JP2022031958A - 分析方法及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
(分析方法)
実施形態の分析方法は、対象における前立腺がんの罹患の有無を判定するための方法である。
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(配列番号1)
を有するmiRNAである。以下、hsa-miR-92a-3pを「標的miRNA」とも称する。また、配列番号1の配列を「第1の配列」とも称する。
(S1-1)標的miRNA1の第1の配列2とハイブリダイズする第1プライマー部4及び第1LAMP認識配列を含む逆転写用プライマー3(以下、「RTプライマー」とも称する)の、第1プライマー部4を第1の配列2とハイブリダイズさせ、第1の配列2を逆転写し、第1aの配列5(標的miRNA1のcDNA)を含む逆転写産物6を得る逆転写工程、
(S1-2)逆転写産物6と標的miRNA1とを解離させる解離工程、
(S1-3)第1aの配列5とハイブリダイズする第2プライマー部8、及び第2LAMP認識配列を含む伸長用プライマー7(以下、「ELプライマー」とも称する)の第2プライマー部8を逆転写産物6の第1aの配列5とハイブリダイズさせ、ELプライマー7及び逆転写産物6を、互いを鋳型として伸長させて、第1aの配列5の相補配列9(即ち、第1の配列に対応するDNA配列)を含む伸長産物10を得る伸長工程、
(S1-4)伸長産物10をLAMP反応により増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
(S1-5)得られた増幅産物を検出する検出工程。
(1)第1LAMP認識配列はB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はB1c配列、F1配列及びF2配列を含む。(この場合、第1aの配列の相補配列9の少なくとも1部をLB配列とする。)
(2)第1LAMP認識配列はLBc配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はB1c配列、F1配列及びF2配列を含む。
(3)第1LAMP認識配列はダミー配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はB1c配列、F1配列及びF2配列を含む。
(4)第1LAMP認識配列はB1配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はF1配列、LFc配列及びF2配列を含む。
(5)第1LAMP認識配列はB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はF1配列、LFc配列及びF2配列を含む。
(6)第1LAMP認識配列はLBc配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はF1配列及びF2配列を含む。
(7)第1LAMP認識配列はB1配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はLFc配列及びF2配列を含む。
実施形態によれば、hsa-miR-92a-3pを含む、前立腺がん検出用マーカーが提供される。
実施形態によれば、前立腺がん検出用キットが提供される。
第2の実施形態において、図5の(a)に示すように、対象由来の試料中のhsa-miR-92a-3pを定量すること(定量工程(S11))を含む、対象における前立腺がんの罹患の有無の判定を補助するための分析方法も提供される。
(S11)対象由来の試料中のhsa-miR-92a-3pを定量する定量工程、及び
(S12)対象が前立腺がんに罹患している可能性に関する情報を得る情報取得工程。
第3の実施形態によれば、図6の(a)に示すように、対象由来の試料中のhsa-miR-92a-3pを定量すること(定量工程(S21))により、対象におけるがんの罹患の有無を判定する。
以下に、実施形態の分析方法又はキットを用いて行った実験について記載する。
健常者16検体、乳がん患者22検体、大腸がん患者6検体、胃がん患者6検体、肺がん患者3検体、卵巣がん患者6検体、膵臓がん患者6検体、胆管がん患者5検体、食道がん患者5検体、肝臓がん患者5検体、脳腫瘍患者5検体、膀胱がん患者5検体、前立腺がん患者5検体、肉腫患者5検体、子宮体がん患者5検体、子宮肉腫患者5検体から得られた血清を用意した。
健常者16検体、乳がん患者5検体、大腸がん患者5検体、胃がん患者5検体、肺がん患者3検体、卵巣がん患者5検体、膵臓がん患者5検体、胆管がん患者5検体、食道がん患者5検体、肝臓がん患者5検体、脳腫瘍患者5検体、膀胱がん患者5検体、前立腺がん患者5検体、肉腫患者2検体、子宮体がん患者2検体、子宮肉腫患者2検体からの血清を用意した。
4組のRTプライマー、ELプライマー、FIPプライマー、BIPプライマー及びLBプライマーを含むプライマーセットを合成した。これらを用いて、hsa-miR-92a-3pをより特異的に伸長及び増幅することができるプライマーの配列、及びの組み合わせを評価した。当該4組のプライマーセットを用いて例2と同じ条件で、配列番号1の合成RNAの0、103、104、105及び106コピー/μLを伸長し、LAMP増幅した。増幅はエンドポイント濁度測定装置(LT-16、ニッポンジーン製)を用いて行い、濁度の立ち上がり時間を計測した。ポジティブコントロールとして、各プライマーセットの配列に対応する伸長産物を人工合成したものを各々合成して用いた。
例2において作製した合成RNAによる検量線用伸長産物を、配列番号10のLB配列に代えて、表6に示す配列番号11のLB配列を用いて例2と同様の方法で増幅した。
その結果を図12に示す。配列番号11のLBプライマーを用いた場合も、濁度の立ち上がり時間のmiRNA濃度依存性が良好であり、miRNAのコピー数が0であるときの非特異的増幅が少なかった。したがって、配列番号11のLB配列も本LAMP増幅系において有効に用いることが可能であることが示された。
例2で使用したFIPプライマー及びBIPプライマー(各48μM)、LBプライマー(24μM)を含むプライマー溶液を調製した。シリコーン製流路パッキン(流路幅×高さ:1mm×1mm)にプライマー溶液100nLを、微量分注機を用いてスポットした。電極をパターニングしたDNAチップ基板(ガラス(0.8mm)/チタン(500nm)/金(2000nm))と該流路パッキンとをカセットに組み込み、チップを作製した。
Claims (13)
- 対象由来の試料中のhsa-miR-92a-3pの存在量を定量することと、
対照由来の試料中のhsa-miR-92a-3pの存在量を定量することと、
前記対象におけるhsa-miR-92a-3pの前記存在量が、同様に測定された対照におけるhsa-miR-92a-3pの前記存在量よりも多い場合、前記対象ががんに罹患していると判定することと
を含む、前記対象におけるがんの罹患の有無の判定を補助する分析方法であって、
前記対照は少なくともがんに罹患していない個体であり、
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫である、分析方法。 - 対象由来の試料中のhsa-miR-92a-3pを定量することと、
前記対象におけるhsa-miR-92a-3pの存在量が閾値以上である場合に、前記対象ががんに罹患していると判定することと
を含む、前記対象におけるがんの罹患の有無の判定を補助する分析方法であって、
前記閾値は、がんに罹患した個体由来の試料中のhsa-miR-92a-3p、及び、少なくともがんに罹患していない個体由来の試料中のhsa-miR-92a-3pの定量値を測定し、比較することで予め決定された値であり
前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん又は子宮肉腫である、分析方法。 - 前記がんの罹患の有無の判定は、前記対象におけるがんの予後判定、又は前記対象におけるがんの再発の有無の判定を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記試料は、血清である、請求項1~3の何れか1項に記載の方法。
- 前記定量は、hsa-miR-92a-3pを増幅するためのプライマーセット、hsa-miR-92a-3pを逆転写するための逆転写用プライマー、hsa-miR-92a-3pを伸長するための伸長用プライマー、及びhsa-miR-92a-3pを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも1種の核酸を用いて行われる、請求項1~4の何れか1項に記載の方法。
- 前記定量は、hsa-miR-92a-3pを逆転写するための逆転写用プライマーと、前記逆転写用プライマーにより逆転写された塩基配列を増幅する増幅用プライマーセットとを用いて得られる核酸を検出して行われる、請求項1~4の何れか1項に記載の方法。
- 前記定量は、hsa-miR-92a-3pを逆転写するための逆転写用プライマーと、前記逆転写用プライマーにより逆転写された塩基配列を伸長するための伸長用プライマーと、伸長用プライマーにより伸長された塩基配列を増幅する増幅用プライマーセット(以下、「第1プライマーセット」と称する)とを用いて得られる核酸を検出して行われる、請求項1~4の何れか1項に記載の方法。
- 前記第1プライマーセットは、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号11のLBプライマーを含むか、
配列番号12のFIPプライマー、配列番号13のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、又は
配列番号14のFIPプライマー、配列番号15のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号2を含み、前記伸長用プライマーが配列番号3を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号4を含み、前記伸長用プライマーが配列番号5を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号6を含み、前記伸長用プライマーが配列番号7を含む、
請求項7に記載の方法。 - 乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん又は子宮肉腫を検出するためのマーカーであるhsa-miR-92a-3pとハイブリダイズする核酸を含む、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん又は子宮肉腫を検出するためのキット。
- 前記核酸は、hsa-miR-92a-3pを増幅するためのプライマーセット、hsa-miR-92a-3pを逆転写するための逆転写用プライマー、hsa-miR-92a-3pを伸長するための伸長用プライマー、及びhsa-miR-92a-3pを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも1種の核酸である、請求項9に記載のキット。
- 前記キットは、前記マーカーであるhsa-miR-92a-3pを逆転写するための逆転写用プライマーと、前記逆転写用プライマーにより逆転写された塩基配列を増幅する増幅用プライマーセットとを具備し、
前記マーカーであるhsa-miR-92a-3pとハイブリダイズする核酸は、前記逆転写用プライマーである、請求項9に記載のキット。 - 前記キットは、前記マーカーであるhsa-miR-92a-3pを逆転写するための逆転写用プライマーと、前記逆転写用プライマーにより逆転写された塩基配列を伸長するための伸長用プライマーと、伸長用プライマーにより伸長された塩基配列を増幅する増幅用プライマーセット(以下、「第1プライマーセット」と称する)とを具備し、
前記マーカーであるhsa-miR-92a-3pとハイブリダイズする核酸は、前記逆転写用プライマーである、請求項9に記載のキット。 - 前記第1プライマーセットは、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号11のLBプライマーを含むか、
配列番号12のFIPプライマー、配列番号13のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、又は
配列番号14のFIPプライマー、配列番号15のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号2を含み、前記伸長用プライマーが配列番号3を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号4を含み、前記伸長用プライマーが配列番号5を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号6を含み、前記伸長用プライマーが配列番号7を含む、
請求項12に記載のキット。
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