ES2870030T3 - Reducción del nivel de LPA para tratar trastornos del sistema nervioso central - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de autotaxina (AT) para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno psiquiátrico de un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Reducción del nivel de LPA para tratar trastornos del sistema nervioso central

La invención se refiere a métodos de tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, en particular trastornos neurológicos y trastornos psiquiátricos en un sujeto, que comprenden reducir el nivel de LPA en el cerebro de dicho sujeto.

Antecedentes de la invención

El cerebro, es decir, el sistema nervioso central, es con diferencia el órgano más complejo del cuerpo humano. Debido a su complejidad, el cerebro es propenso a una variedad de enfermedades, tales como enfermedades psiquiátricas, neurológicas y neurodegenerativas. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, esquizofrenia, depresión, trastornos de ansiedad, propensión a estrés, trastornos de pánico, trastorno bipolar, trastorno por déficit de atención con hiperactividad (^a D^h D), trastornos de la conducta alimentaria, pero también esclerosis múltiple, epilepsia, enfermedad de Alzheimer y accidente cerebrovascular isquémico.

Dado que en la actualidad todavía no se entiende bien el funcionamiento del cerebro, el tratamiento de sus enfermedades todavía presenta una necesidad médica no cubierta significativa.

En particular, la esquizofrenia, la depresión y el trastorno bipolar son enfermedades mentales graves que afectan a aproximadamente una de cada cien personas en los países occidentales y provoca sufrimiento personal y familiar significativo, así como provoca costes sociales y económicos. Las causas neurobiológicas de tales enfermedades pueden rastrearse a disfunciones en la transmisión sináptica en el cerebro, y habitualmente se recomiendan agentes antipsicóticos, que se basan principalmente en alterar las rutas de señalización de dopamina o serotonina, para el tratamiento. Sin embargo, estas terapias provocan efectos secundarios frecuentes y con frecuencia graves.

Recientemente, se ha encontrado que la señalización de lípidos bioactivos y las interacciones proteína-lípido están implicadas en todas las etapas de procesos de señalización sináptica. Se ha identificado un controlador genético para esta ruta, la molécula de tipo fosfatasa “gen relacionado con la plasticidad 1” (PRG-1), que cuando se “desactiva” provoca déficits del comportamiento en ratones que son indicativos de enfermedad mental (Trimbuch et al., 2009). La secuencia genética de PRG-1 está altamente conservada entre animales de laboratorio y seres humanos.

Descripción de la invención

Con el objetivo de caracterizar de manera más específica la función de esta ruta en trastornos del sistema nervioso central, los presentes inventores encontraron que la mutación genética recientemente notificada (polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)) R345T en PRG-1 interfiere con la ruta mediante una pérdida de control sobre los niveles sinápticos de LPA y un posterior aumento de la liberación de glutamato en la sinapsis. Esta mutación genética tiene una frecuencia de aproximadamente el 0,6 %, correspondiente a aproximadamente 3,5 millones de ciudadanos europeos y 1,5 millones de los Estados Unidos. Además, los inventores evaluaron una cohorte de población humana usando mediciones sensoriales y de EEG, y encontraron que portadores de esta mutación genética mostraban una regulación sensorial reducida, la capacidad para eliminar mediante filtración información sensorial irrelevante. La regulación sensorial reducida está asociada con esquizofrenia y otros trastornos del comportamiento.

Las neuronas en el cerebro humano pueden dividirse ampliamente en dos clases: excitadoras o inhibidoras, dependiendo de si tienden a inducir o a suprimir la generación de un potencial de acción. Mantener el equilibrio correcto de excitación e inhibición (equilibrio E/I) garantiza que la actividad neuronal se regula de manera homeostática y permanece en un intervalo estrecho y seguro. Las neuronas excitadoras se caracterizan por la liberación del neurotransmisor glutamato, y niveles aumentados en la sinapsis conducen a desequilibrios en los sistemas de E/I. Se ha sugerido que las disfunciones relacionadas con este sistema homeostático contribuyen a la fisiopatología de trastornos mentales (Harrison y Weinberger, 2005; Javitt et al., 2008). PRG-1 controla estrechamente la síntesis de ácido lisofosfatídico (LPA), que a su vez controla la liberación de glutamato en la sinapsis (Trimbuch et al,. 2009; YUNG YUN C et al.; “Lysophosphatidic Acid Signaling in the Nervous System”, NEURON, vol. 85, n.° 4, páginas 669-682 y LIN M et al.; “Lysophosphatidic Acid (LPA) receptors: Signaling properties and disease relevance”, PROSTAGLANDINS AND OTHER LIPID MEDIATORS, vol. 91, n.° 3-4, 2010, páginas 130-138).

Reinstaurar un equilibrio E/I normal puede proporcionar un posible tratamiento para una gama de enfermedades mentales y neurológicas.

En esta ruta recién identificada, se ha encontrado sorprendentemente que la síntesis desregulada de LPA o niveles de LPA sinápticos no controlados conducen a una liberación de glutamato excesiva en la sinapsis y a un desplazamiento en el equilibrio E/I. Por tanto, reducir el nivel de ácido lisofosfatídico (LPA) en el cerebro puede tratar o prevenir muchos trastornos del sistema nervioso central.

Por tanto, un aspecto de la presente invención es proporcionar un inhibidor de autotaxina (AT) para su uso en el tratamiento o la prevención de trastornos psiquiátricos en un sujeto, que comprende reducir el nivel de LPA, que conduce a una mejor regulación de la liberación de glutamato en la sinapsis y, por tanto, a la reinstauración del equilibrio E/I.

Tal como se ha encontrado por los inventores, el PRG-1 desactivado conduce a niveles de LPA no controlados, es decir, excesivos. Por tanto, en una realización, los trastornos del sistema nervioso central se tratan activando o regulando por incremento PRG-1.

El LPA se sintetiza por la proteína autotaxina que actúa aguas arriba del eje LPA-LPA2/PRG-1 (Moolenaar y Perrakis, 2011). Tal como se ha encontrado por los inventores, la inhibición de autotaxina disminuye los niveles de LPA.

Por tanto, los trastornos psiquiátricos se tratan inhibiendo la autotaxina.

En una realización preferida, el inhibidor de autotaxina es éster (3,5-diclorofenil)metílico del ácido 4-[3-(2,3-dihidro-2-oxo-6-benzoxazolil)-3-oxopropil]-1-piperazincarboxílico (PF8380) o ácido (Z)-3-((4-((3-(4-fluorobencil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolan-5-iliden)-metil)fenoxi)metil)bencenoborónico (HA130).

Eligiendo dos inhibidores de autotaxina estructuralmente no relacionados, los inventores han mostrado que el efecto farmacológico observado se basa en la inhibición de autotaxina y no en ninguna otra propiedad intrínseca a las moléculas sometidas a prueba.

Se describen inhibidores de autotaxina, entre otros, en los documentos WO2009046841, WO2010115491 o WO2011044978. En particular, el documento WO2009046841 da a conocer una clase completa de derivados de piperidina y piperazina como inhibidores de autotaxina que también incluyen PF8380.

Además, los inventores han mostrado que ratones, que tienen un equilibrio de excitación/inhibición alterado, que se sabe que son un endofenotipo de trastornos psiquiátricos relacionados con esquizofrenia en el ser humano (por ejemplo, Harrison y Weinberger, 2005; Javitt et al., 2008), tras el tratamiento con un inhibidor de autotaxina mostraron una completa recuperación de la inhibición por impulso previo (PPI) alterada, el mejor fenotipo de ratón establecido para trastornos psiquiátricos tales como esquizofrenia (Davis, 1984; Swerdlow et al., 1994; Braff et al., 2001). Este ensayo de prueba también se usa de manera similar en seres humanos y evalúa la capacidad del cerebro para la regulación sensorial, que se encuentra que está alterada en individuos que portan una mutación de pérdida de función en el gen PRG-1, indicando por tanto fuertemente que los inhibidores de autotaxina también pueden ser eficaces en seres humanos.

De manera notable, los inventores también pudieron demostrar en un modelo de ratón que los inhibidores de autotaxina reducen eficazmente la ingesta de alimentos tras la privación de alimentos, lo que indica que pueden usarse para tratar trastornos de la conducta alimentaria, o trastornos que se benefician de una ingesta de alimentos reducida, tales como obesidad.

También hay evidencias que sugieren que esta ruta desempeña un papel en otros trastornos psiquiátricos, tales como trastornos de ansiedad y ADHD, así como en trastornos neurológicos tales como esclerosis múltiple y accidente cerebrovascular isquémico. Para este último, los inventores ya han recopilado primeros datos en modelos animales que muestran que el tamaño de infarto y los déficits motores relacionados con el accidente cerebrovascular se reducen significativamente mediante el uso del agente de inhibición de ATX, PF8380.

Se ha sugerido que el equilibrio E/I está implicado en una variedad de trastornos psiquiátricos, incluyendo esquizofrenia y trastorno bipolar, pero también trastornos de pánico, ADHD y, de manera más general, en la resiliencia, la resistencia innata del organismo frente al estrés y a la adversidad. Esta estrategia terapéutica puede ser adecuada no sólo para el tratamiento de pacientes que padecen enfermedad mental, sino que también puede usarse de manera preventiva en individuos que son particularmente propensos a problemas de salud mental.

También se piensa que la regulación de LPA y, mediante esta ruta, la regulación de la hiperexcitabilidad neuronal, desempeña un papel importante en muchas afecciones neurológicas tales como epilepsia, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer así como accidente cerebrovascular. Para el accidente cerebrovascular, los inventores ya han recopilado resultados preliminares de que el tamaño de infarto y los déficits motores relacionados con el accidente cerebrovascular se reducen significativamente en un modelo de ratón cuando se administra PF8380. Por tanto, el inhibidor de autotaxina (AT) es para su uso en la prevención o el tratamiento de trastornos psiquiátricos, tales como esquizofrenia, depresión, trastornos de ansiedad, propensión a estrés y trastornos relacionados con el estrés, trastornos de pánico, trastorno bipolar, ADHD o trastornos de la conducta alimentaria, tales como trastorno de la conducta alimentaria compulsiva. En el presente documento se da a conocer además un método que se refiere al tratamiento de trastornos neurológicos tales como esclerosis múltiple, epilepsia, enfermedad de Alzheimer y accidente cerebrovascular isquémico. Además, en otra realización, el inhibidor de autotaxina (AT) es para su uso en el tratamiento de la obesidad.

Según la presente invención, el inhibidor de autotaxina (AT) es para su uso en la prevención o el tratamiento de trastornos psiquiátricos, tales como esquizofrenia, depresión, trastornos de ansiedad, propensión a estrés y trastornos relacionados con el estrés, trastornos de pánico, trastorno bipolar, ADHD, trastornos de la conducta alimentaria, tales como trastorno de la conducta alimentaria compulsiva, u obesidad.

En otro aspecto, la invención se refiere a un inhibidor de autotaxina (AT) (denominado a continuación en el presente documento “agente”) que puede reducir el nivel de ácido lisofosfatídico (LPA) en el cerebro de un sujeto, para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno psiquiátrico de un sujeto.

El trastorno psiquiátrico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en esquizofrenia, depresión, trastornos de ansiedad, propensión a estrés, trastornos de pánico, trastorno bipolar, trastornos de la conducta alimentaria, tales como trastorno de la conducta alimentaria compulsiva, y ADHD.

En el presente documento se da a conocer además que puede tratarse un trastorno del sistema nervioso central, que es un trastorno neurológico, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en esclerosis múltiple, epilepsia, enfermedad de Alzheimer y accidente cerebrovascular isquémico.

En una realización, el agente puede reducir la excitación en el cerebro en estados de hiperexcitación relacionados con enfermedad mental, mediante la reducción del nivel de LPA.

En una realización, el agente puede inhibir o regular por disminución la autotaxina, logando de ese modo una reducción de los niveles de LPA.

El agente es un inhibidor de autotaxina, preferiblemente éster (3,5-diclorofenil)metílico del ácido 4-[3-(2,3-dihidro-2-oxo-6-benzoxazolil)-3-oxopropil]-1-piperazincarboxílico (PF8380) o ácido (Z)-3-((4-((3-(4-fluorobencil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolan-5-iliden)-metil)fenoxi)metil)bencenoborónico (HA130).

En el presente documento se da a conocer además una sustancia farmacéuticamente activa (denominada “agente”) que puede reducir el nivel de ácido lisofosfatídico (LPA) en el cerebro de un sujeto, agente que es preferiblemente un inhibidor de autotaxina, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad en el sujeto. En el presente documento se da a conocer además una sustancia farmacéuticamente activa (denominada “agente”) que puede reducir el nivel de ácido lisofosfatídico (LPA) en el cerebro de un sujeto, agente que es preferiblemente un inhibidor de autotaxina, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central u obesidad en el sujeto.

Tal como se usa el presente documento, “tratar” o “tratamiento” de un estado, un trastorno o una afección incluye: (1) inhibir el estado, el trastorno o la afección, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recidiva de la misma (en el caso de tratamiento de mantenimiento) o al menos un síntoma clínico o subclínico de la misma, o (2) aliviar o atenuar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado, el trastorno o la afección o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos.

Los términos “prevenir” o “prevención” se refieren a la profilaxis de una afección e incluyen prevenir o retrasar la aparición de síntomas clínicos del estado, el trastorno o la afección que se desarrollan en un ser humano que puede verse afectado por, o estar predispuesto a, el estado, el trastorno o la afección pero aún no experimenta ni presenta síntomas clínicos o subclínicos del estado, el trastorno o la afección.

Un modelo animal de trastornos del sistema nervioso central

La pérdida de PRG-1 da como resultado un fenotipo de hiperexcitación neuronal (Trimbuch et al., 2009), que se sabe que está presente en una variedad de trastornos psiquiátricos (véase Harisson y Weinberger, 2005; Javitt et al., 2008). Con respecto a esto, la deficiencia en PRG-1 es un modelo para un fenotipo de hiperexcitación neuronal relevante para trastornos psiquiátricos. Además, una mutación de PRG-1 está altamente conservada entre animales de laboratorio (R346T en ratones) y seres humanos (R345T en seres humanos), lo que significa que los resultados del modelo animal deben poder aplicarse directamente a seres humanos. Los inventores pudieron mostrar que esta mutación conduce a la pérdida de función de PRG-1 (véase a continuación). Para someter a prueba esta hipótesis, los inventores criaron ratones que carecían de un alelo de PRG-1 (PRG-1 /-) imitando la situación en portadores de R345T para evaluar su capacidad de procesamiento sensorial en comparación con ratones silvestres normales. Se emplearon metodologías electrofisiológicas in vivo así como pruebas de comportamiento para evaluar el procesamiento de información en estos ratones. Los ratones PRG-1 /- mostraron una interacción social reducida y también eran menos resilientes al estrés que los ratones silvestres, signos que son indicativos de los rasgos de comportamiento observados en trastornos mentales complejos. Con este modelo de ratón, que permite la cuantificación de parámetros asociados con enfermedad mental en seres humanos, ahora es posible someter a prueba agentes prospectivos que posiblemente pueden mejorar los síntomas provocados por esta mutación. Además de estos datos, los inventores han generado un ratón con inserción que porta la mutación humana PRG-1R346T. Usando este modelo de ratón, los inventores han validado los ratones PRG-1+/- como modelo para portadores de la mutación PRG-1R346T (figura 6).

Figuras

Figura 1: la mutación de pérdida de función PRG-1R346T redujo la intemalización de LPA debido a O-glicosilación alterada.

(A) PRG-1 y PRG-1R346T se expresan en las membranas de células HEK 293. (B) Imágenes de fluorescencia convencional de células transfectadas y estimuladas con TopFluor (TF)-LPA tras el lavado con SDS al 0,001 %. Barra de escala: 10 |im. (C, D) Análisis de FACS de TF-LPA internalizado de células transfectadas con PRG-1 y PRG-1R346T (n = 7 cada uno; prueba de la t). (E, F) La incubación con LPA C-17 y el posterior lavado tal como se describió anteriormente condujeron a un aumento significativo de TF-LPA en células que expresan PRG-1 pero no en células que expresan PRG-1R346T En línea, MG C-17, un producto de degradación de LPA C-17, aumentó significativamente en células que expresan PRG-1 pero no en células de control o que expresan PRG-1R346T (n = 4 cada uno; prueba de Kruskal-Wallis con prueba de comparaciones múltiples de Dunn). (G) La evaluación cuantitativa de la fosforilación de S347 usando péptidos marcados isotópicamente y espectrometría de masas de PRG-1 silvestre purificado y PRG-1R346T a partir de células HEK293 transfectadas estables reveló bajos niveles de fosforilación total para ambas variantes de proteína (n = 3 mediciones). (H) La captación de TF-LPA tal como se analiza mediante FACS disminuyó significativamente en PRG-1 mutante S347A y S347D. (I) La inmunotransferencia de tipo Western (WB) de IP usando un anticuerpo contra PRG-1 específico reveló niveles reducidos de O-GlcNAc en PRG-1R346T en comparación con PRG-1 silvestre. (J) El análisis densitométrico de n = 7 WB a partir de IP de células que expresan PRG-1 y PRG-1R346T reveló una cantidad significativamente reducida de O-GlcNAc en PRG-1R346T (prueba de la t). Todos los experimentos se realizaron en paralelo. Los diagramas de barras representan la media ± E.E.M. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Figura 2: PRG-1R346T no logra rescatar el fenotipo PRG-1'/_ ni inducir una captación de TF-LPA significativa.

(A, B) La electroporación in utero (IUE) de PRG-1 y PRG-1R346T conduce a la expresión en membrana de estos constructos. (C, D) Registros electrofisiológicos de fijación de voltaje de células completas in vitro a partir de neuronas estrelladas espinosas de la capa IV PRG-1'/_ en S1BF reconstituido o bien con PRG-1 (C) o bien con PRG-1R346T (D) mediante IUE (n = 11 neuronas PRG-1'/_ y 11 neuronas reconstituidas con PRG-1R346T de 4 ratones por grupo; prueba de la t). (E) Imagen de campo claro y regiones de interés (ROI, amarillo) de cultivos neuronales primarios que contienen neuronas PRG-1'/_. (F) Detección de neuronas transfectadas mediante un casete de IRES-GFP transfectado conjuntamente mediante iluminación fluorescente. Barra de escala: 50 |im. (G) Fluorescencia de nivel inicial (calculada como Af/f) de neuronas transfectadas y no transfectadas antes de la estimulación con TF-LPA. (H) Las neuronas transfectadas con PRG-1*1 presentaron un claro aumento en la intensidad de fluorescencia después de la aplicación de TF-LPA (izquierda), mientras que las neuronas transfectadas con PRG-1R346T no eran diferentes de las neuronas PRG-1'/_ no transfectadas (derecha). (I) El análisis de intensidad de fluorescencia de las ROI reveló una captación de TF-LPA significativa en neuronas transfectadas con PRG-1*1 pero no en neuronas transfectadas con PrG-1R346T (n = 25 neuronas por condición; ANOVA de mediciones repetidas con corrección a posteriori de Bonferroni). (J) La expresión de GFP o de PRG-1R346T en neuronas silvestres no alteró la captación de TF-LPA en comparación con neuronas no transfectadas (n = 57 neuronas silvestres, 10 transfectadas con GFP y 10 transfectadas con PRG-1R346T; prueba de Kruskal-Wallis con prueba de comparaciones múltiples de Dunn). (K) Visión general de imágenes de campo claro e imágenes de fluorescencia que muestra TF-LPA en neuronas con ROI (amarillo) de un cultivo neuronal primario. (L) El análisis de fluorescencia reveló una captación de TF-LPA inferior significativa en neuronas PRG-1+/_ en comparación con neuronas silvestres (n = 15 neuronas por grupo; prueba de la t). ***p<0,001. Los diagramas de barras representan la media ± E.E.M.

Figura 3: expresión de PRG-1 en la corteza de campo de barriles somatosensorial (S1BF) y evaluación electrofisiológica in vivo.

(A) PRG-1 se expresa fuertemente en neuronas de la capa IV del S1BF tal como se muestra mediante el indicador P-Gal. Barra de escala: 100 |im. (B) PRG-1 está ubicado en dendritas y (C) en espinas positivas para MAP-2. Barra de escala: 5 |im. (D-F) Evaluación de la red cortical en ratones PRG-1+/_ tal como se revela mediante actividad de MUA espontánea (picos: líneas; ráfagas: barras) analizada en ratones wt (11379 ráfagas; 5 ratones) y PRG-1+/_ (17919 ráfagas; 8 ratones). (G) Números de ráfagas de MUA en ratones PRG-1+/_ antes y después de la aplicación del inhibidor de ATX, HA-130.

Figura 4: los ratones PRG-1+/_ presentan una regulación sensorial alterada que se rescata mediante la inhibición de ATX.

(A) Respuestas de impulsos emparejados (ISI de 500 ms) frente a estimulación mecánica de bigote individual (el perfil muestra el promedio de 30 respuestas) y (B-D) análisis de amplitudes máximas (B), diferencia S1-S2 (C) y razón de S2/S1 (D, todas la prueba de la U de Mann-Whitney; n = 10 animales WT y 6 animales het. para PRG-1). (E) Respuestas de impulsos emparejados antes y después de la aplicación del inhibidor de ATX, hA-130. (F, G) Amplitudes máximas y razón de S2/S1 antes y después de la inhibición de ATX mediante HA-130 (n = 6 animales). Se evaluaron datos que comparan respuestas de impulsos emparejados antes y después de la aplicación de HA-130 mediante una prueba de la t para datos emparejados unilateral. Los gráficos de cajas representan los percentiles 25 y 75. La línea central muestra el percentil 50 (mediana). Los bigotes indican los percentiles 10 y 90.

Figura 5: los ratones PRG-1+/_ presentan un endofenotipo típico para trastornos psiquiátricos que se rescató mediante la inhibición de ATX.

(A) El índice de interacción social se redujo significativamente en ratones PRG-1+/_ (het.) (n = 12 ratones silvestres y 14 het.; prueba de la t para datos no emparejados). (B) Prueba de suspensión por la cola en condiciones normales y después de la exposición a tensión de restricción aguda (n = 14 animales het. para PRG-1 y 12 wt; prueba de la t para datos no emparejados). (C) Los ratones PRG-1+/_ presentaron un déficit robusto en PPI en todos los estímulos por impulso previo. La inhibición de ATX mediante tratamiento con PF8380 rescató significativamente el déficit de PPI en ratones PRG-1+/_ hasta un nivel que no era diferente de la PPI medida en ratones wt (ANOVA de 2 factores con prueba a posteriori de Bonferroni; n = 19 animales wt, 12 animales het. para PRG-1 y 10 animales het. para PRG-1 PF8380). *P<0,05, **P<0,01. Los diagramas de barras representan la media ± E.E.M.

Figura 6: la inhibición de ATX suprime un endofenotipo de trastornos psiquiátricos inducido por una mutación de PRG-1 humano (PRG-1R346T).

Los ratones que portan una mutación de PRG-1 humano monoalélica (PRG-1R346T) presentan una inhibición por impulso previo (PPI) significativamente reducida. Sin embargo, la inhibición de ATX tal como se muestra mediante tratamiento con PF8380 pudo rescatar la PPI reducida hasta valores WT. (ANOVA de un factor con prueba a posteriori de Bonferroni; n = 9 animales wt, 15 animales PRG-1R346T+/' y 15 animales PRG-1R346T+/' PF8380). **P<0,01, ***P<0,001. Las barras representan la media ± E.E.M.

Figura 7: R345T de PRG-1: una mutación humana de pérdida de función induce un endofenotipo para trastornos mentales.

(A) PRG-1 se expresa en neuronas positivas para NeuN de la corteza humana somatosensorial. Obsérvese la expresión de PRG-1 que delinea perfiles dendríticos de neuronas positivas para NeuN. El inserto representa la expresión de PRG-1 dendrítica en una neurona estrellada espinosa de la capa IV a un aumento superior. Barra de escala: 100 |im. (B) Los puntos de PRG-1 y PSD-95 delinean perfiles dendríticos de una neurona piramidal. El aumento superior (inserto) muestra a modo de ejemplo la ubicación conjunta de PRG-1/PSD95 (cabezas de flecha). (C) Análisis estratificado del genotipo de prg-1 en el potencial relacionado con acontecimientos P50 en portadores de mutPRG-1.

Figura 8: la hiperexcitabilidad neuronal inducida por aplicación de ketamina se redujo mediante la inhibición de ATX tal como se muestra mediante análisis de potencial de campo local (LFP).

(A) La aplicación de HA130 durante el lavado de ketamina inhibió la potenciación excitadora tal como se muestra mediante LFP provocados (ANOVA de 2 factores; n = 9 controles y n = 7 tras la aplicación de HA130 10 |iM). Los valores representan la media ± E.E.M.

(B) Las curvas de entrada-salida reflejan la potenciación tras la aplicación de ketamina (en comparación con el nivel inicial antes de la aplicación de ketamina). Sin embargo, tras le tratamiento con HA-130, la potenciación inducida por ketamina se revirtió a valores de nivel inicial.

Figura 9: la inhibición de ATX revierte el comportamiento característico en un modelo animal para esquizofrenia. (A) La PPI analizada en un modelo animal de esquizofrenia inducida por ketamina disminuyó significativamente y se rescató hasta valores WT mediante la inhibición de ATX mediante PF8380.

(B) La hiperactividad tras la aplicación de ketamina tal como se presenta en un entorno de campo abierto se redujo significativamente tras la inhibición de ATX mediante PF8380.

Figura 10: la inhibición de ATX mediante PF8380 reduce el tamaño de infarto en un modelo de ratón de oclusión de arteria cerebral medial (MCAO) de accidente cerebrovascular.

(A) La inhibición de ATX redujo significativamente el volumen de infarto medido 1 día (MCAO de 1 h) y 3 días (MCAO de 30 min) tras la MCAO.

(B) La inhibición de ATX mediante PF8380 disminuyó significativamente el volumen de infarto (MCAO de 30 min medida 3 d tras el accidente cerebrovascular) en ratones PRG-1+/_, que son un modelo animal para una variante de PRG-1 de pérdida de función humana (PRG-1R346T) que da como resultado hiperactividad cortical.

Figura 11: la inhibición de ATX da como resultado una puntuación neurológica mejorada y un mejor rendimiento motor en un modelo de ratón de oclusión de arteria cerebral medial (MCAO) de accidente cerebrovascular en ratones PRG-1+/- el modelo animal para una variante de PRG-1 de pérdida de función humana (PRG-1R346T) que da como resultado hiperactividad cortical.

(A) La inhibición de ATX mejora significativamente el desenlace en una puntuación de gravedad neurológica modificada (Chen J et al. 2001) tras el accidente cerebrovascular en ratones PRG-1+/- un modelo animal para hiperexcitabilidad cortical que imita una mutación PRG-1R345T humana (N = 11 ratones PRG-1+/_ y 13 PRG-1+/_ PF8380. ANOVA de 2 factores y comparaciones múltiples a posteriori usando el ajuste de Bonferroni para la comparación a las 3 h, 24 h, 48 h y 72 h tras la MCAO. ***p<0,001, **** p<0,0001. Los diagramas representan la media ± E.E.M.

(B) La disfunción sensorimotora a largo plazo tras accidente cerebrovascular tal como se muestra mediante la prueba de la esquina (Zhang L et al. 2002) mejoró significativamente en ratones PRG-1+/_ mediante la inhibición de ATX, N = 11 ratones PRG-1+/- y 13 PRG-1+/- PF8380. ANOVA de 2 factores *p<0,05, ***p<0,001 significativo. Comparaciones múltiples tras ANOVA de 2 factores significativas 24 h tras la MCAO y hasta 72 h tras la MCAO. Figura 12: HA130 disminuye las mEPSC en ratones het. para PRG-1.

(A) La inhibición de ATX mediante HA-130 10 |iM (izquierda) disminuyó las mEPSC en ratones het. para PRG-1, sugiriendo un efecto dependiente de la dosis génica de deficiencia en PRG-1 (prueba de la t de Student para datos emparejados; n = 8).

(B) La inhibición de ATX mediante HA-130 10 |iM disminuyó las mEPSC, lo cual refleja la liberación glutamatérgica espontánea en terminales presinápticos y que está mediada por receptores de LPA2 presinápticos (Trimbuch et al., 2009) (prueba de la t de Student para datos emparejados; n = 8).

Figura 13: PF8380 no afecta a la mEPSC en animales silvestres, pero reduce la mEPSC en ratones con deficiencia en PRG-1 (KO).

(A) La inhibición de ATX mediante PF8380 no afectó a la frecuencia ni a las amplitudes de mEPSC en animales silvestres (WT).

(B) Sin embargo, en condiciones de concentraciones de fosfolípidos sinápticas aumentadas tal como están presentes en ratones con deficiencia en PRG-1, la aplicación de PF8380 1 |iM redujo significativamente la frecuencia de mEPSC (izquierda) y, por tanto, la hiperexcitabilidad neuronal, aunque no influyó en su amplitud (derecha, prueba de la t de Student para datos emparejados).

Figura 14: HA130 disminuye las sPSC en ratones PRG-1+/_.

La inhibición de ATX en ratones PRG-1+/_, que presentan una hiperexcitabilidad neuronal, reveló una disminución significativa de corrientes postsinápticas espontáneas (sPSC) tras el tratamiento con HA130 1 |iM y 10 |iM. Las sPSC son la suma de la entrada excitadora e inhibidora global a nivel de una única neurona y reflejan el equilibrio de excitación/inhibición (e/i).

Figura 15: PF8380 disminuye las eEPSC.

La aplicación de PF8380 en secciones de hipocampo procedentes de ratones con deficiencia en PRG-1 afectó significativamente a los potenciales provocados (izquierda), pero no alteró un segundo estímulo aplicado a un intervalo de 50 ms (centro) dando como resultado un aumento de PPR (derecha, todas son pruebas de la t de Student para datos emparejados).

Figura 16: los registros in vivo simultáneos de la MEC y la CA1 del hipocampo en ratones con movimiento libre muestran el impacto de PF-8380 sobre el fenotipo de sobreexcitación.

(A) Frecuencia de coherencia theta entre MEC y CA1 (7-12 Hz) y (B) la coherencia en el intervalo theta y gamma de ratones WT, PRG1-/- y PRG1-/- tratados con p F8380 (n = 15 ratones WT, 13 ratones PRG1-/- sin tratar y 7 PRG1-/-tratados con PF8380). Véase también la figura complementaria S5. (C) La frecuencia máxima de la coherencia theta entre MEC y CA1 fue inferior en ratones PRG1-/- y PRG1-/- tratados con PF8380 que en ratones WT. (D) Frecuencia máxima de la coherencia gamma. (E, F) La coherencia gamma entre MEC y CA1 fue superior en ratones PRG1-/- y se redujo hasta niveles WT mediante tratamiento con PF8380 mientras que la coherencia theta media no se vio afectada por la deleción de PRG1. Se aplicó ANOVA de un factor con corrección de Bonferroni para datos con distribución normal y la prueba de Kruskal-Wallis y de comparaciones múltiples de Dunn para datos no paramétricos. (G) En línea con las concentraciones efectivas de PF8380 en líquido cefalorraquídeo (CSF; véase la figura 12), la inhibición de ATX mediante esta sustancia dio como resultado una disminución significativa de las especies de LPA principales (LPA 16:0, 18:1, 18:2), las cuales representan la mayor parte del contenido en LPA del cerebro (n = 6 para todos los grupos excepto para LPA18:2, PRG-1+vehículo con n = 5; prueba de la U de Mann-Whitney unilateral). Para evitar el sesgo mediante una posible contaminación con sangre, que contiene niveles de LPA superiores y puede producirse durante la extracción de CSF, se excluyeron los valores que superaban la media 2xDE.

Figura 17: el registro in vivo en la capa II de la MEC y en la CA1 del hipocampo de ratones con movimiento libre muestra la acción específica de PF 8380 sobre el fenotipo excitador.

(A) Secciones de cerebro con tinción de Nissl representan la posición de electrodo en la región de CA1 del hipocampo y en la capa II de la corteza entorrinal medial (MEC). Barra de escala: 200 |im. (B) Ejemplo de un perfil que muestra el comportamiento exploratorio de ratón en el campo abierto durante el registro simultáneo en la CA1 y la capa II de la MEC. (C) Ejemplo del perfil de velocidad del ratón mostrado en b durante el comportamiento exploratorio en el campo abierto. (D, E) Los ratones silvestres (n = 15) y PRG- 1-/- (sin tratar, n = 10, y tratados con PF8380, n = 6) mostraron una preferencia similar y ninguna diferencia en la velocidad de movimiento promedio durante el comportamiento exploratorio en el entorno de campo abierto (ANOVA de un factor). (F) La aplicación de PF83801 |im que bloquea la molécula de síntesis de LPA, autotaxina (ATX), redujo significativamente las corrientes postsinápticas espontáneas (sPSC), que son la suma de la entrada excitadora e inhibidora global, a nivel de una única neurona al tiempo que no afectó a la amplitud (n = 13 neuronas sin tratar y 12 PRG-1-/- tratadas con PF8380). Se calcularon los datos usando una prueba de Mann-Whitney unilateral. (G) La aplicación in vivo de PF8380 en concentraciones terapéuticas de 30 mg/KG/PC25 dio como resultado concentraciones robustas en el suero y niveles eficaces en el líquido cefalorraquídeo (csf) que fueron hasta 4 veces superiores a la CI50.

Figura 18: la evaluación del aprendizaje espacial en ratones PRG-1-/- muestra el impacto específico de PF8380 sobre los déficits de comportamiento relacionados con la hiperexcitación.

(A) La latencia de escape en el laberinto acuático de Morris en ratones PRG1-/- sin tratar (n = 10) y tratados con PF8380 (n = 7) no cambió durante los días de entrenamiento. (B, C) La velocidad de movimiento media y el tiempo empleado sin moverse (inmovilidad) durante los ensayos de prueba fueron significativamente diferentes entre animales PRG-1-/-tratados con PF8380 y sin tratar. Todos los datos representan la media ± e.e.m. Se calcularon los datos usando un ANOVA de RM de dos factores. (D, E) Se presentan los errores de memoria de trabajo y las entradas de nueva rama de los ensayos 4+5 se presentan como porcentaje de los ensayos 1+2 (n = 10 animales WT, 10 PRG-1-/- y 10 PRG-1-/-/LPA2-/-). Se calcularon los datos usando una prueba de la t para datos emparejados bilateral para ratones WT y PRG1-/- y una prueba de la t para datos emparejados unilateral para el grupo LPA2-R-/-/PRG1-/- y una prueba de rangos con signo de parejas coincidentes de Wilcoxon cuando los datos no tenían distribución normal. Todos los datos representan la media ± e.e.m. *p<0,05; ***p<0,001.

Figura 19: la inhibición de ATX reduce la ingesta de alimentos inducida por privación de alimentos.

(A) La inhibición de ATX no altera la ingesta de alimentos en ratones de control. Sin embargo, cuando se expusieron a alimentos animales sometidos a privación de alimentos durante la noche, los animales tratados con PF8380 presentaron una ingesta de alimentos significativamente reducida (dentro del plazo de 60 min) apuntando a un efecto cortical específico de PF8380 sobre el comportamiento relacionado con obesidad (n = 31 animales de control (C) y 31 C+PF8380, 45 sometidos a privación de alimentos y 45 sometidos a privación de alimentos PF8380, prueba de la U de Mann-Whitney, ****p<0,0001).

(B) Los controles, los controles sometidos a privación de alimentos durante la noche y los animales sometidos a privación de alimentos durante la noche tratados con PF8380 no presentaron diferencias significativas en el comportamiento de locomoción en el campo abierto (OF, 10 min) tal como se evalúa mediante la distancia total (n = 12 animales por grupo, prueba de Kruskal-Wallis).

Ejemplos experimentales que ilustran la invención

PRG-1R346T es una mutación de pérdida de función

Se mostró que PRG-1 participa en la internalización de ácido lisofosfatídico (LPA) en compartimentos postsinápticos intracelulares (Trimbuch et al., 2009), controlando de ese modo los niveles de LPA en la hendidura sináptica. Para entender las consecuencias moleculares del SNP humano que da como resultado un intercambio de arginina (R) por treonina (T) en la posición 345 en la cadena de aminoácidos de PRG-1, los inventores establecieron líneas de células HEK con expresión estable del homólogo de ratón de este SNP, PRG-1R346T, y encontraron una ubicación de membrana similar en comparación con PRG-1 silvestre (wtPRG-1, figura 1A). Tras la aplicación de LPA marcado por fluorescencia (TopFluor(TF)LPA) y retirada de TF-LPA unido a superficie usando SDS al 0,001 %, las células que expresaban PRG-1R346T presentaron una señal de fluorescencia inferior en compartimentos intracelulares (figura 1B). Este hallazgo se cuantificó mediante análisis de FACS (ejemplo mostrado en la figura 1C) revelando una capacidad significativamente reducida de células que expresaban P^r G-1R346T para internalizar TF-LPA en comparación con wtPRG-1 (figura 1D). Para demostrar sin ambigüedad la internalización de LPA, los inventores aplicaron un producto químico modificado, LPA no natural (C17-LPA) sobre células que expresaban wtPRG-1 que mostraron una internalización estadísticamente significativa de C17-LPA (figura 1E) y la presencia intracelular de su metabolito C17-MAG (figura 1F) en comparación con células HEK que carecen de cualquier expresión de PRG-1. En línea con los resultados anteriores, las células que expresaban PRG-1R346T no mostraron ningún aumento significativo de C17-LPA intracelular ni de su metabolito C17-MAG, proporcionando evidencias adicionales de que PRG-1R346T carece de la capacidad para mediar en la internalización de LPA al interior de las células (figura 1E, F).

PRG-1R346T altera la O-glicosilación, pero no la fosforilación de S347 adyacente

Dado que PRG-1R346T se expresaba de manera apropiada en la membrana, los inventores plantearon la hipótesis de que una modificación postraduccional estaba implicada en la pérdida de función en la internalización de TF-LPA. De manera interesante, el SNP que cambia R345 (arginina) a 3457 (treonina) está ubicado en estrecha proximidad a un sitio de fosforilación notificado con frecuencia (Goswami et al., 2012; Huttlin et al., 2010; Munton et al., 2007; Trinidad et al, 2008; Wisniewski et al., 2010). Por tanto, los inventores abordaron la cuestión sobre hasta qué punto la S (serina) adyacente en la posición 346 en seres humanos y en la posición 347 en el ratón se fosforila en condiciones silvestres y si esta fosforilación se ve eventualmente alterada debido a la mutación de R a T, que altera motivos de fosforilación típicos (Pearson y Kemp, 1991). Usando un análisis por espectrometría de masas cuantitativo y péptidos marcados isotópicamente correspondientes al péptido que contiene S347, los inventores detectaron que, aunque se describe como un posible sitio de fosforilación relacionado con la actividad (Munton et al., 2007), S347 adyacente al sitio de SNP sólo mostró una fosforilación minoritaria (el 4,73 % del PRG-1 total, figura 1G). Además, en PRG-1R346T, los inventores no pudieron detectar ningún cambio relevante en la fosforilación de S347 (el 3,33 % del PRG-1 total, figura 1G) ni ninguna fosforilación de la T en la posición 346. Para evaluar adicionalmente si la fosforilación de S347 es una posible causa relevante para la pérdida de captación de LPA de PRG-1R346T, los inventores establecieron líneas de células HEK con una expresión estable de PRG-1S347A y PRG-1S347D, que imitan o bien el estado no fosforilado (S347A) o bien el estado fosforilado (S347D) de S347. Ambas líneas celulares carecían de la capacidad para internalizar significativamente TF-LPA por encima de niveles iniciales (figura 1H), argumentando fuertemente contra un papel importante para la fosforilación que explique la pérdida de función de PRG-1R346T en la internalización de TF-LPA, sin embargo, apuntando a la necesidad de S347 en esta posición. Otra modificación postraduccional intracelular, críticamente importante para la función cerebral, es la glicosilación de OGlcNAC (Rexach et al., 2008), que se produce en residuos de S y T y tiene una interacción compleja con la fosforilación (Tarrant et al., 2012). Usando estudios de inmunoprecipitación y anticuerpos específicos, los inventores analizaron la glicosilación de O-GlcNAC en wtPRG-1 en comparación con PRG-1R346T y detectaron niveles de glicosilación significativamente reducidos en células que expresaban PRG-1R346T (figura 1I, J), indicando una interferencia de la mutación R346T con su sitio de O-glicosilación S347 adyacente. Dado que ni A ni D son una diana para la glicosilación de O-GlcNAC y las líneas celulares que expresaban PRG-1S347A y PRG-1S347D carecían de la capacidad de internalizar TF-LPA (figura 1H), estos datos apuntan a la necesidad de una O-glicosilación en S para una función apropiada de PRG-1, que se ve alterada en PRG-1R346T

En resumen, estos datos sobre modificaciones postraduccionales proporcionan evidencias del hecho de que no son los cambios en la fosforilación, sino la O-glicosilación apropiada de S en la posición 346 en seres humanos en la que interfiere el SNP R345T, lo que es crucial para la función de PRG-1.

PRG-1R346T es una mutación de pérdida de función en la sinapsis

Para analizar las posibles consecuencias funcionales del SNP humano en las neuronas, los inventores evaluaron entonces la función de PRG-1R346T en la sinapsis y realizaron registros electrofisiológicos de fijación de voltaje de células completas a partir de neuronas estrelladas espinosas de la capa IV en el S1BF de animales PRG-17' que volvieron a expresar PRG-1R346T suministrado mediante electroporación in utero (figura 2A). Esta nueva expresión dio como resultado una ubicación apropiada de proteína PRG-1R346T en la membrana de la cabeza de la espina, excluyendo un impacto de esta mutación en la selección como diana de proteína (figura 2B). Aunque se notificó que la nueva expresión de wtPRG-1 en neuronas con deficiencia en PRG-1 rescataba la frecuencia de corrientes postsinápticas excitadoras en miniatura (mEPSC) hasta niveles silvestres en células piramidales de CA1 del hipocampo (Trimbuch et al, 2009), PRG-1R346T, aunque está presente en la ubicación dendrítica apropiada, no logró alcanzar este rescate funcional. Esto concuerda con una pérdida de función de PRG-1R346T, supuestamente debida a su incapacidad para soportar la internalización de LPA (figura 2A, C).

Para evaluar directamente las consecuencias funcionales de PRG-1R346T en neuronas en cuanto a su capacidad para internalizar LPA (Trimbuch et al., 2009), los inventores usaron neuronas corticales primarias obtenidas a partir de animales PRG-17- transfectados con un constructo que expresaba o bien prg-1wt o bien prg-1R346T (figura 2E, F) y midieron la internalización de LPA que se marcó mediante un marcador de fluorescencia (TopFluor, TF-LPA) en un modo de obtención de imágenes en directo. Se comparó la capacidad de internalización de TF-LPA o bien de PRG-1 * o bien de PRG-1R346T con neuronas con deficiencia en PRG-1 en el mismo experimento (véase también la figura 1G para niveles iniciales). Aunque la expresión de PRG-1*1 en neuronas indujo un aumento significativo en la internalización de TF-LPA, la expresión de PRG-1R346T no logró hacerlo (figura 2H, I). Para descartar un efecto negativo dominante de PRG-1R346T, los inventores usaron el mismo enfoque y transfectaron neuronas corticales obtenidas a partir de ratones silvestres con un constructo o bien de prg-1R346T o bien de GFP de control y no encontraron ninguna alteración en la internalización de TF-LPA en las neuronas transfectadas (figura 2J). Estos estudios confirmaron que PRG-1R346T era una mutación de pérdida de función en un contexto neuronal. Finalmente, dado que el SNP humano notificado sólo se detectó en portadores monoalélicos, los inventores analizaron el impacto de una pérdida de función monoalélica en neuronas corticales obtenidas a partir de animales PRG-1+/- y encontraron que la pérdida de PRG-1 monoalélica ya era suficiente para disminuir significativamente la internalización de TF-LPA en comparación con neuronas silvestres (figura 2K, L).

La modulación de fosfolípidos alterada debida a la pérdida monoalélica de PRG-1 sináptico afecta al equilibrio E/I cortical

Con el fin de caracterizar el papel de PRG-1 en redes corticales, los inventores evaluaron entonces la expresión de PRG-1 en la corteza cerebral y encontraron una fuerte expresión en la capa IV de la corteza de campo de barriles somatosensorial de ratón (figura 3A) que estaba restringida a neuronas glutamatérgicas. El análisis de la ubicación subcelular reveló que PRG-1 se expresaba en espinas dendríticas (figura 3B, C). Dado que la deleción heterocigótica de PRG-1, dejando tan sólo un alelo de prg-1 funcional, da como resultado una reducción lineal de la expresión de proteína de aproximadamente el 50 % (Trimbuch et al, 2009), y la deficiencia en PRG-1 heterocigótica redujo significativamente la capacidad funcional de neuronas PRG-1+/_ para internalizar TF-LPA en un intervalo similar (figura 2K, L), debe suponerse que los animales PRG-1+/_ son una correlación de animal de portadores de PRG1R345T monoalélico humanos que sólo tienen un alelo de prg-1 funcional no afectado por la mutación. Para entender las implicaciones de tal función de PRG-1 sináptica reducida en el procesamiento de información intracortical, los inventores realizaron registros extracelulares de múltiples canales en la corteza de S1BF de ratones wt y PRG-1+/_ in vivo (figura 3D). La actividad espontánea en ratones PRG-1+/_ mostró una prolongación significativa de la duración de ráfagas de actividad de múltiples unidades (MUA) en comparación con ratones wt (figura 3E, F). Este hallazgo apunta a un cambio en el equilibrio E/I celular hacia la excitación dentro de los microcircuitos corticales que se ha relacionado con déficits de comportamiento graves (Yizhar et al., 2011).

La inhibición de la síntesis de LPA revierte el procesamiento alterado de información cortical en ratones con deficiencia en PRG-1 monoalélica

Para someter a prueba la implicación de fosfolípidos a nivel de la red cortical, los inventores analizaron el efecto de inhibir la molécula de síntesis de LPA, autotaxina (ATX), que actúa aguas arriba del eje LPA-LPA²/PRG-1 (Moolenaar y Perrakis, 2011).

Sorprendentemente, HA-130, un inhibidor de ATX específico recientemente descrito (Albers et al., 2010), disminuyó significativamente las corrientes postsinápticas espontáneas (sPSC), que son la suma de la entrada excitadora e inhibidora global que refleja el equilibrio E/I total (figura 14). En línea con estos hallazgos ex vivo, ya a concentraciones de tan sólo 1 |iM, HA 130, aplicado en la corteza de ratones PRG-1^{+ /_} vivos, disminuyó significativamente el número de ráfagas de actividad de múltiples unidades (MUA) (figura 3G).

Además del análisis de actividad de red cortical espontánea, los inventores evaluaron el procesamiento de información cortical preatencional y midieron la regulación sensorial en un modelo de estimulación de bigotes de doble impulso (figura 4A). Los potenciales de campo local (registrados en el barril cortical específico del bigote) en respuesta a la estimulación repetitiva de un único bigote provocaron amplitudes más grandes que el segundo estímulo en PRG-1^{+ /_} en comparación con wt (S1; S2; ISI = 500 ms; figura 4B). Las amplitudes de S2 más grandes alteraron los valores de S1-S2 y dieron como resultado un aumento estadísticamente significativo de la razón de S2/S1 (figura 4C, D). Estos hallazgos indican que la pérdida de un alelo funcional de prg-1 que está presente en portadores de mutPRG-1, y por tanto una reducción de aproximadamente el 50 % de PRG-1 funcional en la sinapsis, ya provoca un desequilibrio de E/I evidente en redes corticales y una regulación sensorial alterada. Para demostrar si la modulación de fosfolípidos puede afectar directamente al procesamiento de información cortical, los inventores aplicaron HA-130 en el modelo de estimulación de bigotes de doble impulso (figura 4E). Esta inhibición de la síntesis de LPA restauró significativamente la regulación sensorial en animales con deficiencia en PRG-1 monoalélica tal como se muestra mediante la reducción de los valores de S2 (en comparación con los valores de S1) y una razón de S2/S1 reducida (figura 4F, G).

La intervención farmacológica en la deficiencia en PRG-1 monoalélica revierte los déficits del comportamiento característicos de trastornos del sistema nervioso central

Para responder a la pregunta de si alteraciones observadas en la función sináptica excitadora y la actividad de red cortical dan como resultado un fenotipo de comportamiento, los inventores evaluaron animales con deficiencia en PRG-1 monoalélica (PRG-1+/_). Usando un paradigma de caja de tres cámaras (Radyushkin et al., 2009), se encontró un índice de interacción social significativamente reducido en ratones PRG-1+/_ (figura 5A). Los inventores evaluaron además ratones PRG-1+/_ en condiciones normales y tras la aplicación de estrés ambiental, que se sabe que es un factor de riesgo para trastornos mentales (van Winkel et al., 2008). Aunque los ratones P^rG-1+/_ no presentaron ninguna diferencia en condiciones normales en pruebas de suspensión por la cola, tras estrés agudo, los ratones PRG-1+/_ mostraron una inmovilidad significativa superior (figura 5B), que en conjunto se asemejó a aspectos de comportamiento de trastornos mentales complejos (Cryan et al, 2005; Inta et al., 2010; Shen et al., 2008).

Dado que una interacción social reducida y un comportamiento alterado en la prueba de suspensión por la cola reflejan síntomas de trastornos mentales, los inventores evaluaron la inhibición por impulso previo (PPI) en estos animales. La PPI está altamente conservada entre vertebrados, es indicativa de una función mental alterada y es uno de los pocos paradigmas en los que seres humanos y roedores se someten a prueba de maneras similares (Davis, 1984).

Basándose en esto, los inventores estudiaron la PPI de la respuesta de sobresalto en ratones PRG-1+/_ (het.) y silvestres (wt), encontrando que los animales PRG-1+/_ mostraron una disminución significativa de PPI en comparación con crías wt (figura 5C). Para someter a prueba si el tratamiento farmacológico puede revertir estas anomalías del comportamiento indicativas de trastornos mentales, los inventores sometieron a prueba un inhibidor in vivo de la enzima de síntesis de LPA, la autotaxina, (PF8380) que tiene una potencia nanomolar y puede aplicarse por vía oral o mediante inyección en la periferia (Gierse et al., 2010). La inyección intraperitoneal de PF8380 puede disminuir significativamente los niveles de LPA tal como se muestra a modo de ejemplo en el líquido cefalorraquídeo de ratones con deficiencia en PRG-1 (figura 16G). De manera interesante, el tratamiento con PF8380 restauró eficazmente el déficit de PPI observado en ratones PRG-1+/_ con movimiento libre hasta niveles silvestres (figura 5C).

La intervención farmacológica rescata el endofenotipo de trastornos psiquiátricos en un modelo animal inducido por una variante de PRG-1 humana (inserción de PRG-1R346T)

Con el fin de investigar si, de hecho, la mutación humana descrita da como resultado un endofenotipo para trastornos psiquiátricos, los inventores produjeron una línea de ratón con inserción en la que se introdujo el gen mutado PRG-1R346T en lugar del gen silvestre PRG-1. Dado que sólo se detectaron portadores de mutación PRG-1R346T monoalélicos, se usaron animales PRG-1R346T+/' para el estudio, lo cual corresponde a la situación in vivo humana. Tal como se muestra en la figura 6, los portadores monoalélicos de esta mutación humana presentaron una PPI significativamente alterada, que es, tal como se describió anteriormente, un endofenotipo para trastornos psiquiátricos. Sin embargo, la aplicación del inhibidor de autotaxina, PF8380, rescató redujo la PPI en animales P^rG-1R346T+/- hasta niveles WT.

PRG-1R345T: un SNP humano asociado con un endofenotipo para trastornos del sistema nervioso central

El análisis de la expresión de PRG-1 en la corteza humana reveló fuertes señales de PRG-1 neuronales y una clara expresión en neuronas de la capa IV (figura 7A). Usando marcadores específicos tales como GAD67, parvalbúmina y calretinina, los inventores encontraron expresión de PRG-1 específica en neuronas glutamatérgicas pero no en interneuronas. Un análisis subcelular adicional reveló la ubicación conjunta dendrítica de PRG-1 con el marcador de densidad postsináptico PSD95 (figura 7B), confirmando la expresión postsináptica de PRG-1 específica en sinapsis glutamatérgicas de neuronas excitadoras tal como se describe en el cerebro de roedores (Trimbuch et al., 2009). Para demostrar la relevancia de PRG-1 y su SNP de pérdida de función en seres humanos, los inventores analizaron una muestra bien caracterizada de 1811 sujetos alemanes adultos sanos (Brinkmeyer et al., 2011; Lindenberg et al., 2011; Quednow et al., 2012) en los que los inventores detectaron la variante PRG-1R345T (mutPRG-1) a una frecuencia heterocigótica del 0,66 % (12 portadores). El análisis de EEG de los portadores de PRG-1+/mut reveló alteraciones del potencial relacionado con acontecimientos P50 (ERP) provocado por un paradigma de doble chasquido auditivo (estímulo 1 = S1, estímulo 2 = S2), una medición del procesamiento de estímulos preatencional / regulación sensorial y un endofenotipo para trastornos mentales (Javitt et al., 2008; Turetsky et al., 2007). Los portadores de PRG-1+/mut mostraron amplitudes de P50 más grandes en respuesta al segundo estímulo (S2), un hallazgo que apunta a un desequilibrio de excitación-inhibición y una “regulación de salida” deficiente de información redundante (Chang et al., 2011) (figura 7C). Tanto la reducción de S1 como el aumento/la supresión disminuida de S2 pueden contribuir a anomalías de regulación sensorial en trastornos mentales, pero se ha considerado que reflejan procesos distintos/parcialmente solapantes con una arquitectura genética no idéntica (Chang et al., 2011; Javitt et al., 2008). Dado que PRG-1 se expresa en neuronas excitadoras humanas en la corteza somatosensorial (figura 7A, B) y los ratones con deficiencia en PRG-1 (PRG-1'/_) presentan hiperexcitabilidad del hipocampo (Trimbuch et al., 2009), el fenotipo electrofisiológico de portadores de PRG-1+/mut humano sugirió una alteración funcional de mutPRG-1. Esto conduce aparentemente a una liberación de glutamato sináptica aumentada en neuronas excitadoras, induciendo por tanto un desplazamiento en el equilibrio E/I hacia la excitación (Yizhar et al., 2011) y una función alterada de redes corticales tal como se observa en la fisiopatología de trastornos mentales (Belforte et al., 2010; Coyle, 2006; Javitt et al., 2011).

La inhibición de ATX restaura las consecuencias electrofisiológicas y del comportamiento de la hiperexcitabilidad cortical en un modelo animal para esquizofrenia inducida por aplicación de ketamina

A continuación, los inventores analizaron si la inhibición de ATX puede revertir la hiperexcitabilidad cortical en un modelo animal clásico para esquizofrenia inducida por aplicación de ketamina (Schobel SA et al. 2013; Frohlich J y JD Van Horn 2014), que no se basa en una señalización de fosfolípidos sináptica alterada sino que se basa en la hiperexcitabilidad neuronal debida a un aumento del impulso glutamatérgico. Este objetivo era aclarar si la inhibición de ATX puede revertir la hiperexcitabilidad cortical y un equilibrio E/I alterado independientemente de la causa subyacente. Tal como se describió anteriormente (Nosyreva E et al. 2013), la aplicación de ketamina inhibe la neurotransmisión espontánea e induce posteriormente una potenciación de respuestas sinápticas a lo largo del tiempo (figura 8A). Por tanto, los inventores inhibieron ATX usando HA130 10 |iM, un inhibidor de ATX que actúa más rápido que PF8380 (Albers et al., 2010), durante la fase de potenciación. De este modo, se encontró que la inhibición de ATX disminuyó significativamente la potenciación inducida por ketamina (figura 8A). Estos resultados se confirmaron mediante análisis de curvas de entrada-salida (figura 8B), lo que sugiere que ATX es una potente diana en la reducción de la excitabilidad en este modelo animal para esquizofrenia.

Con el fin de correlacionar estos efectos electrofisiológicos con el comportamiento en estos ratones, los inventores analizaron en primer lugar la PPI después de la aplicación de ketamina. De este modo, se encontraron niveles de PPI significativamente reducidos, que podían revertirse a niveles silvestres (WT) tras la inhibición de ATX (figura 9A). Además, la inhibición de ATX podía disminuir significativamente la hiperlocomoción inducida por ketamina (figura 9B), otro síntoma asociado con trastornos psiquiátricos y relacionado con la entrada glutamatérgica aumentada, en un entorno de campo abierto. En resumen, la inhibición de ATX tiene el potencial general de normalizar el equilibrio E/I en trastornos psiquiátricos asociados con una entrada glutamatérgica aumentada y abre una nueva vía terapéutica hacia el tratamiento de trastornos psiquiátricos.

La intervención farmacológica reduce el tamaño de infarto en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular (no forma parte de la presente invención)

La hiperexcitabilidad neuronal es una cuestión crítica en estados fisiopatológicos que está presente durante el accidente cerebrovascular isquémico. En este caso, la denominada penumbra, una región cerebral hipóxica que rodea al núcleo del infarto, contiene tejido cerebral viable que tiene posibilidad de rescatarse. Sin embargo, la hiperexcitabilidad neuronal mediada por hipoxia que conduce a flujo de entrada de calcio y posterior muerte celular pone drásticamente en peligro la supervivencia de tejido neuronal en la penumbra (Lo EH 2008). Hasta ahora, se necesitan de manera crítica medidas para reducir la hiperexcitabilidad neuronal y para inducir neuroprotección en la penumbra. Tal como puede observarse en la figura 10^a , el tamaño de infarto en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular ya se redujo significativamente después de 1 día así como después de 3 días mediante administración de PF8380. Con el fin de demostrar el efecto de la hiperexcitabilidad neuronal reducida, los inventores analizaron ratones PRG-1+/- que, tal como se describió anteriormente, tienen un equilibrio E/I alterado y muestran hiperexcitabilidad neuronal. En línea con resultados anteriores, el tratamiento con PF8380 redujo en gran medida el volumen de infarto en estos ratones (figura 10B). Los inventores han evaluado además las consecuencias de comportamiento del tratamiento con PF8380 en ratones PRG-1+/- a los 3 días tras el accidente cerebrovascular y encontraron una mejora significativa en los ratones tratados (figura 11A, B).

La intervención farmacológica reduce las corrientes postsinápticas en ratones mutantes para PRG-1

Las corrientes postsinápticas excitadoras de excitación alta (sPSC, mEPSC) son sintomáticas para trastornos del sistema nervioso central.

Tal como se muestra en las figuras 13, 14, 15 y 16, los inhibidores de autotaxina HA130 o PF8380 pueden reducir las corrientes postsinápticas excitadoras, lo cual es indicativo de la idoneidad de los inhibidores de autotaxina en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central. De manera interesante, las mEPSC de ratones silvestres no se vieron afectadas por esta intervención (figura 13A), sugiriendo que, cuando se administran a pacientes humanos, los inhibidores de autotaxina pueden no mostrar efectos secundarios adversos provocados por sobredosis.

La intervención farmacológica rescata de manera selectiva la señalización neuronal relacionada con hiperexcitación La evaluación de la coherencia de señalización de corteza-hipocampo y el aprendizaje espacial en ratones PRG-1'/_ muestra un impacto específico de PF8380 sobre cambios de coherencia relacionados con hiperexcitación (coherencia gamma media, figura 16b y f) y déficits del comportamiento (figura 18b y c), no sobre los cambios de coherencia y comportamientos derivados a partir de déficits estructurales en ratones con deficiencia en PRG-1 (figura 16a y c, 18a).

La intervención farmacológica rescató de manera selectiva la señalización neuronal relacionada con la hiperexcitación (coherencia gamma media, figura figura 16b y f), sin embargo, no afectó a alteraciones del desarrollo descritas en ratones con deficiencia en PRG-1 (figura 16a y c).

Tal como se muestra en las figuras 16g y 17g, el inhibidor de autotaxina PF 8380, que se aplica mediante inyección intraperitoneal, llega en concentraciones eficaces al líquido cefalorraquídeo y disminuye significativamente los subtipos de LPA más abundantes. Esta disminución de restos de LPA dio como resultado específicamente el rescate de la coherencia alterada de señalización de corteza-hipocampo y comportamientos relacionados con la hiperexcitación. Esto es un efecto selectivo, dado que la coherencia en las frecuencias y los comportamientos relacionados con cambios en el desarrollo (estructurales) en ratones con deficiencia en PRG-1 no cambian, mostrando una acción específica de la inhibición de autotaxina. En conjunto, esto supone un argumento para una acción terapéutica selectiva de la inhibición de autotaxina en trastornos del sistema nervioso central.

La inhibición de ATX suprime el comportamiento relacionado con obesidad

Las alteraciones metabólicas tales como el ayuno durante la noche inducen cambios en la composición de subtipos de LPA (Ino M et al. 2012). Esto se correlaciona con el aumento de la actividad de ATX tras la privación de alimentos durante la noche, la disponibilidad del sustrato de ATX, LPC, pero también con las preferencias de sustrato de ATX por LPC sin saturar. Con el fin de entender los efectos corticales de la composición de LPA alterada tras el ayuno, los inventores analizaron el consumo de alimentos tras la privación de alimentos durante la noche en animales de control y tratados con PF8380. Aunque en los animales de control el tratamiento con PF8380 no alteró el consumo de alimentos, en los animales sometidos a privación de alimentos PF8380 disminuyó significativamente la ingesta de alimentos (figura 19A). Sin embargo, la privación de alimentos durante la noche no se relacionó con hiperlocomoción dado que la distancia recorrida en un entorno de campo abierto no era diferente entre animales de control, sometidos a privación de alimentos durante la noche y sometidos a privación de alimentos durante la noche tratados con PF (figura 19B).

Métodos usados en los ejemplos experimentales

Ensayo de captación de LPA

Se incubaron células HEK293 y líneas de células HEK293 que expresaban PRG1 silvestre, PRG-1R346T (correspondiente a la mutación R345T humana), PRG1S346A y PRG1S346D con TF-LPA (Avanti Polar Lipids, EE.UU. (Saunders et al., 2011)) a 1 |iM durante 5 min a 37 °C. Tras retirar TF-LPA a partir de la superficie celular lavando las células (3 x 5 min) con SDS al 0,001 % en DMEM, se evaluaron las células mediante citometría de flujo (FACSCantoll, Becton Dickinson, EE.UU.) y se analizaron mediante el software Flowjo (Tree Star, EE.UU.). La captación de TF-LPA se calculó o bien como cambios de TF-LPA internalizado en comparación con células HEK293 no transfectadas o bien con células que expresan PRG-1. En otro conjunto de experimentos, se incubaron las células con lípido no natural C17-LPA (Avanti Polar Lipids, EE.UU.) en vez de TF-LPA. Posteriormente se evaluaron C17-LPA y su producto de degradación C17MG mediante espectrometría de masas. Se prepararon cultivos neuronales primarios y se transfectaron según procedimientos convencionales.

Estudios de fosforilación cuantitativos

Se adquirieron péptidos marcados isotópicamente (HeavyPeptide™ AQUA QuantPro) de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Se usaron los siguientes péptidos marcados con isótopos pesados para la evaluación de ocupación de sitio de fosforilación de PRG-1: SLT DLN QDP S[R(13C6; 15N4)], DAL RSL TDL NQD PS [R(13C6; 15N4)], DAL R [S(PO3H2)] LTD LNQ DPS [R(13C6; 15N4)], DAL T [S(PO3H2)] LTD LNQ DPS [R(13C6; 15N4)] y DAL TSL TDL NQD PS [R(13C6; 15N4)].

Estudios de glicosilación usando inmunoprecipitación conjunta e inmunotransferencia de tipo Western

Para estudios de glicosilación se realizó IP conjunta usando perlas de agarosa con proteína G y un anticuerpo anti-PRG-1 personalizado (Trimbuch et al., 2009) según procedimientos convencionales. Se realizó inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-O-GlcNAc (dilución 1:1000; CTD110.6, Cell Signaling, EE.UU.). Para la cuantificación, se separaron membranas y se evaluó la cantidad total de PRG-1 usando el anticuerpo anti-PRG-1 anteriormente descrito.

Intervención farmacológica

Se trataron los animales usando el potente inhibidor de autotaxina in vivo PF 8380 (Gierse et al., 2010). Los animales recibieron una única inyección i.p. 3 horas antes de la PPI. Se midió la concentración de PF8380 en el líquido cefalorraquídeo (CSF) mediante espectrometría de masas 3 horas después de la inyección, proporcionando una concentración de hasta 0,42 pmol/^l (con una CI50 de 0,1 pmol/^l) (Gierse et al., 2010).

Efecto del genotipo de PRG-1 sobre mediciones de potencial relacionado con acontecimientos P50 en seres humanos

Se investigaron los participantes en el estudio en el contexto del “German Multicenter Study on Nicotine Dependence” (estudio alemán multicéntrico sobre la dependencia de nicotina) (Lindenberg et al., 2011). Este estudio lo aprobaron los comités éticos de la universidad local de cada centro del estudio. Los sujetos estaban sanos según se evaluó mediante una exploración médica convencional, un control de drogas y pruebas de laboratorio clínico de rutina. No tenían ningún trastorno psiquiátrico actual según el eje I de DSM-IV tal como se evalúa mediante la entrevista psiquiátrica normalizada (SCID-1) y no estaban recibiendo ningún medicamento que afectara a la función del SNC. A lo largo de los centros del estudio, se llevó a cabo el estudio incluyendo registros de EEG según el mismo procedimiento normalizado de trabajo. En publicaciones anteriores se ha proporcionado una descripción detallada de la presentación de estímulos (paradigma de doble chasquido auditivo), registro de EEG y análisis de señales del potencial relacionado con acontecimientos P50 (ERP) (Brinkmeyer et al, 2011; Quednow et al, 2012). La medición de P50 más ampliamente usada es la razón de S2/S1 (Turetsky et al, 2007). Sin embargo, datos recientes sugieren que las amplitudes individuales de S1 y S2 así como la diferencia de S1-S2 pueden mostrar una heredabilidad superior (Anokhin et al, 2007) y una fiabilidad superior entre prueba y nueva prueba que la razón de S2/S1 (Fuerst et al, 2007). A la vista de esta falta de superioridad de una medición de P50 particular sobre las otras, se realizaron análisis estadísticos de los efectos del genotipo de prg-1 sobre mediciones de ERP de P50 con amplitudes de S1 y S2, diferencia de S1-S2 y razón de S2/S1.

Se realizó el genotipado mediante pirosecuenciación según las instrucciones del fabricante usando el kit de reactivo de SNP PSQ 96 (Qiagen, Hilden, Alemania) en un instrumento PSQ HS96A (Qiagen, Hilden, Alemania).

Análisis estadísticos

Estaban disponibles conjuntos de datos completos, incluyendo mediciones de ERP de P50 y genotipo de prg-1, a partir de seis centros del estudio para N = 1811 sujetos (N = 12 portadores monoalélicos de la variante prg-1 frente a N = 1799 controles wt/wt). No hubo ninguna desviación con respecto al equilibrio de Hardy-Weinberg (prueba exacta: p = 1,0). Las frecuencias de alelos mayoritario y minoritario (el 99,669 % y el 0,331 %, respectivamente) concordaban con las frecuencias anteriormente notificadas por el proyecto de secuenciación del exoma de NHLBI. Se proporcionan características de muestra sociodemográficas clave en la tabla complementaria S1 (Lehrl, 1999).

Para evitar factores de confusión tales como edad, tabaquismo y centro del estudio, sobre las mediciones de ERP de P50, se realizó un análisis estratificado de los efectos del genotipo de prg-1. Para cada medición de EEG, se determinaron tres estratos prediciendo para cada individuo el valor esperado a partir de un modelo de regresión, incorporando la edad, tabaquismo y centro del estudio, y dividiendo a los individuos en estratos diferenciados, aproximadamente del mismo tamaño, basándose en la inspección visual de los histogramas de valores predichos. Este modelo para asignación de estrato usa principalmente información a partir de los controles wt/wt para controlar los factores de confusión. En un análisis de sensibilidad excluyendo a los portadores a partir del ajuste de modelo, los resultados no cambiaron. Posteriormente, se determinó la diferencia media normalizada entre portadores de prg-1 wt/wt y de R345T monoalélico en cada estrato y se agregó a lo largo de los estratos usando una ponderación de varianza inversa, tal como se usa habitualmente en el metanálisis de efectos fijos (Cooper, 1994). La suposición de distribución normal, requerida para obtener valores de p correspondientes a las diferencias agregadas, se comprobó mediante gráficos de Q-Q. Para el efecto combinado de S1 y S2, se obtuvo la diferencia media normalizada a partir de un modelo de efectos mixtos lineal que incorporó un efecto aleatorio por sujeto. Para todas las demás mediciones, se obtuvieron directamente diferencias medias normalizadas a partir de valores medios y deviaciones estándar, que se calcularon por separado para los portadores y los controles wt/wt, es decir el tamaño no uniforme de los dos grupos no sesga los resultados. De manera similar, los modelos de efectos mixtos lineales tampoco se ven afectados por los tamaños de grupo no uniformes. Estos análisis se realizaron en el entorno estadístico R (Team, 2011) usando el paquete “meta” (versión 2.1-0).

Inmunocitoquímica con tejido humano

Se obtuvieron muestras de la corteza somatosensorial de un cerebro humano a partir de una autopsia de rutina según las directrices del comité ético local. El sujeto falleció de causas no neurológicas. Se fijó el tejido mediante inmersión en PFA al 4 % a lo largo de 48 h y se sometió a congelación ultrarrápida en hielo seco. Se realizaron estudios de ubicación conjunta en secciones criogénicas usando un anticuerpo contra PRG-1 (se usó anticuerpo personalizado descrito y caracterizado por (Trimbuch et al, 2009) a una dilución de 1:500) y anticuerpos contra GAD67 (1:500), MAP2 (1:1000; Chemicon, Temecula, EE.UU.), parvalbúmina y calretinina (1:500; Swant, Bellinzona, Suiza). Se tomaron imágenes confocales en un instrumento Leica SP5.

Accidente cerebrovascular

Para experimentos de accidente cerebrovascular, se anestesiaron los ratones y se realizó la oclusión de la arteria cerebral medial (MCAO) durante 30 min (evaluación después de 3 días) o durante 1 h (evaluación después de 1 día) mediante introducción de un filamento intraluminal tal como se notificó (Ploen et al., 2014). El grupo tratado recibió PF8380 (30 mg/kg de peso corporal) mientras que el grupo de control recibió vehículo (DMSO) mediante aplicación i.p. 3 horas antes de la MCAO. Después de 1 h o después de 30 min de MCAO, respectivamente, se recuperaron los ratones y se sometieron a perfusión 24 horas (MCAO de 1 h) o 72 horas (MCAO de 30 min) después. Se extrajeron los cerebros, se sometieron a congelación ultrarrápida y se cortaron secciones criogénicas usando un criotomo. Se sometieron las secciones de cerebro montadas a tinción de Nissl que permitió medir el área de infarto y calcular el volumen de infarto total por animal. Todas las mediciones se realizaron con enmascaramiento. Se evaluaron los datos para determinar la normalidad y se realizó el análisis estadístico usando una prueba de la t unilateral.

Análisis estadístico

Se realizaron análisis estadísticos de datos (incluyendo pruebas para determinar la normalidad) con GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, EE.UU.) o con SPSS (Chicago, IL, Ee .UU.). Los datos se presentan como valores medios ± e.e.m. La significación se representa como: * p<0,05, ** p<0,001, *** p<0,001.

Cromatografía de líquidos - separación por movilidad iónica - espectrometría de masas (CL-IMS-EM)

Se realizó una separación mediante UPLC a escala nanométrica con un sistema de UPLC nanoAcquity (Waters Corporation) equipado con una columna analítica PepSwift Monolithic PS-DVB, 200 |im x 5 cm (Thermo Scientific Dionex). Para el análisis, se inyectaron directamente las muestras (300 nl) en la columna analítica. La fase móvil A era agua que contenía ácido fórmico al 0,1 % v/v, mientras que la fase móvil B era ACN que contenía ácido fórmico al 0,1 % v/v. Se separaron las muestras a 55 °C con un gradiente del 1-35 % de fase móvil B a lo largo de 20 min a una velocidad de flujo de 800 nl/min. Se aclaró la columna durante 7 min con el 99 % de fase móvil B, seguido por una etapa de nuevo equilibrado a las condiciones iniciales dando como resultado tiempos de análisis totales de 40 min.

Se realizó un análisis de espectrometría de masas de PF-8380 en ESI en modo positivo usando un espectrómetro de masas Synapt G2-S HDMS (Waters Corporation). Se analizaron las muestras usando un método de EM dirigido aislando el precursor con carga individual de PF-8380. Para la fragmentación de PF-8380, se estableció la energía de colisión a 28 eV. Se usó el ciclo de trabajo potenciado (EDC) para aumentar la sensibilidad a m/z 301. El tiempo de adquisición espectral era de 0,5 s con un retraso entre exploraciones de 0,05 s. Todas las muestras y referencias se analizaron en tres repeticiones técnicas.

Procesamiento de datos

Se analizaron manualmente los datos sin procesar usando el software Mass-Lynx V4.1 (Waters Corporation). Se usaron cromatogramas de iones extraídos de iones de fragmentos a m/z 301 para el análisis cuantitativo calculando el área bajo la curva. Pudieron estimarse las concentraciones de PF-8380 en suero y CSF usando una referencia de PF-8380 añadido en suero a concentraciones conocidas.

Evaluación de especies de LPA

Se realizó el análisis de LPA con cromatografía de líquidos - ionización por electropulverización - espectrometría de masas en tándem (CL-ESI-EM/EM). El sistema de c L-EM/EM consistía en un espectrómetro de masas QTrap 5500 de trampa iónica de cuadrupolo triple híbrido (AB Sciex, Alemania) equipado con una fuente Turbo-V que funcionaba en modo de ESI negativo, una bomba de HPLC binaria Agilent 1200, horno de columna (40 °C) y desgasificador y un inyector automático HTC Pal.

Se realizaron dos ciclos de extracción de lípido-lípido de LPA con 1-butanol después de añadir el patrón interno LPA17:0 a la muestra (50 |il de muestra, 20 |il de patrón interno en 500 |il de 1-butanol). Se secaron las fases orgánicas combinadas bajo una corriente suave de nitrógeno a 45 °C y posteriormente volvieron a disolverse en 200 |il de metanol.

Para la separación cromatográfica se usaron una columna C18 (Mercury 20 x 2 mm, 3 |im, 100 A) y precolumna (Phenomenex, Alemania). Se empleó un gradiente lineal a 400 |il/min. La fase móvil A era agua con formiato de amonio 50 mM y ácido fórmico (100:0,2, v/v) y la fase móvil B acetonitrilo/ácido fórmico (100:0,1, v/v), tiempo de ejecución total de 7 min, volumen de inyección de 20 |il. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en el modo de ionización negativo con una tensión de electropulverización de -4500 V a 350 °C. Se usó monitorización de múltiples reacciones (MRM) para la cuantificación. Las transiciones de masas eran m/z 409^79 (LPA 16:0), m/z 437^-153 (LPA 18:0), m/z 431^79 (LPA 18:3) y m/z 457^-153 (LPA 20:4), todas con un tiempo de permanencia de 50 ms. Todos los cuadrupolos funcionaban a una resolución unitaria. Se realizó la cuantificación con el software Analyst V1.5 (Applied Biosystems) usando el método del patrón interno con ponderación de 1/concentración2 La curva de calibración era lineal a lo largo del intervalo de 0,1-500 ng/ml y la precisión era de >95 %.

Evaluación del comportamiento en laberinto radial de ocho ramas y en laberinto acuático de Morris (MWM)

El laberinto radial (RM) consistió en una plataforma central de 22 cm de diámetro y ocho ramas iguales (25x6x6 cm, LxBxH) tal como se describe. Antes del entrenamiento, se sometieron los ratones a privación de alimentos hasta el 85-90 % del peso de alimentos antes de la habituación. Dos días antes del entrenamiento, se habituaron los ratones en el laberinto durante 10 min/día y se entrenaron con un ensayo al día en cinco días consecutivos. Entre los días las ramas se aleatoriamente. Se sometieron a prueba los ratones en un orden aleatorio. Se colocaron los ratones en la plataforma central en una orientación aleatoria y debían recoger las ocho recompensas. Los ratones que visitaban las ramas sin recoger la recompensa y los ratones que visitaban las ramas ya visitadas anteriormente se registraron como errores de memoria de trabajo (WME). Otro parámetro para el aprendizaje espacial era el número de nuevas entradas en ramas durante las ocho primeras ramas visitadas. Se terminó un ensayo cuando se recogieron todas las recompensas o después de 10 min.

Para MWM se registraron la latencia de escape, velocidad de nado, longitud de trayecto y trayectoria de nado para cada ratón. En primer lugar, se entrenaron los ratones durante 5 días en una tarea de “plataforma visible”, después durante 6 días en una tarea de “plataforma oculta” (entrenamiento espacial), seguido por un “ensayo de prueba”, que se repitió 4 veces. Los ratones recibieron diariamente 4 ensayos durante un máximo de 90 s con un intervalo ente ensayos de 5 min. Se midieron la velocidad de nado (media y máx.) y el tiempo de inmovilidad (tiempo empleado sin buscar).

Evaluación electrofisiológica de animales que se comportan con movimiento libre

Se realizaron mediciones electrofisiológicas en animales con movimiento libre tal como se describe (O'Neill PK et al.

2013). En resumen, se mantuvieron los animales durante las intervenciones quirúrgicas con anestesia con isoflurano y se implantaron de manera crónica electrodos (WE3PT10.5F3, MicroProbes, Gaithersburg, MD, EE.UU.) en la corteza entorrinal medial (MEC; 3,1 mm, de lateral a la línea media, 0,2 mm anterior con respecto al seno transversal formando un ángulo de 6° en el sentido anterior-posterior en el plano sagital) y en la región CA1 del hipocampo (1,5 mm de lateral a la línea media, 1,5 mm anterior-posterior y 1,2 mm dorsal-ventral formando un ángulo de 0°). Se conectaron los electrodos a una placa de interconexión de electrodos (EIB-16; Neuralynx, EE.UU.) y se fijaron al cráneo usando tornillos de relojero y cemento dental. Se adquirieron datos neuronales usando un montaje de cabeza de 16 canales y un sistema de adquisición de datos Digital Lynx (Neuralynx, EE.UU.). Se monitorizó la posición del animal usando dos diodos de emisión de luz montados en el montaje de cabeza. Para extraer potenciales de campo local, se sometieron las señales neuronales a filtrado de paso de banda entre 1 y 1000 Hz y se digitalizaron a 2 kHz. Se realizaron registros independientes, cada uno de los cuales duró 10 minutos, mientras los animales se movían libremente en su jaula en un campo abierto (0,5 m x 0,5 m x 0,5 m) y en un laberinto en forma de cruz con una longitud de 0,4 m por rama. Se repitieron los registros durante dos días. Se realizó el análisis de datos neuronales y de comportamiento usando secuencias de comandos de MATLAB escritas de manera personalizada (MathWorks). Se verificó la ubicación de registro mediante la aplicación de corriente al final del experimento, tras lo cual se sometieron los animales a perfusión y se cortaron los cerebros con un vibratomo y se sometieron a tinción de Nissl usando violeta de cresilo.

Análisis de potencial de campo

Se calculó la coherencia de actividad neuronal entre la MEC y en la CA1 usando el método de múltiples conos (rutinas de MATLAB proporcionadas por K. Harris, University College London, Londres, R.U., y G. Buzsáki, New York University, Nueva York, NY, e E.UU.). Se dividieron los potenciales de campo en segmentos de 500 ms (solapamiento de 50 ms) y se calculó la transformada de Fourier de cada segmento tras multiplicarse por dos conos de datos ortogonales. Después se calculó la coherencia calculando el promedio de las densidades espectrales cruzadas de dos señales de potencial de campo a través de ventanas de datos y conos y normalizando con respecto a las densidades espectrales de potencia de cada señal. Para medir la potencia oscilatoria, se usó la transformada de ondículas. Se sometieron las señales de LFP a convolución con una serie de ondículas de Morlet con frecuencias centrales que oscilaban entre 1 y 100 Hz y una longitud de tres ciclos. Se calculó la potencia tomando el valor absoluto de la transformada de ondículas y se calculó el promedio a lo largo del tiempo para obtener el espectro de potencia. Para el análisis estadístico, se calculó el promedio de la coherencia y la potencia dentro de los intervalos de frecuencia theta (7-12 Hz) y gamma (30-70 Hz).

Bibliografía y notas

Albers HM et al., (2010) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 7257-7262

Anokhin AP et al., (2007) Schizophrenia research 89: 312-319

Belforte JE et al., (2010) Nature neuroscience 13: 76-83

Braff et al., (2001) Psychopharmacology 156: 234-58

Brinkmeyer J et al, (2011) Addict Biol 16: 485-498

Chang WP et al., (2011) Psychophysiology 48: 980-992

Chen J, Sanberg PR, Li Y, Wang L, Lu M, Willing AE, Sanchez-Ramos J, Chopp M. 2001. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation 32:2682-2688.

Cryan JF et al., (2005) Neuroscience and biobehavioral reviews 29: 571-625

Davis M (ed) (1984) The mammalian startle response. New York, NY: Plenum Press Frohlich J, Van Horn JD. 2014. Reviewing the ketamine model for schizophrenia. Journal of psychopharmacology 28:287-302.

Fuerst DR et al., (2007) Psychophysiology 44: 620-626

Gierse J et al., (2010) The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 334: 310-317

Goswami T et al., (2012) Proteomics 12: 2185-2189

Harrison PJ, Weinberger DR (2005) Molecular psychiatry 10: 40-68; imagen 5

Huttlin EL et al, (2010) Cell 143: 1174-1189

Ino M, Shimizu Y, Tanaka T, Tokumura A. 2012. Alterations of plasma levels of lysophosphatidic acid in response to fasting of rats. Biological & pharmaceutical bulletin 35:2059-2063.

Inta D et al., (2010) Neuroscience and biobehavioral reviews 34: 285-294

Javitt DC et al., (2008) Nat Rev Drug Discov 7: 68-83

Lindenberg A et al, (2011) Addict Biol 16: 638-653

Lo EH. 2008. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nature medicine 14:497-500.

Moolenaar WH, Perrakis A (2011) Nature reviews Molecular cell biology 12: 674-679

Munton RP et al., (2007) Molecular & cellular proteomics: MCP 6: 283-293

Nosyreva E, Szabla K, Autry AE, Ryazanov AG, Monteggia LM, Kavalali ET. 2013. Acute suppression of spontaneous neurotransmission drives synaptic potentiation. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 33:6990-7002.

Pearson RB, Kemp BE (1991) Methods in enzymology 200: 62-81

Ploen R et al., (2014) Journal of cerebral blood flow and metabolismo official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 34:495-501.

O'Neill PK, Gordon JA, Sigurdsson T. 2013. Theta oscillations in the medial prefrontal cortex are modulated by spatial working memory and synchronize with the hippocampus through its ventral subregion. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 33:14211-14224.

Quednow BB et al., (2012) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109: 62716276

Radyushkin K et al., (2009) Genes, brain, and behavior 8: 416-425

Rexach JE et al., (2008) Nature chemical biology 4: 97-106

Saunders LP et al., (2011) The Journal of biological chemistry 286: 30130-30141

Schobel SA, Chaudhury NH, Khan UA, Paniagua B, Styner MA, Asllani I, Inbar BP, Corcoran CM, Lieberman JA, Moore H, Small SA. 2013. Imaging patients with psychosis and a mouse model establishes a spreading pattern of hippocampal dysfunction and implicates glutamate as a driver. Neuron 78:81-93.

Zhang L, Schallert T, Zhang ZG, Jiang Q, Arniego P, Li Q, Lu M, Chopp M. 2002. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of neuroscience methods 117:207-214. Shen S et al., (2008) The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 28: 10893­ 10904

Swerdlow NR et al., (1994) Arch Gen Psychiatry 51: 139-154

Tarrant MK et al., (2012) Nature chemical biology 8: 262-269

Trimbuch T et al, (2009) Cell 138: 1222-1235

Trinidad JC et al., (2008) Molecular & cellular proteomics: MCP 7: 684-696

Turetsky BI et al., (2007) Schizophrenia bulletin 33: 69-94

van Winkel R et al., (2008) Schizophrenia bulletin 34: 1095-1105

Wisniewski JR et al., (2010) Journal of proteome research 9: 3280-3289

Yizhar O et al, (2011) Nature 477: 171-178

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de autotaxina (AT) para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno psiquiátrico de un sujeto.

2. El inhibidor para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor reduce el nivel de ácido lisofosfatídico (LPA) en el cerebro de dicho sujeto.

3. El inhibidor para el uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el trastorno psiquiátrico se selecciona del grupo que consiste en esquizofrenia, depresión, trastornos de ansiedad, propensión a estrés y trastornos relacionados con el estrés, trastornos de pánico, trastorno bipolar, trastornos de la conducta alimentaria y ADHD.

4. El inhibidor para el uso según la reivindicación 3, en el que el trastorno de la conducta alimentaria es trastorno de la conducta alimentaria compulsiva.

5. El inhibidor para el uso según la reivindicación 3, en el que el trastorno psiquiátrico es obesidad o un trastorno de la conducta alimentaria que conduce a obesidad.

6. El inhibidor para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho sujeto tiene una deficiencia en PRG-1.

7. El inhibidor para el uso según la reivindicación 6, en el que dicha deficiencia en PRG-1 se debe a la mutación R345T en PRG-1.

8. El inhibidor para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el inhibidor de autotaxina es éster (3,5-diclorofenil)metílico del ácido 4-[3-(2,3-dihidro-2-oxo-6-benzoxazolil)-3-oxopropil]-1-piperazincarboxílico (PF8380) o ácido (Z)-3-((4-((3-(4-fluorobencil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolan-5-iliden)-metil)fenoxi)metil)bencenoborónico (HA130).