JP4832312B2 - 標識試薬および標識化分析物の混合物を含む、標識試薬、標識化分析物、およびそれらに由来するフラグメントイオン、ならびにそれらの分析方法 - Google Patents
標識試薬および標識化分析物の混合物を含む、標識試薬、標識化分析物、およびそれらに由来するフラグメントイオン、ならびにそれらの分析方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2004年5月24日に出願された米国特許出願第10/852,730号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第10/852,730号は、2004年4月12日に出願された米国特許出願第10/822,639号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第10/822,639号は、2004年1月5日に出願された米国特許出願第10/751,353号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第10/751,353号は、2004年1月5日に出願された米国特許出願第10/751,387号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第10/751,387号は、2004年1月5日に出願された米国特許出願第10/751,388号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第10/751,388号は、2004年1月5日に出願された米国特許出願第10/751,354号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。
本発明は標識試薬および標識化分析物の混合物を含む、標識試薬、標識化分析物、およびそれらに由来するフラグメントイオン、ならびに標識化分析物の分析のための方法に関する。
本発明は、質量分析による分析物の測定に関する。分析物は、任意の目的分子であり得る。分析物の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、および1500ダルトン未満の低分子が挙げられるが、これらに限定されない。
Innovation And Perspectives In Solid Phase Synthesis(1990)編者:Roger Epton,SPCC(UK)Ltd,Birmingham
本明細書の解釈の目的のために、以下の定義が適用され、そして適切ならばいつでも、単数形は複数形もまた包含し、逆もまた同様である。以下の定義は、他の文書(参考として本明細書中に援用されるものも含む)に含まれる他の可能な定義より優先する。
例えば、酸素の一般的な同位体は、16.0の総質量(実際の質量は15.9949)および18.0の総質量(実際の質量は17.9992)を有し、炭素の一般的な同位体は、12.0の総質量(実際の質量は12.00000)および13.0の総質量(実際の質量は13.00336)を有し、そして窒素の一般的な同位体は、14.0の総質量(実際の質量は14.0031)および15.0の総質量(実際の質量は15.0001)を有する。これらの値は近似であるが、当業者は、あるセットのレポーターにおいて18O同位体を用いる場合、(総質量16.0を有する酸素の同位体に対する)追加の2の質量単位は、18Oを埋め合わせるために、16Oを含むセットの異なるレポーターにおいて、例えば2つの12C原子の代わりに2つの13C原子を、2つの14N原子の代わりに2つの15N原子を、または1つの12C原子および14N原子の代わりに1つの13C原子および1つの15N原子を、そのレポーター内のどこへでも組み込むことにより、埋め合わせられ得る。このようにして、そのセットの2つの異なるレポーターは、機能的質量等価(すなわち、同じ総質量を有する)である。なぜなら、2つの13C原子(2つの12C原子の代わり)の使用、2つの15N原子(2つの14N原子の代わり)の使用、1つの13Cおよび1つの15N(1つの12Cおよび1つの14Nの代わり)の使用(これらにより質量において2ダルトンの増加を達成する)の間の、質量における非常に小さな実際の差異は、そのセットまたはキットの全ての標識において、分析の性質の妨げとならない。
(I.概要)
(反応性基)
本方法、混合物、キットおよび/または組成物の実施形態において使用され得る標識試薬の反応基「RG」は、サンプルの1種以上の反応性分析物と反応し得る、求電子試薬または求核試薬のいずれかであり得る。その反応基は、前から存在してもよいし、インサイチュで調製されてもよい。反応基のインサイチュ調製は、反応性分析物の非存在下で進行してもよいし、反応性分析物の存在下で進行してもよい。例えば、カルボン酸基は、インサイチュで水溶性カルボジイミド(例えば、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩;EDC)で改変され得、これによりアルキルアミンまたはアリールアミンのような求核試薬と反応し得る求電子基を調製し得る。いくつかの実施形態において、EDCによる標識試薬のカルボン酸基の活性化は、分析物を含むアミン(求核試薬)の存在下で実施され得る。いくつかの実施形態において、分析物を含むアミン(求核試薬)もまた、EDCとの初期反応が実施された後に、添加され得る。他の実施形態において、反応基は、保護基のインサイチュ除去により、インサイチュで生成され得る。その結果、求核試薬および/または求電子試薬の反応により分析物の誘導体化をもたらし得る、存在しているか又は新たに作製された試薬が、本発明の方法、混合物、キットおよび/または組成物の実施形態により企図される。
本発明の実施形態において使用される標識試薬のレポーター部分は、測定され得る独特の質量(または質量対電荷比)を有する基であり得る。したがって、あるセットの各レポーターは、独特の総質量を有し得る。異なるレポーターは、それらの独特の質量を達成するために、1以上の重原子を含み得る。例えば、炭素の同位体(l2C、l3Cおよびl4C)、窒素(14Nおよび15N)、酸素(16Oおよび18O)または水素(水素、重水素および三重水素)が存在し、そしてレポーター部分の多様な基の調製において使用され得る。安定な重原子同位体としては、13C、15N、18Oおよび重水素が挙げられる。これらは他の軽原子同位体および重原子同位体もまたそのレポーターにおいて使用され得ることを制限しない。軽原子同位体および重原子同位体を含むレポーターを調製するための基本的な出発物質は、種々の商業的供給元から入手可能である。その商業的供給元は、例えば、Cambridge Isotope Laboratories,Andover,MA(一覧表またはwww.isotope.comの「basic starting materials」を参照のこと)およびIsotec(Sigma−Aldrichの部門)である。Cambridge Isotope LaboratoriesおよびIsotecはまた、特注の合成契約の下で、所望の化合物を調製する。Id.
独特のレポーターは、目的のサンプルと結合し得、それによりそのサンプルの1以上の多重分析物をレポーターで標識化し得る。このようにして、レポーターについての情報が、そのサンプルの1つまたは全ての分析物についての情報と関連し得る。しかし、そのレポーターが測定される場合、そのレポーターは分析物に物理的に結合される必要はない。むしろ、標識化分析物のイオンがフラグメント化され、それにより娘フラグメントイオンおよび検出可能なレポーターを生成した後に、レポーターの独特の総質量が、例えばタンデム型質量分析器での第二の質量分析において測定され得る。測定されるレポーターは、サンプル(このサンプルから、測定される分析物が生じた)を同定するために使用され得る。さらに、他のレポーターの量に対してかまたは較正標準物質(例えば、特定のレポーターで標識化された分析物)に対してかのいずれかの、独特のレポーターの量は、サンプル(単数または複数)における分析物の相対量または絶対量(しばしば、濃度および/または量と表される)を測定するために使用され得る。それゆえ、特定のサンプルにおける1種以上の分析物の量のような情報は、特定のサンプルの各々を標識化するために使用されるレポーター部分と関連し得る。分析物(単数または複数)の同一性もまた決定される場合、その情報は、異なるレポーターに付随する情報と関連し得、それにより1または複数のサンプルにおける標識化分析物の各々の同一性および量の決定を促進する。
本発明の実施形態とともに使用される標識化試薬のリンカー部分は、その分析物との反応が、起こったか否かに依存して、上記レポーターを上記分析物に連結するか、またはそのレポーターを反応性基に連結する。このリンカーは、結合Xおよび結合Yの両方がフラグメント化されたときに(すなわち、結合XおよびYの両方のフラグメンテーションの際に中性損失(neutral loss)を受けたときに)、中性種を生成するように選択され得る。このリンカーは、カルボニル基またはチオカルボニル基のような非常に小さい部分であり得る。例えば、そのリンカーは、少なくとも1個の重原子同位体を含み得、かつ式:
本明細書中に記載される標識化試薬は、結合Xを介して連結されるレポーターおよびリンカーを含む。上に記載されたように、レポーター/リンカーの組合せは、標識化試薬セットおよび/またはキットの各メンバーに対して、総質量が同一であり得る。さらにこの標識化試薬のレポーター/リンカーの組合せの結合Xは、解離エネルギーレベルにさらされたときに、選択されたイオンの少なくとも一部分においてフラグメント化し、それによりリンカーおよび/または分析物からレポーターを放出するように設計され得る。従って、そのレポーターの(m/s比としての)総質量およびその強度は、MS/MS分析において直接観察され得る。
本発明の方法は、タンデム型質量分析計、および分子イオンを選択しフラグメント化する能力を有する他の質量分析計を使用して実施され得る。タンデム型質量分析計(および、より程度は少ないが一段階質量分析計)は、分子イオンの質量対電荷(m/z)比に従って、分子イオンを選択しフラグメント化し、次いで生じたフラグメント(娘)イオンスペクトルを記録する能力を有する。より具体的には、娘フラグメントイオンスペクトルは、選択されたイオンを解離エネルギーレベル(例えば、衝突誘起解離(collision−induced dissociation(CID))にさらすことにより、生成され得る。例えば、特定のm/z比を有する標識化ペプチドに対応するイオンが、第1の質量分析から選択され得、フラグメント化され得、そして第2の質量分析中で再分析され得る。このようなタンデム質量分析を実施し得る代表的な機器としては、磁気4セクター型(magnetic four−sector)質量分析計、タンデム飛行時間型質量分析計、トリプル四重極(triple quadrupole)質量分析計、イオントラップ型質量分析計、およびハイブリッド四重極(hybrid quadrupole)飛行時間型(Q−TOF)質量分析計が挙げられるがこれらに限定されない。
質量分析計中で起こっているプロセスの結果として、結合がフラグメント化することはよく受け入れられている。さらに、結合のフラグメンテーションは、イオンを解離エネルギーレベルに供することにより、質量分析計中で誘起され得る。例えば、その解離エネルギーレベルは、衝突誘起解離(CID)により、質量分析計中で生成され得る。質量分析の分野の当業者は、フラグメンテーションを引き起こす解離エネルギーレベルを付加するための他の例示的な技術としては、光解離、電子捕捉および表面誘起解離が挙げられるが、これらにテ限定されないことを理解する。
いくつかの実施形態において、分析物は、娘イオンフラグメンテーションパターンに基づいて、決定され得る。これらのパターンは、公知のスペクトルまたは「理論」分析物とのコンピュータ支援比較によって、分析される。例えば、低エネルギーCIDの条件下でフラグメント化されたペプチドイオンの娘フラグメントイオンスペクトルは、多くの不連続なフラグメンテーション事象の合計とみなされ得る。通常の命名法は、娘フラグメントイオンを、切断されるアミド結合と、結合分裂後に電荷を保有するペプチドフラグメントとに従って、区別する。分裂性のアミド結合のN末端側の電荷保持は、タイプbイオンの形成を生じる。切断されたアミド結合のC末端側に電荷が保持される場合、そのフラグメントイオンは、タイプyイオンと称される。タイプbイオンおよびタイプyイオンに加えて、CID質量分析は、他の診断フラグメントイオン(娘フラグメントイオン)を含み得る。これらとしては、グルタミン、リジンおよびアルギニンからの、中性でのアンモニアの損失(−17amu)によって発生するイオン、またはヒドロキシル含有アミノ酸(例えば、セリンおよびスレオニン)からの水の損失(−18amu)によって発生するイオンが挙げられる。特定のアミノ酸は、他のアミノ酸よりも、低エネルギーCIDの条件下で、より容易にフラグメント化することが観察された。このことは、プロリン残基またはアスパラギン酸残基を含むペプチドについて、特に明らかであり、そしてアスパルチル−プロリン結合において、なおより明らかである(Mak,M.ら、Rapid Commun.Mass Spectrom.,12:837−842)(1998)。従って、Z−pro二量体またはZ−asp二量体(ここで、Zは、任意の天然アミノ酸であり、proは、プロリンであり、そしてaspは、アスパラギン酸である)のペプチド結合は、他の全てのアミノ酸二量体の組み合わせの間でのペプチド結合と比較して、より不安定である傾向がある。
Xは、レポーターの原子とリンカーの原子との間の結合である。Yは、リンカーの原子と、反応性基の原子、または標識試薬が反応性の分析物と反応した場合、分析物の原子のいずれかとの間の結合である。本発明の実施形態において使用され得る、種々の標識試薬(すなわち、RP−X−LK−Y−RG)の結合Xおよび結合Yは、解離エネルギーレベルに曝露される場合に、選択されたイオンの少なくとも一部にフラグメント化し得る。従って、この解離エネルギーレベルは、結合Xと結合Yとの両方が、標識された分析物(すなわち、RP−X−LK−Y−分析物)の選択されたイオンの少なくとも選択された部分にフラグメント化するように、質量分析計において調節され得る。結合Xのフラグメンテーションは、この分析物からレポーターを放出させ、その結果、このレポーターは、この分析物から独立して決定され得る。結合Yのフラグメンテーションは、結合Xがすでにフラグメント化されているか否かに依存して、この分析物からレポーター/リンカーの組み合わせを放出させるか、またはこの分析物からリンカーを放出させる。結合Yは、結合Xより不安定であり得る。結合Xは、結合Yより不安定であり得る。結合Xおよび結合Yは、相対的不安定性が同じであり得る。
分析物は、この分析物の官能基を、標識試薬の反応性基(RG)と反応させることによって、標識され得る。先に議論されたように、分析物の官能基は、求電子試薬または求核試薬のうちの一方であり得、そして標識試薬の官能基(すなわち、RGまたは反応性基)は、求電子試薬または求核試薬のうちの他方であり得る。求電子試薬と求核試薬とは、反応して、分析物と標識試薬との間に共有結合を形成し得る。
本発明の特定の実施形態において、サンプルは、分析物の標識の前、および標識後に、処理され得る。この処理は、分析物の標識を容易にし得る。この処理は、サンプル成分の分析を容易にし得る。この処理は、サンプルの取り扱いを単純にし得る。この処理は、上記のことの2つ以上を容易にし得る。
いくつかの実施形態において、標識された分析物のサンプルまたはサンプル混合物の処理は、分離を包含し得る。1回以上の分離が、標識された分析物または標識されていない分析物、標識された分析物前駆体または標識されていない分析物前駆体、あるいはその画分に対して、実施され得る。1回以上の分離が、固相捕捉から得られた1つ以上の画分に対して、実施され得る。分離は、上記のものの2つ以上に対して実施され得る。
いくつかの実施形態において、サンプル混合物の異なって標識された同一の分析物の、相対的な定量が可能である。異なって標識された同一の分析物の相対的な定量は、1回目の質量分析において観察された、選択された標識された分析物に対する2回目の質量分析において決定された、レポーター(例えば、特徴イオン)の相対量(例えば、報告されたピークの面積または高さ)の比較によって、可能である。換言すれば、各レポーターが、サンプル混合物を生成するために使用される特定のサンプルに関する情報に相関付けられ得る場合、2回目の質量分析において観察される他のレポーターに対するそのレポーターの相対量は、そのサンプル混合物中のその分析物の相対量である。サンプル混合物を形成するために組み合わせられる成分が既知である場合、サンプル混合物を調製するために使用される各サンプル中の分析物の相対量は、1回目の質量分析から選択された標識された分析物のイオンについて観察されたレポーターの相対量に基づいて、逆算され得る。このプロセスは、1回目の質量分析において観察された、異なって標識された分析物の全てについて、繰り返され得る。この様式で、サンプル混合物を生成するために使用される異なるサンプルの各々における、各反応分析物の相対量(しばしば、濃度および/または量で表現される)が、決定され得る。
本発明の実施形態は、複雑な分析のために使用され得る。なぜなら、サンプルが、迅速かつ反復可能な様式で、質量分析技術を使用して、多重化され得、分析され得、そして再分析され得るからである。例えば、サンプル混合物は、1つ以上のサンプル中の個々の分析物の量について、分析され得る。これらの分析物の量(しばしば、濃度および/または量で表現される)は、サンプル混合物が含むサンプルについて決定され得る。サンプルの処理および質量分析は、迅速に実施され得るので、これらの方法は、多数回繰り返され得、その結果、サンプル混合物の、多くの異なって標識された分析物の量が、その分析物が起源とするサンプル中のそれらの分析物の相対量および/または絶対量に関して、決定され得る。
本発明の方法によれば、定量されるべき分析物は、標識化される。標識化された分析物、分析物それ自体、その分析物の1種以上のフラグメントおよび/またはその標識のフラグメントは、質量分析により定量され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、同じサンプル中の異なる分析物の分析のため、および2種以上の異なるサンプル中の同じ分析物および/または異なる分析物の複数の分析のために使用され得る。この2種以上のサンプルは、混合されてサンプル混合物が形成され得る。複数の分析では、標識化試薬が使用されて、分析物がサンプル混合物のどのサンプルに由来するのかを決定し得る。その分析物の絶対量および/または相対量(異なるサンプル中の同じ分析物に関して)(多くの場合、濃度または量で表現される)が、合わせられてサンプル混合物が形成された2種以上のサンプルの各々において、定量され得る。さらに、その分析物のフラグメント(例えば、娘フラグメントイオン)の質量分析が、分析物および/またはその分析物への前駆体を同定するために使用され得;例えば、その分析物への前駆体分子が分解された場合がそうである。
1)各R1は同じかまたは異なり、そして必要に応じてヘテロ原子を含んでいてもよい1〜8個の炭素原子を含むアルキル基または置換もしくは非置換のアリール基であり、ここでこのアルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および/またはフッ素原子を含み;そして2)各Kは、独立に水素またはアミノ酸側鎖として選択される。この一般構造の標識化分析物を生成するのに適した置換ピペラジン標識試薬は、多くの合成経路によって調製され得る。
いくつかの実施形態では、サンプルの分析物の標識化は、サンプル処理工程を実施する前に実施され得る。いくつかの 実施形態では、分析物の標識化は、他のサンプル処理工程の間で実施され得る。いくつかの実施形態では、分析物の標識化は、サンプル処理の最後の工程であり、そして/またはサンプル混合物の調製の直前に行われる。
例えば、図20を参照して、「コントロール」サンプルおよび分析されるべき「試験」サンプルが存在し得る。図20に図示される例に対して、もし目的が「コントロール」サンプルおよび「試験」サンプルタンパク質のペプチド(上記分析物として)を分析することであるなら、そのサンプルのタンパク質は、いくつかの実施形態では、必要に応じて還元され得、必要に応じて、システインブロックされ得、そして酵素により消化され得、それにより後に続く分析のために標識化され得る分析物ペプチドが生成され得る。この分析物 ペプチドは、いくつかの実施形態では、さらなる処理なしで標識化され得る。いくつかの実施形態では、さらなるサンプル処理が標識化前および/または標識化後に所望され得る。例えば、分離工程は、目的ではない特定のタイプのペプチドを排除するために実施され得、それによりそのサンプルの複雑さが低減される。いくつかの実施形態では、この標識化分析物ペプチドは、質量スペクトル分析の前に分離(例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC))に供され得る。
担体が使用されて前駆体タンパク質または分析物ペプチドが捕捉されるか否かにかかわらず、標識試薬を用いる標識化の工程は、分析物ペプチドへの前駆体タンパク質の消化の前または後のいずれかに実施され得る。従って、これらの作業の流れに対しては、このタンパク質は、消化の前に標識化される。
上記の考察は、具体例として、プロテオーム分析および分析物としてのペプチド定量に焦点を当てたが、記載された概念は、先行する作業の流れが過度の実験の実施なしに適用可能である多くのタイプの分析物を包含することが意図される。従って、本開示の範囲は、考察されたこれらの具体例のいずれかに限定されることは意図されていない。
いくつかの実施形態において、本発明は、混合物(すなわち、サンプル混合物)に関する。その混合物は、少なくとも2つの区別をして標識される分析物を含み得、ここで、その2つの標識された分析物の各々は、異なるサンプルが起源であり得、そして式:RP−X−LK−Y−分析物を構成し得る。各異なる標識に関して、上記混合物の標識された分析物のいくつかは、同じであり得、その標識された分析物のいくつかは、異なり得る。原子、部分または結合、X、Y、RPおよびLKは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。上記混合物は、2つ以上の標識反応の生成物の全て、または一部を混合することにより、形成され得、ここで、各標識反応は、一般式:RP−X−LK−Y−RGの異なる標識試薬を使用し、ここで、原子、部分または結合、X、Y、RP、LK、RGは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。その標識試薬は、同位体コードされた異性体標識試薬または同重体標識試薬であり得る。各異なる標識試薬の独特なレポーターは、2つ以上の標識された分析物の各々が誘導される標識反応を示し得る。標識試薬は、異性体または同重体であり得る。したがって、混合物の標識された分析物の2つ以上は、異性体または同重体であり得る。その混合物は、上記方法のいずれかにおいて開示されたようなサンプル混合物であり得る。これらの方法に関連する標識試薬および標識された分析物の特徴は、先に議論されている。
いくつかの実施形態では、本発明は、キットに関する。そのキットは、式:RP−X−LK−Y−RGの2種以上の標識試薬と、1種以上の試薬、容器、酵素、緩衝液および/または指示書とのセットを含み得る。その原子、部分または結合X、Y、RP、LK、RGは、先に記載されており、その特徴は開示されている。キットの標識試薬は、異性体または同重体であり得る。そのキットの標識試薬の他の特性は、同様に開示されている。例えば、そのキットは、同一のサンプルまたは2種以上の異なるサンプル中の1種以上の分析物の多重分析に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、標識試薬として使用され得る組成物に関する。その組成物は、式:RP−X−LK−Y−RGの標識試薬であり得、ここで、原子、部分または結合、X、Y、RP、LK、RGは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。その標識試薬は、異性体または同重体であり得る。その標識試薬の他の特性は、同様に開示されている。例えば、その標識試薬は、同一のサンプルまたは2種以上の異なるサンプル中の1種以上の分析物の多重分析に有用であり得る。
(A.N−置換ピペラジン化合物重原子同位体の調製)
いくつかの実施形態では、本発明は、同位体富化したN−置換ピペラジンの生成方法、およびN−置換ピペラジンそれ自体に関する。上記方法に従って、部分的に保護されたアミノ酸は、N−置換アミノ酸エステルと縮合され得、ここで、2つのアミノ酸の少なくとも1つは、重原子同位体(例えば、18O、15N、13C、81Br、37Clまたは重水素)で同位体富化される。2つのアミノ酸を縮合するとき、任意の側鎖反応基は、ペプチドを形成するアミノ酸の縮合のためのものである場合、保護され得る。同様に、縮合化学は、アミノ酸を縮合するための種々の公知の方法から選択され得る。これらとしては、カルボジイミド(例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)、活性エステル、混合無水物形成などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明は、同位体富化されたN−置換ピペラジン酢酸エステルの生成方法および同位体富化されたN−置換ピペラジン酢酸に関する。いくつかの実施形態では、各々同位体富化されたN−置換ピペラジン酢酸エステルまたは同位体富化されたN−置換ピペラジン酢酸は、1つ以上の重原子同位体、2つ以上の重原子同位体、3つ以上の重原子同位体、4つ以上の重原子同位体、5つ以上の重原子同位体、6つ以上の重原子同位体または6つより多い重原子同位体を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、N−置換ピペラジン酢酸への18Oの組込み方法に関し、また、18O標識N−置換ピペラジン酢酸それ自体に関する。いくつかの実施形態では、18Oの組込みは、上の節Bに同位体標識されたN−置換ピペラジン酢酸の調製について記載された方法と比較して、実質的に異ならなかった。いくつかの他の実施形態では、18Oの組込みは、実質的に異なり、先に議論された方法についてある懸念をうむ記載を利用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、N−置換ピペラジン酢酸(その同位体富化された変形を含む)の活性エステルの調製方法、ならびに、N−置換ピペラジン酢酸エステルそれ自体およびその同位体富化された変形に関する。上記活性エステルは、任意の活性エステルであり得る。いくつかの実施形態では、上記活性エステルは、以下の式:
図17Aは、114、115、116および117と同定された4つの同重体標識試薬の生成に対してとられる一般的経路を例示する。これらの命名は、各試薬が質量分析計でのフラグメンテーションの際に生成する「特徴(signature)イオン」に基づく(図17B)。この「特徴イオン」は、多重アッセイにおける異なるサンプルに関連する情報を逆重畳積分するために使用され得る。
種々のN−置換ピペラジン、N−置換ピペラジン酢酸およびN−置換ピペラジン酢酸の活性エステルは、各重原子同位体について80%を超える同位体純度の出発物質を用いて調製され得る。その同位体純度は、いくつかの出発物質において、各重原子同位体について93%より大きくあり得る。他の出発物質において、同位体純度は、各重原子同位体について96%より大きくあり得る。さらに他の出発物質において、同位体純度は、各重原子同位体について98%より大きくあり得る。16Oから18Oへの変換を行う場合、重原子同位体の96%以上の同位体純度(酸素原子1個あたり)のカルボン酸基を慣用的に得ることが可能である。
一般的に、N−置換ピペラジン酢酸の活性エステルは、求電子性であり、そして分析物の求核基と反応され、それによって、標識された分析物を生成し得る。いくつかの実施形態では、上記標識試薬は、担体に結合され得る。活性エステルは、チオール基と反応され得、そしてより少ない程度まで、ヒドロキシル基と反応し得る。しかし、活性エステルは、アミノ基との反応に対して特に十分に適している。
図17Cは、114、115、116および117標識試薬の特徴イオンについて2つの可能な構造の例示である。妥当であり得る代替の化学構造が存在するので、参照は、その特徴イオンの分子式に対してなされる。軽特徴イオンの分子式は、C6H13N2 +である。同位体富化された114、115、116および117特徴イオンの分子式は、それぞれ:l3CC5H13N2 +、l3CC5Hl3 l5NN+、l3C2C4H13 15NN+およびl3C3C3H13 15NN+である。
一旦2つ以上のサンプルが、セットの異なる同重体標識で区別を付けて標識されると、サンプル混合物は、標識された分析物のサンプルを混合することにより簡単に調製され得る。そのサンプルは、任意のタイプであり得る。サンプルのうちの1つ以上がコントロールサンプルであり得、サンプルのうちの1つ以上が試験サンプルであり得る。各異なる標識試薬の独特のレポーター部分は、MS/MS条件下で独特の特徴イオンを生成するので、上記混合物の各サンプルの標識された分析物は、その混合物が分析されたときが起源であるサンプルに戻って関連し得る。
(実施例1;モルホリン酢酸の合成)
ブロモ酢酸(2g、14.4モル)を、テトラヒドロフラン(50mL)中に溶解し、テトラヒドロフラン(THF、20mL)中のモルホリン(3.76g、43.2モル)の撹拌溶液に滴下した。その溶液を、室温で3日間撹拌した。白色固体.(4.17g)を濾過し、THF(100mL)で洗浄し、そして温エタノール(EtOH)から再結晶化させた。収量:2.59g:IR:1740cm−1。モルホリン酢酸の2つの異なる同重体変形について、1−13C−ブロモ酢酸(Aldrich PN27、933−1)または2−13C−ブロモ酢酸(Aldrich PN27、935−8)のいずれかを、ブロモ酢酸の代用とした。
ジメチルホルムアミド(乾燥、1.75g、0.024M)を、テトラヒドロフラン(乾燥、30mL)中に溶解した。この溶液を、テトラヒドロフラン(乾燥、20mL)中に溶解した塩化チオニル(2.85g、0.024M)の撹拌溶液に滴下し、氷浴で冷却した。完全に添加し、氷上に30分間置いた後、その氷浴を除去し、固体のN−ヒドロキシスクシンイミド(2g、0.017モル)を添加し(これは、完全に溶解した)、直後に、固体の予め粉末化したモルホリン酢酸[または−1−l3Cもしくは−2−l3Cモルホリン酢酸](3.64g、0.016M)を添加した。そのモルホリン酢酸はゆっくりと溶解し、急速に濁った均一溶液を得た。その反応を一晩室温で力強く撹拌し続けた。白色固体をテトラヒドロフランで洗浄し、減圧下で乾燥させ、3.65g(67%)と秤量した。IRスペクトル1828.0cm−1、1790.0cm−1、1736.0cm−1。
100 pモル量の凍結乾燥したGlu−フィブリノペプチドB(Sigma)を、氷冷した0.5M MOPS緩衝液(NaOHを用いてpH7.8)中の、IまたはII(構造については図1Aを、そして調製については実施例1および2を参照のこと)のいずれかの200μlの新しく作製した2%w/v溶液と、30分間氷上で反応させた。その反応を、TFAを0.5% v/vの最終濃度になるまで添加することにより、停止させた。次いで、修飾されたペプチドを、区別を付けて標識されたペプチドの1:10〜10:1の範囲に大体わたるように、種々の予め決定した割合で混合した。各ペプチド混合物を、Millipore C18 Zip−Tipを使用する逆相脱塩により個々に精製した。過剰な試薬および緩衝液は、逆相充填上には保持せず、したがって、MS分析の前に効率的に除去された。次いで、その混合物(0.5μl)を、MALDI標的プレート上にスポットし、50%アセトニトリル水溶液中0.5μlの1% w/v α−シアノ桂皮酸をその上にスポットし、そして各サンプルを、QTOF分析計に取り付けられたMALDI源を使用して分析した。
実際に、代表的なプロテオミクス分析を以下のように実施し得る。比較用の全細胞タンパク質抽出物(例えば、サンプルAおよびB)を、トリプシンまたは別のタンパク質溶解酵素で別々に消化させる。得られたペプチド混合物を、例えば、化合物IおよびIIと別々に反応させ、ペプチドのN−末端およびリシンアミンの完全な修飾を得る。例えば、サンプルAは、化合物Iと反応され得、サンプルBは、化合物IIと反応され得る。次いで、改変ペプチド/タンパク質を含むサンプルの各々を、(代表的に、多次元HPLCを使用する)クロマトグラフィー分離の前に一緒に混合し、MS技術およびMS/MS技術によって分析する。標識は、上記基が同重体である場合、1回の標識/タグ化処理により実施し得る(第2の試薬でのリシン基の先の保護は必要とされない)。
比較用の全細胞タンパク質抽出物(例えば、サンプルAおよびサンプルB)を、別々にトリプシンで消化する。上記のように、得られたペプチド混合物を、XおよびXI(図8)と別々に反応させ、ペプチドのN−末端およびリシンアミンの完全な修飾を実質的に得る。例えば、サンプルAペプチドは、Xと反応され得、サンプルBペプチドは、XIと反応され得る。次いで、実質的に修飾されたペプチドを含むサンプルAおよびBの各々の既知量を、一緒に混合する。ここで、AおよびBの合わせた混合物に、正確に決定した量で、サンプルAおよびBの混合物中に存在し得るペプチドに対するアミノ酸配列および/または翻訳後修飾(例えば、リン酸化)に正確に対応する合成ペプチドのセット(1つ以上)を添加し、ここで、その合成ペプチドは、同重体標識試薬のセットの別のメンバー(例えば、化合物XIIまたはXIII、図8を参照のこと)で標識される。ここで、先に記載したように、サンプルA、サンプルB由来のペプチドおよび合成内部標準ペプチドを合わせた混合物を、例えば、多次元HPLCによるクロマトグラフィーでの分離に供し、次いで、MSおよびMS/MS技術により分析する。同一配列のサンプルA、Bおよび合成対応物由来の当量の標識されたペプチドの全ては、同重体であり、そして実質的に同一のクロマトグラフィー特性を有する。「実質的に同一のクロマトグラフィー特性」により、区別を付けて標識されたが他の点では同一であるペプチドの分離がほとんどなかった(あったとしてもわずかである)ことを、本発明者らは意味する。MS/MS分析にしたがって、サンプルAおよびB由来のペプチドの絶対濃度を、同重体セット(例えば、XIIまたはXIII)のさらなるメンバーで標識された標準ペプチドに起因するレポーターの強度(「特徴ピーク」)に対する、X(サンプルA)およびXI(サンプルB)についてのレポーターの相対強度の比較により、正確に決定し得る。
ブロモ酢酸を、テトラヒドロフラン(または別の適切な非求核性溶媒)中に溶解し、そしてテトラヒドロフラン(THF、または別の適切な非求核性溶媒)中に過剰のピペリジンを含有する撹拌溶液に滴下した。その溶液を室温で1〜3日間撹拌した。その固体を濾過し、THF(または別の適切な非求核性溶媒)で洗浄し、そして必要に応じて再結晶化した。ピペリジン酢酸の2つの異なる同重体変形について、1−13C−ブロモ酢酸(Aldrich PN27、933−1)または2−13C−ブロモ酢酸(Aldrich PN27、935−8)のいずれかを、ブロモ酢酸の代用とした。異性体置換ピペリジンは、Cambridge Isotope Laboratoriesのような供給源から入手し得る。
テトラヒドロフラン(THF)中に溶解した2当量のピペラジンを含む溶液を、テトラヒドロフラン中に溶解した(ピペラジンの量と比較して)1当量のブロモ酢酸を含む溶液に滴下した。2つの溶液は、実用的な程度に濃縮するべきである。生じた反応溶液を、室温で1〜3日間撹拌する。その固体を濾過し、THFで洗浄し、そして必要に応じて再結晶化する。ピペリジン酢酸の2つの異なる同重体変形について、1−13C−ブロモ酢酸(Aldrich PN27、933−1)または2−13C−ブロモ酢酸(Aldrich PN27、935−8)のいずれかを、ブロモ酢酸の代用とし得る。
1.1モルのビス(2−メトキシエチル)アミン(Aldrich Chemical)に、500mmolのtert−ブチルクロロアセテート(Aldrich Chemical)を滴下した。その反応を3日間撹拌し、次いで、後処理した。その最終反応内容物に、250mLのジクロロメタン(DCM)および200mLの水を添加した。この撹拌溶液に、少しずつ、300mmolの固体炭酸カリウム(K2CO3)を添加した。完全に混合した後、層を分離させた。DCM層を一度、ある容量の水で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、そしてエバポレートして、66.3gの非常に薄い黄色の油状物を得た。この粗製生成物を60℃(200〜500μMHg)でKugelrohr蒸留し、58.9gの透明で無色の油状物(238mmol;95%)を得た。
「立体障害のある切断可能なリンカー」を含む市販のペプチド合成樹脂を、少なくとも2倍過剰のアミノアルキルピペラジン(例えば、1−(2−アミノエチル)ピペラジン(Aldrich P/N A5、520−9)と反応させる;同位体変形を、本明細書中の記載と組み合わせて、図12に例示されるプロセスによって作製し得る。「立体障害のある切断可能なリンカー」によって、リンカーは、切断可能なリンカーと反応される固体担体と原子または基との間に切断可能な共有結合を形成する2級原子または3級原子を含むことを、本発明者らは意味する。立体障害のある固体担体の非限定的な例としては、以下が挙げられる:塩化トリチル樹脂(トリチル−Cl、Novabiochem、P/N 01−64−0074)、2−クロロ塩化トリチル樹脂(Novabiochem、P/N 01−64−0021)、DHPP(Bachem、P/N Q−1755)、MBHA(Applied Biosystems P/N 400377)、4−メチル塩化トリチル樹脂(Novabiochem、P/N 01−64−0075)、4−メトキシ塩化トリチル樹脂(Novabiochem、P/N 01−64−0076)、ヒドロキシ(2−クロロフェニル(chorophnyl))メチル−PS(Novabiochem、P/N 01−64−0345)、リンク酸樹脂(Rink Acid Resin)(Novabiochem P/N 01−64−0380、01−64−0202)、NovaSyn TGTアルコール樹脂(Novabiochem、P/N 01−64−0074)。次いで、上記担体を洗浄することにより、過剰の試薬を除去する。次いで、担体結合ピペラジンの第2級アミンを、トリエチルアミンのような第3級アミンの存在下で、過剰のブロモ酢酸と反応させる。次いで、その担体を洗浄することにより、過剰の試薬を除去する。カルボン酸の活性エステルを作製するために使用される方法に依存して(例えば、活性エステル合成にカルボン酸の塩が必要とされているか否か)、洗浄を、ビス−アルキル化ピペラジンの担体結合カルボン酸基をプロトン化するように調整されるpHを有するために選択し得る。次いで、その担体結合ピペラジンのカルボン酸基を、本明細書中に記載される方法のような、カルボン酸の酸エステルの生成について当該分野で公知の方法を使用して、活性エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル)に変換させる。得られた固体担体を、その後、求核性官能基を有するサンプル(例えば、ペプチド)の分析物を標識/タグ化するために使用し得る。次いで、その標識/タグ化された分析物を、製造者の製造指示書により記載されるように、担体から放出させ得る。次いで、各切断反応の生成物を、サンプル混合物を形成するために組み合わせ得る。
一般的合成注記:他で特に述べない限り、化学物質は、商業的供給源より購入し、入手した状態で使用した。他で特に述べない限り、以下の化学物質は、Sigma−Aldrichから購入した。無水トリフルオロ酢酸(TFAA、P/N 106232)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS、P/N 13067−2)、tert−ブチルブロモアセテート(P/N 124230)、4−ニトロフェニル(4−NP)トリフルオロアセテート(P/N N22657)、ペンタフルオロフェニル(Pfp)トリフルオロアセテート(P/N 377074)、tert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)シアニド(407852)、1−(トリメチルシリル)イミダゾール(P/N 153583)、フェニルブロモアセテート(P/N 404276)、ペンタクロロフェノール(Pcp−OH、P/N P2604)、2,2,2−トリフルオロエタノール(P/N 326747)、1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFI−OH、P/N 105228)、(3−ヒドロキシ−1、2、3−ベンゾトリアジン−4(3H)−オン(Dhbt−OH、P/N 327964)、塩化オキサリル(P/N 320420)、1−メチルピペラジン(P/N 130001)、テトラヒドロフラン(THF乾燥、P/N 186562)ジクロロメタン(DCM乾燥、P/N 270997)、ジオキサン中4M塩酸(HC1)溶液(P/N 345547)、HC1(気体、P/N、295426)、2%DVB、Capacity(塩基):約2.6mmol/gで架橋したポリスチレンに結合した3−ニトロフェノール(3−NP−OH、P/N 163031)1,5,7−トリアザビシクロ[4.4.0]デセ−5−エン(TBD)(ss−TBD、Fluka、P/N 90603)、H2 18O(Isotec、95 18O原子%(P/N 329878)または99% 18O原子%(P/N 487090))、Brl3CH2COOEt(Cambridge Isotope Laboratories(CIL)、P/N CLM−1010−5)、Brl3CH2 13COOEt(CIL、P/N CLM−1011−1)、BrCH2C18O18OH(Isotec、P/N 597031)。全ての水分感受性の反応を、窒素またはアルゴン雰囲気下で実施した。
注記:非標識N−メチルピペラジン(1−メチルピペラジンとしても公知)は、種々の供給源から市販されている。しかし、同位体富化されたN−メチルピペラジン(在庫品目として)のいかなるタイプについても、供給源は見出すことはできなかった。しかし、適切に保護されたグリシンおよびサルコシンは、縮合、環化され得、そしてその生成物(ジケトン)は、還元されて、それによって、N−メチルピペラジンを生成することができることを決定した(図1を参照のこと)。さらに、15Nおよび13Cの同位体標識されたグリシンおよびその部分的に保護された変形(例えば、t−boc保護アミノ酸)の全ての可能な置換物は、IsotecまたはCambridge Isotope Laboratory,Inc.のような供給源から市販されていた。したがって、これは、1つ以上の重原子を含む種々のN−メチルピペラジン化合物に対する有望な経路であると考えられる。適切に保護された(t−boc)同位体富化されたグリシンおよび適切に保護されたサルコシンは、商業的供給源から購入され得、アミノ酸(例えば、グリシンおよびサルコシン)の保護が周知であるので、N−メチルピペラジンに対する合成経路の記載は、適切に保護されたアミノ酸から開始する(図1)。
注記:サルコシンは、メチルエステルまたはエチルエステルのいずれかで市販される。これらのいずれもが、縮合反応に使用され得る。
生成物(32) Rf値 約0.85
t−boc−グリシン(30) Rf値 約0.3(幅広いテーリング)
サルコシン−OEt(31) ベースライン
NMM サルコシンの真上に微かに見える。
0.5%の水を含む1:1のトリフルオロ酢酸(TFA):DCM溶液を調製した。この溶液を、上記縮合反応のカラム精製した生成物(32)に添加した(1gの出発物質あたり約10mL)。生じた溶液を30分間攪拌し、次いでこの溶媒をロータリーエバポレーターによって除去した。次いで、エタノール(1gの出発物質あたり約10mL)を、この反応フラスコに添加し、そしてこの溶液を、再び揮発させて乾燥した。この手順を、トルエンを用いて繰り返した。この生成物を、再び反応フラスコ中でエタノールに溶解し、そして無水炭酸カリウム(4当量)を添加した。この溶液を、短時間激しく泡立て、その後炭酸カリウムを添加した。反応混合物の液滴を除去し、水で希釈し、そして溶液のpHを決定した。このpHが、8を下回る場合、炭酸カリウムをさらに添加した。pHが8より大きいことを一度確認し、この反応を一晩還流させた。次いで、この温かい反応混合物を、セライトのプラグに通して、過剰な塩を除去した。このケークを、無水エタノールで2回すすいだ。この濾液をより大きなフラスコに移し、そして揮発させて乾燥した。この生成物の泡状物質を、9:1の酢酸エチル−メタノール中に再溶解し、そしてシリカゲルのプラグに通した。次いでこのシリカゲルを、約4カラム容量の9:1の酢酸エチル−メタノールで洗浄した。全ての画分をエバポレートして乾燥させた。
生成物 Rf値 約0.2
代替的なTLC条件:10% MeOH/DCM;加熱によって展開する
生成物(青色のスポット) Rf値=0.54。
硫酸ナトリウムの飽和溶液を調製した。テトラヒドロフラン(THF)(実施例11で使用される物質に基づいて出発物質1mmolあたり4mL)を、実施例11の手順を使用して形成したジケトピペラジンに添加した。この反応フラスコは還流冷却器を備え、そしてTHF中の3当量の1M LiAlH4(LAH溶液;LAHをRed−Alまたは他の還元試薬で置換することが可能であり得るが、これは試みなかった)を、滴下漏斗を用いて溶液に添加した。添加の開始において激しく水素が発生したが、これは添加を続けるとおさまった。この反応を加熱して4時間還流した。反応が完了した後、この溶液を室温まで冷却し、そして残りのLAHを、飽和硫酸ナトリウム水溶液(添加したLAH溶液の1/4の容量)を非常にゆっくり添加してクエンチした。この反応は、灰色の懸濁液として出現した。
4:1:1のエタノール:水:水酸化アンモニウム
生成物 Rf値=0.6
TLC−N1−t−Boc−N2−メチルピペラジン(ニンヒドリンによって展開する)
4:1のDCM−MeOH
生成物 Rf値=0.5。
0.5%の水を含む1:1のTFA、DCM溶液を調製した。この溶液を、上記の還元から単離した物質に添加した(出発物質1gあたり約10mL)。この反応を、30分間攪拌し、次いでこの溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いて除去した。冷却器中に回収される溶媒がそれ以上観察されなくなったときに、溶媒のエバポレーションを終了した。TFAを、生成物の残渣に添加(出発物質1gあたり約2mL)して自由流動する(free flowing)溶液を形成した。このTFA溶液を遠心チューブに移し、そしてジエチルエーテルを添加して、生成物の塩を沈殿させた。この溶液を、ボルテックスを使用して混合した。次いで、この溶液を遠心分離し、そしてその上清をデカントして沈殿を回収した。次いで、その濾過物を、エーテルを用いてこの生成物を再懸濁することによって1回洗浄し、ボルテックスし、そして再び遠心分離した。生成物を、低い減圧下で乾燥して残りのエーテルを除去した。
実施例11の手順の生成物を、冷却器、添加用漏斗、およびアルゴン(Ar)インレットを取り付けた多首RBF中で無水THF(SM 1mmolあたり5mL)に溶解した。この溶液に、3当量のLAH溶液を、Ar下で室温にて、滴下漏斗を介してゆっくりと添加した。激しい水素の発生を、添加し始めに観察した。添加後、この濁った溶液を加熱して3時間還流した。TLCを使用して、この反応が終了したときを決定した(出発物質(SM)の消失、10%MeOH/DCM TLC展開溶媒、可視化剤(visualizer)としてのPMA)。反応が完了した後、この溶液を室温まで冷却し、そして飽和硫酸ナトリウム水溶液(添加したLAH溶液の1/4の容量)を、非常にゆっくり添加しながらクエンチした。ゲル様の白色固溶体を、Na2SO4固体のプラグに通してH2Oを除去した。濾過したケークを、洗浄液のTLCが生成物をほとんど示さなくなるまでTHFによって数回洗浄した(1グラムのSMあたり400mL)。その後、TFA(4当量)をTHF溶液に添加した(HCl塩を所望する場合、ジオキサン中のHClもまた、添加し得る)。この溶液の色は、淡黄色から淡褐色に変化した。この溶液を減少させた圧力下において、ロータリーエバポレーター上で濃縮して茶色の油状物質を得た。この淡褐色の生成物を、エーテルを添加(1グラムのSMあたり42mL)することによってビス−TFAの塩として沈殿させ、N−メチル−ピペラジンを80%の収率で得た。1H NMR(D2O)を使用して、所望の生成物を確認した。
注記:図17Aは、本明細書中で114、115、116および117と称される、4種の同重体標識試薬中への重原子同位体の合成的な組込みのための経路を図示する。図17Aから理解されるように、特定の重原子同位体は、N−メチルピペラジンの生成に使用される、市販の同位体標識されたグリシンの選択によって組込まれ得る。特定の他の重原子は、市販のブロモ酢酸の選択に基づくアルキル化反応の間に組込まれ得る。いくつかの場合において、この18Oは、18O標識された水を使用して有効な交換を介して組込まれ得る。この標識試薬は、一旦この試薬が解離エネルギーの適用によってフラグメント化される質量分析中の特徴イオンを形成するフラグメントの質量に基づいて、114、115、116および117と表される(図17Aおよび図17Bを参照のこと)。
15mLのトルエン中1.18g(11.83mmol)のN−メチルピペラジンの攪拌溶液に、室温で1g(5.91mmol)のエチルブロモアセテート,1,2−13Cを15分間の時間にわたって滴下した。白色固体の即時の形成が観察された。次いで、この反応混合物を油浴中で90℃にて4時間加熱した。この混合物を室温まで冷却後、オフホワイトの固体をろ過により取り出し、25mLのトルエンで洗浄した。次いで、合わせたろ液および洗浄液を回転エバポレーター中で濃縮し、その残留物を高減圧下で5時間乾燥させ、1.10g(定量的)のN−メチルピペラジン酢酸−1,2−13Cのエチルエステル(38)をオフホワイトの油状物として得た。粗生成物(38)をMSおよび1H−NMRにより分析し、さらなる精製をせずに、次の工程に直接使用した。MS(ESI,m/z):189.16(M+1),1H−NMR(DMSOd6)δ4.2(m,2H),3.4(d,1H,J=7Hz),3.05(d,1H,J=7Hz)),2.4−2.7(b,8H),2.3(s,3H),1.25(t,3H)。
メタノール(MeOH、14mL)中200mg(1.14mmol)のN−メチルピペラジン−15N2HCl(36’)2TFA塩もまた使用され得る)のスラリーに、1.76g(4.59mmol)のss−TBDを2.6mmol/gのロードで添加し、その後CH2Cl2(6mL)を添加した。次いで、この混合物を15分間超音波処理し、次いで、アルゴン雰囲気下で氷浴中で冷却した。この激しく攪拌したスラリーに、アセトニトリル(3mL)中193mg(1.14mmol)のブロモ酢酸エチル−2−13Cの溶液をシリンジポンプを使用して(2mL/時間の速度を維持する)滴下した。滴下の完了後、氷浴を取り除き、その混合物を室温で一晩(18時間)攪拌を続けた。次いで、この混合物を、焼結漏斗を通してろ過し、その固体をMeOHを用いて数回(4×10mL)洗浄した。次いで、合わせたろ液および洗浄液を回転エバポレーター中で濃縮し、その残留物を高減圧下で維持し、N−メチルピペリジン酢酸のエチルエステル(40)を、オフホワイトの固体として111mg(51%)得た。この粗生成物をさらなる精製をせずに、次の工程に直接使用した。
DCM(15mL)中のブロモ酢酸(715mg、5mmol)の溶液に、700mgのトリチル−Cl樹脂(1mmol、1.45mmol/g)を添加し、その後ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(1.79mL、10mmol)を添加した。この溶液を室温で1時間混合した。次いで、この樹脂をろ過し、ジクロロメタン(3×4mL)で洗浄し、その後、ジクロロメタン−メタノール−DIPEAの溶液(17:2:3、5mL)を用いて洗浄し、最後に、ジクロロメタン(3×4mL)で洗浄した。
注記:最初の実験において、18OのN−メチルピペラジン酢酸への組込みを、18O標識されたブロモ酢酸(CILにより特別に合成された)を使用して図15Aに図示されるようにして試みた。このアプローチに対する懸念としては、後の反応において、18Oが、残っている水由来の16Oと交換し得る可能性、またはそうでなければエステル化プロセスの間に他の試薬由来の16Oと交換し得る可能性が挙げられる。つい最近、適用された合成手順は、図15Bに図示され、N−メチルピペラジン酢酸の所望の重変形(heavy version)の形成に対する平衡反応を駆動するためにH2 18Oを使用して、16O⇔18O交換反応を利用する。両方のスキームとも機能することが示されているが、現在スキームBは、最も高度に18O富化された生成物の生成を補助する。
DCM(0.575mL)中TBDMS−CN(172mg、1.190mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、18O標識したブロモ酢酸(42)(170mg、1.189mmol)を添加し、その溶液を80℃まで20分間で加熱し、その後室温まで冷却した。その生成物(43)を、油状物として単離した(254mg、85%収率)。
200mg(1.24mmol)のN−メチルピペラジン酢酸1,2−13C(46)を、アルゴンを流した5mLのプラスチックバイアル中で秤量した。次いで、このバイアルをグローブボックス内に移し、2.5mLの18O水(>99%、18O)を添加した。次いで、このバイアルにシリコンセプタムを装着し、開口針を用いてセプタムに穴を開けた後、長い針を使用して溶液を通してHClガスのゆっくりとした流れを通過させた。この溶液が温まった(約2分間)場合、そのHCl通過を止め、セプタムを、スクリューキャップを用いて取り外した。次いで、このバイアルを加熱ブロック中で80℃にて18時間加熱した。アリコートを、MSにより分析し、そして18O純度を93%と計算した。次いで、この反応混合物をスピードバック(speedvac)中で乾燥するまで濃縮させ、その残留物を上記の18O交換の第2のサイクルに供した。MS分析により、第2のサイクル後の18O純度を96%と決定した。次いで、この混合物をスピードバック中で乾燥するまでエバポレートし、微量の水をトルエンとの同時エバポレーション(1mL×2)により除去した。220mgのN−メチルピペラジン酢酸−1,2−13C−18O22HCl(47a)を、不純物(47b)とともに得た。MS(ESI、m/z),165(M+1)。
注記:N−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの生成のためにいくつかの方法を用いた。スキームA(図16A)によって図示される手順は、N−ピペラジンのフルオロアルコールエステルの生成に良好に機能した(図16Cおよび図16Dを参照のこと)。スキームB(図16B)によって図示される手順は、N−メチルピペラジンの種々の活性エステルを生成したが、固相塩基(例えば、ss−TBD)を使用しない場合、溶液相塩基の塩酸塩は、除去するのが困難であった。スキームC(図16Cおよび図16D)によって図示される手順は、N−メチルピペラジンの活性エステルの生成に、最も一般的に適用可能な経路であることが照明された。
THF(5mL)中、N−メチルピペラジンフェニルエステル(48)(100mg、0.426mmol)およびナトリウムフェノキシド(1mg、9μmol)の溶液に、TMS−イミダゾール(69μL、0.468mmol)を添加した。この溶液を、20分間混合し、イミダゾール(49)を生成した。次いで、CF3CH2OH(80μL、0.213mmol)を、そのようにして得た淡黄色の溶液に添加した。この溶液を、生成物の透明な形成がTLCにより示される(Rf=0.6、4:1 DCM−MeOH)までさらに30分間混合した。次いで、この反応物をEtOAcを用いて15mLまで希釈し、その生成物(50)を、ジオキサン中のHCl溶液(4M、2mL)の添加により沈殿させた。THFを用いた洗浄(2×15mL)の後、生成物を白色固体として単離した。固体のNMRは、生成物とイミダゾール(HCl塩として)との1:1混合物を示唆した。MH+計算値=241.13、検出値=241.12。
DCM(25mL)中N−メチルピペラジン酢酸(N−MPAA)(79mg、0.5mmol)の懸濁液に、塩化オキサリルの溶液(4mL、0.8mmol、DCM中2.0M溶液)を室温にて10分間にわたって添加した。さらに30分間の反応後、減圧下で、溶媒および過剰の試薬を除去し、白色の固体を得た(52)。DCM(25mL)中NHS(57mg、0.5mmol)の溶液を、その固体に添加し、その後ss−TBD(390mg、1mmol、2.6mmol/g)を添加した。生じた溶液を、5分間超音波処理をし、そのとき全ての固体が溶解した。ss−TBD樹脂をろ過により除去し、溶媒をエバポレートして白色の泡状物(97%収率)を得た。生成物を、これまでのように、ES−MSによって特徴付けた。
注記:トリフルオロ酢酸エステルを介した、N−メチルピペラジン酢酸(N−MPAA)のその活性エステルへの変換は、代表的に、2工程プロセスである。試薬が市販されている稀な場合(表2を参照のこと)を除いて、第一の工程は、酢酸をエステル化するための試薬の調製に関する。第二の工程は、上記エステル化試薬をN−メチルピペラジン酢酸と反応させて活性エステルを生成する工程に関する。種々の活性エステルを生成し、ペプチドの水性標識に関して試験した。NHSエステルがこの用途に非常に有用であることが証明されたが、他のエステルは、他の用途において有用であることを証明する可能性がある。それにもかかわらず、活性エステルを生成するこの方法は、非常に強力(robust)であり、かつ一般的に、多種多様な可能物にわたって適用可能であることを証明した。図16Dは、同じ一般的手順を用いて生成された7つの異なる活性エステルを図示する。
無水トリフルオロ酢酸(4.9mL、4×8.68mmol(2.5当量〜4当量が代表的に使用される)をN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(1g、8.69mmol)に添加し、アルゴン下で1〜2時間攪拌して均一な反応混合物を生成した。過剰の試薬および副生成物CF3COOHを減圧下(ロータリーエバポレーション)で除去した。生成物を、定量可能な収量の白色固体として得た。高真空下で3〜4時間、この固体を乾燥させ、アルゴン(Ar)ガスまたは窒素(N2)ガス下で保存した。
THF中のトリフルオロアセテートの溶液(0.58M、1.2当量)をN−メチルピペラジン酢酸の固体サンプルに添加し、均一な溶液が得られるまでボルテックスまたはシェーカー中で混合した。カルボン酸とリフルオロ酢酸エステルとの反応は、N−ヒドロキシピロリジノン(N−hydroypyrrolidinone)(NHP、18時間)を除く全ての場合について、通常30分以内に完了した。活性エステルへの変換の進行をES−MSによってモニタリングした。生成物および任意の出発物質(N−MPAA)の量を、その反応物のサンプル(エタノール中)のES−MSへの直接注入によって決定することができた。いくつかの場合、活性エステル生成物を、ジオキサン中のHCl溶液(4M、反応物の50体積%)の添加により、二塩酸塩として沈殿させ、続いてTHF、酢酸エチルおよびヘキサンで洗浄した。他の場合、この生成物を反応物からモノTFA塩として単離した。ビス−TFA塩が所望された場合に、TFAの添加が行われ得た。
Dhbtエステル 計算値MH+=304.14 検出値=304.20
NHPエステル 計算値MH+=242.15 検出値=242.20
4−NPエステル 計算値MH+=280.13 検出値=280.20
1H NMR(400MHz、CDCl3)d8.20(d,2H,J=9.2Hz,芳香族プロトン)、7.25(d,2H,J=9.2Hz,芳香族プロトン)、3.69−3.40(ブロード,2H,環プロトン)、3.57(s,2H,−CH2−CO−)、3.15−2.90(ブロード,6H,環プロトン),2.78(s,3H,−CH3)。
Pfpエステル 計算値MH+=325.10 検出値=325.10
Pcpエステル 計算値MH+=404.95 検出値=405.90
3−NPエステル 計算値MH+=280.13 検出値=280.20
NHSエステル 計算値MH+=256.13 検出値=256.10。
THF(1.8mL)中のN−メチルピペラジン酢酸−1,2−13C,18O,2HCl(56)(60mg、0.25mmol)のスラリーに、アルゴン下でDIPEA(98mg、0.76mmol)を添加した。この混合物を5分間ボルテックスし、N−ヒドロキシスクシンイミドのトリフルオロアセテート(160mg、0.76mmol)を添加した。10分間超音波処理した後、この反応混合物を室温で4時間攪拌し、続いて遠心分離によってあらゆる不溶解物質を除去した。上清をデカントし、次いでTHF(3mL)で希釈し、そしてジオキサン(1.8mL)中のHClの4M溶液をゆっくりと添加した。沈殿したNHSエステルのHCl塩を遠心分離によって分離し、THF(3mL×4)で洗浄し、高真空下で乾燥させて、62mg(74%)のNHSエステル(58)を灰色がかった白色固体として得た。
(実施例24:N−メチルピペラジン酢酸のNHS−エステル(NMPAA−NHS)試薬の同重体セットによる(タンパク質消化物に由来する)ペプチド混合物の標識のための一般的手順)
(緩衝液および試薬組成)
注記;必要な場合、以下の工程1および2において、100μLまでの溶解緩衝液を添加してサンプルを溶解する。標識の前に過剰の緩衝液を乾燥させる(「トリプシンによる消化」における工程6を参照のこと)。
2. 20μLの溶解緩衝液を、100μgの試験サンプルを含むチューブに添加する(高濃度のサンプル溶液を用いて作業する場合、変性緩衝液を添加して、体積を20μLまでにする)
3. 1μLの変性試薬を、コントロールサンプルのチューブおよび試験サンプルのチューブの両方に添加する
4. 2μLの還元試薬を、コントロールサンプルのチューブおよび試験サンプルのチューブの両方に添加する
5. ボルテックスして混合し、次いで遠心する
6. コントロールチューブおよび試験チューブを60℃で1時間インキュベートする
7. ボルテックスして混合し、次いで遠心する
8. 各チューブに1μLのシステインブロック試薬を添加する
9. ボルテックスして混合し、次いで遠心する
10. 室温で10分間インキュベートする
11. コントロールチューブおよび試験チューブをボルテックスして混合し、次いで遠心する。
1. トリプシンのバイアル(塩化カルシウムを含む)を25μLのMilli−Q(登録商標)水または等価物で再構成する
2. ボルテックスして混合し、次いで遠心する
3. 10μLのトリプシン溶液を、各タンパク質溶液に添加する
4. ボルテックスして混合し、次いで遠心する
5. 37℃で12〜16時間インキュベートする
6. ボルテックスして混合し、次いで遠心する。
注記:NMPAA−NHS試薬114のバイアルおよびNMPAA−NHS試薬117のバイアルを室温にする(このバイアルは、約1mgの活性試薬を含む)。
2. 1分間ボルテックスして溶解させ、次いで遠心する
3. NMPAA−NHS試薬114の溶液をコントロールサンプル溶液に移す
4. NMPAA−NHS試薬117の溶液を試験サンプルに移す
5. 各バイアルをボルテックスして混合し、次いで遠心する
6. 室温で1時間インキュベートする
7. 各バイアルをボルテックスして混合し、次いで遠心する
8. NMPAA−NHS試薬114バイアルの内容物とNMPAA−NHS試薬117バイアルの内容物とを1つのチューブに合わせる
注記:より多くの数のサンプルおよびコントロールが所望される場合、NMPAA−NHS試薬115およびNMPAA−NHS試薬116もまた使用できる。
96mM 重炭酸トリエチルアンモニウム
0.019% SDS
0.96mM TCEP
1.9mM MMTS
10μg トリプシン
89μg 塩化カルシウム
1mg NMPAA−NHS試薬
1μL 2−プロパノール
70μL エタノール(67%)
100μg サンプル。
等モル量のウシ血清アルブミン、αカゼイン、アルコールデヒドロゲナーゼ、α−ラクトアルブミン、βガラクトシダーゼ、血清トランスフェリンおよびミオグロビン(全てSigma、Milwaukee WIから得た)を含有するタンパク質混合物を還元し(2mM TCEP、Pierce,Rockford IL)、アルキル化し(5mM ヨードアセタミド、Sigma)およびトリプシン消化した(1:20、Promega、Madison WI)。4つの当量のアリコートを、各々、4つの富化されたN−メチルピペラジン酢酸(NMPAA)NHSエステル試薬(114,115、116および117)のうちの1つを用いて、0.5mgの試薬を50μLのペプチド溶液に添加して30分間室温で反応させることによって、処理した。この4つの反応物を合わせ、エバポレートして乾燥させ、そして各構成成分の500fmol量を、以下の実施例26において表題「LC−MS分析」のもとで記載されるように、LC−MS/MSによって分析した。
(酵母タンパク質の抽出および標識)
対数期の細胞(75% log)を収集し、凍結して、ドライアイス上で粉砕することによって機械的に溶解した。凍結細胞材料(湿重量100mg)を1mlの溶解緩衝液(0.1M TEAmB、0.1%v/v TritonX−100、6M グアニジン)に懸濁し、ボルテックス(1分)し、超音波処理(5×30秒)し、そして不溶性の細片を遠心分離(13000g、5分間)によりペレット化することによって、粗製の細胞溶解物を調製した。最終的に測定されたタンパク質濃度は、3〜3.4mg/mLであった。タンパク質を還元し(2mM TCEP、37℃、1時間)、アルキル化し(5mM ヨードアセタミド、37℃、2時間)、そして6容量の冷アセトン(ドライアイスで20分)を添加することにより沈殿させた。タンパク質を遠心分離(13000g、5分)によって回収し、風乾させ、そして−80℃で凍結させた。消化のために、タンパク質を消化緩衝液(100mM TEAmB、0.05%w/v SDS)に再懸濁し、最終濃度を1mg/mLとした(BCAアッセイ(Sigma,St.Louis,MO)によって測定された全タンパク質)。次いで、各溶解物からの当量のアリコート(500μg)をトリプシンによって、37℃で一晩消化し(Sigma,1:40 w/w、0時間および2時間において添加)、凍結乾燥した。
各酵母系統について、150μgの全タンパク質を100μLの標識緩衝液(0.25M TEAmB、75%エタノール)に再懸濁し、この後1mgの各々の同位体富化したN−メチルピペラジン酢酸NHSエステルを添加し(最終1%w/v)、そして室温で30分間反応させた。残った試薬を300μLの水を添加することによってクエンチし、さらに30分間かけて過剰の試薬を完全に加水分解し、次いで3つの標識サンプルを混合し、凍結乾燥した。
合わせたペプチド混合物を、Agilent 1100 HPLCシステム上で、ポリスルホエチルAカラム(4.6×100mm、5μm 300A)を用いて強陽イオン交換(SCX)クロマトグラフィーによって分離した。サンプルを4mlのSCXローディング緩衝液(25%v/v ACN、10mM KH2PO4、リン酸によってpH3)中に溶解し、ローディングし、そして20分間0.5mL/分で等組成的に(isocratically)洗浄して過剰な試薬を除去した。0〜500mM KCl(25%v/v ACN,10mM KH2PO4、pH3)、1mL/分の線形勾配によってペプチドを溶出し、画分を1分間隔で回収した。
Probot MALDIスポッティングデバイスを備えるUltimateTMクロマトグラフィーシステム(Dionex−LC Packings,Hercules,CA)上で、ペプチド分離を実施した。約10μgのタンパク質物質を含む個々のSCX画分を注入し、0.3×5mmのトラップカラム(3μ C18(Dionex−LC Packings,Hercules,CA))上で捕捉して、次いで0.1×150mmの分析用カラムに、自動化二成分勾配(automated binary gradient)(800nL/分)(95%緩衝液A(2% アセトニトリル、0.1% TFA)〜45%緩衝液B(85% アセトニトリル、5% イソプロパノール、0.1% TFA)35分、次いで45〜90% B、5分)を使用して溶出した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析/質量分析(MALDI MS/MS)のために、25nLの混合ティー(mixing tee)(Upchurch,WA)により、カラム溶出液をマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)マトリックス(7mg/mL−α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸)と1:2の比率で混合し、16×16スポットアレイにスポットした。MALDIプレートをABI 4700(Applied Biosystems,Framingham,MA)プロテオミクスアナライザー上で分析した。エレクトロスプレー分析のために、Qstar PulsarTM(Applied Biosystems−MDS Sciex)質量分析計に接続したUltimate LCシステムを使用した。液体クロマトグラフィー(LC)の条件は、LC−MALDIについて使用した条件と類似したものであり、5%〜35% B(A:2% アセトニトリル/0.1% ギ酸;B=95% アセトニトリル/0.1% ギ酸)の2時間の勾配を使用して、75μm×150mmのC18カラム(Pepmap,Dionex)に対して、300nl/分の流速でペプチドを分離した。動的排除(dynamic exclusion)を使用して、90〜2000m/zからのMS/MSについて選択した3個までのプリカーサーを用いて、m/z 300〜1500からのサーベイスキャンを得た。回転衝突エネルギーを使用して、フラグメンテーションを促進した。二価の荷電イオンについての代表的な平均値は、それぞれ600m/zおよび900m/zに対して41Vおよび56Vであり、三価の荷電イオンについての代表的な平均値は、それぞれm/z600およびm/z900に対して29Vおよび43Vであった。この衝突エネルギーの範囲は、標識されていないペプチドに対して使用したものよりも約20%高く、塩基性のN末端誘導体の安定化効果を克服し、等価のフラグメンテーション効率を達成した。
ペプチドおよびタンパク質の同定を、Mascotサーチエンジン(Ver 1.9,Matrix Science,London UK)14を使用して実施した。データベースの調査は、酵母のトリプシンにより生じたペプチドに限定した(Swissprotバージョン42.5;4924個のS.cerevisiae配列;138922個の全配列)。S−アセトアミド、N末端およびリジンの修飾を固定として選択し、Met酸化を可変として選択し、可能な1つを失う切断(1 missed cleavage)および<50ppmにおけるプリカーサー誤差許容(precursor error tolerance)を選択した。基本型のソフトウェアツールを用いて、等圧タグからの特徴イオンピークの領域を4700またはQSTARの生データから抽出し、適合させて同定した。次いで、結果をタンパク質に分類し、比率および標準偏差を計算するために、同定したペプチドの完全なリストを、Access(Microsoft,WA)データベースに提供した。存在量比率の計算としては、重複する同位体の寄与(天然の13C成分および富化13C成分の両方)に対する校正が挙げられた。
以下の実施例は、調製した6 Protein Mixtureに関して考察しているが、この考察したワークフローは、目的の未知のサンプルへの適用を含め、一般的に適用可能であり得る。以下に示すプロトコルは、標識前のタンパク質の変性および還元を記載する。標識反応を実施した後に、変性および還元を実施することもまた、可能である。
1.20μLの溶解緩衝液を100μgの6 Protein Mixture(合計3.7nmol)を含むチューブに添加する
2.2μLの還元試薬(TCEP)を添加し、1μlの変性試薬をサンプルチューブに提供する(必要に応じてか、または工程B10の後に実施する)
3.ボルテックスして混合し、次いで遠心する
4.60℃で1時間、チューブをインキュベートする(タンパク質を溶解する)
5.溶液をチューブの底に移動させるために、遠心する
6.各チューブに1μLのシステインブロッキング試薬(MMTS)を添加する
7.ボルテックスして混合し、次いで遠心する
8.室温で10分間インキュベートする。
1.各バイアルの1mgのNMPAA−NHSを室温にする
2.試薬を回転させて、全ての粉末をバイアルの底に移動させる
3.70μLのエタノールを試薬のバイアルに添加する
4.バイアルを1分間ボルテックスして試薬を溶解させ、次いで遠心する
5.1つの調製したバイアルの標識試薬を、1つのタンパク質混合物のサンプルチューブに移す
6.各バイアルをボルテックスして混合し、ついで遠心する
7.室温でインキュベートする
8.サンプルバイアルに30μLの1M NH4HCO3を添加し、ボルテックスして混合し、次いで遠心する
9.20分間インキュベートして、試薬を完全にクエンチする
10.各標識試薬の内容物を1つのチューブ中で合わせる
11.アセトン沈殿:1mLの冷アセトンをサンプルバイアルに添加し、ボルテックスして混合し、次いで遠心する
12.2時間−20℃でインキュベートする
13.14の設定で15分間バイアルを遠心する
14.上清をデカントする
15.2分間スピードバックにかけ(speed vac)、残渣のアセトンを除く
16.サンプルチューブを175μLの25mM NH4HCO3で再懸濁する;60℃で1時間インキュベートする。
1.バイアルのトリプシン(25μg(CaClを含む))を25μLのMilli−Q水で再構成する
2.ボルテックスして混合し、次いで遠心する
3.25μLのトリプシン溶液をタンパク質溶液に添加する
4.ボルテックスして混合し、次いで遠心する
5.37℃で一晩インキュベートする
6.回転させて、溶液をチューブの底に移動させる。
(サンプル)
1)ラミニン 50μmol、TPI1(既知のタンパク質) 25μmol(20μL 1.2mmol/mL)およびTPI2(既知のタンパク質) 20μmol(25μL 0.79mmol/mL)(50mM tris−(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)および0.1% SDS pH8.5(ICAT溶解緩衝液)中)→
全量は、250μLであった。
2)TPIタンパク質消化(100μg TPI/200μL)。
サンプル1およびサンプル2を還元し、2μLの50mM TCEPを添加することによって変性させ、10分間加熱ブロックした。ブロッキング工程は、除いてもよい。
2.1μlの還元試薬をタンパク質溶液に添加して、2mMの最終濃度を達成する
3.タンパク質溶液を37℃で1時間インキュベートする
4.1μlのMMTSを変性させて還元したタンパク質溶液に添加し、10分間ボルテックスする
5.タンパク質溶液を希釈緩衝液(0.1M NH4HCO3)で1:1に希釈する
6.2μlのLysCをタンパク質溶液に添加し、37℃で2時間消化する
7.タンパク質溶液を水で1:1に希釈する
8.10μlのトリプシン(約5μg)を添加し、37℃で5〜10時間消化を続ける
9.2μlの還元試薬を消化物に添加し、システインを含むペプチドを37度で1時間還元する。
1.NANOSEPTMチューブ中でCCS2樹脂を、MilliQ H2Oで3回(3×100μL、5分間)洗浄する(洗浄液を分析にために回収する)
2.50mM Tris含有物(pH8.5)で樹脂を条件付けする(200μl、5分間)
3.各消化物の混合物(200μl)を7mgのCCS2を含むNANOSEPTMチューブに移す
4.ボルテックスプラットホーム上のチューブホルダーにチューブを取り付け、低速で60分間ボルテックスする
5.Eppendorf遠心分離機においてNANOSEPサンプルチューブを回転させて結合していないペプチドを除き、HPLC(FT,Flow through)によって濾液を分析する
6.100μLのMilliQ H2Oで洗浄して(5分間)、さらなる未結合のサンプルを樹脂から除き、分析のためのサンプルを完全に流すために洗浄液を添加する
(N−アセチルシステアミンによるCCS2樹脂のクエンチ)
1.200μlの1.0%のN−アセチルシステアミン溶液(すなわち、200μlの50mM Tris(pH8.5)中、2μL)を樹脂チューブに添加し、室温(RT)で30分間チューブをボルテックスする
2.Eppendorf遠心分離機においてチューブを回転させ、試薬を除く
3.クエンチした樹脂を10mM TEAmB(3×100μl)で洗浄する。洗浄溶媒を回収して分析した(HPLC)
4.スピードバックで樹脂を乾燥させる。
1.5mgの標識試薬(5回の反応に対して十分)をEppendorfチューブ中に計りとる
2.別個のチューブにおいて、以下のタグ付け緩衝液および溶媒を混合する:
50μlの1.0M TEAmB(トリエチルアンモニウムビカーボネート)
250μlのH2O
700μlのエタノール(EtOH)
3.上記の溶液(4×125μL)を標識試薬チューブに移し、混合物をボルテックスし(約20秒)、そして即座に100μLを4つのサンプルチューブの各々に移す
4.チューブを1時間室温(RT)でボルテックスする
5.反応物を遠沈する(分析のための回収)
6.0.1% TFA(H2O中)で3回で樹脂を洗浄(3×100μl)し、0.1% TFAを含む、100μlの25%アセトニトリルで1回以上洗浄する(必要に応じて、これらの洗浄液を、分析のための最初の標識溶液に添加する)
7.切断工程の前に、スピードバックで樹脂を完全に乾燥させる。
(酸切断)
1.95% TFA、5% TIPSを含む200μlのカクテルを乾燥させたサンプルチューブに添加し、低速で1時間室温でボルテックスする
2.チューブを遠沈し、チューブ中の濾液を残しておく
3.100μlの95% TFA、5% TIPSを樹脂チューブに添加して、再度遠沈する
4.プールした濾液を乾燥させ、全てのサンプルを50μL MilliQ H2Oに再溶解する
全ての他のサンプルを50μL MilliQ H2Oに再溶解する。
HPLC分析:95μL H2O中の5μL、80μLを注入する
α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(ACHCA)中のMALDI−MS最終の切断された生成物(1:10)。
Claims (39)
- 式:
Yは、直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立にフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり;そして
各Zは、独立に水素;フッ素;塩素;臭素;ヨウ素;アミノ酸側鎖;置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立にフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基;あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立にフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であり;
ここで、該N−置換ピペラジンは、13C、15Nのいずれかのみまたは13Cおよび15Nの両方で同位体富化されており、ただし、該同位体富化されたN−置換ピペラジン化合物は、C−2位とC−5位、C−2位とC−6位、または、C−3位とC−5位に2つの13C原子を有するN−メチルピペラジンではない、同位体富化されたN−置換ピペラジン化合物、その塩形態、水和物形態、または塩でありかつ水和物である形態。 - 前記N−置換ピペラジンが、2つ以上の重原子同位体、3つ以上の重原子同位体または4つ以上の重原子同位体で同位体富化されている、請求項1に記載の化合物。
- 式:
- 前記化合物が、モノTFA塩、モノHCl塩、ビスTFA塩またはビスHCl塩である、請求項1または3のいずれかに記載の化合物。
- 式:
各Xは、独立にOまたはSであり;
Yは、直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり;
各Zは、独立に水素;重水素;フッ素;塩素;臭素;ヨウ素;アミノ酸側鎖;置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基;あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であり、ただし、該同位体富化されたN−置換ピペラジン酢酸化合物は、同位体富化されたN−メチルピペラジン酢酸ではない、同位体富化されたN−置換ピペラジン酢酸化合物、またはその塩形態、水和物形態、もしくは塩でありかつ水和物である形態。 - 前記N−置換ピペラジン酢酸化合物が、1つ以上の重原子同位体、2つ以上の重原子同位体、3つ以上の重原子同位体、4つ以上の重原子同位体、5つ以上の重原子同位体、6つ以上の重原子同位体、または6つより多い重原子同位体を含む、請求項5に記載の化合物。
- 前記重原子同位体が、各々、独立に18O、15Nまたは13Cである、請求項6に記載の化合物。
- 各Zが、独立に水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である、請求項1または5のいずれかに記載の化合物。
- 前記ピペラジン環の各窒素原子が、独立に14Nまたは15Nである、請求項5に記載の化合物。
- 式:
各C*は、独立に12Cまたは13Cであり;
各N*は、独立に14Nまたは15Nであり;
各Xは、独立にOまたはSであり;
Yは、直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり;
各Zは、独立に水素;重水素;フッ素;塩素;臭素;ヨウ素;アミノ酸側鎖;置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基;あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基である、化合物。 - 式:
- 前記化合物が、双性イオン、モノTFA塩、モノHCl塩、ビスTFA塩またはビスHCl塩である、請求項5または11のいずれかに記載の化合物。
- 前記化合物が、カルボキシレートアニオンである、請求項5に記載の化合物。
- 式:
LGは、活性エステルの脱離基であり;
Xは、OまたはSであり;
Yは、直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり;
各Zは、独立に水素;重水素;フッ素;塩素;臭素;ヨウ素;アミノ酸側鎖;置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基;あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換の直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であり;そして
該N−置換ピペラジン酢酸部分が1つ以上の重原子同位体を含み、
LGが、以下:
化合物。 - 前記N−置換ピペラジン酢酸活性エステル化合物が、13Cで同位体富化されている、請求項14に記載の化合物。
- 前記N−置換ピペラジン酢酸活性エステル化合物が、1つ以上の重原子同位体、2つ以上の重原子同位体、3つ以上の重原子同位体、4つ以上の重原子同位体、5つ以上の重原子同位体、6つ以上の重原子同位体または6つより多い重原子同位体を含む、請求項14に記載の化合物。
- LGがN−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項14に記載の化合物。
- 各Zが、独立に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である、請求項14に記載の化合物。
- 各Zが、独立に水素、メチルまたはメトキシである、請求項1、5または14のいずれかに記載の化合物。
- Yが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、請求項1、5または14のいずれかに記載の化合物。
- Xが16Oまたは18Oである、請求項5または14のいずれかに記載の化合物。
- 式:
各C*は、独立に12Cまたは13Cであり;
各N*は、独立に14Nまたは15Nであり;
LGは、活性エステルの脱離基であり;
Xは、OまたはSであり;
Yは、直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり;そして
各Zは、独立に水素;重水素;フッ素;塩素;臭素;ヨウ素;アミノ酸側鎖;置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基;あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基である、化合物。 - 式:
- 前記化合物が、モノTFA塩、モノHCl塩、ビスTFA塩またはビスHCl塩である、請求項14〜23のいずれかに記載の化合物。
- 各組込まれた重原子同位体が、少なくとも80%の同位体純度、少なくとも93%の同位体純度または少なくとも96%の同位体純度で存在する、請求項1〜24のいずれかに記載の化合物。
- 以下:
式:
1)式:
2)該ピペラジン環の塩基性窒素原子を脱プロトン化するに十分な強塩基と、
を反応させて、それにより、式:
Halは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり;
LGは、活性エステルの脱離基であり;
Xは、OまたはSであり;
Yは、直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり;
各Zは、独立に水素;重水素;フッ素;塩素;臭素;ヨウ素;アミノ酸側鎖;置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基;あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であり;そして
該N−置換ピペラジン酢酸部分が1つ以上の重原子同位体を含む、ならびに
必要に応じて該N−置換ピペラジン酢酸活性エステルを酸で処理する工程であって、
LGが、
を包含する、
式:
- 前記N−置換ピペラジン酢酸活性エステルが13Cで同位体富化されている、請求項26に記載の方法。
- 前記同位体富化されたN−置換ピペラジン酢酸活性エステルが、1つ以上の重原子同位体、2つ以上の重原子同位体、3つ以上の重原子同位体、4つ以上の重原子同位体、5つ以上の重原子同位体、6つ以上の重原子同位体または6つより多い重原子同位体を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記酸が、HClまたはTFAである、請求項26に記載の方法。
- LGがN−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項26に記載の方法。
- 各Zが、独立に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である、請求項26に記載の方法。
- 各Zが、独立に水素、メチルまたはメトキシである、請求項26に記載の方法。
- Yが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、請求項26に記載の方法。
- Xが16Oまたは18Oである、請求項26に記載の方法。
- 請求項26に記載の方法であって、反応するべき前記化合物が、式;
各C*は、独立に12Cまたは13Cであり;
各N*は、独立に14Nまたは15Nであり;
LGは、活性エステルの脱離基であり;
各Xは、独立にOまたはSであり;
Yは、直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のC1〜C6アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり;
各Zは、独立に水素;重水素;フッ素;塩素;臭素;ヨウ素;アミノ酸側鎖;置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルキル基;あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のC1〜C6アルコキシ基である、方法。 - 請求項35に記載の方法であって、前記反応の生成物が、式:
- 各組込まれた重原子同位体が、少なくとも80%の同位体純度、少なくとも93%の同位体純度または少なくとも96%の同位体純度で存在する、請求項26〜36のいずれかに記載の方法。
- 前記N−置換ピペラジン酢酸活性エステルが、モノTFA塩、モノHCl塩、ビスHCl塩またはビスTFA塩である、請求項26〜36のいずれかに記載の方法。
- 2種以上の異なる同重体標識で標識化された同じ分析物を含む混合物であって、ここで該標識化分析物のうちの少なくとも2つが、以下:
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