WO2011007884A1 - タンパク質の定量方法 - Google Patents

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WO2011007884A1
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protein
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mrm
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敬一 中山
雅記 松本
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国立大学法人九州大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a protein quantification method using a multiple reaction monitoring (MRM) method. More particularly, the present invention relates to a method useful for measuring the absolute amount of a target protein contained in a protein mixture such as a biological sample.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • Life maintains its homeostasis through a network composed of many proteins. Since various diseases can be regarded as failure of homeostasis, the abundance of each protein in a living body can be a biomarker for elucidating the molecular mechanism of the disease, a diagnostic biomarker, or a prognostic criterion in treatment. For this purpose, it is necessary to achieve both high completeness and high sensitivity in protein detection and quantification, but there is no practically sufficient technique at present.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • peptides produced by enzymatic digestion etc. from one protein may range from several tens to several hundreds.
  • selection of a target peptide that contributes to the MRM method is an extremely important step in defining the sensitivity of the present method.
  • selection of a target peptide for this MRM method depends on a theoretical estimation method using a measured spectrum obtained by a shotgun / proteome analysis or according to a specific condition.
  • the MRM method is only recognized as a methodology for examining and confirming the results obtained by shotgun / proteome analysis etc., and is not expected to be used as a large-scale screening method.
  • the present invention is a method for absolute quantification of a target protein contained in a biological sample that is a mixture of various types of proteins, more preferably high-speed absolute quantification of the target protein, in view of the current state and problems of the protein quantification technology described above.
  • An object is to provide a method that can be realized. According to the method of the present invention, it is possible to convert the MRM method, which has conventionally been a means for analyzing a specific protein, into an ultrasensitive large-scale analysis method for a protein by utilizing genome information assets that have been enriched in recent years. It becomes possible.
  • the MRM method mass filter (Q1) and a gas collision-induced cleavage of passing ions (peptide here) having a specific mass (CID: C ollision I nduced D issociation) mass passing fragments produced by a filter of (Q3)
  • CID C ollision I nduced D issociation
  • mass passing fragments produced by a filter of (Q3)
  • the present invention has the following configuration: Item 1.
  • a method for identifying and quantifying a target protein in a test sample containing a plurality of proteins comprising the following steps (A) to (D): (A) A step of fragmenting a sample containing the target protein and labeling with a stable isotope X, (B) adding a known amount of an internal standard obtained by fragmenting the same standard protein as the target protein and labeling with the stable isotope Y to the sample obtained in the step (A), (C) A step of subjecting the sample obtained in the above step (B) to an LC-MS / MS apparatus and performing a multiple reaction monitoring (MRM) analysis using the MRM-transition selected for the internal standard, (D) In the MRM chromatogram detected in the above step (C), identify the peptide derived from the internal standard (the internal standard peptide) and the peptide derived from the target protein having the same retention time (target peptide).
  • Item 2. The method according to Item 1, wherein the MRM-transition is selected by a method having the following steps (1) to (3): (1) A step of preparing an internal standard by fragmenting a standard protein identical to the target protein and labeling with a stable isotope Y, (2) A step of subjecting the internal standard obtained in the above step (1) to an LC-MS / MS apparatus and determining a peptide fragment ionic strength corresponding to a peptide derived from the standard protein, (3) A step of selecting two or more fragment ions having a strong intensity per peptide, obtaining an average signal intensity, selecting two or more peptides in descending order of the average intensity, and selecting them as MRM-transition.
  • Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the step (C) or (D) is performed based on a calibration standard table prepared for a standard protein.
  • Item 4 The method according to Item 3, comprising the following steps (a) to (d) for preparing a calibration standard table for a standard protein: (A) fragmenting a known amount of standard protein and labeling with stable isotope Y to prepare an internal standard, (B) A step of subjecting the internal standard obtained in (a) above to an LC-MS / MS apparatus and performing a multiple reaction monitoring (MRM) analysis using the MRM-transition selected for the internal standard, (C) In the MRM chromatogram, a step of selecting two or more types of detected peptides in descending order of sensitivity, and listing them together with a retention time; (D) A step of storing the list created in step (c) for use as a calibration standard table of the standard protein.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • Item 5.2 The steps of (a) to (d) are repeated for standard proteins of two or more, and a calibration standard table is created and stored for each standard protein to construct a library of standard proteins. 4. The method according to 4.
  • protein fragments are not directly quantified, but peptide fragments obtained by digestion are quantified, so that they have various chemical properties without being affected by the solubility of protein molecules. Proteins can be handled in the same way.
  • Example 1 an MRM-transition selection method using PFTS will be described.
  • A shows the results of LC-MS / MS analysis of PFTS (mTRAQ-117 labeled p27 Kip1 digest) in a data-dependent automatic MS / MS acquisition mode. The horizontal axis represents time (minutes), and the vertical axis represents intensity (cps). However, specific numerical values are not particularly related to the essence of the invention.
  • B Search the database with MASCOT and ProteinPilot for the data obtained in A, select MRM-transition, and use PFTS (mTRAQ-117-labeled p27 Kip1 digest) as the sample in the selected MRM-transition.
  • FIG. 5 is a calibration curve in which the area ratio of mTRAQ-113 p27 Kip1 digest / mTRAQ-117 p27 Kip1 digest was calculated and plotted against the concentration of mTRAQ-113 p27 Kip1 digest.
  • Example 1 MRM analysis was performed using the MRM-transition (two types of peptides) of p27 Kip1 and a calibration curve prepared using PFTS (mTRAQ-117-labeled p27 Kip1 digest) and Skp2 gene knockdown cells The result of comparing the abundance (absolute amount) of p27 Kip1 in the middle (Skp2KD1-2 cells, Skp2KD3-10 cells) with control cells (Mock) is shown.
  • FIG. 4A shows a chromatogram obtained by MRM analysis. The horizontal axis represents time (minutes), and the vertical axis represents intensity (cps). However, specific numerical values are not particularly related to the essence of the invention.
  • FIG. 4A shows a chromatogram obtained by MRM analysis. The horizontal axis represents time (minutes), and the vertical axis represents intensity (cps). However, specific numerical values are not particularly related to the essence of the invention.
  • FIG. 4B shows, based on the results, p27 Kip1 in each cell extract (control cells (Mock), knockdown cells (Skp2 KD 1-2 cells), knockdown cells (Skp2 KD 3-10 cells)) (20 ⁇ g). The content of is shown.
  • an arrow a indicates a peak derived from a sample
  • an arrow b indicates a peak derived from an internal standard.
  • the method of the present invention is a method for identifying and quantifying a target protein contained in a test sample containing a plurality of proteins, and comprises the following steps (A) to (D): (A) A step of fragmenting a sample containing the target protein and labeling with a stable isotope X, (B) adding a known amount of an internal standard obtained by fragmenting the same standard protein as the target protein and labeling with the stable isotope Y to the sample obtained in the step (A), (C) A step of subjecting the sample obtained in the above step (B) to LC-MS / MS and performing a multiple reaction monitoring (MRM) analysis using the MRM-transition selected for the internal standard, (D) In the MRM chromatogram detected in the above step (C), identify the peptide derived from the internal standard (the internal standard peptide) and the peptide derived from the target protein having the same retention time (target peptide). A step of quantifying the target protein in the test sample from the comparison between the peak area of
  • test sample targeted by the method of the present invention is not particularly limited as long as it contains two or more proteins.
  • samples include samples (biological samples) derived from living organisms such as microorganisms, plants, and animals (including humans). Specific examples include blood, urine, saliva, hair, cells and cell tissues, processed products thereof, and protein-containing samples obtained by genetic recombination techniques.
  • Step (A) fragmentation treatment and labeling treatment
  • the target protein is first fragmented into peptide aggregates and then labeled with a stable isotope X.
  • a method of digesting the target protein with, for example, a proteolytic enzyme (protease) typified by trypsin or the like, or a chemical cleavage method typified by cyanogen bromide can be used. Digestion treatment with protease is preferable. It is known that a given molar amount of protein produces the same molar amount for each tryptic peptide cleavage product when protein degradative digestion proceeds to completion. Thus, by determining the molar amount of tryptic peptide for a given protein, it is possible to determine the molar amount of the original protein present in the sample.
  • the absolute amount of the target protein can be determined by determining the absolute amount of the peptide derived from the target protein contained in the protease digest (aggregation of peptides). Therefore, in order to advance the protein digestion to completion, it is preferable to reduce and alkylate disulfide bonds contained in the target protein by performing reduction and alkylation treatment prior to protease digestion treatment with trypsin.
  • the obtained digest (peptide aggregate) is subjected to labeling with a stable isotope X.
  • stable isotopes X include 1 H and 2 H for hydrogen atoms, 12 C and 13 C for carbon atoms, and 14 N and 15 N for nitrogen atoms. Can be arbitrarily selected.
  • the labeling with the stable isotope X can be performed by reacting a reagent containing the stable isotope with the digest (peptide aggregate).
  • a reagent containing the stable isotope with the digest (peptide aggregate) As such a commercially available reagent, an amine-specific stable isotope reagent kit, mTRAQ (registered trademark) (Applied Biosystems) can be preferably exemplified.
  • the mTRAQ consists of 2 to 3 types of reagents (mTRAQ-light and mTRAQ-heavy, or mTRAQ-D0, mTRAQ-D4, and mTRAQ-D8) with a constant mass difference by isotope labeling. Binds to the primary amine at the end or lysine residue.
  • Process (B) (addition of internal standard)
  • a known amount of an internal standard is added to the sample obtained in step (A).
  • the internal standard used here is a stable isotope Y of the digest (peptide aggregate) obtained by fragmenting a protein (standard protein) having the same amino acid sequence as the target protein to be measured. It is labeled with.
  • the fragmentation treatment can be performed by the same method as that for the target protein described above. Further, labeling with the stable isotope Y can be performed in the same manner as in the case of the target protein.
  • the stable isotope Y used here is an isotope having a mass different from that of the aforementioned stable isotope X used for labeling the digest of the target protein.
  • mTRAQ registered trademark
  • mTRAQ-light for labeling a standard peptide digest
  • Process (C) (LC-MS / MS and MRM analysis)
  • the sample obtained in the step (B) is first subjected to an LC-MS / MS apparatus, and then multiple reaction monitoring (MRM) analysis is performed using the MRM-transition selected for the internal standard.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the sample (the peptide aggregate labeled with a stable isotope) obtained in the above step (B) by LC (liquid chromatography) using an LC-MS / MS apparatus is first subjected to one-dimensional or multi-dimensional high-performance liquid chromatography.
  • liquid chromatography examples include cation exchange chromatography, which uses a difference in charge of a peptide, and reverse phase chromatography, which uses a difference in hydrophobicity of a peptide. Can be used in combination.
  • tandem mass spectrometry is performed on each separated peptide using a tandem mass spectrometer (MS / MS apparatus) in which two mass spectrometers are connected in series.
  • MS / MS apparatus tandem mass spectrometer
  • a target protein of several fmol can be detected.
  • MS / MS analysis it is possible to analyze the internal sequence information of the peptide, and identification without false positives is possible.
  • the ionization method in mass spectrometry is preferably an electrospray ionization method (ESI method) which is a soft ionization method.
  • ESI method electrospray ionization method
  • mass spectrometry peptide-derived ions generated by various ionization methods are separated according to mass by an analyzer.
  • Magnetic mass separator (Sector MS), quadrupole mass separator (QMS), time-of-flight mass separator (TOFMS), Fourier transform ion cyclotron mass separator (FT-ICRMS) Furthermore, the analyzer which combined these is illustrated.
  • the method of the present invention is characterized in that multiple reaction monitoring (MRM) analysis is performed using the MRM-transition selected for the internal standard when selecting the target peptide.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • selection of MRM-transition and selection of target peptides using the same can be performed by a method having the following steps (1) to (3).
  • (1) A step of preparing an internal standard by fragmenting a standard protein identical to the target protein and labeling with a stable isotope Y, (2) A step of subjecting the internal standard obtained in the above step (1) to an LC-MS / MS apparatus and obtaining a peptide ionic strength corresponding to the peptide derived from the standard protein, (3) A step of selecting two or more fragment ions having high intensity per peptide, obtaining an average signal intensity, selecting two or more kinds of peptides in descending order of intensity average, and selecting them as MRM-transition.
  • a recombinant protein having the same amino acid sequence as the target protein is digested with a protease such as trypsin as described above, and then a stable isotope is used.
  • Labeled eg, mTRAQ reagent heavy: IS label
  • PFTS precursor-fragment transition selection
  • the standard protein is preferably a recombinant protein prepared based on a full-length cDNA library.
  • PFTS may consist of a single purified recombinant protein product or a mixture of multiple proteins.
  • the elution time (retention time) on the chromatogram (for example, reverse phase chromatogram) in liquid chromatography is calculated between individual columns. It is preferable to obtain the data with good reproducibility so that no error occurs. Specifically, it is preferable to standardize the chromatogram using the elution time of two or more standard peptides so that the elution time error is within ⁇ 1 minute. In this way, MRM analysis dependent on elution time (Scheduled MRM analysis) becomes possible, and the number of proteins that can be quantified in one analysis increases dramatically (about 400 proteins / run).
  • Step (D) quantification of target protein in test sample
  • this step identifies a peptide (target peptide) derived from a target protein whose retention time matches that of a peptide derived from an internal standard (internal standard peptide)
  • Quantification of the target protein can be performed using a calibration curve prepared in advance for the standard protein.
  • a calibration curve can be created by the following method.
  • a recombinant protein having the same amino acid sequence as the target protein is digested with a protease such as trypsin and then labeled with two different stable isotopes (one of which is an internal standard peptide).
  • Precursor-fragment transition selection with a known concentration labeled with a stable isotope used for labeling (IS label) and labeled with the stable isotope used for labeling the target peptide (T label)
  • Precursor-fragment transition selection standard PFTS is prepared, and multiple samples are prepared by mixing various concentrations of T-labeled PTFS with a certain amount of IS-labeled PTFS, and these samples are LC-MS / MS described above MRM analysis is performed for the apparatus.
  • a calibration curve is prepared by plotting the area ratio of T-labeled PTFS to IS-labeled PTFS (T-labeled PTFS / IS-labeled PTFS) in the MRM chromatogram thus obtained against the amount of T-labeled PTFS ( (See FIG. 2).
  • the absolute amount of the target protein contained in the test sample can be calculated.
  • the MRM-transition, the standard peptide derived from the standard protein, and the retention time in LC-MS / MS related to the standard peptide are calibrated in advance.
  • a standard table is preferably created.
  • the above-mentioned calibration curve is prepared in advance for the standard protein corresponding to each target protein. In this case, the steps (C) and (D) described above can be performed with reference to the calibration standard table and the calibration curve.
  • the calibration standard table can be created by the following method.
  • A fragmenting a known amount of standard protein and labeling with stable isotope Y to prepare an internal standard
  • B A step of subjecting the internal standard obtained in (a) above to an LC-MS / MS apparatus and performing a multiple reaction monitoring (MRM) analysis using the MRM-transition selected for the internal standard
  • C In the MRM chromatogram, a step of selecting two or more types of detected peptides in descending order of sensitivity and listing them together with their retention times;
  • D A step of storing the list created in step (c) for use as a calibration standard table of the standard protein.
  • the library of standard proteins may be constructed by repeating the above steps (a) to (d) for two or more standard proteins, creating and storing a calibration standard table for each standard protein. Construction of such a library allows absolute quantification for all proteins by the method of the present invention.
  • the present invention is a method for measuring the amount of protein, which includes an internal standard peptide corresponding to a portion subjected to post-translational modification such as phosphorylation, glycosylation, nitration, citrullination, and the like, including a post-translational modification site.
  • post-translational modification such as phosphorylation, glycosylation, nitration, citrullination, and the like.
  • Example 1 PFTS selection and preparation of the calibration curve of the MRM-transition with (1) a preparation of human cyclin-dependent kinase inhibitor protein from the cDNA of recombinant human cyclin-dependent kinase inhibitor protein (recombinant p27 Kip1) p27 Kip1 was incorporated into the pGEX-6P1 E. coli expression vector and expressed in E. coli as a GST fusion protein. Next, GST fusion p27 Kip1 was bound to glutathione sepharose, and then the GST part was cleaved by Precision protease (GE Healthcare) and eluted. The recombinant p27 Kip1 thus obtained was subjected to electrophoresis, and its purity and concentration were measured.
  • recombinant p27 Kip1 thus obtained was subjected to electrophoresis, and its purity and concentration were measured.
  • the obtained treated product (p27 Kip1 digested product) was desalted using SepPAK C18 (manufactured by Nippon Waters Co., Ltd.) (50 mg), and then concentrated by centrifugation.
  • p27 Kip1 digested product (mTRAQ-117 labeled p27 Kip1 digested product) labeled with mTRAQ-heavy (mTRAQ-117) was used as a precursor fragment transition selection standard (PFTS).
  • PFTS fragment transition selection standard
  • Is a triple quadrupole mass spectrometry system (QTRAP5500: manufactured by AB / Sciex) that connects an HPLC system for multidimensional chromatography (Paradigm MS2: manufactured by Michrom) and an autosampler (HTS-PAL: manufactured by HCT).
  • IDA mode was performed.
  • L-column manufactured by Chemicals Evaluation Organization: packing material diameter 3 ⁇ m, inner diameter 100 ⁇ m, column length 15 cm
  • mobile phase A is 0.1% formic acid / 2 vol% methanol aqueous solution
  • mobile phase B is 0.1% formic acid / 98% methanol aqueous solution
  • flow rate is 0.2 mL / min
  • gradient is 5-95% mobile phase B / 30 min
  • 95-95% mobile phase B / 10 min 95-5% mobile phase B / 1 Min
  • 5-5% mobile phase B / 20 min The results are shown in FIG. 1A.
  • the obtained data was searched against human IPI version 3.1.6, which is a human protein database, using the database search site MASCOT and PloteinPilot software (Applied Biosystems).
  • MRM-transition Of the peptides identified by the search, 10 types of peptides with high expected sensitivity were selected, and 2 or more types of fragment ions (MRM-transition) were selected for each peptide. MRM analysis was performed again using the mTRAQ-117 labeled p27 Kip1 digest as a sample in the selected MRM-transition.
  • FIG. 1B It was found from the obtained MRM chromatogram that two types of peptides (indicated by arrows in FIG. 1B) can be detected with high sensitivity. Highly sensitive MRM-transition setting information and retention time were recorded for these two types of peptides.
  • Example 2 Absolute Quantification of Endogenous Protein by MRM Method (1) Preparation of Endogenous Protein HeLa cells (Skp2 KD 1-2 and Skp2 KD3-10) knocked down with a gene encoding Skp2 protein, and control cells (Mock ) was used as a raw material to prepare a cell extract.
  • the Skp2 protein is a p27 Kip1 (human cyclin-dependent kinase inhibitor protein) ubiquitinase prepared in Example 1.
  • the obtained treated product was desalted using SepPAK C18 (manufactured by Nippon Waters Co., Ltd.) (50 mg), and then concentrated by centrifugation.
  • the content of p27 Kip1 in the 20 ⁇ g cell extract was 3 fmol in the control cell (Mock) and about 17 fmol in the knockdown cell (Skp2 KD 1-2 cell). In a down cell (Skp2 KD 3-10 cell), it was about 11 fmol, and it was confirmed that it almost coincided with the above estimated value.

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Abstract

本発明は、生体試料などのタンパク質混合物中に含まれる標的タンパク質の絶対量を測定するために有用な方法を提供する。本発明の方法は下記の工程（A）～（D）を有する： （A）標的タンパク質を含む試料を断片化処理して、安定同位体Ｘで標識する工程、 （B）上記工程（A）で得られた試料に、標的タンパク質と同一の標準タンパク質を断片化処理して安定同位体Yで標識してなる既知量の内部標準物を添加する工程、 （C）上記工程（B）で得られた試料をLC-MS/MS装置に供し、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行う工程、 （D）上記工程（C）で検出されたMRMクロマトグラムにおいて、内部標準物に由来するペプチド（内部標準ペプチド）と保持時間が一致する標的タンパク質に由来するペプチド（標的ペプチド）を同定し、内部標準ペプチドのピーク面積と標的ペプチドのピーク面積との対比から、被験試料中の標的タンパク質を定量する工程。

Description

タンパク質の定量方法
　本発明は、多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring：MRM ）法を用いたタンパク質の定量方法に関する。より詳細には、本発明は、生体試料などのタンパク質混合物中に含まれる標的タンパク質の絶対量を測定するために有用な方法に関する。
　生命は多数のタンパク質によって構成されるネットワークによってその恒常性を維持している。各種疾患はこの恒常性の破綻として捉えることができることから、各タンパク質の生体内での存在量は、疾患の分子機構の解明や診断のためのバイオマーカー、あるいは治療における予後判定の基準となりえる。かかる目的のためには、タンパク質の検出・定量において高い網羅性と高感度を両立させる必要があるが、現時点では実用上十分な技術は存在しない。
　例えば高感度なタンパク質の検出法として、各タンパク質に対する特異的抗体を利用したウェスタン・ブロット法に代表される免疫化学的手法がある。しかし、免疫化学的手法では特異的抗体の取得が前提であり、また、得られる結果は使用する抗体の質に大きく左右される。また、免疫化学的手法で複数のタンパク質を検出するためには、それぞれのタンパク質に対する抗体をすべて揃え、各々の抗体で解析を繰り返す必要があり、実質的に網羅的解析は不可能である。
　またタンパク質の網羅的解析法としては、質量分析計を基盤技術としたプロテオーム解析法が存在するが、従来のプロテオーム解析法では微量タンパク質の検出が極めて困難である。たとえば、典型的なプロテオーム発現解析法である二次元電気泳動では、検出できるタンパク質は発現量が高いタンパク質に限られる。また、LC-MS/MS法と安定同位体標識法（SILAC法, ICAT法、iTRAQ法）を組み合わせた定量的ショットガン・プロテオミクスを用いた場合でも、検出できるタンパク質は数百～3,000程度であり、この範囲の検出数では微量タンパク質を検出・定量することは不可能である（非特許文献１～３参照）。また、これらの方法は一般にタンパク質の絶対定量ではなく、相対定量を目的とするものである。このため、かかる方法を用いて異なる研究・検査機関で、個々に得られたタンパク質の定量値を、相互に比較し、タンパク質間の量的関係を導き出すのは困難である。
　このような従来のタンパク質定量解析の問題点を克服するための手法として、従来低分子化合物の定量分析に用いられてきた多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring：MRM）［選択反応モニタリング（selective reaction monitoring：SRM）とも言う］をペプチドの定量に利用することが提案されている（非特許文献４参照）。しかしながら、ＭＲＭ法を行う場合、事前に対象ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル情報を取得しておく必要がある。
　通常、一つのタンパク質から酵素消化等によって生じるペプチドは、数十から時には数百におよぶこともある。この中からＭＲＭ法に資する標的ペプチドの選定が、本方法の感度を規定する上できわめて重要なステップとなる。現在、このＭＲＭ法のための標的ペプチドの選定は、ショットガン・プロテオーム解析で得られた実測スペクトルを流用する、あるいは特定条件に沿った理論的推定法に依存している。
　しかしながら、微量タンパク質について実測スペクトルが得られることは稀であることや、理論的推定が必ずしも最高感度のペプチド選定を保証できるわけではないことから、ＭＲＭ法を網羅的かつ高感度に行うためには、ＭＲＭ標的ペプチドを効率良く選定するための方法の開発が必要である。
　このため、現時点ではＭＲＭ法はショットガン・プロテオーム解析等で得られた結果を精査・確認するための方法論として認識されているに過ぎず、大規模なスクリーニング法としての利用は想定されていない。
Ong SE, Blagoev B, KratchmarovaI, Kristensen DB, Steen H, PandeyA, Mann M. Mol Cell Proteomics. 1(5):376-86.2002 Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R.Nat Biotechnol. 17(10):994-9.1999 Tan HT, Tan S, Lin Q, Lim TK, Hew CL, Chung MC. Mol Cell Proteomics. 7(6):1174-85. 2008 Lange V, MalmstromJA, Didion J, King NL, Johansson BP, Schafer J, Rameseder J, Wong CH, Deutsch EW, BrusniakMY, Buhlmann P, Bjorck L, Domon B, Aebersold R.　Mol Cell Proteomics. 7(8):1489-500, 2008 Lange V, Picotti P, Domon B, Aebersold R.　Mol Syst Biol. 2008;4:222
　本発明は、上記したタンパク質定量技術の現状および問題点を鑑み、多種類のタンパク質の混合物である生体試料中に含まれる標的タンパク質を絶対定量する方法、より好ましくは標的タンパク質の絶対定量を高速に実現することが可能な方法を提供することを目的とする。かかる本発明の方法によれば、近年充実してきたゲノム情報資産を利用することで、従来は特定タンパク質の解析手段であったＭＲＭ法を、タンパク質の超高感度大規模解析法に変換することも可能になる。
　ＭＲＭ法とは、特定質量を持つイオン（ここではペプチド）を通過させる質量フィルター（Ｑ１）とガス衝突誘導開裂（CID: Collision Induced Dissociation）によって生じる断片を通過させる質量フィルター（Ｑ３）の組み合わせ（MRM-transition：Q1とQ3の質量（m/z）の組み合わせ）を設定し、この二つの質量フィルターを通過できるイオン（ペプチド）を検出することで、複雑な試料中に含まれる特定成分を特異的に定量する方法である（非特許文献５）。
　プロテオームが有する広大なダイナミックレンジの問題を解決できる新技術として期待されているが、ＭＲＭ解析を行うためには、検出したいペプチドのＣＩＤによって生じるフラグメントの質量情報（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を事前に知っておく必要がある。一般に、これらの情報はショットガン・プロテオミクス解析で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの情報が利用されているため、ショットガン解析で検出できない微量なタンパク質に対してＭＲＭ解析を行うことは困難である。この問題、特に後者の問題を解決するための手段として本発明に至った。
　本発明は、下記の構成を有するものである：
項１．タンパク質を複数含む被験試料中の標的タンパク質を同定および定量する方法であって、下記の工程（A）～（D）を有することを特徴とする方法：
（A）標的タンパク質を含む試料を断片化処理して、安定同位体Ｘで標識する工程、
（B）上記工程（A）で得られた試料に、標的タンパク質と同一の標準タンパク質を断片化処理して安定同位体Ｙで標識してなる既知量の内部標準物を添加する工程、
（C）上記工程（B）で得られた試料をLC-MS/MS装置に供し、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行う工程、
（D）上記工程（C）で検出されたMRMクロマトグラムにおいて、内部標準物に由来するペプチド（内部標準ペプチド）と保持時間が一致する標的タンパク質に由来するペプチド（標的ペプチド）を同定し、内部標準ペプチドのピーク面積と標的ペプチドのピーク面積との対比から、被験試料中の標的タンパク質を定量する工程。
　項２．上記MRM-transitionが、下記の工程（1）～（3）を有する方法で選択されたものである項１記載の方法：
（1）標的タンパク質と同一の標準タンパク質を断片化処理して安定同位体Ｙで標識して内部標準物を調製する工程、
（2）上記工程（1）で得られた内部標準物をLC-MS/MS装置に供し、上記標準タンパク質に由来するペプチドに対応するペプチドフラグメントイオン強度を求める工程、
（3）一つのペプチドあたり強度が強いフラグメントイオンを２つ以上選択し、そのシグナル強度平均を求め、強度平均が高い順に２種類以上のペプチドを選択し、MRM-transitionとして選択する工程。
　項３．工程（C）または（D）を、標準タンパク質について作成した較正標準表に基づいて行う、項１または２に記載する方法。
　項４．標準タンパク質について較正標準表を作成する下記の工程（a）～（d)を有する、項３に記載する方法：
（a）既知量の標準タンパク質を断片化処理して、安定同位体Ｙで標識して内部標準物を調製する工程、
（b）上記（a）で得られた内部標準物をLC-MS/MS装置に供し、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行う工程、
（c）MRMクロマトグラムにおいて、検出されたペプチドのうち感度の高い順に２種類以上を選択し、それを保持時間とともにリスト化する工程、
（d）工程（c）で作成したリストを、当該標準タンパク質の較正標準表として使用するために保存する工程。
　項５．２以上の標準タンパク質について、（a）～（d）の工程を繰り返して、各標準タンパク質についてそれぞれ較正標準表を作成保存して、標準タンパク質のライブラリーを構築する工程を有する、項４に記載する方法。
　本発明の方法によれば、第１に、タンパク質を直接定量するのではなく、消化処理により得たペプチド断片を定量するので、タンパク質分子の溶解性に影響されず、様々な化学的性質を持つタンパク質を同一の方法で取り扱うことが可能となる。
　第２に、本発明の方法によれば、質量分析計を用いて測定を行うので、数fmolのタンパク質を定量することが可能である、
　第３に、複数の標的タンパク質にそれぞれ対応する内部標準ペプチドを同時に使用することで、一度の分析から、複数の標的タンパク質の定量を行うことが可能となる。
実施例１において、PFTS を用いたMRM-transitionの選定手法を示す。（Ａ）PFTS（ｍTRAQ-117標識p27Kip1消化物）を、データ依存自動MS/MS取得モードにてLC-MS/MS解析を行った結果を示す。横軸は時間（分）、縦軸は強度（cps）を示す。但し、具体的な数値そのものは発明の本質に特に関係するものではない。（Ｂ）Ａで得られたデータを、MASCOTおよびProteinPilotにてデータベース検索し、MRM-transitionを選定し、選定したMRM-transitionにて実際にPFTS（ｍTRAQ-117標識p27Kip1消化物）を試料としたＭＲＭ解析を行い、シグナル強度が強い二つのペプチド（矢印）を定量用transitionとした。図Ｂ中、横軸は時間（分）、縦軸は強度（cps）を示す。但し、具体的な数値そのものは発明の本質に特に関係するものではない。 PFTSを用いて作成した検量線を示す。mTRAQ-113 p27Kip1消化物／mTRAQ-117 p27Kip1消化物の面積比を算出し、mTRAQ-113 p27Kip1消化物の濃度に対してプロットした検量線である。 実施例２においてモデル細胞としてSkp2遺伝子ノックダウンHeLa細胞（Skp2KD1-2細胞、Skp2KD3-10細胞）を調製し、組み換えp27Kip1を対照標品としてウェスタン・ブロットによる細胞内のp27Kip1量を測定した結果を示す。 実施例１において、PFTS（ｍTRAQ-117標識p27Kip1消化物）を用いて作製したp27Kip1のMRM-transition（２種類のペプチド）および検量線を用いて、ＭＲＭ解析を行い、Skp2遺伝子ノックダウン細胞中（Skp2KD1-2細胞、Skp2KD3-10細胞）のp27Kip1の存在量（絶対量）をコントロール細胞（Mock）と比較した結果を示す。図４Ａは、ＭＲＭ解析を行ったクロマトグラムを示す。横軸は時間（分）、縦軸は強度（cps）を示す。但し、具体的な数値そのものは発明の本質に特に関係するものではない。図４Ｂは、その結果から、各細胞抽出物（コントロール細胞（Mock）、ノックダウン細胞（Skp2 KD 1-2細胞）、ノックダウン細胞（Skp2 KD 3-10細胞））（20μg）中のp27Kip１の含有量を示す。図４Ａ中、矢印ａは試料に由来するピークを、また矢印ｂは内部標準物に由来するピークを示す。
　本発明の方法は、タンパク質を複数含む被験試料に含まれる標的タンパク質を同定および定量する方法であり、下記の工程（A）～（D）を有することを特徴とする：
（A）標的タンパク質を含む試料を断片化処理して、安定同位体Ｘで標識する工程、
（B）上記工程（A）で得られた試料に、標的タンパク質と同一の標準タンパク質を断片化処理して安定同位体Ｙで標識してなる既知量の内部標準物を添加する工程、
（C）上記工程（B）で得られた試料をLC-MS/MSに供し、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行う工程、
（D）上記工程（C）で検出されたMRMクロマトグラムにおいて、内部標準物に由来するペプチド（内部標準ペプチド）と保持時間が一致する標的タンパク質に由来するペプチド（標的ペプチド）を同定し、内部標準ペプチドのピーク面積と標的ペプチドのピーク面積との対比から、被験試料中の標的タンパク質を定量する工程。
　本発明の方法が対象とする被験試料はタンパク質を２以上含むものであればよく、特に制限されない。かかる試料としては、微生物、植物、および動物（ヒトを含む）等の生体に由来する試料（生体試料）を挙げることができる。具体的には、血液、尿、唾液、毛髪、細胞および細胞組織、並びにその処理物、また遺伝子組み換え技術によって得られるタンパク質含有試料などを挙げることができる。
　以下、各工程について説明する。
　工程（Ａ）（断片化処理および標識処理）
　当該工程では、まず標的タンパク質を断片化処理してペプチドの集合物とし、次いでこれを安定同位体Ｘで標識する操作が行われる。
　標的タンパク質の断片化には、標的タンパク質を、例えばトリプシン等で代表されるタンパク分解酵素（プロテアーゼ）で消化処理する方法、臭化シアンに代表される化学的切断方法を使用することができる。好ましくはプロテアーゼによる消化処理である。なお、タンパク質の分解的消化が完結まで進行する場合には、所与のモル量のタンパク質は各トリプシンペプチド解裂生成物に対して同一のモル量を生じることが知られている。このため所与のタンパク質のトリプシンペプチドのモル量を求めることによって、試料中に存在している元のタンパク質のモル量を求めることが可能になる。すなわち、プロテアーゼ消化物（ペプチドの集合物）中に含まれる標的タンパク質に由来するペプチドの絶対量を求めることにより、標的タンパク質の絶対量を求めることが可能になる。従って、タンパク質の分解的消化を完結まで進行させるために、トリプシンによるプロテアーゼ消化処理に先立ち、還元及びアルキル化処理を行い、標的タンパク質に含まれるジスルフィド結合を還元しアルキル化しておくことが好ましい。
　次いで得られた消化物（ペプチド集合物）は安定同位体Ｘによる標識に供される。安定同位体Ｘとしては、水素原子であれば１Ｈと２Ｈ，炭素原子であれば１２Ｃと１３Ｃ、および窒素原子であれば１４Ｎと１５Ｎを挙げることができ、これらの中から任意に選択することができる。ここで安定同位体Ｘによる標識は、安定同位体を含んだ試薬を上記消化物（ペプチド集合物）と反応させることによって実施することができる。かかる商業的に入手可能な試薬としては、アミン特異的な安定同位体試薬キットであるｍTRAQ（登録商標）（Applied Biosystems社製）を好適に例示することができる。当該ｍTRAQは、同位体標識により一定質量差を持たせた２ないし３種類の試薬（mTRAQ-lightとmTRAQ-heavy, あるいはmTRAQ-D0、mTRAQ-D4, およびmTRAQ-D8）からなり、ペプチドのＮ端またはリジン残基の一級アミンに結合する。
　工程（Ｂ）（内部標準物の添加）
　当該工程において、上記工程（Ａ）で得られた試料に、既知量の内部標準物が添加される。ここで使用される内部標準物は、測定対象である標的タンパク質と同一のアミノ酸配列からなるタンパク質（標準タンパク質）を断片化処理し、得られた消化物（ペプチド集合物）について、安定同位体Ｙで標識されてなるものである。ここで断片化処理は、前述する標的タンパク質と同一の方法で実施することができる。また、安定同位体Ｙによる標識も標的タンパク質の場合と同様に実施することができる。しかし、ここで使用される安定同位体Ｙは、標的タンパク質の消化物に対する標識に使用する前述の安定同位体Ｘとは、質量が異なる同位体を使用することが必要である。例えば、前述するｍTRAQ（登録商標）（Applied Biosystems社製）を使用する場合、標的タンパク質の消化物に対する標識には、例えばmTRAQ-lightを用いた場合、標準ペプチドの消化物に対する標識には、mTRAQ-heavyを用いることが必要である。
　工程（Ｃ）（LC-MS/MSおよびMRM解析）
　当該工程では、まず上記工程（Ｂ）で得られた試料をLC-MS/MS装置に供し、次いで内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析が行われる。
　LC-MS/MS装置のLC（液体クロマトグラフィー）により、上記工程（Ｂ）で得られた試料（安定同位体で標識されたペプチド集合物）は、まず一次元または多次元の高速液体クロマトグラフィーにより分離される。
　ここで液体クロマトグラフィーとして、具体的には、ペプチドの電荷の違いを利用して分離を行なう陽イオン交換クロマトグラフィー、ペプチドの疎水性の違いを利用して分離を行なう逆相クロマトグラフィーを挙げることができ、両者を組み合わせて使用することもできる。
　次いで分離された各ペプチドについて、質量分析計を２台直列に連結したタンデム質量分析装置（MS/MS装置）を用いて、タンデム質量分析（MA/MS）を行う。質量分析計を用いることで、数fmolの標的タンパク質の検出が可能となる。そのうえ、MS／MS分析を行なうことで、ペプチドの内部配列情報を解析することが可能となり、擬陽性の無い同定が可能となる。質量分析におけるイオン化の方法はソフトイオン化法であるエレクトロスプレーイオン化法（ESI法）を用いることが好ましい。質量分析では、各種イオン化法により生成したペプチド由来イオンはアナライザーで質量に応じて分離される。例えば、磁場型質量分離装置（Sector MS）、四重極型質量分離装置（QMS）、飛行時間型質量分離装置（TOFMS）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置（FT-ICRMS）が挙げられ、さらにこれらを組み合わせたアナライザーが例示される。
　本発明の方法では、上記標的ペプチドの選別に際して、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行うことを特徴とする。
　ここで、MRM-transitionの選択、およびそれを用いた標的ペプチドの選別は、下記の工程（1）～（3）を有する方法で行うことができる。
（1）標的タンパク質と同一の標準タンパク質を断片化処理して安定同位体Ｙで標識して内部標準物を調製する工程、
（2）上記工程（1）で得られた内部標準物をLC-MS/MS装置に供し、上記標準タンパク質に由来するペプチドに対応するペプチドイオン強度を求める工程、
（3）一つのペプチドあたり強度が強いフラグメントイオを２つ以上選択し、そのシグナル強度平均を求め、強度平均が高い順に２種類以上のペプチドを選択し、MRM-transitionとして選択する工程。
　ここで（1）および（2）の工程は、標的タンパク質と同一のアミノ酸配列からなる組み換えタンパク質（標準タンパク質）について、前述するように、トリプシンなどの蛋白質分解酵素によって消化し、次いで安定同位体で標識したもの（例えばmTRAQ試薬のheavyなど：IS標識とする）を、プリカーサー-フラグメント遷移選定評品（Precursor-fragment transition selection standard：PFTS）として、LC-MSによって自動MS/MS解析モードで測定することによって実施される。ここで標準タンパク質は完全長cDNAライブラリーをもとに作製した組み換えタンパク質であることが好ましい。
　次いで、得られたデータを検索エンジンにかけることでスペクトルの帰属を行い、各タンパク質に対して実験的に検出されるペプチドのリスト化を行う。検出されたペプチドをタンパク質毎にグループ化するとともに、各MS/MSスペクトルからプリカーサーイオンより大きなm/zを有するフラグメント３つ以上とm/z 500以上のフラグメント３つ以上を、スペクトル上のシグナル強度順に選定する。このうち強度が強いものから順に２つ以上を選定し、その強度平均をMRR-transitionの期待感度とする。ひとつのタンパク質から複数のペプチドが検出された場合は、この期待感度を指標に最も感度が高いペプチドを標準ペプチドとして２つ以上選定する。なお、PFTSは単一の組み換えタンパク質精製品からなるものであってもよいし、また複数タンパク質の混合物よりなるものであってもよい。
　なお、上記方法で期待感度が高いペプチド（標準タンパク質について選別される標準ペプチド）については、液体クロマトグラフィーにおけるクロマトグラム（例えば逆相クロマトグラム）上での溶出時間（保持時間）を、カラム個体間で誤差が生じないように再現性よく取得しておくことが好ましい。具体的には２つ以上の標準ペプチドの溶出時間を用いてクロマトグラムを標準化し、溶出時間の誤差を±１分以内に収めるようにすることが好ましい。こうすることで、溶出時間依存的なMRM解析（Scheduled MRM解析）も可能になり、一度の分析で定量できるタンパク質数が飛躍的に増加する（400タンパク質/run程度）。
　工程（Ｄ）（被験試料中の標的タンパク質の定量）
　当該工程は、上記工程（Ｃ）で検出されたＭＲＭクロマトグラムにおいて、内部標準物に由来するペプチド（内部標準ペプチド）と保持時間が一致する標的タンパク質に由来するペプチド（標的ペプチド）を同定し、内部標準ペプチドのピーク面積と標的ペプチドのピーク面積との対比から、被験試料中の標的タンパク質を定量する工程である。
　標的タンパク質の定量は、標準タンパク質について事前に作成した検量線を利用して行うことができる。
　検量線の作成は、下記の方法により行うことができる。
　まず標的タンパク質と同一のアミノ酸配列からなる組み換えタンパク質（標準タンパク質）について、前述するように、トリプシンなどの蛋白質分解酵素によって消化し、次いで異なる２種類の安定同位体で標識（一方を内部標準ペプチドの標識に使用する安定同位体で標識し（IS標識）、他方を標的ペプチドの標識に使用する安定同位体で標識する(T標識）)を施した、濃度既知のプリカーサー-フラグメント遷移選定評品（Precursor-fragment transition selection standard：PFTS）を作成し、一定量のIS標識PTFSに対して、種々濃度のT標識PTFSを混合した複数の試料を作製し、これらの試料を前述するLC-MS/MS装置に供して、ＭＲＭ解析を行う。斯くして得られたＭＲＭクロマトグラムの、IS標識PTFSに対するT標識PTFSの面積比（T標識PTFS／IS標識PTFS）を、T標識PTFSの量に対してプロットすることで検量線を作製する（図２参照）。
　かかる検量線を利用することにより、被験試料中に含まれる標的タンパク質の絶対量を算出することができる。
　なお、本発明の方法において、各標的タンパク質に応じた標準タンパク質について、事前にMRM-transition、標準タンパク質に由来する標準ペプチド、および当該標準ペプチドに関するLC-MS/MSにおける保持時間などについて、予め較正標準表が作成されていることが好ましい。また、各標的タンパク質に応じた標準タンパク質について、予め前述する検量線が作成されていることが好ましい。この場合、かかる較正標準表および検量線を参照して、前述する工程（Ｃ）および（Ｄ）を実施することができる。
　かかる較正標準表の作成は、下記の方法により行うことができる。
（a）既知量の標準タンパク質を断片化処理して、安定同位体Ｙで標識して内部標準物を調製する工程、
（b）上記（a）で得られた内部標準物をLC-MS/MS装置に供し、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行う工程、
（c）MRMクロマトグラムにおいて、検出されたペプチドのうち感度の高い順に２種類以上選択し、その保持時間とともにリスト化する工程、
（d）工程（c）で作成したリストを、当該標準タンパク質の較正標準表として使用するために保存する工程。
　なお、２以上の標準タンパク質について、上記（a）～（d）の工程を繰り返して、各標準タンパク質についてそれぞれ較正標準表を作成保存して、標準タンパク質のライブラリーを構築してもよい。かかるライブラリーの構築により、本発明の方法によりすべてのタンパク質について絶対的な定量が可能になる。
　本発明は、タンパク質の量を測定する方法であるが、リン酸化、糖鎖化、ニトロ化、シトルリン化などの翻訳後修飾を受ける部分に対応する内部標準ペプチドを、翻訳後修飾部位を含んだペプチドとして合成し使用することで、翻訳後修飾を受けた標的タンパク質の量を測定することが可能となる。また、生体内に存在するペプチドに対する内部標準ペプチドを合成し使用すれば、ペプチドの量を測定することも可能となる。
実施例１　PFTS を用いたMRM-transitionの選定と検量線作成
（１）組換えヒトサイクリン依存性キナーゼ阻害タンパク質（組換えp27Kip1）のcDNAからの調製
　ヒトサイクリン依存性キナーゼ阻害タンパク質であるp27Kip1 のcDNAをpGEX-6P1大腸菌発現ベクターに組み込み、大腸菌にGST融合タンパク質として発現させた。次いでGST融合p27Kip1をグルタチオンセファロースに結合させた後、GST部分をPrecission protease (GE Healthcare)処理によって切断し溶出した。斯くして得られた組み換えp27Kip1を、電気泳動に供して、その純度および濃度を測定した。
　（２）組換えp27Kip1の酵素処理（消化）
　上記で調製した精製済みのp27Kip1（600ng）を、7Mグアニジン塩酸を含む100 mM Tris-HCl（pH8.5）100μlに溶解し、86℃にて1時間インキュベーションした。これを、急冷後、等量の100 mM Tris-HCl（pH8.5）と混合し、0.1μgのリシルエンドペプチダーゼを添加して、一晩インキュベーション（37℃）を行った。
　次いで、100 mM TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine）5μlを添加して、56℃にて30分間還元処理（ジスルフィド結合の切断）した後、室温に戻し、5μlの500 mM ヨードアセトアミドを添加して、室温にて30 分間放置した。これを600μlの精製水にて希釈した後、0.1μgのトリプシンを添加し、一晩インキュベーション（37℃）を行った。
　得られた処理物（p27Kip1消化物）をSepPAK C18（日本ウォーターズ（株）製） (50 mg)を用いて脱塩処理した後、遠心濃縮を行った。
　（３）安定同位体標識
　遠心濃縮して得られた乾燥処理物（p27Kip1消化物）を40μlのiTRAQバッファー(Applied Biosystems製：iTRAQ試薬キットに添付）に再溶解し、二つのチューブに等量分注し、各々、mTRAQ-light（mTRAQ-113：1unit）およびmTRAQ-heavy（mTRAQ-117：1unit）で、室温にて２時間処理して標識した。これに100μlの超純水を加えて混和し、室温にて1 時間放置した後、再度遠心濃縮し、各々20μlの0.5% トリフルオロ酢酸水溶液に再溶解し、ストック試料とした（mTRAQ-113標識p27Kip1消化物、mTRAQ-117標識p27Kip1消化物：各々10 pmol/ul)。
　（４）LC-MS/MS解析
　mTRAQ-heavy（mTRAQ-117）で標識したp27Kip1消化物（mTRAQ-117標識p27Kip1消化物）をプリカーサー・フラグメント遷移選定標品（PFTS）として、この20 fmolを、多次元クロマトグラフィ用HPLCシステム（Paradigm MS2：Michrom社製）とオートサンプラー（HTS-PAL：HCT社製）を連結したトリプル四重極質量分析システム（QTRAP5500：AB/Sciex社製）で、LC-MS/MS解析(IDAモード)を行った。なお、分析カラムとして、L-column (化学物質評価機構製：充填剤径3 μm, 内径100μm, カラム長15cm)を用い、移動相Ａは0.1％蟻酸／2容量％ メタノール水溶液、移動相Ｂは0.1％蟻酸／98％メタノール水溶液、流量は0.2ｍＬ／分、グラジエントは、5－95％移動相Ｂ/30分間、95－95％移動相Ｂ/10分間、95－5％移動相Ｂ/1分間、5－5％移動相Ｂ/20分間で測定した。結果を図１Ａに示す。
　得られたデータは、データベース検索サイトMASCOTおよびPloteinPilotソフトウェア（Applied Biosystems製）にて、ヒトタンパク質データベースであるhuman IPI version 3.1.6に対して検索を行った。
　検索によって同定されたペプチドのうち、期待感度が高い10種類のペプチドを選定し、それぞれのペプチドに対して２種類以上のフラグメントイオン（MRM-transition）を選定した。選定したMRM-transitionにて実際にmTRAQ-117標識p27Kip1消化物を試料として、再びMRM解析を行った。
　結果を図１Ｂに示す。得られたMRMクロマトグラムから２種類のペプチド（図１Ｂ中で矢印で示す）が高感度に検出できることが判明した。この２種類のペプチドについて高感度なMRM-transition設定情報と保持時間を記録した。
　（５）p27Kip1の定量
　（３）で調製したmTRAQ-117標識p27Kip1消化物とmTRAQ-113標識p27Kip1消化物を表１に示す割合で混合し、その1μlを用いてＭＲＭの測定を行った。得られたＭＲＭクロマトグラムをMultiQuant（Applied Biosystems社)で解析することでmTRAQ-113 p27Kip1消化物／mTRAQ-117 p27Kip1消化物の面積比を算出し、これをmTRAQ-113 p27Kip1消化物の濃度に対してプロットし、検量線を作製し、MultiQuant用検量線ファイルとして保存した(図２参照)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
図２から、検量線が直線に乗っており、その定量の信頼性が保証されていることが確認された。
　実施例２　ＭＲＭ法による内在性タンパク質の絶対定量
（１）内在性タンパク質の調製
　Skp2タンパク質をコードする遺伝子をノックダウンしたHeLa細胞（Skp2 KD 1-2およびSkp2 KD3-10）、およびコントロール細胞（Mock）を原料として、細胞抽出物を調製した。なお、Skp2タンパク質は、実施例１で調製したp27Kip1（ヒトサイクリン依存性キナーゼ阻害タンパク質）のユビキチン化酵素である。
　ノックダウンによる細胞中のSkp2タンパク質の減少（図３下段）およびそれによるp27Kip1の蓄積（図３上段）をウェスタン・ブロット法にて確認した。結果を図３に示す。20μg細胞抽出物中のp27Kip１の存在量を概算すると、コントロール細胞（Mock）では3 fmol、ノックダウン細胞（Skp2 KD 1-2細胞）では20 fmol、ノックダウン細胞（Skp2 KD 3-10細胞）では10 fmolであることが確認された。
　（２）酵素処理（消化）
　上記で調製した細胞抽出物100μgを、TCA沈澱した後、アセトンにて洗浄し、次いで7 Mグアニジン塩酸を含む100 mM Tris-HCl（pH8.5）100μlに溶解し、86℃にて1時間インキュベーションした。次いで、急冷したのちに等量の100 mM Tris-HCl（pH8.5）と混合し、1μgのリシルエンドペプチダーゼを添加して、一晩インキュベーション（37℃）を行った。
　これに100 mM TCEPを5μl添加して、56℃にて30分間還元処理した後、室温に戻し、500mM ヨードアセトアミドを5μl添加して、室温にて30分間放置した。これを600μlの精製水にて希釈した後、トリプシンを1μg添加し、一晩インキュベーション（37℃）を行った。
　得られた処置物（消化物）をSepPAK C18 （日本ウォーターズ（株）製）(50 mg)を用いて脱塩処理後、遠心濃縮を行った。
　（３）安定同位体標識
　遠心濃縮して得られた乾燥処理物（消化物）を20μlのiTRAQバッファー(Applied Biosystems製：iTRAQ試薬キットに添付）に再溶解し、mTRAQ-light（mTRAQ-113）（1 unit）で室温にて2時間処理して標識した。これに100μlの超純水を加えて混和し、室温にて1時間放置した後、再度遠心濃縮し、20μlの0.5% トリフルオロ酢酸水溶液に再溶解した。これに内部標準物質として500 fmolのp27Kip1-heavy（mTRAQ-117標識p27Kip1消化物）を添加し、逆相マイクロカラムにて脱塩し、遠心濃縮を行った。
　（４）LC-MS/MS解析
　2μg（10 fmol のp27Kip1-heavyを含む）を用いてMRM解析を行った。結果を図４ＡおよびＢに示す。図４Ａからわかるように、内部標準物質（p27Kip1-heavy）由来のMRMピークと全く重なる試料由来のピークが検出された。本実測データをMultiQuant(Applied Biosystems社)で読み込み、その面積比を算出させ、ステップ４で得た検量線を呼び出すことで、試料中のp27Kip1-light（p27Kip1-113）の絶対量を算出した。その結果から、図４Ｂに示すように、20μg細胞抽出物中のp27Kip１の含有量は、コントロール細胞（Mock）では3 fmol、ノックダウン細胞（Skp2 KD 1-2細胞）では約17 fmol、ノックダウン細胞（Skp2 KD 3-10細胞）では約11 fmolであり、上記概算値とほぼ一致していることが確認された。

Claims (5)

  1. タンパク質を複数含む被験試料中の標的タンパク質を同定および定量する方法であって、下記の工程（Ａ）～（Ｄ）を有することを特徴とする方法：
    （Ａ）標的タンパク質を含む試料を断片化処理して、安定同位体Ｘで標識する工程、
    （Ｂ）上記工程（Ａ）で得られた試料に、標的タンパク質と同一の標準タンパク質を断片化処理して安定同位体Ｙで標識してなる既知量の内部標準物を添加する工程、
    （Ｃ）上記工程（Ｂ）で得られた試料をLC-MS/MS装置に供し、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行う工程、
    （Ｄ）上記工程（Ｃ）で検出されたMRMクロマトグラムにおいて、内部標準物に由来するペプチド（内部標準ペプチド）と保持時間が一致する標的タンパク質に由来するペプチド（標的ペプチド）を同定し、内部標準ペプチドのピーク面積と標的ペプチドのピーク面積との対比から、被験試料中の標的タンパク質を定量する工程。
  2. 上記MRM-transitionが、下記の工程（1）～（3）を有する方法で選択されたものである請求項１記載の方法：
    （1）標的タンパク質と同一の標準タンパク質を断片化処理して安定同位体Ｙで標識して内部標準物を調製する工程、
    （2）上記工程（1）で得られた内部標準物をLC-MS/MS装置に供し、上記標準タンパク質に由来するペプチドに対応するペプチドイオン強度を求める工程、
    （3）ペプチドイオン強度の高い順に少なくとも３つ選択して、それらの強度平均をMRM-transitionとして選択する工程。
  3. 工程（Ｄ）を、標準タンパク質について作成した較正標準表に基づいて行う、請求項１または２に記載する方法。
  4. 標準タンパク質について較正標準表を作成する下記の工程（a）～（d)を有する、請求項３に記載する方法：
    （a）既知量の標準タンパク質を断片化処理して、安定同位体Ｙで標識して内部標準物を調製する工程、
    （b）上記（a）で得られた内部標準物をLC-MS/MS装置に供し、内部標準物について選択したMRM-transitionを用いて、多重反応モニタリング（MRM）解析を行う工程、
    （c）MRMクロマトグラムにおいて、検出されたペプチドのうち感度の高い順に２種類以上選択し、その保持時間とともにリスト化する工程、
    （d）工程（c）で作成したリストを、当該標準タンパク質の較正標準表として使用するために保存する工程。
  5. ２以上の標準タンパク質について、（a）～（d）の工程を繰り返して、各標準タンパク質についてそれぞれ較正標準表を作成保存して、標準タンパク質のライブラリーを構築する工程を有する、請求項４に記載する方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014512015A (ja) * 2011-04-21 2014-05-19 ビオメリュー・インコーポレイテッド セファロスポリンに対する耐性の少なくとも１つの機構を質量分析により検出する方法
CN103995042A (zh) * 2014-03-28 2014-08-20 深圳华大基因研究院 一种建立蛋白样品swath离子库的方法
WO2015008453A1 (ja) * 2013-07-16 2015-01-22 国立大学法人熊本大学 質量分析におけるペプチドピークの同定・定量のためのデータベース作成方法
KR20190005034A (ko) * 2017-07-05 2019-01-15 서울대학교산학협력단 액체 크로마토그래프 질량 분석을 이용한 시료의 정량 분석 장치 및 방법
JP2021536570A (ja) * 2018-08-27 2021-12-27 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー タンパク質検出のための組成物及び方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2806211A1 (en) * 2010-07-22 2012-01-26 Georgetown University Mass spectrometric methods for quantifying npy 1-36 and npy 3-36
US10802000B2 (en) 2013-03-15 2020-10-13 Dionex Corporation Method of calibrating a chromatography system
US9804136B2 (en) 2014-09-18 2017-10-31 Dionex Corporation Automated method of calibrating a chromatography system and analysis of a sample
EP4126966A1 (en) 2020-03-31 2023-02-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Proteomic screening for lysosomal storage diseases

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007140291A2 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Applera Corporation Expression quantification using mass spectrometry
WO2008022205A2 (en) * 2006-08-08 2008-02-21 Applera Corporation Thyroxine-containing compound analysis methods

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005181011A (ja) * 2003-12-17 2005-07-07 Yoshio Yamauchi タンパク質解析方法
JP2006300758A (ja) * 2005-04-21 2006-11-02 Apro Life Science Institute Inc 内部標準ペプチドを用いて生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007140291A2 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Applera Corporation Expression quantification using mass spectrometry
WO2008022205A2 (en) * 2006-08-08 2008-02-21 Applera Corporation Thyroxine-containing compound analysis methods

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARNIDGE D R ET AL.: "Absolute Quantification of the Model Biomarker Prostate-Specific Antigen in Serum by LC-MS/MS Using Protein Cleavage and Isotope Dilution Mass Spectrometry", JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 3, no. 3, 2004, pages 644 - 652, XP002477870 *
GYGI SP; RIST B; GERBER SA; TURECEK F; GELB MH; AEBERSOLD R., NAT BIOTECHNOL., vol. 17, no. 10, 1999, pages 994 - 9
JANECKI D J ET AL.: "A multiple reaction monitoring method for absolute quantification of the human liver alcohol dehydrogenase ADH1C1 isoenzyme", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 369, no. 1, 1 October 2007 (2007-10-01), pages 18 - 26, XP022217962 *
LANGE V; MALMSTROM JA; DIDION J; KING NL; JOHANSSON BP; SCHAFER J; RAMESEDER J; WONG CH; DEUTSCH EW; BRUSNIAK MY, MOL CELL PROTEOMICS, vol. 7, no. 8, 2008, pages 1489 - 500
LANGE V; PICOTTI P; DOMON B; AEBERSOLD R., MOL SYST BIOL., vol. 4, 2008, pages 222
MAYYA V ET AL.: "Absolute Quantification of Multisite Phosphorylation by Selective Reaction Monitoring Mass Spectrometry", MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS, vol. 5, no. 6, June 2006 (2006-06-01), pages 1146 - 1157, XP002501278 *
ONG SE; BLAGOEV B; KRATCHMAROVA I; KRISTENSEN DB; STEEN H; PANDEYA; MANN M., MOL CELL PROTEOMICS, vol. 1, no. 5, 2002, pages 376 - 86
See also references of EP2455751A4 *
STAHL-ZENG J ET AL.: "High Sensitivity Detection of Plasma Proteins by Multiple Reaction Monitoring of N-Glycosites", MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS, vol. 6, no. 10, October 2007 (2007-10-01), pages 1809 - 1817, XP002498771 *
TAN HT; TAN S; LIN Q; LIM TK; HEW CL; CHUNG MC, MOL CELL PROTEOMICS, vol. 7, no. 6, 2008, pages 1174 - 85

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014512015A (ja) * 2011-04-21 2014-05-19 ビオメリュー・インコーポレイテッド セファロスポリンに対する耐性の少なくとも１つの機構を質量分析により検出する方法
WO2015008453A1 (ja) * 2013-07-16 2015-01-22 国立大学法人熊本大学 質量分析におけるペプチドピークの同定・定量のためのデータベース作成方法
JP2015021739A (ja) * 2013-07-16 2015-02-02 国立大学法人 熊本大学 質量分析におけるペプチドピークの同定・定量のためのデータベース作成方法
CN103995042A (zh) * 2014-03-28 2014-08-20 深圳华大基因研究院 一种建立蛋白样品swath离子库的方法
KR20190005034A (ko) * 2017-07-05 2019-01-15 서울대학교산학협력단 액체 크로마토그래프 질량 분석을 이용한 시료의 정량 분석 장치 및 방법
KR101958900B1 (ko) 2017-07-05 2019-03-18 서울대학교산학협력단 액체 크로마토그래프 질량 분석을 이용한 시료의 정량 분석 장치 및 방법
JP2021536570A (ja) * 2018-08-27 2021-12-27 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー タンパク質検出のための組成物及び方法
JP7502271B2 (ja) 2018-08-27 2024-06-18 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー タンパク質検出のための組成物及び方法

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