CN113186281B - 作为肝细胞癌标志物的inava - Google Patents
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Abstract
本发明意外地发现INAVA表达产物在肝细胞癌和正常肝组织中差异表达,其中在肝细胞癌中上调表达,并且还发现通过减少体内INAVA表达产物水平,能够显著抑制肝细胞癌成瘤,因此,INAVA可作为肝细胞癌有效的诊断和治疗标志物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及作为肝细胞癌标志物的INAVA。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌。也是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤发病率第六位,尤其好发于亚洲、非洲和南部欧洲。根据世界卫生组织估计,2030年将有超过100万患者死于HCC。目前治疗方法包括手术切除、局部射频、化疗、分子靶向治疗、免疫治疗、介入和肝移植等,但HCC患者的5年生存率仍仅18%,致死性仅次于胰腺癌。因此,寻找新的HCC诊疗策略,以改善患者生存期和生存质量。
先天性免疫激活因子(又称INAVA,HGNC编号为25599)是一种蛋白质编码基因,位于1号染色体,目前研究发现,与INAVA相关的疾病包括炎症性肠病和克罗恩氏病,此前并未发现其与肝细胞癌的关系。为此,提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供确定INAVA表达产物水平的试剂在制备用于检测受试者中肝细胞癌存在的工具中的应用。
本发明的目的之二在于提供减少体内INAVA表达产物水平的制剂在制备肝细胞癌药物中的应用。
为此,本发明提供以下实施方案中的一种或多种:
在一种或多种实施方案中,确定INAVA表达产物水平的试剂在制备用于检测受试者中肝细胞癌存在的工具中的应用。
在一种或多种实施方案中,受试者中INAVA表达产物水平升高指示肝细胞癌存在。
在一种或多种实施方案中,INAVA表达产物包括INAVA mRNA或蛋白。
在一种或多种实施方案中,所述试剂包括特异性结合INAVA核酸或其片段的物质;或;特异性结合INAVA蛋白或其片段的物质。
在一种或多种实施方案中,所述物质包括引物、探针、抗体、核酸适配体。
在一种或多种实施方案中,减少INAVA表达产物水平或抑制INAVA表达产物发挥作用的制剂在制备肝细胞癌药物中的应用。
在一种或多种实施方案中,INAVA表达产物包括INAVA mRNA或蛋白。
在一种或多种实施方案中,所述制剂包括INAVA的干扰RNA、反义寡核苷酸或CRISPRi。
在一种或多种实施方案中,所述制剂包括特异性结合INAVA的抗体或核酸适配体。
在一种或多种实施方案中,所述药物抑制肝细胞癌体内成瘤。
本发明的有益效果包括:
本发明意外地发现INAVA表达产物在肝细胞癌和正常肝组织中差异表达,其中在肝细胞癌中上调表达,并且还发现通过减少体内INAVA表达产物水平,能够显著抑制肝细胞癌成瘤,因此,INAVA可作为肝细胞癌有效的诊断和治疗标志物。
附图说明
图1:肝细胞癌组织和正常肝细胞组织中INAVA mRNA水平;图中Normal表示正常肝细胞组织,Tumor表示肝细胞癌组织;
图2:4对配对肝细胞癌组织及癌旁正常组织中INAVA蛋白水平;图中A为癌旁正常组织;T为肝细胞癌组织,P1-P4为配对样本编号;
图3:97H细胞和HepG2细胞中构建沉默INAVA模型的mRNA表达情况;
图4:97H细胞和HepG2细胞中构建沉默INAVA模型的蛋白表达情况;
图5:接种沉默INAVA的HepG2细胞对裸鼠皮下成瘤的影响;
图6:接种沉默INAVA的HepG2细胞对裸鼠皮下成瘤的体积的影响;
图7:接种沉默INAVA的HepG2细胞对裸鼠皮下成瘤的重量的影响;
以上图中Vector为含有对照质粒的细胞或动物模型,sh-INAVA-1#和sh-INAVA-2#为含有2种沉默INAVA的质粒的细胞或动物模型。
具体实施方案
下文将详细地提供本发明的实施方案,其一种或多种实施方案描述于下文。提供每一种实施方案仅作为解释,而非限制本发明。本领域技术人员在不背离本发明的范围或精神下,可以显而易见地对本发明进行多种修改和变化。例如,作为一个实施方案的部分特征或说明可以用于另一个实施方案中,来产生更进一步的实施方案。
提供以下实施方案中的一种或多种:
在一种或多种实施方案中,确定INAVA表达产物水平的试剂在制备用于检测受试者中肝细胞癌存在的工具中的应用。“确定”按其常规定义或指采取定性或定量的方式,获知INAVA表达产物水平。“受试者”按其常规定义或指接受INAVA表达产物检测的个体。“工具”按其常规定义或指诊断领域常用的试剂盒、试剂卡、试纸条等诊断产品形态。
在一种或多种实施方案中,确定受试者中INAVA表达产物水平的方式,通过对受试者的离体样品进行测定。在一种或多种实施方案中,离体样品包括组织、细胞、体液、排泄物、分泌物等。在一种或多种实施方案中,离体样品例如是全血、血清、血浆、肝组织或循环肿瘤细胞、细胞外游离DNA等。
在一种或多种实施方案中,受试者中INAVA表达产物水平升高指示肝细胞癌存在。“升高”相对于非肝细胞癌群体(例如正常群体),具有显著统计学差异。在一种或多种实施方案中,根据非肝细胞癌群体(例如正常群体)和肝细胞癌群体的INAVA表达产物水平差异,设定阈值(cutoff),若高于所设阈值,则表明受试者患肝细胞癌,其中阈值的设定为本领域公知,依据大量样本进行统计学分析获得。在一种或多种实施方案中,相对于非肝细胞癌群体(例如正常群体),肝细胞癌患者中INAVA表达产物水平升高至少5%、10%、20%、30%、50%、80%、100%、200%等。
在一种或多种实施方案中,INAVA表达产物包括INAVA mRNA或INAVA蛋白。在一种或多种实施方案中,所述试剂包括特异性结合INAVA核酸或其片段的物质;或;特异性结合INAVA蛋白或其片段的物质。为了确定INAVA mRNA水平,通常可以采用荧光定量PCR的方法,Northern印迹杂交的方法、原位杂交的方法。在一种或多种实施方案中,将mRNA逆转录为cDNA,通过特异性结合INAVA核酸特征片段的引物或探针,确定INAVA mRNA水平。为了确定INAVA蛋白水平,通常可以采用免疫组织化学、酶联免疫吸附、化学发光、免疫比浊、免疫层析、电化学等方法进行检测。在一种或多种实施方案中,利用特异性结合INAVA的抗体进行免疫组化检测,确定INAVA蛋白水平。在一种或多种实施方案中,所述物质包括引物、探针、抗体、核酸适配体。其中,核酸适配体是一种能够与蛋白或肽特异性结合的核酸分子。
在一种或多种实施方案中,减少INAVA表达产物水平或抑制INAVA表达产物发挥作用的制剂在制备肝细胞癌药物中的应用。“药物”按其常规定义或指能够对改善或预防疾病有至少一种有益功效的物质;例如预防疾病的发生、减缓疾病的发展、改善疾病状态、治愈疾病等方面。在一种或多种实施方案中,所述药物抑制肝细胞癌体内成瘤。
在一种或多种实施方案中,INAVA表达产物包括INAVA mRNA或INAVA蛋白。在一种或多种实施方案中,所述制剂包括INAVA的干扰RNA、反义寡核苷酸或CRISPRi。其中,干扰RNA(RNAi)按其常规定义或指能够特异性剔除或关闭特定基因的表达的试剂,包括如siRNA、shRNA,其在体内能够实现减少INAVA表达产物水平。反义寡核苷酸按其常规定义或指通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑制该基因表达,在基因水平调控的分子药物。CRISPRi是利用CRISPR技术从转录水平改变基因表达的试剂。在一种或多种实施方案中,所述制剂包括特异性结合INAVA的抗体或核酸适配体。抗体或核酸适配体能够与INAVA蛋白结合,从而抑制INAVA蛋白发挥作用。本发明所述的抗体包括完整抗体片段、抗体发挥功能的核心区域。
下文实施方案中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规操作,如文献、书籍报道的条件或试剂厂家推荐的条件实现。
材料与方法
1、样本与细胞
临床样本来自广州医科大学附属第五医院,包括42例肝细胞癌组织和45例正常肝组织,所有样本均有对应的临床病理信息。肝癌细胞系(97H、Hep G2)来自ATCC。细胞用25cm2培养瓶培养,添加RPMI 1640培养基(Invitrogen,USA)5mL,额外加入终浓度为10%的胎牛血清,200mg/ml青霉素,250mg/ml氯霉素,500mg/ml谷胺酰胺。培养条件设定为二氧化碳浓度5%,温度为37℃。待细胞培养至80%密度时用于实验。
2、实验动物
实验动物采用BALB/c-nu裸鼠,周龄5~6周,体重18~20g。
3、RNA提取
采用Trizol提取法提取组织或细胞的RNA。取约100mg的待测组织/细胞,在液氮中用研钵碾碎,加入TRizol室温裂解10min,每1ml TRizol裂解液加入0.2ml氯仿,剧烈振摇30s,静置5min;随后12,000g离心15min(4℃),吸取上清至新离心管中,加入等体积的异丙醇,吹打均匀,静置10min,随后12,000g离心5min(4℃),用含75%乙醇的DEPC水溶洗涤RNA,沉淀3次,干燥后用DEPC水溶解,获得待测RNA。
4、RT-PCR
将待测RNA按PrimeScript RT reagent Kit说明书操作进行逆转录,按SYBRPremix Ex Taq II Kit说明书进行荧光实时定量PCR,INAVA的引物委托广州市锐博生物科技有限公司设计与合成,其中,设置GAPDH基因作为内参,所有样本至少设置3个副孔。目的基因相对表达量通过Schmittgen and Livak2-ΔΔCt公式计算得出。
5、蛋白提取
取约100mg的待测组织/细胞,碾碎,加入RIPA裂解液裂解30min,收集裂解液,随后12,000g离心15min(4℃),收集上清,获得待测蛋白,蛋白定量按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行。
6、Western blotting
将待测蛋白加入上样缓冲液,沸水浴10min后,冰浴5min。使用SDS PAGE蛋白电泳,电泳后使用PVDF膜电转90min。电转结束后,用5%脱脂奶粉封闭,TBST漂洗3遍,加入INAVA抗体4℃孵育过夜,TBST漂洗3遍,加入封闭液稀释的二抗,室温孵育lh,TBST漂洗3遍,加入ECL发光液,显影,拍照。其中,设置α-tubulin为对照。
7、构建沉默INAVA的细胞模型
委托广州市锐博生物科技有限公司设计并合成INAVA shRNA(1#和2#),参照Lipofectamine2000分别转染至97H细胞和Hep G2细胞中。
8、构建沉默INAVA的动物体内模型及检测成瘤情况
将裸鼠分为2组(每组5只),一组接种沉默INAVA的Hep G2细胞,另一组接种转染对照vector的Hep G2细胞。细胞培养至1×105个/μL时,注射至裸鼠背部的皮下组织中,培养28天后,肿瘤体积用游标卡尺测量,体积用(L×W2)/2计算,实验结束后,对裸鼠进行安乐死,取出肿瘤称重。
测试例1、INAVA在HCC中高表达
提取42例肝细胞癌组织(Tumor)和45例正常肝组织(Normal)标本的RNA,采用RT-PCR方法检测INAVA mRNA水平,结果如图1所示,与正常肝组织相比,肝细胞癌组织中INAVA的mRNA水平显著提高(P<0.01),具有统计学差异。
提取配对的4对(P1-P4)肝细胞癌组织(T)和癌旁正常肝组织(A)的蛋白,采用Western blotting方法检测INAVA蛋白水平,结果如图2所示,与正常肝组织相比,肝细胞癌组织中INAVA的蛋白水平显著提高。
测试例2、沉默INAVA的细胞模型
从肝癌细胞系中选出97H、Hep G2用于构建沉默INAVA的细胞模型,对构建的细胞模型采用RT-PCR和Western blotting进行INAVA的mRNA和蛋白水平检测。结果如图3和图4所示,与对照质粒(Vector)相比,INAVA shRNA(1#和2#)均能显著下调肝癌细胞中INAVA的mRNA和蛋白水平。
测试例3、沉默INAVA抑制体内成瘤
用沉默INAVA的Hep G2细胞系构建动物体内模型,将裸鼠分为2组(每组5只),一组接种沉默INAVA的Hep G2细胞,另一组接种转染对照vector的Hep G2细胞,观察沉默INAVA对裸鼠肿瘤生长和成瘤情况。结果如图5-7所示,沉默INAVA能够有效抑制体内成瘤,肿瘤体积和重量明显降低。
根据以上测试例,可以明确INAVA表达产物在肝细胞癌和正常肝组织中差异表达,其中在肝细胞癌中上调表达,并且还发现通过减少体内INAVA表达产物水平,能够显著抑制肝细胞癌成瘤,因此,INAVA可作为肝细胞癌有效的诊断和治疗标志物。故本发明提出的技术方案为:确定INAVA表达产物水平的试剂在制备用于检测受试者中肝细胞癌存在的工具中的应用,以及减少INAVA表达产物水平或抑制INAVA表达产物发挥作用的制剂在制备肝细胞癌药物中的应用。
Claims (2)
1.减少INAVA表达产物的水平的制剂在制备用于治疗肝细胞癌药物中的应用,所述制剂为靶向INAVA基因的干扰RNA。
2.根据权利要求1所述的应用,其中,所述INAVA表达产物包括INAVAmRNA或INAVA蛋白。
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