ES2938895T3 - Composiciones que comprenden un fármaco antiinflamatorio y un activador DICER para uso en el tratamiento de enfermedades neuronales - Google Patents

Abstract

La presente invención describe composiciones, medios y kits de las mismas para el tratamiento de indicaciones clínicas neuronales en un sujeto mamífero. La composición comprende, entre otros, una combinación sinérgica de un fármaco antiinflamatorio y un activador DICER, preferiblemente una combinación de celecoxib y ciprofloxacina. La presente invención describe además dichas composiciones para su uso en métodos para tratar enfermedades neuronales que incluyen enfermedades de las neuronas motoras (MND), ELA, FTD (demencia frontotemporal), degeneración macular (AMD), autismo y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden un fármaco antiinflamatorio y un activador DICER para uso en el tratamiento de enfermedades neuronales

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a composiciones, medios y kits para tratar indicaciones clínicas neuronales en un sujeto mamífero. La composición comprende una combinación sinérgica de un fármaco antiinflamatorio que es celecoxib y un activador de DICER que es ciprofloxacina. Específicamente, la presente invención se refiere a una enfermedad neuronal que es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Las enfermedades de las neuronas motoras (ENM) son un grupo etiológicamente heterogéneo de trastornos que se caracterizan por debilidad muscular y/o parálisis espástica, que resulta de la degeneración selectiva de las neuronas motoras inferiores y/o las neuronas motoras superiores, respectivamente.

[0003] La ELA es una enfermedad neurodegenerativa marcada por la neurodegeneración de las neuronas motoras tanto superiores como inferiores y deterioro muscular progresivo, atrofia y muerte dentro de aproximadamente cinco años desde el diagnóstico.

[0004] Las formas clínicamente indistinguibles de ELA ocurren como enfermedad esporádica en ausencia de una mutación conocida, o pueden iniciarse por mutaciones genéticas. Alrededor de dos tercios de los casos familiares se desencadenan por mutaciones de cuatro genes que son el marco de lectura abierto 72 del cromosoma 9 (C9ORF72), superóxido dismutasa de Cu/Zn (SOD1), fusionado en sarcoma/translocado en liposarcoma (FUS/TLS), TAR- Proteína de unión a ADN 43 (TDP43), véase Volonté, C et al. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets (Anteriormente Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders), 14(2), 194-207.

[0005] La etiología de la ELA todavía no está clara. Algunos factores etiológicos incluyen la participación de la inflamación y de los MicroRNA, como se detalla en las siguientes secciones.

[0006] Inflamación: estudios patológicos y en animales sugieren que la inflamación puede contribuir a la patología de la ELA y que los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) pueden ser protectores. Una característica típica de la ELA es la neuroinflamación. La neuroinflamación es promovida por la ciclooxigenasa-2 (COX-2), y la actividad de la COX-2 puede ser inhibida por fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los AINE han prolongado la supervivencia en modelos de ratones transgénicos con ELA, pero los resultados de un ensayo clínico no encontraron un efecto protector del inhibidor selectivo de la COX-2 Celecoxib en la progresión de la enfermedad de ELA (véase Cudkowicz ME, et al (2006). Prueba de celecoxib en esclerosis lateral amiotrófica Ann Neurol.; 60:22-31). Además, la evaluación de si el uso de AINE antes de la aparición de los síntomas puede reducir el riesgo o retrasar la aparición de la ELA mediante un estudio de casos y controles sobre el uso de AINE y la ELA (n=111 casos) arrojó resultados no concluyentes, véase Popat RA, et al. (2007), Amyotroph Lateral Scler.;8:157-63, y véase Fondell, Elinor et al. Amtyotrophic lateral sclerosis official publication of the World Federation of Neurology Research Group on Motor Neuron Diseases 13.6 (2012): 573-579.

[0007] MicroARNs: Se desconoce la causa de la ELA, así como el motivo por el que afecta a unas personas y a otras no. Sin embargo, el consenso de los expertos es que las alteraciones moleculares en diferentes células están involucradas en el desarrollo y progresión de la enfermedad. P. ej., la muerte de las neuronas motoras es causada por una variedad de defectos celulares, incluido el procesamiento de moléculas de ARN.

[0008] Durante el envejecimiento normal o las enfermedades neurodegenerativas, la supervivencia y la función neuronales dependen de la homeostasis de las proteínas, que está regulada por múltiples mecanismos, incluida la vía del microARN (miARN). Los microARN son un subconjunto de moléculas de ARN endógenas, pequeñas y no codificantes involucradas en la regulación postranscripcional de la expresión génica eucariótica. Producidos como transcritos primarios largos, se exportan al citoplasma y se modifican aún más para obtener los miARN maduros, siendo cada paso de su biogénesis un paso potencial de regulación. La desregulación en las vías relacionadas con miARN en el sistema nervioso central (SNC) se asocia con lesiones neuronales graves y muerte celular, lo que puede conducir al desarrollo de trastornos neurodegenerativos, como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), véase Rinchetti, P., Rizzuti, M., Faravelli, 1., & Corti, S. (2017). Metabolismo de microARN y desregulación en la esclerosis lateral amiotrófica. Neurobiología molecular, 1-14.

[0009] Además, en diferentes tipos de células, la ausencia de DICER, una enzima de procesamiento de miARN clave, conduce a la neurodegeneración a través de mecanismos autónomos celulares y no autónomos celulares. La pérdida de ciertos miARN también provoca neurodegeneración en algunos organismos modelo. Por otro lado, la expresión de miARN está desregulada en pacientes con diferentes enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, la vía de miARN parece ser esencial en la patogenia de varias enfermedades neurodegenerativas dependientes de la edad; sin embargo, nuestra comprensión del mecanismo subyacente sigue siendo rudimentaria. Gascón, E. y Gao, F.-B. (2012). Cause or Effect: Misregulation of microRNA Pathways in Neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience, 6, 48.

[0010] Se ha demostrado que la pérdida de biogénesis de miARN causa la degeneración de la neurona motora espinal in vivo (H véase Haramati, Sharon, et al. “miRNA malfunction causes spinal motor neuron disease.” Proceedings of the National Academy of Sciences 107.29 (2010): 13111-13116). Además, se demostró que la reducción en los niveles de miARN es un denominador molecular común para múltiples formas de ELA humana familiar y esporádica y que la mejora de la actividad de DICER por una molécula pequeña, la enoxacina, es beneficiosa in vivo en dos modelos independientes de ratones con ELA. Véase Emde, Anna et al. “Dysregulated miRNA Biogenesis Downstream of Cellular Stress and ALS - causing Mutations: A New Mechanism for ALS.” The EMBO Journal EMBO 34.21 (2015): 2633-2651. La rareza de la enfermedad de ELA, junto con la importante variabilidad inter e intrapaciente en el curso clínico y la falta de biomarcadores confiables, han convertido en un desafío el desarrollo de agentes efectivos para tratar la ELA. Todavía no se ha satisfecho la necesidad de un tratamiento seguro y eficaz para la ELA.

[0011] El documento WO2014/02060881 divulga un método para tratar la enfermedad de la neurona motora (MND), que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de mejorar el procesamiento de un premiARN.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0012] Las referencias a métodos de tratamiento en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) por terapia (o para el diagnóstico).

[0013] La presente invención se refiere a métodos y composiciones de un fármaco antiinflamatorio y un activador DICER para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

[0014] Como se usa en lo sucesivo, el término “indicaciones clínicas” generalmente se refiere en lo sucesivo a enfermedades neuronales.

[0015] Como se usa en adelante, el término “enfermedades neuronales” generalmente se refiere en lo sucesivo a enfermedades de las neuronas motoras (MND), FTD (demencia frontotemporal), degeneración macular (AMD), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y autismo.

[0016] Tal como se utiliza en el presente documento, el término “enfermedades de las neuronas motoras” o “MND” generalmente se refiere en lo sucesivo a un grupo de enfermedades que comprende, entre otras, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), paraplejía espástica hereditaria (PEH), esclerosis lateral primaria (ELP), atrofia muscular espinal (AME), atrofia muscular bulbar espinal (AMBE) y síndrome de contractura congénita letal (SCCL).

[0017] Tal como se utiliza en adelante, el término “fármacos antiinflamatorios” “se refiere generalmente en lo sucesivo, de forma no limitativa, a un grupo de fármacos que comprende, entre otros, esteroides, corticosteroides o fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE).

[0018] Como se usa en adelante, el término “ciclooxigenasa” o “COX”, generalmente se refiere en adelante a una enzima (específicamente, una familia de isoenzimas) que es responsable de la formación de prostanoides, incluyendo tromboxano y prostaglandinas tales como prostaciclina, del ácido araquidónico. Los principales inhibidores de la COX son los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE).

[0019] Tal como se utiliza en adelante, el término “dosis baja” se refiere a una dosis terapéuticamente eficaz de un fármaco antiinflamatorio, cuya dosis es menor que la dosis habitual o convencional requerida para producir el efecto terapéutico.

[0020] Los inhibidores clásicos de la COX no son selectivos e inhiben todos los tipos de COX. La inhibición resultante de la síntesis de prostaglandinas y tromboxanos tiene el efecto de reducir inflamación cedida, así como efectos antipiréticos, antitrombóticos y analgésicos.

[0021] Como se usa en lo sucesivo, el término “fármaco antiinflamatorio no esteroideo” o “AINE” se refiere en lo sucesivo a celecoxib.

[0022] Como se usa en adelante, el término “DICER” generalmente se refiere en lo sucesivo a una enzima que escinde el ARN de doble cadena (ARNbc) y el pre-microARN (pre-miARN) en fragmentos cortos de ARN de doble cadena llamados ARN de interferencia pequeños y microARN, respectivamente. Estos fragmentos tienen una longitud aproximada de 20­ 25 pares de bases con un saliente de dos bases en el extremo 3’. Dicer facilita la activación del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que es esencial para la interferencia de ARN. RISC tiene un componente catalítico argonaute, que es una endonucleasa capaz de degradar el ARN mensajero (ARNm).

[0023] Es un objeto de la invención revelar una composición para usar en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto mamífero, en la que la composición comprende una combinación sinérgica de celecoxib y ciprofloxacina, en la que la proporción de celecoxib a ciprofloxacina varía de 1:10 a 1:200 (p/p).

[0024] Otro objeto de la invención es revelar la composición para uso como se define anteriormente en la que la ciprofloxacina es ciprofloxacina-HCl.

[0025] Otro objeto de la invención es revelar la composición para uso como se define en cualquiera de los anteriores, en la que el fármaco antiinflamatorio se administra en una dosis inferior a la indicada para el efecto clínico antiinflamatorio.

[0026] Otro objeto de la invención es divulgar la composición como se define en cualquiera de los anteriores, en la que la composición está configurada para administrarse de una manera seleccionada de un grupo que consiste en una tableta, una cápsula, una píldora, liofilizado, polvo, emulsión, polvo granulado, crema, ungüento, pasta, loción, gel, líquido, solución, parche y cualquier combinación de los mismos.

[0027] Otro objeto de la invención es revelar la composición como se define en cualquiera de los anteriores, en la que la composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en liberación rápida, liberación lenta, liberación sostenida, liberación controlada y cualquier combinación de los mismos.

[0028] Otro objeto de la invención es revelar la composición como se define en cualquiera de los anteriores, en la que la composición comprende además ingredientes seleccionados de un grupo que consiste en solubilizantes, estabilizantes, tampones, modificadores de la tonicidad, agentes de carga, potenciadores/reductores de la viscosidad, tensioactivos, agentes quelantes, adyuvantes y cualquier combinación de los mismos.

[0029] Es un objeto de la invención divulgar un kit que comprende celecoxib y ciprofloxacina para usar en un tratamiento sinérgico de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto mamífero, en el que la proporción de celecoxib a ciprofloxacina varía de 1:10 a 1:200 (p/p).

[0030] Otro objeto de la invención es divulgar la composición para uso como se define en cualquiera de los anteriores, donde la composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en oral, tópica, dérmica, transdérmica, intravenosa, subcutáneo, intramuscular, intraarticular, supositorio, intraventricular, inhalatorio, aerosol, sublingual y cualquier combinación de los mismos.

[0031] Otro objeto de la invención es divulgar la composición para su uso como se define en cualquiera de los anteriores, en la que la composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consta de uno a la vez, no simultáneo, secuencial y concomitantemente.

[0032] Otro objeto de la invención es divulgar la composición para su uso como se define en cualquiera de los anteriores, en la que la composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en dosis única, dosis única diaria, dosis dos veces al día, dosis continua, infusión y cualquier combinación de los mismos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0033] A continuación se describirá la presente invención junto con las siguientes figuras de los dibujos:

Figura 1: Esquema que muestra el protocolo de tratamiento;

Figura 2: El cambio en la distancia recorrida (en %) de SOD1 G93R no tratado en comparación con el tipo salvaje y la larva SOD1 tratada en la recuperación de la fase de desafío;

Figura 3: Combinaciones de ciprofloxacina y celecoxib: actividad locomotora de mutantes de SOD1 tratados en comparación con mutantes de SOD1 no tratados en las 3 fases del experimento;

Figura 4: Combinaciones de ciprofloxacina y celecoxib: actividad locomotora de mutantes de SOD1 tratados en comparación con mutantes de SOD1 no tratados durante todo el período de medición;

Figura 5: La distancia recorrida medida y calculada para 96 mutantes SOD1 frente a larvas WT por intervalo de tiempo de 1 minuto;

Figura 6: Los mutantes SOD1 mostraron una reducción significativa en su actividad locomotora en comparación con WT durante todo el período de medición;

Figura 7: Los mutantes SOD1 mostraron una reducción significativa en su actividad locomotora en comparación con WT en las 3 fases del experimento;

Figura 8: Los mutantes de SOD1 tratados con riluzol mostraron una elevación significativa en su actividad locomotora en comparación con los mutantes de Sod1 no tratados en las 3 fases del experimento;

Figura 9: Actividad locomotora de los mutantes de SOD1 tratados con celecoxib en comparación con los mutantes de SOD1 no tratados en las 3 fases del experimento;

Figura 10: Actividad locomotora de los mutantes de SOD1 tratados con ciprofloxacina en comparación con los mutantes de SOD1 no tratados en las 3 fases del experimento;

Figura 11: Resumen de la actividad locomotora de mutantes SOD1 tratados con distintas concentraciones de ciprofloxacina durante las 3 fases del experimento;

Figura 12: Actividad locomotora de mutantes de SOD1 tratados con enoxacina en comparación con mutantes de SOD1 no tratados en las 3 fases del experimento;

Figura 13: Enoxacina normalizada frente a la actividad locomotora de mutantes de SOD1 tratados con ciprofloxacina en comparación con mutantes de SOD1 no tratados en las 3 fases del experimento;

Figura 14: La administración de Ciprofloxacina y Celecoxib recuperó la axonopatía de peces mutantes SOD1. Análisis morfológico de neuronas motoras individuales en el tronco de la larva del pez cebra; los segmentos S10-S12 se usaron para el análisis. Panel izquierdo - WT, panel medio - pez mutante SOD1 no tratado, panel izquierdo - 1 pM Celecoxib 100 pM pez mutante SOD1 tratado con ciprofloxacina. Panel superior: imágenes de pila z de apótomo reconstruidas en 3D de neuronas motoras ramificadas en el tronco de larvas de pez cebra 6dpf inmunoteñidas con anticuerpos anti-tubulina acetilada. Paneles medio e inferior: la espina (procesos coloreados) de las neuronas motoras trazadas con el análisis de Filamentos del software Imaris (Bitplane; en amarillo, espina de una sola neurona motora). n=15; mutantes de SOD1 de control y tratados y n = 11; pescado WT; y

Figura 15A, 15B, 15C: La combinación de ciprofloxacina y celecoxib provocó una recuperación casi total de la axonopatía de las neuronas motoras de peces mutantes SOD1. Los aspectos de longitud y ramificación de las proyecciones axonales de las neuronas motoras se calcularon utilizando el software Imaris (Bitplane) y se trazan en los gráficos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS

[0034] La presente invención describe una composición para usar en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto mamífero, en la que la composición comprende una combinación de celecoxib y ciprofloxacina, en la que la proporción de celecoxib a ciprofloxacina oscila entre 1:10 a 1:200 (peso/peso).

[0035] La presente invención divulga composiciones terapéuticas y usos terapéuticos de las mismas, para MND, específicamente ELA, con el objetivo de presentar un tratamiento efectivo para pacientes diagnosticados con MND, específicamente ELA. La tecnología que se presenta aquí subraya el papel de los miARN además del fármaco antiinflamatorio que tiene un efecto neuroprotector en el desarrollo de la ELA mediante el uso de modelos farmacológicos de ELA in vivo e in vitro. Consulte Berthod, Frangois y Frangois Gros-Louis. “ In vivo and in vitro models to study amyotrophic lateral sclerosis.” Amyotrophic Lateral Sclerosis. InTech, 2012.

[0036] En un aspecto no reivindicado, la presente descripción describe una combinación de una quinolona, que es un potenciador de DICER (específicamente ciprofloxacina), y un agente antiinflamatorio (específicamente celecoxib), como tratamiento.

[0037] La ciprofloxacina es una quinolona, específicamente una fluoroquinolona, que potencia la actividad de Dicer y, por lo tanto, es capaz de regular al alza la biogénesis de microARN, y celecoxib como fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) selectivo de COX-2.

[0038] Las quinolonas son agentes antibacterianos de amplio espectro que tienen un mecanismo de acción novedoso. Como compuestos sintéticos, estos agentes se han desarrollado ampliamente para optimizar la actividad antimicrobiana, las propiedades farmacocinéticas y la seguridad de los medicamentos. Las quinolonas tienen amplias aplicaciones potenciales y un espectro de actividad más amplio. La ciprofloxacina sigue siendo la quinolona más potente contra Pseudomonas aeruginosa, véase Walker, RC (1999, octubre). The fluoroquinolones. In Mayo Clinic Proceedings (Vol. 74, N210, págs. 1030-1037).

[0039] Las quinolonas provocan toxicidad sinérgica o aditiva con los AINE. Según se informa, la administración concomitante de quinolonas y AINE no esteroideos ha provocado un aumento de la estimulación del SNC. Se ha informado que la administración concomitante de quinolonas y AINE aumenta el riesgo de estimulación del SNC y ataques convulsivos. Los pacientes con trastornos del SNC u otros factores de riesgo que puedan predisponerlos a desarrollar convulsiones o los pacientes que toman medicamentos que reducen el umbral convulsivo pueden no ser candidatos apropiados para el uso de AINE si también están tomando una quinolona. Use una quinolona con precaución en personas que toman un AINE concomitantemente.

[0040] Como consecuencia, se contradice la enseñanza antes mencionada contra el estado de la técnica, por la novedosa afirmación de la presente invención de que la combinación de los dos fármacos sugeridos da como resultado un resultado positivo, significativo y sorprendente para los pacientes con ELA, que no tienen riesgo factores que pueden predisponerlos al desarrollo de convulsiones, tal vez con una nueva formulación que prolongue la liberación de los medicamentos para un tratamiento continuo.

[0041] Específicamente, se investigó la actividad epileptógena inducida por el tratamiento combinado con fármacos antiinflamatorios y enoxacina en ratas a las que se implantaron electrodos de forma crónica. Ferubinac etil y aspirina DL-lisina mostraron un complejo de punta y onda en el EEG sin mostrar cambios de comportamiento notables cuando se inyectaron por vía intraventricular, aunque se necesitó una dosis relativamente alta. La enoxacina, por otro lado, provocó una potente actividad epileptógena caracterizada por un complejo de picos y ondas de alto voltaje ininterrumpido en dosis de 50 y 100 microgramos. Al mismo tiempo, las ratas mostraron hiperactividad, saltos y violentas convulsiones. El tratamiento combinado con enoxacina (p.o.) y ferubinaco etílico (i.v.) provocó una potente actividad epileptógena caracterizada por un estallido ininterrumpido de picos y ondas de alto voltaje. En cuanto al comportamiento, los animales mostraron clonus de las extremidades anteriores, movimientos de cabeza y convulsiones generalizadas. También se observó un complejo de picos y ondas de alto voltaje después del tratamiento combinado con enoxacina (i. vent.) y ferubinaco etílico (i.v. o i. vent.) en asociación con hiperactividad y saltos y convulsiones violentas). Se concluye que el tratamiento simultáneo con enoxacina y ferubinaco etílico produjo actividad epileptógena cuando se inyecta por vía intraventricular, véase Kamei, Chiaki, et al. “Actividad epileptógena inducida por el tratamiento combinado con fármacos antiinflamatorios y enoxacina y su inhibición por un antagonista del calcio, la nicardipina. “Methods and findings in experimental and clinical pharmacology 18.9 (1996): 579-588.

[0042] La presente invención usó el mutante SOD1 G93R y el pez WT para evaluar el efecto de los agentes antiinflamatorios y los activadores DICER en comparación con los tratamientos disponibles para la ELA (véase la Figura 1 para el protocolo de tratamiento).

[0043] La presente invención describe un efecto sinérgico en peces mutantes SOD1 tratados tanto con ciprofloxacina como con celecoxib, específicamente a concentraciones de 1 pM de celecoxib y 100 pM de ciprofloxacina. A estas concentraciones, hubo un efecto dramático en su capacidad para nadar en comparación con los mutantes no tratados (Figuras 2, 3).

[0044] La distancia de movimiento de la larva mutante SOD1 tratada se elevó en un 29 % en comparación con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado (Figura 4). El efecto fue lo suficientemente sorprendente como para que el comportamiento de los peces SOD1 tratados se pareciera mucho al de los peces de tipo salvaje (Figura 5).

[0045] La combinación de la presente invención es en una proporción que oscila entre 1:10 y 1:200 (p/p), de un fármaco antiinflamatorio, que es celecoxib, y un activador de DICER, que es ciprofloxacino.

EJEMPLO 1

[0046] En este estudio se utilizó pez cebra transgénico para el gen superior superóxido dismutasa 1 (SOD1) ligado a ELA. Anteriormente se demostró que el pez mutante SOD1 G93R recapitula los principales fenotipos de la ELA, incluidos los defectos de la unión neuromuscular, la disminución de la resistencia, la pérdida de neuronas motoras y la patología muscular, véase Ramesh T, Lyon AN, Pineda RH, et al. Un modelo genético de esclerosis lateral amiotrófica en pez cebra muestra características fenotípicas de enfermedad de motoneurona. Modelos y mecanismos de enfermedades 2010; 3:652-62. La mutación SOD1 causó déficits de comportamiento relacionados con la locomoción. Los animales mutantes SOD1 mostraron una reducción significativa en su capacidad de natación en comparación con el tipo salvaje durante el desafío de natación espontánea, luz/oscuridad y más dramáticamente después del segundo pico de estrés, exhibiendo una recuperación del desafío (Figuras 5-7). La distancia que se movió la larva de tipo salvaje se promedió durante todo el período de tiempo y se elevó en un 44 % en comparación con el comportamiento de natación mutante SOD1 (Figura 6).

[0047] Como control positivo, los peces mutantes SOD1 se trataron con Riluzole (Figura 8). Se eligió riluzol para este estudio porque durante años fue el único fármaco establecido que demostró tener un efecto modificador de la enfermedad en pacientes con ELA, consulte Bensimon G, Lacomblez L, Meininger V, Group tras. Un ensayo controlado de riluzol en la esclerosis lateral amiotrófica. New England Journal of Medicine 1994;330:585-91. Los animales mutantes SOD1 tratados con Riluzole mostraron una elevación significativa del 36 % en comparación con el comportamiento de natación mutante SOD1.

[0048] En la siguiente serie de experimentos, se trataron peces mutantes SOD1 con Celecoxib a distintas concentraciones (Figura 9). La toxicidad de Celecoxib fue notable en concentraciones altas (30 pm) tanto en mutantes de SOD1 como en animales WT, incluida la toxicidad cardiovascular y la muerte. El tratamiento de larvas mutantes SOD1 con concentraciones más bajas de celecoxib reveló una sutil disminución locomotora en 10 pM (con un fondo de DMSO al 0,3 %) y en 5 pM (con un fondo de DMSO al 0,1 %). Por debajo de estas concentraciones, no se evidenció toxicidad y la morfología y el comportamiento generales fueron normales. Es importante destacar que nuestros resultados muestran que la toxicidad de celecoxib es paralela tanto en sujetos con ELA como en sujetos sanos y que los mutantes de SOD1 no muestran una mayor susceptibilidad al fármaco (sección III). En general, el tratamiento en todas las dosis no mejoró notablemente el comportamiento de natación. A 1 pM, hubo un aumento del 6 % en la actividad de natación en comparación con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado.

[0049] A continuación, los peces mutantes SOD1 se trataron con ciprofloxacina en concentraciones de 500, 200, 100, 50, 10 y 1 pM (Figuras 10, 14). Todas las dosis de ciprofloxacina fueron seguras para los peces y no mostraron toxicidad morfológica ni conductual general o sutil. Las concentraciones más altas tuvieron un efecto positivo en la capacidad de natación de los mutantes SOD1 y la concentración de 100 pM mostró el mayor beneficio. A ese nivel, la distancia recorrida por la larva mutante SOD1 aumentó en un 18 % en comparación con el comportamiento de natación mutante SOD1 no tratado).

[0050] Los peces mutantes SOD1 tratados con Ciprofloxacina mostraron similitud con el tratamiento con las mismas dosis de Enoxacina, su elemento de la familia (Figura 10). La distancia recorrida por las larvas mutantes SOD1 tratadas con enoxacina aumentó en un 20 % en comparación con el comportamiento de natación de las mutantes SOD1 no tratadas.

[0051] A continuación, los peces mutantes SOD1 se trataron tanto con ciprofloxacina como con celecoxib en una variedad de concentraciones. El mayor efecto se observó en concentraciones de Celecoxib 1 pM y Ciprofloxacina 100 pM; a estas concentraciones, hubo un efecto espectacular en su capacidad para nadar en comparación con los mutantes no tratados (Fig. 3). La distancia recorrida por la larva mutante SOD1 tratada se elevó en un 29 % en comparación con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado (Figura 4). El efecto fue lo suficientemente sorprendente como para que el comportamiento de los peces SOD1 tratados se pareciera mucho al de los peces de tipo salvaje.

[0052] Para resumir los distintos efectos de los tratamientos sobre las habilidades motoras de los peces, promediamos los últimos 10 minutos de la distancia recorrida (Figura 2). Después de la introducción de estrés muscular y neurológico adicional, esta fase de recuperación de desafío tiene como objetivo identificar una mayor resistencia muscular. Los animales de tipo salvaje nadaron distancias más largas durante este período en comparación con los peces mutantes SOD1 (elevación del 116 %). El riluzol indujo un claro aumento en la capacidad de natación de los peces (39,7 %), pero se observó un efecto sinérgico significativo con la combinación de ciprofloxacina a 100 pM y celecoxib a 1 pM (72 %, Figura 2). La Figura 2 describe el cambio en la distancia recorrida (en %) de SOD1 G93R no tratado en comparación con el tipo salvaje y la larva SOD1 tratada en la recuperación de la fase de desafío.

[0053] Tras estos convincentes resultados de los ensayos de actividad locomotora, realizamos ensayos morfológicos, analizando la morfología de las neuronas motoras tras el tratamiento con la combinación de Ciprofloxacina a 100 pM y Celecoxib a 1 pM (Figuras 14-15). El pez cebra WT exhibió predominantemente neuronas motoras normales, con axones largos y moderadamente ramificados, mientras que el mutante SOD1 mostró axonopatía severa con fibras ramificadas altamente complejas. Cuando se trataron con la combinación de Celecoxib 1 pM y Ciprofloxacino 100 pM, las larvas mutantes SOD1 mostraron una recuperación significativa de la morfología mutante y obtuvieron una morfología de axón casi normal (Figuras 14-15). Sorprendentemente, la combinación de ciprofloxacina y celecoxib provocó una recuperación casi total de la axonopatía de las neuronas motoras de los peces mutantes SOD1.

[0054] Esta combinación de ciprofloxacina y celecoxib, como se indica en estos estudios preclínicos, puede afectar la neuropatología y la degeneración en pacientes con ELA, ralentizando o inhibiendo la enfermedad.

EJEMPLO 2

a. Metodología

[0055] Peces - Se mantuvieron peces cebra adultos y larvas (Danio rerio) en las instalaciones de peces del laboratorio Russek-Blum (Centro de Ciencias del Mar Muerto y Arava; estación de Yair, Arava Central) a 28,5°C y se criaron según los procedimientos establecidos 25. Los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Ben Gurion. En este estudio se utilizaron líneas transgénicas Tg(sodl:sod1G93R o WT; hsp70:DsRed), véase Ramesh T, Lyon AN, Pineda RH, et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Disease models & mechanisms 2010; 3:652-62. Para generar el pez cebra que expresa el mutante transgénico Sod1, se utilizó una región genómica de pez cebra que contenía el promotor y el gen sodl endógenos. Sodl se mutó cambiando la glicina 93 por arginina (G93R); esta mutación afecta a un aminoácido conservado que a menudo está mutado en la ELA familiar, véase OrrellR, de Belleroche J, Marklund S, Bowe F, Hallewell R. A novel SOD mutant and ELA. Nature 1995;374:504 y Elshafey A, Lanyon WG, Connor JM. Identification of a new missense point mutation in exon 4 of the Cu/Zn superoxide dismutase (SOD-1) gene in a family with amyotrophic lateral sclerosis. Human molecular genetics 1994;3:363-4.

[0056] Materiales y solubilidad - Celecoxib Para lograr una alta concentración de Celecoxib (Celecoxib BP/EP; lote n° CLX/008/04/17; 25 gr; Prudence Pharma Chem, India), el polvo se disolvió en una solución madre de 100 pM en 100 % DMSO. El polvo se disolvió por completo en DMSO al 100 %, pero mientras se diluía el stock de Celecoxib 100 pM en una concentración final de 100 uM (1:1000) en tampón de crianza de pez cebra (DB), el material precipitó, creando partículas y nubes. A continuación, se disolvió celecoxib en una solución madre de 10 pM en DMSO al 100 %. El polvo se disolvió completamente en DMSO al 100 %, y cuando se diluyó a una concentración final de 30 mM en DB (dilución 1: 333,3), el material permaneció en el tampón sin fragmentarse. Los materiales se agregaron a DB en las concentraciones más altas planificadas y se almacenaron en placas de Petri en una incubadora a 28 °C, simulando las condiciones exactas del experimento. La concentración final de DMSO en Celecoxib 30 mM en DB fue del 0,3 %. La inspección de la solución madre mostró una solución clara sin agregados vistos a simple vista ni bajo el microscopio. En la solución diluida final en DB, tampoco se observaron agregados después de 24 o 48 horas. La absorción del espectrofotómetro se observó a las 0, 24 y 48 horas después de la preparación.

[0057] Materiales y solubilidad - Ciprofloxacina Para lograr una alta concentración de ciprofloxacina (clorhidrato de ciprofloxacina Ph, Eur; lote n° CP20517124; 25 gr; Neuland Laboratory LTD, India), el polvo se disolvió en una solución madre de 100 pM en ddH2O. El polvo se disolvió completamente en ddH2O y se disolvió completamente cuando se diluyó hasta una concentración final de 100 uM en DB (dilución 1:1000). La concentración final de DMSO en la ciprofloxacina 100 uM en DB fue del 0,1 %. La inspección de la solución madre mostró una solución amarilla clara sin agregados vistos a simple vista ni bajo el microscopio. En las soluciones diluidas finales en DB, tampoco se observaron agregados después de 24 o 48 horas. Para ajustar el pH a la muestra de control (DMSO al 0,1 % en DB; pH 6,72), se añadieron 12 ul de NaOH 100 pM a la solución de ciprofloxacina 100 uM (pH 6,32). No fue necesaria la adición de NaOH en concentraciones más bajas de ciprofloxacina en DB. La absorción del espectrofotómetro se analizó a las 0, 24 y 48 horas después de la preparación (Figura 3). Un color amarillo claro de la solución provocó valores de absorción más altos. Se midió la absorción de la mezcla de concentraciones más altas (ciprofloxacina 100 uM celecoxib 30 pM+NaOH) en un espectrofotómetro a las 0, 24 y 48 horas después de la preparación.

[0058] Treinta (30) uM de Celecoxib tuvieron una absorción diferente en comparación con el control (DB) de 0,017, 0,013 y 0,021 a las 0, 24 y 48 horas después de la preparación, respectivamente. El ciprofloxacino 100 uM dio diferencias en la absorción en comparación con el control de 0,123, 0,149 y 0,155 a las 0, 24 y 48 horas después de la preparación, respectivamente, debido al color claro amarillo claro de la solución. La mezcla de concentraciones más altas (ciprofloxacina 100 uM celecoxib 30 pM) dio diferencias en la absorción en comparación con el control de 0,16, 0,154 y 0,131 a las 0, 24 y 48 horas después de la preparación, respectivamente.

[0059] El tampón de cría de pez cebra (DB) utilizado como base de todos los experimentos contiene concentraciones finales de: NaCl 1,74 mM, KCl 0,21 mM, MgSO4 0,12 mM, Ca(NO3)2 0,18 mM, HEPES 0,15 mM en ddH2O, pH final= 6.7.

[0060] El protocolo de tratamiento SOD1 G93R mutante o peces WT se recolectaron y criaron de acuerdo con protocolos aceptados y aprobados, véase Westerfield M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) 2000. Se observó la morfología de las larvas (corazón velocidad, morfología general y comportamiento) en cada día.

[0061] La figura 1 es un esquema que muestra el protocolo de tratamiento.

[0062] Se seleccionaron doscientas cuarenta (240) larvas del mismo lote de puesta para introducirlas en tres tratamientos distintos y un control (n=60 por cada tratamiento). El primer y segundo tratamiento se realizaron a los 3 y 5 días posteriores a la fertilización (dpf), respectivamente, cuando la barrera hematoencefálica (BBB) está completamente cerrada y las neuronas motoras (MN) y las uniones neuromusculares (NMJ) están completamente desarrolladas. Los materiales se administraron en el agua de natación (DB). En el día 6, las larvas se llevaron a análisis de comportamiento utilizando el sistema automatizado DanioVision™. Después del análisis, las larvas se fijaron y se llevó a cabo un procedimiento de inmunohistoquímica de montaje completo para utilizarlo en análisis morfológicos de alta resolución. El protocolo de tratamiento se detalla en la Figura 1.

[0063] Análisis de toxicidad Se observaron peces durante el día de la administración y los días siguientes para observar la toxicidad. Se evaluó la toxicidad aguda por apoptosis/necrosis y anomalías del sistema cardiovascular (frecuencia cardíaca, morfología, hemorragia y edema). La cabeza, los ojos y la toxicidad morfológica y conductual general se registraron de acuerdo con los procedimientos aceptados 28.

[0064] Análisis de comportamiento DanioVision™, un sistema de seguimiento automatizado de alto rendimiento de larvas de pez cebra de Noldus Information Technology (Wageningen, Países Bajos), incluido el control de las condiciones de luz y oscuridad, se usó para las mediciones y el análisis de los resultados. Cada una de las larvas se colocó en un solo pozo, con el mismo volumen de agua de natación para garantizar un fondo uniforme. Cada animal se probó para determinar su posición x,y usando resta dinámica 30 veces por segundo. La distancia que cada larva se movió en mm se calculó desde la posición x,y y se promedió por intervalo de tiempo de 1 minuto (promedio de 1800 mediciones por cada 1 minuto). El perfil conductual se midió en 3 fases según los cambios de entorno que aplicamos, para introducir estrés muscular y neurológico adicional. Se registraron y analizaron la natación espontánea, el desafío luz/oscuridad (respuesta optocinética) y la recuperación de los comportamientos de desafío. Todos los animales del mismo tratamiento: tipo salvaje (WT), SOD1 mutante no tratados o tratados se promediaron por intervalo de tiempo de 1 minuto para examinar su reacción al estrés adicional, y luego se calcularon para todo el período de tiempo para obtener un número relativo en comparación con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado. El análisis estadístico utilizado fue la prueba t de Student pareada (dos colas) con dos muestras suponiendo varianzas desiguales. Todos los valores de P informados son de dos colas y el nivel de significación se estableció en 0,05 (*), 0,01 a 0,001 (**) y por debajo de 0,001 (***).

[0065] Análisis morfológico La tinción de montaje completo se realizó en 6 dpf tratados y no tratados SOD1 G93R o WT usando anticuerpos anti-tubulina acetilada usando procedimientos inmunohistoquímicos establecidos. Las proyecciones axonales de las neuronas motoras espinales (segmentos 10-12) teñidas con tubulina antiacetilada se obtuvieron mediante microscopía de apotoma Zeiss. Se usaron imágenes reconstruidas en 3D para la cuantificación usando el software de análisis de imágenes Imaris (Bitplane LTD).

b. Resultados

I. Las larvas transgénicas mutantes en SOD1 muestran deficiencias en la actividad locomotora

[0066] Se demostró previamente que las larvas de pez cebra que expresan la mutación SOD1 G93R causante de ELA tienen deficiencias en la actividad locomotora con proyecciones anómalas del axón motor, pero por lo demás tienen una morfología macroscópica normal, véase Lemmens R, Van Hoecke A, Hersmus N, et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Human molecular genetics 2007;16:2359-65, y Ramesh T, Lyon AN, Pineda RH, et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Disease models & mechanisms 2010;3:652-62.

[0067] Para verificar y elaborar nuestra comprensión de la disfunción motora en estas larvas, realizamos análisis de video usando el sistema DanioVision, como se describe en la sección de materiales y métodos. Se realizaron dos repeticiones biológicas analizando la actividad locomotora de 48 animales en cada una. La Figura 5 representa la distancia recorrida medida y calculada para 96 mutantes de SOD1 frente a larvas por intervalo de tiempo de 1 minuto.

[0068] El parámetro analizado fue la distancia que se movieron las larvas (en mm). En el primer gráfico, se promedió el comportamiento de natación de todos los animales - SODlmut o de tipo salvaje (WT) por intervalo de tiempo de 1 minuto para ver si su reacción al estrés adicional era como se esperaba (Figura 5).

[0069] En todos los puntos de tiempo promediados, la distancia que nadaron las larvas WT en mm fue significativamente mayor en comparación con el pez mutante SOD1. Durante el nado espontáneo, después del desafío luz/oscuridad y después de la recuperación del desafío (Figura 5).

[0070] A continuación, se promediaron las distancias en mm que nadaron todas las larvas WT en un intervalo de tiempo de 1 minuto durante todo el período de tiempo para obtener un número relativo en comparación con el comportamiento de natación del mutante SOD1 (Figura 6).

[0071] Durante todo el experimento, la distancia en mm que nadaron las larvas mutantes SOD1 se redujo significativamente en comparación con las larvas WT. Las larvas WT nadaron casi un 45 % más de distancia que los mutantes SOD1 (Figura 6).

[0072] La Figura 6 revela que los mutantes SOD1 mostraron una reducción significativa en su actividad locomotora en comparación con WT durante todo el período de medición.

[0073] Para analizar la actividad locomotora en los mutantes SOD1 en comparación con los WT durante las diferentes fases del experimento, siguiendo las diferentes respuestas al estrés, calculamos la distancia recorrida por cada parte del experimento (Figura.7). La Figura 7 revela que los mutantes SOD1 mostraron una reducción significativa en su actividad locomotora en comparación con WT en las 3 fases del experimento.

[0074] Cuando se aplican cambios en el entorno de natación, se introduce estrés muscular y neurológico adicional. Durante la natación espontánea (0-10 minutos del experimento) y el desafío luz/oscuridad (respuesta optocinética; 10-20 minutos), los mutantes SOD1 mostraron una reducción significativa en su actividad locomotora en comparación con WT. Las larvas WT nadaron un 22-28 % más que los mutantes SOD1. Después de los dos picos de estrés (t= 10, 20 minutos), se evidenció un comportamiento de recuperación del desafío. Las larvas se congelaron y luego se recuperaron gradualmente a valores de natación espontánea. Durante esta fase, los mutantes SOD1 se recuperaron de manera menos eficiente, a un comportamiento de natación locomotor más bajo. En esta fase, las larvas WT nadaron un 116 % más de distancia que los mutantes SOD1.

II. Verificación - las larvas transgénicas mutantes de SOD1 tratadas con riluzol muestran un aumento de la actividad locomotora.

[0075] La excitotoxicidad crónica del glutamato puede acumularse hasta niveles tóxicos y contribuir a la muerte neuronal en la ELA. Esto proporcionó una base racional para emprender un ensayo clínico con riluzol, un fármaco con efectos complejos, pero que parece bloquear la liberación presináptica de glutamato. Riluzole demuestra un aumento modesto en la supervivencia en los participantes tratados (hasta 2-3 meses) y retrasa el inicio de la dependencia del ventilador o la traqueotomía en pacientes seleccionados, consulte Bensimon G, Lacomblez L, Meininger V, Group tras. A Controlled Trial of Riluzole in Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine 1994;330:585-91.

[0076] Para determinar si nuestro modelo de pez cebra tiene el potencial para identificar nuevas terapias de ELA, probamos la capacidad del fármaco antiexcitotóxico riluzol para modificar el estrés neuronal en las larvas de pez cebra mutante SOD1. Se eligió el riluzol para este estudio porque durante años fue el único fármaco establecido que demostró tener un efecto modificador de la enfermedad en pacientes con ELA y porque es el tratamiento estándar.

[0077] Se administró riluzol al agua de natación de las larvas mutantes SOD1 en una concentración final de 1 mM, una dosis que se probó y no mostró toxicidad en el pez cebra mutante SOD1, véase McGown A, Shaw DPJ, Ramesh T. ZNStress: un protocolo de detección de drogas de alto rendimiento para la identificación de compuestos que modulan el estrés neuronal en el modelo de pez cebra mutante transgénico sod1G93R de esclerosis lateral amiotrófica. Neurodegeneración molecular 2016;11:56.

[0078] Cuando se trataron mutantes de SOD1 con esta concentración de riluzol, se redujo el estrés neuronal en las interneuronas inhibidoras, véase McGown A, McDearmid JR, Panagiotaki N, et al. Early interneuron dysfunction in ALS: insights from a mutant sodl zebrafish model. Annals of Neurology 2013; 73:246-58.

[0079] Cuando se trataron con riluzol, las distancias que nadaron las larvas mutantes SOD1 en mm fueron mayores en comparación con los peces mutantes SOD1 no tratados durante todas las fases del experimento.

[0080] Las distancias en mm que nadaron todas las larvas mutantes SOD1 tratadas con riluzol en un intervalo de tiempo de 1 minuto se promediaron durante todo el período de tiempo para obtener un número relativo en comparación con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado. Los mutantes de SOD1 tratados con riluzol mostraron una elevación significativa en su actividad locomotora en comparación con los mutantes de SOD1 no tratados durante todo el período de medición.

[0081] Durante todo el experimento, la distancia en mm que nadaron las larvas mutantes SOD1 tratadas con riluzol fue significativamente mayor (elevación del 36,8 %) en comparación con las larvas mutantes SOD1 no tratadas.

[0082] Para analizar la actividad locomotora en los mutantes SOD1 en comparación con los WT durante las diferentes fases de los experimentos, y siguiendo las diferentes respuestas al estrés, calculamos la distancia recorrida por cada parte del experimento (Fig. 8).

[0083] La Figura 8 revela que los mutantes de SOD1 tratados con riluzol mostraron una elevación significativa en su actividad locomotora en comparación con los mutantes de Sodl no tratados en las 3 fases del experimento.

[0084] El tratamiento con riluzol provocó una elevación constante de la actividad locomotora en todas las fases del experimento. Los mutantes de SOD1 tratados con riluzol mostraron un aumento significativo en su actividad locomotora en comparación con las larvas mutantes de SOD1 no tratadas durante la natación espontánea (aumento del 38 %), el desafío con luz/oscuridad (aumento del 32 %) y la recuperación del desafío (39,7 %).

III. Toxicidad y eficacia del tratamiento con Celecoxib en el modelo ELA (SOD1 mut).

[0085] El primer material que se probó fue el inhibidor de cox2 Celecoxib que se sugirió que tenía un papel como modulador neuroinflamatorio en el mantenimiento de los macrófagos en su estado neuroprotector (véase Aid S, Bosetti F. Targeting cyclooxygenases-1 and -2 in neuroinflammation: therapeutic implications. Biochimie 2011;93:46-51. Celecoxib se introdujo en el agua de natación de las larvas mutantes SOD1 en tres concentraciones finales, 30 pM, 10 pM y l pM. Debido a restricciones de solubilidad, el experimento se llevó a cabo con un fondo de DMSO al 0,3 % en todas las muestras (incluida la muestra de control).

[0086] Resumen de la sección III: Al utilizar DMSO al 0,3 % como base, Celecoxib provocó toxicidad cardiovascular y la muerte en la concentración de 30 pm. Se evidenció una sutil reducción locomotora en el tratamiento con Celecoxib 10 pM durante la fase específica del experimento. La reducción de DMSO al 0,1 % como base provocó un aumento de la toxicidad producido por Celecoxib. Aunque la morfología y el comportamiento generales eran normales, se observó una reducción de la capacidad locomotora por debajo de Celecoxib 10 pM y fue evidente a 5 pM.

[0087] La enzima superóxido dismutasa es un catalizador antioxidante central que utiliza 02- como sustrato (02-causa un grado considerable de daño biológico), reduciendo sus niveles a oxígeno molecular ordinario (02) o peróxido de hidrógeno (H202), véase Halliwell B, Gutteridge JMC. [1] Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: An overview. Methods in Enzymology: Academic Press; 1990:1-85. In vivo, el celecoxib es oxidado por el citocromo P450 (CYP450) 2C9 y 3a4 al metabolito inactivo hidroxicelecoxib, y luego el hidroxicelecoxib se convierte en carboxycelecoxib y glucurónido de celecoxib, ver Gong L, Thorn CF, Bertagnolli MM, Grosser T, Altman RB, Klein TE. Celecoxib pathways: pharmacokinetics and phannacodynamics. Pharmacogenetics and Genomics 2012;22:310-8. Los resultados que muestran un cambio en la toxicidad dependiendo de los niveles de DMSO pueden explicarse por una posible hipótesis que sugiere un papel del DMSO, un poderoso eliminador de OH en la protección contra la toxicidad de Celecoxib en mutantes SOD1.

[0088] Sin embargo, no se evidenció una eficacia sustancial usando todas las concentraciones de Celecoxib.

IV: Toxicidad y eficacia del tratamiento con ciprofloxacina en el modelo ELA (SOD1 mut)

[0089] El segundo material a ensayar fue la ciprofloxacina sugerida previamente para potenciar la actividad de DICER. Los niveles anormales de miARN son un mecanismo molecular común que subyace en múltiples formas de ELA humana familiar y esporádica, y se descubrió que la mejora de la actividad de DICER es beneficiosa in vivo, ver Emde A, Eitan C, Liou LL, et al. Dysregulated miRNA biogenesis downstream of cellular stress and ALS-causing mutations: a new mechanism for ALS. The EMBO journal 2015;34:2633-51.

[0090] Se introdujo ciprofloxacina en el agua de natación de las larvas mutantes SOD1 en tres concentraciones finales: 1 pM, 10 pM y 100 pM. El experimento se llevó a cabo con un fondo de DMSO al 0,1 % en todas las muestras (incluida la muestra de control). En todas las dosis de ciprofloxacino, no se observaron efectos inducidos por el fármaco en la morfología o la mortalidad.

[0091] Resumen de la sección IV: Los valores normalizados para cada experimento que compara el porcentaje de distancia recorrida de todas las distintas poblaciones tratadas con ciprofloxacina se compararon con las larvas mutantes SOD1 no tratadas. Se pueden hacer dos observaciones principales. En primer lugar, el tratamiento con ciprofloxacino, incluso en dosis altas, no fue tóxico para las larvas mutantes de SOD1. En segundo lugar, parece que bajo estas condiciones de estudio, la concentración de ciprofloxacina 100 uM fue la más potente para afectar la actividad locomotora del modelo ELA.

[0092] El resumen de todos los valores normalizados que representan el porcentaje de la distancia recorrida de las larvas de SOD1 tratadas con ciprofloxacina frente a las no tratadas, refinando las tres fases del experimento, mostró resultados inesperados (Figura 11).

[0093] El tratamiento con ciprofloxacina 1, 10, 50, 100, 200 y 500 pM casi no tuvo efecto sobre la actividad locomotora de las larvas mutantes SOD1 en condiciones de oscuridad (Figura 11). En la segunda fase de la luz, la fase de recuperación del estrés, el tratamiento con ciprofloxacina 50, 100, 200 y 500 pM dio una curva dependiente de la dosis que finalmente terminó en una meseta. Los estudios estáticos ANOVA y t-test no mostraron cambios estadísticamente significativos entre los tratamientos con 200 y 500 pM de ciprofloxacina (las estadísticas presentadas son significativas de los no tratados).

[0094] Durante el período de natación espontánea, solo una dosis de ciprofloxacina 100 uM provocó un comportamiento de natación elevado (Figura 11). Dos posibles explicaciones pueden subyacer al hecho de que el tratamiento con 200 y 500 pM de ciprofloxacina no provocó una elevación en la natación espontánea de los mutantes SOD1: una carga sutil sobre la capacidad de natación debido a las altas concentraciones de ciprofloxacina o, aunque menos razonable, niveles elevados de sal de NaCl en la natación. medios (o ambos). Para ajustar los niveles de pH a los del grupo de control (sin ciprofloxacina), se añadió NaOH a una concentración final de 0,06 mM en los tratamientos de 50 y 100 pM de ciprofloxacina, 0,135 mM y 0,32 mM de NaOH en los tratamientos de 200 pM y 500 pM. Tratamientos con ciprofloxacino, respectivamente.

[0095] La Figura 11 describe un resumen de la actividad locomotora de los mutantes SOD1 tratados con distintas concentraciones de ciprofloxacina durante las 3 fases del experimento.

V. Toxicidad y eficacia del tratamiento con combinaciones de celecoxib y ciprofloxacina en el modelo ELA (SOD1 mut)

[0096] Combinación de cox2 inhibidor Celecoxib que se sugirió que tenía un papel como modulador neuroinflamatorio en el mantenimiento de los macrófagos en su estado neuroprotector23 con ciprofloxacina que se sugirió anteriormente para mejorar la actividad de DICER para atenuar los niveles anormales de miARN, ver Emde A, Eitan C, Liou LL, et al. Dysregulated miRNA biogenesis downstream of cellular stress and ALS-causing mutations: a new mechanism for ALS. The EMBO journal 2015;34:2633-51 fue de interés, ya que ambos abordan dos mecanismos principales que subyacen a la ELA. Además, se ha demostrado la actividad sinérgica de ambos agentes, consulte Dey R, Sultana S, Bishayi B. Combination treatment of celecoxib and ciprofloxacin attenuates live S. aureus induced oxidative damage and inflammation in murine microglia via regulation of cytokine balance. J Neuroimmunol 2018;316:23-39.

[0097] Debido a la limitación tóxica en el uso de Celecoxib, decidimos usar Celecoxib 1,4 y 10 pM en combinación con la concentración más potente de ciprofloxacina (100 mM). El experimento se llevó a cabo sobre el fondo de DMSO al 0,1 % en todas las muestras.

[0098] En todas las combinaciones utilizadas (100 pM Cipro 1 pM Celecoxib; 100 uM Cipro 4 pM Celecoxib; 100 pM Cipro 10 pM Celecoxib), no hubo anomalías del sistema cardiovascular (frecuencia cardíaca, morfología, hemorragia y edema) o mortalidad. El tratamiento de larvas mutantes SOD1 con la concentración más alta de celecoxib con ciprofloxacina (100 pM Cipro 10 pM Celecoxib) tuvo un efecto visible en su capacidad de natación bajo el microscopio. Las larvas nadaron distancias más cortas y cayeron de lado entre movimientos. No se observaron anormalidades obvias en el movimiento en las larvas mutantes SOD1 tratadas con las combinaciones que contenían dosis más bajas de Celecoxib (100 pM Cipro 1 pM Celecoxib; 100 uM Cipro 4 pM Celecoxib).

[0099] La distancia promedio que se movieron las larvas tratadas por intervalo de tiempo de 1 minuto se analizó usando el software EthoVision.

[0100] El movimiento anormal observado bajo el microscopio en las larvas mutantes de SOD1 tratadas con la mezcla 100+10 (Cipro 100 uM Celecoxib 10 pM) fue evidente; las larvas nadaron distancias más cortas durante los períodos de nado espontáneo y desafío de luz/oscuridad. La mezcla que contenía la concentración más baja de Celecoxib 100+1 (Cipro 100uM Celecoxib 1 pM) proporcionó una mejora sustancial en la capacidad de natación del mutante SOD1 durante todos los perfiles de respuesta conductual.

[0101] A continuación, se promedió la distancia en mm que todas las larvas del mismo tratamiento nadaron en un intervalo de tiempo de 1 minuto durante todo el período de tiempo para obtener un número relativo en comparación con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado (Figura 4). La figura 4 muestra la actividad locomotora de los mutantes de SOD1 tratados con combinaciones de ciprofloxacina y celecoxib en comparación con los mutantes de SOD1 no tratados durante todo el período de medición.

[0102] En su conjunto, los mutantes SOD1 tratados con la mezcla 100+1 mostraron una mejora drástica y significativa en la capacidad para nadar (28,8 %, Figura 4). Los mutantes SOD1 tratados con la mezcla 100+4 mostraron una mejora significativa en su capacidad para nadar, aunque menor que la mezcla 10+1 (14,9 %). Los mutantes de SOD1 tratados con la mezcla 100+10 mostraron una reducción significativa en su comportamiento de natación (disminución del 20,7 %, Figura 4).

[0103] Se calculó la distancia recorrida por cada parte del experimento y se comparó con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado (Figura 3). La figura 3 muestra las combinaciones de ciprofloxacina y celecoxib: la actividad locomotora de los mutantes de SOD1 tratados en comparación con los mutantes de SOD1 no tratados en las 3 fases del experimento. En las tres fases del experimento, la eficacia de las distintas combinaciones fue dependiente de la dosis, con mayor potencia a medida que disminuían las dosis de celecoxib en la mezcla (Figura 3). Los mutantes de SOD1 tratados con la mezcla 100+1 mostraron una mejora sobresaliente en su capacidad de natación durante la natación espontánea (25,3 %), el desafío con luz/oscuridad (11,8 %) y de forma más espectacular durante la recuperación del desafío (¡72,2 %!).

[0104] Los mutantes de SOD1 tratados con la mezcla 100+4 mostraron un aumento menor pero aún significativo en su capacidad de natación durante la natación espontánea (14,5 %) y la recuperación del desafío (42,8 %). El tratamiento con la mezcla 100+10 provocó una reducción estadísticamente significativa de la actividad locomotora de las larvas mutantes SOD1 durante la natación espontánea (disminución del 31,4 %) y exposición a la luz/oscuridad (disminución del 29,4 %). Durante la recuperación del desafío, fue evidente un aumento del 17,7 % incluso en la combinación 100+10 (Figura 3).

[0105] Como la combinación de Cipro 100 pM y Celecoxib 1 pM proporcionó una mejora tan sustancial en la capacidad de natación del mutante SOD1, se decidió comprobar adicionalmente su efecto sobre las larvas mutantes de SOD1 usando ensayos morfológicos.

VI: Análisis morfológico de la neurona motora ventral después del tratamiento con la combinación de celecoxib y ciprofloxacina en el modelo ELA (SOD1 mut)

[0106] Modelos de pez cebra ELA mutados en distintos genes asociados a ELA como TDP-43, FUS, C9orf72, Scistml, EPHA4 y SOD1, presentan un fenotipo de axones motores que consiste en axones neuronales motores excesivamente ramificados y desorganizados, así como déficits de natación, véase Kabashi et al., PLoS genetics 2011 ;7:e1002214;. Lemmens et al., Human molecular genetics 2007;16:2359-65;Lattante et al., Human molecular genetics 2015;24:1682-90; Sorana et al., Annals of neurology 2013; 74:180-7; Van Hoecke et al., Nature medicine 2012;18:1418; Sakowski SA, Lunn JS, Busta AS, et al. Neuromuscular effects of G93A-SOD1 expression in zebrafish. Molecular neurodegeneration 2012;7:44; .Armstrong et al., PloS one 2016;11 :e0150188.

[0107] Usamos inmunotinción, microscopía apotómica y software de análisis de imágenes Imaris para caracterizar la morfología de las neuronas motoras en WT, mutantes SOD1 G93R no tratados y mutantes SOD1 G93R tratados con la combinación 100 pM Cipro 1 pM Celecoxib (Figura 14).

[0108] El pez cebra WT exhibió predominantemente neuronas motoras normales, con axones largos y moderadamente ramificados (Figura 14, panel izquierdo).

[0109] Las larvas mutantes SOD1 G93R, todas originarias del mismo lote de puesta, se dividieron en dos grupos, se trataron (la mitad solo con DMSO y la otra mitad con la mezcla), se tiñeron y se tomaron imágenes. El grupo de control mutante SOD1 del modelo ELA (sin tratar, DMSO al 0,1 %) mostró una axonopatía grave con fibras ramificadas muy complejas (Figura 14, panel central). Sorprendentemente, la mitad de las larvas mutantes SOD1 que se trataron con la combinación de Celecoxib 1 pM y Ciprofloxacina 100 pM mostraron una recuperación significativa de la morfología mutante y obtuvieron una morfología de axón casi normal (Figura 14, panel izquierdo).

[0110] En resumen, la Figura 14 describe que la administración de ciprofloxacina y celecoxib recuperó la axonopatía de peces mutantes SOD 1. Análisis morfológico de neuronas motoras individuales en el tronco de la larva del pez cebra; los segmentos S10-S12 se usaron para el análisis. Panel izquierdo: WT, panel central: pez mutante SOD1 no tratado, panel izquierdo: 1 pM Celecoxib 100 pM Ciprofloxacina, pez mutante SOD1 tratado. Panel superior: imágenes de pila z de apótomo reconstruidas en 3D de neuronas motoras ramificadas en el tronco de larvas de pez cebra 6dpf inmunoteñidas con anticuerpos anti-tubulina acetilada. Paneles medio e inferior: la espina (procesos coloreados) de las neuronas motoras trazadas con el análisis de Filamentos del software Imaris (Bitplane; en blanco: espina de una sola neurona motora). n=15; mutantes de SOD1 de control y tratados y n = 11; Pescado WT.

[0111] Se realizaron análisis de imágenes de alta resolución utilizando el software Imaris para comparar distintos parámetros de la morfología de los axones (Figura 15). Todos los parámetros examinados mostraron una reducción en la axonopatía en los peces mutantes SOD1 tratados con Celecoxib 1 pM y Ciprofloxacina 100 pM en comparación con los mutantes SOD1 no tratados, incluido el área, nivel de ramificación, puntos de ramificación (uniones), segmentos, longitud y su extensión en el análisis de Sholl y mostró una recuperación significativa hacia la morfología del axón de tipo salvaje (Figura 15).

[0112] La combinación de ciprofloxacina y celecoxib provocó una recuperación casi total de la axonopatía de las neuronas motoras de los peces mutantes SOD1. En resumen, la Figura 15 representa que la combinación de ciprofloxacina y celecoxib provocó una recuperación casi total de la axonopatía de las neuronas motoras de peces mutantes SOD1. Los aspectos de longitud y ramificación de las proyecciones axonales de las neuronas motoras se calcularon utilizando el software Imaris (Bitplane) y se trazan en los gráficos.

VII. Comparación de la eficacia del tratamiento con enoxacina frente a ciprofloxacina en el modelo ELA (SOD1 mut)

[0113] La enoxacina es una molécula pequeña de la familia de las quinolonas que mejora la degradación del ARNm mediada por ARNsi y promueve la biogénesis de miARN endógenos, véase Melo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011 ;108:4394-9., y Shan et al. A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nature biotechnology 2008;26:933-40. Los modelos de ELA tanto in vitro como in vivo mostraron beneficios cuando se trataron con enoxacina, véase Emde et al., The EMBO journal 2015;34:2633-51, y Shan et al., Nature biotechnology 2008;26:933-40. La ciprofloxacina, otro elemento de la familia de las quinolonas, está disponible comercialmente y se demostró que tiene una actividad sustancial de mejora del ARNi. Su efecto fue ligeramente menor que el de la enoxacina en ensayos de indicadores de ARNi in vitro, véase Shan ibid. En este estudio, la ciprofloxacina mostró una mejora significativa en la actividad de natación de las larvas mutantes SOD1 (Figura 10).

[0114] Para examinar la hipótesis de que la ciprofloxacina, como la enoxacina, puede contribuir al modelo de ELA in vivo, nos propusimos comparar el efecto de la enoxacina y la ciprofloxacina sobre la capacidad motora del mutante de pez cebra SOD1 G93R.

[0115] Se introdujo enoxacina en el agua de natación de las larvas mutantes SOD1 en dos concentraciones finales: 10 pM y 100 pM. El experimento se llevó a cabo con DMSO al 0,1 % de fondo en todas las muestras.

[0116] En ambas dosis de enoxacina, no se observaron efectos inducidos por el fármaco en la morfología o la mortalidad. Se analizó la distancia promedio que se movieron las larvas tratadas por intervalo de tiempo de 1 minuto. El tratamiento con 100 pM de enoxacina provocó un aumento de la actividad locomotora de las larvas de ELA. La dosis de ciprofloxacina 10 pM no afectó significativamente la actividad locomotora de las larvas mutantes tratadas durante todo el experimento. Se observó un efecto de dosis muy similar en las larvas tratadas con ciprofloxacina.

[0117] Durante todo el experimento, la distancia en mm que nadaron las larvas mutantes SOD1 tratadas con enoxacina de 10 pM no cambió en comparación con las larvas mutantes SOD1 no tratadas. Los mutantes de SOD1 tratados con 100 m de enoxacina mostraron un aumento sustancial en su comportamiento de natación (19,9 %). De manera similar, durante todo el experimento, la distancia en mm que nadaron las larvas mutantes SOD1 tratadas con ciprofloxacina 10 pM no cambió en comparación con las larvas mutantes SOD1 no tratadas, mientras que las mutantes SOD1 tratadas con ciprofloxacina 100 pM mostraron un aumento sustancial en su comportamiento de natación (17,8 %).

[0118] Se calculó la distancia recorrida por cada parte del experimento y se comparó con el comportamiento de natación del mutante SOD1 no tratado (Figura 12). El tratamiento con Menoxacina 10 pM casi no tuvo efecto sobre la actividad locomotora de las larvas mutantes SOD1 durante la natación espontánea, el desafío con luz/oscuridad y la recuperación del segundo desafío. El tratamiento con enoxacina de 100 pM mostró un aumento significativo en la actividad locomotora en la fase de nado espontáneo (20,1 %), desafío luz/oscuridad (21 %) y después de la recuperación del desafío (17,6 %, Figura 12).

[0119] La Figura 12 representa la actividad locomotora de los mutantes de SOD1 tratados con enoxacina en comparación con los mutantes de SOD1 no tratados en las 3 fases del experimento.

[0120] En consecuencia, el tratamiento con ciprofloxacina 10 pM casi no tuvo efecto sobre la actividad locomotora de las larvas mutantes SOD1 durante las tres fases experimentales (Figura 10). El tratamiento con Ciprofloxacina 100 pM mostró un aumento significativo de la actividad locomotora en la fase de natación espontánea (26,2 %) y después de la recuperación del desafío (33,5 %).

[0121] Para concluir esta parte, las comparaciones entre los tratamientos con ciprofloxacina 100 pM y enoxacina 100 pM se presentan en la Figura 13. La Figura 13 representa la actividad locomotora normalizada de enoxacina frente a mutantes de SOD1 tratados con ciprofloxacina en comparación con mutantes de SOD1 no tratados en todas las 3 fases del experimento.

[0122] En primer lugar, tanto la enoxacina como la ciprofloxacina provocaron un aumento global similar en la actividad locomotora de las larvas mutantes de SOD1 en el mismo intervalo de concentraciones. En segundo lugar, el tratamiento de mutantes de SOD1 con ciprofloxacina provocó una actividad locomotora elevada en comparación con el tratamiento con enoxacina durante la natación espontánea y la recuperación del desafío (Figura 13).

EJEMPLO 3

[0123] La combinación de ciprofloxacina y celecoxib se formula para administración oral, administración intravenosa o administración tópica.

[0124] Las formulaciones de la presente invención comprenden, entre otras cosas, de manera no limitativa, ingredientes adicionales o excipientes farmacéuticos para desarrollar aún más una fórmula para tener una concentración deseada, dosis efectivas, regímenes de dosificación y tiempos de tratamiento. Estos ingredientes incluyen, entre otros, solubilizantes, estabilizadores, tampones, modificadores de la tonicidad, agentes de carga, potenciadores/reductores de la viscosidad, tensioactivos, agentes quelantes y adyuvantes.

[0125] Administración oral Los fármacos orales se toman como tabletas o cápsulas.

[0126] Tabletas: la disolución de la tableta puede verse afectada significativamente por el tamaño de las partículas y la forma cristalina. El tiempo de disolución se puede modificar para un efecto rápido (disolución rápida) o para una liberación sostenida (tasas de disolución lentas que prolongan la duración de la acción o evitan niveles plasmáticos altos iniciales).

[0127] Cápsulas: Una cápsula es una envoltura gelatinosa que encierra la sustancia activa. Las cápsulas pueden diseñarse para permanecer intactas durante algunas horas después de la ingestión para retrasar la absorción. También pueden contener una mezcla de partículas de liberación lenta y rápida para producir una absorción rápida y sostenida en la misma dosis.

[0128] Liberación oral sostenida: La liberación oral sostenida en cápsulas o tabletas se logra, de manera no limitativa, al incorporar el ingrediente activo en una matriz porosa insoluble, de modo que el fármaco que se disuelve debe salir de la matriz antes de que se pueden absorber, formulaciones de liberación sostenida en las que la matriz se hincha para formar un gel a través del cual sale el fármaco, o mediante un sistema de administración oral de liberación controlada osmótica, en el que el compuesto activo está encerrado en una membrana permeable al agua con un orificio perforado con láser en un extremo. A medida que el agua pasa a través de la membrana, el fármaco es expulsado a través del orificio hacia el tracto digestivo, donde puede ser absorbido.

[0129] Soluciones: Las soluciones farmacéuticas se utilizan ampliamente como formas de dosificación para la administración oral de agentes terapéuticos. Las soluciones farmacéuticas se definen como preparaciones líquidas en las que el agente terapéutico y los distintos excipientes se disuelven en el sistema disolvente elegido. Las soluciones farmacéuticas son homogéneas, es decir, el o los agentes terapéuticos y los excipientes se disuelven en el vehículo.

[0130] Administración parenteral: la administración parenteral se realiza mediante administración intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraarticular. El medicamento se almacena en forma líquida o, si es inestable, liofilizado.

[0131] Administración tópica: Las formulaciones tópicas comprenden, entre otras cosas, crema, ungüento, pasta, loción o gel.

[0132] Entrega transdérmica: la entrega transdérmica se logra, p. ej., mediante parches transdérmicos.

[0133] Las rutas alternativas de administración son supositorios, intraventricular, intramuscular, inhalatoria, en aerosol y sublingual.

EJEMPLO 4

[0134] La composición de la presente invención se utiliza en las relaciones antes mencionadas de combinaciones de: Dosis humana diaria en peso/peso.

TABLA 1: Combinación peso/peso para Ciprofloxacina y Celecoxib

EJEMPLO 5

[0135] Una sinopsis de un ensayo clínico para evaluar el efecto terapéutico de una combinación de celecoxib y ciprofloxacina.

[0136] Como se usa en adelante, el término "Prime C" generalmente se refiere en lo sucesivo a una composición que comprende una combinación de celecoxib y ciprofloxacina.

TABLA 2 sinopsis para un ensayo clínico

(Continuación)

(Continuación)

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para usar en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto mamífero, en la que dicha composición comprende una combinación sinérgica de celecoxib y ciprofloxacina, en la que la proporción de celecoxib a ciprofloxacina varía de 1:10 a 1:200 (peso/peso).

2. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que dicha ciprofloxacina es ciprofloxacina-HCl.

3. La composición para uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la proporción de celecoxib a ciprofloxacina es 1:10 (peso/peso).

4. La composición para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en una tableta, una cápsula, una píldora, polvo liofilizado, emulsión, polvo granulado, crema, pomada, pasta, loción, gel, líquido, solución, parche y cualquier combinación de los mismos.

5. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en liberación rápida, liberación lenta, liberación sostenida, liberación controlada y cualquier combinación de los mismos.

6. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición comprende además ingredientes seleccionados de un grupo que consiste en solubilizantes, estabilizantes, tampones, modificadores de la tonicidad, agentes de carga, potenciadores/reductores de la viscosidad, tensioactivos, agentes quelantes, adyuvantes y cualquier combinación de los mismos.

7. Un kit que comprende celecoxib y ciprofloxacina para usar en un tratamiento sinérgico de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto mamífero, en el que la proporción de celecoxib a ciprofloxacina varía de 1:10 a 1:200 (peso/peso).

8. La composición para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en oral, tópica, dérmica, transdérmica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarticular, supositorio, intraventricular, inhalatorio, aerosol, sublingual y cualquier combinación de los mismos.

9. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en uno a la vez, no simultáneo, secuencial y concomitante.

10. La composición para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha composición está configurada para ser administrable de una manera seleccionada de un grupo que consiste en dosis única, dosis única diaria, dosis dos veces al día, dosis continua, infusión y cualquier combinación de los mismos.