CN113396220A - 基因编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了：编辑细胞中的基因的方法，其涉及使所述细胞与复制叉调节剂接触；以及编辑的细胞及其使用方法。

Description

基因编辑的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年1月29日提交的美国临时专利申请序列号62/798357的优先权，所述临时专利申请通过引用以其全文并入本文。
联邦资助声明
本发明是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的批准号R01 DK055759在政府支持下进行。政府享有本发明的一定权利。
技术领域
本发明涉及基因编辑的方法、编辑细胞的产生及其使用方法。
背景技术
复制叉(RF)是具有解旋酶和DNA合成活性的多蛋白复合物。复制叉具有两个分支的“叉子”，每一个叉子由单链DNA组成。这两条链充当前导链和滞后链DNA合成的模板。复制解旋酶解开亲本双链DNA，从而暴露两个ssDNA模板。DNA聚合酶进行DNA合成。由于双链DNA的反平行性质，DNA复制在复制叉处两条新链之间的相反方向发生。DNA合成由DNA聚合酶介导。在与移动复制叉的方向相同的方向上合成的链、即前导链被连续复制，而在相反方向上合成的链、即滞后链不被连续复制。与复制叉相关的多种蛋白质的协调和调控活性介导DNA复制。(在Waga和Stillman,1998,Annu.Rev.Biochem.67:721-51以及Burgers和Kunkel,2017Annu.Rev.Biochem.86:417-438中综述)
发明内容
本发明提供了一种编辑细胞中的基因的方法，其包括调节所述细胞中的复制叉功能，以及编辑所述细胞中的所述基因。
在一个实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与复制叉调节剂接触。
在另一个实施方案中，所述方法还包括将所述细胞与基因编辑载体接触。
在另一个实施方案中，所述基因编辑载体是腺相关病毒(AAV)载体。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA(small internally segmented interfering RNA)、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是依米丁。在某些实施方案中，依米丁的施用浓度在1nM至100,000nM之间，例如为10nM至10,000nM、100nM-10,000nM、200nM-10,000nM、300nM-10,000nM、400nM-10,000nM、500nM至10,000nM、或在100nM与10,000nM之间，或在100nM与1000nM之间，例如为100nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM或950nM，或在1000nM与10,000nM之间，例如为1000nM、2000nM、3000nM、4000nM、5000nM、6000nM、7000nM、8000nM、9000nM和10,000nM。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是siRNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是shRNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉调功能是DNA合成。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述方法还包括调节复制叉蛋白的功能或表达水平。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白选自由以下组成的组中：DNA聚合酶α、DNA引发酶、RNA引发酶、DNA聚合酶ε、DNA聚合酶δ、叉保护复合物(FPC)组分Timeless、Tipin、Claspin和And1、Cdc45、MCM 2-7(微型染色体维持)解旋酶2-7六聚体蛋白(Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6和Mcm7)、go-ichi-ni-san(GINS)复合物蛋白(Sld5、Psf1、Psf2和Psf3)、复制蛋白A(RPA)、复制因子C夹钳装载(RFC)蛋白(Rfc1、Rfc2、Rfc3、Rfc4和Rfc5)、RMI1蛋白、ATR激酶、ATR相互作用蛋白(ATRIP)、RecQ解旋酶蛋白(RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5)、错配修复(MMR)蛋白(PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6)、增殖细胞核抗原(PCNA)、DNA连接酶、瓣状核酸内切酶1(FEN1)、后期促进复合物亚基5、RecQ介导的基因组不稳定性蛋白1、起点识别复合物亚基1、同源框蛋白Meis2、DNA拓扑异构酶IIIα、DNA聚合酶ε4。
在另一个实施方案中，所述方法还包括调节参与DNA复制的蛋白、例如FANCM蛋白的功能和表达水平。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白选自由以下组成的组：RecQ解旋酶蛋白(RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5)、MMR蛋白(PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6)和PCNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是PCNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)并且所述复制叉调节剂是依米丁。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是PCNA并且所述复制叉调节剂是siRNA。
在另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是PCNA并且所述复制叉调节剂是shRNA。
在另一个实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组中：多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
在另一个实施方案中，所述细胞是灵长类动物细胞。
在另一个实施方案中，所述细胞是分化细胞。
在另一个实施方案中，在所述细胞中的基因编辑效率大于在未与复制叉调节剂接触的细胞中的基因编辑效率。
本发明还提供了一种编辑细胞中的基因的方法，其包括在编辑所述细胞中的所述基因之前使细胞与复制叉调节剂接触一定时间段，以及编辑所述细胞中的所述基因。
在一个实施方案中，所述时间段是约8小时至约7天。
本发明还提供了一种编辑细胞中的基因的方法，其包括在基因编辑期间使细胞与复制叉调节剂接触。
本发明还提供了一种编辑细胞中的基因的方法，其包括在编辑所述细胞中的所述基因之后使所述细胞与复制叉调节剂接触一定时间段，以及编辑所述细胞中的所述基因。
在一个实施方案中，所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述方法还包括将所述细胞与基因编辑载体接触。
在另一个实施方案中，所述基因编辑载体是腺相关病毒(AAV)载体。
本发明还提供了一种编辑受试者的细胞中的基因的方法，其包括：向所述受试者施用基因编辑载体；以及向所述受试者施用复制叉调节剂。
在一个实施方案中，在施用所述基因编辑载体之后施用所述复制叉调节剂。
在另一个实施方案中，在施用所述基因编辑载体之前施用所述复制叉调节剂。
在另一个实施方案中，同时施用所述基因编辑载体和所述复制叉合成调节剂。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述基因编辑载体是AAV载体。
本发明还提供了一种编辑细胞中的基因的方法，其包括：编辑所述细胞中的所述基因；以及使所基因编辑的细胞与复制叉调节剂接触一定时间段。
在一个实施方案中，所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述方法还包括将所述细胞与基因编辑载体接触。
在另一个实施方案中，所述基因编辑载体是AAV载体。
本发明还提供了一种组合物，其包含基因编辑细胞群体，其中所述细胞群体通过用复制叉调节剂调节所述细胞中的复制叉功能来获得。
在一个实施方案中，在所述细胞群体中的基因编辑效率大于第二细胞群体中的基因编辑效率，所述第二细胞群体在不存在调节所述细胞中的复制叉功能的情况下进行基因编辑。
在一个实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与复制叉调节剂接触。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白选自由以下组成的组中：RecQ解旋酶蛋白(RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5)、MMR蛋白(PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6)和PCNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是PCNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的MMR蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是PCNA并且所述复制叉调节剂是依米丁。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是PCNA并且所述复制叉调节剂是siRNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述复制叉蛋白是PCNA并且所述复制叉调节剂是shRNA。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组中：多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述细胞是灵长类动物细胞。
在另一个实施方案中，所述细胞是分化细胞。
在另一个实施方案中，所述方法包括一种或多种、例如1、2、3、4、5、6、7或更多种复制叉调节剂。
在另一个实施方案中，本发明方法包括一种或多种复制叉调节剂，例如依米丁与shRNA的组合、或依米丁与siRNA的组合、或依米丁与shRNA和siRNA的组合或shRNA与siRNA的组合。在另一个实施方案中，所述方法包括一种或多种复制叉调节剂，例如前导链合成抑制剂与shRNA的组合、前导链合成抑制剂与siRNA的组合、前导链合成抑制剂与shRNA和siRNA的组合、或前导链合成抑制剂与滞后链合成抑制剂的组合。在另一个实施方案中，所述方法包括一种或多种复制叉调节剂，例如滞后链合成抑制剂与shRNA组合、滞后链合成抑制剂与siRNA的组合或滞后链合成抑制剂与shRNA和siRNA的组合。
本发明还提供了包含基因编辑载体和外源性复制叉调节剂的细胞，以及由所述细胞衍生或分化而来的细胞。
在一个实施方案中，所述基因编辑载体是AAV载体。
本发明还提供了包含基因修饰和外源性复制叉调节剂的细胞，以及由所述细胞衍生或分化而来的细胞。
在一个实施方案中，所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是前导链合成激活剂或前导链合成抑制剂。
在另一个实施方案中，所述复制叉调节剂是滞后链合成激活剂或滞后链合成抑制剂。
本发明还提供了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明细胞。
本发明还提供了一种在有需要的受试者中移植的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明细胞。
附图说明
下面参考以下非限制性实施例并参考以下附图进一步描述本发明。
图1是人复制叉的示意图。
图2是展示依米丁对小鼠Hepa1-6细胞中的基因编辑的影响的图。
图3是展示依米丁对小鼠肝脏中的体内基因编辑的影响的图。
图4是展示siRNA对RecQ解旋酶蛋白的抑制对基因编辑的影响的图。
图5是展示shRNA对RecQ解旋酶蛋白的抑制对基因编辑的影响的图。
图6是展示shRNA对RecQ解旋酶蛋白的抑制对基因编辑的影响的图。
图7是展示siRNA对错配修复(MMR)蛋白的抑制对基因编辑的影响的图。
图8是展示siRNA对错配修复(MMR)蛋白组合的抑制对基因编辑的影响的图。
图9是展示shRNA对PCNA的抑制对基因编辑的影响的图。
图10呈现了根据本发明可用的载体((A)shRNA载体、(B)AAV-mAlb-GFP、(C)AAV-mAlb-萤光素酶)、(D)AAV-HPe3(AAV2-HPe3)和(E)AAV2-HSN5’及MLV-LHSN63Δ530。
具体实施方式
本发明至少部分地涉及一种基因编辑方法，其包括通过使用复制叉调制剂调节与复制叉相关的蛋白质或编码与复制叉相关的蛋白质的基因的活性或表达，或调节基因编辑。
定义
如本文所用，“基因编辑”或“基因工程化”是指通过插入、缺失、取代、替换或改变一个或多个核苷酸来修饰靶DNA序列，例如以修复与特定疾病或障碍相关的不希望的基因突变。基因编辑可能导致基因不表达、以高于或低于未编辑基因的表达水平的水平表达、无法产生野生型蛋白质、产生蛋白质的突变形式或与未编辑基因相比以不同的时间或在不同的环境中表达。基因编辑载体可用于编辑细胞中的基因。
“编辑细胞”是其中已发生编辑事件的细胞。在一个实施方案中，“编辑细胞”包括已经与基因编辑载体和复制叉调节剂接触的细胞。在一个实施方案中，“编辑细胞”包括包含基因编辑载体和复制叉调节剂的细胞。在另一个实施方案中，“编辑细胞”还包括包含复制叉调节剂或基因编辑载体的细胞。在进一步的实施方案中，“编辑细胞”也是从其中已发生编辑事件的细胞衍生或分化而来的细胞。细胞可以通过本领域已知的任何方法进行基因编辑，例如通过引入编辑载体。
如本文所用，“复制叉调节剂”意指调节复制叉功能，例如DNA合成或DNA双螺旋的解旋的药剂。如本文所用，“调节”意指增加或减少。在一个实施方案中，“复制叉调节剂”包括调节蛋白质或相应基因的活性或表达水平的药剂，其中蛋白质与复制叉相关。复制叉调节剂可以增加或减少蛋白质或相应基因的表达水平，或蛋白质的活性水平。在一个实施方案中，复制叉调节剂直接调节表达或活性水平。在另一个实施方案中，复制叉调节剂例如通过以下方式间接调节表达或活性水平：直接调节蛋白质，所述蛋白质进而直接调节与复制叉相关的蛋白质的表达或活性水平。
在一个实施方案中，复制叉调节剂调节细胞中的基因编辑活性。在一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少进入细胞的基因编辑载体的量。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少基因编辑载体在细胞中的稳定性。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少载体与靶基因座处的同源染色体序列之间的同源配对水平。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少载体与靶基因座之间的重组。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少DNA修复合成过程，其中载体序列被拷贝到染色体的相反链中。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少染色体靶基因座处位点特异性双链断裂的形成。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少双链断裂处的同源定向修复和/或非同源末端连接。
如本文所用，“激活”或“增加”在涉及表达或活性水平时意指相比于活性或表达的对照水平的增加，例如增加2倍或更多，例如2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。激活或增加还意指相比于活性或表达的对照水平增加5％或更多，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。例如，与不存在复制叉调节剂的情况下的复制叉活性水平相比，在存在复制叉调节剂的情况下可以增加复制叉活性水平。在另一个实例中，与不存在复制叉调节剂的情况下的细胞中的基因编辑活性水平相比，在存在复制叉调节剂的情况下可以增加细胞中的基因编辑活性水平。
如本文所用，“抑制”或“减少”在涉及表达或活性水平时意指相比于活性或表达的对照水平的降低，例如降低2倍或更多，例如2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。抑制还意指相比于活性或表达的对照水平降低5％或更多，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。抑制还意指完全抑制，使得检测不到表达或活性。例如，与不存在复制叉调节剂的情况下的复制叉活性水平相比，在存在复制叉调节剂的情况下可以抑制复制叉活性水平。在另一个实例中，与存在复制叉调节剂的情况下的细胞中的基因编辑活性水平相比，在不存在复制叉调节剂的情况下可以抑制基因编辑活性水平。
在某些实施方案中，复制叉调节剂“特异性调节”表达或活性水平。复制叉调节剂特异性调节、增加或减少特定的表达或活性水平，但不显著影响另一种表达或活性水平。在一个实施方案中，特异性抑制与复制叉相关的活性(例如滞后链合成)的复制叉调节剂抑制滞后链合成但不显著影响前导链合成。在其他实施方案中，特异性增加与复制叉相关的活性(例如滞后链合成)的复制叉调节剂增加滞后链合成但不显著影响前导链合成。
在某些实施方案中，“特异性调节”与复制叉相关的基因或蛋白质(例如，DNA polδ)的表达水平的复制叉调节剂调节DNA polδ的水平并且不显著影响与复制叉相关的另一种基因或蛋白质的表达水平。
根据本发明可用的复制叉调节剂包括但不限于小分子、蛋白质、肽和核酸，例如适体、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小内在片段化干扰RNA、microRNA、反义寡核苷酸和信号干扰DNA(siDNA)。在某些实施方案中，复制叉调节剂是对RecQ解旋酶蛋白、增殖细胞核抗原或错配修复蛋白具有特异性的siRNA或shRNA。在一个实施方案中，复制叉调节剂是依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐。根据本发明可用的另外的复制叉调节剂包括但不限于针对参与复制叉活性的与复制叉相关的蛋白的单克隆抗体、双特异性T细胞接合器、序列特异性表观遗传调节剂(例如，与染色质修饰剂连接的基于Cas9的分子)、靶向蛋白质降解系统(例如，泛素系统)和控制复制叉蛋白基因的可诱导调控表达系统。
在一个实施方案中，“组合物”包含基因编辑载体和/或复制叉调节剂。在具体实施方案中，组合物包含基因编辑载体和复制叉调节剂。在另一个实施方案中，组合物包含复制叉调节剂或包含基因编辑载体的细胞。在一些实施方案中，组合物包含编辑细胞。在一些实施方案中，组合物不包含编辑细胞。在一些实施方案中，组合物包含从编辑细胞衍生或分化而来的细胞。“组合物”可以包括包含本发明组合物的配制品。
如本文所用的与使细胞与本发明组合物接触有关的术语“接触(contacting)”或“接触(contact)”是指使本发明组合物与细胞足够接近和/或直接接触的任何手段。在一些实施方案中，接触是指在包含本发明组合物的培养基中培养细胞。在另一个实施方案中，接触是指向受试者施用本发明组合物。
如本文所用，“细胞群体”意指两个或更多个细胞。
如本文所用，“基因编辑效率”意指基因编辑的水平，例如细胞中编辑事件的数量、编辑事件的频率、细胞群体中编辑细胞的数量或编辑在一个细胞或细胞群体中发生的速度。
基因编辑效率的增加可以是相比于基因编辑对照水平的2倍或更多，例如2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多的增加。增加还意指相比于基因编辑对照水平增加5％或更多，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在一个实施方案中，基因编辑效率的增加是相比于未与复制叉调节剂和基因编辑载体接触的对照细胞、已经与基因编辑载体接触但未与复制叉调节剂接触的细胞、已经与复制叉调节剂接触但未与基因编辑载体接触的细胞中的基因编辑效率或相比于基因编辑的预定对照水平增加的。
关于“受试者”意指生物体。在一个实施方案中，受试者是本发明组合物的供体或受体，或由其衍生或分化的子代。“受试者”还是指需要基因编辑的生物体。“受试者”还是指可以向其施用本发明细胞的生物体。“受试者”还是指向其施用复制叉调节剂和/或基因编辑载体的生物体。受试者可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或人细胞。术语“受试者”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠；和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物，例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。“受试者”可以根据本发明方法进行治疗或被筛选用于药物开发目的。根据本发明的一些实施方案的受试者包括需要对根据本发明的疾病的治疗性或预防性治疗、或者接受预防性或治疗性治疗的患者、人或其他对象。
本发明的各种方法包括涉及将值、水平、特征、特性和/或性能与“对照”进行比较的步骤。“对照”可以是本领域普通技术人员熟悉的用于比较目的的任何对照或标准。在一个实施方案中，“对照”是在进行如本文所述的编辑细胞中的基因的方法之前确定的值、水平、特征、特性、性能等。例如，可以在将复制叉调节剂和/或基因编辑载体引入至细胞中之前，或在不存在复制叉调节剂和/或基因编辑载体的情况下确定编辑的发生、编辑事件的数量、编辑的效率和细胞群体中编辑的细胞的数量。“对照”还包括已经在不存在复制叉调节剂的情况下进行编辑的细胞。在另一个实施方案中，“对照”是在表现出例如正常性状的细胞或生物体(例如对照或正常细胞或生物体)中确定的值、水平、特征、特性、性能等。在又一个实施方案中，“对照”是在添加复制叉调节剂和/或基因编辑载体之前确定的预定义值、水平、特征、特性、性能等。
因此，“对照受试者”可以是指与已经根据本发明治疗的受试者进行比较的受试者。“对照受试者”可能未被诊断患有疾病或病症或针对疾病或病症进行治疗。“对照受试者”也可以是指没有发展疾病或病症的风险的受试者。“对照受试者”还可以是指未向其施用根据本发明的细胞的受试者。“对照受试者”还可以是指未用复制叉调节剂和/或编辑载体治疗的受试者。
“对照细胞”可以是指与已经与基因编辑载体和/或复制叉调节剂接触的细胞进行比较的细胞。“对照细胞”可能未与基因编辑载体和/或复制叉调节剂接触。“对照细胞”可能已经在相比于作为对照所针对的细胞不同的条件(包括剂量、时间长度等)下与基因编辑载体和/或复制叉调节剂接触。
本发明的方法用于提供已发生编辑事件的细胞以及从已经发生编辑事件的细胞衍生或分化而来的细胞。在某些实施方案中，编辑细胞包含复制叉调节剂或基因编辑载体。本发明还提供了包含复制叉调节剂和基因编辑载体的细胞。所述方法提供了具有增加的基因编辑事件频率的细胞、以及具有增加的编辑细胞数量的细胞群体的产生。所述方法还提供了一种更高效的产生编辑细胞的方法。本发明的细胞可用于缓和症状或治疗疾病或移植。
基因编辑
细胞可以通过本领域已知的任何方法进行基因编辑，例如通过引入编辑载体。根据本发明可用的基因编辑载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括但不限于逆转录病毒、γ逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)载体和细小病毒载体。
非病毒载体包括但不限于质粒载体，例如pORT、pCOR、pFAR、Minicircle质粒、Minivector质粒、Mini knot质粒和MIDGE、MiLV和ministring质粒(参见Hardee等人2017,Genes,8:65)。用于将遗传物质引入至细胞中进行基因编辑的另外的非病毒载体系统/方法包括物理方法(针头施用、弹道DNA、电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁转染、水穿孔、机械按摩)、化学载体(磷酸钙、二氧化硅、金、阳离子脂质、脂质纳米乳剂、固体脂质纳米颗粒和基于肽的递送方法)和基于聚合物的载体(聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚(DL-丙交酯)和聚(DL-丙交酯-共-糖苷)、树枝状聚合物和聚甲基丙烯酸酯)(参见Ramamoorth等人J.Clinical andDiagnostic Res.,2015,9:1-6)。DNA、RNA和寡核苷酸也可用于基因转移。
基于CRISPR的方法也可用于基因编辑。
可以使用以下方法进行基因编辑：腺相关病毒(AAV)载体基因靶向方法(参见Inoue等人,1999,J.Virology,73:7376-7380和Khan等人,2011,Nature Protocols,6:482-501)，例如使用AAV-mAlb-GFP、AAV-HPe3、AAV2-HSN5'和AAV-Alb-萤光素酶(参见图10)。根据本发明可用的其他AAV载体是本领域已知的。
本发明还提供了一种编辑受试者中的基因的体内方法，其包括向受试者施用本发明的基因编辑载体和复制叉调节剂。
可以单独地或同时用复制叉调节剂和基因编辑载体治疗适当的受试者。
本发明提供了一种编辑受试者中的基因的体内方法，其包括向受试者施用包含基因编辑载体和复制叉调节剂的单一组合物。在一个实施方案中，本发明提供编辑受试者中的基因的体内方法，其包括同时施用包含基因编辑载体的第一组合物和包含复制叉调节剂的第二组合物。
本发明还提供了一种编辑受试者中的基因的体内方法，其包括向受试者依序施用包含基因编辑载体的第一组合物和单独施用包含复制叉调节剂的第二组合物。在一个实施方案中，包含基因编辑载体的组合物在施用包含复制叉调节剂的组合物之前施用。在另一个实施方案中，包含复制叉调节剂的组合物在施用包含基因编辑载体的组合物之前施用。在一个实施方案中，可以施用包含基因编辑载体的组合物，并且在一定时间段之后，施用包含复制叉调节剂的组合物。在另一个实施方案中，施用包含复制叉调节剂的组合物，并且在一定时间段之后，施用包含基因编辑载体的组合物。
如本文所用，“时间段”可以是15分钟或更长时间，例如15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时至24小时，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24小时或更长时间。时间段还包括10-20小时、12-18小时、12-15小时、15至18小时、8-10小时或10-12小时。在某些实施方案中，时间段是2天或更长时间，例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天或更长时间。
复制叉调节剂和/或基因编辑载体可以施用一次或多次。复制叉调节剂和基因编辑载体可以通过任何已知的方法施用，例如如下文在标题为“施用剂量和方式”的部分中所述的。在某些实施方案中，基因编辑载体和/或复制叉调节剂在细胞中施用。在其他实施方案中，基因编辑载体和/或复制叉调节剂不是在细胞中施用。
本发明方法可以用于编辑任何感兴趣的基因。
主要组织相容性复合物(MHC)是存在于所有脊椎动物中的细胞表面多组分分子，其介导白细胞与其他白细胞或其他细胞的相互作用。MHC基因家族分为三组：I类、II类和III类。在人中，MHC称为人白细胞抗原(HLA)。I类分子由α链(或重链)和β2微球蛋白(B2M)组成，而II类分子由两个同源亚基组成：α亚基和β亚基。
在一个实施方案中，本发明方法可用于编辑人白细胞抗原(HLA)I类或II类相关基因。在另一个实施方案中，本发明方法可用于编辑B2M基因。
HLA I类(HLA-I)蛋白在所有有核细胞上表达，并且由HLA I类重链(或α链)和B2M组成。HLA I类蛋白将细胞表面上的肽呈递给CD8+细胞毒性T细胞。迄今为止，已鉴定出6条HLA I类α链，包括3条经典α链(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和3条非经典(HLA-E、HLA-F和HLA-G)α链。HLA I类分子肽结合裂隙上的肽结合特异性由α链决定。CD8+T细胞对HLA I类分子呈递的肽的识别介导细胞免疫。
HLA II类分子(HLA-II)是仅存在于专职性抗原呈递细胞(APC)(包括巨噬细胞、树突细胞和B细胞)上的跨膜蛋白。此外，实质器官有时可能表达参与免疫排斥的HLA II类基因。HLA II类(HLA-II)分子或蛋白质在细胞表面上呈递来自细胞外蛋白质(包括细胞外病原体的蛋白质)的肽抗原上，而HLA I类蛋白质呈递来自细胞内蛋白质或病原体的肽。细胞表面上加载的HLA II类蛋白质与CD4+辅助T细胞相互作用。所述相互作用通过激活B细胞导致吞噬细胞的募集、局部炎症和/或体液应答。迄今为止，已鉴定出若干种HLA II类基因座，包括HLA-DM(HLA-DMA和HLA-DMB分别编码HLA-DMα链和HLA-DMβ链)、HLA-DO(HLA-DOA和HLA-DOB分别编码HLA-DOα链和HLA-DOβ链)、HLA-DP(HLA-DPA和HLA-DPB分别编码HLA-DPα链和HLA-DPβ链)、HLA-DQ(HLA-DQA和HLA-DQB分别编码HLA-DQα链和HLA-DQβ链)、和HLA-DR(HLA-DRA和HLA-DRB分别编码HLA-DRα链和HLA-DRβ链)。
来自同种异体来源的HLA I类和/或II类蛋白质构成移植环境中的外来抗原。非自身HLA I类和/或II类蛋白质的识别是使用多能细胞进行移植或替代疗法的主要障碍。包含编辑的HLA I类或II类相关基因和/或B2M基因的本发明细胞可能对于基于细胞的疗法特别有用。
在其他实施方案中，本发明方法可用于编辑以下基因中的任一种：RFXANK、RFXAP、RFX5、CIITA、CD1d、HPRT1和白蛋白。本发明方法可以用于编辑任何基因。
细胞
可用于根据本发明方法进行编辑的细胞可以是任何细胞，例如哺乳动物细胞。在某些实施方案中，根据本发明的编辑基因的方法在干细胞中进行，所述干细胞选自由以下组成的组：造血干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、肝干细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和间充质干细胞。“多能干细胞”是指具有分化为以下三个胚层中的任一个的潜力的干细胞：内胚层、中胚层或外胚层。“成体干细胞”是多能的，因为它只能产生有限数量的细胞类型。“胚胎干(ES)细胞”是指衍生自囊胚即早期胚胎的内细胞团的多能干细胞。“诱导多能干细胞(iPS细胞)”是通过人工诱导某些基因的表达而从非多能细胞(通常为成年体细胞)人工衍生的多能干细胞。
在另一个实施方案中，根据本发明的编辑基因方法在分化细胞中进行，所述分化细胞包括但不限于树突细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板、造血细胞、胰岛细胞、肝细胞、肌肉细胞、角质细胞、心肌细胞、神经元细胞、骨骼肌细胞、眼部细胞、间充质细胞、成纤维细胞、肺细胞、胃肠道细胞、血管细胞、内分泌细胞，皮肤细胞、脂肪细胞和自然杀伤细胞。
因此，本发明提供了一种编辑干细胞或分化细胞中的基因的方法。本发明还提供了编辑干细胞及由其衍生或分化的子代，以及编辑分化细胞及由其衍生的子代，包括包含复制叉调节剂和/或基因编辑载体的细胞。本发明细胞还包括包含复制叉调节剂和基因编辑载体的细胞，所述细胞在施用至受试者之前未被编辑，但在施用至受试者之后被编辑。
复制叉调节剂
复制叉调节剂可以直接或间接调节与复制叉相关/发生在复制叉处的活性，例如DNA合成或DNA双螺旋的解旋。复制叉调节剂可以调节与复制叉相关的蛋白质或编码与复制叉相关的蛋白质的相应基因的活性或表达水平。
根据本发明可用的复制叉调节剂包括但不限于小分子、蛋白质、肽和核酸，例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、适体、小内在片段化干扰RNA、microRNA、反义寡核苷酸和信号干扰DNA(siDNA)。在一个实施方案中，复制叉调节剂是对RecQ解旋酶蛋白、增殖细胞核抗原或错配修复蛋白具有特异性的siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或shRNA。在另一个实施方案中，复制叉调节剂是依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐。复制叉调节剂可以特异性地调节复制叉处的DNA合成，例如增加和/或减少前导链合成、或增加和/或减少滞后链合成。
在一个实施方案中，复制叉调节剂特异性地增加前导链合成。在另一个实施方案中，复制叉调节剂特异性地减少前导链合成。在另一个实施方案中，复制叉调节剂特异性地增加滞后链合成。在另一个实施方案中，复制叉调节剂特异性地减少滞后链合成。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少前导链和滞后链合成。
在一个实施方案中，复制叉调节剂特异性地增加或特异性地减少前导链合成，但不显著增加或减少滞后链合成。在另一个实施方案中，复制叉调节剂特异性地增加或特异性地减少滞后链合成，但不显著增加或减少前导链合成。根据本领域熟知的方法测量/检测复制叉处的前导链和滞后链合成，例如，如Burhans等人,1991,The EMBO Journal,10:4351-4360和Schauer等人,2017,Bio.Protoc.7:1-23)中所述的。
在某些实施方案中，复制叉调节剂抑制复制叉处的滞后链合成。可用于特异性抑制复制叉处的滞后链合成的药剂包括但不限于依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯水合物、吐根酚碱、或其盐；或对调节滞后链合成的分子(例如，DNA聚合酶δ(Polδ)或DNA聚合酶α、DNA聚合酶β、DNA引物酶和DNA连接酶)具有特异性的siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或shRNA。
在某些实施方案中，复制叉调节剂抑制复制叉处的前导链合成。可用于特异性抑制复制叉处的前导链合成的药剂包括但不限于对调节前导链合成的分子(例如，DNA聚合酶ε(Polε))具有特异性的siRNA或shRNA。
如本文所用，“抑制”或“减少”在涉及复制叉处的滞后链合成时或在涉及复制叉处的前导链合成时意指分别相比于滞后链合成或前导链合成的对照水平降低，例如2倍或更多，例如2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。抑制还意指分别相比于滞后链合成或前导链合成的对照水平减少5％或更多，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。抑制还意指完全抑制，使得检测不到可检测的滞后链合成。
如本文所用，“激活”或“增加”在涉及复制叉处的滞后链合成时或在涉及复制叉处的前导链合成时意指分别相比于滞后链合成或前导链合成的对照水平增加，例如2倍或更多，例如2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。激活或增加还意指分别相比于滞后链合成或前导链合成的对照水平增加5％或更多，例如5％或更多，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在一个实施方案中，对滞后链合成的抑制是相比于未与滞后链合成抑制剂接触的对照细胞、在与滞后链合成抑制剂接触之前的细胞中的滞后链合成水平或相比于滞后链合成的预定对照水平的抑制。
在一个实施方案中，对前导链合成的抑制是相比于未与前导链合成抑制剂接触的对照细胞、在与前导链合成抑制剂接触之前的细胞中的前导链合成水平或相比于前导链合成的预定对照水平的抑制。
复制叉调节剂可以调节与复制叉功能或活性相关的蛋白质或表达所述蛋白质的基因的活性或表达水平，所述蛋白质包括但不限于：DNA聚合酶α、DNA引发酶、RNA引发酶、DNA聚合酶α1、DNA聚合酶ε、DNA聚合酶ε4、DNA聚合酶δ、叉保护复合物(FPC)组分Timeless、Tipin、Claspin和And1、Cdc45、MCM 2-7(微型染色体维持)解旋酶2-7六聚体蛋白(Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6和Mcm7)、go-ichi-ni-san(GINS)复合物蛋白(Sld5、Psf1、Psf2和Psf3)、复制蛋白A(RPA)、复制因子C夹钳装载(RFC)蛋白(Rfc1、Rfc2、Rfc3、Rfc4和Rfc5)、RMI1蛋白、ATR激酶、ATR相互作用蛋白(ATRIP)、RecQ解旋酶蛋白(RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5)、错配修复(MMR)蛋白(PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6)和增殖细胞核抗原(PCNA)、DNA连接酶和瓣状核酸内切酶1(Flap1)。在其他实施方案中，复制叉调节剂调节后期促进复合物亚基5、RecQ介导的基因组不稳定性蛋白1、起点识别复合物亚基1、同源框蛋白Meis2、DNA拓扑异构酶IIIα、DNA聚合酶ε4和FANCM蛋白的活性和/或表达水平。这些蛋白质中的任一种可以参与前导和/或滞后链合成。
与复制叉功能相关的蛋白质包括增加或减少复制叉功能或发生在复制叉处的活性(包括但不限于DNA合成、引物合成、DNA螺旋的解旋)，或增加或减少与复制叉相关或自身调节复制叉功能的蛋白质或编码蛋白质的基因的表达水平的任何蛋白质。
在一个实施方案中，复制叉调节剂直接调节表达或活性水平。在另一个实施方案中，复制叉调节剂例如通过以下方式间接调节表达或活性水平：直接调节蛋白质，所述蛋白质进而直接调节与复制叉相关的蛋白质的表达或活性水平。
复制叉调节剂可以调节细胞中的基因编辑活性。在一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少进入细胞的基因编辑载体的量。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少基因编辑载体在细胞中的稳定性。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少载体与靶基因座处的同源染色体序列之间的同源配对水平。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少载体与靶基因座之间的重组。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少DNA修复合成过程，其中载体序列被拷贝到染色体的相反链中。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少染色体靶基因座处位点特异性双链断裂的形成。在另一个实施方案中，复制叉调节剂增加或减少双链断裂处的同源定向修复和/或非同源末端连接。
在一个实施方案中，所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且复制叉调节剂抑制剂是依米丁、对应于编码RecQ解旋酶蛋白的基因的siRNA(例如如表2中提供的)或对应于编码RecQ解旋酶蛋白的基因的shRNA(例如如表3中提供的)中的一种或多种。
在另一个实施方案中，复制叉蛋白是选自由以下组成的组的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且复制叉调节剂是依米丁、对应于编码错配修复蛋白的基因的siRNA(例如如表4中提供的)或对应于编码错配修复蛋白的基因的shRNA中的一种或多种。
在另一个实施方案中，复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)并且复制叉调节剂是依米丁、对应于编码PCNA的基因的siRNA或对应于编码PCNA的基因的shRNA中的一种或多种。
施用剂量和方式
本发明提供了治疗疾病或病症和/或移植的方法，其包括向受试者施用本发明组合物。
如本文所用，术语“施用”是指将本发明组合物转移、递送、引入或运输至受试者的任何方式。施用方式包括但不限于口服、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、皮内、鼻内、经皮和皮下施用。例如，可以将本发明组合物递送至受试者的静脉、动脉、毛细血管、心脏或组织，以及细胞的特定群体或亚群。在一个实施方案中，施用意指以腹腔内方式将基因编辑载体和复制叉调节剂递送至受试者。本发明组合物的施用可以通过添加示踪剂来评估。
本发明组合物的施用可以在受试者中检测到疾病、或者疾病或障碍的特征性症状表现之前发生，使得疾病或障碍得以预防或可替代地在其进展方面得以延迟。在一个实施方案中，细胞经由递送装置，包括但不限于注射器或导管施用。
关于“有效量”或“治疗有效量”意指本发明组合物足以减轻疾病或病症的症状，或在细胞中引起基因编辑的量。关于“有效量”或“治疗有效量”还意指用于在治疗根据本发明的疾病或病症的疗法中使用的本发明组合物用于诱导治疗或预防作用的量。关于“有效剂量”或“治疗有效量”还意指足以实现或至少部分实现所希望作用的量。本发明组合物的有效量、施用方式和治疗方案可以由本领域技术人员确定。
关于“减轻”意指减少、抑制、减低、减弱、阻止、延迟疾病的发作或稳定疾病的发展或进展。
本发明细胞的治疗有效量可以在从由受试者安全接受的最大细胞数量至治疗所需的最小细胞数量的范围内，包括但不限于约10,000个细胞/kg、约20,000个细胞/kg、约30,000个细胞/kg、约40,000个细胞/kg、约50,000个细胞/kg、约100,000个细胞/kg、约200,000个细胞/kg、约300,000个细胞/kg、约400,000个细胞/kg、约500,000个细胞/kg、约600,000个细胞/kg、约700,000个细胞/kg、约800,000个细胞/kg、约900,000个细胞/kg、约1.1x106个细胞/kg、约1.2x106个细胞/kg、约1.3x106个细胞/kg、约1.4x106个细胞/kg、约1.5x106个细胞/kg、约1.6x106个细胞/kg、约1.7x106个细胞/kg、约1.8x106个细胞/kg、约1.9x106个细胞/kg、约2.1x106个细胞/kg、约2.1x106个细胞/kg、约1.2x106个细胞/kg、约2.3x106个细胞/kg、约2.4x106个细胞/kg、约2.5x106个细胞/kg、约2.6x106个细胞/kg、约2.7x106个细胞/kg、约2.8x106个细胞/kg、约2.9x106个细胞/kg、约3x106个细胞/kg、约3.1x106个细胞/kg、约3.2x106个细胞/kg、约3.3x106个细胞/kg、约3.4x106个细胞/kg、约3.5x106个细胞/kg、约3.6x106个细胞/kg、约3.7x106个细胞/kg、约3.8x106个细胞/kg、约3.9x106个细胞/kg、约4x106个细胞/kg、约4.1x106个细胞/kg、约4.2x106个细胞/kg、约4.3x106个细胞/kg、约4.4x106个细胞/kg、约4.5x106个细胞/kg、约4.6x106个细胞/kg、约4.7x106个细胞/kg、约4.8x106个细胞/kg、约4.9x106个细胞/kg或约5x106个细胞/kg的剂量。在实施方案中，本发明细胞的治疗有效量可以在从100个细胞/kg至约1011个细胞/kg的范围内，例如10,000个细胞/kg至约1011个细胞/kg、100,000个细胞/kg至约1011个细胞/kg、500,000个细胞/kg至约1011个细胞/kg、1x106个细胞/kg至约1011个细胞/kg、2x106个细胞/kg至约1011个细胞/kg、5x106个细胞/kg至约1011个细胞/kg、1x107个细胞/kg至约1011个细胞/kg、1x108个细胞/kg至约1011个细胞/kg、a x 109个细胞/kg至约1011个细胞/kg或1x1010个细胞至约1011个细胞/kg。
在一个实施方案中，本发明细胞的治疗有效量在从约50,000个细胞/kg-150,000个细胞/kg的范围内，例如50,000个细胞/kg-100个细胞/kg、60,000个细胞/kg-100,000个细胞/kg、75,000个细胞/kg-150,000个细胞/kg、90,000个细胞/kg-150,000个细胞/kg。在另一个实施方案中，给受试者的细胞剂量可以是单剂量或单剂量加额外剂量。如果在施用本发明细胞后，或在施用复制叉调节剂和/或基因编辑载体后，疾病的一种或多种症状减少或消除，则称受试者得到针对所述疾病的治疗。
在一个实施方案中，本发明细胞经由眶后注射或手术切口植入施用至受试者以治疗干性黄斑变性或Stargardt黄斑营养不良。
药物组合物
本发明组合物可以单独施用或作为包含稀释剂和/或其他组分的药物组合物施用。可用于本发明的药物组合物可以包含本发明组合物和生理上相容的缓冲液，并且在某些实施方案中包括一种或多种在其中本发明组合物保留活性并且在其中本发明细胞保持有活力的药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露糖醇、右旋糖、水甘油、乙醇、蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；及其组合；以及防腐剂。
本发明的包含细胞的组合物可以保存在溶液或药物组合物中用于短期储存而不丧失活力。在一个实施方案中，根据本领域熟知的冷冻保存方法，将细胞冷冻用于长期储存而不丧失活力。
治疗和移植方法
本发明提供了治疗有经由施用本发明组合物可治疗的疾病或病症风险的受试者的预防和治疗方法。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”定义为向受试者施用本发明组合物以治愈(cure)、治愈(heal)、缓和、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响疾病或障碍或者疾病或障碍的症状。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”在本文中还用于预防性施用本发明组合物的背景中。
如本文所用，“诊断”或“鉴定患者或受试者患有”是指确定个体是否患有疾病或失调、例如本文提供的疾病的过程。有疾病风险的受试者可以通过例如本领域已知的诊断或预后测定中的任一种或组合来鉴定。“疾病”、“障碍”和“病症”是本领域普遍公认的，并且指示受试者中存在通常被公认为异常和/或不期望的体征和/或症状。可以基于病理变化对疾病或病症进行诊断和分类。
在一个实施方案中，“疾病”是指以下中的任一种：癌症、肿瘤生长、结肠癌、乳腺癌、骨癌、脑癌和其他癌(例如，骨肉瘤、神经母细胞瘤、结肠腺癌)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、贲门癌(例如，肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)；肺癌(例如，支气管癌、肺泡癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤错构瘤、间皮瘤)；各种胃肠癌(例如，食道癌、胃癌、胰腺癌、小肠癌和大肠癌)；泌尿生殖道癌(例如，肾脏癌、膀胱癌和尿道癌、前列腺癌、睾丸癌；肝脏癌(例如，肝癌、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤))；骨癌(例如，成骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统癌症(例如，颅骨、脑膜、脑和脊髓的癌症)；妇科癌症(例如，子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌)；血液癌症(例如，与血液有关的癌症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤)；皮肤癌(例如，恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波氏肉瘤、痣发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩、牛皮癣)；和肾上腺癌症(例如，神经母细胞瘤)。
“疾病”还包括以下中的任一种：类风湿性脊椎炎、缺血性灌注后损伤、炎症性肠病、慢性炎症性肺病、湿疹、哮喘、缺血/再灌注损伤、急性呼吸窘迫综合征、感染性关节炎、进行性慢性关节炎、变形性关节炎、创伤性关节炎、痛风性关节炎、莱特尔氏综合征、急性滑膜炎和脊椎炎、肾小球肾炎、溶血性贫血、再生障碍性贫血、中性粒细胞减少症、宿主与移植物疾病、同种异体移植排斥、慢性甲状腺炎、格雷夫斯氏病、原发性胆汁性肝硬化、接触性皮炎、皮肤晒伤、慢性肾功能不全、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、葡萄膜炎、中耳炎、牙周病、肺间质纤维化、支气管炎、鼻炎、鼻窦炎、尘肺病、肺功能不全综合征、肺气肿、肺纤维化、矽肺或慢性炎症性肺病。
在进一步的实施方案中，术语“疾病”包括以下自身免疫性疾病或病症中的任何一种或多种：糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病、斯耶格伦氏综合征(Sjogren's Syndrome)(包括继发于斯耶格伦氏综合征的干燥性角结膜炎)、斑秃、由节肢动物咬伤引起反应的变应性应答、克罗恩氏病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、变应性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药物疹、麻风逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血脑病、特发性双侧进行性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、格雷夫斯眼病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化。
在另一个实施方案中，疾病是指以下中的任一种：威尔逊病、脊髓小脑性共济失调、朊病毒病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、淀粉样变性、阿尔茨海默病、亚历山大病(Alexander's disease)、酒精性肝病、囊性纤维化、皮克病、脊髓性肌营养不良症或路易体痴呆。在一方面，本发明提供了一种用于通过向受试者施用本发明组合物来预防受试者的如上所述的疾病或障碍的方法。
本发明的另一方面涉及通过向受试者施用本发明组合物来治疗受试者的方法。
可以在适当的动物模型中测试本发明组合物。例如，可以将本发明组合物用于动物模型中以确定用所述组合物治疗的功效、毒性或副作用。可替代地，可以将本发明组合物(例如，基因编辑载体和复制叉调节剂，例如依米丁)用于动物模型中以确定这种组合物的作用机制。
试剂盒
本发明提供了试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括载体装置、基因编辑载体和复制叉调节剂，例如依米丁。在另一个实施方案中，试剂盒包括承载装置和基因编辑载体或复制叉调节剂。基因编辑载体和/或复制叉调节剂可以在细胞中提供，在单独细胞中提供或在单一细胞中一起提供。如果需要，试剂盒提供有使用试剂盒生产编辑细胞的说明书。在另一个实施方案中，试剂盒包括本发明细胞或由其衍生的衍生或分化细胞，以及适合于细胞生长和维持的适当培养基。在另一个实施方案中，试剂盒包括本发明细胞或由其衍生的衍生或分化细胞，所述细胞包含基因编辑载体和作为第二组分的复制叉调节剂。在另一个实施方案中，试剂盒包括包含复制叉调节剂的本发明细胞或由其衍生的衍生或分化细胞，以及单独的基因编辑载体。在另一个实施方案中，试剂盒包括具有基因编辑载体的细胞。在另一个实施方案中，试剂盒包括具有复制叉调节剂的细胞。在另一个实施方案中，试剂盒包括具有基因编辑载体和复制叉调节剂两者的细胞。
载体装置可以包括盒子、纸箱、管等中的任一种，其中具有处于剂量限制的一个或多个容器装置，如小瓶、管、安瓿、瓶等。
在其他实施方案中，说明书包括以下中的至少一种：组合物的描述；告诫事项；适应症；禁忌症；动物研究数据；临床研究数据；和/或参考文献，并且可以包括一般包括关于使用细胞、基因编辑载体和复制叉调节剂治疗患有疾病的受试者或编辑受试者中的细胞的信息的说明。说明书可以直接印刷在容器(当存在时)上、作为施加至容器上的标签、或作为在容器中或随容器一起提供的单独纸张、小册子、卡片或折页。试剂盒还可以包括增强基因编辑载体和/或复制叉调节剂的作用的化合物。例如，试剂盒可以包括多于一种复制叉调节剂。试剂盒还可以包括有助于治疗受试者的化合物，例如免疫抑制剂。
动物模型
本发明的编辑细胞也适用于动物，并且也可用于促进各种动物模型系统中疾病的生物医学研究。
用途
本发明方法提供了可用于临床应用(包括疾病治疗和预防)的编辑细胞的体外和体内产生方法。本发明细胞及其分化的子代还可用于鉴定具有特定功能(例如，治疗或预防疾病)的化合物、确定感兴趣的化合物的活性和/或确定感兴趣的化合物的毒性。此外，本发明提供了一种细胞疗法，其包括将编辑细胞或从编辑细胞分化的细胞移植至患者中。
此外，本发明提供了一种用于使用各种编辑细胞来评价化合物、药物或毒剂的生理作用或毒性的方法。
除非另有说明，否则本发明的实践采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，所述技术都在本领域的技术范围内。参见例如Maniatis等人,1982,Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Sambrook等人,1989,MolecularCloning,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Sambrook和Russell,2001,Molecular Cloning,第3版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Ausubel等人,1992),Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons，包括定期更新)；Glover,1985,DNA Cloning(IRLPress,Oxford)；Anand,1992；Guthrie和Fink,1991；Harlow和Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Jakoby和Pastan,1979；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins eds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑1984)；Culture OfAnimal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；专著,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,1987,Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In Enzymology,第154和155卷(Wu等人编辑)；ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编辑,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1986)；Riott,Essential Immunology,第6版,Blackwell ScientificPublications,Oxford,1988；Hogan等人,Manipulating the Mouse Embryo,(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)；Westerfield,M.,Thezebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio),(第4版,Univ.of Oregon Press,Eugene,2000)。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但以下描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其全文并入。如果发生冲突，以包括定义在内的本说明书为主。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并不意在是限制性的。
实施例
通过参考以下实施例描述了本发明，所述实施例以说明的方式提供，而不旨在以任何方式限制本发明。
实施例1
依米丁增加人HT-1080细胞中的基因编辑
鼠白血病病毒(MLV)载体LHSN63Δ53O含有在其开放阅读框的核苷酸63处具有53-bp缺失的无功能性新霉素磷酸转移酶靶基因(neo)、用于选择的潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和用于恢复靶位点的质粒复制起点。
在一些实施方案中，使用HT-1080(人纤维肉瘤细胞)基因编辑测定对细胞进行基因编辑。该方法使用了用LHSN63Δ53O转导的HT-1080neo/HPRT编辑细胞。HT-1080细胞含有MLV LHSN63Δ530靶向基因座的整合拷贝和在外显子3处单拷贝X连锁HPRT基因中的4bp缺失。用AAV2-HSN5'转导细胞并且在G418中培养以鉴定neo基因编辑细胞。AAV2-HSN5'基因靶向载体含有与MLV-LHSN63Δ53O同源的序列，所述序列具有不含53bp缺失的截短型neo基因。可替代地，将HT-1080细胞用AAV2-HPe3靶向载体转导，并且用HAT培养基选择以鉴定HPRT基因编辑细胞(参见Russell等人,2008,Human Gene Therapy,19:907-914和Deyle等人,2014,Nature Structural&Molecular Biol.,21:969-975)。靶向克隆被扩增为多克隆群体。非靶向对照细胞是通过用MLV载体LHSNO转导HT-1080细胞产生，所述载体与LHSN63Δ53O相同，不同之处是它含有功能性neo基因。
在另一个实施方案中，使用HT-1080GFP突变体编辑系和AAVDJ-mAlb-GFP载体对细胞进行基因编辑。在存在该载体的情况下进行基因编辑导致白蛋白敲入，并产生绿色荧光蛋白(GFP)的表达。GFP阳性细胞可以通过流式细胞术检测。
为了确定依米丁对基因编辑的影响，使用具有LHSN63Δ530原病毒和HPRT外显子3Δ4的人HT-1080细胞进行了实验，所述细胞用AAV2-HSN5'或AAV2-HPe3感染。将细胞的平行测定样品在以下条件下处理：
·单独的AAV(MOI 2x104)持续24小时；
·0.125μM依米丁持续8小时，之后添加AAV(MOI 2x104)并且孵育24小时；
·0.25μM依米丁持续24小时，之后添加AAV(MOI 2x104)并且孵育24小时；
·0.25μM依米丁持续24小时，之后添加AAV(MOI 2x104)并且与AAV一起孵育24小时；
·在存在AAV(MOI 2x104)的情况下0.25μM依米丁持续24小时；
·AAV(MOI-2x104)持续8小时，之后添加0.25μM依米丁并且与依米丁一起孵育23小时；
·AAV(MOI-2x104)持续24小时，之后添加0.25μM依米丁并且与依米丁一起孵育8小时；
·AAV(MOI-2x104)持续8小时，之后添加依米丁(0.25μM)并且与依米丁一起孵育18小时，去除依米丁，之后添加第二剂量的依米丁(0.25μM)并且孵育16小时；或者
·AAV(MOI 2x104)持续24小时，之后添加依米丁(0.25μM)并且孵育7小时，去除依米丁，之后添加第二剂量的依米丁(0.25μM)持续2小时。
对于每个实验，在存在4x108AAV的情况下接种和培养2x104个细胞。所有实验在DMEM+10％FBS+pen/strep中进行。依米丁二盐酸盐水合物：将E2375(Sigma)在水中制备并且通过在0.22uM过滤器上过滤来灭菌。
实验的结果在下表1中提供。这些数据证明，在存在依米丁的情况下存在基因编辑的增加。
表1
Figure BDA0003187316330000301
Figure BDA0003187316330000311
实施例2
依米丁增加小鼠Hepa1-6细胞中的基因编辑
为了确定依米丁对基因编辑的影响，使用载体AAVDJ-mAlb-GFP、使用小鼠Hepa1-6肝癌细胞进行实验。在存在该载体的情况下进行基因编辑导致白蛋白敲入，并产生绿色荧光蛋白(GFP)的表达。
在第0天，将100,000个细胞铺板于具有10％FBS、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1.5ml DMEM中。在第1天，通过以下方式用AAVDJ-mAlb-GFP(复数(MOI)–50,000)转导细胞：去除培养基并且向细胞中添加1.5ml的含有所需MOI的AAVDJ-mAlb-GFP病毒的新鲜培养基(具有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM)。对于100,000个细胞，为了实现50,000的MOI，添加5x106个载体基因组。
在第2天，添加具有或不具有依米丁的新鲜培养基(1.5ml的具有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM)。用无依米丁、或具有30nM依米丁、100nM依米丁或1000nM依米丁处理平行测定样品。对照样品不含AAV。在第3天，去除培养基并且将1.5ml的具有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM添加至细胞。在第6、7和10天测量GFP的表达。
使用流式细胞术来测量GFP表达。在测定的那天(第6、7和10天)，将细胞胰蛋白酶化，并且将所得细胞沉淀物重悬于500μL的FACS缓冲液(没有Ca2+、Mg2+，并补充有2％FBS、1mM EDTA的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲盐水))中。在FACScanto II上分析所得细胞悬浮液中的GFP阳性细胞。对于用无AAV、0nM依米丁、30nM依米丁、和100nM依米丁处理的样品，分析100,000个细胞，并且对于用1000nM依米丁处理的样品，分析70,000个细胞。
如图2中所展示，在存在1000nM依米丁的情况下存在GFP的表达的增加(在第6天22倍、第7天12倍并且第10天3倍)。结果证明，依米丁增加了小鼠肝癌细胞系中的基因编辑。
实施例3
依米丁增加小鼠肝脏的体内编辑
为了确定依米丁对体内基因编辑的影响，使用C57BL/6小鼠进行实验。
使用了10只小鼠。在第0天，向5只小鼠(I组)通过眶后注射以3x1011vg/小鼠的量给予AAVDj-mALB-萤光素酶载体。AAVDj-mALB-萤光素酶载体的基因编辑导致白蛋白基因座敲入和萤光素酶表达。向5只小鼠(第2组)通过眶后注射以3x1011vg/小鼠的量注射AAVDj-mALB-萤光素酶载体，并且通过腹膜内注射以5mg/kg的浓度给予在DPBS中的依米丁。向5只小鼠(第3组)通过腹膜内注射以5mg/kg的浓度仅注射依米丁。
在第1-5天向第2组和第3组施用依米丁。在第8、11和22天，在存在通过腹膜内注射施用的15mg/kg D-萤光素的情况下进行体内成像，以确定编辑的发生。施用D-萤光素后，用异氟烷麻醉小鼠并将其置于IVIS成像仪中，并且记录生物发光峰值(Gornalusse等人,2017,Nature Biotech,35(8):765–772)。如图3中所展示，依米丁增加了小鼠肝脏中体内基因编辑的水平。与用单独的AAV治疗的小鼠相比，在第8天观察到2.3倍增加。在第15天和第22天，分别观察到1.6倍和1.4倍增加。
实施例4
通过施用编辑细胞对受试者的治疗
在一个实施方案中，通过施用根据本文所述方法(例如实施例1和2)制备的编辑细胞对受试者进行治疗。
使用本发明编辑细胞来治疗受试者的多种疾病或病症。剂量、递送途径和赋形剂可以根据所治疗的疾病或病症进行改变。在一个实施方案中，使用衍生自本发明编辑细胞的视网膜色素上皮细胞(RPE)来治疗干性黄斑变性或Stargardt黄斑营养不良。在第0天，通过眶后注射或手术切口植入用在多种生理学合适的缓冲液中的任一种中的50,000个细胞、100,000个细胞、150,000个细胞、500,000个细胞或更多细胞治疗患者。通过测定以下各项来监测患者的安全性：与细胞产品相关的任何2级(NCI分级系统)或更大的不良事件；细胞被感染原污染的任何证据；以及细胞显示出致瘤潜力的任何证据。通过本领域已知的常规测试监测细胞的成功植入和功能，包括：获得细胞已植入正确位置的结构证据(OCT成像、萤光素血管造影术、自体荧光摄影、裂隙灯检查伴眼底摄影)；和显示植入位置的增强活性和视敏度的改善的视网膜电图证据(mfERG)。
实施例5
siRNA对RecQ解旋酶的抑制增加编辑
为了确定对应于编码RecQ解旋酶蛋白RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5的RecQ解旋酶基因的siRNA对基因编辑的影响，使用HT-1080neo/HPRT编辑系进行实验。用对RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5中的每一种具有特异性的siRNA处理每种解旋酶基因。
用三种不同的siRNA对(RECQL1 253/254、RECQL1 255/256、RECQL1 257/258、RECQL2 BLM 259/260、RECQL2 BLM 261/262、RECQL2 BLM 263/264；RECQL3 WRN 265/266、RECQL3 WRN 267/268、RECQL3 WRN 269/270、RECQL4 271/272、RECQL4 273/274、RECQL4275/276、RECQL4 277/278、RECQL5 279/2806和RECQL4 281/282)处理每种解旋酶基因。
表2
Figure BDA0003187316330000331
Figure BDA0003187316330000341
Figure BDA0003187316330000351
通过G418或HAT选择测量HPRT和neo编辑频率，并将其针对加扰siRNA对照进行归一化。
在第1天将105个HT-1080细胞铺板在6孔板中。所有实验一式三份进行。在第2天，以104的MOI用AAV-HSN或AAV-HPe3转导细胞。然后将与脂质体RNAiMAX试剂混合的3nMsiRNA添加至细胞。在第4天，用胰蛋白酶处理细胞，并且在没有选择的情况下将0.1％的细胞重新铺板在6孔板中，以确定集落形成单位的数量。将剩余的细胞重新铺板在6孔板中，以进一步分析基因编辑频率。
在第5天，通过向实验板中添加G418(700ug/ml)来进行neo基因修正实验。在第15天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将neo基因修正的百分比计算为G418抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
在第5天，通过将1X HAT(次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷培养基)添加至实验板来进行HPRT基因修正实验。在第15天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将HPRT基因修正的百分比计算为HAT抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
将CFU针对对照(加扰siRNA)样品的CFU进行归一化。通过将归一化的CFU乘以neo基因修正百分比的平均值来计算编辑指数。
如图4中所展示，siRNA对RecQ解旋酶的抑制增加了基因编辑。
实施例6
shRNA对RecQ解旋酶的抑制增加编辑
为了确定对应于RecQ解旋酶基因的shRNA对基因编辑的影响，使用HT-1080neo/HPRT编辑系进行实验。用表达对RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5中的每一种具有特异性的shRNA(下表3中提供的序列)的慢病毒载体处理每种解旋酶基因。图10中提供了shRNA载体的图谱。通过G418或HAT选择测量HPRT和neo编辑频率，并将其针对加扰shRNA对照进行归一化。
在第1天将2x104个HT-1080细胞铺板在6孔板中。所有实验一式三份进行。在第2天，以2x104的MOI用AAV-shRNA转导细胞。在第3天，以2x104的MOI用AAV-HSN或AAV-HPe3转导细胞。在第5天，用胰蛋白酶处理细胞，并且在没有选择的情况下将0.1％的细胞重新铺板在6孔板中，以确定集落形成单位的数量。将剩余的细胞重新铺板在6孔板中，以进一步分析基因编辑频率。
在第6天，通过向实验板中添加G418(700ug/ml)来进行neo基因修正实验。在第16天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将neo基因修正的百分比计算为G418抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
在第6天，通过将1X HAT(次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷培养基)添加至实验板来进行HPRT基因修正实验。在第16天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将HPRT基因修正的百分比计算为HAT抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
将CFU针对对照(加扰siRNA)样品的CFU进行归一化。通过将归一化的CFU乘以neo基因修正百分比的平均值来计算编辑指数。
表3
Figure BDA0003187316330000361
Figure BDA0003187316330000371
如图5中所展示，shRNA对RecQ解旋酶的抑制增加了基因编辑。
实施例7
shRNA对RecQ解旋酶的抑制增加编辑
为了确定对应于RecQ解旋酶基因的shRNA对基因编辑的影响，使用HT-1080GFP突变体编辑系进行实验。用表达对RECQL1(AAV-294-RECQL1)、RECQL2(AAV-295-RECQL2)、RECQL3(AAV-296-RECQL3)、RECQL4(AAV-297-RECQL4)和RECQL5(AAV-298-RECQL5)中的每一种具有特异性的shRNA(上表3中提供的序列)的病毒载体处理每种解旋酶基因。通过流式细胞术测量GFP编辑频率以鉴定GFP阳性细胞并且针对用加扰shRNA对照处理的细胞进行归一化。
如图6中所展示，siRNA对RecQ解旋酶的抑制增加了基因编辑。
实施例8
siRNA对错配修复(MMR)蛋白的抑制增加编辑
为了确定对应于表达MMR蛋白PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6的MMR基因的siRNA对基因编辑的影响，使用HT-1080neo/HPRT编辑系进行实验。将每种MMR基因用三个不同的siRNA对(在下表4提供)处理。
表4
Figure BDA0003187316330000381
Figure BDA0003187316330000391
Figure BDA0003187316330000401
通过G418或HAT选择测量HPRT和neo基因编辑频率，并将其针对加扰siRNA对照进行归一化。
在第1天将105个HT-1080细胞铺板在6孔板中。所有实验一式三份进行。在第2天，以104的MOI用AAV-HSN或AAV-HPe3转导细胞。然后将与脂质体RNAiMAX试剂混合的3nMsiRNA添加至细胞。在第4天，用胰蛋白酶处理细胞，并且在没有选择的情况下将0.1％的细胞重新铺板在6孔板中，以确定集落形成单位的数量。将剩余的细胞重新铺板在6孔板中，以进一步分析基因编辑频率。
在第5天，通过向实验板中添加G418(700ug/ml)来进行neo基因修正实验。在第15天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将neo基因修正的百分比计算为G418抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
在第5天，通过将1X HAT(次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷培养基)添加至实验板来进行HPRT基因修正实验。在第15天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将HPRT基因修正的百分比计算为HAT抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
将CFU针对对照(加扰siRNA)样品的CFU进行归一化。通过将归一化的CFU乘以neo基因修正百分比的平均值来计算编辑指数。
如图7中所展示，siRNA对错配修复蛋白的抑制增加了基因编辑。
实施例9
siRNA对错配修复(MMR)蛋白组合的抑制增加编辑
为了确定对应于表达MMR蛋白PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6的MMR基因的siRNA对基因编辑的影响，使用HT-1080neo/HPRT编辑系进行实验。将每种MMR基因或基因组合(MSH2和MSH3、MSH4和MSH5、MSH2和MSH6、MLH1和PMS2、MLH1和MLH3以及MLH1和PMS1)用具有表5中呈现的序列的三个不同的siRNA对处理。
表5
Figure BDA0003187316330000411
Figure BDA0003187316330000421
如下通过G418或HAT选择测量HPRT和neo基因编辑频率，并将其针对加扰siRNA对照进行归一化。
在第1天将105个HT-1080细胞铺板在6孔板中。所有实验一式三份进行。在第2天，以104的MOI用AAV-HSN或AAV-HPe3转导细胞。然后将与脂质体RNAiMAX试剂混合的3nMsiRNA添加至细胞。在第4天，用胰蛋白酶处理细胞，并且在没有选择的情况下将0.1％的细胞重新铺板在6孔板中，以确定集落形成单位的数量。将剩余的细胞重新铺板在6孔板中，以进一步分析基因编辑频率。
在第5天，通过向实验板中添加G418(700ug/ml)来进行neo基因修正实验。在第15天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将neo基因修正的百分比计算为G418抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
在第5天，通过将1X HAT(次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷培养基)添加至实验板来进行HPRT基因修正实验。在第15天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将HPRT基因修正的百分比计算为HAT抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。将CFU针对对照(加扰siRNA)样品的CFU进行归一化。通过将归一化的CFU乘以neo基因修正百分比的平均值来计算编辑指数。
如图8中所展示，siRNA对错配修复蛋白组合的抑制增加了基因编辑。
实施例10
shRNA对PCNA的抑制增加编辑
为了确定对对应于PCNA基因的mRNA具有特异性的shRNA对基因编辑的影响，使用HT-1080GFP编辑系进行实验。将PCNA基因用表达对PCNA基因具有特异性shRNA(下表6中提供的序列)的慢病毒载体(AAV-301-PCNA)处理。图10中提供了shRNA载体的图谱。通过G418或HAT选择测量HPRT和neo编辑频率，并将其针对加扰shRNA对照进行归一化。
表6
Figure BDA0003187316330000431
通过流式细胞术测量GFP编辑频率以鉴定GFP阳性细胞并且针对用加扰siRNA对照处理的细胞进行归一化。
如图9中所展示，shRNA对PCNA的抑制增加了基因编辑。
实施例11
shRNA对另外的选择叉蛋白的抑制增加编辑
为了确定对选择复制叉蛋白具有特异性的shRNA对基因编辑的影响，使用HT-1080/neo/HPRT编辑系进行实验。将下表8中指出的每种基因用由慢病毒载体表达的shRNA(下表7中提供的序列)抑制。
表7
Figure BDA0003187316330000432
Figure BDA0003187316330000441
Figure BDA0003187316330000451
通过G418或HAT选择测量HPRT和neo基因编辑频率，并将其针对未用shRNA处理的细胞进行归一化。
首先用表达对靶向基因具有特异性的shRNA的慢病毒转导细胞。然后在第1天将用特异性shRNA转导的2x104个HT-1080细胞铺板在6孔板中，并且用强力霉素(1μg/ml)将shRNA的表达诱导24小时。在第2天，以2x104的MOI用AAV-HSN或AAV-HPe3转导细胞。在第4天，用胰蛋白酶处理细胞，并且在没有选择的情况下将0.1％的细胞重新铺板在6孔板中，以确定集落形成单位的数量。将剩余的细胞重新铺板在6孔板中，以进一步分析基因编辑频率。
在第5天，通过向实验板中添加G418(700ug/ml)来进行neo基因修正实验。在第16天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将neo基因修正的百分比计算为G418抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。在第6天，通过将1X HAT(次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷培养基)添加至实验板来进行HPRT基因修正实验。在第16天，用PBS洗涤板，并且用考马斯亮蓝G染色集落。将HPRT基因修正的百分比计算为HAT抗性CFU数量/每个原始孔的总CFU。
实验的结果在下表8中提供。
表8
Figure BDA0003187316330000452
Figure BDA0003187316330000461
序列表
<110> 华盛顿大学
<120> 基因编辑的方法
<130> 19-107-PCT
<150> US 62/798,357
<151> 2019-01-29
<160> 113
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
ctcactgagt gatacttta 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
taaagtatca ctcagtgag 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
caatctggtt ctaagaata 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
tattcttaga accagattg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
gtcagtgttg tattggaaa 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
tttccaatac aacactgac 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
agcagcgatg tgatttgc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
gcaaatcaca tcgctgct 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
accttcctat gatattgat 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
atcaatatca taggaaggt 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
gtgtccatta cttcaatat 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
atattgaagt aatggacac 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
ggatgaatgt gcagaataa 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
ttattctgca cattcatcc 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
ttaacagtct ggttaaaca 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
tgtttaacca gactgttaa 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
gacttcatct gcagagaga 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
tctctctgca gatgaagtc 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
ggctcaacat gaagcagaa 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
ttctgcttca tgttgagcc 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
gccactggtt ccttcacca 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
tggtgaagga accagtggc 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
gggaatctgt cctgcagaa 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
ttctgcagga cagattccc 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
ggatgaagct cattgtgtt 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
aacacaatga gcttcatcc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
gtgttgcgct gcctcttga 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
tcaagaggca gcgcaacac 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
tctatgatgt gcaattcaa 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
ttgaattgca catcataga 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
attgaccgaa tcactcgtg 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
cacgagtgat tcggtcaat 19
<210> 33
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
tcagtgttgt attggaaatt ggatccaatt tccaatacaa cactgacttt ttctcgag 58
<210> 34
<211> 62
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ggccctcgag aaaaagtcag tgttgtattg gaaattggat ccaatttcca atacaacact 60
ga 62
<210> 35
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
tgtccattac ttcaatattt ggatccaaat attgaagtaa tggacac 47
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<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
ggccctcgag aaaaagtgtc cattacttca atatttggat ccaaatattg aagtaatgga 60
ca 62
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
acttcatctg cagagagatt ggatccaatc tctctgcaga tgaagtcttt ttctcgag 58
<210> 38
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
ggccctcgag aaaaagactt catctgcaga gagattggat ccaatctctc tgcagatgaa 60
gt 62
<210> 39
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
ccactggttc cttcaccatt ggatccaatg gtgaaggaac cagtggcttt ttctcgag 58
<210> 40
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
ggccctcgag aaaaagccac tggttccttc accattggat ccaatggtga aggaaccagt 60
gg 62
<210> 41
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
gatgaagctc attgtgtttt ggatccaaaa cacaatgagc ttcatccttt ttctcgag 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
ggccctcgag aaaaaggatg aagctcattg tgttttggat ccaaaacaca atgagcttca 60
tcc 63
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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gctgacatcg ttcttagta 19
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
tactaagaac gatgtcagc 19
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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gcaggaagct gctctgtta 19
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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taacagagca gcttcctgc 19
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ggaatcatct ggaaagaat 19
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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attctttcca gatgattcc 19
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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ccgtagtcac tgtatggaat 20
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<212> DNA
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<220>
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attccataca gtgactacgg 20
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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gggctaaact gatttcctt 19
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
aaggaaatca gtttagccc 19
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
gtcttacatg catactgta 19
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
tacagtatgc atgtaagac 19
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
gccagctaat gctatcaaa 19
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
tttgatagca ttagctggc 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
gcattagttt ctcagttaa 19
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 58
ttaactgaga aactaatgc 19
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 59
gtattcaagt gattgttaa 19
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 60
ttaacaatca cttgaatac 19
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 61
ggatgttgta cttgagaat 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
attctcaagt acaacatcc 19
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
gcacagaagg ttgctatat 19
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 64
atatagcaac cttctgtgc 19
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 65
gtcttcaagt tgaacctga 19
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 66
tcaggttcaa cttgaagac 19
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 67
cccaggatgc cattgttaa 19
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 68
ttaacaatgg catcctggg 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 69
gactttacaa gaagattta 19
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 70
taaatcttct tgtaaagtc 19
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 71
gaaatcattt cacgaataa 19
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
ttattcgtga aatgatttc 19
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
ctctttggct gccatcata 19
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 74
tatgatggca gccaaagag 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
gactctgtag catttatca 19
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 76
tgataaatgc tacagagtc 19
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 77
gccagtttgt gaactagaa 19
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 78
ttctagttca caaactggc 19
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 79
gcctctagtt gatattgaa 19
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
ttcaatatca actagaggc 19
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
gcatttacac tgtttgcta 19
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
tagcaaacag tgtaaatgc 19
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
gctgctgaat caaagataa 19
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
ttatctttga ttcagcagc 19
<210> 85
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
gccagtgact ttgagatta 19
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 86
taatctcaaa gtcactggc 19
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 87
gctggtcctt attgatgaa 19
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 88
ttcatcaata aggaccagc 19
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 89
gccctctttg tttccttat 19
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 90
ataaggaaac aaagagggc 19
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 91
cagatgaagc cttaaataa 19
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 92
ttatttaagg cttcatctg 19
<210> 93
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 93
gctctgatgt ggaatttaa 19
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 94
ttaaattcca catcagagc 19
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 95
ctattacgtt cctctataa 19
<210> 96
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 96
ttatagagga acgtaatag 19
<210> 97
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 97
attgatccga ttcgattgc 19
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 98
gcaatcgaat cggatcaat 19
<210> 99
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 99
ttgtaatttc ctgtgcaatt ggatccaatt gcacaggaaa ttacaacttt ttc 53
<210> 100
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 100
tcgagaaaaa gttgtaattt cctgtgcaat tggatccaat tgcacaggaa attacaa 57
<210> 101
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 101
gttgacagtg agcgcggaga gacttggata atgcaatagt gaagccacag atgtattgca 60
ttatccaagt ctctccttgc ctactgcctc 90
<210> 102
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 102
gttgacagtg agcgcgcgca ttatctcagc tacttatagt gaagccacag atgtataagt 60
agctgagata atgcgcttgc ctactgcctc 90
<210> 103
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 103
gttgacagtg agcgcccgta gtcactgtat ggaatatagt gaagccacag atgtatattc 60
catacagtga ctacggttgc ctactgcctc 90
<210> 104
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 104
gttgacagtg agcgtaagca gcgatgtgat ttgcattagt gaagccacag atgtaatgca 60
aatcacatcg ctgcttatgc ctactgcctc 90
<210> 105
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 105
gttgacagtg agcgtgatct agttacagct gaagcatagt gaagccacag atgtatgctt 60
cagctgtaac tagatcatgc ctactgcctc 90
<210> 106
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
gttgacagtg agcgtggaca tttactggct catgattagt gaagccacag atgtaatcat 60
gagccagtaa atgtccatgc ctactgcctc 90
<210> 107
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
gttgacagtg agcgcggact ttatcagaaa ctcaaatagt gaagccacag atgtatttga 60
gtttctgata aagtccttgc ctactgcctc 90
<210> 108
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
gttgacagtg agcgcgccac gtttcaacag atatattagt gaagccacag atgtaatata 60
tctgttgaaa cgtggcttgc ctactgcctc 90
<210> 109
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
gttgacagtg agcgcggagt ctgcgtgcga ggattatagt gaagccacag atgtataatc 60
ctcgcacgca gactccttgc ctactgcctc 90
<210> 110
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
gttgacagtg agcgaaacct tcctatgata ttgatatagt gaagccacag atgtatatca 60
atatcatagg aaggttgtgc ctactgcctc 90
<210> 111
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
gttgacagtg agcgcggtgt ccattacttc aatatttagt gaagccacag atgtaaatat 60
tgaagtaatg gacaccatgc ctactgcctc 90
<210> 112
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
gttgacagtg agcgaaggtt atctgtgcta caattgtagt gaagccacag atgtacaatt 60
gtagcacaga taacctgtgc ctactgcctc 90
<210> 113
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
gttgacagtg agcgcgcaga tcatgtgtga gctaaatagt gaagccacag atgtatttag 60
ctcacacatg atctgcatgc ctactgcctc 90

Claims (84)

1.一种编辑细胞中的基因的方法，其包括调节所述细胞中的复制叉功能，以及编辑所述细胞中的所述基因。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括使所述细胞与复制叉调节剂接触。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括使所述细胞与基因编辑载体接触。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述基因编辑载体是腺相关病毒(AAV)载体。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是依米丁。
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是siRNA。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是shRNA。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述复制叉功能是DNA合成。
10.如权利要求2-9中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
11.如权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其还包括其中调节复制叉功能包括调节复制叉蛋白的功能或表达水平。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述复制叉蛋白选自由以下组成的组中：DNA聚合酶α、DNA引发酶、RNA引发酶、DNA聚合酶ε、DNA聚合酶δ、叉保护复合物(FPC)组分Timeless、Tipin、Claspin和And1、Cdc45、MCM2-7(微型染色体维持)解旋酶2-7六聚体蛋白(Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6和Mcm7)、go-ichi-ni-san(GINS)复合物蛋白(Sld5、Psf1、Psf2和Psf3)、复制蛋白A(RPA)、复制因子C夹钳装载(RFC)蛋白(Rfc1、Rfc2、Rfc3、Rfc4和Rfc5)、RM1I蛋白、ATR激酶、ATR相互作用蛋白(ATRIP)、RecQ解旋酶蛋白(RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5)、错配修复(MMR)蛋白(PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6)、增殖细胞核抗原(PCNA)、瓣状核酸内切酶1(FEN1)、DNA连接酶、后期促进复合物亚基5、RecQ介导的基因组不稳定性蛋白1、起点识别复合物亚基1、同源框蛋白Meis2、DNA拓扑异构酶IIIα、DNA聚合酶ε4和FANCM蛋白。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述复制叉蛋白选自由以下组成的组中：RecQ解旋酶蛋白(RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5)、错配修复(MMR)蛋白(PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6)和增殖细胞核抗原(PCNA)。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5。
16.如权利要求13或14所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6。
17.如权利要求13或14所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)。
18.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
19.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
20.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
21.如权利要求13或16所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
22.如权利要求13或16所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
23.如权利要求13或16所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
24.如权利要求13或17所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
25.如权利要求13或17所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
26.如权利要求13或17所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组中：多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述细胞是灵长类动物细胞。
29.如权利要求1-26和28中任一项所述的方法，其中所述细胞是分化细胞。
30.如权利要求2-29中任一项所述的方法，其中在所述细胞中的基因编辑效率大于在未与复制叉调节剂接触的细胞中的基因编辑效率。
31.一种编辑细胞中的基因的方法，其包括在编辑所述细胞中的所述基因之前使细胞与复制叉调节剂接触一定时间段，以及编辑所述细胞中的所述基因。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述时间段是8小时至7天。
33.一种编辑细胞中的基因的方法，其包括在基因编辑期间使细胞与复制叉调节剂接触，以及编辑所述细胞中的所述基因。
34.一种编辑细胞中的基因的方法，其包括在编辑所述细胞中的所述基因之后使细胞与复制叉调节剂接触一定时间段。
35.如权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
36.如权利要求31-35中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
37.如权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
38.如权利要求31-37中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与基因编辑载体接触。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述基因编辑载体是腺相关病毒(AAV)载体。
40.一种编辑受试者的细胞中的基因的方法，其包括：
a.向所述受试者施用基因编辑载体；以及
b.向所述受试者施用复制叉调节剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述复制叉调节剂是在施用所述基因编辑载体之后施用。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述复制叉调节剂是在施用所述基因编辑载体之前施用。
43.如权利要求40所述的方法，其中同时施用所述基因编辑载体和所述复制叉调节剂。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
45.如权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
46.如权利要求40-45中任一项所述的方法，其中所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
47.如权利要求40-46中任一项所述的方法，其中所述基因编辑载体是腺相关病毒(AAV)载体。
48.一种编辑细胞中的基因的方法，其包括：
a.编辑所述细胞中的所述基因；以及
b.使所基因编辑的细胞与复制叉调节剂接触一定时间段。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
50.如权利要求48或49所述的方法，其中所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
51.如权利要求48-50所述的方法，其中所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
52.如权利要求48-51中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与基因编辑载体接触。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述基因编辑载体是腺相关病毒(AAV)载体。
54.如权利要求31-53中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白选自由以下组成的组中：RecQ解旋酶蛋白(RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5)、错配修复(MMR)蛋白(PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6)和增殖细胞核抗原(PCNA)。
55.如权利要求31-54中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5。
56.如权利要求31-53中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6。
57.如权利要求31-53中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)。
58.如权利要求31-54中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
59.如权利要求31-54中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
60.如权利要求31-54中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的RecQ解旋酶蛋白：RECQL1、RECQL2、RECQL3、RECQL4和RECQL5，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
61.如权利要求31-53和56中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
62.如权利要求31-53和56中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
63.如权利要求31-53和56中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是选自由以下组成的组中的错配修复(MMR)蛋白：PMS2、PMS2、MLH1、MLH2、MLH3、MSH4、MSH5和MSH6，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
64.如权利要求31-53和57中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)，并且所述复制叉调节剂是依米丁。
65.如权利要求31-53和57中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)，并且所述复制叉调节剂是siRNA。
66.如权利要求31-53和57中任一项所述的方法，其中所述复制叉蛋白是增殖细胞核抗原(PCNA)，并且所述复制叉调节剂是shRNA。
67.如权利要求31-66中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组中：多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
68.如权利要求31-66中任一项所述的方法，其中所述细胞是灵长类动物细胞。
69.如权利要求31-66和68中任一项所述的方法，其中所述细胞是分化细胞。
70.一种组合物，其包含基因编辑细胞群体，所述群体通过调节所述细胞中的复制叉功能而获得。
71.如权利要求70所述的组合物，其中在所述细胞群体中的基因编辑效率大于在第二细胞群体中的基因编辑效率，所述第二细胞群体在不存在调节所述细胞中的复制叉功能的情况下进行基因编辑。
72.如权利要求70或71所述的组合物，其中所述基因编辑细胞群体通过以下方式获得：通过使所述细胞与复制叉调节剂接触来调节所述细胞中的复制叉功能。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
74.如权利要求72或73所述的组合物，其中所述复制叉调节剂是前导链合成抑制剂。
75.如权利要求72-73中任一项所述的组合物，其中所述复制叉调节剂是滞后链合成抑制剂。
76.一种细胞，其包含基因编辑载体和外源性复制叉调节剂。
77.如权利要求76所述的细胞，其中所述基因编辑载体是腺相关病毒(AAV)载体。
78.一种细胞，其包含基因修饰和外源性复制叉调节剂。
79.如权利要求76-78中任一项所述的细胞，其中所述复制叉调节剂选自由以下组成的组中：依米丁、去氢依米丁、依米丁二氢氯化水合物、吐根酚碱、或其盐；对RecQ解旋酶具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；对PCNA具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体；以及对错配修复蛋白具有特异性的shRNA、siRNA、适体、小内在片段化干扰RNA、微RNA、反义寡核苷酸或抗体。
80.如权利要求761-79中任一项所述的细胞，其中所述复制叉调节剂是前导链合成激活剂或前导链合成抑制剂。
81.如权利要求76-80中任一项所述的细胞，其中所述复制叉调节剂是滞后链合成激活剂或滞后链合成抑制剂。
82.一种细胞，其从如权利要求76-81中任一项所述的细胞衍生或分化而来。
83.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求70-82中任一项所述的细胞。
84.一种在有需要的受试者中移植的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求70-82中任一项所述的细胞。
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