KR101337064B1 - 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 Ｏ-ＧｌｃＮＡｃ 펩타이드의 분리 및 동정 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질의 O-GlcNAcylation에 대한 정보를 내포하는 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 펩타이드의 세린 또는 트레오닌 잔기에 결합되어 있는 인산기 또는 O-GlcNAc의 화학적 변형 없이 쉽고 빠르게 O-GlcNAc 펩타이드를 인산화 펩타이드와 분리해 낼 수 있을 뿐만 아니라 분리된 O-GlcNAc 펩타이드의 서열 및 O-GlcNAc의 수식화 위치를 규명할 수 있다. 따라서 본 발명은 O-GlcNAc 펩타이드의 분석을 통한 새로운 질병 메커니즘 연구, 치료제 및 진단용 마커의 개발 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 Ｏ-ＧｌｃＮＡｃ 펩타이드의 분리 및 동정 방법 {Method for identifying O-GlcNAc peptide using metal-affinity chromatography}
본 발명은 단백질의 O-GlcNAcylation에 대한 정보를 내포하는 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법에 관한 것이다.
단백질의 동정과 더불어 그 단백질의 전사 후 변형 과정에 대한 연구는 기능적인 프로테옴 (functional proteomics) 연구에 있어서 매우 중요하다. 그 중에서도 단백질의 O-GlcNAcylation (O-GlcNAc glycosylation)은 1980년대 초에 발견 되었으며, 단백질의 O-GlcNAcylation에 의해 핵이나 세포질에서 단백질의 세린(serine)이나 트레오닌(threonine)의 수산기(-OH)에 O-linked β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) 으로 당화가 되어 있는 많은 당단백질이 발견되었다.
다수의 연구 결과들을 통해 세린과 트레오닌의 잔기에 O-GlcNAc이 첨가되고 제거되는 역동적인 순환과정이 핵과 세포질의 단백질 활성의 핵심 조절인자로 작용하는 것을 확인할 수 있다. 또한 단백질의 O-GlcNAcylation은 인산화(phosphorylation) 과정과 함께 mRNA가 단백질로 번역된 후의 운명과 표적 단백질의 기능을 변화시키며, 인산화가 일어날 수 있는 세린과 트레오닌 자리에 발생하여 인산화 과정과 상호 경쟁적으로 발생한다.
O-GlcNAcylation의 조절기능장애(dysregulation)는 당뇨, 신경퇴행성 질환 그리고 암과 같은 질병들과 연관 관계가 있다. 예를 들면, 유방암에서 기본 종양조직에 비해 전이성 림프절 조직의 단백체에서 GlcNAcylation이 현저하게 증가함이 알려졌으며, 제2형 당뇨병인 경우에도 근육조직에서 O-GlcNAc 수식 단백체의 뚜렷한 증가가 관찰되었다.
따라서 새로운 O-GlcNAc 당단백체의 발견과 O-GlcNAcylation이 일어나는 특정 세린 또는 트레오닌 수식화 위치의 규명은 O-GlcNAcylation과 관련된 생물학적 메커니즘을 이해하는데 있어 매우 중요하다.
현존하는 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 동정 방법으로는 O-GlcNAc 당단백질화 특정 단일항체 (galactosyltransferase labeling of O-GlcNAc with UDP[H3]Gal)를 이용하는 방법(Roquemore, E.P. et al. Detection of O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) on cytoplasmic and nuclear proteins. Methods Enzymol. 230, 443-460(1994)), pan-특이적 O-GlcNAc 항체를 이용하는 방법(Liu, K. et al. Glucose stimulates protein modification by O-linked GlcNAc in pancreatic β cells: linkage of O-linked GlcNAc to β cell death. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 97, 2820-2825 (2000) ; Zachara, N.E. et al . Dynamic O-GlcNAc modification of nucleocytoplasmic proteins in response to stress. A survival response of mammalian cells. J. Biol . Chem . 279, 30133-30142 (2004), GlcNAc binding lectin WGA를 사용하는 방법(Cieniewski-Bernard, C. et al . Identification of O-linked N-acetylglucosamine proteins in rat skeletal muscle using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Mol . Cell. Proteomics 3, 577-585 (2004)), 인산기의 가수분해를 이용한 방법(Lance Wells et al. Mapping Sites of O-GlcNAc Modification Using Affinity Tags for Serine and Threonine Post-translational Modifications. Mol . Cell . Proteomics 1, 791-804 (2002)) 등이 있다. 그러나 전술한 방법들은 O-GlcNAc 펩타이드를 분리하기 위하여 샘플 내 펩타이드 잔기에 결합되어 있는 인산기 또는 O-GlcNAc을 가수분해하거나 태그를 붙이는 등 샘플의 화학적인 변형이 수반되는 문제가 있었다. 따라서 샘플의 화학적 변형 없이 쉽고 빠르게 O-GlcNAc 펩타이드를 인산화 펩타이드와 분리해 내는 것과 더불어 최신 질량 분석 기술 적용하여 단백체 O-GlcNAcylation의 수식화 위치를 밝힘으로써 O-GlcNAcylation 관련 분자생물학적 메커니즘을 도출하고 관련 질병에 대한 새로운 치료 및 진단 표적을 규명할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
본 발명은 O-GlcNAc 단백체를 규명하기 위한 것으로서, 단백체의 동일한 세린 또는 트레오닌 잔기에 O-GlcNAc 또는 인산기가 수식화 되어 있는 부분을 보존하면서 펩타이드 수준에서 빠르고 간단하게 O-GlcNAc 펩타이드를 분리 및 동정하는 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 인산화 펩타이드(phospho peptide)와 O-GlcNAc 펩타이드(O-linked β-N-acetylglucosamine peptide)를 포함하는 분석대상 샘플에 대하여 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 인산화 펩타이드를 컬럼에 흡착시켜 제거하는 단계를 포함하는 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 분석대상 샘플에 대하여 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 컬럼에 흡착된 인산화 펩타이드와 컬럼에 흡착되지 않은 O-GlcNAc 펩타이드를 분리하는 단계; 2) 컬럼에 흡착된 인산화 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하고, 컬럼에 흡착되지 않은 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하는 단계; 3) 단계 2)에서 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드에 대하여 티올 친화성 크로마토그래피를 수행하여 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 정제하는 단계; 및 4) 정제된 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)로 분석하여 비교하는 단계를 포함하는 동일 분석대상 샘플 내 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량 정량 분석 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 제1 분석대상 샘플 및 제2 분석대상 샘플에 대하여 각각 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 인산화 펩타이드를 컬럼에 흡착시키켜 제거하는 단계; 2) 단계 1)에서 인산화 펩타이드를 제거한 제1 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하고, 인산화 펩타이드를 제거한 제2 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하는 단계; 3) 단계 2)에서 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드에 대하여 티올 친화성 크로마토그래피를 수행하여 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 정제하는 단계; 및 4) 정제된 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)로 분석하여 비교하는 단계를 포함하는 상이한 분석대상 샘플 내 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량 정량 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 펩타이드의 세린 또는 트레오닌 잔기에 결합되어 있는 인산기 또는 O-GlcNAc의 화학적 변형 없이 쉽고 빠르게 O-GlcNAc 펩타이드를 인산화 펩타이드와 분리해 낼 수 있을 뿐만 아니라 분리된 O-GlcNAc 펩타이드의 서열 및 O-GlcNAc 수식화 위치를 규명할 수 있다. 따라서 본 발명은 O-GlcNAc 펩타이드의 분석을 통한 새로운 질병 메커니즘 연구, 치료제 및 진단용 마커의 개발 등에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 실시예에서 사용한 표준 샘플을 나타낸 것이다.
도 3은 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드의 분리 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 TiO2 친화성 크로마토그래피를 이용하여 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드를 분리한 후 질량분석기로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
(A) O-GlcNAc 펩타이드의 LC/MS 용리 크로마토그램 (m/z 559.8 [M+2H]2+, m/z 1118.6 [M+H]+)
(B) 인산화 펩타이드의 LC/MS 용리 크로마토그램 (m/z 498.2 [M+2H]2+, m/z 995.4 [M+H]+)
도 5는 본 발명에 따른 BEMAD 방법의 개략도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따른 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 d0-DTT 및 d6-DTT를 부가한 표준 샘플간 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량을 정량적으로 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 생물학적 샘플에 표준 샘플인 O-GlcNAc 펩타이드(TAPT(O-GlcNAc)STIAPG)와 인산화 펩타이드(TAPT(phospho)STIAPG)를 1:1 비율로 함께 섞어 실험 과정을 거친 후에도 비율이 그대로 유지되어 나타나는지 정량적으로 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
(A) d0 (DTT) 표지된 인산화 펩타이드의 LC/MS 용리 크로마토그램
(B) d6 (DTT) 표지된 O-GlcNAc 펩타이드의 LC/MS 용리 크로마토그램
(C) 트리플 쿼드러플 MS 분석 (Triple Qudrupole MS analysis) 결과 d0 (DTT) 표지된 인산화 펩타이드 ([M+H]+ , m/z 1051.4) 및 d6 (DTT) 표지된 O-GlcNAc 펩타이드 ([M+H]+ m/z 1057.4)가 1:1 비율로 검출됨을 보여주는 MS 스펙트럼
본 발명은 인산화 펩타이드(phospho peptide)와 O-GlcNAc 펩타이드(O-linked β-N-acetylglucosamine peptide)를 포함하는 분석대상 샘플에 대하여 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 인산화 펩타이드를 컬럼에 흡착시켜 제거하는 단계를 포함하는 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법을 제공한다.
본 발명의 “인산화 펩타이드”는 펩타이드의 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 인산기(phosphate group)가 수식화되어 있는 펩타이드를 의미하며, “O-GlcNAc 펩타이드”는 펩타이드의 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 O-결합 N-아세틸글루코사민 (O-linked β-N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)이 수식화되어 있는 펩타이드를 의미한다. 앞서 배경기술에서 언급한 바와 같이, 전사 후 변형과정인 세린 또는 트레오닌 잔기의 인산화 또는 O-GlcNAcylation 은 상호 경쟁적인 과정으로서 이들은 핵과 세포질의 단백질 활성을 조절하는 중요한 조절인자이다. 따라서 분석대상 샘플로부터 O-GlcNAc 펩타이드를 분리 및 동정함에 있어서 우선 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드를 분리해내는 것이 중요하다.
이 때 분석대상 샘플은 인산화 펩타이드 및 O-GlcNAc 펩타이드를 포함하는 샘플로서 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 O-GlcNAc 펩타이드를 분리해 내고자 하는 대상체의 세포로부터 얻은 단백질 샘플일 수 있으며, 또는 상기 단백질 샘플을 트립신 등의 처리에 의해 펩타이드로 변환한 샘플일 수 있다.
본 발명에 있어서 “금속 친화성 크로마토그래피 (metal affinity chromatography)"라 함은 특정한 2가 금속 이온(doubly charged cation)에 대한 특정 아미노산의 친화도를 이용하여 단백질 또는 펩타이드를 정제하는 크로마토그래피 기술을 의미한다. 즉 분석대상 샘플을 크로마토그래피 컬럼에 흘려보내면 컬럼 상에 고정되어 있는 금속 이온에 친화력을 갖는 물질만 컬럼에 흡착되고 나머지 성분들은 흡착되지 않은 채 컬럼을 통과하여 나온다. 그런 다음 흡착된 물질을 pH 및/또는 염 농도와 같은 환경 조건들을 변화시킴으로써 용리시켜 정제하는 것이다.
본 발명에서는 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드를 포함하는 분석대상 샘플을 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼에 통과시키면, 컬럼 상의 2가 금속 이온과 인산화 펩타이드의 인산기의 친화력에 의해 인산화 펩타이드만이 컬럼에 흡착되고, 인산기를 포함하지 않는 O-GlcNAc 펩타이드는 컬럼에 흡착되지 않고 빠져나오게 된다. 이를 통하여 인산화 펩타이드의 인산기의 화학적 변형 없이도 빠르고 손쉽게 인산화 펩타이드를 분석대상 샘플로부터 제거할 수 있으며, 결과적으로 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드를 용이하게 분리할 수 있다.
이 때 상기 금속 친화성 크로마토그래피에 사용되는 금속은 TiO2, ZrO2, GaO4 또는 FeO2 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이외에도 인산화 펩타이드의 인산기와 친화력을 갖는 금속 이온을 제공하는 임의의 금속화합물이 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 또한 상기 TiO2, ZrO2, GaO4 또는 FeO2 금속들은 컬럼 내에 팁(tip) 또는 비드(bead) 형태로 포함될 수 있으며, 아가로스 또는 자성 입자와 컨쥬게이션된 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 본 발명의 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법은 상기 인산화 펩타이드를 제거한 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에 BEMAD 방법을 이용하여 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT) 친화성 태그를 부가하고 티올 친화성 크로마토그래피를 이용하여 O-GlcNAc 펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 전술한 금속 친화성 크로마토그래피에 의하여 분석대상 샘플에 포함된 인산화 펩타이드는 제거하였지만, 인산화 펩타이드가 제거되고 남은 분석대상 샘플 내에는 O-GlcNAc 펩타이드 외에도 여러 가지 펩타이드들이 혼합된 상태이며, 따라서 이 중 O-GlcNAc 펩타이드만을 최종 정제하기 위하여 BEMAD 방법 및 티올 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것이다.
본 발명에 있어서 “BEMAD 방법”이란 β 제거반응 및 DTT를 이용한 마이클 부가반응(β-Elimination and Michael Addition of Dithiothreitol)을 의미한다. β 제거반응(β-Elimination)에 의하여 알칼리 조건 하에서 O-GlcNAc 펩타이드의 세린 또는 트레오닌 잔기에 수식화되어 있는 O-GlcNAc을 제거할 수 있으며, O-GlcNAc이 제거된 자리에 마이클 부가반응(Michael Addition)에 의해 티올기를 갖는 친화성 태그로서 DDT를 부가시킴으로써, 이후 수행되는 티올 친화성 크로마토그래피(Thiol affinity chromatography)에 의해 티올기가 부가된 O-GlcNAc 펩타이드만을 정제할 수 있다.
본 발명에 있어서 “친화성 태그”란 친화성 크로마토그래피를 통한 목적물질의 검출을 용이하기 위해 목적물질에 융합되는 융합 파트너를 의미한다. 본 발명에서는 친화성 태그로서 디티오트레이톨을 사용하였으며, 디티오트레이톨 친화성 태그를 통해 펩타이드에 티올기를 부가함으로써 이후 수행되는 티올 친화성 크로마토그래피에 의해 목적 펩타이드를 검출할 수 있다.
또한 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법은 상기 정제된 O-GlcNAc 펩타이드를 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)를 이용하여 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기는 예를 들어 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석기(tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)일 수 있다. LC-MS/MS 는 분석대상 물질을 액상 크로마토그래피로 분리한 뒤 질량분석기로 보내어 MS/MS 탠덤 분석을 통해 펩타이드의 정성 및 정량 분석을 가능하게 한다.
상기 LC-MS/MS 분석 방법에 의하면 정제된 O-GlcNAc 펩타이드의 서열 시퀀싱이 가능할 뿐만 아니라 O-GlcNAc 펩타이드 서열 내의 O-GlcNAc 수식화 위치까지 분석 가능하여, O-GlcNAc 단백체 관련 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
결과적으로 본 발명에 따른 O-GlcNAc 펩타이드의 분리 및 동정 방법은 도 1에 나타난 바와 같이, 1) 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드를 포함하는 분석대상 샘플에 대하여 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 인산화 펩타이드를 컬럼에 흡착시켜 제거하는 단계; 2) 단계 1)에서 인산화 펩타이드를 제거한 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에 BEMAD 방법을 이용하여 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하는 단계; 3) 디티오트레이톨 친화성 태그가 부가된 O-GlcNAc 펩타이드를 티올 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계; 및 4) 정제된 O-GlcNAc 펩타이드를 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 로 분석하는 단계를 포함한다. 이에 따르면 인산화 펩타이드로부터 O-GlcNAc 펩타이드를 간단하게 분리해낼 수 있을 뿐만 아니라 O-GlcNAc 펩타이드의 서열 및 O-GlcNAc 수식화 위치까지 정확하게 동정해낼 수 있다.
또한 본 발명은 1) 분석대상 샘플에 대하여 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 컬럼에 흡착된 인산화 펩타이드와 컬럼에 흡착되지 않은 O-GlcNAc 펩타이드를 분리하는 단계; 2) 컬럼에 흡착된 인산화 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하고, 컬럼에 흡착되지 않은 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하는 단계; 3) 단계 2)에서 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드에 대하여 티올 친화성 크로마토그래피를 수행하여 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 정제하는 단계; 및 4) 정제된 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)로 분석하여 비교하는 단계를 포함하는 동일 분석대상 샘플 내 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량 정량 분석 방법을 제공한다.
O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드는 세린과 트레오닌 자리에서 상호 경쟁적으로 일어나는 단백질 전사후 변형과정인 O-GlcNAc glysosylation과 인산화에 의해 각각 생성되며, O-GlcNAc의 첨가 또는 제거는 단백질 활성의 핵심 조절인자로 알려져 있기 때문에, 동일한 생물학적 샘플 내에서 상호 경쟁적 관계에 있는 O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드의 상대량을 비교 분석하는 것은 단백질의 활성 연구, 질병 메커니즘 연구 등에 있어서 매우 중요한 의미를 갖는다. 상기 방법에 따르면 동일한 분석대상 샘플 내의 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드의 상대적인 양을 정량적으로 비교 분석할 수 있다.
이 때 금속 친화성 크로마토그래피, BEMAD, 티올 친화성 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 각각에 대한 세부적인 사항은 앞서 설명한 바와 같다. 다만 본 방법은 동일한 분석대상 샘플 내의 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드의 상대적인 양을 비교하기 위한 것이므로, 금속 친화성 크로마토그래피 수행 결과 컬럼에 흡착된 인산화 펩타이드를 제거하지 않고 별도로 용리시킨 후 용출된 인산화 펩타이드에 BEMAD 방법을 이용하여 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하여 O-GlcNAc 펩타이드와 동일한 분석 과정을 거친다는 점에서 상이하다. 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드를 각각 제1 질량 태그 및 제2 질량 태그로 표지하였기 때문에, 단계 4)의 질량분석 결과 얻은 각각의 질량 태그에 대한 신호의 세기(Intensity)를 비교함으로써 분석대상 샘플 내 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량을 정량적으로 비교 분석할 수 있다. 즉, 질량분석 결과 얻은 데이터 에는 gradient time(x축)에 따른 이온 크로마토그래피의 값(y축)이 나타나는데, 여기서 세로축(y축)이 상대적인 신호의 세기(relative intensity)를 보여준다. 샘플내 각 펩타이드의 존재량에 따라 신호의 세기가 다르게 나타나므로 이를 비교 분석함으로써 상대적인 정량이 가능하다.
본 발명에 있어서 “질량 태그”란 질량분석을 통한 목적물질의 검출을 용이하게 하기 위해 목적물질에 융합되는 융합 파트너로서, 목적물질에 상이한 질량 특징을 갖는 질량 태그를 융합시킴으로써 구별되는 질량 특징을 통해 목적물질을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 제1 질량 태그 및 제2 질량 태그는 일반적인 디티오트레이톨인 d0-DTT (normal dithiothreitol), 1 내지 6개의 중수소(heavy hydrogen)가 결합된 디티오트레이톨인 d1-DTT 내지 d6-DTT에서 선택되는 서로 상이한 화합물일 수 있으며, 하기 실시예에서는 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨로서 d0-DTT를, 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨로서 d6-DTT를 사용하였다(K. Vosseller et. al. Quantitative analysis of both protein expression and serine / threonine post-translational modifications through stable isotope labeling with dithiothreitol. Proteomics. 2005 Feb;5(2):388-98 참조).
이와 같이 본 방법을 이용하면 하나의 샘플 내에서 O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드의 상대적인 양을 정량적으로 비교 분석할 수 있다. 따라서 특정 질병 샘플 내에서 O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드를 비교함으로써 특정 질병과 관련된 O-GlcNAc 펩타이드를 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라, 다수의 샘플 (예를 들면, 정상 및 질병 상태의 샘플) 내 O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드의 상대적인 양을 비교 분석함으로써 특정 질병을 진단하거나 치료제를 스크리닝 하는 데에도 본 방법을 활용할 수 있다. 또한 본 발명은 1) 제1 분석대상 샘플 및 제2 분석대상 샘플에 대하여 각각 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 인산화 펩타이드를 컬럼에 흡착시키켜 제거하는 단계; 2) 단계 1)에서 인산화 펩타이드를 제거한 제1 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하고, 인산화 펩타이드를 제거한 제2 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하는 단계; 3) 단계 2)에서 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드에 대하여 티올 친화성 크로마토그래피를 수행하여 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 정제하는 단계; 및 4) 정제된 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)로 분석하여 비교하는 단계를 포함하는 상이한 분석대상 샘플간 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량 정량 분석 방법을 제공한다.
상기 방법에 따르면 서로 상이한 분석대상 샘플에 포함된 O-GlcNAc 펩타이드 사이의 상대적인 양을 정량적으로 비교 분석할 수 있다. 이 때 금속 친화성 크로마토그래피, BEMAD, 티올 친화성 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 각각에 대한 세부적인 사항은 앞서 설명한 바와 같다. 다만 본 방법은 상이한 분석대상 샘플간 O-GlcNAc 펩타이드의 상대적인 양을 비교하기 위한 것이므로, BEMAD 방법에서 제1 분석대상 샘플로부터 분리한 O-GlcNAc 펩타이드에는 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하고 제2 분석대상 샘플로부터 분리한 O-GlcNAc 펩타이드에는 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가한다는 점에서 차이가 있다. 제1 및 제2 분석대상 샘플의 O-GlcNAc 펩타이드를 각각 제1 질량 태그 및 제2 질량 태그로 표지하였기 때문에, 단계 4)의 질량분석 결과 얻은 각각의 질량 태그에 대한 신호의 세기를 비교함으로써 제1 및 제2 분석대상 샘플간 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량을 정량적으로 비교 분석할 수 있다.
전술한 바와 같이 상기 제1 질량 태그 및 제2 질량 태그는 일반적인 디티오트레이톨인 d0-DTT (normal dithiothreitol), 1 내지 6개의 중수소(heavy hydrogen)가 결합된 디티오트레이톨인 d1-DTT 내지 d6-DTT에서 선택되는 서로 상이한 화합물일 수 있으며, 하기 실시예에서는 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨로서 d0-DTT를, 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨로서 d6-DTT를 사용하였다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 제1 분석대상 샘플은 정상 상태의 샘플이고 제2 분석대상 샘플은 질병 상태의 샘플일 수 있다.
이와 같이 정상 상태의 샘플 내 O-GlcNAc 펩타이드의 양과 특정 질병 상태의 샘플 내 O-GlcNAc 펩타이드의 상대적인 양적 차이를 분석함으로써, 특정 질병과 관련된 특이적인 O-GlcNAc 펩타이드를 스크리닝 할 수 있을 뿐만 아니라, 이미 특정 질병과의 관련성이 밝혀진 O-GlcNAc 펩타이드의 상대적인 양적 변화를 분석함으로써 특정 질병을 진단하거나 치료제를 스크리닝 하는 데에도 본 방법을 활용할 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 표준 샘플( standard sample )을 이용한 O- GlcNAc 펩타이드의 분리 실험
전사인자 CREB의 일차 서열 내에 O-GlcNAc 사이트를 포함하는 O-GlcNAc-변형된 LC/MS 표준 펩타이드(Invitrogen, Cat #. C33373)를 O-GlcNAc 펩타이드 표준 샘플로 사용하였으며, O-GlcNAc 대신 인산기를 포함하는 표준 펩타이드(Invitrogen, Cat #. C33373)를 인산화 펩타이드 표준 샘플로 사용하였다(도 2).
금속 친화성 크로마토그래피
리간드로 이산화티타늄(TiO2)이 흡착된 Titansphere® Phos-TiO Kit(GL Sciences Inc.)를 사용하여 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하였다(도 3). 팁 컬럼(Tip column)은 버퍼 A (0.5% TFA, 80% ACN) 20㎕를 첨가하여 20℃에서 2분간 3000xg으로 원심분리하고 버퍼 B (0.4% TFA, 60% ACN, 25% Acetic acid) 20㎕를 첨가하여 20℃에서 2분간 3000xg으로 원심분리 하여 흡착되어 있는 TiO2 를 평형화 시켰다. 전술한 O-GlcNAc화 되어있는 합성 펩타이드(TAPT(O-GlcNAc)STIAPG)와 인산화된 합성 펩타이드(TAPT(phospho)STIAPG)를 1:1 비율로 버퍼 B 용액 (0.4% TFA, 60% ACN, 25% Acetic acid )에 용해시켜 버퍼 A로 평형화 시켜놓은 TiO2 팁 컬럼에 첨가하였다. 20℃에서 10분간 1000xg으로 원심분리 한 후, flow through sup(비흡착액)을 보관하였다. 세척은 버퍼 B 20㎕를 첨가하여 20℃에서 2분간 3000xg로 원심분리 한 뒤 버퍼 A 20㎕를 첨가하여 20℃에서 2분간 3000xg로 2회 원심분리 하여 실시하였다. 비흡착액은 모두 하나로 모아 수득하였다. 이산화티타늄 리간드에 결합된 샘플의 용리는, 팁을 용리 튜브로 옮긴 후 5% NH4OH 50㎕를 첨가하여 1000xg으로 5분씩 2회 원심분리하고 30% 아세토니트릴 50㎕를 첨가하여 1000xg 으로 5분간 원심분리 하여 용출액(elution sample)을 수득하였다. 용출액과 비흡착액을 각각 완전 건조시켰다.
수득한 용출액과 비흡착액을 각각 질량분석기(Agilent 6430 Triple Quadrupole LC/MS System)를 이용하여 분석한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 용출액에는 인산화 펩타이드가 존재하고, 비흡착액에는 O-GlcNAc 펩타이드가 각각 존재함을 확인하였다. 뿐만 아니라 O-GlcNAc 펩타이드 표준 샘플과 인산화 펩타이드 표준 샘플을 1:1로 혼합하여 분석을 수행한 결과 그 비율이 1:1인 것까지도 질량분석기로 확인할 수 있었다. 따라서 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하면 펩타이드 샘플 자체의 화학적인 변형 없이 O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드를 손쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 샘플 내 O-GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드의 상대적인 양까지도 정량적으로 분석할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2: 표준 샘플을 도입한 생물학적 샘플( biological sample ) 내에서 O- GlcNAc 펩타이드의 분리 실험
표준 샘플을 도입한 생물학적 샘플의 제작
5XFAD 마우스 모델의 뇌에서 시냅토좀(synaptosome)을 추출하여 용해 버퍼 (50mM Tris HCl pH 8.0, 8M urea, 50mM sodium fluoride, 0.25mg/ml PMSF (in EtOH), 1mM sodium orthovanadate, 25x Complete (protease inhibitor), 10X phosphatase inhibitor)로 용해(lysis)시켰다. 상기 용해된 샘플을 실온에서 2시간 반응하여 변성시킨 후, DTT(최종 농도 10mM)를 첨가하여 실온에서 45분 내지 1시간 동안 디설파이드 환원반응 시키고, 이오도아세트아미드(최종 농도 30mM)를 첨가하여 실온에서 암조건으로 30분간 설프히드릴기 알킬화 반응을 수행하였다. 처리된 샘플을 50mM NH4HCO3 를 이용하여 우레아의 최종 농도가 1M이하가 되도록 희석하였고, 트립신과 샘플의 비율을 1:50으로 트립신 처리하여 37℃에서 16시간 반응시켰다. 그 후 C-18 Reverse Phase로 탈염화 하여 5XFAD 마우스 모델의 브레인 시냅토좀 (synaptosome) 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 상기 시냅토좀 펩타이드 혼합물에 표준 샘플인 O-GlcNAc 펩타이드 표준 샘플 (TAPT(O-GlcNAc)STIAPG)과 인산화 펩타이드 표준 샘플 (TAPT(phospho)STIAPG)을 각각 5 picomole씩 1:1 비율로 혼합하여, 표준 샘플을 도입한 생물학적 샘플을 제작하였다.
금속 친화성 크로마토그래피
상기 표준 샘플을 도입한 생물학적 샘플로부터 우선 인산화 펩타이드를 분리하기 위하여, 생물학적 샘플을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 개시된 방법과 동일한 방법으로 이산화티타늄을 이용한 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 다만 생물학적 샘플에 대한 크로마토그래피 수행 결과 수득한 비흡착액(flow through sup)에는 O-GlcNAc 펩타이드 외에도 여러 가지 펩타이드들이 혼합되어 있으므로, 이 중 O-GlcNAc 펩타이드 만을 선별하기 위하여 다음과 같이 BEMAD 방법 (β-Elimination and Michael addition of dithiothreitol)을 시행하고 티올 친화성 크로마토그래피 (Thiol Affinity Chromatography)를 통해 O-GlcNAc 펩타이드 만을 분리해낸 뒤, 질량분석 방법을 통해 동정하였다.
BEMAD : β 제거반응 및 DTT 를 이용한 마이클 부가반응
GlcNAc 당을 β 제거반응 시킨 후 여기에 디티오트레이톨(DTT)을 마이클 부가반응 시키는 BEMAD 방법의 개략도는 도 5에 나타나 있으며, 구체적인 BEMAD 과정은 다음과 같다 (Mapping sites of O-GlcNAc modification using affinity tags for serine and threonine post-translational modifications. Mol . Cell . Proteomics 1, 791-804 (2002) 참조). 건조된 펩타이드들을 0.05M Ba(OH)2, 90% 메탄올 및 10 mM DTT 혼합물에 재부유 시켰다. 최종 pH는 pH 12.0-12.5였으며, 45 ℃ 에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응은 0.3M H2SO4로 종결시켰다. 펩타이드들을 reversephase C18 cartridege(Waters)를 통해 탈염화 하였고, 0.1% 포름산 및 80% 아세토니트릴로 용리시켰으며, Speed Vac 으로 건조시켰다. DTT 부가반응을 통해 MS/MS 분석에 안정한 황화물 부가체를 얻을 수 있었다.
티올 친화성 크로마토그래피 ( Thiol Affinity Chromatography )
산소를 제거한 HPLC 물을 이용하여 Thiopropyl Sepharose 6B(GE Healthcare)를 팽창시키고 세척하였다. Thiopropyl Sepharose 6B(GE Healthcare)를 스핀 컬럼에 넣고 산소를 제거한 TBS-EDTA (20mM Tris (pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA)를 이용하여 평형을 이루게 하였다. 건조된 펩타이드들을 TBS-EDTA에 부유시켰으며, 이를 티올 세파로오스 비드가 들어있는 스핀컬럼에 넣어 4시간 동안 실온에서 회전하며 결합반응을 시행하였다. 그 후 컬럼을 TBS-EDTA로 500㎕씩 7회 세척하였고, TBS-EDTA-DTT (20mM Tris (pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 20mM DTT)를 컬럼에 첨가하여 1시간 반응시켰다. 200㎕ TBS-EDTA-DTT로 세 차례 순차적으로 용리시켰다. 티올 친화성 컬럼으로부터 용리된 펩타이드들을 포름산을 이용하여 pH3 이하가 되도록 산성화 시킨 후 reverse-phase C18 cartridege(Waters)로 탈염화 하였고, 80% 아세토니트릴, 0.1% 포름산 혼합 용액으로 용리시켜 획득한 펩타이드들을 speed vac으로 건조시켰다.
질량분석기 분석 ( Mass Spectrometry Analysis )
수득한 용출액을 질량분석기(Agilent 6430 Triple Quadrupole LC/MS System)를 이용하여 분석한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 BEMAD 방법에 의해 티올기가 부가된 O-GlcNAc 펩타이드가 동정 되었다. 결과적으로 금속 친화성 크로마토그래피 및 BEMAD 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드를 용이하게 분리 및 동정할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 생물학적 샘플 내 O- GlcNAc 펩타이드의 상대량 비교 실험
3-1: d0 - DTT 및 d6 - DTT 를 이용한 정량 분석
실시예 1의 O-GlcNAc 펩타이드 표준 샘플을 두 그룹으로 나눈 뒤, 각 그룹에 대하여 d0-DTT 와 d6-DTT를 이용하여 BEMAD를 수행하였다. 이 때, d0-DTT 표지 O-GlcNAc 펩타이드의 양을 d6-DTT 표지 O-GlcNAc 펩타이드의 2배가 되도록 하여 BEMAD를 수행하였다.
상기 두 그룹의 샘플에 대하여 질량분석기로 분석을 수행한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 d0-DTT 표지 그룹에서 d6-DTT 표지 그룹에 비해 신호의 세기가 2배로 검출되었다. 이를 통해 상이한 질량을 갖는 질량 태그를 이용해 서로 다른 샘플내 펩타이드의 양을 상대적으로 정량분석 가능함을 알 수 있다.
3-2: 동일 샘플 내에서 O- GlcNAc 펩타이드와 인산화 펩타이드의 상대량 비교 실험
실시예 2에서 제작한 인산화 펩타이드 표준 샘플과 O-GlcNAc 펩타이드 표준 샘플이 1:1로 도입된 생물학적 샘플에 대하여 실시예 2에 기재된 금속 크로마토그래피 방법에 의해 분리한 용출액과 비흡착액을 각각 d0-DTT 와 d6-DTT를 이용하여 BEMAD 과정을 시행하고 이를 혼합하여 티올 크로마토그래피를 시행하였다.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이 Agilent 6430 Triple Quadrupole LC/MS 질량분석기를 통해 나타나는 신호(Intensity)의 ratio를 통해 d0-DTT 가 부착된 인산화 펩타이드(A)와 d6-DTT가 부착된 O-GlcNAc 펩타이드(B)가 1:1 비율을 반영하는 것이 확인되었다.
3-3: 상이한 샘플간 O- GlcNAc 펩타이드의 상대량 비교 실험
질병 상태인 실험군 샘플과 정상 상태인 대조군의 샘플에 대하여 각각 실시예 2에 개시된 것과 동일한 방법으로 이산화티타늄 친화성 크로마토그래피 및 BEMAD 방법을 수행하였다. 다만 O-GlcNAc 펩타이드의 상대적인 양적 차이를 분석하기 위하여 실험군 샘플은 d0-DTT, 대조군 샘플은 d6-DTT로 마이클 부가반응을 시행하였다. 질량분석기를 통해 나타나는 결과의 ratio를 통해 질병 상태의 실험군(d0-DTT) 및 대조군(d6-DTT)에 포함된 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량을 비교분석 할 수 있다.
실시예 4: 생물학적 샘플( biological sample ) 내에서 O- GlcNAc 펩타이드의 분리 실험
5XFAD 마우스 모델의 해마(hippocampus)의 미토콘드리아 분획에 대하여 실시예 2에 개시된 방법에 따라 O-GlcNAc 단백질의 동정을 수행하였다.
O-GlcNAc 단백질로 분리된 단백질들 중 90% 이상 확률을 기준으로 필터링 한 결과, 미토콘드리아의 단백질로 알려져 있는 단백질 22개(표 2의 볼드체)를 포함하여 총 76개의 O-GlcNAc 단백질이 동정되었다(표 2). 이 중에서 이미 O-GlcNAc 단백질로 공지된 단백질도 5개가 포함되어 있었다(표 1).
분리된
총 단백질 수		 미토콘드리아
단백질 수		 O-GlcNAc 단백질로 공지된 단백질
확률>=0.9 76 22 Vdac1, Hspd1, Sncb, Uqcrc2, Acta1
단백질 Symbol Swiss Prot Entrez ID
Voltage - dependent anion - selective channel protein 1 VDAC1 Q60932 22333
Glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase G3P P16858 14433
ADP / ATP translocase 1 ADT1 P48962 11739
Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1 AT1B1 P14094 11931
Hexokinase -1 HXK1 P17710 15275
2',3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase CN37 P16330 12799
Excitatory amino acid transporter 2 EAA2 P43006 20511
Tubulin alpha-4A chain TBA4A P68368 22145
60 kDa heat shock protein , mitochondrial CH60 P63038 15510
ATP synthase subunit beta , mitochondrial ATPB P56480 11947
14-3-3 protein eta 1433F P68510 22629
Tubulin alpha-1A TBA1A P68369 22142
Tubulin alpha-1B chain TBA1B P05213 22143
Dihydropyrimidinase - related protein 2 DPYL2 O08553 12934
Fructose - bisphosphate aldolase A ALDOA P05064 11674
10 kDa heat shock protein , mitochondrial CH10 Q64433 15528
Brain acid soluble protein 1 BASP1 Q91XV3 70350
Tubulin alpha-8 chain TBA8 Q9JJZ2 53857
Malate dehydrogenase , mitochondrial MDHM P08249 17448
Tubulin alpha-3 chain TBA3 P05214 22144
Tubulin alpha-1C chain TBA1C P68373 22146
Creatine kinase B- type Ckb Q04447 12709
ATP synthase subunit alpha , mitochondrial ATPA Q03265 11946
Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-3 AT1A3 Q6PIC6 232975
Potassium-transporting ATPase alpha chain 1 ATP4A Q64436 11944
ATP synthase subunit gamma , mitochondrial ATPG Q91VR2 11949
Tubulin beta-6 chain TBB6 Q922F4 67951
Tubulin beta-2A chain TBB2A Q7TMM9 22151
Tubulin beta-4 chain TBB4 Q9D6F9 22153
Tubb5 protein (Fragment) Tubb5 Q80ZV2 22154
AF4/FMR2 family, member 1 Aff1 A3KMF4 17355
Myelin basic protein (Fragment) Q09J72 Q09J72 17196
Putative uncharacterized protein Actb Q3TIJ9 11461
Beta-actin-like protein 2 ACTBL Q8BFZ3 238880
Actin, gamma, cytoplasmic 1 Actg1 B1ATY0 11465
Skeletal muscle alpha-actin mRNA. (Fragment) Acta1 Q61264 11459
Putative uncharacterized protein Q8CF71 Q8CF71 11475
Aconitate hydratase , mitochondrial ACON Q99KI0 11429
Clathrin heavy chain 1 Cltc Q68FD5 67300
Pyruvate kinase isozymes M1 / M2 Pkm2 P52480 18746
Myosin-IXa MYO9A Q8C170 270163
Beta - synuclein SYUB Q91ZZ3 104069
Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit alpha KCC2A P11798 12322
Vesicle-fusing ATPase NSF P46460 18195
ATP-binding cassette sub-family A member 13 ABCAD Q5SSE9 268379
Clavesin-1 CLVS1 Q9D4C9 74438
Cation channel sperm-associated protein subunit beta CTSRB A2RTF1 271036
Dihydrolipoyl dehydrogenase , mitochondrial DLDH O08749 13382
Syntaxin-1A GN=Stx1a PE=2 SV=1 STX1A O35526 20907
Triosephosphate isomerase TPIS P17751 21991
NADH dehydrogenase [ ubiquinone ] 1 alpha subcomplex subunit 4 Ndufa4 Q62425 17992
Serine/threonine-protein kinase MRCK beta MRCKB Q7TT50 217866
Pleckstrin homology domain-containing family A member 8 PKHA8 Q80W71 231999
Thioredoxin-related transmembrane protein 4 TMX4 Q8C0L0 52837
Perilipin-1 OS=Mus musculus GN=Plin1 PE=1 SV=2 PLIN1 Q8CGN5 103968
Conserved oligomeric Golgi complex subunit 3 COG3 Q8CI04 338337
Paxillin PAXI Q8VI36 19303
Sialic acid-binding Ig-like lectin 5 SIGL5 Q920G3 233186
Tetratricopeptide repeat protein 32 TTC32 Q9DAC7 75516
Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 4 factor 2 alpha kinase 4 E2AK4 Q9QZ05 27103
Protein MRVI1 MRVI1 Q9WUX5 17540
Muc19 protein A4QMU5 A4QMU5 239611
MKIAA2026 protein (Fragment) 9930021J03Rik Q5DTT0 240613
Platelet-activating factor acetylhydrolase IB subunit alpha LIS1 P63005 18472
Cytochrome c oxidase subunit 2 COX2 P00405 17709
Neuroplastin NPTN P97300 20320
Purkinje cell protein 4 PCP4 P63054 18546
V-type proton ATPase subunit B, brain isoform VATB2 P62814 11966
Neuronal membrane glycoprotein M6-a GPM6A P35802 234267
L- lactate dehydrogenase B chain LDHB P16125 16832
Heat shock cognate 71 kDa protein HSP7C P63017 15481
Predicted Tmem181b B2RVR2 547127
Uncharacterized protein Spnb4 E9PX29 80297
Cytochrome b- c1 complex subunit 2, mitochondrial QCR2 Q9DB77 67003
GTP-binding nuclear protein Ran RAN P62827 19384
Cofilin-1 COF1 P18760 12631
실시예 5: O- GlcNAc 수식화 위치의 확인
실시예 4에서 분리 동정한 5개의 공지된 O-GlcNAc 단백질 중 하기 표 3에 나타난 4개의 단백질에 대한 질량분석 및 아미노산 서열 분석 결과 질량 태그 d0DTT로 인해 질량이 증가한 아미노산의 위치를 확인할 수 있었으며 이를 통해 수식화 위치의 가능성을 예상해 볼 수 있다.
번호 단백질 펩타이드 서열 확률
1 60 kDa heat shock protein, mitochondrial TVIIEQS[223]WGSPK 0.9999
2 Beta-synuclein TSGVVQGVAS[223]VAEK 0.9978
3 Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial AVAQGNLSS[223]ADVQAAK 0.9117
4 Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 TDEFQLHTNVNDGTEFGGS[223]IYQK 0.9954

Claims (9)

  1. 삭제
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  5. 1) 분석대상 샘플에 대하여 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 컬럼에 흡착된 인산화 펩타이드와 컬럼에 흡착되지 않은 O-GlcNAc 펩타이드를 분리하는 단계;
    2) 컬럼에 흡착된 인산화 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하고, 컬럼에 흡착되지 않은 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드에 대하여 티올 친화성 크로마토그래피를 수행하여 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 정제하는 단계; 및
    4) 정제된 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)로 분석하여 비교하는 단계를 포함하는 동일 분석대상 샘플 내 인산화 펩타이드와 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량 정량 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 1)의 금속 친화성 크로마토그래피에 사용되는 금속은 TiO2, ZrO2, GaO4 또는 FeO2 인 방법.
  7. 1) 제1 분석대상 샘플 및 제2 분석대상 샘플에 대하여 각각 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하여 인산화 펩타이드를 컬럼에 흡착시켜서 제거하는 단계;
    2) 단계 1)에서 인산화 펩타이드를 제거한 제1 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제1 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하고, 인산화 펩타이드를 제거한 제2 분석대상 샘플 내의 O-GlcNAc 펩타이드에는 BEMAD 방법을 이용하여 제2 질량 태그 표지된 디티오트레이톨 친화성 태그를 부가하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드에 대하여 티올 친화성 크로마토그래피를 수행하여 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 정제하는 단계; 및
    4) 정제된 제1 또는 제2 질량 태그 표지된 펩타이드를 각각 고성능 액체 크로마토그래피-질량분석기 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)로 분석하여 비교하는 단계를 포함하는 상이한 분석대상 샘플 내 O-GlcNAc 펩타이드의 상대량 정량 분석 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 단계 1)의 금속 친화성 크로마토그래피에 사용되는 금속은 TiO2, ZrO2, GaO4 또는 FeO2 인 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제1 분석대상 샘플은 정상 상태의 샘플이고 제2 분석대상 샘플은 질병 상태의 샘플인 방법.
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