JP2007525639A - 分析物分析に関する方法、混合物、キット、および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/443,612号(2003年1月30日出願)の優先権を主張するもので、該米国特許出願は本明細書において参考として援用される。
本発明は、質量分析による分析物測定の分野に関する。
本発明は、1つの分析物または複数の分析物を質量分析によって測定するための方法、混合物、キットおよび/または組成物に関する。分析物は、目的とする任意の分子とすることができる。分析物の非限定的例として、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭化水素、脂質、ステロイド、および分子量が1,500ダルトン未満の低分子が挙げられる。
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用されるとともに、単数形で用いられた用語は、適当でる場合は常に、複数形をも包含するものであり、その逆もあてはまる。すなわち、
a.本明細書で用いられる「分析物(analyte)」とは、測定すべき目的とする分子をいう。分析物の非限定的例として、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸(DNAまたはRNAの両方)、炭化水素、脂質、ステロイド、および/または分子量が1,500ダルトン未満の低分子を挙げることができる。上記分析物または上記分析物を含む試料の源として、限定されるものではなく、どのような源に由来するものでもよい。1つの分析物または複数の分析物を、天然のものまたは合成したものとすることができる。分析物または該分析物を含む試料の源の非限定的な例として、限定されるものではないが、細胞もしくは組織、またはそれらの培養物(または継代培養物)が挙げられる。分析物源の非限定的例として、限定されるものではないが、粗または加工済みの細胞溶解物、体液、組織抽出物、または細胞抽出物が挙げられる。上記分析物源のさらに別の非限定的例として、限定されるものではないが、クロマトグラフィー分離または電気泳動分離等の分離プロセスから得られる分画が挙げられる。体液として、限定されるものではないが、血液、尿、大便、髄液、脳脊髄液、羊水、リンパ液、または腺分泌液が挙げられる。加工済み溶解物(processed cell lysate)が意味することは、細胞を溶解する上で必要とされる処理に加えて、回収された材料に対してさらに加工を施すために、細胞溶解物が処理されることである。例えば、試料は、ペプチドである1種類以上の分析物を含む細胞溶解物であり、該ペプチドは粗細胞溶解物の全タンパク質成分をタンパク質分解酵素処理し、前駆タンパク質またはタンパク質を消化することによって形成される。
(反応基)
方法、混合物、キット、および/または組成物実施形態で用いる反応基「RG」または試薬は、求電子試薬または求核試薬のいずれかであり、一試料の1種類以上の反応性分析物と反応することが可能である。反応基は事前に存在しうるか、もしくは該反応基をin−situで調製することができる。反応基のin−situ調製は、反応性分析物の不在下で進行することができ、または反応性分析物の存在下で進行することができる。例えば、カルボン酸基の修飾は、水溶性カルボジイミド(例えば、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミドハイドロクロライド;EDC)によりin−situでおこなうことができ、それによってアミノ基等の求核試薬と反応しうる救電子性試薬を調製する。いくつかの実施形態では、標識化試薬のカルボン酸基をEDCにより活性化させることは、分析物を含むアミン(求核試薬)の存在したでおこなうことができる。いくつかの実施形態で、分析物を含むアミン(求核試薬)もまた、EDCによる初期反応がおこなわれた後に付加することができる。いくつかの実施形態では、反応基は、保護基をin−situで取り除くことで、in−situで生成することができる。その結果、求核試薬および/または求電子試薬の反応によって分析物の誘電体化をもたらしうる任意に存在または新たに生成された試薬または複数の試薬は、本発明の方法、混合物、キット、および/または組成物実施形態によって、検討される。
方法、混合物、キット、および/または組成物実施形態で用いられる1つの標識化試薬または複数の標識化試薬のレポーター部分は、測定しうる固有の質量(または質量と電荷との比(質量電荷比))を持つ基である。したがって、一つのセットの各々のレポーターは、固有の総質量を持つことができる。異なるレポーターは、1種類以上の重原子同位体を持つことで固有の質量を達成することができる。例えば、炭素の同位体(12C、13C、および14C)、窒素の同位体(14Nおよび15N)、酸素の同位体(16Oおよび18O)、または水素の同位体(水素、重水素、および三重水素)が存在し、レポーター部分の多様な群の調製に用いることができる。安定した重原子同位体の例として、13C、15N、18O、および重水素が挙げられる。他の軽および重原子同位体もレポーターで用いることができるので、これらに限定されるものではない。軽および重原子同位体を含むレポーターの調製に適した出発原料は、種々の市販元、例えばCambridge Isotope Laboratories, Andover, MA (
1112595933440_0
でリストまたは「出発原料」を参照のこと) およびIsotec (Sigma−Aldrichの一事業部)から入手可能である。Cambridge Isotope LaboratoriesおよびIsotecは、特注合成契約のもとで所望の化合物も調製する。同上(Id)。
レポーターを、ポリマーではない低分子とすることができる。レポーターはバイオポリマー(例えば、ペプチド、タンパク質、または核酸)またはバイオポリマーの構成要素(例えば、アミノ酸、ヌクレオシド、またはヌクレオチド)である必要はない。レポーターの総質量は、250ダルトン未満である。そのような低分子は、第2の質量分析で容易に測定することができる。この文脈において、第2の質量分析を、一般的にはタンデム質量分析計で、第1の質量分析で測定される選択されたイオンに対しておこなうことができる。特定の質量電荷比を持つイオンを、起こりうるフラグメンテーションとさらなる質量分析とのために、第1の質量分析から特異的に選択することができるので、第1の質量分析からの非選択イオンが第2の質量分析に持ち込まれず、そのため第2の質量分析のスペクトラムにコンタミが生ずることはない。さらに、質量分析計の感度および直線性(定量化を目的として)を、この低質量範囲でかなり強くすることができる。さらに質量分析計技術の現状は、この質量範囲で1ダルトン未満の基腺質量解像度を可能にさせることができる(例えば、図6参照)。これらの因子が、当該技術分野の状態に対して有用な前進であると判明される可能性がある。
方法、混合物、キット、および/または組成物実施形態で用いる1つの標識試薬または複数の標識試薬のリンカー部分は、分析物による反応が生じたかどうかに応じて、レポーターを分析物に結合させるか、あるいはレポーターを反応基に結合させる。リンカーの選択は、結合XおよびYの両方がフラグメント化した場合に中性種を生成するためにおこなうことができる(結合XおよびYの両方のフラグメンテーションに対して、ニュートラル・ロス(neutral loss)を起こす)。リンカーは、非常に小さな部分であり、例えばカルボニルまたはチオカルボニル基である。例えば、リンカーは少なくとも1種類の重原子同位体を含み、かつ下記の式を有する。すなわち、
本明細書に記載した標識化試薬は、レポーターとリンカーとから構成され、これらは結合Xを介して結合している。上記したように、レポーター/リンカー組み合わせは、1セットおよび/またはキットの標識化試薬の各構成要素に対して総質量が同じである。さらに、標識化試薬のレポーター/リンカー組み合わせの結合Xを、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、選択されたイオンの少なくとも一部分でフラグメント化するように設計することができ、それによって、分析物からレポーターが放出される。したがって、レポーター(m/s比として)の総質量およびその強度をMS/MS分析で観察することができる。
本発明の方法は、タンデム質量分析計と分子イオンを選択してフラグメント化する能力を有する他の質量分析計とを用いて、実施することができる。タンデム質量分析計(および低度1段式(lesser degree single−stage)質量分析計)は、質量電荷(m/z)比にもとづいて分子イオンの選択およびフラグメント化をおこなって、結果として得られたフラグメント(娘)イオン・スペクトラムを記録する能力を有する。より具体的には、選択されたイオンが解離エネルギー・レベル(例えば、衝突誘起解離(CID))を受けることによって、娘フラグメント・イオン・スペクトルを生成することができる。例えば、特定のm/z比の標識化ペプチドに対応するイオンを、第1の質量分析から選択し、フラグメント化し、さらに第2の質量分析で再度分析することができる。そのようなタンデム質量分析を実行することができる代表的装置として、限定されるものではないが、磁場4セクタ、タンデム飛行時間、三連四重極、イオン・トラップ、およびハイブリッド四重極飛行時間(Q−TOF)質量分析が挙げられる。
結合が質量分析計で起こるプロセスの結果として、フラグメント化することができることがよく理解されている。さらに、結合フラグメンテーションは、イオンを解離エネルギー・レベルにさらすことで質量分析計で得られる結果である。例えば、解離エネルギー・レベルを、衝突誘起解離(CID)によって質量分析計内に生成することができる。質量分析法の当業者は、フラグメンテーションを引き起こす解離エネルギーを改善するための他の典型的な技術として、限定されるものではないが、光解離、電子捕獲、および表面誘起解離が挙げられる。
いくつかの実施形態では、娘イオン・フラグメンテーション・パターンに基づいて分析物を測定することができる。ここで、フラグメンテーション/パターンは、既知または「理論上」の分析物のスペクトルとコンピュータ支援で比較することによって分析される。例えば、低エネルギーCIDの条件下でフラグメント化したペプチド・イオンの娘フラグメント・イオン・スペクトラムは、多くの離散的なフラグメンテーション・イベントの合計と考えられる。一般の命名法は、分解するアミド結合と結合分裂後の電荷を保持するペプチド・フラグメントにもとづいて、娘フラグメント・イオンを区別する。分裂性アミド結合のN末端側の電荷保持は、b−型イオンの形成をもたらす。もし、壊れたアミド結合のC末端側に電荷が残るならば、フラグメント・イオンをy型イオンと呼ぶ。bおよびy型イオンに加えて、CID質量スペクトルは、他の診断用フラグメント・イオン(娘フラグメント・イオン)を含むものであってもよい。これらは、グルタミン、リジン、およびアルギニンからのアンモニア(−17amu)のニュートラル・ロスあるいはセリンおよびスレオニン等のヒドロキシル含有アミノ酸からの水(−18aum)の喪失によって生成されたイオンを含む。ある種のアミノ酸が、他のものよりも低エネルギーCIDの条件下で、より容易にフラグメント化することが観察されている。このことは、特に、プロリンまたはアスパラギン酸残基を含むペプチドであきらかであり、さらにアスパルチル−プロリン結合でなおさらそうである(Mak, M. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 12: 837−842) (1998)。したがって、Z−proダイマーまたはZ−aspダイマーのペプチド結合(ここで、Zha任意の天然アミノ酸、proはプロリン、およびaspはアスパラギン酸)は、すべての他のアミノ酸ダイマー組み合わせの間でのペプチド結合と比較して、よりいっそう不安定となる傾向にある。
Xは、レポーターの原子とリンカーの原子とのあいだの結合である。Yは、リンカーの原子と、反応基もしくは標識化試薬が反応性分析物と反応している場合は該分析物のいずれかとのあいだの結合である。本発明の実施形態で使用しうる種々の標識化試薬(すなわち、RP−X−LK−Y−RG)の結合XおよびYは、解離エネルギー・レベルにさらされた場合、選択されたイオンの少なくとも一部分で、フラグメント化することができる。したがって、結合XおよびYが標識分析物(すなわち、RP−X−LK−Y−分析物)の選択されたイオンの少なくとも一部分にフラグメント化されるように、解離エネルギー・レベルを質量分析計で調節することができる。結合Xのフラグメンテーションは、レポーターを別個に分析物から測定することができるように、該分析物からレポーターを離す。結合Yのフラグメンテーションは、結合Xがすでにフラグメント化されているかどうかに依存して、分析物からレポーター/リンカー組み合わせを、または分析物からリンカーを離す。結合Yを結合Xよりも不安定化させることができる。結合Xを結合Yよりも不安定化させることができる。結合XおよびYの両方を同じく相対的に不安定なものとすることができる。
本発明のいくつかの実施形態では、分析物の標識後と同様に、該標識に先立って、試料を加工することができる。この加工によって分析物の標識を促進することができる。この加工で試料の構成要素の分析を促進することができる。この加工によって、試料の取り扱いを簡素化することができる。この加工は、前述したことの2つ以上を促進することができる。
いくつかの実施形態では、標識分析物の試料または試料混合物の加工に、分離を含むことができる。例えば、複数の異なる試料由来の複数の差異的標識分析物を含む1つの試料混合物を、調製することができる。差異的標識(differentially labeled)とは、標識の各々が同定可能な固有の性質を持つことを意味する(例えば、MS/MS分析で固有の「サイン・イオン」を作る固有のレポーター部分を含む)。試料混合物を分析するために、試料混合物の構成要素を分離して、質量分析を該試料混合物の一分画のみに実施することができる。このようにして、分離された分析物の質量を個々に分析して分析プロセスの感度を高めることができるので、分析の複雑性を実質的に減らすことができる。もちろん、この分析を上記試料混合物の1種類以上の別の分画に対して1回以上繰り返して、該試料混合物のすべての分画を分析することが可能となる。
いくつかの実施形態では、1つの試料で同一の差異的標識分析物の相対的定量化が可能である。同一の差異的標識分析物の相対的定量化は、第1の質量分析で観察された選択標識分析物に対する第2の質量分析で測定されるレポーターの相対量(例えば、報告されたピークの面積または高さ)と比較することによって、可能である。言い換えれば、試料混合物を生成するために用いられる特定の試料に対する情報と各レポーターとを相関させることができる場合には、第2の質量分析で観察された他のレポーターに関して、そのレポーターの相対量は試料混合物に含まれるその分析物の相対量である。試料混合物を形成するために組み合わされた構成要素が既知である場合には、試料混合物を調製するために用いられる各試料に含まれる分析物の相対量を、第1の質量分析から選択された標識分析物のイオンに対して観察されたレポーターのもとの相対量に基づいて、計算することができる。このプロセスを、第1の質量分析で観察された異なる標識分析物の全てに対して、繰り返すことができる。このようにして、試料混合物を生成するために用いる複数の異なる試料の各々に含まれる各反応性分析物の相対量(しばしは、濃度および/または分量で表現される)を、測定することができる。
本発明の方法、混合物、キット、および/または組成物を複合分析に用いることができる。なぜなら、質量分析技術を用いて、素早くかつ繰り返して、試料を多重化し、分析し、さらに再分析することができるからである。例えば、試料混合物の分析を、1つ以上の試料に含まれる個々の分析物の量について実施することができる。上記試料混合物を構成する試料に対して、これらの分析物の量(しばしば、濃度および/または分量で表される)を測定することができる。試料加工および質量分析を素早くおこなうことができることから、これらの方法を数多く繰り返すことで、試料混合物の多くの差異的標識分析物の量を、分析物が由来する試料中でのそれらの相対量および/または絶対量に関して、測定することができる。
(A.方法)
本発明の方法によれば、測定すべき分析物を標識する。標識分析物、分析物それ自体、分析物の1つ以上のフラグメントおよび/または標識のフラグメントを、質量分析によって測定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、2種類以上の異なる試料に含まれる複数の同一および/または異なる分析物の多重化分析のためにと同様に、同一資料に含まれる複数の異なる分析物の分析のために、用いられる。2種類以上の試料を混合して、1つの試料混合物とすることができる。多重化分析では、標準化試料を用いて、試料混合物のどの試料から分析物が由来するかを測定することができる。分析物の絶対および/または相対(異なる試料に含まれる同一の分析物に関して)量(しばしば濃度または分量で表される)を、試料混合物を形成するために組み合わされた2種類以上の試料で、測定することができる。さらに、分析物のフラグメント(例えば、娘フラグメント・イオン)の質量分析は、分析物および/または該分析物に対する前駆体の同定、例えば分析物に対する前駆体が分解された場合、に用いられる。
(1)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合された水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み;また(2)各Kは、別々に、水素またはアミノ酸側鎖として選択される。この一般構造の標識分析物を生成するのに適した置換ピペラジン標識化試薬は、多くの合成経路によって調製することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は混合物(すなわち、試料混合物)に関する。混合物は、少なくとも2種類の差異的標識分析物を含むことができ、これら2種類の標識分析物の各々は異なる試料から生ずることができ、また式RP−X−LKーY−分析物を有する。各々の異なる標識について、混合物の標識分析物のいくつかが同一であり、該標識分析物のいくつかが異なる。原子、部分または結合、X、Y、RP、およびLKについては、すでに説明されており、またそれらの特性が開示された。混合物は、2種類以上の標識化反応の産物のすべてまたは一部を混合することによって、形成される。ここで、各標識化反応では、一般式RP−X−LK−Y−RGの異なる標識化試薬が用いられ、式中、原子、部分、または結合X、Y、RP、LK、RGについてはすでに説明されており、またそれらの特性が開示されている。標識化試薬は、同位体的にコード化された異性体的または同重体的標識化試薬である。各々の異なる標識化試薬の固有のレポーターは、2種類以上の標識分析物の各々がどの標識反応に由来するかについて指示することができる。標識化試薬は、異性体的または同重体的である。それゆえ、混合物の2種類以上の標識分析物は、異性体的または同重体的である。上記方法のいずれかに開示されるように、混合物は試料混合物である。それらの方法に対応づけられた1つの標識化試薬および複数の標識分析物の特性はすでに述べられている。
いくつかの実施形態では、本発明はキットに関する。キットは、式:RP−X−LK−Y−RGの2種類以上の標識化試薬のセットおよび1種類以上の試薬、容器、酵素、緩衝液、および/または取扱説明書を含むことができる。原子、部分、結合X、Y、RP、LK、RGについてはすでに説明されており、またそれらの特性も開示されている。キットの標識化試薬を異性体的または同重体的なものとすることができる。キットの標準化試薬の他の特性も同様に開示されている。例えば、キットは、同一試料または2種類以上の異なる試料に含まれる1種類以上の分析物の多重化分析にとって有用である。
複数の実施形態では、本発明は、標識化試薬として用いることができる組成物に関する。該組成物は、式RP−X−LK−Y−RGの標識化試薬でありえ、式中、原子、部分、または結合X,Y、RP、LK、RGは、先述しており、それらの特性は開示した。標識化試薬は、異性体的または同重体的でありうる。標識化試薬の他の特性も同様に開示した。例えば、標識化試薬は、同じ試料中または2種類以上の異なる試料中の1種類以上の分析物の多重化分析に有用である。
ブロモ酢酸(2g、14.4mole)をテトラヒドロフラン(50mL)に溶解し、テトラヒドロフラン(THF、20mL)中のモルホリン(3.76g、43.2mole)の攪拌した溶液に滴下した。溶液を室温で3日間攪拌した。白色の固体(4.17g)を濾過し、THF(100mL)で洗浄し、温エタノール(EtOH)から再結晶化した(収率2.59g、IR1740cm−1)。2種類の異なる同重体型のモルホリン酢酸に対して、ブロモアセティック−1−13Cアシッド(bromoacetic−1−13C acid)(Aldrich PN 27,933−1)またはブロモアセティック−2−13Cアシッド(bromoacetic−2−13C acid)(Aldrich PN 27,935−8)のいずれかをブロモ酢酸と置換した。
ジメチルホルムアミド(乾燥、1.75g、0.024M)をテトラヒドロフラン(乾燥、30mLs)に溶解した。この溶液を、テトラヒドロフラン(乾燥、20mLs)に溶解した塩化チオニル(2.85g、0.024M)の攪拌した溶液に滴下し、氷浴で冷却した。添加の完了および氷上での30分後に、氷浴を除去し、固形N−ヒドロキシスクシンイミド(2g、0.017M)を添加(完全に溶解させる)し、その後即座に、固形粉末前モルホリン酢酸(または1−13Cもしくは−2−13Cモルホリン酢酸)(3.64g、0.016M)を添加した。モルホリン酢酸は徐々に溶解し、急速に白濁する均一な溶液を得た。室温で一晩、激しく攪拌しながら反応させた。白色固体をテトラヒドロフランで洗浄し、真空乾燥させた(重量3.65g(67%)、IRスペクトル1828.0cm−1、1790.0cm−1、1736.0cm−1)。
氷上で30分間、氷冷0.5M MOPS緩衝液(NaOHを有してpH7.8、)中で、凍結乾燥Glu−フィブリノペプチドB(Glu−Fibrinopeptide B)(Sigma)100pmole量を、IまたはII(構造に関しては図1A、調製に関しては実施例1および2を参照)いずれかの新たに作製した2%w/v溶液200μlと反応させた。0.5%v/v最終濃度になるようにTFAを添加して、反応を停止させた。その後、修飾ペプチドを、差次的標識ペプチドの1:1ないし10:1範囲をほぼ網羅する種々の所定の比率で混合した。ミリポアC18ジップ−チップ(Millipore C18 Zip−Tip)を用いた逆相脱塩によって、各ペプチド混合物を個々に精製した。過剰な試薬および緩衝液は、逆相パッキング上に保持されないので、MS分析前に効率的に除去された。その後、混合物(0.5μl)をMALDIターゲット・プレート上にスポッティングし、50%中の水性アセトニトリル中で1%w/vα−シアノケイ皮酸0.5μlを用いてオーバー・スポッティングし、QTOF分析計に装着したMALDI源を用いて各試料を分析した。
実践上は、代表的なプロテオーム分析を以下のように実行することができる。比較のための全細胞タンパク質抽出物(例えば、試料AおよびB)を、別々に、トリプシンまたは別のタンパク質分解酵素で消化する。得られたペプチド混合物を、別々に、異なる異性体または同重体標識化試薬(例えば、化合物IおよびII)と反応させ、ペプチドのN末端およびリジンアミンの完全修飾をおこなう。例えば、試料Aを化合物Iと反応させることができ、試料Bを化合物IIと反応させることができる。その後、修飾ペプチド/タンパク質を含有する試料の各々をまとめて混合した後、クロマトグラフィー分離(多くの場合、多次元HPLCを用いて)をおこない、MSおよびMS/MS技術によって分析する。基が同重体的であるとき、単一の標識処理(第2の試薬を用いたリジン基の事前のブロッキングは必要ではない)を用いて標識を実行することができる。
その後、標識タンパク質/ペプチドの混合物をクロマトグラフィーによって分離し、溶出物またはその分画を上記実施例3に記載したように質量分析によって分析する。三連四重極質量分析計またはQトラップ質量分析計を用いて、有効な感度を有意に増加させることも可能であり、ここで、100よび101のm/z領域を前駆イオン・モードでモニタリングする。2つの「署名(signature)」ピークの相対比を、試料AおよびB各々の中の目的とするペプチド/タンパク質分析物各々の比と直接相関させる。本明細書で使用するように「署名(signature)」ピークとは、レポーターに対するピークである。
比較のための全細胞タンパク質抽出物(例えば、試料AおよびB)を、別々に、トリプシンで消化する。得られたペプチド混合物を、別々に、XおよびXI(図8)と反応させ、上述のように、N末端およびリジンアミンの実質的に完全な修飾をおこなう。例えば、試料AペプチドをXと反応させ、試料BペプチドをXIと反応させる。その後、実質的に修飾されたペプチドを含有する試料AおよびBの既知量または各々をまとめて混合する。組み合わされたAおよびBの混合物に、試料AおよびBの混合物中に存在する可能性のあるペプチド(群)にアミノ酸配列および/または翻訳後修飾(例えば、リン酸化)で厳密に対応する合成ペプチド(群)のセット(1種類以上)を正確に測定された量で添加し、ここで、該合成ペプチド(群)を同重体標識化試薬のセットの別の構成要素(例えば、化合物XIIまたはXIII、図8参照)で標識する。試料A、試料B、および合成内部基準ペプチドに由来する組み合わされたペプチド混合物を、任意で、例えば多次元HPLCによってクロマトグラフィー分離するか、または電気泳動分離し、その後、MSおよびMS/MS技術によって、上述のように分析することができる。試料A、試料B,および同一配列の合成対応物に由来する等価物標識ペプチドの全ては、同重体的であり、実質的に同一のクロマトグラフィー特性を有する。「実質的に同一のクロマトグラフィー特性(substantially identical chromatographic property)」とは、差次的に標識されているが同一なペプチドの分離がたとえあるとしても、ほとんどおこなわれないことを意味する。MS/MS分析に続いて、同重体セットの付加的な構成要素(例えば、XIIまたはXIII)で標識された基準ペプチドに起因するレポーターの強度(「署名ピーク(signature peak)」を基準にして、X(試料A)およびXI(試料B)に対するレポーターの相対強度の比較によって、試料AおよびBに由来するペプチドの絶対濃度を正確に測定することが可能である。
ブロモ酢酸をテトラヒドロフラン(または別の好適な非求核性溶剤)に溶解し、テトラヒドロフラン(THF、またはたは別の好適な非求核性溶剤)中の過度のピペリジンを含有する攪拌した溶液に滴下する。溶液を室温で1ないし3日間攪拌する。固体を濾過し、THE(または別の好適な非求核性溶剤)で洗浄し、任意で再結晶化する。2種類の異なる同重体型のピペリジン酢酸に対して、ブロモアセティック−1−13Cアシッド(bromoacetic−1−13C acid)(Aldrich PN 27,933−1)またはブロモアセティック−2−13Cアシッド(bromoacetic−2−13C acid)(Aldrich PN 27,935−8)のいずれかをブロモ酢酸と置換する。異性体置換ピペリジンを好適な出発材料から調製することができ、またはケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories)またはアイソテック(Isotec)等のソースから特別注文ベースで入手することができる。
テトラヒドロフラン(THF)に溶解した2等価物のピペラジンのを含有する溶液を、テトラヒドロフランに溶解した1等価物のブロモ酢酸(ピペラジンの量に対して)を含有する溶液に滴下する。この2つの溶液は、実用的であるように濃縮すべきである。得られた反応溶液を室温で1ないし3日間攪拌する。固体を濾過し、THEで洗浄し、任意で再結晶化する。2種類の異なる同重体型のピペリジン酢酸に対して、ブロモアセティック−1−13Cアシッド(bromoacetic−1−13C acid)(Aldrich PN 27,933−1)またはブロモアセティック−2−13Cアシッド(bromoacetic−2−13C acid)(Aldrich PN 27,935−8)のいずれかをブロモ酢酸と置換する。
ビス(2−メトキシエチル)アミン(Aldrich Chemical)1.1moleに、tert−ブチルクロロアセテート(Aldrich Chemical)500mmolを滴下した。3日間攪拌して、その後反応を生じさせた。最終反応内容物に、ジクロロメタン(DCM)250mLおよび水200mLを添加した。この攪拌溶液に、部分的に、固形炭酸カリウム(K2CO3)300mmolを添加した。混合が完了した後に、層を分離した。DCM層を1容量の水で1回洗浄して、乾燥させ(Na2SO4)、濾過および気化し、非常に薄黄色の油66.3gを得た。この粗産物を60℃でKugelrohrで蒸留し(200ないし500μM Hg)、無色透明の油58.9g(238mmol、95%)を得た。
「立体障害された切断可能なリンカー(sterically hindered cleavable linker)」を含む市販のペプチド合成樹脂を、少なくとも2倍過剰なアミノアルキルピペラジン(例えば、1−(2−アミノエチル)ピペラジン、Aldrich P/N A5,520−9、本明細書内の記載と組合させて図11に説明されるプロセスによって異性体型を作製することができる)と反応させる。「立体障害された切断可能なリンカー(sterically hindered cleavable linker)」とは、リンカーが、固体支持体と切断可能なリンカーに反応する原子または基との間の切断可能な共有結合を形成する第2級または第3級原子を含むことを意味する。立体障害された固体支持体の非限定的例としては、塩化トリチル樹脂(トリチル−Cl、Novabiochem,P/N 01−64−0074)、2−クロロトリチルクロリド樹脂(Novabiochem,P/N 01−64−0021)、DHPP(Bachem,P/N Q−1755)、MBHA(Applied Biosystems P/N 400377)、4−メチルトリチルクロリド樹脂(Novabiochem,P/N 01−64−0075)、4−メトキシトリチルクロリド樹脂(Novabiochem,P/N 01−64−0076)、ヒドロキシ−(2−クロロフェニル)メチル−PS(Novabiochem,P/N 01−64−0345)、リンク・アシッド樹脂(Rink Acid Resin)(Novabiochem,P/N 01−64−0380および01−64−0202)、ノバシンTGT(NovaSyn TGT)アルコール樹脂(Novabiochem,P/N 01−64−0074)が挙げられる。その後、支持体を洗浄することによって、過剰な試薬を除去する。その後、トリエチルアミン等の第3級アミンの存在下で、支持体結合ピペラジンの第2級アミンを過度のブロモ酢酸と反応させる。その後、支持体を洗浄することによって、過剰な試薬を除去する。カルボン酸の活性エステルを生成するために使用する方法(例えば、活性エステルの合成に、カルボン酸の塩が必要であるか否か)に応じて、ビス−アルキル化ピペラジンの支持体結合カルボン酸基をプロトン化するために調整されるpHを有するように洗浄を選択することができる。その後、上記に記載される方法等の、カルボン酸の活性エステルの生成のための当該技術分野で公知の手順を用いて、支持体結合ピペラジンのカルボン酸基を活性エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル)に変換する。その後、得られた固体支持体を用いて、求核性官能基を有する試料の分析物(例えば、ペプチド)を標識することができる。その後、製造元の製品指示書に記載されるように、標識分析物を支持体から遊離させることができる。その後、各切断反応の産物を組み合わせて、試料混合物を形成することができる。
Claims (182)
- 以下:
a)各々の試料が1種類以上の反応性分析物を含む2種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が1種類以上の標識分析物を含む2種類以上の差次的標識試料を生成し、前記セットの前記異なる標識化試薬の各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−RG
またはその塩(式中、
i)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、前記試料の前記1種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、前記セットの各試薬に対して異なるものとし、
iii)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの前記異なる標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、
iv)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
v)Yは、前記リンカーの原子と前記反応基の原子との間の結合であり、ここで、前記標識化試薬が前記反応性分析物と反応したら、結合Yは前記分析物に前記リンカーを結合させ、
vi)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する)を含む、工程;ならびに
b)前記2種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で1種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成し、ここで、RPは、
i)250ダルトン未満の総質量を有し、かつ/または、
ii)質量分析計で標識分析物の結合XおよびY両方の少なくとも一部のフラグメンテーションを起こさせるために印加される解離エネルギーの条件下で、実質的にサブ・フラグメント化が起こらず、かつ/または、
iii)ポリマーではないか、または生体ポリマーではない、工程、
を包含する、方法。 - 以下:
a)各々の試料が1種類以上の反応性分析物を含む2種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が1種類以上の標識分析物を含む2種類以上の差次的標識試料を生成し、前記セットの前記異なる標識化試薬の各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−RGまたはその塩(式中、
i)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、前記試料の前記1種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、前記セットの各試薬に対して異なるものとし、
iii)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの前記異なる標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、
iv)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
v)Yは、前記リンカーの原子と前記反応基の原子との間の結合であり、ここで、前記標識化試薬が前記反応性分析物と反応したら、結合Yは前記分析物に前記リンカーを結合させ、
vi)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する)を含む、工程;ならびに
b)前記2種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で1種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成し、ここで、前記リンカーLKは、質量分析計で結合XおよびY両方のフラグメンテーションを起こす印加された解離エネルギーの条件下で、ニュートラル・ロスを受ける工程、
を包含する、方法。 - 以下:
a)各々の試料が1種類以上の反応性分析物を含む2種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が1種類以上の標識分析物を含む2種類以上の差次的標識試料を生成し、前記セットの前記異なる標識化試薬の各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−RGまたはその塩(式中、
i)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、前記試料の前記1種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、前記セットの各試薬に対して異なるものとし、
iii)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの前記異なる標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、
iv)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
v)Yは、前記リンカーの原子と前記反応基の原子との間の結合であり、ここで、前記標識化試薬が前記反応性分析物と反応したら、結合Yは前記分析物に前記リンカーを結合させ、
vi)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する)を含む、工程;ならびに
b)前記2種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で1種類以上の較正基準とを混合することによって、試料混合物を生成する工程、
を包含し、
質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合XまたはYの一方のフラグメンテーションが結合XまたはYの他方のフラグメンテーションを誘導することを特徴とする、方法。 - 以下:
a)各々の試料が1種類以上の反応性分析物を含む2種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が1種類以上の標識分析物を含む2種類以上の差次的標識試料を生成し、ここで、前記セットの前記異なる標識化試薬の各々が、以下の式:RP−X−LK−Y−RG
またはその塩(式中、
i)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、前記試料の前記1種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、前記セットの各試薬に対して異なるものとし、
iii)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの前記異なる標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、
iv)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
v)Yは、前記リンカーの原子と前記反応基の原子との間の結合であり、ここで、前記標識化試薬が前記反応性分析物と反応したら、結合Yは前記分析物に前記リンカーを結合させ、
vi)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化する)を含む、工程;ならびに
b)前記2種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で1種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成する工程、
を包含し、
i)質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Xは、結合Yに比べてフラグメンテーションの傾向が少なく、かつ/または
ii)質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Xは、Z−proアミノ酸ダイマーまたはZ−aspアミノ酸ダイマーのペプチド結合と比べて、フラグメンテーションの傾向が少なく、ここで、Zは、任意の天然アミノ酸であり、proは、プロリンであり、aspは、アスパラギン酸であることを特徴とする、方法。 - 以下:
a)各々の試料が1種類以上の反応性分析物を含む2種類以上の試料を、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬と反応させる工程であって、該工程によって、各々が1種類以上の標識分析物を含む2種類以上の差次的標識試料を生成し、前記セットの前記異なる標識化試薬の各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−RGまたはその塩、
(式中、
i)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、前記試料の前記1種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、前記セットの各試薬に対して異なるものとし、
iii)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、
a)前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの前記異なる標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、かつ
b)前記リンカーは、少なくとも1種類の重原子同位体を含み、以下の式:
式中、R1は、同一または異なるものであり、1ないし8個の炭素原子を含むアルキル基とし、前記アルキル基はヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここで前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
iv)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
v)Yは、前記リンカーの原子と前記反応基の原子との間の結合であり、ここで、前記標識化試薬が前記反応性分析物と反応したら、結合Yは前記分析物に前記リンカーを結合させる)を含む、工程;ならびに
b)前記2種類以上の差次的標識試料またはその部分と、任意で1種類以上の較正基準とを混合する工程であって、該工程によって、試料混合物を生成する工程、
を包含する、方法。 - 以下:
c)前記試料混合物またはその分画上で第1の質量分析を実行する工程;
d)前記第1の質量分析で選択された標識分析物のイオンを解離エネルギー・レベルにさらすことによって、イオン化されたレポーター部分と、少なくとも複数の前記選択されたイオンのイオン化された娘フラグメント・イオンとを形成する工程;ならびに
e)前記選択されたイオン、前記イオン化されたレポーター部分、および前記娘フラグメント・イオン、またはそれらの分画上で第2の質量分析を実行する工程、
をさらに包含する、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。 - 以下:
f)前記第2の質量分析で、各レポーター部分の総質量および相対量と、前記娘フラグメント・イオンの総質量とを測定する工程、
をさらに包含する、請求項6に記載の方法。 - 電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程(d)ないし(f)を1回以上繰り返すことをさらに包含する、請求項7に記載の方法。
- 工程(a)ないし(f)を1回以上繰り返し、各回が前記試料混合物の異なる分画を用いることをさらに包含する、請求項8に記載の方法。
- 前記2種類以上の試料が酵素的消化反応の産物である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2種類以上の試料がタンパク質分解酵素的消化反応の産物である、請求項10に記載の方法。
- 前記タンパク質酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、ArgC、LysC、V8プロテアーゼ、AspN、プロナーゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼCである、請求項11に記載の方法。
- 各試料が粗または加工済みの細胞溶解物、体液、組織抽出物、あるいは細胞抽出物である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 各試料が分離プロセスから得た分画である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分離プロセスがクロマトグラフィー分離または電気泳動分離である、請求項14に記載の方法。
- 前記体液が血液、尿、髄液、脳脊髄液、羊水、リンパ液、または腺分泌液である、請求項13に記載の方法。
- 前記1種類以上の分析物がタンパク質、核酸分子、炭化水素、脂質、ステロイド、または1500ダルトン未満の低分子である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種類以上の分析物がペプチドである、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドが少なくとも1種類のタンパク質の消化によって形成される、請求項18に記載の方法。
- 前記ペプチドが粗細胞溶解物の全タンパク質成分の消化によって形成される、請求項19に記載の方法。
- 前記セットの各試薬の前記反応基が前記反応性分析物との反応のためにin situで調製される、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記セットの前記各試薬の前記反応基が、水溶性カルボジイミドで活性化されたカルボン酸基である、請求項21に記載の方法。
- 前記水溶性カルボジイミドが1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3エチルカルボジイミドハイドロクロリド(EDC)である、請求項22に記載の方法。
- 前記セットの各試薬の前記反応基がアミン反応性の活性エステル基である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記活性エステルがN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、2−ニトロフェニルエステル、4−ニトロフェニルエステル、2,4−ジニトロフェニルエステル、または2,4−ジハロフェニルエステルである、請求項24に記載の方法。
- 前記セットの各試薬の前記反応基がチオール反応求電子性基である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記チオール反応基がマレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、およびα−ハロアシルからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記セットの各試薬の前記反応基がヒドロキシル反応求電子性基である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 各試薬の前記反応基がアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基からなる群から選択される求核性試薬である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーターが置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジン化合物、あるいはそれらの塩である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーターがカルボン酸、スルホン酸、またはリン酸基含有化合物、あるいはそれらの塩である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター部分が、前記分析物を測定するために用いられる条件下で、実質的にサブ・フラグメント化を起こさないことを特徴とする、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター部分が生体ポリマーではないことを特徴とする、請求項2ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター部分がポリマーではないことを特徴とする、請求項2ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーがカルボニルまたはチオカルボニル基である、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーがポリマーまたはバイオポリマー部分である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマー部分がサブ・フラグメント化することができる、請求項36に記載の方法。
- 前記1種類以上の差次的標識分析物の各々が、前記差次的標識分析物をもたらす前記試料を同定する異性体的標識を含む、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種類以上の差次的標識分析物の各々が、前記差次的標識分析物をもたらす前記試料を同定する同重体的標識を含む、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 各同重体的標識分析物の前記標識が、N−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して前記分析物が結合する置換または非置換酢酸部分によってN−アルキル化される環状窒素原子を有する5、6、または7員複素環であり、各々の異なる標識が1種類以上の重原子同位体を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記試料混合物中の前記同重体的標識分析物の各々が、以下の式:
式中、
a)Zは、O、S、NH、またはNR1であり、
b)各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり、
c)Wは、前記環状窒素にオルト、メタ、またはパラで位置する原子または基であり、NH、N−R1、N−R2、P−R1、P−R2、O、またはSであり、
d)前記複素環の各炭素は、式CJ2を有し、
e)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
f)R2は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基、または前記試薬を固体支持体に切断可能に結合させる切断可能なリンカーであり、ここで、前記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、1ないし8個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項40に記載の方法。 - 前記同重体的標識分析物がペプチドである、請求項40に記載の方法。
- 前記試料混合物が、以下の式:
式中、
a)G’は、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基であり、ここで、前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
b)前記複素環の各炭素は式CJ2を有し、ここで、各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
c)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項41に記載の方法。 - 前記同重体的標識分析物がペプチドである、請求項47に記載の方法。
- 前記セットの各異なる標識化試薬が支持体結合性であり、異なる標識化試薬を保持する支持体と各異なる試料を反応させるように切断可能なリンカーを介して前記支持体に結合され結合され、かつ、前記方法は、工程(b)を実行する前に、
i)任意で樹脂を洗浄し、前記標識化試薬の前記反応基と反応しない前記試料の成分を除去する工程;および
ii)前記切断可能なリンカーを切断する工程であって、該工程によって、各々の試料が1種類以上の標識分析物を含む前記2種類以上の差次的標識試料を回収する、工程、
をさらに包含し、
特定の試料に関連する前記標識分析物が、そこに結合する固有の前記レポーターによって同定可能および/定量可能である、請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。 - 前記セットの各異なる標識化試薬が、以下の式:
E−F−RP−X−LK−Y−RG
の固体支持体であり、
式中、
i)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、前記試料の前記1種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、前記セットの各試薬に対して異なるものとし、
iii)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの前記異なる標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、
iv)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
v)Yは、前記リンカーの原子と前記反応基の原子との間の結合であり、ここで、前記標識化試薬が前記反応性分析物と反応したら、結合Yは前記分析物に前記リンカーを結合させ、
vi)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
vii)Eは、固体支持体であり、
viii)Fは、前記固体支持体へ結合され、かつ前記レポーターへ切断可能に結合される切断可能なリンカーである、請求項50に記載の方法。 - 標識化試薬の前記セットが、1種類以上の以下の支持体結合標識化試薬、すなわち、
式中、
i)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、前記試料の前記1種類以上の反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)Eは、固体支持体であり、
iii)Fは、前記固体支持体へ結合され、かつ前記レポーターへ切断可能に結合される切断可能なリンカーであり、
iv)Gは、前記切断可能なリンカーに切断可能に結合させるアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、ここで、前記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、1ないし8個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
v)前記複素環の各炭素は式CJ2を有し、ここで、各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
vi)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項51に記載の方法。 - 前記支持体がポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリアクリルアミド、ガラス、シリカ、制御多孔性ガラス(CPG)、または逆相シリカから構成される、請求項50に記載の方法。
- 前記固体支持体がビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面状である、請求項50に記載の方法。
- 以下:
c)工程a)を実行する前に、各試料を少なくとも1種類の酵素で消化して、前記試料の成分を部分的または完全に分解する工程、をさらに包含する、請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。 - 前記酵素がタンパク質分解酵素である、請求項55に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、ArgC、LysC、V8プロテアーゼ、AspN、プロナーゼ、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼCである、請求項56に記載の方法。
- 前記方法が、以下:
c)前記試料混合物を分離する工程、
をさらに包含する、請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。 - 前記分離がクロマトグラフィーによって実行される、請求項58に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー分離の方法が順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティー・クロマトグラフィーである、請求項59に記載の方法。
- 前記分離が電気泳動によっておこなわれる、請求項58に記載の方法。
- 前記電気泳動分離が1次元電気泳動分離、2次元電気泳動分離、またはキャピラリー電気泳動分離である、請求項61に記載の方法。
- 前記方法が、以下:
c)工程a)を実行する前に、各試料を少なくとも1種類の酵素で消化して、前記試料の成分を部分的または完全に分解する工程;および
d)前記試料混合物を分離する工程、
をさらに包含する、請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。 - 前記酵素がタンパク質分解酵素である、請求項63に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼCである、請求項64に記載の方法。
- 前記分離がクロマトグラフィーによって実行される、請求項63に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー分離の方法が順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティー・クロマトグラフィーである、請求項66に記載の方法。
- 前記分離が電気泳動分離である、請求項63に記載の方法。
- 前記電気泳動分離が1次元電気泳動分離、2次元電気泳動分離、またはキャピラリー電気泳動分離である、請求項68に記載の方法。
- 電荷比に対する選択された質量に関連する前記標識分析物の同一性が前記娘フラグメント・イオンの分析によって測定される、請求項7に記載の方法。
- 前記第2の質量分析での各レポーターの相対量が他のレポーターを基準にして測定される、請求項70に記載の方法。
- 前記同定された分析物に関連する各レポーターの相対量を、前記試料混合物を形成するために添加される各試料の量に相関させることによって、前記混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の前記分析物の相対量を測定する、請求項71に記載の方法。
- (i)前記試料混合物が前記同定された分析物に対する既知量の較正基準を含み、各レポーターの絶対量が前記較正基準に関連するレポーターの量を基準にして測定され、
(ii)前記試料混合物の各異なる試料中の前記同定された分析物の絶対量が各レポーターの量を基準にして測定される、請求項72に記載の方法。 - 電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程(d)ないし(f)を1回以上繰り返すことによって、前記試料混合物を形成するために組み合わされた前記2種類以上の試料の各々中の1種類以上の他の分析物の相対量を同定および/または測定することをさらに包含する、請求項72に記載の方法。
- 電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程(d)ないし(f)を1回以上繰り返すことによって、前記試料混合物を形成するために組み合わされた前記2種類以上の試料の各々中の1種類以上の他の分析物の絶対量を同定および/または測定することをさらに包含する、請求項73に記載の方法。
- 前記分析物がペプチドであり、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の1種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の前記1種類以上のペプチドの同一性および相対量にもとづいて測定される、請求項72に記載の方法。
- 前記分析物がペプチドであり、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の1種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の前記1種類以上のペプチドの同一性および絶対量にもとづいて測定される、請求項73に記載の方法。
- 以下:
c)工程(a)を実行する前に、各試料を少なくとも1種類の酵素で消化して、前記試料の成分を部分的または完全に分解する工程;および
d)工程(c)を実行する前に、前記試料混合物を分離する工程、
をさらに包含する、請求項7に記載の方法。 - 前記酵素がタンパク質分解酵素である、請求項78に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素がトリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼCである、請求項79に記載の方法。
- 前記分離がクロマトグラフィーによって実行される、請求項78に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー分離の方法が順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティー・クロマトグラフィーである、請求項81に記載の方法。
- 前記分離が電気泳動分離である、請求項78に記載の方法。
- 前記電気泳動分離が1次元電気泳動分離、2次元電気泳動分離、またはキャピラリー電気泳動分離である、請求項83に記載の方法。
- 電荷比に対する選択された質量に関連する前記標識分析物の同一性が前記娘フラグメント・イオンの分析によって測定される、請求項78に記載の方法。
- 前記第2の質量分析での各レポーターの相対量が他のレポーターを基準にして測定される、請求項85に記載の方法。
- 前記同定された分析物に関連する各レポーターの相対量を、前記試料混合物を形成するために添加される各試料の量に相関させることによって、前記混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の前記分析物の相対量を測定する、請求項86に記載の方法。
- (i)前記試料混合物が前記同定された分析物に対する既知量の較正基準を含み、各レポーターの絶対量が前記較正基準に関連するレポーターの量を基準にして測定され、
(ii)前記試料混合物の各異なる試料中の前記同定された分析物の絶対量が各レポーターの量を基準にして測定される、請求項87に記載の方法。 - 電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程(d)ないし(f)を1回以上繰り返すことによって、前記試料混合物を形成するために組み合わされた前記2種類以上の試料の各々中の1種類以上の他の分析物の相対量を同定および/または測定することをさらに包含する、請求項87に記載の方法。
- 電荷比に対する異なる選択された質量で選択された標識分析物のイオン上で、工程(d)ないし(f)を1回以上繰り返すことによって、前記試料混合物を形成するために組み合わされた前記2種類以上の試料の各々中の1種類以上の他の分析物の絶対量を同定および/または測定することをさらに包含する、請求項88に記載の方法。
- 前記分析物がペプチドであり、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の1種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の前記1種類以上のペプチドの同一性および相対量にもとづいて測定される、請求項87に記載の方法。
- 前記分析物がペプチドであり、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の1種類以上のタンパク質の同一性および相対量が、前記試料混合物を形成するために組み合わされる前記2種類以上の試料の各々の中の前記1種類以上のペプチドの同一性および絶対量にもとづいて測定される、請求項88に記載の方法。
- 少なくとも2種類の標識分析物を含む混合物であって、前記2種類の標識分析物の各々が前記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−分析物
またはその塩を含み、
式中、
a)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
b)LKは、前記分析物と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように前記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
c)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
d)Yは、前記リンカーの原子と前記分析物の原子との間の結合であり、
e)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、RPは、
i)250ダルトン未満の総質量を有し、かつ/または、
ii)質量分析計で標識分析物の結合XおよびY両方の少なくとも一部のフラグメンテーションを起こさせるために印加される解離エネルギーの条件下で、実質的にサブ・フラグメント化が起こらず、かつ/または、
iii)ポリマーではないか、または生体ポリマーではない、混合物。 - 少なくとも2種類の標識分析物を含む混合物であって、前記2種類の標識分析物の各々が前記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−分析物またはその塩を含み、
式中、
a)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
b)LKは、前記分析物と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように前記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
c)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
d)Yは、前記リンカーの原子と前記分析物の原子との間の結合であり、
e)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、前記リンカーLKは、質量分析計で結合XおよびY両方のフラグメンテーションを起こす印加された解離エネルギーの条件下で、ニュートラル・ロスを受ける、混合物。 - 少なくとも2種類の標識分析物を含む混合物であって、前記2種類の標識分析物の各々が前記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−分析物
またはその塩を含み、
式中、
a)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
b)LKは、前記分析物と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように前記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
c)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
d)Yは、前記リンカーの原子と前記分析物の原子との間の結合であり、
e)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合XまたはYの一方のフラグメンテーションが結合XまたはYの他方のフラグメンテーションを誘導する、混合物。 - 少なくとも2種類の標識分析物を含む混合物であって、前記2種類の標識分析物の各々が前記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−分析物
またはその塩を含み、
式中、
a)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
b)LKは、前記分析物と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が各標識分析物に対して同じものであるように前記異なるレポーター間の総質量での差異を補正し、
c)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
d)Yは、前記リンカーの原子と前記分析物の原子との間の結合であり、
e)結合Xおよび結合Yは、解離エネルギー・レベルを受けた場合に、前記標識分析物の少なくとも部分でフラグメント化し、
ここで、
i)質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Xは、結合Yに比べてフラグメンテーションの傾向が少なく、かつ/または
ii)質量分析計で印加された解離エネルギーの条件下で、結合Xは、Z−proアミノ酸ダイマーまたはZ−aspアミノ酸ダイマーのペプチド結合と比べて、フラグメンテーションの傾向が少なく、ここで、Zは、任意の天然アミノ酸であり、proは、プロリンであり、aspは、アスパラギン酸であることを特徴とする混合物。 - 少なくとも2種類の標識分析物を含む混合物であって、前記2種類の標識分析物の各々が前記混合物を形成するために組み合わされる異なる試料から発生し、各々が、以下の式:
RP−X−LK−Y−分析物
またはその塩を含み、
式中、
a)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、各試料に対して異なるものとし、
b)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、
i)前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの前記異なる標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、かつ
ii)前記リンカーは、少なくとも1種類の重原子同位体を含み、以下の式:
式中、R1は、同一または異なるものであり、1ないし8個の炭素原子を含むアルキル基とし、前記アルキル基はヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここで前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
c)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
d)Yは、前記リンカーの原子と前記分析物の原子との間の結合であることを特徴とする混合物。 - 前記1種類以上の分析物がペプチドである、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記1種類以上の分析物がタンパク質である、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記1種類以上の分析物が核酸分子である、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記レポーターが置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジン化合物、あるいはそれらの塩である、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記レポーターがカルボン酸、スルホン酸、またはリン酸基含有化合物、あるいはそれらの塩である、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記リンカーがカルボニルまたはチオカルボニル基である、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記少なくとも2種類の標識分析物の各々が異性体的標識を含む、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記少なくとも2種類の標識分析物の各々が同重体的標識を含む、請求項93ないし97のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記少なくとも2種類の標識分析物の各々が、N−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して前記分析物が結合する置換または非置換酢酸部分によってN−アルキル化される環状窒素原子を有する5、6、または7員複素環である同重体的標識を含み、各々の異なる標識が1種類以上の重原子同位体を含む、請求項105に記載の混合物。
- 前記混合物中の前記少なくとも2種類の同重体的標識分析物の各々が、以下の式:
式中、
a)Zは、O、S、NH、またはNR1であり、
b)各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素であり、
c)Wは、前記環状窒素にオルト、メタ、またはパラで位置する原子または基であり、NH、N−R1、N−R2、P−R1、P−R2、O、またはSであり、
d)前記複素環の各炭素は、式CJ2を有し、
e)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
f)R2は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基、または前記試薬を固体支持体に切断可能に結合させる切断可能なリンカーであり、ここで、前記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、1ないし8個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項106に記載の混合物。 - 前記混合物が、以下の式:
式中、
a)G’は、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、ここで、前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
b)前記複素環の各炭素は式CJ2を有し、ここで、各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
c)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項107に記載の混合物。 - 1種類以上の較正基準をさらに包含する、請求項93ないし97のいずれかに記載の混合物。
- N−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して活性エステルのアルコール部分が結合する置換または非置換酢酸部分によってN−アルキル化される環状窒素原子を有する5、6、または7員複素環である活性エステル化合物であって、前記化合物が1種類以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされていることを特徴とする化合物。
- 前記化合物が3種類以上の重原子同位体で同位体的にエンリッチされている、請求項113に記載の化合物。
- 前記複素環が1種類以上の置換基で置換されている、請求項113に記載の化合物。
- 前記1種類以上の置換基がアルキル、アルコキシ、またはアリール基である、請求項115に記載の化合物。
- 前記1種類以上の置換基が保護または非保護のアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基である、請求項116に記載の化合物。
- 前記複素環が脂肪族である、請求項113に記載の化合物。
- 前記複素環が芳香族である、請求項113に記載の化合物。
- 前記複素環が1個以上の付加的な窒素、酸素、またはイオウ原子を含む、請求項113に記載の化合物。
- 前記活性エステルがN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項113に記載の化合物。
- 前記化合物が塩である、請求項113に記載の化合物。
- 前記化合物がモノTFA塩、モノHCl塩、ビスTFA塩、またはビスHCl塩である、請求項113に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも80%の同位体純度で存在する、請求項113に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも93%の同位体純度で存在する、請求項113に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも96%の同位体純度で存在する、請求項113に記載の化合物。
- 前記N−置換モルホリン酢酸活性エステルが3種類以上の重原子同位体でエンリッチされる、請求項127に記載の化合物。
- LGがN−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項127に記載の化合物。
- 各Zが別々に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である、請求項127に記載の化合物。
- 各Zが別々に水素、メチル、またはメトキシである、請求項127に記載の化合物。
- Xが16Oまたは18Oである、請求項127に記載の化合物。
- 前記モルホリンの環の窒素原子が14Nまたは15Nである、請求項127に記載の化合物。
- 前記化合物がモノTFA塩またはモノHCl塩である、請求項127に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも80%の同位体純度で存在する、請求項127に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも93%の同位体純度で存在する、請求項127に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも96%の同位体純度で存在する、請求項127に記載の化合物。
- 前記N−置換ピペリジン酢酸活性エステルが3種類以上の重原子同位体でエンリッチされる、請求項140に記載の化合物。
- LGがN−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項140に記載の化合物。
- 各Zが別々にて水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である、請求項140に記載の化合物。
- 各Zが別々に水素、メチル、またはメトキシである、請求項140に記載の化合物。
- Xが16Oまたは18Oである、請求項140に記載の化合物。
- 前記ピペリジンの環の窒素原子が14Nまたは15Nである、請求項140に記載の化合物。
- 前記化合物がモノTFA塩またはモノHCl塩である、請求項140に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも80%の同位体純度で存在する、請求項140に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも93%の同位体純度で存在する、請求項140に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも96%の同位体純度で存在する、請求項40に記載の化合物。
- 前記N−置換ピペラジン酢酸活性エステルが3種類以上の重原子同位体でエンリッチされる、請求項153に記載の化合物。
- LGがN−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項153に記載の化合物。
- 各Zが別々に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である、請求項153に記載の化合物。
- 各Zが別々に水素、メチル、またはメトキシである、請求項153に記載の化合物。
- Xが16Oまたは18Oである、請求項153に記載の化合物。
- 前記ピペラジンの環の各窒素原子が14Nまたは15Nである、請求項153に記載の化合物。
- 前記化合物がモノTFA塩、モノHCl塩、ビスTFA塩、またはビスHCl塩である、請求項153に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも80%の同位体純度で存在する、請求項153に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも93%の同位体純度で存在する、請求項153に記載の化合物。
- 組み込まれる重原子同位体の各々が少なくとも96%の同位体純度で存在する、請求項153に記載の化合物。
- a)セットの各々の試薬が、以下の式:
RP−X−LK−Y−RG
またはその塩を含む分析物の標識に適した2種類以上の試薬の前記セットと、
(式中、
i)RGは、求電子試薬である反応基であり、前記試料の1種類以上の前記反応性分析物と反応することが可能であり、
ii)RPは、固定された電荷を含むか、またはイオン化することが可能なレポーター部分であり、ここで、各レポーターの質量は、前記セットの各試薬に対して異なるものとし、
iii)LKは、前記反応基と前記レポーターの基とを結合させるリンカー部分であり、ここで、
a)前記リンカーの質量は、前記レポーターとリンカーとの組合せの統合総質量が前記セットの各試薬に対して同じものであるように前記セットの異なる前記標識化試薬に対する前記レポーター間の総質量での差異を補正し、かつ
b)前記リンカーは、少なくとも1種類の重原子同位体を含み、以下の式:
式中、R1は、同一または異なるものであり、1ないし8個の炭素原子を含むアルキル基とし、前記アルキル基はヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を任意に含むものであってもよく、ここで前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
iv)Xは、前記レポーターの原子と前記リンカーとの間の結合であり、
v)Yは、前記リンカーの原子と前記反応基の原子との間の結合であり、ここで、前記標識化試薬が前記反応性分析物と反応したら、結合Yは前記分析物に前記リンカーを結合させる。)
b)1種類以上の試薬、容器、酵素、緩衝剤、または指示書と、
を含む、キット。 - 前記キットがタンパク質分解酵素を含む、請求項166に記載のキット。
- 前記セットの各試薬の前記反応基が活性エステルである、請求項166に記載のキット。
- 前記活性エステルがN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項168に記載のキット。
- 前記レポーターが置換または非置換のモルホリン、ピペリジン、またはピペラジンである、請求項166に記載のキット。
- 前記レポーターがカルボン酸、スルホン酸、またはリン酸基を含む、請求項166に記載のキット。
- 前記リンカーがカルボニルまたはチオカルボニル基である、請求項166に記載のキット。
- 前記セットの各試薬が、別々に、切断可能なリンカーを介して固体支持体に結合する、請求項166に記載のキット。
- 前記セットの全ての試薬が異性体的である、請求項166に記載のキット。
- 前記セットの全ての試薬が同重体的である、請求項166に記載のキット。
- 前記セットの全ての試薬が、以下の式:
式中、
a)RGは、求電子試薬である反応基であり、
b)Zは、O、S、NH、またはNR1であり、
c)各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
d)Wは、前記環状窒素にオルト、メタ、またはパラで位置する原子または基であり、NH、N−R1、N−R2、P−R1、P−R2、O、またはSからなる群から選択され、
e)前記複素環の各炭素は、式CJ2を有し、
f)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
g)R2は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基、または前記試薬を固体支持体に切断可能に結合させる切断可能なリンカーであり、ここで、前記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、1ないし8個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに前記アルキルおよびアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項176に記載のキット。 - 前記セットが、以下の4種類の支持体結合試薬、すなわち、
式中、
a)RGは、前記反応基であり、
b)Eは、固体支持体であり、
c)Fは、前記固体支持体へ結合される切断可能なリンカーであり、
d)Gは、切断可能なリンカーに切断可能に結合させるアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基であり、ここで、前記アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、またはチオアルキル基は、1ないし8個の炭素原子を有し、かつ任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよく、さらに前記アルキルおよびアリール基の記炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含み、
e)前記複素環の各炭素は式CJ2を有し、ここで、各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
f)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項177に記載のキット。 - 前記セットの全ての試薬が、以下の式:
式中、
a)RGは、求核試薬または求電子試薬である反応基であり、
b)Zは、O、S、NH、またはNR1であり、
c)各Jは、同一または異なるものであり、H、重水素(D)、R1、OR1、SR1、NHR1、N(R1)2、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され、
d)各R1は、同一または異なるものであり、任意でヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでもよい炭素原子数1ないし8個のアルキル基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール基の炭素原子は、別々に、結合した水素、重水素、および/またはフッ素原子を含む、請求項176に記載のキット。
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