CN102395886B - 用于对修饰的肽进行定量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供定量样品中修饰肽的方法，包括：(a)从样品中获得肽；(b)将参考修饰肽添加到步骤(a)获得的肽中，产生肽与参考修饰肽的混合物；(c)在所述肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MS)以获得与样品中的肽相关的数据；和(d)使用计算机程序将样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；其中通过以下方法编撰所述修饰肽的数据库：(i)从样品中获得肽；(ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；(iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；(iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，鉴定所述修饰肽；和(v)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。

Description

用于对修饰的肽进行定量的方法
本发明涉及用于对修饰的肽进行定量的方法，尤其是涉及用于对磷酸化的肽进行定量的方法。此类方法用于例如鉴定和定量蛋白上的磷酸化位点，以及用于定量蛋白激酶的活性。
多数蛋白通过添加官能团而以一定方式被修饰，这些修饰可以通过质谱法来检测。
可以通过质谱法检测的蛋白修饰包括磷酸化、硝化、糖基化、乙酰化、甲基化和脂化。这些蛋白修饰在细胞中具有多种生物学功能。
质谱法(MS)是分析技术，其测定当分子或原子被离子化、蒸气化并被导入能够根据它们的质荷比分离这些离子的仪器时，所形成的离子的质荷比(m/z)。质谱法还包括将分子分解为片段，因此能够测定分子的结构。MS与液相色谱法的物理分离技术的组合被称作液相色谱-质谱法(LC-MS)。
在典型的MS程序中，样品被载入MS仪器，存在于该样品中的化合物被离子化，例如，通过电喷射离子化(ESI)或基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)。然后，通过不同形式的质量分析器，例如飞行时间、离子捕获或四极或这些的组合，来计算离子的质荷比。
正常细胞的动态平衡由信号传导途径的作用控制，当所述作用被下调时，也引起很多疾病，包括癌症、神经退化、过敏和糖尿病。蛋白和脂激酶是这些途径的主要成员，因此，这些酶代表用于治疗很多疾病的药物靶的最重要的类别之一。
已经报道了用于无偏(unbiased)检测酶活性的方法。可以使用化学探针来共价连接酶活性位点中的有反应活性的氨基酸(Blethrow，J.D.等人，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)105，1442-1447(2008))或底物上的有反应活性的氨基酸(Barglow，K.T.&Cravatt，B.F.Nat Methods(自然方法)4，822-827(2007))。将连接于探针的蛋白亲和纯化并通过质谱法测定它们的性质。该方法可以检测活性和底物，但是其需要大量的细胞，并且所提供的信息仅为定性的。
作为更加定量化的方法，已知为特定激酶的底物的蛋白上的磷酸化位点的定量是激酶活性的度量。当使用质谱作为读出来执行时，该方法允许在单一实验中定量数百至数千个磷酸化位点。例如，使用以稳定同位素进行的代谢标记(SILAC方法)，可以定量以EGF处理HeLa细胞之后显示出改变的表达水平的大于2000个磷酸化位点(Olsen，J.V.等人，Cell(细胞)127，635-648(2006))。然而，由于细胞需要保持代谢活性以引入标记的氨基酸，所以该方法不能用作一般性工具来定量原代组织中的信号传导，并且其低通量限制了其有用性。
使用同位素标记的内部标准肽来测定磷酸化的肽可以是替代方式(Gerber，S.A.等人，Proc Nat/Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)100，6940-6945(2003))，但是，虽然在理论上是可能的，但是在实际中不可能合成数以千计的以稳定同位素标记的磷酸化的肽以用作内部标准。
iTRAQ试剂可用于以稳定同位素化学地标记肽(Ross，P.L.；等人，Mol Cell Proteomics(分子和细胞蛋白质组学)2004，3，(12)，1154-69.)。该技术可用于肽、包括修饰肽的相对定量。其局限性在于：可以被比较的样品数受到同位素标记物数目的限制，对于获得数据的统计学验证，这对其有用性增加了限制。在临床环境中，化学标记也是不实际的，可能在化学反应步骤引入差异性。
因此，本领域需要可用于无偏、全面且精确地测定原代组织中的信号传导的方法。
本发明人发明了改进的用于定量修饰的肽尤其是磷酸化的肽的方法。该方法包括产生修饰的肽的数据库和将该数据库与获自生物样品的数据进行比较，通常使用计算机程序进行。
在第一方面，本发明提供了用于定量样品中的修饰肽的方法，该方法包括：
(a)从样品中获得肽；
(b)将参考修饰肽添加到步骤(a)中获得的肽中，以产生肽与参考修饰肽的混合物；
(c)在所述肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MS)以获得与样品中的肽相关的数据；和
(d)使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；
其中通过以下方法编撰所述修饰肽的数据库：
i)从样品中获得肽；
ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；
iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；
iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽；和
v)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。
本发明提供了用于定量样品中的修饰肽的方法。本发明的方法适合于定量含有可通过质谱检测的任何修饰的肽。
本发明的方法用于定量源自较长的蛋白的修饰肽。本发明的方法可用于同时定量数以千计的修饰肽。
本发明的方法特别适合于定量样品中的磷酸化的肽，因此，在一个实施方式中，所述修饰肽是磷酸化的肽。在本发明的该实施方式中，术语“磷蛋白(phosphoprotein)”本文中用于指磷酸化的蛋白，术语“磷酸肽(phosphopeptide)”在本文中用于指磷酸化的肽。
本发明的方法还用于定量通过例如乙酰化、硝化、糖基化、甲基化和/或脂化修饰的肽。
本发明的方法用于定量任意含有肽的样品中的修饰肽。所述样品通常是生物样品，因此可以是获自生物来源的任何类型的样品，例如，获自人、动物、植物或细菌的样品。因此，本发明包括使用获自人和非人来源的样品。
本发明的方法用于检测和定量来自任何目标物种的样品的修饰肽。通常而言，本发明的方法用于分析来自人或动物的样品。所述动物通常是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、母牛、绵羊或山羊。所述动物备选为鸟类例如鸡，鱼类例如斑马鱼，线虫类例如蠕虫，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，或昆虫例如果蝇，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。本发明的方法也可用于分析来自其它生命形式例如细菌和酵母的样品。本发明的方法可用于分析来自在实验上具有重要意义的细菌物种的样品，所述细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或酵母，例如面包酵母，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。本发明的方法也可用于分析来自植物或真菌或病毒的样品。
通常而言，生物样品源自人，并且可以是例如体液样品，例如尿或血液，或其它组织。通常而言，生物样品是细胞系或组织，通常是原代组织。例如，样品可以是来自人或动物的组织。人或动物可以是健康的或患病的。
在本发明的一些实施方式中，在进行本发明的方法之前，以测试底物处理样品本身或该样品所获自的生物。因此，在该实施方式中，在细胞系或组织上进行本发明的方法之前，以测试底物处理细胞系或组织所获自的生物。所述测试底物通常是外源化学品或药物，例如小分子抑制剂、RNAi、治疗肽和抗体。本发明的该实施方式允许研究测试底物对于肽修饰的效应。例如，在一个实施方式中，当本发明的方法用于定量磷酸化的肽时，可以在实施本发明的方法之前，以途径激动剂和/或激酶抑制剂处理细胞系。典型的激酶抑制剂包括PI3K的抑制剂，例如渥曼青霉素和PI-103，如实施例中所使用。至少有80种激酶抑制剂处于临床开发的不同阶段(Zhang，J.；等人，Nat RevCancer(自然综述癌症)2009，9，(1)，28-39.)。该技术也用于研究怀疑对激酶途径具有效应的其它类型的抑制剂，例如HSP90抑制剂，磷酸酶抑制剂和抗体药物。
本发明的方法的步骤(a)包括从样品中获得肽。可以使用本领域已知的任何适宜方法从样品中获得肽。
在一个实施方式中，本发明的方法的步骤(a)包括：
(1)裂解样品中的细胞；
(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和
(3)将所述蛋白切割为肽。
在本发明的该实施方式的步骤(1)中，将样品中的细胞裂解或裂开。可以使用本领域已知的任何适宜方法来裂解细胞，例如使用物理方法，例如机械裂解(例如使用Waring搅拌器)、液体匀浆、超声或人工裂解(例如使用杵和钵)或基于去污剂的方法，例如CHAPS或Triton-X。通常而言，使用变性缓冲液例如基于脲的缓冲液来裂解细胞。
在本发明的该实施方式的步骤(2)中，从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白。换言之，从裂解的细胞的其它成分中分离蛋白。
在本发明的该实施方式的步骤(3)中，将来自裂解的细胞的蛋白切割为肽。换言之，将蛋白分解为较短的肽。蛋白分解也通常被称作消化。在本发明中可以使用本领域已知的任何适宜的试剂进行蛋白的切割。
通常使用蛋白酶进行蛋白切割或消化。本发明中可以使用任何适宜的蛋白酶。在本发明中，蛋白酶通常是胰蛋白酶、糜蛋白酶、Arg-C，胃蛋白酶，V8，Lys-C，Asp-C和/或AspN。备选地，可以例如使用羟胺、甲酸、溴化氰、BNPS-粪臭素，2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)或任何其它适宜的试剂化学地切割蛋白。
用于本发明中并且通常按照如上所述的步骤(3)通过蛋白切割或消化而产生的肽适合用于质谱分析中。通常而言，此类肽的长度为大约5至30个氨基酸，例如7至25个氨基酸，10至20个氨基酸，12至18个氨基酸，或14至16个氨基酸。然而，也可以使用更短和更长的肽，例如大约2至大约50，例如大约3至大约40，或大约4至大约45个氨基酸。可以被分析的肽的长度受到质谱仪对此类长肽进行测序的能力的限制。在一些情况下，可以分析长达300个氨基酸的多肽。
在本发明的方法的步骤(b)中，将参考修饰肽加入到获自样品的肽中以产生肽与参考修饰肽的混合物。因此步骤(b)产生一个肽混合物(包括修饰的肽)/样品。参考修饰肽在本文中也被称作“内部标准”(ISs)。通常而言，加入5至10，例如6至9，或7至8个参考修饰肽。
在本发明中，参考修饰肽通常是参考磷酸化的肽。此类参考磷酸化的肽通常源自确定性质和浓度的参考蛋白，经常被称作内部标准(IS)蛋白。ISs可以是商业上可获得的蛋白，例如酪蛋白。备选地，特别针对用于本发明而合成ISs。在本发明的该实施方式中，通常按照与需要定量的一些磷酸化的肽相同的序列来合成参考磷酸化的肽，但是在碳和氮的稳定的重同位素中富集。通常使用固相合成化学法合成肽，其中一次添加一个氨基酸以形成氨基酸链或多肽。通常而言，在替代常规的12C和14N的13C和15N中富集此类肽。该富集引起参考磷酸化的肽比具有相同序列的内源性磷酸化的肽更重大约6-10道尔顿，从而可以使用质谱法区分它们。
在本发明的另一个实施方式中，当本发明的方法用于定量乙酰化肽，参考修饰肽是参考乙酰化肽。此类参考乙酰化肽通常是含有乙酰化氨基酸的合成肽。
通常以已知的量在每个待比较的样品中添加参考修饰肽。在下游分析中，针对参考修饰肽的信号标准化内源性修饰肽的信号。
在一个实施方式中，本发明的步骤(b)还包括从获自步骤(b)的肽与参考修饰肽的混合物富集修饰肽，以产生富集的修饰肽的混合物。因此，该另外的步骤产生富集的修饰肽的单一混合物/样品。因此，在本发明的该实施方式中，步骤(c)包括在所述富集的修饰肽的混合物上进行质谱(MS)，以获得与样品中的肽相关的数据。在本发明的该实施方式中，步骤(b)通常产生富集的磷酸化的肽的混合物。
通常使用色谱法进行富集修饰肽的步骤。在一个实施方式中，色谱是固定的金属离子亲和色谱(IMAC)，二氧化钛(TiO2)色谱，和/或二氧化锆(ZrO2)色谱。通常而言，色谱是IMAC和TiO2色谱。
备选地，使用基于抗体的方法进行富集修饰肽的步骤。
在本发明的一个实施方式中，当被定量的肽是磷酸化的肽时，将具有针对磷酸化氨基酸例如酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸或组氨酸的亲和性的抗体连接(固定)于固体基质。通过这些抗体特异性结合磷酸化的肽的能力来富集磷酸化的肽。然后洗掉非磷酸化的肽，而磷酸化的肽保留在抗体包被的基质上。通常使用低pH溶剂或通过任何其它合适的使抗体与磷酸化的肽之间的相互作用变性的方法将磷酸化的肽从固定的抗体上洗脱。
在本发明的另一个实施方式中，当被定量的肽是乙酰化肽时，通过使用针对乙酰化氨基酸残基的特定抗体来富集乙酰化肽。将此类抗体连接于固体基质，然后通过抗体特异性结合乙酰化氨基酸残基的能力来富集。然后洗掉非乙酰化肽，而乙酰化肽保留在固定的抗体上。
在本发明的方法的步骤(c)中，在获自步骤(b)的肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MS)以获得与样品中的肽相关的数据。通常而言，该数据的形式为针对样品的MS数据文件。在本发明的一个实施方式中，当本发明的方法的步骤(b)进一步包括从获自(b)的肽与参考修饰肽的混合物中富集修饰肽以产生富集的修饰肽的混合物时，步骤(c)包括在所述富集的修饰肽的混合物上进行质谱(MS)，以获得与样品中的肽相关的数据，通常是针对样品的MS数据文件。通常而言，质谱是液相色谱-质谱(LC-MS)。因此，步骤(c)通常产生LC-MS数据文件(一个样品一个文件)。
与样品中的肽相关的数据通常包括肽的质荷比(m/z)，电荷(z)和/或相对保留时间。
在本发明的方法的步骤(d)中，使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据(通常是MS数据文件的形式，更通常是LC-MS数据文件的形式)与修饰肽的数据库中的数据进行比较。例如，将样品中的肽的质荷比(m/z)，电荷(z)和/或相对保留时间与数据库中修饰肽的质荷比(m/z)，电荷(z)和/或相对保留时间进行比较。这使得能够使用修饰肽的数据库鉴定并定量样品中的每个稀释肽。
通常而言，计算机程序是被称作PESCAL的程序(Cutillas，P.R.；Vanhaesebroeck，B.Mol Cell Proteomics(分子和细胞蛋白质组学)6(9)，1560-73，2007)。PESCAL构建所有待比较的样品的数据库中存在的每个修饰肽的提取离子色谱(XIC，即洗脱谱)。这是通过集中之前被鉴定为磷酸化的肽(即，存在于在该程序的第一步中构建的数据库中)的m/z和保留时间上的XIC而进行的。PESCAL还考虑肽的电荷以辅助性质的正确排列。该程序还计算每个XIC曲线下的峰的高度和面积。通过将每个被分析的修饰肽的强度读数(峰面积或高度)除以参考修饰肽的强度读数来标准化数据。
在本发明的方法中，通过包括以下步骤的方法编撰修饰肽的数据库：
(i)从样品中获得肽；
(ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；
(iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；
(iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽；和
(v)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。
本发明的方法的步骤(i)包括从样品获得肽。可以使用本领域已知的任何适宜方法从样品获得肽。
样品通常是生物样品，并且可以是如上所述的获自生物来源的任何类型的样品。通常而言，样品是细胞系或原代组织。
在本发明的一些实施方式中，当步骤(i)中使用的样品是细胞系时，在进行步骤(i)之前以抑制剂处理所述样品。所述抑制剂可以是任何适宜类型的抑制剂。通常而言，当本发明的方法用于定量磷酸化的肽时，所述抑制剂是磷酸酶抑制剂。以磷酸酶抑制剂处理增加磷酸化的化学计量，并产生可以包含于数据库中的更大数目的磷酸化的肽。此外，当目的是定量甲基化和乙酰化的肽时，可以分别使用甲基转移酶抑制剂或乙酰水解酶抑制剂。
在一个实施方式中，本发明的步骤(i)包括：
(1)裂解样品中的细胞
(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和
(3)使用与上文所述的步骤(a)中的步骤(3)相同的方法将所述蛋白切割为肽。
在本发明的该实施方式的步骤(1)中，将样品中的细胞裂解或裂开。可以使用本领域已知的任何适宜方法来裂解细胞，例如使用物理方法，例如机械裂解(例如使用Waring搅拌器)、液体匀浆、超声或人工裂解(例如使用杵和钵)或基于去污剂的方法，例如CHAPS或Triton-X。通常而言，使用变性缓冲液例如基于脲的缓冲液来裂解细胞。
在本发明的该实施方式的步骤(2)中，从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白。换言之，从裂解的细胞的其它成分中分离蛋白。
在本发明的该实施方式的步骤(3)中，使用与上文所述的步骤(a)中的步骤(3)相同的方法将来自裂解的细胞的蛋白切割为肽。因此，步骤(i)的步骤(3)产生肽包括修饰肽的混合物。
在本发明中可以使用本领域已知的任何适宜的试剂进行蛋白的切割。然而，如上所述，步骤(i)的步骤(3)中使用的切割方法必须与上文所述的步骤(a)的步骤(3)中使用的切割方法相同。通常使用蛋白酶进行蛋白切割或消化。本发明中可以使用任何适宜的蛋白酶。在本发明中，蛋白酶通常是胰蛋白酶、糜蛋白酶、Arg-C，胃蛋白酶，V8，Lys-C，Asp-C或AspN。备选地，可以例如使用羟胺、甲酸、溴化氰、BNPS-粪臭素，2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)或任何其它适宜的试剂化学地切割蛋白。
用于本发明中并且通常按照如上所述的步骤(3)通过蛋白切割而产生的肽适合用于质谱分析中。通常而言，此类肽的长度为大约5至30个氨基酸，例如7至25个氨基酸，10至20个氨基酸，12至18个氨基酸，或14至16个氨基酸。然而，也可以使用更短和更长的肽，例如大约2至大约50，例如大约3至大约40，或大约4至大约45个氨基酸。可以被分析的肽的长度受到质谱仪对此类长肽进行测序的能力的限制。在一些情况下，可以分析更长的，长达300个氨基酸的多肽。
在本发明的方法的步骤(ii)中，从步骤(i)中获得的肽中富集修饰肽。因此，步骤步骤(ii)产生富含修饰肽的数种级分。
通常使用多维色谱进行步骤(ii)中的修饰肽的富集。在一个实施方式中，使用强阳离子交换高效液相色谱(SCX-HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行所述多维色谱。在另一个实施方式中，使用阴离子交换高效液相色谱(SAX-HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行所述多维色谱。在本发明的这些实施方式中，连续进行色谱技术。
备选地，使用基于抗体的方法进行步骤(ii)中的修饰肽的富集。
在本发明的一个实施方式中，当被定量的肽是磷酸化的肽时，将具有针对磷酸化氨基酸例如酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸或组氨酸的亲和性的抗体连接于固体基质。通过这些抗体特异性结合磷酸化的肽的能力来富集磷酸化的肽。然后洗掉非磷酸化的肽，而磷酸化的肽保留在抗体包被的基质上。通常使用低pH溶剂或通过任何其它合适的使抗体与磷酸化的肽之间的相互作用变性的方法将磷酸化的肽从固定的抗体上洗脱。
在本发明的另一个实施方式中，当被定量的肽是乙酰化肽时，通过使用针对乙酰化氨基酸残基的特定抗体来富集乙酰化肽。将此类抗体连接于固体基质，然后通过抗体特异性结合乙酰化氨基酸残基的能力来富集。然后洗掉非乙酰化肽，而乙酰化肽保留在抗体包被的基质上。
在本发明的方法的步骤(iii)中，在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)。
在本发明的方法的步骤(iv)中，将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽。该步骤通常使用商业上可获得的搜索引擎进行，例如但不限于MASCOT、ProteinProspector Phenyx或Sequest搜索引擎。
在本发明的方法的步骤(v)中，将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。该数据库列出在随后的生物实验中定量磷酸化的肽所需的所有参数。通常而言，与修饰肽相关的数据包括修饰肽的本性、质荷比(m/z)，电荷和/或相对保留时间。这允许将与样品中的肽相关的数据(通常为样品中的肽的质荷比(m/z)，电荷(z)和相对保留时间)与数据库中修饰肽的这些值进行比较，因此允许鉴定并定量样品中的修饰肽。
对于可以使用本发明的方法比较的样品的数目没有限制。
本发明的方法通常用于定量磷酸化的肽。在该实施方式中，本发明的方法是用于靶向和深度定量信号传导的技术(被称作TIQUAS)，其允许灵敏、迅速且广泛地定量信号传导途径的活性。在一个简单的检验中，该方法可以同时测定蛋白上的数以千计的磷酸化位点。
因此，本发明的方法在信号传导途径的分析中有用，因此信号传导途径的流在很大程度上受脂和蛋白激酶、使蛋白磷酸化的酶的控制。
根据本发明的该实施方式的方法相对于使用质谱来定量磷酸化的肽的其它方法具有优点(见表1)。这些优点包括广泛性(可以定量数以千计的磷酸化的肽)、通量(分析时间是大约2小时/样品或大约20个样品/天/LC-MS)、该技术的比较不受限数目的样品的能力，以及其优越的灵敏性(因为定量无需通过串联质谱(MS/MS)鉴定肽)。与之比较：SILAC实验需要大约3周来比较至多3个样品；这是因为细胞需要在SILAC培养基中生长大约2周，并且对于每次实验需要深入的分离。
表1的参考文献
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在一个实施方式中，本发明提供了用于定量样品中的磷酸化的肽的方法，该方法包括：
(a)从样品中获得肽；
(b)任选地，将参考磷酸化的肽添加到步骤(a)中获得的肽中，以产生肽与参考磷酸化的肽的混合物；并从步骤(b)中获得的肽与参考磷酸化的肽的混合物中富集磷酸化的肽，以产生富集的磷酸化的肽的混合物；
(c)在所述肽与参考磷酸化的肽的混合物上或所述富集的磷酸化的肽的混合物上进行质谱(MS)以获得与样品中的肽相关的数据；和
(d)使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据与磷酸化的肽的数据库中的数据进行比较；
其中通过以下方法编撰所述磷酸化的肽的数据库，其包括：
(i)从样品中获得肽；
(ii)从获自步骤(i)的肽富集磷酸化的肽；
(iii)在获自步骤(ii)的富集的磷酸化的肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；
(iv)将步骤(iii)中检测的磷酸化的肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述磷酸化的肽；和
(v)将与步骤(iv)中鉴定的磷酸化的肽相关的数据编撰成数据库。
在一个实施方式中，本发明提供了用于定量样品中的磷酸化的肽的方法，如图1所示。
在一个实施方式中，本发明提供了如下的用于定量样品中的磷酸化的肽的方法。该方法在本文中被称作TIQUAS。TIQUAS技术的基础在于构建可以通过LC-MS检测和定量的磷酸化的肽的数据库。该数据库列出在随后的生物实验中定量磷酸化的肽所需的所有参数，包括磷酸化的肽的本性、质荷比(m/z)，电荷和/或相对保留时间。通过使用多维色谱(例如强阳离子交换、IMAC和TiO2)通过富集磷酸化的肽来构建数据库。然后通过LC-MS/MS分析富集的磷酸化的肽的级分以鉴定磷酸化的肽。数据库的构建需要大约2至3周的质谱时间，但是一旦其构建完毕，其可用于以良好的通量和灵敏性进行生物学实验。
本发明人已经写了一个被称作PESCAL的计算机程序(Cutillas和Vanhaesebroeck，Molecular&Cellular Proteom ics(分子和细胞蛋白质组学)6，1560-1573(2007))，该程序使得在运行获自生物实验的磷酸化的肽的LC-MS时，数据库中所列的每种磷酸化的肽的定量自动化。对于这些生物学实验，使用胰蛋白酶或其它适宜的蛋白酶消化细胞裂解物中的蛋白。以已知的量将磷酸肽内部标准(其为参考磷酸化的肽)掺入到所有待比较的样品中。使用简单易行的IMAC或TiO2提取步骤富集得到的肽混合物中的磷酸化的肽。在大约120分钟(总循环)的单一LC-MS运行中分析富集的磷酸化的肽。然后PESCAL构建所有待比较的样品的数据库中存在的每种磷酸化的肽的提取离子色谱(XIC，即洗脱谱)。该程序还计算每个XIC曲线下的峰的高度和面积。通过将每个被分析的磷酸肽的强度读数(峰面积或高度)除以磷酸肽ISs的强度读数来标准化数据。
该磷酸蛋白组学方法允许比较不受限数目的样品和重复。
在另一个实施方式中，本发明的方法是用于定量样品中的乙酰化肽的方法。乙酰化的定量分析包括使用合适的蛋白酶例如胰蛋白酶消化细胞裂解物中的蛋白，以产生数以千计的肽。然后通过使用针对乙酰化氨基酸残基的特定抗体富集乙酰化的肽。含有乙酰化氨基酸的合成肽用作内部标准，在富集步骤之前掺入到样品中。然后使用LC-MS/MS鉴定这些乙酰化的肽，然后将其并入数据库中。通过LC-MS在单一样品中鉴定乙酰化的肽，采用数据库中的条目作为参考。
现在将通过参考以下实施例进一步描绘本发明，以下实施方式仅是为了解释的目的而呈现。在实施例中，参考多个附图，其中：
图1是解释本发明的实施方式的流程图。该流程图的注释如下：1以磷酸酶抑制剂处理增加了磷酸化的化学计量，并产生可以包含于数据库中的更大数目的磷酸化的肽。2蛋白酶通常是胰蛋白酶、糜蛋白酶、Arg-C、胃蛋白酶、V8、Lys-C、Asp-C或AspN。3通常使用强阳离子交换，高效液相色谱(HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱，或备选地使用阴离子交换、高效液相色谱(HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行多维色谱。在另一个替代方式中，可以使用基于抗体的方法。4生物样品可以是任何适宜的生物样品，通常是细胞系(任选以研究试剂处理)或来自动物或患者的原代组织。对于可以比较的样品数目没有限制。5内部标准是参考磷酸化的肽，并且以已知的量加入到每个待比较的样品中。在下游分析中将内源性磷酸化的肽的信号针对内部标准肽的信号进行标准化。
图2显示了使用TIQUAS定量分析细胞信号传导的策略，其中(A)显示了实验设计；(B)给出了所获得的数据的总结(4个独立的生物学重复)；和通过概率分类的数据的快照；(C)是来自蛋白磷酸酶1(PP1)调节亚基11的磷酸化的肽的提取离子色谱(XIC)的实例；(D)显示了之前被证明在PI3K的下游的蛋白上的磷酸化位点的实例。
图3显示了在实施例1中描述的分析中鉴定的磷酸化位点的实例。
图4(A)显示了具有不同的针对PI-103的敏感性的细胞系中的PI-103对于增殖抑制的IC50；和(B)显示了使用本发明的方法在相同的细胞系中对于磷酸肽定量的结果。表格显示了具有阳性相关性的磷酸肽(在抗性更高的细胞系中的高度磷酸化)。
图5显示了通过无标记物的LC-MS进行磷酸肽的准确定量的策略。(A)显示促分裂原活化蛋白激酶3(pERK1)肽(IADPEHDHTGFLTEpYVATR)的MS谱：m/z＝751.33939，tR＝54.54min，z＝3)。(B)该m/z±25ppm的提取离子色谱(XIC)产生4个可能的候选物。(C)应用另外的电荷和同位素分布限制之后，该肽的色谱洗脱峰可以被准确鉴定(图中箭头所指的)，因为前三个同位素的XICs具有对应于光谱中所显示的相对强度(也可以从序列数据中计算同位素的相对强度)。(D)通过缩窄构建XIC的质量窗(±7ppm)达到了进一步的特异性。
图6显示：具有不同的针对信号传导抑制剂的敏感性的AML细胞系显示出显著不同的蛋白磷酸化模式。(A)、(B)和(C)：在存在所示的抑制剂的情况下培养AML细胞系72小时，并通过MTS检验法测定生存力。数据点显示为平均值±SEM(n＝3)。(D)、(E)和(F)：在如(A)、(B)和(C)中所述的具有不同的针对信号传导抑制剂的敏感性的细胞系中，通过TIQUAS鉴定的磷酸肽的实例被强烈(如通过倍数变化所测定)和显著(如通过t-检验统计法所测定)地差别化调节。
实施例1——对于PI3K信号传导的研究
使用本发明的新的定量技术定量NIH-3T3成纤维细胞中的磷酸化位点：使所述细胞饥饿，然后在以具有或不具有泛-PI3K抑制剂渥曼青霉素(WM)预温育的情况下使用血清刺激所述细胞。这些实验进行4次。
图2(A)显示了实验设计。按照标示处理细胞，以基于脲的缓冲液裂解细胞以获得细胞核以及细胞质蛋白，并消化蛋白。通过IMAC和TiO2色谱富集得到的磷酸化的肽，并使用由本发明人开发的计算机程序(PESCAL)(Cutillas和Vanhaesebroeck，Molecular&Cellular Proteomics(分子和细胞蛋白质组学)6，1560-1573(2007))通过LC-MS进行定量。
图2(B)给出了所获得的数据的总结，和通过概率分类的数据的快照。在数据库中检测到3,100个磷酸肽，在这些分析中定量了2,350个磷酸化的肽，其中265个受到在血清刺激前通过WM处理细胞的显著性(p＜0.05)影响。图2(B)中显示的磷酸肽的进一步信息列于表2。
图2(C)是来自PP1调节亚基11的磷酸化的肽(CCCIpYEKPR；XIC＝m/z 683.26)的提取离子色谱的实例，证明该位点对于WM敏感。
图2(D)显示了之前被证明在PI3K下游的蛋白上的磷酸化位点的实例。分别显示了4个独立实验的数据以证明实验的可再现性。这些位点已知在PI3K的下游，因此这些数据验证了本发明的方法。该磷酸蛋白质组方法允许比较不受限数目的样品和重复。
在受到以WM处理细胞的影响的蛋白激酶和磷酸酶，以及转录和翻译因子上鉴定了数个磷酸化位点(图3)。数值是4次独立实验的经标准化的平均磷酸化的肽水平。使用student’s t检验对血清组与WM样品组的平均值计算p值。图3中显示的磷酸肽的进一步信息列于表3。
表3
实施例2——具有针对PI3K和mTOR的双重抑制剂的多种敏感性的 细胞中的信号传导的研究
要求保护的技术也用于研究具有针对PI-103的多种敏感性的一组细胞系中的激酶途径，PI-103是脂激酶PI3K和蛋白激酶mTOR的抑制剂。
使用滴定浓度的PI-103温育图4A中显示的组中的细胞系，并测定它们的增殖速率作为抑制剂浓度的函数。抑制剂浓度表示为IC50(产生50％抑制时的抑制剂浓度)，浓度单位为微摩尔(图4A)。
在单独实验中(图4B)，使用所公开的技术定量这些细胞系中的磷酸肽。实验进行三次。如图4B所示，数种磷酸肽与IC50值相关联，因而说明抑制剂功效与激酶途径激活的因果关系。这些值与统计上的显著性相关(高于0.75的R2值是统计上显著的)。此外，抗性和敏感性细胞系的平均磷酸肽信号的统计学测试(student’s t-检验test)也是显著的。这些磷酸肽可以代表抑制剂功效的新的生物标志物，并且也可以解释这些抑制剂的作用模式。
实施例3——研究与癌细胞对激酶抑制剂的敏感性相关的激酶途径的 激活
分析策略
本实施例中使用的TIQUAS方法包括使用LC-MS以靶向之前通过LC-MS/MS鉴定的磷酸肽的定量。使用本文描述的计算机程序PESCAL(Cutillas，P.R.；Vanhaesebroeck，B.Mol Cell Proteomics(分子和细胞蛋白质组学)6(9)，1560-73，2007)自动化进行该分析。PESCAL执行给定分子离子的前三种同位素的提取离子色谱(XIC)。这允许鉴定肽离子的电荷并计算同位素的相对强度，然后同位素的相对强度可以与理论同位素分布相关联。
图5诠释了该分析的原理，其将高分辨率且高质量精确性的质谱与新形式的Pescal组合，以特异性并可信赖地鉴定色谱峰以用于无标记物的定量。由于这是靶向的方法，其中通过单一的LC-MS/MS运行分析样品，所以避免了数据依赖性实验中的取样不足的问题。该方法的特征在于其在不受限数目的样品和重复上提供深度定量信息的能力，具有足够的通量使其用作常规的磷酸蛋白质组学工具。
白血病细胞中的药物应答的TIQUAS分析
研究了8种AML细胞系对于AML进展关键性途径中的激酶的一组抑制剂的应答，所述途径为JAK、MEK和PI3K途径。以浓度渐增的LY294002、PI103和IC87114(以PI3K作为主要靶标的抑制剂)、MEK抑制剂(MEK I，Calbiochem)、JAK抑制剂(JAK I，Calbiochem)和FLT3抑制剂(Calbiochem)处理细胞。这些激酶都是治疗多种形式的癌症的潜在药物靶标；然而，对于使细胞对于它们的抑制易感的机理知之甚少。我们实验组中的细胞系的增殖对于这些激酶抑制剂的功能显示出宽范围的敏感性，这反映了临床状况：患者可能对癌症药物具有不同程度的应答。
然后TIQUAS方法用于比较HEL相对于AML-193(对于JAK I具有抗性和敏感性)、P31/FUJ相对于MV4-11(对于PI-103具有抗性和敏感性)、以及HEL相对于MV4-11(对于MEK I具有抗性和敏感性)中的基础磷酸化水平；这些实验进行一式三份(图6A，B和C)。在这些分析中鉴定了3000种以上的磷酸肽。在这些细胞系中共定量了1095中磷酸肽，其中数百个在敏感性和抗性细胞系之间显示出显著(p＜0.05)和强烈的(＞2倍)差异(这些的实例显示于图6D、E和F)。
材料和方法
细胞培养 急性骨髓性白血病细胞系(AML-193，CMK，CTS，HEL，Kasumi-1，KG-1，MV4-11和P31/FUJ)以及鼠NIH/3T3成纤维细胞在37℃在5％CO2的潮湿空气中常规培养于补充了10％牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的培养基中。将AML细胞系在额外补充了50μMβ-巯基乙醇的RPMI中维持在大约5to 10x105细胞/毫升。NIH-3T3成纤维细胞生长于DMEM培养基。
对于磷酸蛋白质组研究，在实验的前一天将AML细胞以5x105细胞/毫升接种于新鲜的培养基中。每个培养物在10ml中含有5x106个细胞，在3个独立的细胞培养物中进行。当测试药物抑制剂的效应时，以1μMPI-103，500nM MEK I抑制剂和500nM JAK I抑制剂(分别来自Calbiochem的528100，444937和420099)处理细胞1小时，然后收获。
通过在300xg离心10分钟收获细胞，然后以冰冷的含有1mM钒酸钠和1mM氟化钠的PBS洗涤2次。使用变性缓冲液(20mM HEPES pH8.0，8M脲，1mM钒酸钠，1mM氟化钠，2.5mM焦磷酸钠，1mMβ-甘油-磷酸)在10x106细胞/毫升的浓度进行裂解。通过超声进行进一步的蛋白溶解。通过在20000xg离心10分钟使裂解物碎片澄清，通过Bradford检验法测定上清液的蛋白浓度。然后将样品冷冻保存在-80℃，直至进一步分析。
AML细胞系对于药物处理的敏感性。对于每种条件，将8种细胞系(AML-193，CMK，CTS，HEL，Kasumi-1，KG-1，MV4-11和P31/FUJ)以1x105个细胞/ml以一式三份接种于96孔板中。恢复2个小时之后，以浓度渐增的(1nM，10nM，100nM，1μM和10μM)FLT3抑制剂、MEK I抑制剂、JAKI抑制剂、LY294002、PI-103和IC87114处理细胞。作为对照，以介质(DMSO)处理细胞以及保持细胞不进行处理。处理72小时之后，通过MTS检验测定细胞生存力(CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation assay(CellTiterAqueous单溶液细胞增殖测定法)，Promega Corporation(Promega公司)，Madison，WI，USA)。
消化和固相提取。
以4.1mM DTT和8.3mM碘乙酰胺在黑暗中和室温中进行样品还原和烷基化各15分钟。以HEPES pH8.0将样品稀释至2M脲之后，使用10TAME单位的固定的TLCK-胰蛋白酶/5x106细胞在37℃进行胰蛋白酶消化16小时。通过加入TFA至1％的终浓度以停止反应。根据生产商的说明书，使用Sep-Pak C18柱(Waters UK Ltd，Manchester，UK)将得到的肽溶液脱盐。使用5ml 50％ACN/0.1％TFA进行肽的洗脱。
固定金属离子亲和色谱(IMAC)。使用改编的IMAC富集程序(Alcolea，M.P.等人，J Proteome Res (蛋白质组研究杂志)8(8)，3808(2009))进行磷酸肽的分离。简而言之，在室温将每种样品与300μl Fe(III)-包被的琼脂糖高效珠子一起温育30分钟，所述珠子用作50％ACN/0.1％TFA中的50％浆料。丢弃未结合的肽并以300μl 50％ACN/0.1％TFA洗涤珠子两次。以300μl 1.5％的pH11的氨水洗脱富集的磷酸肽级分。使用含有50％ACN的50μl 1.5％的pH11的氨水进行的第二次洗脱允许进一步富集。洗脱的肽最终在SpeedVac中干燥并储存于-80℃。
纳米流-液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)。对于磷酸蛋白质组学实验，将干燥的磷酸肽富集的样品溶解于10μl 0.1％TFA中并在LC-MS/MS系统中分析。所述系统包含LTQ-Orbitrap XL质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Hemel Hempstead，UK)，其在线连接于纳米流超高压液相色谱仪(nanoAcquity，Waters/Micromass)，所述色谱仪的流速为5μL/分钟(上样)和400nL/分钟(洗脱)，其操作背压为大约3,000psi。在BEH 100μm x 100mm柱(Waters/Micromass)中进行分离。流动相为溶液A：LC-MS级别的水中的0.1％FA，以及溶液B：LC-MS级别的ACN中的0.1％FA。梯度运行为1％B至35％B，100分钟；然后在85％B洗涤5分钟、在1％B平衡7分钟。在LTQ-Orbitrap XL中以60000的分辨率在m/z 400获得全扫描测量谱(m/z 350-1600)。使用数据依赖性分析(DDA)，其中存在于测量谱中的5个丰度最高的多重带电粒子进行自动质量选择并通过碰撞诱导的解离(标准化的碰撞能35％)进行片段化。MS扫描之后进行5次MS/MS扫描(m/z50-2000)。限定于500个条目的排除列表、40秒的排除持续和10ppm的质量窗使得能够进行动态排除。
数据分析。使用Mascot Distiller进行LTQ-Orbitrap MS/MS数据的平滑化和集中化。使用Mascot搜索引擎，针对国际蛋白索引(IPI小鼠v3.49，165169个序列和IPI人v3.56，76539个序列)中的人或小鼠序列库检索经处理的文件。使用Mascot Daemon(v2.2.2；Matrix Science，London，UK)自动化进行检索。参数包括，选择胰蛋白酶作为消化酶，允许一个丢失的切割，脲基甲基(C)设定为固定修饰，Pyro-glu(N-末端)，氧化(M)和磷酸(STY)(Phospho(STY))是可变修饰。以±7ppm的质量容忍和±800mmu的片段质量容忍搜索数据集。当高于统计上显著的阈值时(期望值＜0.05)(如Mascot所返回)，命中被认为是显著性的。通过针对假数据库的检索而估计的假阳性率是大约2％。当被Mascot返回并且也存在于phosphoELM数据库中时，报告修饰位点。否则修饰位点被认为是不确定的；在此情况下，磷酸肽被报告为蛋白序列内的起始-末端残基。
将通过Mascot以统计上显著的阈值鉴定的磷酸肽置于通过LC-MS可定量的肽的数据库中。然后使用如本文描述的计算机程序PESCAL(Cutillas，P.R.&Vanhaesebroeck，B.Quantitative profile of five murine coreproteomes using label-free functional proteomics.(使用无标记蛋白质组学的五个鼠核心蛋白质组的定量谱)Mol Cell Proteomics (分子和细胞蛋白质组学)6，1560-1573(2007))。PESCAL定量在想要比较的所有样品的数据库中存在的肽的强度。PESCAL使用所选择的肽的m/z和保留时间来构建每个离子的前三种同位素的提取离子色谱(XICs)。这将限制性应用于分子质量、保留时间和电荷，其允许明确鉴定对应于所研究的磷酸肽的LC-MS洗脱谱。用于构建XIC的窗口分别是m/z为7ppm和保留时间为5分钟。然后可以通过测定每个单独的XIC的峰的高度来计算强度值。

Claims (19)

1.用于定量样品中的修饰肽的方法，所述方法包括：
(a)从样品中获得肽；
(b)从步骤(a)中获得的肽中富集修饰肽，以产生富集的修饰肽的混合物；
(c)在所述富集的修饰肽的混合物上进行质谱(MS)，以获得与样品中的肽相关的数据；和
(d)使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；
其中通过以下方法编撰修饰肽的数据库，所述方法包括：
i.从样品中获得肽；
ii.从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；
iii.在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；
iv.将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽；和
v.将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述修饰肽是磷酸化的肽。
3.根据权利要求1或权利要求2中所述的方法，其中所述样品是细胞系或原代组织。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)包括：
(1)裂解样品中的细胞；
(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和
(3)将所述蛋白切割为肽。
5.根据权利要求4中所述的方法，其中使用蛋白酶进行步骤(3)。
6.根据权利要求5中所述的方法，其中所述蛋白酶选自由胰蛋白酶、糜蛋白酶、Arg-C、胃蛋白酶、V8、Lys-C、Asp-C和AspN组成的组。
7.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(3)包括将所述蛋白切割为5-30个氨基酸的肽。
8.根据权利要求7中所述的方法，其中使用色谱进行富集修饰肽的步骤。
9.根据权利要求8中所述的方法，其中所述色谱选自由固定金属离子亲和色谱(IMAC)、二氧化钛(TiO2)色谱和二氧化锆(ZrO2)色谱组成的组。
10.根据权利要求7中所述的方法，其中使用基于抗体的方法进行富集修饰肽的步骤。
11.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与样品中的肽相关的数据包括肽的质荷比(m/z)、电荷(z)和相对保留时间。
12.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(c)中所述的质谱(MS)是液相色谱-质谱(LC-MS)。
13.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(i)包括：
(1)裂解样品中的细胞；
(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和
(3)使用与权利要求4的步骤(3)相同的方法将所述蛋白切割为肽。
14.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中使用多维色谱进行步骤(ii)。
15.根据权利要求14中所述的方法，其中使用强阳离子交换高效液相色谱(SCX-HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行所述多维色谱。
16.根据权利要求14中所述的方法，其中使用阴离子交换高效液相色谱(SAX-HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行所述多维色谱。
17.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中使用基于抗体的方法进行步骤(ii)。
18.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中使用MASCOT搜索引擎进行步骤(iv)。
19.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与修饰肽相关的数据选自由修饰肽的本性、修饰肽的质荷比(m/z)、电荷和相对保留时间组成的组。
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