JP4832312B2 - 標識試薬および標識化分析物の混合物を含む、標識試薬、標識化分析物、およびそれらに由来するフラグメントイオン、ならびにそれらの分析方法 - Google Patents

標識試薬および標識化分析物の混合物を含む、標識試薬、標識化分析物、およびそれらに由来するフラグメントイオン、ならびにそれらの分析方法 Download PDF

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Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２００４年５月２４日に出願された米国特許出願第１０／８５２，７３０号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第１０／８５２，７３０号は、２００４年４月１２日に出願された米国特許出願第１０／８２２，６３９号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第１０／８２２，６３９号は、２００４年１月５日に出願された米国特許出願第１０／７５１，３５３号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第１０／７５１，３５３号は、２００４年１月５日に出願された米国特許出願第１０／７５１，３８７号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第１０／７５１，３８７号は、２００４年１月５日に出願された米国特許出願第１０／７５１，３８８号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。米国特許出願第１０／７５１，３８８号は、２００４年１月５日に出願された米国特許出願第１０／７５１，３５４号の一部継続出願であり、これは、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は標識試薬および標識化分析物の混合物を含む、標識試薬、標識化分析物、およびそれらに由来するフラグメントイオン、ならびに標識化分析物の分析のための方法に関する。
（導入）
本発明は、質量分析による分析物の測定に関する。分析物は、任意の目的分子であり得る。分析物の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、および１５００ダルトン未満の低分子が挙げられるが、これらに限定されない。
分析物は、式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの標識試薬、その塩、および／またはその水和物との、その分析物の反応により、標識化され得る。ここで、ＲＧは、分析物と反応する反応基であり、そしてＲＰ、Ｘ、ＬＫおよびＹは、以下により詳細に説明される。それゆえ、標識化分析物は、一般式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物を有し得る。異性体標識試薬または同重体標識試薬のセットは、２種以上の異なるサンプルの分析物を標識化するために使用され得、その標識試薬は、異なるサンプルの各々に対して異なり得、ここで、その標識試薬は、サンプル（そこから、標識化分析物が生じる）と結合し得る独特のレポーター「ＲＰ」を含み得る。それゆえ、そのレポーターの存在および／または量のような情報は、たとえそれが異なるサンプルの標識化産物を混合することにより誘導された標識化分析物の複雑な混合物の分析からのものであったとしても、サンプル中の分析物の存在および／または量（しばしば、濃度および／または量と表される）と相関し得る。このような複合サンプル混合物の分析は、１または複数の分析物を、同じものから、または多重様式の多重サンプルから、測定することを可能にするような様式で実施され得る。したがって、本発明の実施形態は、複合サンプル混合物の多重分析について、特によく適している。例えば、本発明の実施形態は、タンパク質分析および／またはゲノム分析において、ならびにゲノム分析およびタンパク質分析に関係する相関研究のために、使用され得る。
例えば、同位体富化されたＮ−置換ピペラジンおよびＮ−置換ピペラジン酢酸が、Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステル合成における中間体として使用され得る。活性エステルは、ペプチド合成において周知であり、ペプチド合成において一般的に使用される条件下で、アミノ酸のアミンと容易に反応する特定のエステルをいう（活性エステルの議論については、非特許文献１を参照のこと）。一般に使用される形態の活性エステルは、Ｎ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルである。
Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルは、標識試薬として使用され得る。いくつかの実施形態において、同重体（または異性体）標識試薬のセットが、調製され得る。同重体標識試薬のセットは、分析物（例えば、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、ステロイド、低分子など）を標識化するために使用され得る。標識化分析物は、一緒に混合され、質量分析計で同時に分析され得る。
同重体標識試薬の各々において分布する重原子同位体が、質量分析計（ＭＳ）において分析される場合に、独特の特徴イオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｏｎ）の生成をもたらすように設計され得るので、各標識試薬と結合した混合物の標識化成分、およびその混合物を生成するために使用された各標識試薬の成分を包含することにより、逆重畳積分され得る。逆重畳積分は、その混合物から標識化され、そして組み合わされた個々のサンプルの各々における１以上の標識化成分の相対量および／または絶対量（しばしば、濃度および／または量として表される）の測定を包含する。本明細書中に記載されるＮ−置換ピペラジン酢酸は、それゆえ、分析物分析のための強力なツールであり得る。異性体試薬および／または同重体試薬が使用され得る実験的分析としては、経時的研究、バイオマーカー分析、多重プロテオーム分析、多重実験、アフィニティープルダウン、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の測定、および多重コントロール実験が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９０）編者：Ｒｏｇｅｒ Ｅｐｔｏｎ，ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ
（定義）
本明細書の解釈の目的のために、以下の定義が適用され、そして適切ならばいつでも、単数形は複数形もまた包含し、逆もまた同様である。以下の定義は、他の文書（参考として本明細書中に援用されるものも含む）に含まれる他の可能な定義より優先する。
ａ．）本明細書中で使用される場合、「分析物」とは、測定され得る目的の分子をいう。分析物の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡの両方）、炭水化物、脂質、ステロイドおよび１５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量の他の低分子が挙げられるが、これらに限定されない。分析物、または分析物を含むサンプルの供給源は、制限とはならず、任意の供給源に由来し得る。分析物は、天然物であっても合成物であってもよい。分析物、または分析物を含むサンプルに対する供給源の非限定的な例としては、細胞または組織、あるいはそれらの培養物（または継代培養物）が挙げられる。分析物供給源の非限定的な例としては、粗製細胞溶解物または処理された細胞溶解物、体液、組織抽出物、細胞抽出物あるいは分離プロセス（例えば、クロマトグラフィー分離、１Ｄ電気泳動分離、２Ｄ電気泳動分離またはキャピラリー電気泳動分離）による画分（または部分）が挙げられるが、これらに限定されない。体液としては、血液、尿、糞便、脊髄液、脳脊髄液、羊水、リンパ液または腺分泌由来流体が挙げられるが、これらに限定されない。処理された細胞溶解物は、その細胞を溶解するのに必要とされる処理に加えて、その細胞溶解物が処理されており、それにより収集された物質のさらなる処理を実施することを意味する。例えば、サンプルは、１種以上の分析物を含む細胞溶解物であり得る。その分析物は、その細胞溶解物をタンパク質分解酵素で処理し、それにより前駆体ペプチドおよび／または前駆体タンパク質を消化することによって形成されるペプチドである。
ｂ．）化合物に関して本明細書中で使用される場合、「軽い」とは、重原子同位体で富化されていない化合物をいう。化合物に関して本明細書中で使用される場合、「重い」とは、少なくとも１つの重原子同位体が富化されている化合物をいう。
ｃ．）用いられている文脈に基づいて明確に意図されない場合（例えば、そうでないことを示す構造の参照がなされている場合）を除いて、「エステル」とは、エステルおよび／またはチオエステルの両方をいう。
ｄ．）原子または分子の質量は、近似（しばしば最も近い原子質量単位の自然数または小数点第一位もしくは小数点第二位が最も近い原子質量単位）であり得ることが、十分に容認される。本明細書中で使用される場合、「総質量」とは、絶対質量およびある範囲内のおよその質量をいう。ここで、その範囲は、使用される異なる同位体タイプの質量における非常に小さな差異が検出され得るか否かに関わらず、異なる原子タイプの同位体の使用が質量において非常に近いために、それらがレポーターおよび／またはリンカー部分の質量の均衡をとる目的のために、等価に機能する（そのため、同重体標識試薬または同位体標識試薬のセットまたはキットにおいて、レポーター／リンカーの組み合わせの総質量は同じである）ような範囲である
例えば、酸素の一般的な同位体は、１６．０の総質量（実際の質量は１５．９９４９）および１８．０の総質量（実際の質量は１７．９９９２）を有し、炭素の一般的な同位体は、１２．０の総質量（実際の質量は１２．０００００）および１３．０の総質量（実際の質量は１３．００３３６）を有し、そして窒素の一般的な同位体は、１４．０の総質量（実際の質量は１４．００３１）および１５．０の総質量（実際の質量は１５．０００１）を有する。これらの値は近似であるが、当業者は、あるセットのレポーターにおいて１８Ｏ同位体を用いる場合、（総質量１６．０を有する酸素の同位体に対する）追加の２の質量単位は、１８Ｏを埋め合わせるために、１６Ｏを含むセットの異なるレポーターにおいて、例えば２つの１２Ｃ原子の代わりに２つの１３Ｃ原子を、２つの１４Ｎ原子の代わりに２つの１５Ｎ原子を、または１つの１２Ｃ原子および１４Ｎ原子の代わりに１つの１３Ｃ原子および１つの１５Ｎ原子を、そのレポーター内のどこへでも組み込むことにより、埋め合わせられ得る。このようにして、そのセットの２つの異なるレポーターは、機能的質量等価（すなわち、同じ総質量を有する）である。なぜなら、２つの１３Ｃ原子（２つの１２Ｃ原子の代わり）の使用、２つの１５Ｎ原子（２つの１４Ｎ原子の代わり）の使用、１つの１３Ｃおよび１つの１５Ｎ（１つの１２Ｃおよび１つの１４Ｎの代わり）の使用（これらにより質量において２ダルトンの増加を達成する）の間の、質量における非常に小さな実際の差異は、そのセットまたはキットの全ての標識において、分析の性質の妨げとならない。
これは、図８を参照して図示され得る。図８において、化合物ＸＶＩＩのレポーター／リンカーの組み合わせ（図８；化学式Ｃ５ １３ＣＨ１０ １５Ｎ２Ｏ）は、２つの１５Ｎ原子および１つの１３Ｃ原子、ならびに１２９．１３８の総理論的質量を有する。比較として、同重体ＸＶ（図８；化学式Ｃ５ １３ＣＨ１０Ｎ２ １８Ｏ）は、１つの１８Ｏ原子および１３Ｃ原子、ならびに１２９．１５１の総理論的質量を有する。わずかな絶対質量の差異（それぞれ、質量１２９．１３８対質量１２９．１５１）が存在するが、化合物ＸＶＩＩおよびＸＶは、重原子同位体含量を除いては、構造的および化学的に区別不可能な同重体である。しかし、本発明の目的のためには、化合物ＸＶＩＩおよびＸＶの総質量は１２９．１である。なぜなら、質量分析計が同重体ＸＶＩＩとＸＶとの間の絶対質量の小さな差異を測定するのに十分に高感度であるか否かに関わらず、このことは分析を妨げないからである。
図８から、構造内での同じ重原子同位体の分布のみが、異性体標識試薬および／または同重体標識試薬のセットの作製のための検討事項ではないことが、明確である。所望の総質量の異性体または同重体を達成するために、重原子同位体タイプを混合することが可能である。この方法において、重原子同位体の選択（組み合わせ）およびそれらの分布の両方が、本発明の実施形態のために有用な異性体標識試薬および／または同重体標識試薬の作製における検討事項として利用可能である。
ｅ．）本明細書中で使用される場合、「フラグメンテーション」とは、共有結合の破壊をいう。
ｆ．）本明細書中で使用される場合、「フラグメント」とは、フラグメンテーションの産物（名詞）またはフラグメンテーションを引き起こす操作（動詞）をいう。
ｇ．）化合物について本明細書中で使用される場合、「同位体富化された」は、化合物（例えば、標識試薬）が、１以上の重原子同位体（例えば、重水素、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３７Ｃｌまたは８１Ｂｒのような安定な同位体）で合成的に富化されていることを意味する。「富化された」により、重原子同位体の量が、天然に形成される組成物において通常見られる量を超えていることが意味される。同位体富化は１００％有効ではないので、富化の状態がより小さい、化合物の不純物が存在し得、そしてこれらはより小さい質量を有する。同様に、過剰富化（望ましくない富化）により、そして天然の同位体の存在量により、より大きな質量の不純物が存在し得る。
ｈ．）本明細書中で使用される場合、「標識試薬」とは、測定のための分析物をマークするのに適した部分をいう。用語「標識」は、用語「タグ」、および「マーク」、および他の等価な用語および句と同義語である。例えば、標識化分析物は、タグ化分析物またはマーク分析物として、称され得る。
ｉ．）本明細書中で使用される場合、「天然同位体存在量」とは、天然の同位体の天然の分布に基づいた化合物において見られる１以上の同位体のレベル（または分布）をいう。例えば、生きている植物から得られた天然の化合物は、１２Ｃに対して、代表的に、約１．０８％１３Ｃを含む。
ｊ．）本明細書中で使用される場合、同重体は、同じ名目上の総質量の構造的および化学的に区別不可能（同位体含量および分布を除いて）な化合物である。比較すると、異性体は、同じ見かけの総質量の構造的かつ／または化学的に区別不可能な化合物である。
ｋ．）本明細書中で使用される場合、「担体」、「固体担体」、「固体キャリア」または「固相」とは、その上に標識試薬が固定化され得る任意の固相物質をいう。固定化は、例えば、標識化がその担体上で起こるか否かに関わらず、分析物を標識化するためまたは標識試薬を調製するために使用され得る。担体は、「樹脂」、「合成担体」、「固相」、「表面」、「膜」および／または「担体」のような用語を包含する。固体担体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドならびにコポリマーおよびそれらのグラフト）からなり得る。固体担体はまた、無機物（例えば、ガラス、シリカ、微細孔性ガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカ）でもあり得る。固体担体の構成は、ビーズ、球形、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。担体は、多孔性または非多孔性であり得、そして膨張特性または非膨張特性を有し得る。担体は、ウェル、凹部または他の容器、器、特徴または位置の形態で構成され得る。複数の担体は、試薬のロボットによる送達のために、または検出方法および／または検出機器によりアドレス可能な種々の位置に、アレイ状に構成され得る。
（発明の種々の実施形態の説明）
（Ｉ．概要）
（反応性基）
本方法、混合物、キットおよび／または組成物の実施形態において使用され得る標識試薬の反応基「ＲＧ」は、サンプルの１種以上の反応性分析物と反応し得る、求電子試薬または求核試薬のいずれかであり得る。その反応基は、前から存在してもよいし、インサイチュで調製されてもよい。反応基のインサイチュ調製は、反応性分析物の非存在下で進行してもよいし、反応性分析物の存在下で進行してもよい。例えば、カルボン酸基は、インサイチュで水溶性カルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥＤＣ）で改変され得、これによりアルキルアミンまたはアリールアミンのような求核試薬と反応し得る求電子基を調製し得る。いくつかの実施形態において、ＥＤＣによる標識試薬のカルボン酸基の活性化は、分析物を含むアミン（求核試薬）の存在下で実施され得る。いくつかの実施形態において、分析物を含むアミン（求核試薬）もまた、ＥＤＣとの初期反応が実施された後に、添加され得る。他の実施形態において、反応基は、保護基のインサイチュ除去により、インサイチュで生成され得る。その結果、求核試薬および／または求電子試薬の反応により分析物の誘導体化をもたらし得る、存在しているか又は新たに作製された試薬が、本発明の方法、混合物、キットおよび／または組成物の実施形態により企図される。
標識試薬の反応基が求電子試薬である場合、それは、分析物の適した求核試薬と反応し得る。標識試薬の反応基が求核試薬である場合、それは、分析物の適した求電子試薬と反応し得る。適切な求核基と求電子基との多数の対が公知であり、化学分野および生化学分野にてしばしば使用される。分析物（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイドまたは１５００ダルトン未満の分子量の他の低分子）に結合し、その誘導体化をもたらし得る適した求核基と求電子基とを含む試薬の非限定的な例は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｐｅｒｓｔｏｒｐ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃｏｍｐａｎｙ），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ６１１０５，ＵＳＡに記載されている。他の適した試薬が当該分野において周知であり、そしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのような製造メーカーから市販されている。
標識試薬の反応基は、アミン反応基であり得る。例えば、そのアミン反応基は、活性エステルであり得る。活性エステルは、ペプチド合成において周知であり、ペプチド合成において一般的に使用される条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応する特定のエステルをいう。アミン反応性活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｐｆｐ）、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステルまたは２，４−ジハロフェニルエステルであり得る。例えば、活性エステルのアルコール基またはチオール基は、以下：
の式を有し得、ここで、ＸはＯまたはＳであるが、好ましくはＯである。前述の全てのアルコール基またはチオール基は、ペプチド化学の分野において活性エステルを形成することが知られており、ここでそのアルコール基またはチオール基は、アミノ酸のＮ−α−アミンとエステルのカルボニル炭素との反応により置換される。本明細書中に記載される任意の適した標識／タグ化試薬活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）は、周知の手順を使用して調製され得ることは、明白なはずである（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」第２章の「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ」、１３７〜１６５ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと；Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｏｇｅｒ Ｅｐｔｏｎ編、ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，１９９０もまた参照のこと）。一般式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの標識試薬の代表的な例である、Ｎ置換ピペラジン酢酸の活性エステルの形成のための方法は、以下に詳細に説明される。
別の実施形態において、標識試薬の反応基は、混合無水物であり得る。なぜなら、混合無水物は、アミン基と効率的に反応し、それによりアミド結合を生成することが知られているからである。
標識試薬の反応基は、チオール反応基であり得る。例えば、そのチオール反応基は、マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）、ハロゲン化アルキル、α−ハロ−アシルのハロゲン化アリール、ならびにα−ハロ−チオンまたは／およびα−ハロイミンであり得る。ハロゲン化またはハロにより、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。
標識試薬の反応基は、ヒドロキシル反応基であり得る。例えば、そのヒロドキシ反応基は、ハロゲン化トリチル反応部分またはハロゲン化シリル反応部分であり得る。ハロゲン化トリチル反応部分は、置換されていても（例えば、Ｙ−メトキシトリチル、Ｙ−ジメトキシトリチル、Ｙ−トリメトキシトリチルなど）、置換されていなくてもよく、ここで、Ｙは以下で定義される。シリル反応部分は、アルキル置換ハロゲン化シリル（例えば、Ｙ−ジメチルシリル、Ｙ−ジトリエチルシリル、Ｙ−ジプロピルシリル、Ｙ−ジイソプロピルシリルなど）であり得、ここでＹは以下で定義される。
標識試薬の反応基は、アミン基、ヒドロキシル基またはチオール基のような求核試薬であり得る。
（レポーター部分）
本発明の実施形態において使用される標識試薬のレポーター部分は、測定され得る独特の質量（または質量対電荷比）を有する基であり得る。したがって、あるセットの各レポーターは、独特の総質量を有し得る。異なるレポーターは、それらの独特の質量を達成するために、１以上の重原子を含み得る。例えば、炭素の同位体（ｌ２Ｃ、ｌ３Ｃおよびｌ４Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏおよび１８Ｏ）または水素（水素、重水素および三重水素）が存在し、そしてレポーター部分の多様な基の調製において使用され得る。安定な重原子同位体としては、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏおよび重水素が挙げられる。これらは他の軽原子同位体および重原子同位体もまたそのレポーターにおいて使用され得ることを制限しない。軽原子同位体および重原子同位体を含むレポーターを調製するための基本的な出発物質は、種々の商業的供給元から入手可能である。その商業的供給元は、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ（一覧表またはｗｗｗ．ｉｓｏｔｏｐｅ．ｃｏｍの「ｂａｓｉｃ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌｓ」を参照のこと）およびＩｓｏｔｅｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの部門）である。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃはまた、特注の合成契約の下で、所望の化合物を調製する。Ｉｄ．
独特のレポーターは、目的のサンプルと結合し得、それによりそのサンプルの１以上の多重分析物をレポーターで標識化し得る。このようにして、レポーターについての情報が、そのサンプルの１つまたは全ての分析物についての情報と関連し得る。しかし、そのレポーターが測定される場合、そのレポーターは分析物に物理的に結合される必要はない。むしろ、標識化分析物のイオンがフラグメント化され、それにより娘フラグメントイオンおよび検出可能なレポーターを生成した後に、レポーターの独特の総質量が、例えばタンデム型質量分析器での第二の質量分析において測定され得る。測定されるレポーターは、サンプル（このサンプルから、測定される分析物が生じた）を同定するために使用され得る。さらに、他のレポーターの量に対してかまたは較正標準物質（例えば、特定のレポーターで標識化された分析物）に対してかのいずれかの、独特のレポーターの量は、サンプル（単数または複数）における分析物の相対量または絶対量（しばしば、濃度および／または量と表される）を測定するために使用され得る。それゆえ、特定のサンプルにおける１種以上の分析物の量のような情報は、特定のサンプルの各々を標識化するために使用されるレポーター部分と関連し得る。分析物（単数または複数）の同一性もまた決定される場合、その情報は、異なるレポーターに付随する情報と関連し得、それにより１または複数のサンプルにおける標識化分析物の各々の同一性および量の決定を促進する。
レポーターは、不変の電荷を含んでもよいし、イオン化され得てもよい。レポーターは、不変の電荷を含んでもよいし、イオン化され得てもよいので、標識試薬は、単離されていてもよいし、塩形態（もしくは塩の混合物）または双性イオン形態の反応性分析物を標識するために使用されてもよい。レポーターのイオン化により、質量分析におけるその測定が促進される。それにより、レポーターはイオン（時として、特徴イオンと呼ばれる）として測定され得る。イオン化される場合、そのレポーターは、１以上の正味の正電荷または負電荷を含有し得る。したがって、そのレポーターは、１以上の酸性基または塩基性基を含有し得る。なぜなら、そのような基は、質量分析計において容易にイオン化され得るからである。例えば、そのレポーターは、１以上の塩基性窒素原子（正電荷）または１以上のイオン化可能な酸性基（例えば、カルボン酸基、スルホン酸基またはリン酸基）（負電荷）を含有し得る。塩基性窒素を含む非限定的なレポーターとしては、置換または非置換の、モルホリン、ピペリジンまたはピペラジンが挙げられる。
レポーターは、置換または非置換の酢酸部分（これに、分析物がＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して結合される）でＮ−アルキル化された環窒素原子を含む５員、６員、または７員の複素環を含有し得る。ここで、異なる標識の各々は、１以上の重原子同位体を含有する。その複素環は、置換または非置換であり得る。その複素環は、脂肪族または芳香族であり得る。その複素環部分の可能な置換基としては、アルキル、アルコキシおよびアリール基が挙げられる。置換基は、分析物を担体へ結合させるのに適した、保護されているかまたは保護されていない基（例えば、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基）を含み得る。その複素環は、追加のヘテロ原子（例えば、１つ以上の窒素、酸素または硫黄原子）を含み得る。
レポーターは、分析物の分析のための条件下で、実質的に二次フラグメント化しないように、選択され得る。レポーターは、質量分析計の中で標識化分析物の少なくとも一部の選択されたイオンの、結合Ｘまたは結合Ｙ両方のフラグメンテーションを引き起こすために解離エネルギーが加えられる条件下で、実質的にサブフラグメントしないように選択され得る。「実質的に二次フラグメント化しない」により、目的の分析物を首尾よく分析した場合に、レポーターのフラグメントがバックグラウンドノイズ上で検出するのが困難であるかまたは不可能であることを意味する。レポーターの総質量は、測定されることが求められている分析物またはその分析物の任意の予想されるフラグメントと比較して、異なるように意図的に選択され得る。例えば、タンパク質またはペプチドが分析物である場合は、そのレポーターの総質量は、任意の天然に生じるアミノ酸もしくはペプチド、またはそれらの予想されるフラグメントと比較して、異なるように選択され得る。これにより、分析物の決定が容易になる。なぜなら、分析物に依存して、偶然一致する同じ質量を有するサンプルのいずれの可能な成分も存在しないことにより、任意の分析の結果に信頼性が加えられ得るからである。ペプチドについてほとんどバックグラウンドが予想され得ない場合の質量範囲は、表１において見ることができる。
レポーターは、非ポリマー性の低分子であり得る。レポーターは、生体高分子（例えば、ペプチド、タンパク質またはヌクレオチド）または生体高分子の構成要素（例えば、アミノ酸、ヌクレオシドまたはヌクレオチド）である必要はない。レポーターの総質量は、２５０ダルトン未満であり得る。そのような低分子は、第一の質量分析において偶然一致する同じ質量を有するサンプルの他の成分を含まない第二の質量分析において、容易に測定され得る。この文脈において、第二の質量分析は、第一の質量分析において測定された、選択されたイオンについて、代表的にはタンデム型質量分析計において実施され得る。特定の質量対電荷比のイオンは、可能なフラグメンテーションおよびさらなる質量分析のために、第一の質量分析から特異的に選択され得るので、第一の質量分析から選択されなかったイオンは第二の質量分析に進められず、これにより第二の質量分析のスペクトルを複雑にしない。さらに、質量分析計の感度および（定量化の目的のための）検出器の直線性が、この低質量領域において極めて頑強であり得る。加えて、質量分析計技術の現在の状態により、この質量領域において１ダルトン未満のベースラインの質量分解能が可能であり得る（例えば、図６を参照のこと）。これらの要素は、当該分野の状況に有用な進歩であることが実証され得る。
（リンカー部分）
本発明の実施形態とともに使用される標識化試薬のリンカー部分は、その分析物との反応が、起こったか否かに依存して、上記レポーターを上記分析物に連結するか、またはそのレポーターを反応性基に連結する。このリンカーは、結合Ｘおよび結合Ｙの両方がフラグメント化されたときに（すなわち、結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションの際に中性損失（ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ）を受けたときに）、中性種を生成するように選択され得る。このリンカーは、カルボニル基またはチオカルボニル基のような非常に小さい部分であり得る。例えば、そのリンカーは、少なくとも１個の重原子同位体を含み得、かつ式：
を含み、ここでＲ１は、同じかまたは異なり、そして必要に応じて１個のヘテロ原子を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基または置換もしくは非置換のアリール基であって、ここでこのアルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含む。このリンカーは、より大きい部分であり得る。このリンカーは、ポリマーまたは生体高分子であり得る。このリンカーは、解離エネルギーレベルに曝されたときに、二次フラグメント化するように設計され；それは、そのリンカーの中性のフラグメントのみを生成するための二次フラグメンテーションを含む。
このリンカー部分は、その質量が、混合物の各標識化分析物に対するレポーター間のまたはセットおよび／もしくはキットの試薬に対するレポーター間の総質量差を補償するように、１個以上の重原子同位体を含み得る。さらに、レポーター／リンカーの組合せの凝集体総質量（すなわち、全体として捉えられた総質量）は、混合物の各標識化分析物に対して、またはセットおよび／またはキットの試薬に対して、同じであり得る。より具体的には、そのリンカー部分は、異なるサンプルからの標識化分析物のレポーター間の総質量差を補償し、ここでそのレポーターの独特の総質量は、標識化分析物が由来するサンプルと相関し、そしてそのレポーター／リンカーの組合せの凝集体総質量は、それが由来するサンプルにかかわらず、サンプル混合物の各標識化分析物に対して同じである。このようにして、２種以上の異なるサンプル中の同一の分析物の総質量は、標識化され、次いで混合されサンプル混合物が形成されたときに、同じ総質量を有し得る。
例えば、上記標識化分析物、または分析物を標識化するためのセットおよび／またはキットの試薬は、同位体または同重体であり得る。従って、特定の質量対電荷比のイオン（サンプル混合物から取り出された）が、質量分析計中で、そのサンプル混合物の最初の質量分析から選択される（すなわち、選択されたイオン）場合、サンプル混合物を構成する異なるサンプルからの同一の分析物は、サンプル混合物中のそれぞれの濃度および／または量に比例して、その選択されたイオンにおいて示される。従って、このリンカーは、上記レポーターを上記分析物に連結するだけでなく、それはまた独特のレポーター部分の異なる質量を補償する役割を果たし得、それにより種々のサンプルの標識化分析物におけるレポーター／リンカーの組合せの総質量が均一化される。
そのリンカーは、レポーター／リンカーの組合せの凝集体総質量がセットまたはキットのすべての試薬に対して同じであるように、標識化試薬中のレポーターに対する質量バランスとして作用し得るので、そのリンカー中の原子の数が多いほど、セットおよび／またはキットの異なる同位体／同重体標識化試薬の可能な数は大きい。別の言い方をすれば、一般にリンカーが含む原子の数が多いほど、より多い数の潜在的なレポーター／リンカーの組合せが存在し得る。なぜなら、同位体は、リンカー中のせいぜい任意の位置で置換され得、それによりそのレポーター部分の異なる質量を相殺するために使用されるそのリンカー部分の異性体または同重体を生成し、そしてそれにより、レポーター／リンカーの異性体もしくは同重体のセットを生成するからである。標識化試薬のこのような多様なセットは、同じサンプルおよび／または異なるサンプル中の分析物の多重分析のために特によく適している。
セットおよび／またはキットの標識化試薬の総数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれより多くであり得る。セットまたはキットの標識化試薬の多様性は、レポーター部分およびリンカー部分の原子の数、軽同位体を置き換えるのに利用可能な重原子同位体、および同位体が合成的に配置され得る種々の合成の構成によってのみ制限される。しかし、上に示唆されるように、多くの同位体富化された基本出発物質が、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｓｏｔｅｃのような製造業者から容易に入手可能である。このような同位体富化された基本出発物質は、同重体および異性体標識化試薬のセットを生成するために使用される合成プロセスにおいて使用され得、または同重体および異性体標識化試薬のセットを生成するために使用される合成プロセスにおいて使用され得る同位体富化された出発物質を生成するために使用され得る。標識化試薬のセットにおける使用のために適した同重体標識化試薬の調製のいくつかの例は、以下により詳細に考察される。
（レポーター／リンカーの組合せ）
本明細書中に記載される標識化試薬は、結合Ｘを介して連結されるレポーターおよびリンカーを含む。上に記載されたように、レポーター／リンカーの組合せは、標識化試薬セットおよび／またはキットの各メンバーに対して、総質量が同一であり得る。さらにこの標識化試薬のレポーター／リンカーの組合せの結合Ｘは、解離エネルギーレベルにさらされたときに、選択されたイオンの少なくとも一部分においてフラグメント化し、それによりリンカーおよび／または分析物からレポーターを放出するように設計され得る。従って、そのレポーターの（ｍ／ｓ比としての）総質量およびその強度は、ＭＳ／ＭＳ分析において直接観察され得る。
このレポーター／リンカーの組合せは、セットまたはキットの種々の標識化試薬の中で．同じかまたは異なる重原子同位体の種々の組合せを含み得る。科学文献において、このことは、コード化（ｃｏｄｉｎｇ）または同位体コード化（ｉｓｏｔｏｐｅ ｃｏｄｉｎｇ）と称されることがある。例えば、Ａｂｅｒｓｏｌｄらは、同位体でコードされた親和性タグ（ＩＣＡＴ；ＷＯ００／１１２０８を参照のこと）を開示している。１つの局面では、Ａｂｅｒｓｏｌｄらの試薬は、異性体または同重体標識化試薬のような２種以上の同じ質量標識化試薬を教示していないという点で、本発明の標識化試薬とは異なる。
（質量分析計／質量分析（ＭＳ））
本発明の方法は、タンデム型質量分析計、および分子イオンを選択しフラグメント化する能力を有する他の質量分析計を使用して実施され得る。タンデム型質量分析計（および、より程度は少ないが一段階質量分析計）は、分子イオンの質量対電荷（ｍ／ｚ）比に従って、分子イオンを選択しフラグメント化し、次いで生じたフラグメント（娘）イオンスペクトルを記録する能力を有する。より具体的には、娘フラグメントイオンスペクトルは、選択されたイオンを解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ））にさらすことにより、生成され得る。例えば、特定のｍ／ｚ比を有する標識化ペプチドに対応するイオンが、第１の質量分析から選択され得、フラグメント化され得、そして第２の質量分析中で再分析され得る。このようなタンデム質量分析を実施し得る代表的な機器としては、磁気４セクター型（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｏｕｒ−ｓｅｃｔｏｒ）質量分析計、タンデム飛行時間型質量分析計、トリプル四重極（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）質量分析計、イオントラップ型質量分析計、およびハイブリッド四重極（ｈｙｂｒｉｄ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計が挙げられるがこれらに限定されない。
これらのタイプの質量分析計は、種々のイオン化源と組合わせて使用され得、イオン化源としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。イオン化源は、分析物がすでに固定電荷を有しているわけではない第１の質量分析のための荷電を帯びた種を生成するために使用され得る。さらなる質量分析機器およびフラグメンテーション法としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ機器における供給源後の減衰およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間型）−ＴＯＦ ＭＳを使用する高エネルギーＣＩＤが挙げられる。タンデム質量分析計の最近の総説として、Ｒ．ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＤ．Ｇｏｏｄｌｅｔｔ、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）を参照のこと。ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析技術の考察について本明細書中に参考として援用される米国特許第６，３１９，４７６号もまた参照のこと。
（解離エネルギーレベルによるフラグメンテーション）
質量分析計中で起こっているプロセスの結果として、結合がフラグメント化することはよく受け入れられている。さらに、結合のフラグメンテーションは、イオンを解離エネルギーレベルに供することにより、質量分析計中で誘起され得る。例えば、その解離エネルギーレベルは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）により、質量分析計中で生成され得る。質量分析の分野の当業者は、フラグメンテーションを引き起こす解離エネルギーレベルを付加するための他の例示的な技術としては、光解離、電子捕捉および表面誘起解離が挙げられるが、これらにテ限定されないことを理解する。
衝突誘起解離により結合をフラグメント化するプロセスには、結合のフラグメンテーションが起こる点までの不活性ガスとの衝突を介して選択されたイオンの運動エネルギー状態を高めることが関与する。例えば、運動エネルギーは、衝突セル中での不活性ガス（例えば、窒素、ヘリウムまたはアルゴン）との衝突により移され得る。そのイオンに移され得る運動エネルギーの量は、衝突セル中に入ることが可能なガス分子の数に比例する。より多くのガス分子が存在する場合、より多くの量の運動エネルギーが選択されたイオンに移され得、存在するガス分子がより少ない場合には、より少ない運動エネルギーが移される。
それゆえに、質量分析計中の解離エネルギーレベルが制御され得ることが明白である。特定の結合が他の結合よりも不安定であることも十分に受け入れられている。上記分析物または上記レポーター／リンカー部分における結合の不安定性は、その分析物またはレポーター／リンカー部分の性質に依存する。従って、この解離エネルギーレベルは、その分析物および／または標識（例えば、レポーター／リンカーの組合わせ）が、測定可能な様式でフラグメント化され得るように、調整され得る。当業者は、どのように質量分析計の構成要素へのこのような日常的な調整をなし、それにより適切なレベルの解離エネルギーを達成し、それにより標識化分析物のイオンの少なくとも一部分をイオン化されたレポーター部分および娘フラグメントイオンへとフラグメント化するかを理解する。
例えば、解離エネルギーが、第１の質量分析から選択された／隔離されたイオンに適用され得る。タンデム型質量分析計では、抽出されたイオンは、解離エネルギーレベルに供され得、次いで第２の質量分析器に移され得る。その選択されたイオンは、選択された質量対電荷比を有し得る。この質量対電荷比は、質量分析計の特徴に依存する質量対電荷比の範囲内にあり得る。衝突誘起解離が使用される場合、そのイオンは、それらを解離エネルギーが適用されている衝突セルを通すことにより、第１の質量分析器から第２の質量分析器へ移され得、それによりフラグメントイオンが生成され得る。例えば、分析のために第２の質量分析器に送られたイオンは、残存する（フラグメント化されていない）選択されたイオンのいくらか、または一部分、ならびに標識化分析物のレポーターイオン（特徴イオン）および娘フラグメントイオンを含み得る。
（コンピュータ支援データベース分析による分析物の決定）
いくつかの実施形態において、分析物は、娘イオンフラグメンテーションパターンに基づいて、決定され得る。これらのパターンは、公知のスペクトルまたは「理論」分析物とのコンピュータ支援比較によって、分析される。例えば、低エネルギーＣＩＤの条件下でフラグメント化されたペプチドイオンの娘フラグメントイオンスペクトルは、多くの不連続なフラグメンテーション事象の合計とみなされ得る。通常の命名法は、娘フラグメントイオンを、切断されるアミド結合と、結合分裂後に電荷を保有するペプチドフラグメントとに従って、区別する。分裂性のアミド結合のＮ末端側の電荷保持は、タイプｂイオンの形成を生じる。切断されたアミド結合のＣ末端側に電荷が保持される場合、そのフラグメントイオンは、タイプｙイオンと称される。タイプｂイオンおよびタイプｙイオンに加えて、ＣＩＤ質量分析は、他の診断フラグメントイオン（娘フラグメントイオン）を含み得る。これらとしては、グルタミン、リジンおよびアルギニンからの、中性でのアンモニアの損失（−１７ａｍｕ）によって発生するイオン、またはヒドロキシル含有アミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）からの水の損失（−１８ａｍｕ）によって発生するイオンが挙げられる。特定のアミノ酸は、他のアミノ酸よりも、低エネルギーＣＩＤの条件下で、より容易にフラグメント化することが観察された。このことは、プロリン残基またはアスパラギン酸残基を含むペプチドについて、特に明らかであり、そしてアスパルチル−プロリン結合において、なおより明らかである（Ｍａｋ，Ｍ．ら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１２：８３７−８４２）（１９９８）。従って、Ｚ−ｐｒｏ二量体またはＺ−ａｓｐ二量体（ここで、Ｚは、任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏは、プロリンであり、そしてａｓｐは、アスパラギン酸である）のペプチド結合は、他の全てのアミノ酸二量体の組み合わせの間でのペプチド結合と比較して、より不安定である傾向がある。
従って、ペプチドサンプルおよびタンパク質サンプルについては、低エネルギーＣＩＤスペクトルは、重なっているｂ系列のイオンおよびｙ系列のイオン、同じペプチド由来の内部フラグメントイオン、ならびにイモニウムイオンおよび他の中性損失（ｎｅｕｔｒａｌ−ｌｏｓｓ）イオンにおいて、余分な配列特異的情報を含む。このようなＣＩＤスペクトルを解釈して、親ペプチドのアミノ酸配列を新規に組み立てることは、大変であり、そして時間を浪費する。ペプチド配列を同定する際の最も重要な進歩は、ペプチドＣＩＤスペクトルを、タンパク質配列データベースおよびＤＮＡ配列データベースにすでに存在するペプチド配列と相関付ける、コンピュータアルゴリズムの開発であった。このようなアプローチは、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，５：９７６−９８９（１９９４））およびＭＡＳＣＯＴ（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｄ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０：３５５１−３５６７（１９９９））のようなプログラムによって、例示される。
手短に言えば、実験的なペプチドＣＩＤスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）は、タンパク質配列データベースまたはゲノム配列データベースから得られたペプチド配列からコンピュータを使用して作成された、「理論的な」娘フラグメントイオンスペクトルと適合させられるか、または相関付けられる。この適合または相関付けは、ＭＳ／ＭＳモードでの、娘フラグメントイオンの期待される質量と観察される質量との間の類似性に基づく。潜在的な適合または相関は、実験フラグメントパターンと「理論的」フラグメントパターンとがいかに良好に一致するかに従って、スコア付けされる。所定のペプチドのアミノ酸配列について検索するデータベースに対する制約は、非常に区別しやすいので、ゲノム全体のデータベースまたは発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースにおいて任意の所定のタンパク質を同定するために、単一のペプチドＣＩＤスペクトルで十分であり得る。他の概説については、Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：５−８（２０００）およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：８９３−９００（１９９８）を参照のこと。
従って、ＭＳ／ＭＳスペクトルの娘フラグメントイオン分析は、標識された分析物の分析物を決定するために使用され得るのみでなく、この分析はまた、決定される分析物の起源である分析物を決定するために使用され得る。例えば、ＭＳ／ＭＳ分析におけるペプチドの同定は、タンパク質の酵素的消化の結果としてペプチドが切断されたタンパク質を決定するために使用され得る。このような分析は、他の分析物（例えば、核酸）に対して適用され得ることが、予測される。
（結合Ｘおよび結合Ｙ）
Ｘは、レポーターの原子とリンカーの原子との間の結合である。Ｙは、リンカーの原子と、反応性基の原子、または標識試薬が反応性の分析物と反応した場合、分析物の原子のいずれかとの間の結合である。本発明の実施形態において使用され得る、種々の標識試薬（すなわち、ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ）の結合Ｘおよび結合Ｙは、解離エネルギーレベルに曝露される場合に、選択されたイオンの少なくとも一部にフラグメント化し得る。従って、この解離エネルギーレベルは、結合Ｘと結合Ｙとの両方が、標識された分析物（すなわち、ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物）の選択されたイオンの少なくとも選択された部分にフラグメント化するように、質量分析計において調節され得る。結合Ｘのフラグメンテーションは、この分析物からレポーターを放出させ、その結果、このレポーターは、この分析物から独立して決定され得る。結合Ｙのフラグメンテーションは、結合Ｘがすでにフラグメント化されているか否かに依存して、この分析物からレポーター／リンカーの組み合わせを放出させるか、またはこの分析物からリンカーを放出させる。結合Ｙは、結合Ｘより不安定であり得る。結合Ｘは、結合Ｙより不安定であり得る。結合Ｘおよび結合Ｙは、相対的不安定性が同じであり得る。
目的の分析物がタンパク質またはペプチドである場合、結合Ｘおよび結合Ｙの相対的不安定性は、アミド（ペプチド）結合に関して調節され得る。結合Ｘ、結合Ｙ、または結合Ｘと結合Ｙとの両方は、代表的なアミド（ペプチド）結合と比較して、不安定性が高くても、同じであっても、低くてもよい。例えば、解離エネルギーの条件下では、結合Ｘおよび／または結合Ｙは、Ｘ−ｐｒｏ二量体またはＺ−ａｓｐ二量体（ここで、Ｚは、任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏは、プロリンであり、そしてａｓｐは、アスパラギン酸である）のペプチド結合と比較して、フラグメンテーションを受けにくくあり得る。いくつかの実施形態において、結合Ｘおよび結合Ｙは、代表的なアミド結合とおよそ同じレベルの解離エネルギーでフラグメント化する。いくつかの実施形態において、結合Ｘおよび結合Ｙは、代表的なアミド結合と比較して、高いレベルの解離エネルギーでフラグメント化する。
結合Ｘおよび結合Ｙはまた、結合Ｙのフラグメンテーションが、結合Ｘのフラグメンテーションを生じるように、およびその逆であるように、存在し得る。この様式で、結合Ｘと結合Ｙとの両方は、本質的に同時にフラグメント化し得、その結果、かなりの量の分析物、またはその娘フラグメントイオンは、第二の質量分析において、部分標識を含まない。「かなりの量の分析物」とは、２５％未満、好ましくは１０％未満の、部分的に標識された分析物が、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて決定され得ることを意味する。
第二の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）のスペクトルにおいて、分析物の標識されたフラグメントと標識されていないフラグメントとの間には、明白な境界が存在し得るので、この特徴は、娘フラグメントイオンスペクトルのコンピュータ支援分析からの、分析物の同定を単純化し得る。さらに、分析物のフラグメントイオンは、いくつかの実施形態において、レポーター／リンカー部分で完全に標識されるか、標識されないかのいずれかである（部分的には標識されない）ので、娘フラグメントイオンの質量に、破壊された結合にわたる同位体分散（例えば、同位体が、第二の質量分析において慣用的に決定される、部分的に標識された分析物の単一の不安定な結合の各側に存在する場合に事実である）によって引き起こされる分散がほとんどあり得ないか、または全くあり得ない。
（分析物の標識）
分析物は、この分析物の官能基を、標識試薬の反応性基（ＲＧ）と反応させることによって、標識され得る。先に議論されたように、分析物の官能基は、求電子試薬または求核試薬のうちの一方であり得、そして標識試薬の官能基（すなわち、ＲＧまたは反応性基）は、求電子試薬または求核試薬のうちの他方であり得る。求電子試薬と求核試薬とは、反応して、分析物と標識試薬との間に共有結合を形成し得る。
標識反応は、溶液中で起こり得る。いくつかの実施形態において、分析物または標識試薬のうちの一方は、担体に結合され得る。この標識反応は、時々、水性条件下で実施され得る。水性条件は、タンパク質、ペプチドおよび核酸のような、生物分子の標識のために選択され得る。この標識反応は、時々、有機溶媒中、または有機溶媒の混合物中で実施され得る。有機溶媒は、低分子である分析物のために選択され得る。水と有機溶媒との混合物は、広い範囲にわたって使用され得る。例えば、水と、約６０％〜約９５％の有機溶媒（ｖ／ｖ）との溶液が、分析物を標識するために調製され得、そして使用され得る。いくつかの実施形態において、水と、約６５％〜約８０％の有機溶媒（ｖ／ｖ）との溶液が、分析物を標識するために調製され得、そして使用され得る。有機溶媒の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、ならびにアルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよび／またはブタノール）が挙げられる。
標識反応を実施する場合、ｐＨが調節され得る。ｐＨは、４〜１０の範囲であり得る。ｐＨは、この範囲の外側であり得る。一般に、非水性反応の塩基性度は、非求電子有機塩基の添加によって、調節され得る。適切な塩基の非限定的な例としては、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。あるいは、水を含有する溶媒のｐＨは、生物学的緩衝剤（例えば、（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）または４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ））、あるいは無機緩衝剤（例えば、炭酸カルシウムおよび／または炭酸水素ナトリウム）を使用して、調節され得る。反応性基のうちの少なくとも１つは、求電子試薬であり得るので、緩衝剤を、いかなる求核基も含まないように選択することが、望ましくあり得る。当業者は、通常の実験を応用して、標識試薬での分析物の標識を容易にするように、標識反応のｐＨを調節するために使用され得る他の緩衝剤を認識する。
（サンプル処理）
本発明の特定の実施形態において、サンプルは、分析物の標識の前、および標識後に、処理され得る。この処理は、分析物の標識を容易にし得る。この処理は、サンプル成分の分析を容易にし得る。この処理は、サンプルの取り扱いを単純にし得る。この処理は、上記のことの２つ以上を容易にし得る。
例えば、サンプルは、酵素で処理され得る。この酵素は、プロテアーゼ（タンパク質およびペプチドを分解するため）、ヌクレアーゼ（核酸を分解するため）、または他の何らかの酵素であり得る。この酵素は、非常に予測可能な分解パターンを有するように選択され得る。２種以上のプロテアーゼ酵素および／または２種以上のヌクレアーゼ酵素が、一緒に使用されるか、あるいは他の酵素と一緒に使用され、これによって、サンプル成分を分解し得る。
例えば、タンパク質分解酵素であるトリプシンは、セリンプロテアーゼであり、リジンまたはアルギニンと、非特異的なアミノ酸との間のペプチド結合を切断し、これによって、アミン末端（Ｎ末端）およびリジンまたはアルギニンのカルボニル末端アミノ酸（Ｃ末端）を含むペプチドを生成する。この様式で、このタンパク質の切断から生じるペプチドは、予測可能であり、そしてトリプシン消化物由来のサンプルにおけるそれらの存在および／または量は、それらが起源とするタンパク質の存在および／または量の指標になり得る。さらに、ペプチドの遊離アミン末端は、その標識を容易にする、良好な求核試薬であり得る。他の例示的なタンパク質分解酵素としては、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＣが挙げられる。
例えば、タンパク質（例えば、プロテインＺ）は、トリプシンのようなプロテアーゼで消化されると、３つのペプチド（例えば、ペプチドＢ、ペプチドＣおよびペプチドＤ）を生成し得る。従って、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で消化され、そして分析されるとペプチドＢ、ペプチドＣおよびペプチドＤを含むことが確認されるサンプルは、プロテインＺにもともと含まれていたといえる。ペプチドＢ、ペプチドＣおよびペプチドＤの量はまた、消化されたサンプル中のプロテインＺの量と相関する。この様式で、サンプル（またはその画分）中のペプチドＢ、ペプチドＣおよびペプチドＤのうちの１つ以上の同一性および／または量のあらゆる決定を使用して、もとのサンプル（またはその画分）中のプロテインＺを同定および／または定量し得る。
酵素の活性は、予測可能であるので、既知の配列のタンパク質の分解から生成されるペプチドの配列は、予測され得る。この情報を用いて、「理論的な」ペプチド情報が作成され得る。従って、実際のサンプルの質量分光分析からの、（上記のような）娘フラグメントイオンのコンピュータ支援分析における、「理論的な」ペプチドフラグメントの決定は、１つ以上の未知のサンプル中の１種以上のペプチドまたはタンパク質を決定するために使用され得る。
いくつかの場合において、サンプルの処理は、標識されるべき分析物に対する前駆体の処理を包含し得る。例えば、標識されるべき分析物が、消化されたタンパク質由来のペプチドであり、そして標識試薬が、この例において、ペプチドまたはペプチド分析物のアミン基（例えば、リジンのＮ−α−アミン基およびＮ−ε−アミン基）と反応するように選択される場合、このサンプルのタンパク質（分析物前駆体分子）は、標識反応を容易にする様式で、処理され得る。この例において、このタンパク質は、還元剤（例えば、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ））で還元され得、次いで、チオール基が、ブロッキング剤（例えば、メチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ））との反応によって、ブロックされ得る。この様式で、このタンパク質のチオール基は、ブロックされ、従って、分析物のアミンと標識試薬との間の標識反応を妨害しない。
当業者は、特定の他の前駆体分子の処理が、容易に入手可能な試薬、および慣用的な実験の補助によって適合され得るプロトコルを使用して、実施され得ることを理解する。正確な選択物または試薬および条件は、標識されるべき分析物の性質、および標識試薬の性質に依存して、選択され得る。
いくつかの実施形態において、サンプルの処理は、分析物または分析物前駆体を、標識試薬で標識されていても標識されていなくても、固体担体に固定することを包含し得る。いくつかの実施形態において、固定は、サンプルの複雑さを低下させることを容易にし得る。いくつかの実施形態において、固定は、分析物の標識を容易にし得る。いくつかの実施形態において、固定は、分析物前駆体の標識を容易にし得る。いくつかの実施形態において、固定は、特定の特性を有する（例えば、システイン部分を含むかまたは欠く）サンプル成分の画分の選択的な標識を容易にし得る。この固定は、上記のことの２つ以上を容易にし得る。
（サンプル混合物の分離を包含する分離）
いくつかの実施形態において、標識された分析物のサンプルまたはサンプル混合物の処理は、分離を包含し得る。１回以上の分離が、標識された分析物または標識されていない分析物、標識された分析物前駆体または標識されていない分析物前駆体、あるいはその画分に対して、実施され得る。１回以上の分離が、固相捕捉から得られた１つ以上の画分に対して、実施され得る。分離は、上記のものの２つ以上に対して実施され得る。
例えば、異なるサンプル由来の異なって標識された分析物を含有するサンプル混合物が、調製され得る。異なって標識されるとは、標識の各々が、同定され得る独特の特性を有する（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析において独特の「特徴イオン」を生成する、独特のレポーター部分を有する）ことを意味する。サンプル混合物を分析する目的で、このサンプル混合物の成分は、分離され得、そして質量分析が、このサンプル混合物の画分のみに対して実施され得る。この様式で、この分析の複雑さが、かなり低下する。なぜなら、分離された分析物は、質量を個々に分析され得、これによって、分析プロセスの感度を高めるからである。もちろん、この分析は、１つ以上のさらなるサンプル混合物の画分に対して、１回以上繰り返され得、これによって、このサンプル混合物の全ての画分の分析を可能にする。
異なって標識された同一の分析物が、そのサンプル混合物中でのそれらの分析物の存在度に比例する濃度（または量）で同時に溶出する分離条件を使用して、このサンプル混合物を構成するサンプルの各々における、各標識された分析物の量を決定し得るが、このサンプル混合物に添加される各サンプルの量が、既知であることを条件とする。従って、いくつかの実施形態において、サンプル混合物の分離は、質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析）において決定された信号と、サンプル混合物中の異なって標識された分析物の量との間の相関を維持しながら、分析を単純にし得る。
この分離は、クロマトグラフィーによって実施され得る。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して、このようなサンプルの分離および質量分析を行い得る。さらに、目的の分析物を分離するために適切な、任意のクロマトグラフィー分離プロセスが、使用され得る。例えば、クロマトグラフィー分離は、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーであり得る。
分離は、電気泳動により実施され得る。使用され得る電気泳動分離技術の非限定的な例としては、１Ｄ電気泳動分離、２Ｄ電気泳動分離および／またはキャピラリー電気泳動分離が挙げられるが、これらに限定されない。
同重体標識試薬、または試薬のセットを使用して、サンプルの分析物を標識し得る。同重体標識試薬は、分離工程が実施される場合に、特に有用である。なぜなら、標識試薬のセットの同重体標識は、構造的にも化学的にも区別不可能である（そしてフラグメンテーションがレポーターを分析物から除去するまで、総質量によって区別不可能であり得る）からである。従って、異なる同重体標識で標識された、同一の組成の全ての分析物は、全く同じ様式でクロマトグラフィーで分離され得る（すなわち、同時に溶出し得る）。これらの分析物は、構造的にも化学的にも区別不可能であるので、この分離プロセスからの溶出液は、サンプル混合物中の標識された分析物の量に比例する量の、各同重体標識された分析物を含み得る。さらに、サンプル混合物がどのように調製されたかの知識（サンプルの割合、サンプル混合物を調製するために添加された、他の任意の成分（例えば、較正標準物質））から、このサンプル混合物中の標識された分析物の量を、その分析物の起源であるサンプル中の標識された分析物の量に逆に関連付けることが可能である。
標識試薬はまた、異性体であり得る。異性体は、時々、クロマトグラフィーで分離され得るが、条件に依存して、分離プロセスが、異なって標識された同一の分析物の全てを同時に溶出するように操作され得る状況が存在する。この状況において、この溶出物中に存在する標識された分析物の全ての量が、サンプル混合物におけるこれらの分析物の濃度および／または量に比例する。
本明細書中において使用される場合、同重体は、見かけの総質量が同じである、構造的にも化学的にも区別不可能な化合物（同位体の含有量および／または分布を除く）であり（例えば、図１を参照のこと）、一方で異性体は、見かけの全質量が同じである、構造的および／または化学的に区別可能な化合物である点で、同重体は、異性体とは異なる。
（分析物の相対的定量および絶対的定量）
いくつかの実施形態において、サンプル混合物の異なって標識された同一の分析物の、相対的な定量が可能である。異なって標識された同一の分析物の相対的な定量は、１回目の質量分析において観察された、選択された標識された分析物に対する２回目の質量分析において決定された、レポーター（例えば、特徴イオン）の相対量（例えば、報告されたピークの面積または高さ）の比較によって、可能である。換言すれば、各レポーターが、サンプル混合物を生成するために使用される特定のサンプルに関する情報に相関付けられ得る場合、２回目の質量分析において観察される他のレポーターに対するそのレポーターの相対量は、そのサンプル混合物中のその分析物の相対量である。サンプル混合物を形成するために組み合わせられる成分が既知である場合、サンプル混合物を調製するために使用される各サンプル中の分析物の相対量は、１回目の質量分析から選択された標識された分析物のイオンについて観察されたレポーターの相対量に基づいて、逆算され得る。このプロセスは、１回目の質量分析において観察された、異なって標識された分析物の全てについて、繰り返され得る。この様式で、サンプル混合物を生成するために使用される異なるサンプルの各々における、各反応分析物の相対量（しばしば、濃度および／または量で表現される）が、決定され得る。
他の実施形態において、分析物の絶対的な定量が、決定され得る。これらの実施形態に関して、既知の量の１種以上の異なって標識された分析物（較正標準物質）が、サンプル混合物に添加され得る。この較正標準物質は、サンプル混合物の分析を標識するために使用される標識のセットの、異性体標識または同重体標識で標識される、予測される分析物であり得るが、較正標準物質に対するレポーターは、このサンプル混合物を形成するために使用されるサンプルのいずれかと比較して、独特であることを条件とする。一旦、較正標準物質に対するレポーターの相対量が、サンプル混合物の異なって標識された分析物についてのレポーターの相対量に対して決定されると、このサンプル混合物中の異なって標識された分析物の絶対量（しばしば、濃度および／または量で表現される）を計算することが可能である。この様式で、各異なって標識された分析物（この分析物に対して、この分析物が起源とするサンプル中に、較正標準物質が存在する）の絶対量もまた、そのサンプル混合物がどのように調製されたかの知識に基づいて、決定され得る。
上記のことにかかわらず、レポーター（特徴イオン）の強度の補正が、適切であるように、レポーター内の天然に存在するかまたは人工的に作製された、任意の同位体存在度に関して、なされ得る。レポーターの特徴イオンにおける不純物の同位体存在度を補正する、多数の方法が存在する。このような補正の１つの例が、実施例３に見出され得る。これらの型の補正のより洗練された例はまた、同時係属中の、共有に係る米国仮特許出願番号６０／５２４，８４４（発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｆｏｒ Ｄｅ−Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ Ａ Ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」、２００３年１１月２６日出願、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。各レポーター（例えば、特徴イオン）の強度を精密に定量するためにより注意を払うほど、もとのサンプル中の分析物の相対量および絶対量は、より精密になる。
（プロテオーム分析）
本発明の実施形態は、複雑な分析のために使用され得る。なぜなら、サンプルが、迅速かつ反復可能な様式で、質量分析技術を使用して、多重化され得、分析され得、そして再分析され得るからである。例えば、サンプル混合物は、１つ以上のサンプル中の個々の分析物の量について、分析され得る。これらの分析物の量（しばしば、濃度および／または量で表現される）は、サンプル混合物が含むサンプルについて決定され得る。サンプルの処理および質量分析は、迅速に実施され得るので、これらの方法は、多数回繰り返され得、その結果、サンプル混合物の、多くの異なって標識された分析物の量が、その分析物が起源とするサンプル中のそれらの分析物の相対量および／または絶対量に関して、決定され得る。
このような迅速な多重分析が有用である１つの用途は、プロテオーム分析の分野においてである。プロテオームは、ゲノム配列にコードされた情報を、構造、機能、および生物学的プロセスの調節の観点で記載するために、実験的アプローチとして観察され得る。これは、細胞または組織によって発現される全タンパク質成分の体系的分析によって、達成され得る。質量分析は、本発明の方法実施形態、混合物実施形態、キット実施形態および／または組成物実施形態と組み合わせて使用されて、このような全体的なタンパク質分析のための、１つの可能なツールである。
例えば、４つの同重体標識試薬のセットを用いて、実験において、タンパク質発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを、例えば、特定の刺激に対する増殖中の細胞の応答に基づいて決定するための、４つの時点を得ることが可能である。より少ない時点を実施し、１つまたは２つのコントロールを組み込むこともまた、可能である。同じ多重実験において、二連または三連で行うこともまた、可能である。全ての場合において、タンパク質発現の、必要に応じて、コントロールに関するアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、１回の多重実験において決定され得る。さらに、サンプル混合物の処理は、平行して実施されるので、その結果は、直接比較可能である。なぜなら、プロトコルまたは実験条件のわずかな変動が、それらの結果に影響を与え得る危険性がないからである。従って、これらの同重体標識試薬が使用され得る実験分析としては、時間経過実験、バイオマーカー分析、多重プロテオーム分析、ムドピット（ｍｕｄｐｉｔ）実験、アフィニティープルダウン、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の決定、および多重コントロール実験が挙げられるが、これらに限定されない。
（ＩＩ．方法）
本発明の方法によれば、定量されるべき分析物は、標識化される。標識化された分析物、分析物それ自体、その分析物の１種以上のフラグメントおよび／またはその標識のフラグメントは、質量分析により定量され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、同じサンプル中の異なる分析物の分析のため、および２種以上の異なるサンプル中の同じ分析物および／または異なる分析物の複数の分析のために使用され得る。この２種以上のサンプルは、混合されてサンプル混合物が形成され得る。複数の分析では、標識化試薬が使用されて、分析物がサンプル混合物のどのサンプルに由来するのかを決定し得る。その分析物の絶対量および／または相対量（異なるサンプル中の同じ分析物に関して）（多くの場合、濃度または量で表現される）が、合わせられてサンプル混合物が形成された２種以上のサンプルの各々において、定量され得る。さらに、その分析物のフラグメント（例えば、娘フラグメントイオン）の質量分析が、分析物および／またはその分析物への前駆体を同定するために使用され得；例えば、その分析物への前駆体分子が分解された場合がそうである。
記載されるアプローチの１つの差異は、異なるサンプルからの分析物が、化学的に同位体または同重体（等しい質量を有する）であり、かつその分析物が由来するサンプルを同定する独特の標識で差次的に同位体標識化され得る（すなわち、同位体でコードされ得る）という事実にある。その差次的に標識化された分析物は、質量分析計のＭＳモードのおいては区別されない。なぜなら、それらはすべて、同一の（総）質量対電荷比を有するからである。しかし、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）を介して、解離エネルギーレベルに供された場合、その標識はフラグメント化し、質量分析計において質量（質量対電荷比）により分解され得る独特のレポーターを与える。質量スペクトルで観察されるレポーターの相対量は、サンプル混合物中の標識化分析物の相対量、そして必然的に、それが由来するサンプル中のその分析物の量と相関し得る。従って、レポーター（すなわち、特徴イオン）の相対強度は、合わされてサンプル混合物が形成された２種以上の異なるサンプル中の分析物（単数または複数）の相対量を測定するために使用され得る。絶対的な定量化が所望される各分析物についての較正用標準物質がそのサンプル混合物中に組込まれている場合、そのレポーター情報から、２種以上のサンプルにおける分析物（単数または複数）の絶対量（多くの場合、濃度および／または分量として表現される）が、誘起され得る。
例えば、その分析物は、そのサンプルを処理するために酵素による消化反応を使用したタンパク質の分解から生じたペプチドであり得る。タンパク質分解は、そのサンプルの、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８ プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼ Ｃ）を用いた処理により達成され得る。サンプル混合物中のペプチドの同一性およびその量の定量により、そしてそれが由来したサンプルを同定することにより、そして必要に応じてそのサンプルに由来する他のペプチドの定量と組み合わせて、分解されたペプチドへの前駆体タンパク質が、同定され得、そして／またはそれが由来したサンプルに対して定量され得る。この方法は、１種以上のサンプル中の（すなわち、サンプル混合物からの）タンパク質（単数または複数）の多重定量を可能にするので、それは多重方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、２種以上のサンプル（各々１種以上の反応性分析物を含有する各サンプル）の各々と、標識化試薬のセットの異なる標識化試薬を反応させる工程であって、ここでこのセットの異なる標識化試薬は、各々、式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧを含む工程、を包含する方法に関する。その結果、各サンプルの１種以上の分析物は、その分析物の求核剤または求電子剤と、その異なる標識化試薬の、それぞれ、求電子性または求核性反応性基（ＲＧ）との反応により、部分「ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−」で標識化される。この標識化プロセスは、２種以上の差次的に標識化れたサンプルを生成し、その各々が、１種以上標識化分析物を含む。このセットの標識化試薬は、同位体または同重体であり得る。各標識化試薬のレポーターは、各標識化分析物が由来するサンプルとともに同定され得、それゆえにそれを同定するために使用され得る。
ＲＧは、反応性基であり、その特徴は、以前に説明されている。ＲＰは、レポーター部分であり、その特徴は、以前に説明されている。各レポーターの総重量は、そのセットの各試薬に対して異なり得る。ＬＫは、リンカー部分であり、その特徴は、以前に説明されている。そのリンカーの総重量は、そのレポーター／リンカーの組合せの凝集体総重量が、そのセットの各試薬に対して同じであるように、上記異なる標識化試薬に対するレポーター間の総重量の差を補償し得る。Ｘは、そのレポーターの原子とそのリンカーの原子との間の結合である。Ｙは、そのリンカーの原子と上記反応性基の原子との間の結合である（または、分析物との反応後、Ｙは、そのリンカーの原子とその分析物の原子との間の結合である）。結合ＸおよびＹは、質量分析計中で解離エネルギーレベルに供されたときに、標識化分析物の少なくとも一部でフラグメント化し得る。結合ＸおよびＹの特徴は、以前に説明されている。
いったん各サンプルの分析物が、そのサンプルに対して独特の標識化試薬で標識化されると、２種以上の差次的に標識化されたサンプル、またはその一部は、混合されてサンプル混合物が生成され得る。定量化が所望される場合、合わされてサンプル混合物が生成された各サンプルの体積および／または分量が、記録され得る。各サンプルの体積および／または分量は、そのサンプル混合物の全サンプル体積および／または分量に対して、そのサンプル混合物の分析からの、各サンプル中の同定された分析物の量（多くの場合、濃度および／または分量で表現される）を定量するために必要な比を決定するために使用され得る。そのサンプル混合物は、それゆえに、複雑な混合物を含み得、ここで同じ分析物および／または異なる分析物の相対量が、２種以上のサンプルの各々における分析物の量の相対的な定量化によるか、またはそのサンプル混合物に較正用標準物質もまた添加されている場合には絶対的に、同定および／または定量化され得る。
この混合物は、次いで分光測定技術に供され得、ここで第１の質量分析が、第１の質量分析計を使用して、そのサンプル混合物またはその画分について実施され得る。次いで、第１の質量分析からの特定の質量対電荷比のイオンが選択され得る。次いで、この選択されたイオンは、解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））にさらされ得、それによりその選択されたイオンのフラグメンテーションを誘起する。標識化された分析物の、特定の質量対電荷比を有する選択されたイオンを解離エネルギーレベルにさらすことにより、結合ＸおよびＹの両方が、選択されたイオンの少なくとも一部でフラグメント化され得る。結合ＸおよびＹの両方のフラグメンテーションは、レポーター／リンカー部分のフラグメンテーションを引き起こし得、そしてその分析物からの、電荷を帯びたかまたはイオン化したレポーターの放出を引き起こし得る。解離エネルギーレベルにさらされたイオンはまた、その分析物のフラグメンテーションを引き起こし得、それによりその分析物の娘フラグメントイオンを生成し得る。次いで、イオン（残存している選択されたイオン、娘フラグメントイオンおよび、電荷を帯びたかまたはイオン化したレポーター）、またはその画分が、第２の質量分析計へと導かれ得る。
第２の質量分析計において、第２の質量分析は、その選択されたイオン、およびそのフラグメントについて実施され得る。この第２の質量分析は、選択された質量対電荷比で存在する各独特のレポーターの総質量（またはｍ／ｚ）および相対量、ならびにそのサンプル混合物の少なくとも１種の反応性分析物のその娘フラグメントイオンの総重量を定量し得る。選択された質量対電荷比で存在する各分析物に対して、その娘フラグメントイオンは、選択された質量対電荷比で存在する分析物（単数または複数）を同定するために使用され得る。例えば、この分析は、「コンピューター支援データベース分析による分析物の決定」と題するセクションで以前に説明されたように行われ得る。
いくつかの実施形態では、このプロセスの特定の工程は、１回以上繰り返され得る。例えば、いくつかの実施形態では、以前に選択されたいずれの質量対電荷比とも異なる第１の質量スペクトル分析からの選択された質量対電荷比のイオンは、解離エネルギーレベルへ処理され得、以前に説明されたように、それにより選択されたイオンの少なくともいくつかのうちのイオン化されたレポーター部分およびイオン化された娘フラグメントイオンが形成され得る。その選択されたイオン、そのイオン化されたレポーター部分およびその娘フラグメントイオン、またはそれらの画分の第２の質量分析が、実施され得る。第２の質量分析における各レポーター部分の総質量および相対量およびその娘フラグメントイオンの総重量もまた、定量され得る。このようにして、情報が、第１の質量分析からの１種以上のさらなる分析物を同定しそして定量化するために利用可能にされ得る。
いくつかの実施形態では、プロセス全体が、１回以上繰り返され得る。例えば、上記サンプル混合物が分画されている（例えば、クロマトグラフィーまたは電気泳動により分離される）場合は、このプロセスを１回以上繰り返すことが有用であり得る。各画分についてこのプロセスを繰り返すことにより、サンプル混合物全体のすべてを分析することが可能である。いくつかの実施形態では、プロセス全体が１回以上繰り返され、そしてこれらの繰り返しの各々の内で、例えば上に記載されたように、特定の工程がまた１回以上繰り返されることが企図される。このようにして、サンプル混合物の内容物が、可能な範囲で最大限調べられ得、そして定量され得る。
質量分析の分野の当業者は、第１の質量分析および第２の質量分析が、タンデム質量分析計で実施され得ることを理解する。タンデム質量分析を実施するのに適した機器は、本明細書中で以前に説明されている。タンデム質量分析計が好ましいが、一段階（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｇｅ）質量分析計も使用され得る。例えば、分析物のフラグメンテーションが、コーン電圧フラグメンテーションにより誘起され得、次いで、一段階四重極質量分析計または飛行時間型質量分析計を使用した、生成したフラグメントの質量分析が行われ得る。他の例では、分析物は、レーザー源を使用した解離エネルギーレベルにさらされ得、そして得られたフラグメントは、飛行時間型質量分析計またはタンデム飛行時間型（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計における供給後の減衰に従って記録される。
以前に開示された多重方法に従って、いくつかの実施形態では、結合Ｘは、その分析物の結合（例えば、ペプチド骨格アミド（ペプチド）結合）のフラグメンテーションに比べて、多かれ少なかれフラグメンテーションを受けやすくあり得るか、または実質的に等しくフラグメンテーションを受け得る。いくつかの実施形態では、結合Ｙは、分析物の結合（例えば、ペプチド骨格におけるアミド（ペプチド）結合）フラグメンテーションに比べて、多かれ少なかれフラグメンテーションを受けやすくあり得る。いくつかの実施形態では、上記セットの各試薬に対するリンカーは、結合ＸおよびＹのフラグメンテーション後は、電荷において中性である（すなわち、上記リンカーがフラグメント化して質量の中性損失（ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ）をもたらし、それゆえにＭＳ／ＭＳスペクトルでは観察されない）。さらにいくつかの他の実施形態では、結合ＸおよびＹの位置は、セットの標識化試薬内で、混合物の標識化分析物内で、またはキットの標識化試薬内で変化しない。さらにいくつかの他の実施形態では、そのセットの各試薬に対するレポーターは、上記分析物（例えば、ペプチド骨格のアミド（ペプチド）結合）をフラグメント化するために使用される条件下で、実質的に二次フラグメント化しない。さらにいくつかの他の実施形態、結合Ｘは、結合Ｙと比べて、よりフラグメンテーションを受けにくい。さらにいくつかの他の実施形態では、結合Ｙは、結合Ｘと比べて、よりフラグメンテーションを受けにくい。さらにいくつかの他の実施形態では、結合ＸおよびＹは、ほぼ同じ不安定性であるか、またはそうでなければ、結合ＸまたはＹの一方のフラグメンテーションが、結合ＸまたはＹの他方のフラグメンテーションを生じるように選択される。標識化分析物のＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−部分についての他の特徴は、以前に説明されている。
いくつかの実施形態では、各同重体標識化分析物の標識は、置換もしくは非置換の酢酸部分でＮ−アルキル化されている５員、６員または７員の環窒素原子を含有する複素環式環であり得、その酢酸部分に対して上記分析物がＮ−アルキル酢酸部分カルボニル炭素を介して連結されており、ここで各異なる標識は、１種以上の重原子同位体を含む。この複素環式環は、置換または非置換であり得る。この複素環式環は、脂肪族であっても芳香族であってもよい。この複素環式部分の可能な置換基としては、アルキル、アルコキシおよびアリール基が挙げられる。この置換基は、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基のような、上記分析物を担体に連結するのに適した保護された基または未保護の基を含み得る。この複素環式環は、さらなる１種以上の窒素、酸素または硫黄原子のようなヘテロ原子を含み得る。
いくつかの実施形態では、上記サンプル混合物中の標識化分析物は、同重体であり得、そして各々、一般式：
を備え、ここでＺは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１であり；各Ｊは同じかまたは異なり、そしてＨ、重水素（Ｄ）、Ｗ、Ｒ、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ’）２、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり、；Ｗは、上記環窒素に対してオルト、メタまたはパラに位置する原子または基であって、ＮＨ、Ｎ−Ｒ１、Ｎ−Ｒ２、Ｐ−Ｒ１、Ｐ−Ｒ２、ＯまたはＳであり；上記複素環式環の各炭素は、式ＣＪ２を有し；各Ｒ１は、同じかまたは異なり、そして必要に応じて１個のヘテロ原子を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基または置換もしくは非置換のアリール基であって、ここでこのアルキルおよびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／もしくはフッ素原子を含み；そしてＲ２は、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル基または切断可能に上記試薬を上記固体担体に連結する切断可能なリンカーであって、ここでこのアミノアルキル、ヒドロキシアルキルまたはチオアルキルは、１〜８個の炭素原子を含み、炭素原子は、必要に応じて１個のヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含み得、そしてここでこのアルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含む。
例えば、上記サンプル混合物は、式：
の１種以上の同重体標識化分析物を含み得、ここで、１３Ｃおよび１８Ｏの同位体は、上記モルホリンレポーターと上記異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間の総質量の均衡をとるために使用される。
この一般構造の標識化分析物を生成するのに適したモルホリン標識試薬は、多くの合成経路によって調整され得る。例えば、同位体標識化モルホリン化合物または非同位体標識化モルホリン化合物は、実施例１に記載されるように、同位体標識化または非同位体標識化ブロモ酢酸化合物と反応され得る。環置換モルホリンおよび／または置換ブロモ酢酸出発物質がまた、選択され得、そして過度の実験を実施することなく（上記の手順または当該分野で周知の他の手順に対して、ほとんど変更を加えないか、またはまったく変更を加えないで）当業者により使用され得、それにより、本発明のセットまたはキットで使用され得る異なる重原子同位体含量の（すなわち、同位体でコードされた）種々の異なるモルホリンベースの標識試薬が生成されることは、同様に明らかなはずである。
モルホリンの代わりに、所望の同位体分布を有する置換または非置換のピペリジンを選択することが可能である。ピペリジンが選択される場合、同位体Ｄ（重水素）、１３Ｃまたは１５Ｎが、それぞれ、Ｈ、１２Ｃおよび１４Ｎに対して置換され得、ピペリジンの場合は、１８Ｏは環原子中に使用されないことを除いて、モルホリンに対して図示された様式と類似の様式で、標識試薬のセットの試薬の総質量を変更するために使用され得る。ピペリジンの例示的な合成は、必要に応じて同位体富化された出発物質を使用して、実施例６に記載される。
上記サンプル混合物は、式：
の１つ以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで炭素１３、酸素１８および窒素１５の同位体が、上記レポーターと上記異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間の総質量の均衡をとるために使用される。この一般構造の標識化分析物を生成するのに適切なピペラジン標識試薬は、多くの合成経路によって調製され得る。例えば、重いピペラジン化合物または軽いピペラジン化合物が、実施例７に記載されるように、重い標識化ブロモ酢酸化合物または軽い標識化ブロモ酢酸化合物と反応され得る。図９Ａおよび９Ｂを参照して、容易に入手可能な重い出発物質または軽い出発物質を使用する同位体富化されたピペラジンへの２つの異なる合成経路についての一般スキームが示される。
具体的に図９Ａを参照して、２当量の１５Ｎ−標識化グリシン１が縮合され得、ビス同位体標識化ジケトピペラジン２（同位体標識は、図において＊で示されている）が形成される。次いで、このジケトピペラジンは、同位体標識化ピペラジンに還元され得る。次いで、この同位体標識化ピペラジンは、ブロモ酢酸と反応され得、そして実施例７に記載されるように、活性エステル３に変換され得る。
図９Ｂを具体的に参照して、ビス１５Ｎ−標識化エチレンジアミン４は、シュウ酸５と縮合され得、ビス同位体標識化ジケトピペラジン６が形成される（同位体標識は、図において＊で示されている）。次いで、このジケトピペラジンは、同位体標識化ピペラジンに還元され得る。次いで、この同位体標識化ピペラジンは、ブロモ酢酸と反応され、そして実施例７に記載されるように、活性エステル３に変換され得る。
環置換ピペラジンは、単に適切に置換出発物質を選択することにより、上記の方法を使用して作製され得ることは、同様に明らかである。適切な場合、置換ブロモ酢酸（重いか軽いかのいずれか）が、同様に使用され得る。重いによって、その化合物が、１個以上の重原子同位体で同位体富化されていることが意味される。軽いによって、それが同位体富化されていないことが意味される。従って、適切に置換された出発物質が選択され得、それによって本発明のセットまたはキットで使用され得る種々の異なるピペラジンベースの標識試薬が生成される。
例えば、上記サンプル混合物は、式：
の１つ以上の同重体により標識化された分析物を含み得、ここで、炭素１３、酸素１８および窒素１５の同位体が、上記レポーターと上記異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間の総質量の均衡をとるために使用され、ここで；
１）各Ｒ１は同じかまたは異なり、そして必要に応じてヘテロ原子を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基または置換もしくは非置換のアリール基であり、ここでこのアルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含み；そして２）各Ｋは、独立に水素またはアミノ酸側鎖として選択される。この一般構造の標識化分析物を生成するのに適した置換ピペラジン標識試薬は、多くの合成経路によって調製され得る。
例えば、図１０を参照して、Ｎ−アルキル置換ピペラジン試薬は、例示された手順に従って調製され得る。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）で保護されたグリシン１０は、Ｎ−メチル−グリシン１１のエステル（例えば、エチルエステル）と縮合され得、それによりｔ−ｂｏｃ保護されたグリシン−Ｎ−メチル−グリシン二量体１２のエステルが形成される。次いでこのｇｌｙ−ｇｌｙ二量体１２は、ｔ−ｂｏｃ保護基の除去により環化され得、続いて縮合されて、それによりＮ−メチル−ジケトピペラジン１３の酸塩が形成される。１３の酸塩は、中和され、そして還元されて上記Ｎ−メチル−ピペラジン１４が形成される。次いで、このＮ−メチル−ピペラジン１４は、ブロモ酢酸１５（またはその置換バ−ジョン）と反応され得、そして実施例７に記載されるように、活性エステル１６に変換され得る。
環置換ピペラジンが、単にグリシン以外のアミノ酸またはＮ−メチルアミノ酸（またはそのエステル）（例えば、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸など）を選択することにより、上記の方法を使用して作製され得ることが明らかであるはずである。同様に、このアミノ酸は、環置換ピペラジン同重体標識試薬のセットを調製するのに必要な同位体の所望の分布を有する環置換ピペラジンを調製するために適した様式で、同位体標識化され得ることが明らかであるはずである。
Ｎ−アルキル置換ピペラジン試薬は、さらに別の例示された手順に従って調製され得る。図１１を参照して、グリシンメチルエステル２１は、ブロモ酢酸のエチルエステル２２と反応され得、ジエチルイミノジアセテート２３を形成する。ジエチルイミノジアセテート２３というジエステルは、適切な試薬（例えば、塩化チオニル）を用いた処理により、ジ酸塩化物２４に変換され得る。次いで、このジ酸塩化物２４は、例えば、アルキルアミン（例えば、メチルアミン）と反応され得、Ｎ−アルキル−ジケトピペラジン２５を形成する。次いで、Ｎ−アルキル−ジケトピペラジン２５は還元され得、Ｎ−アルキル−ピペラジン２６を形成する。次いで、このＮ−アルキル−ピペラジンは、ブロモ酢酸と反応され得、そして実施例７に記載されるように、活性エステル２７に変換され得る。
環置換ピペラジンは、単にグリシン以外のアミノ酸（例えば、アラニン、フェニルアラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸など）のエステルまたはブロモ酢酸の置換バ−ジョンを選択することにより、上記の方法を使用して作製され得ることが明らかであるはずである。同様に、アミノ酸およびブロモ酢酸（およびその置換誘導体）は、同重体標識試薬のセットを調製するのに必要な同位体の所望の分布を有する環置換ピペラジンを調製するために適した様式で、同位体標識化され得ることが明らかであるはずである。アルキルアミンの代わりに、アルキルジアミン、ヒドロキシアルキルアミンもしくはチオアルキルアミン、またはその同位体標識化バージョンを選択することが、以下により詳細に記載されるように、担体に結合された標識試薬を生成するために使用され得ることが、さらに明らかであるはずである。
本方法のさらにいくつかの他の実施形態では、サンプル混合物中の標識化分析物は、同重体であり、そして各々、式：
を含み、ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ１であり；各Ｊは、同じかまたは異なり、そしてＨ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ）２、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素からなる群より選択され；各Ｒ１は、同じかまたは異なり、そして必要に応じて１個のヘテロ原子を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり、ここで、このアルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含む。
例えば、サンプル混合物は、式：
の２種以上の同重体標識化分析物を含み得、ここで、炭素１３および酸素１８の同位体が、上記レポーターと上記異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間の総質量の均衡をとるために使用される。この一般構造の標識化分析物を生成するのに適した置換された標識試薬は、実施例８に記載される一般的プロセスにより調製され得る。
本発明のさらにいくつかの他の実施形態では、標識試薬のセットまたはキットの各異なる標識試薬は、各異なるサンプルが異なる標識試薬を保有する担体と反応され得るように、切断可能なリンカーを介して担体に連結され得る。いくつかの実施形態では、この担体は、それ自体、反応性分析物の標識化のために使用され得る。いくつかの実施形態では、この標識試薬は、その担体から取り除かれ得、次いである場合には、引き続く処理（例えば、反応性基の保護）の後で、反応性分析物の標識化のために使用され得る。
いくつかの実施形態によれば、サンプルからの分析物は、上記固体担体と反応され得（各サンプルは、異なる固体担体と、それゆえに異なるレポーターと反応される）、そしてこの反応性基と反応しないサンプルの樹脂に結合した成分は、必要に応じて洗い流され得る。この標識化分析物（単数または複数）は、その担体を切断可能なリンカーを切断する条件下で処理することにより、各固体担体から取り除かれ得、それによりレポーター／リンカー／分析物複合体をその担体から放出する。各担体は、切断可能なリンカーを切断する条件下で同様に処理され得、それにより２種以上の異なるサンプルを得、各サンプルは、１種以上の標識化分析物を含み、ここで特定のサンプルに関連するこの標識化分析物は、それに連結された独特のレポーターにより識別および／または定量化され得る。収集されたサンプルは、次いで混合され得、上記のように、サンプル混合物が形成される。
例えば、上記の方法において使用されるセットの各異なる標識試薬は、式：Ｅ−Ｆ−ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの固体担体であり得、ここで；ＲＧ、Ｘ、Ｙ、ＲＰおよびＬＫは、上で記載されている。Ｅは、固体担体であり、そしてＦはその固体担体に連結されかつ上記レポーターに切断可能に連結された切断可能なリンカーである。この一般式の担体は、実施例９に記載されるように、調製され得る。
いくつかの実施形態では、１セットの担体に結合された標識試薬は、標識化Ｎ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体に基づき得る。重いピペラジン誘導体と軽いピペラジン誘導体との両方が、調製され得る。例えば、Ｎ−アルキルアミンとしてのアルキルジアミン、チオアルキルアミンまたはヒドロキシアルキルアミンを用いて開始する図１１に図示された手順を使用することにより、この標識化Ｎ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体が形成され得る（上記の図１１の考察を参照のこと）。このアルキルジアミン、チオアルキルアミンまたはヒドロキシアルキルアミンは、所望のＮ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体適切な場合には、重くても軽くてもよい。このＮ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体のアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基は、適切に保護され得る。アルキルジアミン、チオアルキルアミンまたはヒドロキシアルキルアミンが使用される場合、そのピペラジンは、Ｎ−アミノアルキル、Ｎ−チオアルキルまたはＮ−ヒドロキシアルキル部分を含み得、ここでこの部分のアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基は、担体上の上記切断可能なリンカーと反応され得、それにより上記Ｎ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジン誘導体から調製されたピペラジンを切断可能に担体に連結する。
標識試薬を含む担体は、いくつかの方法のいずれによっても調製され得る。いくつかの実施形態では、上記Ｎ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジンのアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基は、適切な担体の切断可能なリンカーと反応され得る。この切断可能なリンカーは、「立体障害のある切断可能なリンカー」であり得る（実施例９を参照のこと）。このピペラジンは標識試薬の上記セットに対して所望される標識試薬の性質に依存して、同位体標識化または非同位体標識化ハロ酢酸（置換もしくは非置換）と反応され得る。その後、このカルボン酸は、活性エステルに変換され得る。この活性エステルは、サンプルの分析物と反応され得、それによりこの分析物を上記担体の標識試薬で標識化する。この切断可能なリンカーの切断は、上記担体から標識化分析物を放出する。このプロセスが、標識化担体のセットの異なる担体の調製のために、独特のピペラジンベースの標識試薬を用いて繰り返され得る。
いくつかの実施形態では、上記Ｎ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジンは、同位体標識化または非同位体標識化ハロ酢酸（置換もしくは非置換）、またはそのエステルと最初に反応され得る。好ましくは、上記Ｎ−（アミノアルキル）、Ｎ−（チオアルキル）またはＮ−（ヒドロキシアルキル）−ピペラジンのアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基は、適切な保護試薬で保護され得る（適切な保護基の一覧表のために、Ｇｒｅｅｎら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９を参照のこと）。得られるビスアルキル化ピペラジンの未保護のアミノ、チオールまたはヒドロキシル基は、次いで、適切な担体の切断可能なリンカーと反応され得る。その後、このカルボン酸は、活性エステルに変換され得る。このハロ酢酸化合物が、エステルであるなら、そのエステルは活性エステルへの変換の前に、ケン化され得る。この活性エステルは、サンプルの分析物と反応され得、それにより上記分析物を上記担体の標識試薬で標識化する。切断可能なリンカーの切断は、上記担体から標識化分析物を放出する。このプロセスが、標識化担体のセットの異なる担体の調製のために、独特のピペラジンベースの標識試薬を用いて繰り返され得る。
それゆえに、いくつかの実施形態では、標識試薬のセットは、以下：
の担体に結合された標識試薬の１種以上を含み得、ここでＲＧ、ＥおよびＦは、上に記載されている。この方法によれば、Ｇは、アミノアルキル、ヒドロキシアルキルまたはチオアルキル基であり得、上記切断可能なリンカーに切断可能に連結され得、ここでこのアミノアルキル、ヒドロキシアルキルまたはチオアルキル基は、必要に応じて１個のヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含み、ここで、このアルキルおよびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含む。この複素環式環の各炭素は、式ＣＪ２を有し得、ここで各Ｊは、同じかまたは異なり、そしてＨ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲｌ、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素からなる群より選択される。各Ｒ１は、同じであっても異なっていてもよく、そして必要に応じて１個のヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、または置換もしくは非置換アリール基であり、ここでこのアルキルおよびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含む。
いくつかの実施形態では、上記標識化分析物は、上記分析物と標識試薬を含む担体とを最初に反応させることにより生成され得、切断可能なリンカーを介して上記担体に切断可能に連結され得、次いでこの担体から、標識化分析物が切断される。従って、サンプル混合物は、式：
の１種以上の同重体標識化分析物を含み得、ここでＧ’は、必要に応じて１個のヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアミノアルキル、ヒドロキシアルキルまたはチオアルキル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり得、ここでこのアルキルおよびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含む。この複素環式環の各炭素は、式ＣＪ２を有し得、ここで各Ｊは、同じかまたは異なり、そしてＨ、重水素（Ｄ）、Ｒ１、ＯＲｌ、ＳＲ１、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素からなる群より選択される。各Ｒ１は、同じであっても異なっていてもよく、そして必要に応じて１個のヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、または置換もしくは非置換アリール基であり、ここでこのアルキルおよびアリール基の炭素原子は、独立に連結水素、重水素および／またはフッ素原子を含む。ここで、アルキルアミン基、ヒドロキシアルキル基またはチオアルキル基は、上記固体担体の切断可能なリンカーに連結された部分であり得る。各切断反応の生成物は合わされ得、本明細書中に記載される方法により、標識化分析物の分析に適したサンプル混合物が生成される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、各サンプルを少なくとも１種の酵素で消化し、そのサンプルの分析物の標識化を実施する前に、そのサンプルの成分を、部分的または完全に分解する工程を包含し得る（「サンプル処理」と題する上記セクションも参照のこと）。例えば、上記酵素は、（タンパク質およびペプチドを分解するための）プロテアーゼであってもよく、または（核酸を分解するための）ヌクレアーゼであってもよい。これらの酵素はまた、一緒に使用されてもよく、それによりサンプル成分が分解される。この酵素は、トリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼＣのようなペプシンタンパク質分解酵素であり得る。
いくつかの実施形態では、これらの方法は、最初の質量分析を実施する前に、このサンプル混合物を分離する工程をさらに包含し得る（「サンプル混合物の分離」と題する上記セクションも参照のこと）。このようにして、第１の質量分析は、上記サンプル混合物の１画分のみについて実施され得る。この分離は任意の分離方法により実施され得、その方法としては、クロマトグラフィーによるか、電気泳動によるかが挙げられる。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）が、このようなサンプル分離および質量分析をおこなうために使用され得る。さらに、目的の分析物を分離するのに適した任意のクロマトグラフィー分離プロセスが使用され得る。適切なクロマトグラフィー分離および電気泳動分離の非限定的な例は、本明細書中に記載されている。
さらに他の実施形態では、本発明の方法は、サンプル成分を分解するための酵素処理および分離工程の両方を包含し得る。
上に記載されたように、娘フラグメントイオンの総質量の分析により、選択されたイオンに関連する分析物を定量することが可能である。１つのこのような定量方法は、「コンピューター支援データベース分析による分析物の決定」と題するセクションに記載されている。
いったん上記分析物が定量されると、第２の質量分析における各レポーター部分の総質量および相対量ならびに娘フラグメントイオンの総質量に関する情報が、そのサンプル混合物についての他の情報を決定するための基礎を提供する。レポーターの量は、質量スペクトルにおけるピーク強度により定量され得る。いくつかの実施形態では、レポーターの量は、質量分析計を使用して得られるそのレポーター（特徴イオン）信号のピーク高さまたはピーク幅の分析により定量され得る。各サンプルは、異なる標識試薬を用いて標識化され得、そして各標識試薬は特定のサンプルと相関され得る独特のレポーターを含み得るので、第２の質量分析における異なるレポーターの定量は、選択された分析物のイオンが由来するサンプルを識別する。複数のレポーターが見出される場合（例えば、本発明の多重方法に従って）、各レポーターの相対量は、他のレポーターに対して定量され得る。第２の質量分析で定量された各レポーターの相対量は、サンプル混合物中の分析物の相対量と相関するので、合わされてサンプル混合物が形成される各サンプル中の分析物の相対量（多くの場合、濃度／およびまたは量として表現される）が、定量され得る。適切な場合、そのレポーターに関連するピーク強度の補正は、上で考察されたように、天然の同位体存在比または人工的に生成された同位体存在比に対して実施され得る。より具体的には、サンプル混合物へと合わせられる各サンプルの体積および／または量が公知である場合、各サンプル中の分析物の相対量（多くの場合、濃度／およびまたは量として表現される）は、第２の質量分析において定量された各レポーターの相対量に基づき、計算され得る。
この分析は、異なる質量対投入量比の選択されたイオンについて、１回以上繰り返され得、それにより、合わされてサンプル混合物が形成された各サンプル中の１種以上のさらなる分析物の相対量が得られる。適切な場合、上記レポーターに関連するピーク強度の補正は、天然の同位体存在比または人工的に生成された同位体存在比に対して実施され得る。
あるいは、選択された質量対電荷比を有する、分析物に連結された独特のレポーターを含む較正用標準物質が、そのサンプル混合物に既知量で（多くの場合、濃度／およびまたは量として表現される）添加された場合、上記較正用標準物質に関連するその独特のレポーターの量は、合わされてサンプル混合物が形成されたサンプルの各々の中の分析物の絶対量（多くの場合、濃度／およびまたは量として表現される）を定量するために使用され得る。較正用標準物質に対するそのレポーターに関連する分析物の量は既知であり、そして他のすべてのレポーターの相対量は、選択されたイオンに関連する標識化分析物に対して定量されるので、このことは可能である。その独特のレポーターの各々（上記較正用標準物質に対するレポーターを含む）に対して定量されるレポーターの相対量は、合わされてサンプル混合物が形成された各サンプルに関連する分析物の量に比例するので、そのサンプルの各々中の分析物の絶対量（多くの場合、濃度／およびまたは量として表現される）は、サンプル混合物を生成するのに使用された処方に対して計算される比に基づき、定量され得る。適切な場合、上記レポーターに関連するピーク強度の補正は、天然の同位体存在比または人工的に生成された同位体存在比に対して実施され得る。
この分析は、異なる質量対投入量比の選択されたイオンについて、１回以上繰り返され得、それにより、合わされてサンプル混合物が形成された各サンプル中の１種以上のさらなる分析物の相対量が得られる。適切な場合、上記レポーターに関連するピーク強度の補正は、天然の同位体存在比または人工的に生成された同位体存在比に対して実施され得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、消化工程および／または分離工程とともに実施され得る。いくつかの実施形態では、この方法の工程は、消化工程および／または分離工程を伴うかまたは伴わずに、１回以上繰り返され得、それによりサンプル中の１種以上の他の分析物または２種以上のサンプルの各々中の１種以上の分析物（担体に結合された標識試薬で標識化されたサンプルを含む）が識別および／または定量化される。較正用標準物質が、特定の分析物に対するサンプル混合物中に存在するか否かに依存して、この定量化は、その他の標識化分析物に対してのものであり得、またはそれは絶対的なものであり得る。このような分析方法は、特に上記標識化分析物の予備的な分離（例えば、液体クロマトグラフィーまたは電気泳動）が第１の質量分析の前に行われる場合は、複雑な性質を有する複数のサンプルのプロテオーム分析のために特に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、上記分析物は、サンプルまたはサンプル混合物中のペプチドであり得る。サンプルまたはサンプル混合物中のそのペプチドの分析は、サンプルまたはサンプル混合物中の識別可能なタンパク質の量（多くの場合、濃度／およびまたは量として表現される）を提供するために使用され得、ここで１種以上のサンプル中のタンパク質は、第１の質量分析の前に分解され得る。さらに、異なるサンプルからの情報が、定量を行うために（例えば、細胞増殖に影響を及ぼし得る物質の異なる濃度とともにインキュベートされた細胞中の上記タンパク質の量に対する効果を比較するために）に比較され得る。他の非限定的な例としては、疾患の組織と健康な組織の発現されたタンパク質成分または細胞培養物の比較が挙げられ得る。このことは、微生物もしくはウイルスのような感染性因子による感染または癌のような他の疾患状態後の、細胞、組織または生物学的流体中で発現されたタンパク質の比較を包含し得る。他の例では、タンパク質濃度の経時的な変化（タイムコース）研究が、細胞または組織の発現されたタンパク質成分に対する薬物による処置の効果を検討するために着手され得る。さらに他の例では、経時的に採取された異なるサンプルからの情報が使用され得、疾患（例えば、癌）または感染の結果としての、組織、器官または生物学的流体中の特異的なタンパク質が検出され、その濃度がモニタリングされる。
いくつかの実施形態では、上記分析物は、サンプルまたはサンプル混合物中の核酸フラグメントであり得る。この核酸フラグメントに関する情報は、サンプルまたはサンプル混合物中の識別可能な核酸分子の量（多くの場合、濃度／およびまたは量として表現される）を定量するために使用され得、ここでそのサンプルは、第１の質量分析の前に分解された物であった。さらに、これらの異なるサンプルからの方法は、上に記載されたような定量を行うために比較され得る。
（ＩＩＩ．作業の流れ）
いくつかの実施形態では、サンプルの分析物の標識化は、サンプル処理工程を実施する前に実施され得る。いくつかの 実施形態では、分析物の標識化は、他のサンプル処理工程の間で実施され得る。いくつかの実施形態では、分析物の標識化は、サンプル処理の最後の工程であり、そして／またはサンプル混合物の調製の直前に行われる。
非限定的な例としてプロテオーム分析を使用して、少なくともいくつかの可能な作業の流れが使用され得る。以下の考察の理解を助けるために、時折、前駆体タンパク質と分析物であるペプチドとの間で区別がなされる。しかし、このペプチドおよびタンパク質のいずれかまたは両方が、本明細書中で記載されるような分析物であると考えられることが理解されるべきである。
１つのタイプの作業の流れでは、この前駆体タンパク質は、後で標識化され得るペプチド分析物に消化され得る。別のタイプの作業の流れでは、その前駆体タンパク質は、標識試薬で標識化され得、次いで標識化ペプチド分析物に消化され得る。別のタイプの作業の流れでは、その前駆体タンパク質は、固体担体上に捕捉され得、消化され、次いで上記担体に結合されたペプチドが標識化され得る。必要に応じて、ペプチドを通る流れが標識化され得る。別のタイプの作業の流れでは、上記前駆体タンパク質は、固体担体上に捕捉され、標識化され得、次いでこの担体に結合されたタンパク質が消化されて、標識化ペプチドが生成される。必要に応じて、ペプチドを通る流れがまた、分析され得る。作業の流れにかかわらず、さらなるサンプル処理（例えば、分離工程）が、ＭＳ分析の前に所望される場合、標識化ペプチドについて実施され得る。
（Ａ．消化およびその後の標識化が関与する例示的な仕事の流れ）
例えば、図２０を参照して、「コントロール」サンプルおよび分析されるべき「試験」サンプルが存在し得る。図２０に図示される例に対して、もし目的が「コントロール」サンプルおよび「試験」サンプルタンパク質のペプチド（上記分析物として）を分析することであるなら、そのサンプルのタンパク質は、いくつかの実施形態では、必要に応じて還元され得、必要に応じて、システインブロックされ得、そして酵素により消化され得、それにより後に続く分析のために標識化され得る分析物ペプチドが生成され得る。この分析物 ペプチドは、いくつかの実施形態では、さらなる処理なしで標識化され得る。いくつかの実施形態では、さらなるサンプル処理が標識化前および／または標識化後に所望され得る。例えば、分離工程は、目的ではない特定のタイプのペプチドを排除するために実施され得、それによりそのサンプルの複雑さが低減される。いくつかの実施形態では、この標識化分析物ペプチドは、質量スペクトル分析の前に分離（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））に供され得る。
別の作業の流れが、図２１Ａおよび２２に図示される。図２２は、主に図２２がチペプチド捕捉に関与するシステインのチオール基のブロッキングおよび脱保護の任意の工程を図示する点で、図２１Ａと異なる。図２１Ａは、いくつかの実施形態において、「コントロール」サンプルおよび「試験」サンプルが、どのように酵素によって消化され、次いでそのサンプルの成分が、切断可能なリンカーを介して固相に捕捉され得るかを図示する。例えば、この担体は、切断可能なリンカーおよびペプチドの部分と反応する反応性基を含み得る（このような担体の基本成分の図示のための図２１Ｂを参照のこと）。例えば、システイン含有ペプチドを捕捉するのに適切な特異的な担体が、図２１Ｃに図示される。このシステイン含有ペプチドのチオール基は、図示された担体のヨードアセテート基と反応し得る。すべてのペプチドがシステインを含むとは予想されないので、これは、分析されるべきサンプルの複雑さを低減するための方法である。なぜなら、システイン部分を有しないペプチドは、担体を通って流れ、捕捉されないからである。いったん、固定化されると、図２１Ａに図示される処理方法に従って、そのペプチドのアミン基は、標識試薬で標識化され得る（図２１Ａを参照のこと）。この標識化ペプチド分析物は、次いで、その担体からか切断され得、そして（混合物を形成することを含めて）さらに処理され得、そして／または分析され得る（図２１Ａ）。
いくつかの実施形態では、（上記担体の官能基と反応しないので）担体を通って流れるペプチドは、（廃棄される代わりに）収集され得、標識試薬で標識化され得、そして上記担体から収集された標識化ペプチドとは別個にまたはそれらと一緒に分析され得る。この仕事の流れは、図２３および２４に図示される。図示されるように、固体担体を通って流れるペプチドは、１セットの標識試薬の同じ標識試薬または異なる標識試薬で標識化され得る。標識試薬にかかわらず、それらは、必要に応じて、ＭＳ／ＭＳ分析により分析されるサンプル混合物と混合され得る。それらはまた、独立に分析され得る。図２３および２４は、まだ上記担体上にある間（図２３）か、またはそれらがその担体から切断された後（図２４）かのいずれかに、上記担体上に保持されたペプチドを標識化することが可能である点で、異なる。
図２５を参照して、上記前駆体タンパク質を捕捉するために、固体担体を使用することもまた可能である。図示されるように、平行な経路を使用して処理される２つのサンプルがオ存在する。タンパク質のシステイン部分を捕捉するために適切な担体は、図２１Ｃに図示される。その図によれば、その担体に結合されたタンパク質は、消化され得る。システイン部分を含まないペプチドは、洗浄によってその担体から除去され得、そして収集され得る。それらは、必要に応じて標識化され得、そしてサンプル混合物とともに分析されてもよく、または別個に分析されてもよい。この担体に結合されたシステイン含有ペプチドは、次いで、標識試薬で標識化され得、そしてこの担体から切断され得る（図２５に示される選択肢）。この担体に結合されたシステイン含有ペプチドは、そうでなければ最初にその担体から切断され得、次いで標識試薬で標識化され得る（図２５に示されていない選択肢）。異なるサンプルに由来する標識化ペプチド（必要に応じて、システイン部分を含まない標識化ペプチドを含む）は、混合され得、処理され得、そして／または分析され得る。
（Ｂ．標識化およびその後の消化が関与する例示的な作業の流れ）
担体が使用されて前駆体タンパク質または分析物ペプチドが捕捉されるか否かにかかわらず、標識試薬を用いる標識化の工程は、分析物ペプチドへの前駆体タンパク質の消化の前または後のいずれかに実施され得る。従って、これらの作業の流れに対しては、このタンパク質は、消化の前に標識化される。
このサンプルタンパク質を還元してシステインブロックし、サンプルタンパク質のＮ−ε−リジンの側鎖アミン基を標識試薬で標識化し、次いでこのタンパク質を標識化ペプチドに消化することが可能である。この標識化ペプチド分析物は、分析され得るか、またはそれらは、例えば、分離によりまたは担体への固定化によりさらに処理され得る（サンプル混合物を調製することを含む）。例えば、標識試薬とこのサンプルタンパク質のＮ−ε−リジンの側鎖アミン基との反応により、この前駆体タンパク質を標識化し、次いで必要に応じてこの標識化前駆体タンパク質を担体に固定化することが可能である。この標識化タンパク質は、この担体から切断され得、次いで消化され得るか、またはその標識化タンパク質は、まだ担体に結合されたままで消化され得る。後者の場合では、担体に結合された消化物は、システイン部分を含まない担体からペプチドを遊離する。これらは、収集され得、そして必要に応じて、別個に、または後で放出される、システイン部分を含む標識化ペプチドを含むサンプル混合物の一部としてかのいずれかで分析され得る。
前駆体タンパク質が、ペプチドへの消化の前に標識化される場合、消化パターンが変更され得る。例えば、トリプシンを用いた消化は、主にＣ−末端アルギニンペプチドを生成すると予想され得る。なぜなら、Ｎ−ε−リジンの側鎖アミン基は、標識により修飾されるからである。その結果、トリプシンの活性は、Ａｒｇ−Ｃの活性と非常に類似となり得る。またリジン側鎖を含むそれらのＣ−末端アルギニンペプチドのみが、標識化され得、そしてそれゆえ質量分析計で検出可能となり得るので、これは、さらに処理されかつ／または分析されるべきサンプルの複雑さをさらに低減するための方法を提示する。
いくつかの実施形態では、そのタンパク質を還元し、そしてそのシステイン基を標識試薬（すなわち、チオール特異的標識試薬）で標識化し、次いでそのタンパク質を分析のための標識化ペプチドに消化することが可能である。この標識化ペプチド分析物は、分析され得るか、または例えば、分離および／または担体への固定化により、さらに処理され得る。例えば、上記リジン側鎖のＮ−α−アミン基および／またはＮ−ε−アミン基と、担体の官能基との反応により、標識化ペプチドを担体に固定化することが可能である。アミン官能基を含む化合物の固定化のための切断可能なリンカーを有する担体としては、トリチルリンカーを含む樹脂が挙げられる（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能な塩化トリチル樹脂（Ｔｒｉｔｙｌ−Ｃｌ）または２−クロロ塩化トリチル樹脂を参照のこと）。この作業の流れは、以前に記載された流れとは異なる。この標識化分析物は、その担体から切断され得、さらに処理され得、そして／または分析され得る。このプロセスは、実質的な複雑さの低減は提供しないことがあるかも知れない。なぜなら、消化されたすべてのペプチドは少なくともＮ−α−アミン基を含むと予想されるからである。
上記の例は、種々の可能な作業の流れを網羅しているとは意図されていない。それらは、単に例示的であることが意図されている。標識化が消化より先に実施される実施形態に関して、その消化を実施する前にさらなる処理を施すことが可能である。
（Ｃ．要旨）
上記の考察は、具体例として、プロテオーム分析および分析物としてのペプチド定量に焦点を当てたが、記載された概念は、先行する作業の流れが過度の実験の実施なしに適用可能である多くのタイプの分析物を包含することが意図される。従って、本開示の範囲は、考察されたこれらの具体例のいずれかに限定されることは意図されていない。
（ＩＶ．混合物）
いくつかの実施形態において、本発明は、混合物（すなわち、サンプル混合物）に関する。その混合物は、少なくとも２つの区別をして標識される分析物を含み得、ここで、その２つの標識された分析物の各々は、異なるサンプルが起源であり得、そして式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物を構成し得る。各異なる標識に関して、上記混合物の標識された分析物のいくつかは、同じであり得、その標識された分析物のいくつかは、異なり得る。原子、部分または結合、Ｘ、Ｙ、ＲＰおよびＬＫは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。上記混合物は、２つ以上の標識反応の生成物の全て、または一部を混合することにより、形成され得、ここで、各標識反応は、一般式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの異なる標識試薬を使用し、ここで、原子、部分または結合、Ｘ、Ｙ、ＲＰ、ＬＫ、ＲＧは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。その標識試薬は、同位体コードされた異性体標識試薬または同重体標識試薬であり得る。各異なる標識試薬の独特なレポーターは、２つ以上の標識された分析物の各々が誘導される標識反応を示し得る。標識試薬は、異性体または同重体であり得る。したがって、混合物の標識された分析物の２つ以上は、異性体または同重体であり得る。その混合物は、上記方法のいずれかにおいて開示されたようなサンプル混合物であり得る。これらの方法に関連する標識試薬および標識された分析物の特徴は、先に議論されている。
上記混合物の分析物は、ペプチドであり得る。その混合物の分析物は、タンパク質であり得る。その混合物の分析物は、ペプチドおよびタンパク質であり得る。その混合物の分析物は、核酸分子であり得る。その混合物の分析物は、炭水化物であり得る。その混合物の分析物は、脂質であり得る。その混合物の分析物は、ステロイドであり得る。その混合物の分析物は、１５００ダルトン未満の低分子であり得る。その混合物の分析物は、２種以上の分析物タイプを含む。その分析物タイプは、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、ステロイドおよび／または１５００ダルトン未満の低分子から選択され得る。
いくつかの実施形態では、各々同重体で標識された分析物の標識は、５員、６員または７員の複素環であり得、この複素環は、分析物がＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して結合される置換もしくは非置換の酢酸部分でＮ−アルキル化された環窒素原子を含み、ここで、各異なる標識は、１つ以上の重原子同位体を含む。その複素環は、置換または非置換であり得る。その複素環は、脂肪族または芳香族であり得る。その複素環式部分の可能な置換基としては、アルキル基、アルコキシ基およびアリール基が挙げられる。その置換基は、分析物を担体へ結合させるのに適切な、保護された基または保護されていない基（例えば、アミン基、ヒドロキシル基またはチオール基）を含み得る。その複素環は、１個以上の窒素原子、酸素原子または硫黄原子のようなさらなるヘテロ原子を含み得る。
いくつかの実施形態では、上記混合物の標識された分析物は、同重体であり、各々、式：
を含み、ここで、Ｚ、ＪおよびＷは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。例えば、上記サンプル混合物は、式：
の、１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで、炭素１３および酸素１８の同位体は、モルホリンレポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用される。
いくつかの実施形態では、上記サンプル混合物は、式：
の１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで、炭素１３、酸素１８および窒素１５の同位体は、レポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用される。いくつかの実施形態では、上記サンプル混合物は、式：
の１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで、炭素１３、酸素１８および窒素１５の同位体は、レポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用され、ここで；１）各Ｒ１は、同じかまたは異なり、そして必要に応じてヘテロ原子を含み得る１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、または置換もしくは非置換のアリール基を含み得、ここで、そのアルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立して、結合した水素原子、重水素原子および／またはフッ素原子を含み；そして２）各Ｋは、独立して、水素またはアミノ酸側鎖として選択される。
いくつかの実施形態では、上記混合物の標識された分析物は、同重体であり、各々、式：
を含み、ここで、Ｚ、ＪおよびＲ１は、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。例えば、上記サンプル混合物は、式：
の、１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで、炭素１３および酸素１８の同位体は、レポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用される。
他の実施形態では、その標識された分析物は、最初にその分析物と標識試薬を含む担体とを反応させ、切断可能なリンカーを介してその担体に切断可能に結合し、次いで、その標識された分析物をその担体から切断する工程によって生成され得る。例えば、上記混合物の標識された分析物は、一般式：
を含む１種以上の同重体であり得、ここで：Ｇ’は、先に記載されており、その特徴は開示されている。
（Ｖ．キット）
いくつかの実施形態では、本発明は、キットに関する。そのキットは、式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの２種以上の標識試薬と、１種以上の試薬、容器、酵素、緩衝液および／または指示書とのセットを含み得る。その原子、部分または結合Ｘ、Ｙ、ＲＰ、ＬＫ、ＲＧは、先に記載されており、その特徴は開示されている。キットの標識試薬は、異性体または同重体であり得る。そのキットの標識試薬の他の特性は、同様に開示されている。例えば、そのキットは、同一のサンプルまたは２種以上の異なるサンプル中の１種以上の分析物の多重分析に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、各々同重体で標識された分析物の標識は、５員、６員または７員の複素環であり得、この複素環は、分析物がＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して結合される置換もしくは非置換の酢酸部分でＮ−アルキル化された環窒素原子を含み、ここで、各異なる標識は、１つ以上の重原子同位体を含む。その複素環は、置換または非置換であり得る。その複素環は、脂肪族または芳香族であり得る。その複素環式部分の可能な置換基としては、アルキル基、アルコキシ基およびアリール基が挙げられる。その置換基は、分析物を担体へ結合させるのに適切な、保護された基または保護されていない基（例えば、アミン基、ヒドロキシル基またはチオール基）を含み得る。その複素環は、１個以上の窒素原子、酸素原子または硫黄原子のようなさらなるヘテロ原子を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットの異なる試薬は、同重体であり、各々、式：
を含み、ここで、ＲＧ，Ｚ、ＪおよびＷは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。例えば、キットの試薬は、式：
の、１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで、ＲＧは反応基であり、炭素１３および酸素１８の同位体は、モルホリンレポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用される。
いくつかの実施形態では、上記キットは、式：
の、１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで、ＲＧは反応基であり、炭素１３、酸素１８および窒素１５の同位体は、レポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用される。いくつかの実施形態では、キットの試薬は、式：
の、１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで：炭素１３、酸素１８および窒素１５の同位体は、レポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用され、ここで；１）各Ｒ１は、同じかまたは異なり、そして必要に応じてヘテロ原子を含み得る１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、または置換もしくは非置換のアリール基を含み得、ここで、そのアルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立して、結合した水素原子、重水素原子および／またはフッ素原子を含み；そして２）各Ｋは、独立して、水素またはアミノ酸側鎖として選択される。さらに他の実施形態では、上記キットの標識された分析物は、同重体であり、各々、式：
を含み、ここで：ＲＧ、Ｚ、ＪおよびＲ１は、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。例えば、キットの試薬は、式：
の、１種以上の同重体で標識された分析物を含み得、ここで、ＲＧは先に記載および開示されており、炭素１３および酸素１８の同位体は、レポーターと異なる標識試薬のカルボニルリンカーとの間で総質量のバランスをとるために使用される。
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のセットの担体を含むキットに関し、各々の担体は、切断可能なリンカーを介して担体に切断可能に結合されている、異なる標識試薬を含む。例えば、その切断可能なリンカーは、化学的にまたは光分解的に切断可能であり得る。その担体は、異なるサンプルと反応され得、それによって、サンプルの分析物を同一のレポーター／リンカーで標識し、そして異なるサンプルの分析物を異なるレポーター／リンカー組み合わせで標識する。本発明の実施形態で使用され得るセットの担体は、一般式：Ｅ−Ｆ−Ｇ−ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧを有し、ここで、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＲＰ、Ｘ、ＬＫ、ＹおよびＲＧは、先に本明細書中で定義されており、それらの特徴は開示されている。そのセットの各々異なる担体は、独特のレポーターを含み得る。
例えば、キットの担体は、式：
の２種以上の試薬担体を含み得、ここで：Ｅ、Ｆ、ＧおよびＲＧは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。
いくつかの実施形態では、上記キットは、タンパク質分解性酵素を含む。そのタンパク質分解性酵素は、トリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシンまたはカルボキシペプチダーゼＣであり得る。いくつかの実施形態では、上記キットは、異なるサンプルの分析物を区別をして標識する標識試薬を使用するための指示書を備え得る。
（ＶＩ．組成物）
いくつかの実施形態では、本発明は、標識試薬として使用され得る組成物に関する。その組成物は、式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの標識試薬であり得、ここで、原子、部分または結合、Ｘ、Ｙ、ＲＰ、ＬＫ、ＲＧは、先に記載されており、それらの特徴は開示されている。その標識試薬は、異性体または同重体であり得る。その標識試薬の他の特性は、同様に開示されている。例えば、その標識試薬は、同一のサンプルまたは２種以上の異なるサンプル中の１種以上の分析物の多重分析に有用であり得る。
その標識試薬は、少なくとも１個の重原子同位体で同位体富化され得る（コードされ得る）。その標識試薬は、同位体富化され、２個以上の重原子同位体を含み得る。その標識試薬は、同位体富化され、３個以上の重原子同位体を含み得る。その標識試薬は、同位体富化され、４個以上の重原子同位体を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１個の重原子同位体は、標識試薬のカルボニル基またはチオカルボニル基へ組み込まれ、そして少なくとも１個の他の重原子同位体は、標識試薬のレポーター基に組み込まれる。
各々組み込まれた重原子同位体は、少なくとも８０％の同位体純度で存在し得る。各々組み込まれた重原子同位体は、少なくとも９３％の同位体純度で存在し得る。各々組み込まれた重原子同位体は、少なくとも９６％の同位体純度で存在し得る。
その標識試薬は、固定電荷を含むレポーター基またはイオン化可能なレポーター基を含む。したがって、そのレポーター基は、容易にイオン化される塩基性部分または酸性部分を含み得る。いくつかの実施形態では、上記レポーターは、モルホリン、ピペリジンまたはピペラジン化合物であり得る。いくつかの実施形態では、上記レポーターは、カルボン酸基含有化合物、スルホン酸基含有化合物またはリン酸基含有化合物であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、上記標識試薬は、それらの塩形態で単離され得る。例えば、ピペラジン含有標識試薬は、モノ−ＴＦＡ塩、モノ−ＨＣｌ塩、ビス−ＴＦＡ塩またはビス−ＨＣｌ塩として得られ得る。その標識試薬中に存在する対イオンの数は、標識試薬中に存在する酸性基および／または塩基性基の数に依存し得る。
いくつかの実施形態では、上記標識試薬は、カルボニルリンカーまたはチオカルボニルリンカーを含み得る。カルボニルリンカーまたはチオカルボニルリンカーを含む標識試薬は、分析物の標識のために活性エステル形態で使用され得る。活性エステルにおいて、アルコール基は、脱離基（ＬＧ）を形成する。いくつかの実施形態では、その活性エステルのアルコール（ＬＧ）は、式：
を有し得、ここで、ＸはＯまたはＳである。その活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであり得る。
いくつかの実施形態では、上記活性エステル化合物は、５員、６員または７員の複素環であり得、この複素環は、活性エステルのアルコール部分がＮ−アルキル酢酸部分のカルボニル炭素を介して結合される置換もしくは非置換の酢酸部分でＮ−アルキル化された環窒素原子を含み、ここで、上記化合物は、１つ以上の重原子同位体で同位体富化されている。その活性エステルの複素環は、１つ以上の置換基で置換され得る。その１つ以上の置換基は、アルキル基、アルコキシ基およびアリール基であり得る。その１つ以上の置換基は、アルキルアミン基、アルキルヒドロキシ基またはアルキルチオ基であり得る。その１つ以上の置換基は、保護されたかもしくは保護されていない、アミン基、ヒドロキシル基またはチオール基であり得る。上記複素環は、脂肪族であり得る。上記複素環は、芳香族であり得る。上記複素環は、１個以上のさらなる窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記活性エステル化合物は、式：
のＮ−置換モルホリン酢酸活性エステル化合物またはその塩であり得、ここで；ＬＧは活性エステルの脱離基であり；ＸはＯまたはＳであり；各Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含み得る直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、上記アルキル基およびアリール基の炭素原子は、各々独立して、結合した水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｚは、独立して、水素、メチルまたはメトキシであり得る。いくつかの実施形態では、Ｘは、１６Ｏまたは１８Ｏである。上記モルホリン環の窒素原子は、１４Ｎまたは１５Ｎであり得る。いくつかの実施形態では、上記活性エステルは、式：
を含む化合物であり、ここで、各Ｃ＊は、独立して、１２Ｃまたは１３Ｃであり；ＬＧは活性エステルの脱離基であり；ＸはＯまたはＳであり；そして各Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含み得る直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、上記アルキル基およびアリール基の炭素原子は、各々独立して、結合した水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基である。
いくつかの実施形態では、上記活性エステル化合物は、式：
のＮ−置換ピペリジン酢酸活性エステル化合物またはその塩であり得、ここで；ＬＧは活性エステルの脱離基であり；ＸはＯまたはＳであり；各Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含み得る直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、上記アルキル基およびアリール基の炭素原子は、各々独立して、結合した水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｚは、独立して、水素、メチルまたはメトキシであり得る。いくつかの実施形態では、Ｘは、１６Ｏまたは１８Ｏである。ピペリジン環の窒素原子は、１４Ｎまたは１５Ｎであり得る。いくつかの実施形態では、上記活性エステルは、式：
を含む化合物であり、ここで、各Ｃ＊は、独立して、１２Ｃまたは１３Ｃであり；ＬＧは活性エステルの脱離基であり；ＸはＯまたはＳであり；そして各Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含み得る直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、上記アルキル基およびアリール基の炭素原子は、各々独立して、結合した水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基である。
いくつかの実施形態では、上記活性エステル化合物は、式：
のＮ−置換ピペリジン酢酸活性エステル化合物またはその塩であり得、ここで；ＬＧは活性エステルの脱離基であり；ＸはＯまたはＳであり；Ｐｇは、アミン保護基であり；そして各Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含み得る直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、上記アルキル基およびアリール基の炭素原子は、各々独立して、結合した水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｚは、独立して、水素、メチルまたはメトキシであり得る。いくつかの実施形態では、Ｘは、１６Ｏまたは１８Ｏである。いくつかの実施形態では、ピペリジン環の各窒素原子は、１４Ｎまたは１５Ｎであり得る。いくつかの実施形態では、上記活性エステルは、式：
を含む化合物であり、ここで、各Ｃ＊は、独立して、１２Ｃまたは１３Ｃであり；ＬＧは活性エステルの脱離基であり；ＸはＯまたはＳであり；Ｐｇは、アミン保護基であり；そして各Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含み得る直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、上記アルキル基およびアリール基の炭素原子は、各々独立して、結合した水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基である。
（ＶＩＩ．例示的なＮ−置換ピペラジンベースの標識試薬）
（Ａ．Ｎ−置換ピペラジン化合物重原子同位体の調製）
いくつかの実施形態では、本発明は、同位体富化したＮ−置換ピペラジンの生成方法、およびＮ−置換ピペラジンそれ自体に関する。上記方法に従って、部分的に保護されたアミノ酸は、Ｎ−置換アミノ酸エステルと縮合され得、ここで、２つのアミノ酸の少なくとも１つは、重原子同位体（例えば、１８Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、８１Ｂｒ、３７Ｃｌまたは重水素）で同位体富化される。２つのアミノ酸を縮合するとき、任意の側鎖反応基は、ペプチドを形成するアミノ酸の縮合のためのものである場合、保護され得る。同様に、縮合化学は、アミノ酸を縮合するための種々の公知の方法から選択され得る。これらとしては、カルボジイミド（例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、活性エステル、混合無水物形成などが挙げられるが、これらに限定されない。
上記部分的に保護されたアミノ酸は、ペプチド合成において周知の保護基であるアミノ保護基（Ｎ−保護基）（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）を含む。多くの他の適切なＮ−保護基が、ペプチド合成分野で周知である。部分保護アミノ酸は、アミノ酸が反応性側鎖部分を含む場合、側鎖保護を含み得る。多くの適切な側鎖保護基は同様に、ペプチド合成分野で公知である。上記アミノ酸は、任意の天然アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、リシン）または基本構造：
の非天然アミノ酸であり得、ここで、Ｐｇは、Ｎ−保護基であり得る。各基Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ酸側鎖、必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含み得る直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、上記アルキル基およびアリール基の炭素原子は、各々独立して、結合した水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または必要に応じて置換もしくは非置換のアリール基を含んでいてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、そのアルキル基およびアリール基の炭素原子が、各々、独立に連結水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基である。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立して、水素、メチルまたはメトキシであり得る。いくつかの実施形態では、各Ｚは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり得る。いくつかの実施形態では、各Ｚは、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。本明細書中で使用される場合、アルキルエーテル基は、１つ以上のポリエチレングリコール置換基を含み得る。同様に、本明細書中で使用される場合、アルコキシ基は、エーテルおよび／またはポリエチレングリコール置換基を含み得る。上記Ｎ−保護基は、酸に不安定な保護基であり得る。上記Ｎ−保護基は、塩基に不安定な保護基であり得る。
上記Ｎ−置換アミノ酸エステルは、任意の天然アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、リシン）または基本構造：
の非天然アミノ酸であり得、ここで、Ｚは先に定義されている。基Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であり得、ここで、そのアルキル基またはアルキルエーテル基の炭素原子は、独立して、連結水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む。いくつかの実施形態では、Ｙは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである。基Ｒは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基または置換もしくは非置換のフェニル基であり得、ここで、そのアルキル基またはフェニル基の炭素原子は、各々独立して、連結水素原子、重水素原子またはフッ素原子を含む。いくつかの実施形態では、上記Ｎ−置換アミノ酸エステルは、サルコシンのエステル（例えば、メチルまたはエチル）であり、これは、Ｎ−メチルグリシンのエステルである。いくつかの実施形態では、Ｒは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり得る。
１５Ｎまたは１３Ｃ標識グリシンのあらゆる可能な置換物（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）が市販されている。同様に、他の天然アミノ酸は、１つ以上の組み込まれた重原子同位体を有して市販されている。１つ以上の重原子同位体を含むグリシンおよび他のアミノ酸は市販されているので、これらのアミノ酸は、Ｎ−置換ピペラジンの生成のための手順に容易に組み入れられ得る。重原子同位体を含むアミノ酸は、ペプチド化学で周知の手順を使用してＮ−保護され得る。例えば、上記アミノ酸は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基またはｔ−ｂｏｃ基でＮ−保護され得る。さらに、重原子同位体を含むアミノ酸は、周知の手順を使用して、Ｎ−アルキル化され得、そしてアミノ酸エステルに変換され得る。したがって、本明細書中に記載されるようなＮ−置換ピペラジンの調製のための重原子同位体含有出発物質は、市販されているか、またはただ慣用的な実験を使用して市販のアミノ酸から容易に調製され得るかのいずれかである。
上記方法に従って、上記２つのアミノ酸は、縮合され得、それによって、エステルとしてＮ−保護ペプチドダイマーを生成し得る。そのＮ−保護ペプチドダイマーエステルは、１つ以上の重原子同位体を含む１つ以上のアミノ酸の組込みにより、１つ以上の重原子同位体を含み得る。そのＮ−保護ペプチドダイマーエステルは、１つの重原子同位体、２つの重原子同位体、３つの重原子同位体、４つの重原子同位体、５つの重原子同位体または６つの重原子同位体を含み得る。そのＮ−保護ペプチドダイマーは、６つより多い重原子同位体を含み得る。そのＮ−保護ペプチドダイマーエステルは、一般式：
を有し得、ここで、Ｐｇ、Ｒ、ＹおよびＺは、先に定義されている。
上記方法に従って、上記Ｎ−保護ペプチドダイマーエステルは、次いで、環化されて、６員の環状ジオン（ジアミドとしても公知）を形成し得る。環化は、そのＮ−保護ペプチドダイマーエステルのＮ保護基を除去し、そしてその脱保護アミンとエステル基との反応を起こす工程により進行する。その反応は、塩基性条件下で実施され得、その生成物の迅速な生成のために加熱され得る。その環化の環状ジオン（ジアミド）生成物は、一般式：
を有し得、ここで、ＹおよびＺは、先に定義されている。
上記方法に従って、上記環状ジオン（ジアミド）のカルボニル（ケト）基は、次いで、還元されて、所望の同位体富化Ｎ−置換ピペラジンを形成し得る。還元は、還元剤（例えば、水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）またはＲｅｄ−Ａｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用して実施され得る。いくつかの実施形態では揮発性油状物であるその生成物は、必要に応じて一時的に修飾（例えば、保護）され、単離に役立ち得る。ピペラジンは２つの塩基性窒素原子を含むので、その生成物は、いくつかの実施形態では、モノ−酸塩またはビス−酸塩として単離され得る。例えば、１つ以上に重原子同位体を含むＮ−置換ピペラジンは、モノ−ＴＦＡ塩、モノ−ＨＣｌ塩、ビス−ＴＦＡ塩またはビス−ＨＣｌ塩として単離され得る。
図１３は、Ｎ−メチルピペラジンの生成に対する上記一般手順の適用を例示する。実施例１０〜１３は、３つの異なるＮ−メチルピペラジン（各々、１〜３個の重原子同位体を含む）の生成に対する例示した手順の適用を記載する。
図１３および実施例１０〜１３に関して、ｔ−ｂｏｃ保護グリシン（３０）は、サルコシンメチルエステル（３１）と縮合され、それによってジペプチド（３２）を生成する。そのｔ−ｂｏｃ基は除去され、そのジペプチドは環状ジアミド（ジオン）（３３）に環化される。次いで、そのジアミド（ジオン）のカルボニル基（ケトン基）は、還元され、Ｎ−メチルピペラジンを生成する。そのＮ−メチルピペラジン生成物を、一過性に保護し得る（３４）か、またはその還元から直接獲得し得る（３５）かのいずれかである。その生成物はまた、酸の塩（例えば、ＴＦＡ塩（３６）またはＨＣｌ（３７））として獲得し得る。
要約すると、広範な種類のＮ−置換ピペラジン化合物（標識されていないか、または１つ以上の重原子同位体で標識されている）は、上記プロセスによって生成され得る。結論として、本発明は、一般式：
の１つ以上の重原子同位体を含む同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物の可能なもの全て（可能な全てのその塩形態（塩または塩の混合物）を含む）を企図し、ここで、ＹおよびＺは先に定義されている。塩形態でも塩形態でなくてもいずれにせよ、水和物形態（すなわち、１つ以上の複合体化重水分子または軽水分子）で存在する同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物もまた企図される。そのＮ−置換ピペラジンは、１３Ｃおよび／または１５Ｎのいずれかのみで同位体富化される。
上記同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物は、１つ以上の重原子同位体、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体、４つ以上の重原子同位体、５つ以上の重原子同位体、６つ以上の重原子同位体または６つより多くの重原子同位体を含み得る。ピペラジン環の各窒素原子は、独立して、１４Ｎまたは１５Ｎであり得る。ピペラジン環または基Ｙにおける各炭素原子は、独立して、１２Ｃまたは１３Ｃであり得る。例えば、上記Ｎ−置換ピペラジン化合物は、式：
を有し得る。
（Ｂ．重原子同位体を含むＮ−置換ピペラジン酢酸の調製）
いくつかの実施形態では、本発明は、同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸エステルの生成方法および同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸に関する。いくつかの実施形態では、各々同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸エステルまたは同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸は、１つ以上の重原子同位体、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体、４つ以上の重原子同位体、５つ以上の重原子同位体、６つ以上の重原子同位体または６つより多い重原子同位体を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｎ−置換ピペラジンは、１つ以上の重原子同位体を含む（すなわち、同位体富化された）ハロ酢酸部分と反応され得る。この文脈において、ハロとは、ハロゲン、塩素、臭素またはヨウ素をいう。さらなるいくつかの他の実施形態において、１つ以上の重原子同位体を含む（すなわち、同位体富化された）Ｎ−置換ピペラジンは、ハロ酢酸部分と反応され得る。いくつかの他の実施形態では、同位体富化されたＮ−置換ピペラジンは、同位体富化されたハロ酢酸部分と反応され得る。したがって、生成物Ｎ−置換ピペラジン酢酸に見出される重原子同位体は、ピペラジン、ハロ酢酸部分またはピペラジンとハロ酢酸部分との両方を経由して導入され得る。以下により詳細に議論されるように、１８Ｏはまた、Ｈ２ ｌ８Ｏとの交換によって、Ｎ−置換ピペラジン酢酸のカルボン酸部分に導入され得る。
多くの軽Ｎ−置換ピペラジン（例えば、Ｎ−メチルピペラジンおよびＮ−エチルピペラジン）は、市販されている。さらに、上の節Ａは、市販のアミノ酸からの同位体富化されたＮ−置換ピペラジンの調製を記載する。軽Ｎ−置換ピペラジン化合物および重Ｎ−置換ピペラジン化合物の両方は、１つ以上の重原子同位体を含む同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸を生成するために使用され得る。
多くの軽ハロ酢酸部分および重ハロ酢酸部分は、市販されている。Ｎ−置換ピペラジンと反応されるハロ酢酸部分は、カルボン酸またはカルボン酸のエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステルまたはフェニルエステル）として購入され得る。カルボン酸のみが利用可能であり、エステルが所望される場合、そのエステルは、周知のエステル化方法を使用して調製され得る。エステルのみが利用可能であり、カルボン酸が所望される場合、そのエステルは、加水分解されて、カルボン酸を生成し得る。カルボン酸またはエステルのいずれかが、アルキル化反応に使用され得るが、ただし、カルボン酸が使用される場合、少なくとも１つのさらなる当量の塩基が必要とされる。アルキル化を実施するためにエステルが使用される場合、その生成物エステルは、加水分解（すなわち、鹸化）されて、Ｎ−置換ピペラジン酢酸を生成し得る。Ｎ−置換ピペラジンをアルキル化するために使用され得るカルボン酸化合物およびエステル化合物の一般構造は、以下：
であり、ここで、ＺおよびＲは、上に定義されている。Ｈａｌは、ハロゲン（Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）であり、そして各Ｘは、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）である。いくつかの実施形態では、各Ｘは、１６Ｏまたは１８Ｏである。上記ハロ酢酸化合物の原子のうちの１つ以上は、重原子同位体であり得る。
ハロ酢酸部分を用いてのＮ−置換ピペラジンのアルキル化は、塩基性条件下で進行する。その塩基は、ピペラジンを脱保護するのに十分強くあれさえすればよいが、ハロ酢酸部分と実質的に反応しないように選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ−置換ピペラジンが塩基である場合、２当量以上のＮ−置換ピペラジンが使用され得る。１当量のみのＮ−置換ピペラジンを使用することが望ましい場合（例えば、Ｎ−置換ピペラジンが１つ以上の重原子同位体で標識され、従って有用な場合）、他の塩基が使用され得る。適切な塩基としては、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＰＡ）のようなヒンダード塩基が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な塩基としては、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムが挙げられる。ヒンダード塩基は、ハロ酢酸部分と実質的に反応しないので、よい選択である。
固相塩基（例えば、２％ ＤＶＢで架橋したポリスチレンに結合した１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デセ−５−エン（ＴＢＤ）、容量（Ｃａｐａｃｉｔｙ）（塩基）：約２．６ｍｍｏｌ／ｇ（ｓｓ−ＴＢＤ、Ｆｌｕｋａ、Ｐ／Ｎ９０６０３））もまた、使用され得る（図１４Ｂを参照のこと）。固相塩基は、一旦アルキル化反応が完了すると、濾過により生成物から容易かつ完全に除去されるという利点を有する。したがって、得られた生成物は、その塩基の塩が混入されていない。
カルボン酸がＮ−置換ピペラジンをアルキル化するために使用される場合、上記反応は、一般式：
の生成物またはその塩形態を生成し得、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、先に定義されている。Ｎ−置換ピペラジン酢酸の１つ以上の原子は、重原子同位体であり得る。塩形態でも塩形態でなくてもいずれにせよ、水和物形態（すなわち、１つ以上の複合体化重水分子または軽水分子）で存在する同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物もまた企図される。
エステルが、Ｎ−置換ピペラジンをアルキル化するために使用される場合、上記反応は、一般式：
のエステルまたはその塩形態を生成し得、ここで、Ｒ、Ｘ、ＹおよびＺは、先に定義されている。塩形態でも塩形態でなくてもいずれにせよ、水和物形態（すなわち、１つ以上の複合体化重水分子または軽水分子）で存在する同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸エステル化合物もまた企図される。Ｎ−置換ピペラジン酢酸エステルの１つ以上の原子は、重原子同位体であり得る。そのＮ−置換ピペラジン酢酸エステルは、エステルの加水分解によって、一般式：
のＮ−置換ピペラジン酢酸に変換され得、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、先に定義されている。そのＮ−置換ピペラジン酢酸は、塩形態および／または水和物形態で存在し得る。エステルのプロトン化の状態に依存して、ピペラジンが塩基性であるので（酸により中和されない限り）、加水分解を実施するために水溶液に塩基を添加することは、必要でもあり、必要なくもあり得る。したがって、塩基は、エステルのカルボン酸への加水分解を誘導するために必要とされる場合に添加され得るが、いくつかの実施形態では、塩基は必要とされない。加水分解はまた、水性酸性条件下で実施され得る。
Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、両性イオン性であり得る。Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、カルボン酸基（またはチオ酸基）および２つの塩基性窒素原子を含むので、Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、少なくとも４つの異なる形態で存在し得る。Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、そのカルボン酸アニオンとして完全に脱保護されて存在し得る。Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、そのモノ保護両性イオンとして存在し得る。Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、一塩基性塩（例えば、モノ−ＴＦＡまたはモノ−ＨＣｌ塩）として存在し得る。Ｎ−置換ピペラジン酢酸はまた、その二塩基性塩（例えば、ビス−ＴＦＡまたはビス−ＨＣｌ塩）として存在し得る。生成物のプロトン化の状態は、それが単離される条件の関数である。Ｎ−置換ピペラジン酢酸のプロトン化状態の全ては、本発明の実施形態として、その水和物形態の化合物を含んで、企図される。
それぞれ、図１４Ａおよび１４Ｂ、ならびに実施例１４および１５に関して、２つの異なる同位体富化されたＮ−メチルピペラジン酢酸化合物の生成が記載される。図１４Ａおよび実施例１４において、２当量の市販の非標識Ｎ−メチルピペラジン（３５）は、ブロモ酢酸エチルと反応され、２つの１３Ｃ原子を含むＮ−メチルピペラジン酢酸化合物を生成する。Ｎ−メチルピペラジンは塩基性であるので、エチルエステルの加水分解は、単に水溶液中で化合物を加熱することによって進行した。
図１４Ｂおよび実施例１５に関して、出発ピペラジンは、１５Ｎ標識Ｎ−メチルピペラジンのビス−ＴＦＡ塩である。ピペラジン塩基の酸塩は、ピペラジンを脱保護するのに十分な塩基がその反応に添加される限り、アルキル化され得る。この実施例において、ブロモ酢酸エチルは、１３Ｃ標識される。ピペラジン反応物および酢酸反応物の両方が重原子同位体を含むので、固相塩基が選択され、それによって、１当量のみの各反応物が生成物を生成するために必要とされた。実施例１４で観察されたように、エチルエステルの加水分解は、単に水溶液中で化合物を加熱することによって進行した。
いくつかの他の実施形態では、Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、固体担体上に集められ得る。上記方法に従って、ならびに図１４Ｃおよび実施例１６に関して、カルボン酸としてのハロ酢酸部分は、トリチルクロライド樹脂と反応され、それによって、担体結合ハロ酢酸を生成し得る。次いで、その担体結合ハロ酢酸は、所望のＮ−置換ピペラジン（例えば、Ｎ−メチルピペラジン）で塩基性条件下で処理され、それによって、Ｎ−置換ピペラジン酢酸を生成し得る。１８Ｏ標識化合物を含んで、同位体富化されたＮ−メチルピペラジンおよびハロ酢酸部分が使用され得るが、１８Ｏ標識は、特別な問題を含み得、以下により詳細に議論される。
上述の議論にしたがって、重原子同位体は、Ｎ−置換ピペラジン酢酸の実質的に任意の位置で組み込まれ得る（以下により詳細に議論される１８Ｏ組込みを含む）。結果的に、本発明は、一般式：
の１つ以上の重原子同位体を含む同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸の可能な全てのもの（その全ての可能な塩形態および／または水和物形態を含む）を企図し、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、先に定義されている。例えば、上記Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、式：
を有し得、ここで、各Ｃ＊は独立して、１２Ｃまたは１３Ｃであり、各Ｎ＊は、独立して、１４Ｎまたは１５Ｎであり、各Ｘは、独立して、ＯまたはＳであり、可変物ＹおよびＺは、先に定義されている。いくつかの実施形態では、上記Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、式：
を有する。
（Ｃ．Ｎ−置換ピペラジン酢酸への１８Ｏの組込み）
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｎ−置換ピペラジン酢酸への１８Ｏの組込み方法に関し、また、１８Ｏ標識Ｎ−置換ピペラジン酢酸それ自体に関する。いくつかの実施形態では、１８Ｏの組込みは、上の節Ｂに同位体標識されたＮ−置換ピペラジン酢酸の調製について記載された方法と比較して、実質的に異ならなかった。いくつかの他の実施形態では、１８Ｏの組込みは、実質的に異なり、先に議論された方法についてある懸念をうむ記載を利用する。
１８Ｏ標識Ｎ−置換ピペラジン酢酸の調製に関する懸念は、非標識の水（Ｈ２ １６Ｏ）と重カルボン酸基の１８Ｏとの間で起こり得る１８Ｏ⇔１６Ｏの交換に起因する。カルボン酸基は、本質的に酸性である。酸は、カルボン酸基および水（例えば、サンプル中の残存水または反応（例えば、エステルの加水分解）で使用された水）の酸素原子の交換を触媒し得る。結果的に、１８Ｏ標識Ｎ−置換ピペラジン酢酸が所望されるときはいつでも、２つの異なる合成経路のうちの１つが選択された。
いくつかの実施形態では、上記１８Ｏ標識Ｎ−置換ピペラジン酢酸は、適切に１８Ｏ標識されたハロ酢酸部分でのアルキル化によって得られた。上記手順は、酸に不安定なハロ酢酸エステルをアルキル化反応に使用した以外は、本質的に上記節Ｂに概略されている通りである。いくつかの実施形態では、上記ハロ酢酸部分は、式：
を含んだ。ここで、Ｈａｌは、先に定義されており、Ｒ’は、酸に不安定なエステル基であり、これとしては、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルまたはｔ−ｂｏｃが挙げられるが、これらに限定されない。
図１５Ａおよび実施例１７に関して、（１８Ｏ）２ブロモ酢酸（４３）のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）エステルは、アルキル化反応に使用された。このエステルは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．からカスタムオーダーとして入手した１８Ｏ標識ブロモ酢酸（４２）、およびＴＢＤＭＳ−ＣＮを使用して調製された。Ｎ−メチルピペラジン酢酸のＴＢＤＭＳエステル（４４ａ、４４ｂおよび４４ｃ）は、Ｎ−メチルピペラジンでのアルキル化の生成物であった。そのＴＢＤＭＳエステルが選択され、それによって、そのＴＢＤＭＳエステルは、例えば、塩化オキサリルを用いて酸塩化物に変換され、それによって、任意の水および１８Ｏの１６Ｏでの可能な交換に対する要件を回避し得た。固相塩基（ｓｓ−ＴＢＤ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で、上記酸塩化物は、ＮＨＳエステル（４５ａおよび４５ｂ）に変換された。カルボン酸が所望される場合、活性エステルの代わりに、ＴＢＤＭＳエステルが、ＴＦＡのような無水酸での処理によってカルボン酸に変換され得る。したがって、１８Ｏ⇔１６Ｏ交換を導く水性処理は、活性エステルまたはカルボン酸が所望される場合でも回避され得る。
いくつかの他の実施形態では、Ｎ−置換ピペラジン酢酸を生成するためのアルキル化は、上記節Ｂに記載されたとおりに進行し、１８Ｏは後で組み込まれた。図１５Ｂおよび実施例１８に関して、酸性条件下でのＨ２ １８ＯでのＮ−置換ピペラジン酢酸の処理により、１８Ｏを、任意のＮ−置換ピペラジン酢酸のカルボン酸基に組み込むことができたことが見出された。例えば、図１５Ｂに関して、１１４標識試薬を生成するために使用された、１８Ｏを欠く同位体富化されたＮ−メチルピペラジン酢酸（４６）は、Ｈ２ １８ＯとＨＣｌまたはＴＦＡのいずれかとを用いて処理され、それによって、１８Ｏ同位体富化されたＮ−メチルピペラジン酢酸（４７ａ）および（４７ｂ）のＴＦＡ塩またはＨＣｌ塩を生成した。塩形態でも塩形態でなくでもいずれにおいて、水和物形態（すなわち、１つ以上の複合体化重水分子または軽水分子）で存在する同位体富化化合物もまた、企図される。
さらに、生成物の同位体純度を、酸性条件下でのＨ２ １８Ｏでの反復サイクルの処理により増加することができた。Ｈ２ １８Ｏの富化状態が多くなるにつれて、高度に１８Ｏ富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸を生成するために必要とされるサイクルは少なくなる。９９％純度のＨ２ １８Ｏを使用した場合、Ｎ−置換ピペラジン酢酸の同位体富化は、代表的に、２サイクル後に９６％であった。１回以上のさらなるサイクルが、生成物Ｎ−置換ピペラジン酢酸の１８Ｏ同位体含量をさらに増加するために実施され得る。この変換を酸性条件下で行ったので、上記生成物を、Ｎ−置換ピペラジン酢酸のビス−酸塩（例えば、ビス−ＴＦＡ塩またはビス−ＨＣｌ塩）として容易に単離した。塩形態でも塩形態でなくでもいずれにおいて、水和物形態（すなわち、１つ以上の複合体化重水分子または軽水分子）で存在する同位体富化化合物もまた、企図される。
結論的に、本発明は、一般式：
の１つ以上の重原子同位体を含む同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物の可能なもの全て（可能な全てのその塩形態（塩または塩の混合物））を企図する。上記同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物は、１つ以上の重原子同位体、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体、４つ以上の重原子同位体、５つ以上の重原子同位体、６つ以上の重原子同位体または６つより多くの重原子同位体を含み得る。ピペラジン環の各窒素原子は、独立して、１４Ｎまたは１５Ｎであり得る。ピペラジン複素環およびＮ−酢酸部分における各炭素原子は、独立して、１２Ｃまたは１３Ｃであり得る。上記構造における各酸素原子は、１６Ｏまたは１８Ｏであり得る。
（Ｄ．Ｎ−置換ピペラジン酢酸の種々の活性エステルの調製）
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｎ−置換ピペラジン酢酸（その同位体富化された変形を含む）の活性エステルの調製方法、ならびに、Ｎ−置換ピペラジン酢酸エステルそれ自体およびその同位体富化された変形に関する。上記活性エステルは、任意の活性エステルであり得る。いくつかの実施形態では、上記活性エステルは、以下の式：
のアルコールまたはチオールを使用して形成され得、ここで、ＸはＯまたはＳであるが、Ｏが好ましい。いくつかの他の実施形態では、上記活性エステルは、以下の式：
のアルコールまたはチオールを使用して形成され得、ここで、ＸはＯまたはＳであるが、Ｏが好ましい。
いくつかの実施形態では、上記活性エステルは、中間体のイミダゾリドを介して調製され得る。この方法に従って、Ｎ−置換ピペラジン酢酸エステル（その同位体富化された変形を含む）は、イミダゾリドに変換され得る。次いで、そのように調製されたイミダゾリドは、選択されたアルコールと反応され、それによって、選択されたアルコールの活性エステルを生成し得る。
図１６Ａおよび実施例１９に関して、この手順を使用して、２，２，２−トリフルオロエタノールおよび１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールの活性エステルが調製された。上記図面および実施例にしたがって、Ｎ−メチルピペラジン酢酸（４８）のフェニルエステルは、トリメチルシリルイミダゾール（ＴＭＳ−イミダゾール）およびナトリウムフェノキシドで処理され、Ｎ−メチルピペラジン酢酸（４９）のイミダゾリドを形成した。次いで、そのイミダゾリド（４９）を、２，２，２−トリフルオロエタノールまたは１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩ−ＯＨ）のいずれかと反応させ、ビス−酸塩として、それぞれ、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の所望の活性エステル（５０）または（５１）を生成した。
いくつかの他の実施形態では、上記活性エステルは、Ｎ−置換ピペラジン酢酸（その同位体富化された変形を含む）を酸塩化物へ変換し、その後、その酸塩化物と選択したアルコールとを反応させ、それによって、その選択したアルコールの活性エステルを生成することにより、調製され得る。
図１６Ｂおよび実施例２０に関して、Ｎ−メチルピペラジン酢酸のＮＨＳエステルおよびＮＨＰエステルの調製は、この一般的手順を使用して例示される。上記図面および実施例に従って、Ｎ−メチルピペラジン酢酸は、塩化オキサリルで処理され、酸塩化物（５２）を生成する。次いで、その酸塩化物はＮＨＰまたはＮＨＳのいずれか、および固相塩基で処理され、それによって、遊離のピペラジン塩基として（酸塩としてではない）、それぞれ、活性エステル（５３）または（５４）を生成する。
図１６Ｂはまた、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）エステル（５５）の生成に対する塩化オキサリルの適用を例示し、ここで、溶液相塩基（例えば、トリエチルアミン）が使用される。この反応は、その溶液相塩基を用いて良好に進行したが、その塩の塩酸塩は、除去するのが困難であることが証明された。固相塩基の適用は、この懸念を回避する。
さらなるいくつかの他の実施形態では、上記活性エステルは、Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルを形成するために所望されるアルコールのトリハロ酢酸エステルでの、Ｎ−置換ピペラジン酢酸（その同位体富化された変形を含む）の処理により調製され得る。この文脈において、ハロとは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいうが、好ましくは、フッ素および塩素をいう。上記トリハロ酢酸エステルは、一般式：
を有し、ここで、Ｈａｌとは、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）をいい、ＬＧとは、脱離基のアルコールをいう。トリハロ酢酸エステルの脱離基（ＬＧ）は、以下の一般式：
を有し得、ここで、ＸはＯまたはＳであるが、好ましくはＯである。脱離基（ＬＧ）を含むＮ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルは、首尾よく、同定されたトリフルオロ酢酸エステル（ここで、ＸはＯである）を使用して調製された。
この手順は、Ｎ−置換ピペラジン酢酸（ここで、そのＮ−置換ピペラジン酢酸は酸塩形態または両性イオン形態である）に適用され得る。そのＮ−置換ピペラジン酢酸は、アルコールのトリハロ酢酸エステルと反応され得、それによって、Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルを生成し得る。ピペラジン環の塩基性窒素原子を脱保護し得る塩基は、出発物質がＮ−置換ピペラジン酢酸の酸塩である場合、生成物の形成を誘導するために必要とされるような反応に添加され得る。Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルは、それ自体で、モノ−酸塩またはジ−酸塩（例えば、モノ−ＴＦＡ塩、モノＨＣ１塩、ビス−ＴＦＡ塩またはビス−ＨＣｌ塩）として単離され得る。塩形態でも塩形態でなくても、水和物形態（すなわち、１つ以上の複合体化重水分子または軽水分子）で存在する同位体富化された活性エステル化合物もまた、企図される。トリハロ酢酸エステルがＮ−置換ピペラジン酢酸と反応される場合、その生成物は：
またはその塩形態および／または水和物形態であり得、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは先に定義されている。基ＬＧは、標識される文先物の反応性基により置き換えられる活性エステルの脱離基である；本質的に、上記脱離基は、活性エステルを形成するのに使用されるアルコールである。
特定のトリハロ酢酸エステルは、市販されている。例えば、ペンタフルオロフェノールおよび４−ニトロフェノールのトリフルオロ酢酸エステルは、商業的供給源から購入され得る。しかし、他のものは、所望のアルコールと無水トリハロ酢酸とを反応させることにより得られ得る。以下の表２に関して、ペンタクロロフェノール（Ｐｃｐ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（Ｄｈｂｔ）、ＮＨＳ、３−ニトロフェノール（３−ＮＰ）およびＮ−ヒドロキシピロリジノン（ＮＨＰ）のトリフルオロ酢酸エステルは、それぞれのアルコールと無水トリフルオロ酢酸とを反応させることにより調製された。そのような反応の一般手順は、実施例２１に見られ得る。他の活性エステルの形成に適切なトリハロ酢酸エステルを生成するために使用され得る他のアルコールもまた、使用され得る。
図１６Ｃは、ＮＨＳエステルとしての１１４および１１５標識試薬の生成を例示する。したがって、上記手順は、首尾よく、Ｎ−置換ピペラジン酢酸の同位体富化活性エステルの生成に適用された。これらの活性エステル試薬は、ピペラジン塩基のビス−ＨＣｌ塩からビス−ＨＣｌとして生成された。
図１６Ｄは、この一般的プロセスを使用して生成された、多くの他のＮ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの生成を例示する。当業者に理解されるように、この手順は、一般的で、確固たるものであり、そして多くのＮ−置換ピペラジン酢酸誘導体の多くの他の活性エステルの生成に適用され得る。
したがって、同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物の活性エステルは、１つ以上の重原子同位体、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体、４つ以上の重原子同位体、５つ以上の重原子同位体、６つ以上の重原子同位体または６つより多くの重原子同位体を含み得る。ピペラジン環の各窒素原子は、独立して、１４Ｎまたは１５Ｎであり得る。ピペラジン複素環およびＮ−酢酸部分における各炭素原子は、独立して、１２Ｃまたは１３Ｃであり得る。上記構造における各酸素原子は、１６Ｏまたは１８Ｏであり得る。
（Ｅ．同重体標識試薬のセットの調製についての同位体組込み経路）
図１７Ａは、１１４、１１５、１１６および１１７と同定された４つの同重体標識試薬の生成に対してとられる一般的経路を例示する。これらの命名は、各試薬が質量分析計でのフラグメンテーションの際に生成する「特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）イオン」に基づく（図１７Ｂ）。この「特徴イオン」は、多重アッセイにおける異なるサンプルに関連する情報を逆重畳積分するために使用され得る。
図１７Ａに例示される経路は、Ｎ−置換ピペラジン酢酸およびその活性エステルの生成について上に示される手順を利用する。特に、適切な同位体標識されたグリシンは、適切な同位体標識されたＮ−置換ピペラジン（すなわち、Ｎ−メチルピペラジン）の調製に使用された。その標識Ｎ−メチルピペラジンおよび非標識Ｎ−メチルピペラジンは、同位体標識されたブロモ酢酸誘導体で処理され、続いて１８Ｏ富化を行うかまたは行わず、それによって、所望の構造のＮ−メチルピペラジン酢酸化合物を生成し得る。
これらの適切に標識されたＮ−メチルピペラジン酢酸化合物は、本願の場合において、ペプチドのような分析物とのカップリングのために、活性エステル（例えば、ＮＨＳエステル）への変換により、標識試薬として使用された。しかし、上記分析物は、任意の分析物であり得る。上記標識反応は、２つ以上の異なる同重体標識で標識した同一の分析物を含む標識された分析物の混合物を生成した。
先に述べたように、標識された分析物の混合物は、質量分析計において分析され得る。この質量分析計において、標識された分析物は、フラグメント化し、独特のレポーターフラグメントイオン（すなわち、特徴イオン）を生成する。その独特のフラグメントイオンは、質量分析計で観察されるために、正または負のいずれかに荷電されなければならない。図１７は、１１４、１１５、１１６および１１７標識試薬のレポーターフラグメントイオンについての異なる可能な構造を例示する。
（Ｆ．同位体富化の状態）
種々のＮ−置換ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジン酢酸およびＮ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルは、各重原子同位体について８０％を超える同位体純度の出発物質を用いて調製され得る。その同位体純度は、いくつかの出発物質において、各重原子同位体について９３％より大きくあり得る。他の出発物質において、同位体純度は、各重原子同位体について９６％より大きくあり得る。さらに他の出発物質において、同位体純度は、各重原子同位体について９８％より大きくあり得る。１６Ｏから１８Ｏへの変換を行う場合、重原子同位体の９６％以上の同位体純度（酸素原子１個あたり）のカルボン酸基を慣用的に得ることが可能である。
特定の場合において、１６Ｏと交換され得る１８Ｏを除いて、出発物質の同位体純度および組成は、一般的に、生成物の同位体純度に直接言い換えられる。さらに、１８Ｏに関して、９６％を超える同位体純度（原子１個あたり）は、本明細書中に記載される方法を使用して達成され得ることが示されている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、各重原子同位体について少なくとも８０％の同位体純度を有する、Ｎ−置換ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジン酢酸および／またはＮ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルに関する。いくつかの他の実施形態では、本発明は、各重原子同位体について少なくとも９３％の同位体純度を有する、Ｎ−置換ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジン酢酸および／またはＮ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルに関する。さらなるいくつかの他の実施形態において、本発明は、各重原子同位体について少なくとも９６％の同位体純度を有する、Ｎ−置換ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジン酢酸および／またはＮ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルに関する。なおさらなる他の実施形態において、本発明は、各重原子同位体について少なくとも９８％の同位体純度を有する、Ｎ−置換ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジン酢酸および／またはＮ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルに関する。
（Ｇ．Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルでの分析物の標識）
一般的に、Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルは、求電子性であり、そして分析物の求核基と反応され、それによって、標識された分析物を生成し得る。いくつかの実施形態では、上記標識試薬は、担体に結合され得る。活性エステルは、チオール基と反応され得、そしてより少ない程度まで、ヒドロキシル基と反応し得る。しかし、活性エステルは、アミノ基との反応に対して特に十分に適している。
Ｎ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルは、溶液中で分析物と反応され、それによって、標識された分析物を生成し得る。標識を達成するために使用される溶液は、分析物および標識試薬の性質に依存して選択され得る。標識試薬および／または分析物が可溶性であるか、または少なくとも部分的に可溶性であるように、条件が選択され得る。分析物は生体分子であり得るので、標識条件は、水性であるように選択される得る。水性条件は、標識試薬および／または分析物の溶解度を上昇させる有機修飾因子を含み得る。有機修飾因子は、水混和性であり得、そしてこれらとしては、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノールまたはｎ−ブタノールもしくはｔ−ブタノール）、エーテル（例えば、テトラヒドロフランまたはジオキサン）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）などが挙げられ得るが、これらに限定されない。その反応は、好ましいイオン強度および／またはｐＨの条件下で実施され得る。
一般的に、水溶液のｐＨは、緩衝剤で調節され得る。そのｐＨは、４〜１０の範囲内に調整され得る。そのｐＨは、この範囲の外側に調整され得る。非水性反応の塩基性度は、非求核性有機塩基の添加によって調節され得る。適切な塩基の非限定的な例としては、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）が挙げられる。あるいは、上記ｐＨは、（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）または４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）のような生物学的緩衝剤を使用して調節され得る。炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウムのような無機緩衝剤もまた、ｐＨを調節するために使用され得る。上記緩衝剤が標識試薬と反応しないように、非求核性緩衝剤が使用され得る。
Ｎ−メチルピペラジン酢酸の同重体標識試薬の４つ全て（１１４、１１５、１１６および１１７；図１７Ａを参照のこと）は、ＮＨＳエステルとして生成された。これらの試薬は、例示的なセットの同重体標識試薬を含む。２つ以上の試薬が、ペプチド（消化タンパク質から得られるペプチド（分析物）を含む）を標識するために使用された（実施例２４および２６を参照のこと）。試薬のセット（２つ以上の試薬）は、本明細書中に記載のような一般的手順を使用して、プロテオーム分析を含む多重分析に適切であると示された。
上記試薬は標識試薬であり、非ポリマーの低分子量同重体化合物であるので、それ以外ではスペクトルを複雑にし得るＭＳまたはＭＳ／ＭＳモードのいずれかにおいて顕著なシグナル分裂は存在しない。
（Ｈ．フラグメント化された場合のＮＭＰＡＡ同重体標識試薬の一般的特性）
図１７Ｃは、１１４、１１５、１１６および１１７標識試薬の特徴イオンについて２つの可能な構造の例示である。妥当であり得る代替の化学構造が存在するので、参照は、その特徴イオンの分子式に対してなされる。軽特徴イオンの分子式は、Ｃ６Ｈ１３Ｎ２ ＋である。同位体富化された１１４、１１５、１１６および１１７特徴イオンの分子式は、それぞれ：ｌ３ＣＣ５Ｈ１３Ｎ２ ＋、ｌ３ＣＣ５Ｈｌ３ ｌ５ＮＮ＋、ｌ３Ｃ２Ｃ４Ｈ１３ １５ＮＮ＋およびｌ３Ｃ３Ｃ３Ｈ１３ １５ＮＮ＋である。
図１８および１９に関して、フラグメント化された場合の同重体標識試薬の一般的特性が例示される。その同重体標識試薬は、レポーター、バランス（ｂａｌａｎｃｅ）および分析物反応基を含むと考えられ得る。一旦分析物が標識されると、その分析物は、バランスに直接連結され得る。
例示されるように、レポーターをバランスに連結させる結合、およびそのバランスを分析物（または分析物の反応基）に連結させる結合が存在する。解離エネルギーレベルに供された場合、これらの結合は、フラグメント化され得る。いくつかの実施形態では、それら結合のうちの１つのフラグメンテーションは、他の結合のフラグメンテーションをもたらす。この点において、部分標識された分析物は、ＭＳ／ＭＳスペクトルにほとんど観察されないか、観察されない。これは、よりきれいなスペクトルを生じる。上記標識がフラグメント化される場合、上記レポーターは、特徴イオンを生成し、そして上記バランスは、中性損失を生じるように選択され得るか、またはそれはまた、フラグメントイオンを生成し得る。上記バランスが中性損失（非荷電フラグメント）を生じる場合、そのフラグメントは、ＭＳ／ＭＳスペクトルに観察されない。これは、よりきれいなスペクトルを生じる。
図１８に例示されるように、Ｎ−メチルピペラジン標識試薬の同重体セットの試薬の各々は、レポーター、バランスおよび分析物反応基を含む。標識された分析物は、図１９Ａに表され、質量分析計において生成したフラグメントの質量分析は、図１９Ｂに示される。標識された分析物の混合物についての結合フラグメントテーションは、図１９Ｃに例示される。これらの試薬は、好ましいフラグメント化特徴を示すことが決定されている。具体的に、それらは、ほとんど観測されない部分的に標識された分析物を生成する傾向がある。さらに、カルボニルバランス基は、主に、中性損失によりフラグメント化すると考えられる。さらに、標識のレポーターは２つの塩基性窒素基を含むので、そのレポーターは、質量分析計において、特徴イオンおよび標識された分析物の両方について、強いイオン信号を生じる。
図１９Ｃは、４つの異なるサンプル由来のペプチドが、同重体標識試薬のセットの異なる標識試薬の各々（すなわち、１１４、１１５、１１６および１１７）で標識され得るプロセスを例示する。その標識されたペプチドは、サンプル混合物を形成するために混合され得、ＭＳ分析によって分析され得る。４つの区別を付けて標識されたペプチドは、それら全てが同じ総質量を有するので、ＭＳにおいて単一ピークとして現れる。解離エネルギーに供された後、その後の質量分析は、レポーター（特徴イオン）の質量およびペプチドの娘フラグメントイオンの質量を提供する。
（Ｉ．サンプル混合物の調製）
一旦２つ以上のサンプルが、セットの異なる同重体標識で区別を付けて標識されると、サンプル混合物は、標識された分析物のサンプルを混合することにより簡単に調製され得る。そのサンプルは、任意のタイプであり得る。サンプルのうちの１つ以上がコントロールサンプルであり得、サンプルのうちの１つ以上が試験サンプルであり得る。各異なる標識試薬の独特のレポーター部分は、ＭＳ／ＭＳ条件下で独特の特徴イオンを生成するので、上記混合物の各サンプルの標識された分析物は、その混合物が分析されたときが起源であるサンプルに戻って関連し得る。
上記サンプル混合物は、種々の量の各サンプルを混合することによって、調製され得る。上記サンプル混合物は、当量の各サンプルを混合することによって調製され得る。このようにして、質量分析計で観察された特徴イオンについてのピーク強度に基づいて、各サンプルにおける各分析物の量（分析物ごと）の直接比較ができる。当量のサンプルが一緒に混合されていてもいなくても、サンプル混合物を調製するために使用されるサンプルの量は、記録され得る。当量でないサンプルがサンプル混合物を調製するために使用される場合、この情報から適切な比が計算され得、それによって、サンプル混合物中の分析物の相対量および／または絶対量（多くの場合、濃度または量で表される）は、特徴イオンピークの強度に基づいて決定され得る。
例えば、分析物として消化ペプチドを含む２つ以上のサンプル（各サンプルは、同重体標識試薬（１１４、１１５、１１６または１１７；図１７Ａを参照のこと）の１つで標識されている）は、タンデム型質量分析計で分析され得る混合物を形成するために混合され得る。この第１のＭＳ分析の後、２つ以上の異なる同重体標識で標識された同一分析物のフラグメントイオンの混合物を表す特定の質量の選択されたイオンは、その選択されたイオンのフラグメンテーションを引き起こす解離エネルギーに供され得る。上記選択されたイオンおよびそのフラグメントは、次いで、質量分析計で再分析され得、ここで、分析物および分析物の娘イオンを標識するために使用される同重体標識試薬の特徴イオンが観察され得る（図１９Ｃを参照のこと）。サンプル中の分析物の相対定量が決定され得る。絶対定量は、標識された標準として既知量のペプチドがサンプル混合物に添加された場合に可能である。
以下の実施例は、開示された組成物および方法の例示であり、本発明の範囲を限定することは意図されない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更および改変は、当業者に明らかであり、本発明を種々の使用および条件に適合させるためになされ得る。したがって、他の実施形態が包含される。
（Ａ：モルホリン誘導体の合成）
（実施例１；モルホリン酢酸の合成）
ブロモ酢酸（２ｇ、１４．４モル）を、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２０ｍＬ）中のモルホリン（３．７６ｇ、４３．２モル）の撹拌溶液に滴下した。その溶液を、室温で３日間撹拌した。白色固体．（４．１７ｇ）を濾過し、ＴＨＦ（１００ｍＬ）で洗浄し、そして温エタノール（ＥｔＯＨ）から再結晶化させた。収量：２．５９ｇ：ＩＲ：１７４０ｃｍ−１。モルホリン酢酸の２つの異なる同重体変形について、１−１３Ｃ−ブロモ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＮ２７、９３３−１）または２−１３Ｃ−ブロモ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＮ２７、９３５−８）のいずれかを、ブロモ酢酸の代用とした。
（実施例２；モルホリン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成）
ジメチルホルムアミド（乾燥、１．７５ｇ、０．０２４Ｍ）を、テトラヒドロフラン（乾燥、３０ｍＬ）中に溶解した。この溶液を、テトラヒドロフラン（乾燥、２０ｍＬ）中に溶解した塩化チオニル（２．８５ｇ、０．０２４Ｍ）の撹拌溶液に滴下し、氷浴で冷却した。完全に添加し、氷上に３０分間置いた後、その氷浴を除去し、固体のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２ｇ、０．０１７モル）を添加し（これは、完全に溶解した）、直後に、固体の予め粉末化したモルホリン酢酸［または−１−ｌ３Ｃもしくは−２−ｌ３Ｃモルホリン酢酸］（３．６４ｇ、０．０１６Ｍ）を添加した。そのモルホリン酢酸はゆっくりと溶解し、急速に濁った均一溶液を得た。その反応を一晩室温で力強く撹拌し続けた。白色固体をテトラヒドロフランで洗浄し、減圧下で乾燥させ、３．６５ｇ（６７％）と秤量した。ＩＲスペクトル１８２８．０ｃｍ−１、１７９０．０ｃｍ−１、１７３６．０ｃｍ−１。
（実施例３：２つのサンプルにおける分析物決定および相対的定量）
１００ ｐモル量の凍結乾燥したＧｌｕ−フィブリノペプチドＢ（Ｓｉｇｍａ）を、氷冷した０．５Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．８）中の、ＩまたはＩＩ（構造については図１Ａを、そして調製については実施例１および２を参照のこと）のいずれかの２００μｌの新しく作製した２％ｗ／ｖ溶液と、３０分間氷上で反応させた。その反応を、ＴＦＡを０．５％ ｖ／ｖの最終濃度になるまで添加することにより、停止させた。次いで、修飾されたペプチドを、区別を付けて標識されたペプチドの１：１０〜１０：１の範囲に大体わたるように、種々の予め決定した割合で混合した。各ペプチド混合物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ１８ Ｚｉｐ−Ｔｉｐを使用する逆相脱塩により個々に精製した。過剰な試薬および緩衝液は、逆相充填上には保持せず、したがって、ＭＳ分析の前に効率的に除去された。次いで、その混合物（０．５μｌ）を、ＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットし、５０％アセトニトリル水溶液中０．５μｌの１％ ｗ／ｖ α−シアノ桂皮酸をその上にスポットし、そして各サンプルを、ＱＴＯＦ分析計に取り付けられたＭＡＬＤＩ源を使用して分析した。
図２は、試薬ＩおよびＩＩで修飾されたＧｌｕ−フィブリノペプチドの１：１混合物から得られたＭＳスペクトルの展開プロットである。ｍ／ｚ １６９９におけるピークは、Ｎ−末端で修飾されたＧｌｕ−フィブリノペプチドの質量を表し、予測されたとおり、２つの異なる形態のペプチドのｍ／ｚにおいて観測可能な差異は存在しない（図１Ａ（ＩＩＩ）および１Ａ（ＩＶ）を参照のこと）。その修飾されたペプチドは、同重体である。ピークについて観察された同重体クラスターは、１つの種について予測されたとおり正確である。
次いで、ｍ／ｚ １６９９の１価に荷電した前駆体イオンを、低エネルギーＣＩＤ（約−７０Ｖの衝突オフセット）によるフラグメント化について選択し、図３に見られるＭＳ／ＭＳスペクトルを生じた。予測されたとおり、観測されたイオン系列は、タイプｂ−およびタイプｙ−が優勢であった。これらのイオン全ては、それらが区別を付けて標識されたペプチド種の１：１混合物を構成したと示さずに、単一種として現れた。例えば、ｍ／ｚ １０５６．５における顕著なｙ−イオンの展開は、図４のように展開プロットで示され、ｍ／ｚ ８８６．３における顕著なｂ−イオンは、図５のように展開プロットで示される。
しかし、約１００ ｍ／ｚにおけるスペクトルの厳密な試験（図６）は、両方の種ＶＩＩおよびＶＩＩＩの存在を明らかにし（図１Ｂ）、これは、それぞれ、種ＶおよびＶＩ（図１Ｂ）のフラグメントテーション生成物である。ｍ／ｚ １２８．１ではピークは観察されず、それによって、種ＶおよびＶＩは、観測されるのに十分なほど安定でないことを示す。したがって、本実施例において、ペプチドのカルボニル基とアミノ末端アミノ酸との間のアミド結合のフラグメント化は、レポーター／リンカー部分のその後のフラグメント化および中性ＣＯとしてのカルボニル部分の損失を誘導した。ピーク積分を、機器に備わった計測器を使用して実施した。約６％の天然に存在する第２のＣ−１３同位体寄与についての比較にしたがって、測定された、ＶＩＩＩ／ＶＩＩ（１０１／１００）の相対比は、１．０３（予測値１．００）であった。表１は、天然に存在する第２のＣ−１３寄与について修正して、調製されたさらなる実験混合物についての実測比 対 観測比（強度ｍ／ｚ１０１ ／ ｍ／ｚ１００として表される割合）を示す。このデータはまた、図７で図面で表される。平均誤差＜１０％で、観測値と予測値との間に良好な一致が存在する。
（実施例４：プロテオミクス分析）
実際に、代表的なプロテオミクス分析を以下のように実施し得る。比較用の全細胞タンパク質抽出物（例えば、サンプルＡおよびＢ）を、トリプシンまたは別のタンパク質溶解酵素で別々に消化させる。得られたペプチド混合物を、例えば、化合物ＩおよびＩＩと別々に反応させ、ペプチドのＮ−末端およびリシンアミンの完全な修飾を得る。例えば、サンプルＡは、化合物Ｉと反応され得、サンプルＢは、化合物ＩＩと反応され得る。次いで、改変ペプチド／タンパク質を含むサンプルの各々を、（代表的に、多次元ＨＰＬＣを使用する）クロマトグラフィー分離の前に一緒に混合し、ＭＳ技術およびＭＳ／ＭＳ技術によって分析する。標識は、上記基が同重体である場合、１回の標識／タグ化処理により実施し得る（第２の試薬でのリシン基の先の保護は必要とされない）。
次いで、標識されたタンパク質／ペプチドの混合物を、上記実施例３に記載のように、クロマトグラフィーで分離し、そして溶離液またはその画分を質量分析計で分析する。有効感度はまた、三連四重極質量分析計またはＱトラップ質量分析計を使用して顕著に増加し得、ここで、１００および１０１のｍ／ｚ領域は、前駆体イオンモードでモニタリングされる。その２つの「特徴」ピークの相対比を、サンプルＡおよびサンプルＢの各々における目的の各ペプチド／タンパク質分析物の比と直接相関させる。本明細書中で使用される場合、「特徴」ピークは、レポーターのピークである。
（実施例５：分析物決定および内部標準に対する定量）
比較用の全細胞タンパク質抽出物（例えば、サンプルＡおよびサンプルＢ）を、別々にトリプシンで消化する。上記のように、得られたペプチド混合物を、ＸおよびＸＩ（図８）と別々に反応させ、ペプチドのＮ−末端およびリシンアミンの完全な修飾を実質的に得る。例えば、サンプルＡペプチドは、Ｘと反応され得、サンプルＢペプチドは、ＸＩと反応され得る。次いで、実質的に修飾されたペプチドを含むサンプルＡおよびＢの各々の既知量を、一緒に混合する。ここで、ＡおよびＢの合わせた混合物に、正確に決定した量で、サンプルＡおよびＢの混合物中に存在し得るペプチドに対するアミノ酸配列および／または翻訳後修飾（例えば、リン酸化）に正確に対応する合成ペプチドのセット（１つ以上）を添加し、ここで、その合成ペプチドは、同重体標識試薬のセットの別のメンバー（例えば、化合物ＸＩＩまたはＸＩＩＩ、図８を参照のこと）で標識される。ここで、先に記載したように、サンプルＡ、サンプルＢ由来のペプチドおよび合成内部標準ペプチドを合わせた混合物を、例えば、多次元ＨＰＬＣによるクロマトグラフィーでの分離に供し、次いで、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ技術により分析する。同一配列のサンプルＡ、Ｂおよび合成対応物由来の当量の標識されたペプチドの全ては、同重体であり、そして実質的に同一のクロマトグラフィー特性を有する。「実質的に同一のクロマトグラフィー特性」により、区別を付けて標識されたが他の点では同一であるペプチドの分離がほとんどなかった（あったとしてもわずかである）ことを、本発明者らは意味する。ＭＳ／ＭＳ分析にしたがって、サンプルＡおよびＢ由来のペプチドの絶対濃度を、同重体セット（例えば、ＸＩＩまたはＸＩＩＩ）のさらなるメンバーで標識された標準ペプチドに起因するレポーターの強度（「特徴ピーク」）に対する、Ｘ（サンプルＡ）およびＸＩ（サンプルＢ）についてのレポーターの相対強度の比較により、正確に決定し得る。
前述は、２つのサンプル（すなわち、サンプルＡおよびＢ）の記載であるが、このプロセスは、多くの実際の方法に広げられ得る。例えば、標識／タグ化試薬の多量の十分なセットが存在するという条件で、同時に分析される多くのサンプルが存在し得る。
二重（または、分析されるより多くのサンプルが存在する場合はそれより多く）の内部標準が存在し得る（例えば、サンプルＡペプチドは、（既知の絶対濃度の）試薬ＸＩＩで標識された合成ペプチドで「スパイク（ｓｐｉｋｅ）」され得、サンプルＢペプチドは、（既知の絶対濃度の）試薬ＸＩＩＩで標識された合成ペプチドでスパイクされ得る）。上記のように、全てが合わせられ、分離され得、そして分析される場合、サンプルＡペプチドは、化合物ＸＩＩについての特徴ピークに対して定量され得、サンプルＢペプチドは、化合物ＸＩＩＩについての特徴ピークに対して定量され得る。
（実施例６：ピペリジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの例示的な合成）
ブロモ酢酸を、テトラヒドロフラン（または別の適切な非求核性溶媒）中に溶解し、そしてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、または別の適切な非求核性溶媒）中に過剰のピペリジンを含有する撹拌溶液に滴下した。その溶液を室温で１〜３日間撹拌した。その固体を濾過し、ＴＨＦ（または別の適切な非求核性溶媒）で洗浄し、そして必要に応じて再結晶化した。ピペリジン酢酸の２つの異なる同重体変形について、１−１３Ｃ−ブロモ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＮ２７、９３３−１）または２−１３Ｃ−ブロモ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＮ２７、９３５−８）のいずれかを、ブロモ酢酸の代用とした。異性体置換ピペリジンは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのような供給源から入手し得る。
酢酸誘導体を活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）に変換するために、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をテトラヒドロフラン（または別の適切な非求核性溶媒）中に溶解する。この溶液を、テトラヒドロフラン（または別の適切な非求核性溶媒）中に溶解した（ＤＭＦのモル量を基礎として）等モル量の塩化チオニルの撹拌溶液に滴下し、氷浴で冷却する。完全に添加し、氷上に３０分間置いた後、その氷浴を除去し、固体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、直後に、ピペリジン酢酸（または−１−ｌ３Ｃもしくは−２−ｌ３Ｃピペリジン酢酸）を添加する。その反応を一晩室温で力強く撹拌し続ける。生成物ピペリジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、次いで、できるかぎり濾過のみによって反応混合物から単離する。再結晶および／またはクロマトグラフィーは、必要に応じて、粗製生成物を精製するために使用され得る。
（実施例７：ピペラジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの例示的な合成）
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解した２当量のピペラジンを含む溶液を、テトラヒドロフラン中に溶解した（ピペラジンの量と比較して）１当量のブロモ酢酸を含む溶液に滴下した。２つの溶液は、実用的な程度に濃縮するべきである。生じた反応溶液を、室温で１〜３日間撹拌する。その固体を濾過し、ＴＨＦで洗浄し、そして必要に応じて再結晶化する。ピペリジン酢酸の２つの異なる同重体変形について、１−１３Ｃ−ブロモ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＮ２７、９３３−１）または２−１３Ｃ−ブロモ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＮ２７、９３５−８）のいずれかを、ブロモ酢酸の代用とし得る。
酢酸誘導体を活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）に変換するために、乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１．７５ｇ、０．０２４Ｍ）をテトラヒドロフラン中に溶解し得る。この溶液を、テトラヒドロフラン中に溶解した（ＤＭＦのモル量を基礎として）等モル量の塩化チオニルの撹拌溶液に滴下し、氷浴で冷却し得る。完全に添加し、氷上に３０分間置いた後、その氷浴を除去し、固体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、直後に、ピペリジン酢酸（または−１−ｌ３Ｃもしくは−２−ｌ３Ｃピペリジン酢酸）を添加し得る。その反応を一晩室温で力強く撹拌し続け得る。次いで、生成物ピペリジン酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、できるかぎり濾過のみによって反応混合物から単離し得る。次いで、再結晶またはクロマトグラフィーが、粗製生成物を精製するために使用され得る。
（実施例８：Ｎ，Ｎ’−（２−メトキシエチル）−グリシン活性エステルの例示的な合成）
１．１モルのビス（２−メトキシエチル）アミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に、５００ｍｍｏｌのｔｅｒｔ−ブチルクロロアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を滴下した。その反応を３日間撹拌し、次いで、後処理した。その最終反応内容物に、２５０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）および２００ｍＬの水を添加した。この撹拌溶液に、少しずつ、３００ｍｍｏｌの固体炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を添加した。完全に混合した後、層を分離させた。ＤＣＭ層を一度、ある容量の水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、そしてエバポレートして、６６．３ｇの非常に薄い黄色の油状物を得た。この粗製生成物を６０℃（２００〜５００μＭＨｇ）でＫｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留し、５８．９ｇの透明で無色の油状物（２３８ｍｍｏｌ；９５％）を得た。
精製した（撹拌）Ｎ、Ｎ−（２−メトキシエチル）−グリシン−ｔｅｒｔ−ブチルエステルに、１２．１ｍＬの濃塩酸をゆっくりと添加した。その反応を一晩撹拌し、次いで、副生成物（例えば、水、ＨＣｌ、イソブチレン）を真空蒸発により除去した。１Ｈ−ＮＭＲ分析は、ｔ−ブチルエステルが加水分解されたと示したが、依然として水およびＨＣｌが存在すると考えられた。その粗製生成物を、２回、アセトニトリル（ＡＣＮ）から共蒸発したが、依然として水およびＨＣｌが存在した。不純物を取り除くために、４．４ｇのアリコートを、その粗製生成物から取り出し、１３５〜１５５℃でＫｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留した（蒸留が始まった後、圧力を急速に下げながら、１００〜２００ μＭ Ｈｇ）。収量４．２ｇ（１８．４ｍｍｏｌ；９５％回収率の粘度のある透明で無色の油状物）。その蒸留した生成物は、任意の水またはＨＣｌを全く含まなかった。
次いで、任意の適切に同位体標識した置換または非置換のＮ、Ｎ’−（２−メトキシエチル）−グリシンの活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を、本明細書中に記載される方法のような当該分野で公知の方法によって調製し得る。
（実施例９：標識／タグ化試薬を含む固体担体を調製するための例示的な方法）
「立体障害のある切断可能なリンカー」を含む市販のペプチド合成樹脂を、少なくとも２倍過剰のアミノアルキルピペラジン（例えば、１−（２−アミノエチル）ピペラジン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ／Ｎ Ａ５、５２０−９）と反応させる；同位体変形を、本明細書中の記載と組み合わせて、図１２に例示されるプロセスによって作製し得る。「立体障害のある切断可能なリンカー」によって、リンカーは、切断可能なリンカーと反応される固体担体と原子または基との間に切断可能な共有結合を形成する２級原子または３級原子を含むことを、本発明者らは意味する。立体障害のある固体担体の非限定的な例としては、以下が挙げられる：塩化トリチル樹脂（トリチル−Ｃｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７４）、２−クロロ塩化トリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００２１）、ＤＨＰＰ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ Ｑ−１７５５）、ＭＢＨＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４００３７７）、４−メチル塩化トリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７５）、４−メトキシ塩化トリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７６）、ヒドロキシ（２−クロロフェニル（ｃｈｏｒｏｐｈｎｙｌ））メチル−ＰＳ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−０３４５）、リンク酸樹脂（Ｒｉｎｋ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｉｎ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｐ／Ｎ ０１−６４−０３８０、０１−６４−０２０２）、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７４）。次いで、上記担体を洗浄することにより、過剰の試薬を除去する。次いで、担体結合ピペラジンの第２級アミンを、トリエチルアミンのような第３級アミンの存在下で、過剰のブロモ酢酸と反応させる。次いで、その担体を洗浄することにより、過剰の試薬を除去する。カルボン酸の活性エステルを作製するために使用される方法に依存して（例えば、活性エステル合成にカルボン酸の塩が必要とされているか否か）、洗浄を、ビス−アルキル化ピペラジンの担体結合カルボン酸基をプロトン化するように調整されるｐＨを有するために選択し得る。次いで、その担体結合ピペラジンのカルボン酸基を、本明細書中に記載される方法のような、カルボン酸の酸エステルの生成について当該分野で公知の方法を使用して、活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）に変換させる。得られた固体担体を、その後、求核性官能基を有するサンプル（例えば、ペプチド）の分析物を標識／タグ化するために使用し得る。次いで、その標識／タグ化された分析物を、製造者の製造指示書により記載されるように、担体から放出させ得る。次いで、各切断反応の生成物を、サンプル混合物を形成するために組み合わせ得る。
（Ｂ．Ｎ−メチルピペラジン誘導体の合成）
一般的合成注記：他で特に述べない限り、化学物質は、商業的供給源より購入し、入手した状態で使用した。他で特に述べない限り、以下の化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ、Ｐ／Ｎ １０６２３２）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｐ／Ｎ １３０６７−２）、ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（Ｐ／Ｎ １２４２３０）、４−ニトロフェニル（４−ＮＰ）トリフルオロアセテート（Ｐ／Ｎ Ｎ２２６５７）、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）トリフルオロアセテート（Ｐ／Ｎ ３７７０７４）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）シアニド（４０７８５２）、１−（トリメチルシリル）イミダゾール（Ｐ／Ｎ １５３５８３）、フェニルブロモアセテート（Ｐ／Ｎ ４０４２７６）、ペンタクロロフェノール（Ｐｃｐ−ＯＨ、Ｐ／Ｎ Ｐ２６０４）、２，２，２−トリフルオロエタノール（Ｐ／Ｎ ３２６７４７）、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩ−ＯＨ、Ｐ／Ｎ １０５２２８）、（３−ヒドロキシ−１、２、３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ、Ｐ／Ｎ ３２７９６４）、塩化オキサリル（Ｐ／Ｎ ３２０４２０）、１−メチルピペラジン（Ｐ／Ｎ １３０００１）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ乾燥、Ｐ／Ｎ １８６５６２）ジクロロメタン（ＤＣＭ乾燥、Ｐ／Ｎ ２７０９９７）、ジオキサン中４Ｍ塩酸（ＨＣ１）溶液（Ｐ／Ｎ ３４５５４７）、ＨＣ１（気体、Ｐ／Ｎ、２９５４２６）、２％ＤＶＢ、Ｃａｐａｃｉｔｙ（塩基）：約２．６ｍｍｏｌ／ｇで架橋したポリスチレンに結合した３−ニトロフェノール（３−ＮＰ−ＯＨ、Ｐ／Ｎ １６３０３１）１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デセ−５−エン（ＴＢＤ）（ｓｓ−ＴＢＤ、Ｆｌｕｋａ、Ｐ／Ｎ ９０６０３）、Ｈ２ １８Ｏ（Ｉｓｏｔｅｃ、９５ １８Ｏ原子％（Ｐ／Ｎ ３２９８７８）または９９％ １８Ｏ原子％（Ｐ／Ｎ ４８７０９０））、Ｂｒｌ３ＣＨ２ＣＯＯＥｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＩＬ）、Ｐ／Ｎ ＣＬＭ−１０１０−５）、Ｂｒｌ３ＣＨ２ １３ＣＯＯＥｔ（ＣＩＬ、Ｐ／Ｎ ＣＬＭ−１０１１−１）、ＢｒＣＨ２Ｃ１８Ｏ１８ＯＨ（Ｉｓｏｔｅｃ、Ｐ／Ｎ ５９７０３１）。全ての水分感受性の反応を、窒素またはアルゴン雰囲気下で実施した。
同位体富化された出発物質を、概して、Ｉｓｏｔｅｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）のいずれかから入手した。一般的に、最も高度に富化された出発物質を入手し、同位体富化されたピペラジン誘導体の生成に使用した。しかし、出発物質の同位体富化の状態は、選択肢であり、これにより、当業者は、出発物質の価格（同位体富化の状態が多くなるにつれて、価格が高くなる）と最終生成物における富化同位体の純度に対する要件との間のバランスをとることを理解する。したがって、同位体富化された化合物の合成の最も実用的な方法は、常に最も一般的な合成経路を経由して進行するとは限らないことを、当業者は理解する。実際に、同一化合物の異なる同位体改変物に対して２つ以上の異なる経路が存在し得る。したがって、本明細書中に記載されるいくつかの反応および／または化合物について、種々の合成経路がとられ、したがって、以下に議論されている。これらの経路に関する特定の利点および懸念もまた、議論される。
（Ｉ．同位体標識されたＮ−メチルピペラジンの合成）
注記：非標識Ｎ−メチルピペラジン（１−メチルピペラジンとしても公知）は、種々の供給源から市販されている。しかし、同位体富化されたＮ−メチルピペラジン（在庫品目として）のいかなるタイプについても、供給源は見出すことはできなかった。しかし、適切に保護されたグリシンおよびサルコシンは、縮合、環化され得、そしてその生成物（ジケトン）は、還元されて、それによって、Ｎ−メチルピペラジンを生成することができることを決定した（図１を参照のこと）。さらに、１５Ｎおよび１３Ｃの同位体標識されたグリシンおよびその部分的に保護された変形（例えば、ｔ−ｂｏｃ保護アミノ酸）の全ての可能な置換物は、ＩｓｏｔｅｃまたはＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．のような供給源から市販されていた。したがって、これは、１つ以上の重原子を含む種々のＮ−メチルピペラジン化合物に対する有望な経路であると考えられる。適切に保護された（ｔ−ｂｏｃ）同位体富化されたグリシンおよび適切に保護されたサルコシンは、商業的供給源から購入され得、アミノ酸（例えば、グリシンおよびサルコシン）の保護が周知であるので、Ｎ−メチルピペラジンに対する合成経路の記載は、適切に保護されたアミノ酸から開始する（図１）。
（実施例１０：サルコシンエステルとｔ−ｂｏｃ−グリシンとの縮合のための一般的手順（図１３））
注記：サルコシンは、メチルエステルまたはエチルエステルのいずれかで市販される。これらのいずれもが、縮合反応に使用され得る。
丸底フラスコ（ＲＢＦ）に、１．１当量（ｅｑ．）のサルコシンエチルエステル（３１）および１当量のｔ−ｂｏｃ−グリシン（３０）（種々の同位体で標識したＮ−メチルピペラジンの生成のための同位体で標識したｔ−ｂｏｃ−グリシンを含む）を添加した。次いで、この固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）の添加によって溶解した（約２０ｍＬ／ｇのｔ−ｂｏｃ−グリシン）。この攪拌溶液に、１．１当量のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を添加し、次いでＤＣＭ中の１．１当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を添加した。数分以内に沈殿が形成された。この反応を、一晩攪拌した。この反応を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニタリングした。ｔ−ｂｏｃ−グリシンが、なお存在する場合、さらなるＤＣＭ中のＤＣＣを添加した。この反応が終了したと判断したとき、この固体を濾過し、そしてそのケークをＤＣＭでリンスした。次いで、生成物含有溶液を、エバポレートして乾燥した。
上記生成物を５０％酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）／ヘキサンを充填したカラムを使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。少量の５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン溶液を使用して、風乾した生成物を溶解／懸濁した（完全に溶解しない）。この溶液／スラリーを充填したカラム上にロードした。このカラムを５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出して、最小限に保持された生成物を得た。生成物含有画分をエバポレートして油状か、まだらな油状か、またはうろこ状の固体を得た（重原子同位体含量がより多い物質は、より固体の特徴を示すようにみえた）。
ＴＬＣ条件：ＥｔＯＡｃ（ニンヒドリンおよび加熱によって展開した）
生成物（３２） Ｒｆ値 約０．８５
ｔ−ｂｏｃ−グリシン（３０） Ｒｆ値 約０．３（幅広いテーリング）
サルコシン−ＯＥｔ（３１） ベースライン
ＮＭＭ サルコシンの真上に微かに見える。
（実施例１１：１−メチル−２，５−ジケトピペラジンの合成のための一般的手順（図１３））
０．５％の水を含む１：１のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ＤＣＭ溶液を調製した。この溶液を、上記縮合反応のカラム精製した生成物（３２）に添加した（１ｇの出発物質あたり約１０ｍＬ）。生じた溶液を３０分間攪拌し、次いでこの溶媒をロータリーエバポレーターによって除去した。次いで、エタノール（１ｇの出発物質あたり約１０ｍＬ）を、この反応フラスコに添加し、そしてこの溶液を、再び揮発させて乾燥した。この手順を、トルエンを用いて繰り返した。この生成物を、再び反応フラスコ中でエタノールに溶解し、そして無水炭酸カリウム（４当量）を添加した。この溶液を、短時間激しく泡立て、その後炭酸カリウムを添加した。反応混合物の液滴を除去し、水で希釈し、そして溶液のｐＨを決定した。このｐＨが、８を下回る場合、炭酸カリウムをさらに添加した。ｐＨが８より大きいことを一度確認し、この反応を一晩還流させた。次いで、この温かい反応混合物を、セライトのプラグに通して、過剰な塩を除去した。このケークを、無水エタノールで２回すすいだ。この濾液をより大きなフラスコに移し、そして揮発させて乾燥した。この生成物の泡状物質を、９：１の酢酸エチル−メタノール中に再溶解し、そしてシリカゲルのプラグに通した。次いでこのシリカゲルを、約４カラム容量の９：１の酢酸エチル−メタノールで洗浄した。全ての画分をエバポレートして乾燥させた。
注記および代替手順：ＴＦＡ／ＤＣＭ／Ｈ２Ｏ溶液によるｔ−ｂｏｃ基の脱保護に続いて、ＴＬＣ（ニンヒドリン／加熱は、Ｒｆ値０．８５のスポットの、その位置における暗赤褐色のスポットへの転換を示す）が行われ得る。脱保護の後、メタノール添加し、濃縮し、そしてメタノールによって再処理し、次いで２回目の濃縮を行い、そして真空中で乾燥して過剰のＴＦＡを除去することがまた、受容可能である。
いくつかの反応において、濃水酸化アンモニウム（１６ｍｍｏｌの出発物質あたり約６０ｍＬの大過剰量）を炭酸カリウムに対して代用した。（濃水酸化アンモニウムを、室温でこの反応に添加した場合、これは、白色の不溶性物質およびわずかに乳白色の反応混合物を生成した）。濃水酸化アンモニウムの添加後、このフラスコを、セプタムで密封して、アンモニアの喪失を防いだ。環化は、一晩（１２時間）の反応後に完了するようであるが、いくつかの場合においては、数時間にわたって６０℃に加熱する工程で十分であった。この反応を、ＴＬＣ（加熱によりＭｅＯＨ中の１０％リンモリブデン酸（ＰＭＡ）によって可視化される１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によってモニタリングした。この生成物は、Ｒｆ値０．５４に、青色のスポットとして現れた。脱ブロック物質（起点における赤褐色のスポット）が、ＰＭＡによって可視化され得ないことに起因して、別のＴＬＣを、相互参照としてニンヒドリン／加熱を使用して行った。
ＴＬＣ分析によって環化が完了したと判断した場合、この混合物を濾過し、そしてそのフラスコおよび固体をＤＣＭによってすすいだ。この濾液を濃縮し、そしてクロマトグラフィーの前に１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中に再溶解した。白色の蝋状固体を、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中に一部溶解し、そしてこの物質を超音波処理した。超音波処理は首尾よく混合物を溶解し、次いで、それをカラムに適用した。溶出した最初の画分は、主に白色の蝋状固体であった。主要な画分（ジオン（またはジアミド）生成物（３３））が、次に溶出し、その後、別の微量の不純物（Ｒｆ値０．３）が溶出した。不完全なＴＦＡ除去によりアンモニウムトリフレートの形成が生じる場合においては、この不純物は、生成物および二次的物質と共に同時に溶出した。第２のカラムを使用して、所望の生成物を完全に精製し得た。
このジオン（３３）の融点：１１６、１１７：モデル化合物について１３８〜１３９：ｌｉｔ：１３６〜１３９（Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ １８，４２３，１９８１）；１４２〜１４３（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ６１，４４５，１９２４）。
ＴＬＣ条件：９：１の酢酸エチル−メタノール（リンモリブデン酸および加熱によって展開する）
生成物 Ｒｆ値 約０．２
代替的なＴＬＣ条件：１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；加熱によって展開する
生成物（青色のスポット） Ｒｆ値＝０．５４。
（実施例１２：Ｎ−メチルピペラジンの合成のための一般的手順（経路Ａ；図１３））
硫酸ナトリウムの飽和溶液を調製した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（実施例１１で使用される物質に基づいて出発物質１ｍｍｏｌあたり４ｍＬ）を、実施例１１の手順を使用して形成したジケトピペラジンに添加した。この反応フラスコは還流冷却器を備え、そしてＴＨＦ中の３当量の１Ｍ ＬｉＡｌＨ４（ＬＡＨ溶液；ＬＡＨをＲｅｄ−Ａｌまたは他の還元試薬で置換することが可能であり得るが、これは試みなかった）を、滴下漏斗を用いて溶液に添加した。添加の開始において激しく水素が発生したが、これは添加を続けるとおさまった。この反応を加熱して４時間還流した。反応が完了した後、この溶液を室温まで冷却し、そして残りのＬＡＨを、飽和硫酸ナトリウム水溶液（添加したＬＡＨ溶液の１／４の容量）を非常にゆっくり添加してクエンチした。この反応は、灰色の懸濁液として出現した。
ＤＣＭを、この懸濁液に添加し（ＴＨＦの１／２容量）、そして灰色のゲル様固体を濾過によって除去した。次いでこのフラスコおよび濾過した固体を、ＤＣＭ（ＴＨＦの１／４の容量）で十分に２回洗浄した。その後、合わせた有機溶液（ＤＣＭ／ＴＨＦ）を、Ｎａ２ＳＯ４（固体−無水物）によって乾燥し、そして濾過した。（いくつかの初期の実験において、Ｎ−メチルピペラジンを油状物質（遊離塩基であり、ＴＦＡ塩またはＨＣｌ塩としてではない）として単離したが、この生成物は、揮発油であることが決定され、したがって高収率で単離されなかった）。
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボネート（３当量）をこの溶液に添加し、これを一晩攪拌しかつ通風した。ＴＬＣを使用して、この反応をモニタリングした。一旦完了したら、この溶媒をロータリーエバポレーターにより除去して液体を得た。この液体が、わずかに揮発性であることに起因して、溶媒の低減圧エバポレーションが推奨される（高い減圧条件は避けるべきである）。この生成物を、ＤＣＭ中に溶解し、そして酢酸エチル中の８％メタノールが充填されたシリカゲルカラム上にロードした。生成物を、酢酸エチル溶液中の８％メタノールを用いて溶出した。生成物含有画分を、ＴＬＣによって決定し、貯留し、そして液体になるまでエバポレートした。この液体を、脱保護反応に直接用いた。注記：このｔ−ｂｏｃ脱保護を、粗製Ｎ−メチルピペラジン生成物を単離する目的でのみ行ったが、このことは、次なる脱保護を必要とする。
ＴＬＣ−Ｎ−メチルピペラジン（ニンヒドリンによって展開する）
４：１：１のエタノール：水：水酸化アンモニウム
生成物 Ｒｆ値＝０．６
ＴＬＣ−Ｎ１−ｔ−Ｂｏｃ−Ｎ２−メチルピペラジン（ニンヒドリンによって展開する）
４：１のＤＣＭ−ＭｅＯＨ
生成物 Ｒｆ値＝０．５。
（脱保護）
０．５％の水を含む１：１のＴＦＡ、ＤＣＭ溶液を調製した。この溶液を、上記の還元から単離した物質に添加した（出発物質１ｇあたり約１０ｍＬ）。この反応を、３０分間攪拌し、次いでこの溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いて除去した。冷却器中に回収される溶媒がそれ以上観察されなくなったときに、溶媒のエバポレーションを終了した。ＴＦＡを、生成物の残渣に添加（出発物質１ｇあたり約２ｍＬ）して自由流動する（ｆｒｅｅ ｆｌｏｗｉｎｇ）溶液を形成した。このＴＦＡ溶液を遠心チューブに移し、そしてジエチルエーテルを添加して、生成物の塩を沈殿させた。この溶液を、ボルテックスを使用して混合した。次いで、この溶液を遠心分離し、そしてその上清をデカントして沈殿を回収した。次いで、その濾過物を、エーテルを用いてこの生成物を再懸濁することによって１回洗浄し、ボルテックスし、そして再び遠心分離した。生成物を、低い減圧下で乾燥して残りのエーテルを除去した。
（実施例１３：Ｎ−メチルピペラジンの合成のための一般的手順（経路Ｂ；図１３））
実施例１１の手順の生成物を、冷却器、添加用漏斗、およびアルゴン（Ａｒ）インレットを取り付けた多首ＲＢＦ中で無水ＴＨＦ（ＳＭ １ｍｍｏｌあたり５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、３当量のＬＡＨ溶液を、Ａｒ下で室温にて、滴下漏斗を介してゆっくりと添加した。激しい水素の発生を、添加し始めに観察した。添加後、この濁った溶液を加熱して３時間還流した。ＴＬＣを使用して、この反応が終了したときを決定した（出発物質（ＳＭ）の消失、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ ＴＬＣ展開溶媒、可視化剤（ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ）としてのＰＭＡ）。反応が完了した後、この溶液を室温まで冷却し、そして飽和硫酸ナトリウム水溶液（添加したＬＡＨ溶液の１／４の容量）を、非常にゆっくり添加しながらクエンチした。ゲル様の白色固溶体を、Ｎａ２ＳＯ４固体のプラグに通してＨ２Ｏを除去した。濾過したケークを、洗浄液のＴＬＣが生成物をほとんど示さなくなるまでＴＨＦによって数回洗浄した（１グラムのＳＭあたり４００ｍＬ）。その後、ＴＦＡ（４当量）をＴＨＦ溶液に添加した（ＨＣｌ塩を所望する場合、ジオキサン中のＨＣｌもまた、添加し得る）。この溶液の色は、淡黄色から淡褐色に変化した。この溶液を減少させた圧力下において、ロータリーエバポレーター上で濃縮して茶色の油状物質を得た。この淡褐色の生成物を、エーテルを添加（１グラムのＳＭあたり４２ｍＬ）することによってビス−ＴＦＡの塩として沈殿させ、Ｎ−メチル−ピペラジンを８０％の収率で得た。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）を使用して、所望の生成物を確認した。
（ＩＩ．Ｎ−メチル−ピペラジン酢酸を形成するＮ−メチルピペラジンのアルキル化）
注記：図１７Ａは、本明細書中で１１４、１１５、１１６および１１７と称される、４種の同重体標識試薬中への重原子同位体の合成的な組込みのための経路を図示する。図１７Ａから理解されるように、特定の重原子同位体は、Ｎ−メチルピペラジンの生成に使用される、市販の同位体標識されたグリシンの選択によって組込まれ得る。特定の他の重原子は、市販のブロモ酢酸の選択に基づくアルキル化反応の間に組込まれ得る。いくつかの場合において、この１８Ｏは、１８Ｏ標識された水を使用して有効な交換を介して組込まれ得る。この標識試薬は、一旦この試薬が解離エネルギーの適用によってフラグメント化される質量分析中の特徴イオンを形成するフラグメントの質量に基づいて、１１４、１１５、１１６および１１７と表される（図１７Ａおよび図１７Ｂを参照のこと）。
図１４Ａを参照すると、スキームＡは、双性イオンでありかつ塩（例えば、モノＴＦＡ塩もしくはビスＴＦＡ塩またはモノＨＣｌ塩もしくはビスＨＣｌ塩）ではないＮ−メチルピペラジン酢酸を生成するために有用である。図１４Ｂを参照すると、スキームＢは、それが、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の生成に、１当量のみのＮ−メチルピペラジンの使用を必要とし、したがって、貴重な同位体標識した出発物質の浪費を排除することに起因して有用である。図２Ｃを参照すると、スキームＣは、１８Ｏ争奪（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）（または残りの水に由来する１６Ｏとの交換）の出現を減少させることが期待されるような、同位体標識したブロモ酢酸、特定の１８Ｏ標識ブロモ酢酸に関するアルキル化に有用である。
（実施例１４：同位体標識したＮ−メチルピペラジン酢酸の合成のための手順（スキームＡ；図１４Ａ）
１５ｍＬのトルエン中１．１８ｇ（１１．８３ｍｍｏｌ）のＮ−メチルピペラジンの攪拌溶液に、室温で１ｇ（５．９１ｍｍｏｌ）のエチルブロモアセテート，１，２−１３Ｃを１５分間の時間にわたって滴下した。白色固体の即時の形成が観察された。次いで、この反応混合物を油浴中で９０℃にて４時間加熱した。この混合物を室温まで冷却後、オフホワイトの固体をろ過により取り出し、２５ｍＬのトルエンで洗浄した。次いで、合わせたろ液および洗浄液を回転エバポレーター中で濃縮し、その残留物を高減圧下で５時間乾燥させ、１．１０ｇ（定量的）のＮ−メチルピペラジン酢酸−１，２−１３Ｃのエチルエステル（３８）をオフホワイトの油状物として得た。粗生成物（３８）をＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲにより分析し、さらなる精製をせずに、次の工程に直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）：１８９．１６（Ｍ＋１），１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）δ４．２（ｍ，２Ｈ），３．４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）），２．４−２．７（ｂ，８Ｈ），２．３（ｓ，３Ｈ），１．２５（ｔ，３Ｈ）。
上記のように水（２０ｍＬ）中で調製したＮ−メチルピペラジン酢酸のエチルエステル（３８）（１．１ｇ、ｍｍｏｌ）の溶液を２４時間還流させた。この反応をＭＳ分析によりモニタリングした。２４時間後、この反応混合物を回転エバポレーター中で濃縮し、白色の固体生成物を得た。これをアセトン（１０ｍＬ）で一晩粉砕した。次いで、この生成物をろ過により分離し、減圧乾燥機中で４５℃にて一晩高減圧下で乾燥させて、７８０ｍｇのＮ−メチルピペラジン酢酸，１，２−１３Ｃ（３９）を、白色の粉末固体として得た。３００ｍｇのこの生成物を、昇華（１ｍｍ／Ｈｇ、１１０〜１２０℃）によりさらに精製し、２７０ｍｇの白色固体を得た。
注記：この手順は、標識されていないＮ−メチルピペラジンを利用する。この手順は、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の双性イオンの生成に有用である。
この生成物はまた、上記のとおりの単離の前または後の適切な酸を用いた処理によりモノＨＣｌ塩もしくはビスＨＣｌ塩またはモノＴＦＡ塩もしくはビスＴＦＡ塩として単離され得る。
（実施例１５：同位体標識したＮ−メチルピペラジン酢酸の合成のための手順（スキームＢ；図１４Ｂ）
メタノール（ＭｅＯＨ、１４ｍＬ）中２００ｍｇ（１．１４ｍｍｏｌ）のＮ−メチルピペラジン−１５Ｎ２ＨＣｌ（３６’）２ＴＦＡ塩もまた使用され得る）のスラリーに、１．７６ｇ（４．５９ｍｍｏｌ）のｓｓ−ＴＢＤを２．６ｍｍｏｌ／ｇのロードで添加し、その後ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）を添加した。次いで、この混合物を１５分間超音波処理し、次いで、アルゴン雰囲気下で氷浴中で冷却した。この激しく攪拌したスラリーに、アセトニトリル（３ｍＬ）中１９３ｍｇ（１．１４ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸エチル−２−１３Ｃの溶液をシリンジポンプを使用して（２ｍＬ／時間の速度を維持する）滴下した。滴下の完了後、氷浴を取り除き、その混合物を室温で一晩（１８時間）攪拌を続けた。次いで、この混合物を、焼結漏斗を通してろ過し、その固体をＭｅＯＨを用いて数回（４×１０ｍＬ）洗浄した。次いで、合わせたろ液および洗浄液を回転エバポレーター中で濃縮し、その残留物を高減圧下で維持し、Ｎ−メチルピペリジン酢酸のエチルエステル（４０）を、オフホワイトの固体として１１１ｍｇ（５１％）得た。この粗生成物をさらなる精製をせずに、次の工程に直接使用した。
この生成物を上記スキームＡに記載される様式で、加水分解した。生成物（４１）について、以下の分析データを得た。
上の一般的な手順を実質的に変化させることなく、他の同位体標識したＮ−メチルピペラジンに適用し、種々の同位体標識されたＮ−メチルピペラジン酢酸誘導体を生成した。
この生成物はまた、上記のとおりの単離の前または後の適切な酸を用いた処理によりビスＨＣｌ塩またはビスＴＦＡ塩として単離され得る。
（実施例１６：同位体標識されたＮ−メチルピペラジン酢酸の合成のための一般的手順（スキームＣ；図１４Ｃ））
ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のブロモ酢酸（７１５ｍｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液に、７００ｍｇのトリチル−Ｃｌ樹脂（１ｍｍｏｌ、１．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、その後ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１．７９ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を室温で１時間混合した。次いで、この樹脂をろ過し、ジクロロメタン（３×４ｍＬ）で洗浄し、その後、ジクロロメタン−メタノール−ＤＩＰＥＡの溶液（１７：２：３、５ｍＬ）を用いて洗浄し、最後に、ジクロロメタン（３×４ｍＬ）で洗浄した。
次いで、この樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中Ｎ−メチルピペラジン（Ｎ−ＭＰ）の溶液（０．５７ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を用いて３０分間処理し、次いで、ＤＭＦおよびジクロロメタン（それぞれ３×４ｍＬ）を用いて洗浄した。そのようにして樹脂上に生成したＮ−ＭＰＡを、ジクロロメタン中２５％のＴＦＡ溶液（１０ｍＬで５分間）を用いて切断し、樹脂を同じ溶液を用いて（２×５ｍＬ）洗浄した。ＴＦＡのエバポレーション後、その生成物を沈殿させ、エーテルを用いて洗浄した（３８８ｍｇ、９９％収率、ビスＴＦＡ塩）。この生成物をＮＭＲ（文献に合わせて）により、そしてＥＳ−ＭＳにより同定した（ＭＨ＋計算値＝１５９．１１、検出値１５９．１４）。
上の一般的な手順を実質的に変化させることなく、他の同位体標識されたＮ−メチルピペラジンに適用し、種々の同位体標識されたＮ−メチルピペラジン酢酸誘導体を生成した。
この生成物はまた、ＨＣｌがＴＦＡではなく担体からの生成物の切断に使用される場合、そのビスＨＣｌ塩として単離され得た。他の酸がまた、切断反応のために使用され得、その生成物は、使用された酸の塩になる。
（ＩＩＩ．１８ＯのＮ−メチルピペラジン酢酸への組込みのための方法）
注記：最初の実験において、１８ＯのＮ−メチルピペラジン酢酸への組込みを、１８Ｏ標識されたブロモ酢酸（ＣＩＬにより特別に合成された）を使用して図１５Ａに図示されるようにして試みた。このアプローチに対する懸念としては、後の反応において、１８Ｏが、残っている水由来の１６Ｏと交換し得る可能性、またはそうでなければエステル化プロセスの間に他の試薬由来の１６Ｏと交換し得る可能性が挙げられる。つい最近、適用された合成手順は、図１５Ｂに図示され、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の所望の重変形（ｈｅａｖｙ ｖｅｒｓｉｏｎ）の形成に対する平衡反応を駆動するためにＨ２ １８Ｏを使用して、１６Ｏ⇔１８Ｏ交換反応を利用する。両方のスキームとも機能することが示されているが、現在スキームＢは、最も高度に１８Ｏ富化された生成物の生成を補助する。
（実施例１７：活性エステルへの変換を含む、１８Ｏ同位体標識されたＮ−メチルピペラジン酢酸の合成のための一般的手順（スキームＡ、図１５Ａ））
ＤＣＭ（０．５７５ｍＬ）中ＴＢＤＭＳ−ＣＮ（１７２ｍｇ、１．１９０ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下で、１８Ｏ標識したブロモ酢酸（４２）（１７０ｍｇ、１．１８９ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液を８０℃まで２０分間で加熱し、その後室温まで冷却した。その生成物（４３）を、油状物として単離した（２５４ｍｇ、８５％収率）。
ＤＣＭ（２．５ｍＬ）中、ＢｒＣＨ２Ｃ１８Ｏ２−ＴＢＤＭＳ（４３）（２５４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ−ＭＰ（１１０μＬ、１ｍｍｏｌ）、ＴＢＤ樹脂（５７６ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、２．６ｍｍｏｌ／ｇ）およびＤＣＭを含むアルゴンを流したフラスコに０℃にて添加した。添加の完了後、その反応を室温で１時間継続させ、次いで、その樹脂をろ過し、ＤＣＭを用いて洗浄した。合わせたろ液を回転エバポレーターにより濃縮し、１１８ｍｇの油状物（４４ａおよび４４ｂまたは４４ｃ）を得た（４２％収率）。
注記：エステル化の間の１８Ｏ⇔１６Ｏの交換の可能性に起因して、この経路により調製されたＮ−メチルピペラジン酢酸は、以下のＶＩ説に記載されるトリフルオロ酢酸手順を使用して、活性エステルに変換しなかった。その代わりに、以下に記載される塩化オキサリルおよびＮＨＳを使用して、変換した。
ＤＣＭ（５ｍＬ）中の上で得たＮ−ＭＰＡＡ（４４ａおよび４４ｂまたは４４ｃ）の１８Ｏを含むＴＢＤＭＳエステル（１１８ｍｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、塩化オキサリルの溶液（０．４２７ｍＬ、０．８５４ｍｍｏｌ、ジクロロメタン注２Ｍ溶液）を添加した。オフホワイトのスラリーが形成されるまで反応を１時間継続させた。溶媒および過剰の試薬を反応混合物から除去した。乾燥ＴＨＦ（１．４ｍＬ）中ＮＨＳ（５０ｍｇ、０．４２７ｍｍｏｌ）の溶液を、生じた固体に添加し、その後、５ｍＬのジクロロメタン、４ｍＬのＴＨＦおよび２４６ｍｇのｓｓ−ＴＢＤ樹脂（０．６４０ｍｍｏｌ、２．６ｍｍｏｌ／ｇ）を添加した。その混合物を超音波処理し、２０分間混合し、その後、樹脂をろ過し、５ｍＬの乾燥ジクロロメタンを用いて洗浄した。このようにして得たろ液に、２ｍＬの、ジオキサン中４．０ＭのＨＣｌ溶液を添加し、その沈殿物（４５ａおよび４５ｂ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ×２）を用いて洗浄し、その後ヘキサン（５ｍＬ）を用いて洗浄し、減圧下で乾燥させた（１０ｍｇ、７％収率）。ＥＳ−ＭＳ（ｉ−プロパノール中の直接注入）は、同位体純度が、この段階で約７４％であることを示す。
（実施例１８：１８Ｏ同位体標識されたＮ−メチルピペラジン酢酸の合成のための一般的手順（スキームＢ；図１５Ｂ））
２００ｍｇ（１．２４ｍｍｏｌ）のＮ−メチルピペラジン酢酸１，２−１３Ｃ（４６）を、アルゴンを流した５ｍＬのプラスチックバイアル中で秤量した。次いで、このバイアルをグローブボックス内に移し、２．５ｍＬの１８Ｏ水（＞９９％、１８Ｏ）を添加した。次いで、このバイアルにシリコンセプタムを装着し、開口針を用いてセプタムに穴を開けた後、長い針を使用して溶液を通してＨＣｌガスのゆっくりとした流れを通過させた。この溶液が温まった（約２分間）場合、そのＨＣｌ通過を止め、セプタムを、スクリューキャップを用いて取り外した。次いで、このバイアルを加熱ブロック中で８０℃にて１８時間加熱した。アリコートを、ＭＳにより分析し、そして１８Ｏ純度を９３％と計算した。次いで、この反応混合物をスピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）中で乾燥するまで濃縮させ、その残留物を上記の１８Ｏ交換の第２のサイクルに供した。ＭＳ分析により、第２のサイクル後の１８Ｏ純度を９６％と決定した。次いで、この混合物をスピードバック中で乾燥するまでエバポレートし、微量の水をトルエンとの同時エバポレーション（１ｍＬ×２）により除去した。２２０ｍｇのＮ−メチルピペラジン酢酸−１，２−１３Ｃ−１８Ｏ２２ＨＣｌ（４７ａ）を、不純物（４７ｂ）とともに得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ），１６５（Ｍ＋１）。
注記：この生成物をさらなる精製をせずに、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの生成に使用した。ビスＴＦＡ塩をまた、ＴＦＡをＨＣｌの代わりに用いて上記の手順を使用して生成した。
（ＩＶ．Ｎ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの調製）
注記：Ｎ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの生成のためにいくつかの方法を用いた。スキームＡ（図１６Ａ）によって図示される手順は、Ｎ−ピペラジンのフルオロアルコールエステルの生成に良好に機能した（図１６Ｃおよび図１６Ｄを参照のこと）。スキームＢ（図１６Ｂ）によって図示される手順は、Ｎ−メチルピペラジンの種々の活性エステルを生成したが、固相塩基（例えば、ｓｓ−ＴＢＤ）を使用しない場合、溶液相塩基の塩酸塩は、除去するのが困難であった。スキームＣ（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）によって図示される手順は、Ｎ−メチルピペラジンの活性エステルの生成に、最も一般的に適用可能な経路であることが照明された。
（実施例１９：イミダゾリド形成によるＮ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの合成（スキームＡ、図１６Ａ））
ＴＨＦ（５ｍＬ）中、Ｎ−メチルピペラジンフェニルエステル（４８）（１００ｍｇ、０．４２６ｍｍｏｌ）およびナトリウムフェノキシド（１ｍｇ、９μｍｏｌ）の溶液に、ＴＭＳ−イミダゾール（６９μＬ、０．４６８ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を、２０分間混合し、イミダゾール（４９）を生成した。次いで、ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ（８０μＬ、０．２１３ｍｍｏｌ）を、そのようにして得た淡黄色の溶液に添加した。この溶液を、生成物の透明な形成がＴＬＣにより示される（Ｒｆ＝０．６、４：１ ＤＣＭ−ＭｅＯＨ）までさらに３０分間混合した。次いで、この反応物をＥｔＯＡｃを用いて１５ｍＬまで希釈し、その生成物（５０）を、ジオキサン中のＨＣｌ溶液（４Ｍ、２ｍＬ）の添加により沈殿させた。ＴＨＦを用いた洗浄（２×１５ｍＬ）の後、生成物を白色固体として単離した。固体のＮＭＲは、生成物とイミダゾール（ＨＣｌ塩として）との１：１混合物を示唆した。ＭＨ＋計算値＝２４１．１３、検出値＝２４１．１２。
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールエステル（５１）を、上に示される一般的手順を使用して、但し、（ＣＦ３）２ＣＨＯＨをＣＦ３ＣＨ２ＯＨの代わりに用いて単離した。この生成物について、以下の分析データを得た（Ｒｆ＝０．３７、９：１ ＤＣＭ−ＭｅＯＨ）。ＭＨ＋計算値＝３０９．１１、検出値＝３０９．１１。
注記：Ｎ−メチルピペラジンフェニルエステルを、上記のアルキル化手順（図１４Ａおよび図１４Ｂを参照のこと）により、ブロモ酢酸フェニルをブロモ酢酸エチルの代わりに用いて調製した。
（実施例２０：塩化オキサリルによるＮ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの合成（スキームＢ、図１６Ｂ））
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中Ｎ−メチルピペラジン酢酸（Ｎ−ＭＰＡＡ）（７９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、塩化オキサリルの溶液（４ｍＬ、０．８ｍｍｏｌ、ＤＣＭ中２．０Ｍ溶液）を室温にて１０分間にわたって添加した。さらに３０分間の反応後、減圧下で、溶媒および過剰の試薬を除去し、白色の固体を得た（５２）。ＤＣＭ（２５ｍＬ）中ＮＨＳ（５７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、その固体に添加し、その後ｓｓ−ＴＢＤ（３９０ｍｇ、１ｍｍｏｌ、２．６ｍｍｏｌ／ｇ）を添加した。生じた溶液を、５分間超音波処理をし、そのとき全ての固体が溶解した。ｓｓ−ＴＢＤ樹脂をろ過により除去し、溶媒をエバポレートして白色の泡状物（９７％収率）を得た。生成物を、これまでのように、ＥＳ−ＭＳによって特徴付けた。
（トリフルオロ酢酸エステルを介したＮ−メチルピペラジン酢酸の活性エステルの合成（スキームＣ、図１６Ｃおよび図１６Ｄ））
注記：トリフルオロ酢酸エステルを介した、Ｎ−メチルピペラジン酢酸（Ｎ−ＭＰＡＡ）のその活性エステルへの変換は、代表的に、２工程プロセスである。試薬が市販されている稀な場合（表２を参照のこと）を除いて、第一の工程は、酢酸をエステル化するための試薬の調製に関する。第二の工程は、上記エステル化試薬をＮ−メチルピペラジン酢酸と反応させて活性エステルを生成する工程に関する。種々の活性エステルを生成し、ペプチドの水性標識に関して試験した。ＮＨＳエステルがこの用途に非常に有用であることが証明されたが、他のエステルは、他の用途において有用であることを証明する可能性がある。それにもかかわらず、活性エステルを生成するこの方法は、非常に強力（ｒｏｂｕｓｔ）であり、かつ一般的に、多種多様な可能物にわたって適用可能であることを証明した。図１６Ｄは、同じ一般的手順を用いて生成された７つの異なる活性エステルを図示する。
（実施例２１：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドトリフルオロアセテート１０、１１および他のトリフルオロ酢酸エステルの合成）
無水トリフルオロ酢酸（４．９ｍＬ、４×８．６８ｍｍｏｌ（２．５当量〜４当量が代表的に使用される）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１ｇ、８．６９ｍｍｏｌ）に添加し、アルゴン下で１〜２時間攪拌して均一な反応混合物を生成した。過剰の試薬および副生成物ＣＦ３ＣＯＯＨを減圧下（ロータリーエバポレーション）で除去した。生成物を、定量可能な収量の白色固体として得た。高真空下で３〜４時間、この固体を乾燥させ、アルゴン（Ａｒ）ガスまたは窒素（Ｎ２）ガス下で保存した。
図１６Ｄおよび表２を参照すると、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）および４−ニトロフェノール（４−ＮＰ）のトリフルオロ酢酸エステルは市販されていた。残りのトリフルオロ酢酸エステルを、上記の一般的手順を用いて合成した（ただし、反応時間および反応温度は変化させた）。さらに、いくつかの場合、上記生成物を蒸留によって分離した。トリフルオロ酢酸エステルの収量は良好であり、いくつかの場合は定量可能な量に近かった。使用した具体的な条件を、以下の表２に示す。
（実施例２２：トリフルオロ酢酸エステルからのＮ−置換ピペラジン酢酸の活性エステルの調製のための一般的方法）
ＴＨＦ中のトリフルオロアセテートの溶液（０．５８Ｍ、１．２当量）をＮ−メチルピペラジン酢酸の固体サンプルに添加し、均一な溶液が得られるまでボルテックスまたはシェーカー中で混合した。カルボン酸とリフルオロ酢酸エステルとの反応は、Ｎ−ヒドロキシピロリジノン（Ｎ−ｈｙｄｒｏｙｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）（ＮＨＰ、１８時間）を除く全ての場合について、通常３０分以内に完了した。活性エステルへの変換の進行をＥＳ−ＭＳによってモニタリングした。生成物および任意の出発物質（Ｎ−ＭＰＡＡ）の量を、その反応物のサンプル（エタノール中）のＥＳ−ＭＳへの直接注入によって決定することができた。いくつかの場合、活性エステル生成物を、ジオキサン中のＨＣｌ溶液（４Ｍ、反応物の５０体積％）の添加により、二塩酸塩として沈殿させ、続いてＴＨＦ、酢酸エチルおよびヘキサンで洗浄した。他の場合、この生成物を反応物からモノＴＦＡ塩として単離した。ビス−ＴＦＡ塩が所望された場合に、ＴＦＡの添加が行われ得た。
Ｄｈｂｔエステル 計算値ＭＨ＋＝３０４．１４ 検出値＝３０４．２０
ＮＨＰエステル 計算値ＭＨ＋＝２４２．１５ 検出値＝２４２．２０
４−ＮＰエステル 計算値ＭＨ＋＝２８０．１３ 検出値＝２８０．２０
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）ｄ８．２０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，芳香族プロトン）、７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，芳香族プロトン）、３．６９−３．４０（ブロード，２Ｈ，環プロトン）、３．５７（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−）、３．１５−２．９０（ブロード，６Ｈ，環プロトン），２．７８（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ３）。
Ｐｆｐエステル 計算値ＭＨ＋＝３２５．１０ 検出値＝３２５．１０
Ｐｃｐエステル 計算値ＭＨ＋＝４０４．９５ 検出値＝４０５．９０
３−ＮＰエステル 計算値ＭＨ＋＝２８０．１３ 検出値＝２８０．２０
ＮＨＳエステル 計算値ＭＨ＋＝２５６．１３ 検出値＝２５６．１０。
（実施例２３：Ｎ−メチルピペラジン酢酸−１，２−１３Ｃ−１８Ｏ２，２ＨＣｌのＮＨＳ−エステルの合成（１１４標識試薬））
ＴＨＦ（１．８ｍＬ）中のＮ−メチルピペラジン酢酸−１，２−１３Ｃ，１８Ｏ，２ＨＣｌ（５６）（６０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のスラリーに、アルゴン下でＤＩＰＥＡ（９８ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を５分間ボルテックスし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのトリフルオロアセテート（１６０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。１０分間超音波処理した後、この反応混合物を室温で４時間攪拌し、続いて遠心分離によってあらゆる不溶解物質を除去した。上清をデカントし、次いでＴＨＦ（３ｍＬ）で希釈し、そしてジオキサン（１．８ｍＬ）中のＨＣｌの４Ｍ溶液をゆっくりと添加した。沈殿したＮＨＳエステルのＨＣｌ塩を遠心分離によって分離し、ＴＨＦ（３ｍＬ×４）で洗浄し、高真空下で乾燥させて、６２ｍｇ（７４％）のＮＨＳエステル（５８）を灰色がかった白色固体として得た。
種々の同位体富化されたＮ−メチルピペラジン酢酸を用いる場合を除いて、１１５標識試薬（５９）の生成のために、上記の手順に従った。生成物（５９）に関する分析データは以下の通りである。
注記：トリフルオロ酢酸エステル試薬を、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の双性イオン、ならびにＮ−メチルピペラジ酢酸のモノ塩およびビス塩（例えば、モノ−ＨＣｌ塩、モノ−ＴＦＡ塩、ビス−ＨＣｌ塩もしくはビス−ＴＦＡ塩）と反応させることができる。ビス−ＨＣｌ塩を使用した場合、ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｌｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＤＩＰＥＡ）のような塩基を添加して、この酸を中和した。しかし、トランスエステル化反応は、Ｎ−メチルピペラジン酢酸のビス−ＴＦＡ塩によって、塩基を添加することなく明確に進行した。
（Ｖ．同重体標識試薬セットを用いた標識および分析）
（実施例２４：Ｎ−メチルピペラジン酢酸のＮＨＳ−エステル（ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ）試薬の同重体セットによる（タンパク質消化物に由来する）ペプチド混合物の標識のための一般的手順）
（緩衝液および試薬組成）
（タンパク質の還元およびシステインのブロック）
注記；必要な場合、以下の工程１および２において、１００μＬまでの溶解緩衝液を添加してサンプルを溶解する。標識の前に過剰の緩衝液を乾燥させる（「トリプシンによる消化」における工程６を参照のこと）。
１． ２０μＬの溶解緩衝液を、１００μｇのコントロールサンプルを含むチューブに添加する（高濃度のサンプル溶液を用いて作業する場合、変性緩衝液を添加して、体積を２０μＬまでにする）
２． ２０μＬの溶解緩衝液を、１００μｇの試験サンプルを含むチューブに添加する（高濃度のサンプル溶液を用いて作業する場合、変性緩衝液を添加して、体積を２０μＬまでにする）
３． １μＬの変性試薬を、コントロールサンプルのチューブおよび試験サンプルのチューブの両方に添加する
４． ２μＬの還元試薬を、コントロールサンプルのチューブおよび試験サンプルのチューブの両方に添加する
５． ボルテックスして混合し、次いで遠心する
６． コントロールチューブおよび試験チューブを６０℃で１時間インキュベートする
７． ボルテックスして混合し、次いで遠心する
８． 各チューブに１μＬのシステインブロック試薬を添加する
９． ボルテックスして混合し、次いで遠心する
１０． 室温で１０分間インキュベートする
１１． コントロールチューブおよび試験チューブをボルテックスして混合し、次いで遠心する。
（トリプシンによる消化）
１． トリプシンのバイアル（塩化カルシウムを含む）を２５μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水または等価物で再構成する
２． ボルテックスして混合し、次いで遠心する
３． １０μＬのトリプシン溶液を、各タンパク質溶液に添加する
４． ボルテックスして混合し、次いで遠心する
５． ３７℃で１２〜１６時間インキュベートする
６． ボルテックスして混合し、次いで遠心する。
注記：上記「タンパク質の還元およびシステインのブロック」の工程１および２において変性緩衝液を増加した場合、サンプルを遠心真空濃縮機中で乾燥させる。この乾燥サンプルに３０μＬの変性緩衝液を添加し、ボルテックスして混合し、次いで遠心する。
（ＮＭＰＡＡのＮＨＳエステル（ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ）で標識する）
注記：ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１４のバイアルおよびＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１７のバイアルを室温にする（このバイアルは、約１ｍｇの活性試薬を含む）。
１． ７０μＬの無水エタノールを各試薬バイアルに添加する
２． １分間ボルテックスして溶解させ、次いで遠心する
３． ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１４の溶液をコントロールサンプル溶液に移す
４． ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１７の溶液を試験サンプルに移す
５． 各バイアルをボルテックスして混合し、次いで遠心する
６． 室温で１時間インキュベートする
７． 各バイアルをボルテックスして混合し、次いで遠心する
８． ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１４バイアルの内容物とＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１７バイアルの内容物とを１つのチューブに合わせる
注記：より多くの数のサンプルおよびコントロールが所望される場合、ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１５およびＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬１１６もまた使用できる。
（標識溶液中の構成成分の最終濃度（全体積１０４μＬ））
９６ｍＭ 重炭酸トリエチルアンモニウム
０．０１９％ ＳＤＳ
０．９６ｍＭ ＴＣＥＰ
１．９ｍＭ ＭＭＴＳ
１０μｇ トリプシン
８９μｇ 塩化カルシウム
１ｍｇ ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ試薬
１μＬ ２−プロパノール
７０μＬ エタノール（６７％）
１００μｇ サンプル。
（実施例２５：タンパク質混合物の調製および分析（６タンパク質混合物としても公知））
等モル量のウシ血清アルブミン、αカゼイン、アルコールデヒドロゲナーゼ、α−ラクトアルブミン、βガラクトシダーゼ、血清トランスフェリンおよびミオグロビン（全てＳｉｇｍａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩから得た）を含有するタンパク質混合物を還元し（２ｍＭ ＴＣＥＰ、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）、アルキル化し（５ｍＭ ヨードアセタミド、Ｓｉｇｍａ）およびトリプシン消化した（１：２０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）。４つの当量のアリコートを、各々、４つの富化されたＮ−メチルピペラジン酢酸（ＮＭＰＡＡ）ＮＨＳエステル試薬（１１４，１１５、１１６および１１７）のうちの１つを用いて、０．５ｍｇの試薬を５０μＬのペプチド溶液に添加して３０分間室温で反応させることによって、処理した。この４つの反応物を合わせ、エバポレートして乾燥させ、そして各構成成分の５００ｆｍｏｌ量を、以下の実施例２６において表題「ＬＣ−ＭＳ分析」のもとで記載されるように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
（実施例２６：Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける多重タンパク質定量）
（酵母タンパク質の抽出および標識）
対数期の細胞（７５％ ｌｏｇ）を収集し、凍結して、ドライアイス上で粉砕することによって機械的に溶解した。凍結細胞材料（湿重量１００ｍｇ）を１ｍｌの溶解緩衝液（０．１Ｍ ＴＥＡｍＢ、０．１％ｖ／ｖ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、６Ｍ グアニジン）に懸濁し、ボルテックス（１分）し、超音波処理（５×３０秒）し、そして不溶性の細片を遠心分離（１３０００ｇ、５分間）によりペレット化することによって、粗製の細胞溶解物を調製した。最終的に測定されたタンパク質濃度は、３〜３．４ｍｇ／ｍＬであった。タンパク質を還元し（２ｍＭ ＴＣＥＰ、３７℃、１時間）、アルキル化し（５ｍＭ ヨードアセタミド、３７℃、２時間）、そして６容量の冷アセトン（ドライアイスで２０分）を添加することにより沈殿させた。タンパク質を遠心分離（１３０００ｇ、５分）によって回収し、風乾させ、そして−８０℃で凍結させた。消化のために、タンパク質を消化緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡｍＢ、０．０５％ｗ／ｖ ＳＤＳ）に再懸濁し、最終濃度を１ｍｇ／ｍＬとした（ＢＣＡアッセイ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって測定された全タンパク質）。次いで、各溶解物からの当量のアリコート（５００μｇ）をトリプシンによって、３７℃で一晩消化し（Ｓｉｇｍａ，１：４０ ｗ／ｗ、０時間および２時間において添加）、凍結乾燥した。
（多重試薬による標識）
各酵母系統について、１５０μｇの全タンパク質を１００μＬの標識緩衝液（０．２５Ｍ ＴＥＡｍＢ、７５％エタノール）に再懸濁し、この後１ｍｇの各々の同位体富化したＮ−メチルピペラジン酢酸ＮＨＳエステルを添加し（最終１％ｗ／ｖ）、そして室温で３０分間反応させた。残った試薬を３００μＬの水を添加することによってクエンチし、さらに３０分間かけて過剰の試薬を完全に加水分解し、次いで３つの標識サンプルを混合し、凍結乾燥した。
（陽イオン交換クロマトグラフィー）
合わせたペプチド混合物を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上で、ポリスルホエチルＡカラム（４．６×１００ｍｍ、５μｍ ３００Ａ）を用いて強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーによって分離した。サンプルを４ｍｌのＳＣＸローディング緩衝液（２５％ｖ／ｖ ＡＣＮ、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、リン酸によってｐＨ３）中に溶解し、ローディングし、そして２０分間０．５ｍＬ／分で等組成的に（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）洗浄して過剰な試薬を除去した。０〜５００ｍＭ ＫＣｌ（２５％ｖ／ｖ ＡＣＮ，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３）、１ｍＬ／分の線形勾配によってペプチドを溶出し、画分を１分間隔で回収した。
（ＬＣ−ＭＳ分析）
Ｐｒｏｂｏｔ ＭＡＬＤＩスポッティングデバイスを備えるＵｌｔｉｍａｔｅＴＭクロマトグラフィーシステム（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で、ペプチド分離を実施した。約１０μｇのタンパク質物質を含む個々のＳＣＸ画分を注入し、０．３×５ｍｍのトラップカラム（３μ Ｃ１８（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））上で捕捉して、次いで０．１×１５０ｍｍの分析用カラムに、自動化二成分勾配（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｂｉｎａｒｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ）（８００ｎＬ／分）（９５％緩衝液Ａ（２％ アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）〜４５％緩衝液Ｂ（８５％ アセトニトリル、５％ イソプロパノール、０．１％ ＴＦＡ）３５分、次いで４５〜９０％ Ｂ、５分）を使用して溶出した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析／質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ／ＭＳ）のために、２５ｎＬの混合ティー（ｍｉｘｉｎｇ ｔｅｅ）（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ，ＷＡ）により、カラム溶出液をマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）マトリックス（７ｍｇ／ｍＬ−α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）と１：２の比率で混合し、１６×１６スポットアレイにスポットした。ＭＡＬＤＩプレートをＡＢＩ ４７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）プロテオミクスアナライザー上で分析した。エレクトロスプレー分析のために、Ｑｓｔａｒ ＰｕｌｓａｒＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ）質量分析計に接続したＵｌｔｉｍａｔｅ ＬＣシステムを使用した。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の条件は、ＬＣ−ＭＡＬＤＩについて使用した条件と類似したものであり、５％〜３５％ Ｂ（Ａ：２％ アセトニトリル／０．１％ ギ酸；Ｂ＝９５％ アセトニトリル／０．１％ ギ酸）の２時間の勾配を使用して、７５μｍ×１５０ｍｍのＣ１８カラム（Ｐｅｐｍａｐ，Ｄｉｏｎｅｘ）に対して、３００ｎｌ／分の流速でペプチドを分離した。動的排除（ｄｙｎａｍｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を使用して、９０〜２０００ｍ／ｚからのＭＳ／ＭＳについて選択した３個までのプリカーサーを用いて、ｍ／ｚ ３００〜１５００からのサーベイスキャンを得た。回転衝突エネルギーを使用して、フラグメンテーションを促進した。二価の荷電イオンについての代表的な平均値は、それぞれ６００ｍ／ｚおよび９００ｍ／ｚに対して４１Ｖおよび５６Ｖであり、三価の荷電イオンについての代表的な平均値は、それぞれｍ／ｚ６００およびｍ／ｚ９００に対して２９Ｖおよび４３Ｖであった。この衝突エネルギーの範囲は、標識されていないペプチドに対して使用したものよりも約２０％高く、塩基性のＮ末端誘導体の安定化効果を克服し、等価のフラグメンテーション効率を達成した。
（データ分析および解釈）
ペプチドおよびタンパク質の同定を、Ｍａｓｃｏｔサーチエンジン（Ｖｅｒ １．９，Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫ）１４を使用して実施した。データベースの調査は、酵母のトリプシンにより生じたペプチドに限定した（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔバージョン４２．５；４９２４個のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列；１３８９２２個の全配列）。Ｓ−アセトアミド、Ｎ末端およびリジンの修飾を固定として選択し、Ｍｅｔ酸化を可変として選択し、可能な１つを失う切断（１ ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）および＜５０ｐｐｍにおけるプリカーサー誤差許容（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｅｒｒｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を選択した。基本型のソフトウェアツールを用いて、等圧タグからの特徴イオンピークの領域を４７００またはＱＳＴＡＲの生データから抽出し、適合させて同定した。次いで、結果をタンパク質に分類し、比率および標準偏差を計算するために、同定したペプチドの完全なリストを、Ａｃｃｅｓｓ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，ＷＡ）データベースに提供した。存在量比率の計算としては、重複する同位体の寄与（天然の１３Ｃ成分および富化１３Ｃ成分の両方）に対する校正が挙げられた。
（実施例２７：消化の前にサンプルを含むタンパク質を標識するための一般的なワークフロー）
以下の実施例は、調製した６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｘｔｕｒｅに関して考察しているが、この考察したワークフローは、目的の未知のサンプルへの適用を含め、一般的に適用可能であり得る。以下に示すプロトコルは、標識前のタンパク質の変性および還元を記載する。標識反応を実施した後に、変性および還元を実施することもまた、可能である。
（Ａ．タンパク質の還元およびシステインのブロッキング）
１．２０μＬの溶解緩衝液を１００μｇの６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ（合計３．７ｎｍｏｌ）を含むチューブに添加する
２．２μＬの還元試薬（ＴＣＥＰ）を添加し、１μｌの変性試薬をサンプルチューブに提供する（必要に応じてか、または工程Ｂ１０の後に実施する）
３．ボルテックスして混合し、次いで遠心する
４．６０℃で１時間、チューブをインキュベートする（タンパク質を溶解する）
５．溶液をチューブの底に移動させるために、遠心する
６．各チューブに１μＬのシステインブロッキング試薬（ＭＭＴＳ）を添加する
７．ボルテックスして混合し、次いで遠心する
８．室温で１０分間インキュベートする。
（Ｂ．標識試薬を用いてタンパク質混合物を標識する）
１．各バイアルの１ｍｇのＮＭＰＡＡ−ＮＨＳを室温にする
２．試薬を回転させて、全ての粉末をバイアルの底に移動させる
３．７０μＬのエタノールを試薬のバイアルに添加する
４．バイアルを１分間ボルテックスして試薬を溶解させ、次いで遠心する
５．１つの調製したバイアルの標識試薬を、１つのタンパク質混合物のサンプルチューブに移す
６．各バイアルをボルテックスして混合し、ついで遠心する
７．室温でインキュベートする
８．サンプルバイアルに３０μＬの１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を添加し、ボルテックスして混合し、次いで遠心する
９．２０分間インキュベートして、試薬を完全にクエンチする
１０．各標識試薬の内容物を１つのチューブ中で合わせる
１１．アセトン沈殿：１ｍＬの冷アセトンをサンプルバイアルに添加し、ボルテックスして混合し、次いで遠心する
１２．２時間−２０℃でインキュベートする
１３．１４の設定で１５分間バイアルを遠心する
１４．上清をデカントする
１５．２分間スピードバックにかけ（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）、残渣のアセトンを除く
１６．サンプルチューブを１７５μＬの２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で再懸濁する；６０℃で１時間インキュベートする。
（標識タンパク質をトリプシンで消化する）
１．バイアルのトリプシン（２５μｇ（ＣａＣｌを含む））を２５μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再構成する
２．ボルテックスして混合し、次いで遠心する
３．２５μＬのトリプシン溶液をタンパク質溶液に添加する
４．ボルテックスして混合し、次いで遠心する
５．３７℃で一晩インキュベートする
６．回転させて、溶液をチューブの底に移動させる。
（実施例２８：消化の前にサンプルを含むタンパク質を標識するための一般的な手順（予言的））
（サンプル）
１）ラミニン ５０μｍｏｌ、ＴＰＩ１（既知のタンパク質） ２５μｍｏｌ（２０μＬ １．２ｍｍｏｌ／ｍＬ）およびＴＰＩ２（既知のタンパク質） ２０μｍｏｌ（２５μＬ ０．７９ｍｍｏｌ／ｍＬ）（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）および０．１％ ＳＤＳ ｐＨ８．５（ＩＣＡＴ溶解緩衝液）中）→
全量は、２５０μＬであった。
２）ＴＰＩタンパク質消化（１００μｇ ＴＰＩ／２００μＬ）。
（手順）
サンプル１およびサンプル２を還元し、２μＬの５０ｍＭ ＴＣＥＰを添加することによって変性させ、１０分間加熱ブロックした。ブロッキング工程は、除いてもよい。
１．５０μＬの変性緩衝液中にタンパク質混合物（５０〜１００μｇ）を溶解する
２．１μｌの還元試薬をタンパク質溶液に添加して、２ｍＭの最終濃度を達成する
３．タンパク質溶液を３７℃で１時間インキュベートする
４．１μｌのＭＭＴＳを変性させて還元したタンパク質溶液に添加し、１０分間ボルテックスする
５．タンパク質溶液を希釈緩衝液（０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３）で１：１に希釈する
６．２μｌのＬｙｓＣをタンパク質溶液に添加し、３７℃で２時間消化する
７．タンパク質溶液を水で１：１に希釈する
８．１０μｌのトリプシン（約５μｇ）を添加し、３７℃で５〜１０時間消化を続ける
９．２μｌの還元試薬を消化物に添加し、システインを含むペプチドを３７度で１時間還元する。
（図２１Ｃに例示する担体（ＣＣＳ２）によるＣｙｓペプチドの捕捉）
１．ＮＡＮＯＳＥＰＴＭチューブ中でＣＣＳ２樹脂を、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで３回（３×１００μＬ、５分間）洗浄する（洗浄液を分析にために回収する）
２．５０ｍＭ Ｔｒｉｓ含有物（ｐＨ８．５）で樹脂を条件付けする（２００μｌ、５分間）
３．各消化物の混合物（２００μｌ）を７ｍｇのＣＣＳ２を含むＮＡＮＯＳＥＰＴＭチューブに移す
４．ボルテックスプラットホーム上のチューブホルダーにチューブを取り付け、低速で６０分間ボルテックスする
５．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機においてＮＡＮＯＳＥＰサンプルチューブを回転させて結合していないペプチドを除き、ＨＰＬＣ（ＦＴ，Ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）によって濾液を分析する
６．１００μＬのＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで洗浄して（５分間）、さらなる未結合のサンプルを樹脂から除き、分析のためのサンプルを完全に流すために洗浄液を添加する
（Ｎ−アセチルシステアミンによるＣＣＳ２樹脂のクエンチ）
１．２００μｌの１．０％のＮ−アセチルシステアミン溶液（すなわち、２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中、２μＬ）を樹脂チューブに添加し、室温（ＲＴ）で３０分間チューブをボルテックスする
２．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機においてチューブを回転させ、試薬を除く
３．クエンチした樹脂を１０ｍＭ ＴＥＡｍＢ（３×１００μｌ）で洗浄する。洗浄溶媒を回収して分析した（ＨＰＬＣ）
４．スピードバックで樹脂を乾燥させる。
（ＮＭＰＡＡ−ＮＨＳ標識試薬を使用したＣｙｓペプチドのタグ付け）
１．５ｍｇの標識試薬（５回の反応に対して十分）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に計りとる
２．別個のチューブにおいて、以下のタグ付け緩衝液および溶媒を混合する：
５０μｌの１．０Ｍ ＴＥＡｍＢ（トリエチルアンモニウムビカーボネート）
２５０μｌのＨ２Ｏ
７００μｌのエタノール（ＥｔＯＨ）
３．上記の溶液（４×１２５μＬ）を標識試薬チューブに移し、混合物をボルテックスし（約２０秒）、そして即座に１００μＬを４つのサンプルチューブの各々に移す
４．チューブを１時間室温（ＲＴ）でボルテックスする
５．反応物を遠沈する（分析のための回収）
６．０．１％ ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ中）で３回で樹脂を洗浄（３×１００μｌ）し、０．１％ ＴＦＡを含む、１００μｌの２５％アセトニトリルで１回以上洗浄する（必要に応じて、これらの洗浄液を、分析のための最初の標識溶液に添加する）
７．切断工程の前に、スピードバックで樹脂を完全に乾燥させる。
（樹脂からのタグ付きペプチドの切断）
（酸切断）
１．９５％ ＴＦＡ、５％ ＴＩＰＳを含む２００μｌのカクテルを乾燥させたサンプルチューブに添加し、低速で１時間室温でボルテックスする
２．チューブを遠沈し、チューブ中の濾液を残しておく
３．１００μｌの９５％ ＴＦＡ、５％ ＴＩＰＳを樹脂チューブに添加して、再度遠沈する
４．プールした濾液を乾燥させ、全てのサンプルを５０μＬ ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏに再溶解する
全ての他のサンプルを５０μＬ ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏに再溶解する。
ＨＰＬＣ分析：９５μＬ Ｈ２Ｏ中の５μＬ、８０μＬを注入する
α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＡＣＨＣＡ）中のＭＡＬＤＩ−ＭＳ最終の切断された生成物（１：１０）。
上に示される実施例は、例示のみの目的のためのものであり、本発明の範囲に対する限定として考察されるべきではない。
図１Ａは、２つの異なる同重体標識試薬（例えば、化合物Ｉおよび化合物ＩＩ）との、分析物の反応を図示する。 図１Ｂは、図１Ａに図示される標識化分析物のフラグメンテーションを図示する。これにより、同重体標識化分析物からの異なる質量のレポーター部分（例えば、特徴イオンとしての化合物ＶＩＩ及びＶＩＩＩ）を産生する。 図２は、標識化分析物の質量スペクトルの拡大プロットである。 図３は、図２の拡大プロットにおいて同定された、選択された標識化分析物の第二の質量分析から得られた完全な質量スペクトルである。 図４は、第二の質量分析において測定された、分析物の優勢なｙイオン娘フラグメントイオンの質量スペクトルの拡大プロットである。 図５は、第二の質量分析において測定された、分析物の優勢なｂイオン娘フラグメントイオンの質量スペクトルの拡大プロットである。 図６は、第二の質量分析において測定された、２種のレポーター（すなわち、特徴イオン）の質量スペクトルの拡大プロットである。 図７は、標識化ペプチドの種々の混合物に対する第二の質量分析により測定されたレポーターの、実測値対予測値比のプロットである。その混合物の各ペプチドは、２種の異なるレポーターのうちの一方を含む。 図８は、同重体標識試薬の２つのセットを図示する。ここで、同じ同位体（化合物Ｘ−ＸＩＩＩ）および異なる同位体（化合物ＸＶ−ＸＶＩＩＩ）が、そのセット内で使用され、それにより、同じ総質量のレポーター／リンカー部分であるが、各々がそのセット内の異なる総質量のレポーター部分を有することを達成する。いくつかの化合物ＸＶ−ＸＶＩＩＩの間で、絶対質量のわずかな差異が存在することもまた、特筆すべきである。 図９Ａおよび図９Ｂは、基本的な出発物質からの同位体標識化ピペラジン標識試薬への合成経路の図示である。この経路はまた、非同位体標識化ピペラジン試薬の調製のために使用され得、ここで、非同位体標識化出発物質が使用される。 図１０は、基本的な出発物質からの同位体標識化Ｎ−アルキルピペラジン標識試薬および非同位体標識化Ｎ−アルキルピペラジン標識試薬への合成経路の図示である。 図１１は、基本的な出発物質からの同位体標識化Ｎ−アルキルピペラジン標識試薬および非同位体標識化Ｎ−アルキルピペラジン標識試薬への合成経路である。 図１２は、基本的な出発物質からの、同位体標識化ピペラジン標識試薬および非同位体標識化ピペラジン標識試薬への、固相ベースの合成経路を図示する。 図１３は、Ｎ−メチルピペラジンの合成のための合成スキームの図示である。 図１４Ａは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の合成のための合成スキームの図示である。 図１４Ｂは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の合成のための別の合成スキームの図示である。 図１４Ｃは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の合成のためのなお別の合成スキームの図示である。 図１５Ａは、１８Ｏ標識化Ｎ−メチルピペラジン酢酸の合成のための合成スキームの図示である。 図１５Ｂは、１８Ｏ標識化Ｎ−メチルピペラジン酢酸の合成のための別の合成スキームの図示である。 図１６Ａは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の種々の活性エステルの合成のための合成スキームの図示である。 図１６Ｂは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の種々の活性エステルの合成のための別の合成スキームの図示である。 図１６Ｃは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の種々の活性エステルの合成のためのなお別の合成スキームの図示である。 図１６Ｄは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸の種々の活性エステルの合成のためのなお別の合成スキームの図示である。 図１７Ａは、４種の同重体Ｎ−メチルピペラジン酢酸の調製のための重原子同位体組み込み経路の図示である。 図１７Ｂは、４種のＮ−メチルピペラジン酢酸エステル標識試薬を使用した、ペプチドの標識およびフラグメンテーションの図示である。 図１７Ｃは、図１７Ｂに図示される試薬の同重体なセットから生成される特徴イオンの各々についての、２種の可能な構造の図示である。 図１８は、同重体標識試薬を含むＮ−メチルピペラジン酢酸部分の例を含む、同重体標識試薬の一般的特性の図示である。 図１９Ａは、Ｎ−メチルピペラジン酢酸で標識されたペプチド分析物の図示である。 図１９Ｂは、どのようにＮ−メチルピペラジン酢酸部分がレポーター部分およびバランス部分を含むかの図示である。 図１９Ｃは、どのようにペプチドが異なる同重体標識試薬で標識化され、混合され、第一のＭＳ分析、次いで第二のＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析により分析されるかの図示である。これらにより、標識化ポリペプチドのレポーターおよび娘イオンフラグメントが生成される。 図２０は、プロテオーム分析のための１つの可能な作業の流れの図示である。 図２１Ａは、固相捕捉を用いたプロテオーム分析のための１つの可能な作業の流れの図示である。 図２１Ｂは、ペプチドおよびタンパク質を捕獲するために使用され得る支持の一般的部分の図示である。 図２１Ｃは、システイン部分のチオール基と担体のヨード酢酸部分との反応による、ペプチドおよびタンパク質の捕獲のために使用され得る特異的な担体の図示である。 図２２は、固相捕獲を用いたプロテオーム分析のための１つの可能な作業の流れの図示である。 図２３は、固相捕獲を用いたプロテオーム分析のための１つの可能な作業の流れの図示である。 図２４は、固相捕獲を用いたプロテオーム分析のための１つの可能な作業の流れの図示である。 図２５は、固相捕獲を用いたプロテオーム分析のための１つの可能な作業の流れの図示である。

Claims (39)

  1. 式：
    の同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物、その塩形態、水和物形態、または塩でありかつ水和物である形態であって、該同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物は、１つ以上の重原子同位体を含み、ここで
    Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立にフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり；そして
    各Ｚは、独立に水素；フッ素；塩素；臭素；ヨウ素；アミノ酸側鎖；置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立にフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基；あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立にフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であり；
    ここで、該Ｎ−置換ピペラジンは、１３Ｃ、１５Ｎのいずれかのみまたは１３Ｃおよび１５Ｎの両方で同位体富化されており、ただし、該同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物は、Ｃ−２位とＣ−５位、Ｃ−２位とＣ−６位、または、Ｃ−３位とＣ−５位に２つの１３Ｃ原子を有するＮ−メチルピペラジンではない、同位体富化されたＮ−置換ピペラジン化合物、その塩形態、水和物形態、または塩でありかつ水和物である形態。
  2. 前記Ｎ−置換ピペラジンが、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体または４つ以上の重原子同位体で同位体富化されている、請求項１に記載の化合物。
  3. 式：
    の請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、その塩形態、水和物形態、または塩でありかつ水和物である形態を含む、化合物。
  4. 前記化合物が、モノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡ塩またはビスＨＣｌ塩である、請求項１または３のいずれかに記載の化合物。
  5. 式：
    の同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物、またはその塩形態、水和物形態、もしくは塩でありかつ水和物である形態であって、該同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物は、１つ以上の重原子同位体を含み、ここで
    各Ｘは、独立にＯまたはＳであり；
    Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり；
    各Ｚは、独立に水素；重水素；フッ素；塩素；臭素；ヨウ素；アミノ酸側鎖；置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基；あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であり、ただし、該同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物は、同位体富化されたＮ−メチルピペラジン酢酸ではない、同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物、またはその塩形態、水和物形態、もしくは塩でありかつ水和物である形態。
  6. 前記Ｎ−置換ピペラジン酢酸化合物が、１つ以上の重原子同位体、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体、４つ以上の重原子同位体、５つ以上の重原子同位体、６つ以上の重原子同位体、または６つより多い重原子同位体を含む、請求項５に記載の化合物。
  7. 前記重原子同位体が、各々、独立に１８Ｏ、１５Ｎまたは１３Ｃである、請求項６に記載の化合物。
  8. 各Ｚが、独立に水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である、請求項１または５のいずれかに記載の化合物。
  9. 前記ピペラジン環の各窒素原子が、独立に１４Ｎまたは１５Ｎである、請求項５に記載の化合物。
  10. 式：
    の同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸化合物であって、該化合物はその塩形態、水和物形態、または塩でありかつ水和物である形態を含み、ここで
    各Ｃ＊は、独立に１２Ｃまたは１３Ｃであり；
    各Ｎ＊は、独立に１４Ｎまたは１５Ｎであり；
    各Ｘは、独立にＯまたはＳであり；
    Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり；
    各Ｚは、独立に水素；重水素；フッ素；塩素；臭素；ヨウ素；アミノ酸側鎖；置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基；あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基である、化合物。
  11. 式：
    の請求項１０に記載の化合物であって、該化合物は、その塩形態、水和物形態、または塩でありかつ水和物である形態を含む、化合物。
  12. 前記化合物が、双性イオン、モノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡ塩またはビスＨＣｌ塩である、請求項５または１１のいずれかに記載の化合物。
  13. 前記化合物が、カルボキシレートアニオンである、請求項５に記載の化合物。
  14. 式：
    のＮ−置換ピペラジン酢酸活性エステル化合物またはその塩形態もしくは水和物形態であって、ここで
    ＬＧは、活性エステルの脱離基であり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり；
    各Ｚは、独立に水素；重水素；フッ素；塩素；臭素；ヨウ素；アミノ酸側鎖；置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基；あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換の直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であり；そして
    該Ｎ−置換ピペラジン酢酸部分が１つ以上の重原子同位体を含み、
    ＬＧが、以下：
    である、
    化合物。
  15. 前記Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステル化合物が、１３Ｃで同位体富化されている、請求項１４に記載の化合物。
  16. 前記Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステル化合物が、１つ以上の重原子同位体、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体、４つ以上の重原子同位体、５つ以上の重原子同位体、６つ以上の重原子同位体または６つより多い重原子同位体を含む、請求項１４に記載の化合物。
  17. ＬＧがＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項１４に記載の化合物。
  18. 各Ｚが、独立に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である、請求項１４に記載の化合物。
  19. 各Ｚが、独立に水素、メチルまたはメトキシである、請求項１、５または１４のいずれかに記載の化合物。
  20. Ｙが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、請求項１、５または１４のいずれかに記載の化合物。
  21. Ｘが１６Ｏまたは１８Ｏである、請求項５または１４のいずれかに記載の化合物。
  22. 式：
    の請求項１４に記載の化合物であって、ここで
    各Ｃ＊は、独立に１２Ｃまたは１３Ｃであり；
    各Ｎ＊は、独立に１４Ｎまたは１５Ｎであり；
    ＬＧは、活性エステルの脱離基であり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり；そして
    各Ｚは、独立に水素；重水素；フッ素；塩素；臭素；ヨウ素；アミノ酸側鎖；置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基；あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基である、化合物。
  23. 式：
    のＮ−置換ピペラジン酢酸活性エステル化合物であって、ここで、ＬＧが、以下：
    である、化合物。
  24. 前記化合物が、モノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＴＦＡ塩またはビスＨＣｌ塩である、請求項１４〜２３のいずれかに記載の化合物。
  25. 各組込まれた重原子同位体が、少なくとも８０％の同位体純度、少なくとも９３％の同位体純度または少なくとも９６％の同位体純度で存在する、請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物。
  26. 以下：
    式：
    のＮ−置換ピペラジン酢酸化合物もしくはその塩と、
    １）式：
    の化合物、および該ピペラジン化合物が塩である場合は、必要に応じて
    ２）該ピペラジン環の塩基性窒素原子を脱プロトン化するに十分な強塩基と、
    を反応させて、それにより、式：
    のＮ−置換ピペラジン酢酸活性エステルまたはその塩形態もしくは水和物形態を形成する工程であって、ここで
    Ｈａｌは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり；
    ＬＧは、活性エステルの脱離基であり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり；
    各Ｚは、独立に水素；重水素；フッ素；塩素；臭素；ヨウ素；アミノ酸側鎖；置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基；あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であり；そして
    該Ｎ−置換ピペラジン酢酸部分が１つ以上の重原子同位体を含む、ならびに
    必要に応じて該Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステルを酸で処理する工程であって、
    ＬＧが、
    である、
    を包含する、
    式：
    の該Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステルまたはその塩形態もしくは水和物形態を製造する方法。
  27. 前記Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステルが１３Ｃで同位体富化されている、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記同位体富化されたＮ−置換ピペラジン酢酸活性エステルが、１つ以上の重原子同位体、２つ以上の重原子同位体、３つ以上の重原子同位体、４つ以上の重原子同位体、５つ以上の重原子同位体、６つ以上の重原子同位体または６つより多い重原子同位体を含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記酸が、ＨＣｌまたはＴＦＡである、請求項２６に記載の方法。
  30. ＬＧがＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項２６に記載の方法。
  31. 各Ｚが、独立に水素、重水素、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である、請求項２６に記載の方法。
  32. 各Ｚが、独立に水素、メチルまたはメトキシである、請求項２６に記載の方法。
  33. Ｙが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、請求項２６に記載の方法。
  34. Ｘが１６Ｏまたは１８Ｏである、請求項２６に記載の方法。
  35. 請求項２６に記載の方法であって、反応するべき前記化合物が、式；
    を有し、ここで
    各Ｃ＊は、独立に１２Ｃまたは１３Ｃであり；
    各Ｎ＊は、独立に１４Ｎまたは１５Ｎであり；
    ＬＧは、活性エステルの脱離基であり；
    各Ｘは、独立にＯまたはＳであり；
    Ｙは、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルエーテル基であって、ここで該アルキル基またはアルキルエーテル基は、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換であり；
    各Ｚは、独立に水素；重水素；フッ素；塩素；臭素；ヨウ素；アミノ酸側鎖；置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基であって、該アルキル基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルキル基；あるいは置換もしくは非置換のアリール基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であって、該アルコキシ基およびアリール基が、各々、独立に重水素原子もしくはフッ素原子で置換されるかまたは非置換である、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基である、方法。
  36. 請求項３５に記載の方法であって、前記反応の生成物が、式：
    のＮ−メチルピペラジン酢酸活性エステルであり、ここでＬＧは、以下：
    である、方法。
  37. 各組込まれた重原子同位体が、少なくとも８０％の同位体純度、少なくとも９３％の同位体純度または少なくとも９６％の同位体純度で存在する、請求項２６〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記Ｎ−置換ピペラジン酢酸活性エステルが、モノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビスＨＣｌ塩またはビスＴＦＡ塩である、請求項２６〜３６のいずれかに記載の方法。
  39. ２種以上の異なる同重体標識で標識化された同じ分析物を含む混合物であって、ここで該標識化分析物のうちの少なくとも２つが、以下：
    からなる群より選択される式の化合物、またはそれらの塩形態、水和物形態、もしくは塩でありかつ水和物である形態であり、ここで、該分析物は、脂質、ステロイド、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、１５００ダルトン未満の低分子、ならびに、置換もしくは非置換の酢酸部分でＮ−アルキル化されている環窒素原子を含有する５員、６員または７員の複素環式環であり、ここで、該環は、脂肪族であっても芳香族であってもよく、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アミン基、ヒドロキシル基またはチオール基で置換されていてもよい、混合物。
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