함으로써 HPRT 유전자 보정 실험을 수행하였다. 15 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. HPRT 유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 HAT-내성 CFU의 수로 계산하였다.
CFU를 대조군(스크램블된 siRNA) 샘플의 CFU로 정규화하였다. 정규화된 CFU에 neo　유전자 보정 백분율의 평균을 곱하여 편집 지수를 계산하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, siRNA에 의한 RecQ 헬리카제의 억제는 유전자 편집을 증가시킨다.
실시예 6
shRNA에 의한 RecQ 헬리카제의 억제는 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한 RecQ 헬리카제 유전자에 상응하는 shRNA의 효과를 결정하기 위해, HT-1080 neo/HPRT 편집 라인을 사용하여 실험을 수행하였다. 각 헬리카제 유전자를 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5 각각에 대해 특이적인 shRNA(서열은 하기 표 3에 제공됨)를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 처리하였다. shRNA 벡터의 맵은 도 10에 제공되어 있다. HPRT 및 neo 편집 빈도를 G418 또는 HAT 선택에 의해 측정하고, 스크램블된 shRNA 대조군으로 정규화하였다.
2 x 104　개 HT-1080 세포를 1 일째에 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다. 2 일째에, 세포를 2 x 104의 MOI로 AAV-shRNA로 형질도입하였다. 3 일째에, 세포를 2 x 104의 MOI로 AAV-HSN 또는 AAV-HPe3으로 형질도입하였다. 5 일째에, 세포를 트립신으로 처리하고 세포 중 0.1%를 선택 없이 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하여 콜로니 형성 유닛의 수를 결정하였다. 나머지 세포는 유전자 편집 빈도의 추가 분석을 위해 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다.
6 일째에, G418(700ug/ml)을 실험 플레이트에 첨가하여 neo 유전자 보정 실험을 수행하였다. 16 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. neo　유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 G418-내성 CFU의 수로 계산하였다.
6 일째에, 1X HAT(하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 배지)를 실험 플레이트에 첨가하여 HPRT 유전자 보정 실험을 수행하였다. 16 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. HPRT 유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 HAT-내성 CFU의 수로 계산하였다.
CFU를 대조군(스크램블된 siRNA) 샘플의 CFU로 정규화하였다. 정규화된 CFU에 neo　유전자 보정 백분율의 평균을 곱하여 편집 지수를 계산하였다.
표 3
Figure pct00004
도 5에 나타낸 바와 같이, shRNA에 의한 RecQ 헬리카제의 억제는 유전자 편집을 증가시킨다.
실시예 7
shRNA에 의한 RecQ 헬리카제의 억제는 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한 RecQ 헬리카제 유전자에 상응하는 shRNA의 효과를 결정하기 위해, HT-1080 GFP 돌연변이체 편집 라인을 사용하여 실험을 수행하였다. 각 헬리카제 유전자를 RECQL1(AAV-294-RECQL1), RECQL2(AAV-295-RECQL2), RECQL3(AAV-296-RECQL3), RECQL4(AAV-297-RECQL4) 및 RECQL5(AAV-298-RECQL5) 각각에 대해 특이적인 shRNA(서열은 상기 표 3에 제공됨)를 발현하는 바이러스 벡터로 처리하였다. 유세포 분석에 의해 GFP 편집 빈도를 측정하여 GFP 양성 세포를 식별하고 스크램블된 shRNA 대조군으로 처리된 세포로 정규화하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, siRNA에 의한 RecQ 헬리카제의 억제는 유전자 편집을 증가시킨다.
실시예 8
siRNA에 의한 불일치 복구(MMR) 단백질의 억제는 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한 MMR 단백질 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6을 발현하는 MMR 유전자에 상응하는 siRNA의 효과를 결정하기 위해, HT-1080 neo/HPRT 편집 라인을 사용하여 실험을 수행하였다. 각 MMR 유전자를 3 개의 상이한 siRNA 쌍(하기 표 4에 제공됨)으로 처리하였다.
표 4
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
HPRT 및 neo 유전자 편집 빈도를 G418 또는 HAT 선택에 의해 측정하고 스크램블된 siRNA 대조군으로 정규화하였다.
105　개 HT-1080 세포를 1 일째에 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다. 2 일째에, 세포를 104의 MOI로 AAV-HSN 또는 AAV-HPe3으로 형질도입하였다. 그런 다음 리포펙타민 RNAiMAX 시약과 혼합된 3nM siRNA를 세포에 첨가하였다. 4 일째에, 세포를 트립신으로 처리하고 세포 중 0.1%를 선택 없이 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하여 콜로니 형성 유닛의 수를 결정하였다. 나머지 세포는 유전자 편집 빈도의 추가 분석을 위해 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다.
5 일째에, G418(700ug/ml)을 실험 플레이트에 첨가하여 neo 유전자 보정 실험을 수행하였다. 15 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. neo　유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 G418-내성 CFU의 수로 계산하였다.
5 일째에, 1X HAT(하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 배지)를 실험 플레이트에 첨가하여 HPRT 유전자 보정 실험을 수행하였다. 15 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. HPRT 유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 HAT-내성 CFU의 수로 계산하였다.
CFU를 대조군(스크램블된 siRNA) 샘플의 CFU로 정규화하였다. 정규화된 CFU에 neo　유전자 보정 백분율의 평균을 곱하여 편집 지수를 계산하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, siRNA에 의한 불일치 복구 단백질의 억제는 유전자 편집을 증가시킨다.
실시예 9
siRNA에 의한 불일치 복구(MMR) 단백질 조합의 억제는 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한 MMR 단백질 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6을 발현하는 MMR 유전자에 상응하는 siRNA의 효과를 결정하기 위해, HT-1080 neo/HPRT 편집 라인을 사용하여 실험을 수행하였다. 각 MMR 유전자 또는 유전자의 조합(MSH2 및 MSH3, MSH4 및 MSH5, MSH2 및 MSH6, MLH1 및 PMS2, MLH1 및 MLH3 및 MLH1 및 PMS1)을 표 5에 나타낸 서열을 갖는 3 개의 상이한 siRNA 쌍으로 처리하였다.
표 5
Figure pct00008
HPRT 및 neo 유전자 편집 빈도를 G418 또는 HAT 선택에 의해 측정하고 다음과 같이 스크램블된 siRNA 대조군으로 정규화하였다.
105　개 HT-1080 세포를 1 일째에 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다. 2 일째에, 세포를 104의 MOI로 AAV-HSN 또는 AAV-HPe3으로 형질도입하였다. 그런 다음 리포펙타민 RNAiMAX 시약과 혼합된 3nM siRNA를 세포에 첨가하였다. 4 일째에, 세포를 트립신으로 처리하고 세포 중 0.1%를 선택 없이 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하여 콜로니 형성 유닛의 수를 결정하였다. 나머지 세포는 유전자 편집 빈도의 추가 분석을 위해 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다.
5 일째에, G418(700ug/ml)을 실험 플레이트에 첨가하여 neo 유전자 보정 실험을 수행하였다. 15 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. neo　유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 G418-내성 CFU의 수로 계산하였다.
5 일째에, 1X HAT(하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 배지)를 실험 플레이트에 첨가하여 HPRT 유전자 보정 실험을 수행하였다. 15 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. HPRT 유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 HAT-내성 CFU의 수로 계산하였다. CFU를 대조군(스크램블된 siRNA) 샘플의 CFU로 정규화하였다. 정규화된 CFU에 neo　유전자 보정 백분율의 평균을 곱하여 편집 지수를 계산하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, siRNA에 의한 불일치 복구 단백질 조합의 억제는 유전자 편집을 증가시킨다.
실시예 10
shRNA에 의한 PCNA의 억제는 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한, PCNA 유전자에 상응하는 mRNA에 특이적인 shRNA의 효과를 결정하기 위해, HT-1080 GFP 편집 라인을 사용하여 실험을 수행하였다. PCNA 유전자를 PCNA 유전자에 특이적인 shRNA(서열은 하기 표 6에 제공됨)를 발현하는 렌티바이러스 벡터(AAV-301-PCNA)로 처리하였다. shRNA 벡터의 맵은 도 10에 제공되어 있다. HPRT 및 neo 편집 빈도를 G418 또는 HAT 선택에 의해 측정하고, 스크램블된 shRNA 대조군으로 정규화하였다.
표 6
Figure pct00009
유세포 분석에 의해 GFP 편집 빈도를 측정하여 GFP 양성 세포를 식별하고 스크램블된 siRNA 대조군으로 처리된 세포로 정규화하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, shRNA에 의한 PCNA의 억제는 유전자 편집을 증가시킨다.
실시예 11
shRNA에 의한 추가 선택된 분기점 단백질의 억제는 편집을 증가시킨다
유전자 편집에 대한 선택된 복제 분기점 단백질에 특이적인 shRNA의 효과를 결정하기 위해, HT-1080/neo/HPRT 편집 라인을 사용하여 실험을 수행하였다. 하기 표 8에 나타낸 각 유전자는 렌티바이러스 벡터로부터 발현된 shRNA(서열은 하기 표 7에 제공됨)로 억제하였다.
표 7
Figure pct00010
Figure pct00011
HPRT 및 neo 유전자 편집 빈도를 G418 또는 HAT 선택에 의해 측정하고 shRNA로 처리되지 않은 세포로 정규화하였다.
세포를 먼저 표적화된 유전자에 특이적인 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 그런 다음 특이적 shRNA로 형질도입된 2 x 104　개 HT-1080 세포를 1 일째에 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, shRNA의 발현을 독시사이클린(1 μg/ml)으로 24 시간 동안 유도하였다. 2 일째에, 세포를 2 x 104의 MOI로 AAV-HSN 또는 AAV-HPe3으로 형질도입하였다. 4 일째에, 세포를 트립신으로 처리하고 세포 중 0.1%를 선택 없이 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하여 콜로니 형성 유닛의 수를 결정하였다. 나머지 세포는 유전자 편집 빈도의 추가 분석을 위해 6-웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다.
5 일째에, G418(700ug/ml)을 실험 플레이트에 첨가하여 neo 유전자 보정 실험을 수행하였다. 16 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. neo　유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 G418-내성 CFU의 수로 계산하였다. 6 일째에, 1X HAT(하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 배지)를 실험 플레이트에 첨가하여 HPRT 유전자 보정 실험을 수행하였다. 16 일째에, 플레이트를 PBS로 세척하고 콜로니를 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색하였다. HPRT 유전자 보정 백분율은 각각의 원래 웰에 대한 총 CFU 당 HAT-내성 CFU의 수로 계산하였다.
실험 결과는 하기 표 8에 제공되어 있다.
표 8
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF WASHINGTON <120> A Method of Gene Editing <130> 19-107-PCT <150> US 62/798,357 <151> 2019-01-29 <160> 113 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 ctcactgagt gatacttta 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 taaagtatca ctcagtgag 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 caatctggtt ctaagaata 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 tattcttaga accagattg 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 gtcagtgttg tattggaaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 tttccaatac aacactgac 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 agcagcgatg tgatttgc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 gcaaatcaca tcgctgct 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 accttcctat gatattgat 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 atcaatatca taggaaggt 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 gtgtccatta cttcaatat 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 atattgaagt aatggacac 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 ggatgaatgt gcagaataa 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 ttattctgca cattcatcc 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 ttaacagtct ggttaaaca 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 tgtttaacca gactgttaa 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 gacttcatct gcagagaga 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 tctctctgca gatgaagtc 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 ggctcaacat gaagcagaa 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 ttctgcttca tgttgagcc 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 gccactggtt ccttcacca 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 tggtgaagga accagtggc 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 gggaatctgt cctgcagaa 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 ttctgcagga cagattccc 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 ggatgaagct cattgtgtt 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 aacacaatga gcttcatcc 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 gtgttgcgct gcctcttga 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 tcaagaggca gcgcaacac 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 tctatgatgt gcaattcaa 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 ttgaattgca catcataga 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 attgaccgaa tcactcgtg 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 cacgagtgat tcggtcaat 19 <210> 33 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 tcagtgttgt attggaaatt ggatccaatt tccaatacaa cactgacttt ttctcgag 58 <210> 34 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 ggccctcgag aaaaagtcag tgttgtattg gaaattggat ccaatttcca atacaacact 60 ga 62 <210> 35 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 tgtccattac ttcaatattt ggatccaaat attgaagtaa tggacac 47 <210> 36 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 ggccctcgag aaaaagtgtc cattacttca atatttggat ccaaatattg aagtaatgga 60 ca 62 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 acttcatctg cagagagatt ggatccaatc tctctgcaga tgaagtcttt ttctcgag 58 <210> 38 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 ggccctcgag aaaaagactt catctgcaga gagattggat ccaatctctc tgcagatgaa 60 gt 62 <210> 39 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 ccactggttc cttcaccatt ggatccaatg gtgaaggaac cagtggcttt ttctcgag 58 <210> 40 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 ggccctcgag aaaaagccac tggttccttc accattggat ccaatggtga aggaaccagt 60 gg 62 <210> 41 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 41 gatgaagctc attgtgtttt ggatccaaaa cacaatgagc ttcatccttt ttctcgag 58 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 42 ggccctcgag aaaaaggatg aagctcattg tgttttggat ccaaaacaca atgagcttca 60 tcc 63 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 43 gctgacatcg ttcttagta 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 tactaagaac gatgtcagc 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 45 gcaggaagct gctctgtta 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 46 taacagagca gcttcctgc 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 47 ggaatcatct ggaaagaat 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 48 attctttcca gatgattcc 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 49 ccgtagtcac tgtatggaat 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 attccataca gtgactacgg 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 51 gggctaaact gatttcctt 19 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 52 aaggaaatca gtttagccc 19 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 53 gtcttacatg catactgta 19 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 tacagtatgc atgtaagac 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 55 gccagctaat gctatcaaa 19 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 tttgatagca ttagctggc 19 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 gcattagttt ctcagttaa 19 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 ttaactgaga aactaatgc 19 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 gtattcaagt gattgttaa 19 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 ttaacaatca cttgaatac 19 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 ggatgttgta cttgagaat 19 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 62 attctcaagt acaacatcc 19 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 63 gcacagaagg ttgctatat 19 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 64 atatagcaac cttctgtgc 19 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 65 gtcttcaagt tgaacctga 19 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 66 tcaggttcaa cttgaagac 19 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 67 cccaggatgc cattgttaa 19 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 68 ttaacaatgg catcctggg 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 69 gactttacaa gaagattta 19 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 70 taaatcttct tgtaaagtc 19 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 71 gaaatcattt cacgaataa 19 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 72 ttattcgtga aatgatttc 19 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 73 ctctttggct gccatcata 19 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 74 tatgatggca gccaaagag 19 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 75 gactctgtag catttatca 19 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 76 tgataaatgc tacagagtc 19 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 77 gccagtttgt gaactagaa 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 78 ttctagttca caaactggc 19 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 79 gcctctagtt gatattgaa 19 <210> 80 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 80 ttcaatatca actagaggc 19 <210> 81 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 81 gcatttacac tgtttgcta 19 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 82 tagcaaacag tgtaaatgc 19 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 83 gctgctgaat caaagataa 19 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 84 ttatctttga ttcagcagc 19 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 85 gccagtgact ttgagatta 19 <210> 86 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 86 taatctcaaa gtcactggc 19 <210> 87 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 87 gctggtcctt attgatgaa 19 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 88 ttcatcaata aggaccagc 19 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 89 gccctctttg tttccttat 19 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 90 ataaggaaac aaagagggc 19 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 91 cagatgaagc cttaaataa 19 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 92 ttatttaagg cttcatctg 19 <210> 93 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 93 gctctgatgt ggaatttaa 19 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 94 ttaaattcca catcagagc 19 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 95 ctattacgtt cctctataa 19 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 96 ttatagagga acgtaatag 19 <210> 97 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 97 attgatccga ttcgattgc 19 <210> 98 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 98 gcaatcgaat cggatcaat 19 <210> 99 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 99 ttgtaatttc ctgtgcaatt ggatccaatt gcacaggaaa ttacaacttt ttc 53 <210> 100 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 100 tcgagaaaaa gttgtaattt cctgtgcaat tggatccaat tgcacaggaa attacaa 57 <210> 101 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 101 gttgacagtg agcgcggaga gacttggata atgcaatagt gaagccacag atgtattgca 60 ttatccaagt ctctccttgc ctactgcctc 90 <210> 102 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 102 gttgacagtg agcgcgcgca ttatctcagc tacttatagt gaagccacag atgtataagt 60 agctgagata atgcgcttgc ctactgcctc 90 <210> 103 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 103 gttgacagtg agcgcccgta gtcactgtat ggaatatagt gaagccacag atgtatattc 60 catacagtga ctacggttgc ctactgcctc 90 <210> 104 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 104 gttgacagtg agcgtaagca gcgatgtgat ttgcattagt gaagccacag atgtaatgca 60 aatcacatcg ctgcttatgc ctactgcctc 90 <210> 105 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 105 gttgacagtg agcgtgatct agttacagct gaagcatagt gaagccacag atgtatgctt 60 cagctgtaac tagatcatgc ctactgcctc 90 <210> 106 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 106 gttgacagtg agcgtggaca tttactggct catgattagt gaagccacag atgtaatcat 60 gagccagtaa atgtccatgc ctactgcctc 90 <210> 107 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 107 gttgacagtg agcgcggact ttatcagaaa ctcaaatagt gaagccacag atgtatttga 60 gtttctgata aagtccttgc ctactgcctc 90 <210> 108 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 108 gttgacagtg agcgcgccac gtttcaacag atatattagt gaagccacag atgtaatata 60 tctgttgaaa cgtggcttgc ctactgcctc 90 <210> 109 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 109 gttgacagtg agcgcggagt ctgcgtgcga ggattatagt gaagccacag atgtataatc 60 ctcgcacgca gactccttgc ctactgcctc 90 <210> 110 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 110 gttgacagtg agcgaaacct tcctatgata ttgatatagt gaagccacag atgtatatca 60 atatcatagg aaggttgtgc ctactgcctc 90 <210> 111 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 111 gttgacagtg agcgcggtgt ccattacttc aatatttagt gaagccacag atgtaaatat 60 tgaagtaatg gacaccatgc ctactgcctc 90 <210> 112 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 112 gttgacagtg agcgaaggtt atctgtgcta caattgtagt gaagccacag atgtacaatt 60 gtagcacaga taacctgtgc ctactgcctc 90 <210> 113 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 113 gttgacagtg agcgcgcaga tcatgtgtga gctaaatagt gaagccacag atgtatttag 60 ctcacacatg atctgcatgc ctactgcctc 90

Claims (84)

  1. 세포에서 유전자를 편집하는 방법으로서, 세포에서 복제 분기점(fork) 기능을 조절하는 단계, 및 상기 세포에서 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포를 유전자 편집 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할(small internally segmented) 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴인, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 siRNA인, 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 shRNA인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 기능이 DNA 합성인, 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 선도 가닥 합성 억제제인, 방법.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 지연 가닥 합성 억제제인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 기능을 조절하는 단계가 복제 분기점 단백질의 기능 또는 발현 수준을 조절하는 단계를 포함하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 DNA 폴리머라제 α, DNA 프리마제, RNA 프리마제, DNA 폴리머라제 ε, DNA 폴리머라제 δ, 분기점 보호 복합체(FPC) 성분 Timeless, Tipin, Claspin 및 And1, Cdc45, MCM 2-7(미니 염색체 유지) 헬리카제 2-7 육량체 단백질(Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6 및 Mcm7), GINS(go-ichi-ni-san) 복합체 단백질(Sld5, Psf1, Psf2 및 Psf3), 복제 단백질 A(RPA), 복제 인자 C 클램프 로더(RFC) 단백질(Rfc1, Rfc2, Rfc3, Rfc4, 및 Rfc5), RMI1 단백질, ATR 키나제, ATR-상호작용 단백질(ATRIP), RecQ 헬리카제 단백질(RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5), 불일치 복구(MMR) 단백질(PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6), 및 증식 세포 핵 항원(PCNA), Flap 엔도뉴클레아제 1(Flap1), DNA 리가제, 후기 촉진 복합체 서브유닛 5, RecQ-매개된 게놈 불안정성 단백질 1, 기원 인식 복합체 서브유닛 1, 호메오박스 단백질 Meis2, DNA 토포이소머라제 III 알파, DNA 폴리머라제 엡실론 4, 및 FANCM 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RecQ 헬리카제 단백질(RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5), 불일치 복구(MMR) 단백질(PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6), 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질인, 방법.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질인, 방법.
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)인, 방법.
  18. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴인, 방법.
  19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 siRNA인, 방법.
  20. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 shRNA인, 방법.
  21. 제13항 또는 제16항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴인, 방법.
  22. 제13항 또는 제16항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 siRNA인, 방법.
  23. 제13항 또는 제16항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 shRNA인, 방법.
  24. 제13항 또는 제17항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴인, 방법.
  25. 제13항 또는 제17항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 상기 복제 분기점 조절제가 siRNA인, 방법.
  26. 제13항 또는 제17항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 상기 복제 분기점 조절제가 shRNA인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 및 배아 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 영장류 세포인, 방법.
  29. 제1항 내지 제26항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 분화된 세포인, 방법.
  30. 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에서의 유전자 편집 효율이 복제 분기점 조절제과 접촉되지 않은 세포에서의 유전자 편집 효율보다 더 큰 것인, 방법.
  31. 세포에서 유전자를 편집하는 방법으로서, 세포에서 유전자를 편집하기 전에 일정 기간 동안 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포에서 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 일정 기간이 8 시간 내지 7 일인, 방법.
  33. 세포에서 유전자를 편집하는 방법으로서, 유전자 편집 동안 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계, 및 세포에서 유전자를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 세포에서 유전자를 편집하는 방법으로서, 세포에서 유전자를 편집한 후에 일정 기간 동안 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 선도 가닥 합성 억제제인, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 지연 가닥 합성 억제제인, 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 유전자 편집 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
  40. 대상체의 세포에서 유전자를 편집하는 방법으로서,
    a. 유전자 편집 벡터를 대상체에게 투여하는 단계; 및
    b. 복제 분기점 조절제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 유전자 편집 벡터를 투여한 후에 투여되는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 유전자 편집 벡터를 투여하기 전에 투여되는, 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터 및 복제 분기점 조절제가 동시에 투여되는, 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 선도 가닥 합성 억제제인, 방법.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 지연 가닥 합성 억제제인, 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
  48. 세포에서 유전자를 편집하는 방법으로서,
    a. 세포에서 유전자를 편집하는 단계; 및
    b. 유전자 편집된 세포를 복제 분기점 조절제와 일정 기간 동안 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 선도 가닥 합성 억제제인, 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 지연 가닥 합성 억제제인, 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 유전자 편집 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
  54. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RecQ 헬리카제 단백질(RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5), 불일치 복구(MMR) 단백질(PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6), 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  55. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질인, 방법.
  56. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질인, 방법.
  57. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)인, 방법.
  58. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴인, 방법.
  59. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 siRNA인, 방법.
  60. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 RECQL1, RECQL2, RECQL3, RECQL4 및 RECQL5로 이루어진 군으로부터 선택된 RecQ 헬리카제 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 shRNA인, 방법.
  61. 제31항 내지 제53항 및 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴인, 방법.
  62. 제31항 내지 제53항 및 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 siRNA인, 방법.
  63. 제31항 내지 제53항 및 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 PMS2, PMS2, MLH1, MLH2, MLH3, MSH4, MSH5 및 MSH6으로 이루어진 군으로부터 선택된 불일치 복구(MMR) 단백질이고, 상기 복제 분기점 조절제가 shRNA인, 방법.
  64. 제31항 내지 제53항 및 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴인, 방법.
  65. 제31항 내지 제53항 및 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 상기 복제 분기점 조절제가 siRNA인, 방법.
  66. 제31항 내지 제53항 및 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 단백질이 증식 세포 핵 항원(PCNA)이고 상기 복제 분기점 조절제가 shRNA인, 방법.
  67. 제31항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 및 배아 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  68. 제31항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 영장류 세포인, 방법.
  69. 제31항 내지 제66항 및 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 분화된 세포인, 방법.
  70. 세포에서 복제 분기점 기능을 조절함으로써 수득된 유전자 편집된 세포의 집단을 포함하는, 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 세포의 집단에서 유전자 편집 효율이 상기 세포에서 복제 분기점 기능을 조절하지 않은 채로 유전자 편집된 제2 세포의 집단에서 보다 더 큰 것인, 조성물.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 유전자 편집된 세포의 집단이 상기 세포를 복제 분기점 조절제와 접촉시킴으로써 상기 세포에서 복제 분기점 기능을 조절하여 수득되는 것인, 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 선도 가닥 합성 억제제인, 조성물.
  75. 제72항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 지연 가닥 합성 억제제인, 조성물.
  76. 유전자 편집 벡터 및 외인성 복제 분기점 조절제를 포함하는 세포.
  77. 제76항에 있어서, 상기 유전자 편집 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 세포.
  78. 유전자 변형 및 외인성 복제 분기점 조절제를 포함하는, 세포.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 에메틴, 데하이드로에메틴, 에메틴 디하이드로클로로 수화물, 세파엘린, 또는 이의 염; RecQ 헬리카제에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; PCNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체; 및 불일치 복구 단백질에 특이적인 shRNA, siRNA, 앱타머, 작은 내부적 분할 간섭 RNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포.
  80. 제761항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 선도 가닥 합성 활성제 또는 선도 가닥 합성 억제제인, 세포.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 분기점 조절제가 지연 가닥 합성 활성제 또는 지연 가닥 합성 억제제인, 세포.
  82. 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항의 세포로부터 유래되거나 또는 분화되는 세포.
  83. 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제70항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 필요로 하는 대상체에서 이식하는 방법으로서, 제70항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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