CN111512411A - 同量异序标签在质谱法中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及同量异序标记在使用数据非依赖性采集(DIA)的质谱法(MS)分析中的用途，其中所述同量异序标记包括在质谱仪中碎裂的基团或由其组成，所述基团碎裂(i)在低于碎裂分析物衍生的前体离子所需能量的能量下和/或比所述前体离子更高的转化率；和(ii)在根据(i)所述的能量下，并且当与前体离子偶联时，在所述基团内的单个位点处产生第一部分和第二部分，所述第二部分与所述前体离子偶联。

Description

同量异序标签在质谱法中的用途
本发明涉及同量异序标记(isobaric label)在使用数据非依赖性采集(DIA)的质谱法(MS)分析中的用途，其中所述同量异序标记包括在质谱仪中碎裂的基团或由其组成，所述基团碎裂(i)在低于使分析物衍生的前体离子碎裂所需能量的能量下和/或比所述前体离子更高的转化率；和(ii)在根据(i)所述的能量下，并且当与前体离子偶联时，在所述基团内的单个位点处以产生第一部分和第二部分，所述第二部分与所述前体离子偶联。
在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开内容虽然被认为与本发明的可专利性无关，但其全部内容通过引用并入本文。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独文件通过引用被具体地和单独地表明并入一样。
在复杂混合物领域中，例如在生物系统研究中，通过质谱法(MS)的分析正在持续地扩大。质谱法可用于确定分析物的身份及其数量。经验表明，在检测器(例如Orbitrap检测器)中的分析是限速步骤。为了增加通量的目的，已经开发了涉及在差异标记每个样品中的分析物后汇集样品的程序。这在本领域中称为同量异序标记。已确立的同量异序标记的形式称为TMT和iTRAQ。将同量异序标记与分析物(通常为肽)缀合，随后在质谱仪中碎裂。当使用本领域已确定的同量异序标记时，不可能仅使标记碎裂而不使肽分析物碎裂。当分析物-标记的缀合物碎裂时，形成至少一个碎片，其包含肽分析物的一部分。形成至少一个进一步的碎片，其不包含肽分析物的任何部分。当依赖本领域已确定的同量异序标记时，只有后者可以用于定量。这对质谱仪的操作模式有重要影响。由于用于定量的碎片不包含关于其衍生自的肽-标记缀合物的信息，因此仅当分离和分析非常有限的m/z范围(基本上对应于单个分析物)时，才可能进行定量。这对通量和/或光谱分辨率有严重的影响，尤其是在质谱仪在线偶联到提供恒定样品输出的装置(例如液相色谱装置)的设置中。
鉴于以上，非常需要在质谱仪上更好地利用时间。一方面可以就其本身而言通过质谱仪更好的时间管理，另一方面通过使用先进的同量异序标记，来实现这样的更好的利用。本发明通过两种途径解决了现有技术缺陷，该两种途径可以单独使用或组合使用。
因此，在第一方面，本发明涉及同量异序标记在使用数据非依赖性采集(DIA)的质谱法(MS)分析中的用途，其中所述同量异序标记包括在质谱仪中碎裂的基团或由其组成：所述基团碎裂(i)在低于使分析物衍生的前体离子碎裂所需能量的能量下和/或比所述前体离子更高的转化率；和(ii)在根据(i)所述的能量下，并且当与前体离子偶联时，在所述基团内的单个位点处以产生第一部分和第二部分，所述第二部分与所述前体离子偶联。
与MS结合使用的术语“数据非依赖性采集”(缩写为“DIA”)具有其本领域已确定的含义(Gillet等人，2012，doi：10.1074/mcp.O111.016717)。通常，它是指如此m/z范围的MS2扫描中的分析，该范围具有通常包含多种分析物的宽度。MS1扫描中的峰数目或峰类型通常不会影响m/z范围的选择；还进一步参见下文。
应当理解，术语“前体离子”不是指单个离子或单个分子，而是指相同种类(即相同化学组成和构成)的多个分子或离子。
此外，应当理解，例如当结合多个样品使用时，术语“同量异序标记”实际上是指一组标记。在这样的组中的这些标记在化学上是相同的，但具有不同的同位素取代模式。以下标题为“同量异序标记”的部分将对此进行进一步的解释和说明。
优选分析物是肽。如本领域已知的，通过蛋白水解，优选地胰蛋白酶消化多肽或蛋白质来获得肽。
同量异序标记
在较早的国际专利申请WO 2018/087397中已经公开了根据第一方面的同量异序标记。该较早申请的全部公开内容是本发明的一部分，并且通过引用并入本文。我们注意到，上述“在质谱仪中碎裂的基团”在WO 2018/087397中的“在质谱仪中碎裂的部分”中具有其对应部分。
此外，应当理解，在与分析物缀合之前，同量异序标记包含反应基。该反应基在WO2018/087397中也指定为“反应部分”。
取决于上下文，使用术语“同量异序标记”来指定两种可能性之一：第一，包括能够碎裂的部分和反应部分的化合物，这是在与任何分析物缀合之前的同量异序标记；和第二，同量异序标记以其与分析物缀合的形式，在这种情况下，反应部分不再存在。
关于包括反应部分并依赖于WO 2018/087397的公开内容的同量异序标记，同量异序标记是包括以下或由以下组成的化合物：(a)反应部分，所述反应部分能够与肽的官能团反应以形成共价键；和与其共价地连接的在质谱仪中碎裂的(b)部分，所述部分碎裂(i)在以低于使肽碎裂所需能量的能量下和/或比肽更高的转化率；和(ii)在根据(i)所述的能量下，并且当经由所述反应基与肽偶联时，在与肽偶联的所述化合物内的单个位点处以产生第一部分和第二部分，所述第二部分与所述肽偶联。
该化合物被设计用于与肽、多肽或蛋白质共价地连接。这是通过要求(a)实施的。用于将化合物偶联至肽的许多化学品是可获得的，并且是技术人员已知的。为此目的的优选和/或示例性解决方案将在下面进一步详细公开。根据第一方面，能够与反应部分反应的肽、多肽或蛋白质的优选官能团是氨基，例如肽、多肽或蛋白质的N-末端主链氨基或侧链氨基。因此，优选反应部分是胺反应部分。
与分析物，更具体地为肽反应后，形成化合物-肽缀合物。在所述单个位点碎裂后，所述化合物-肽缀合物产生所述第一部分和第二缀合物。第二缀合物是所述肽与在所述第一部分后丢失后本发明的所述化合物的其余部分(第二部分)的缀合物。如果多个肽以相同衍生，那么碎裂将产生多个第二缀合物。这些第二缀合物具有恒定和可变的部分。可变部分由包括在具体第二部分中的具体肽决定，和恒定部分是源自所述化合物的第二缀合物的组分。该部分在本文中也称为第二缀合物的恒定部分。在本领域中，并且相对于与本文所公开的同量异序标签不同的同量异序标签，恒定部分也指称为“平衡部分”。第二部分或恒定部分在一定意义上是恒定的，因为对于给定的化合物，第二部分或恒定部分始终具有相同的化学结构。关于同位素取代，应当理解，在一组具有相同结构的化合物中，所述第二部分或恒定部分在它们的同位素取代方面彼此不同，结果是该组化合物中不同的第二部分具有不同的质量——至少不同的精确质量并且优选地还为不同的标称质量。在结构方面，第二部分恒定部分一般地是化合物的部分，该部分以开始于可碎裂(可切割)的键并结束于所述第二缀合物中的分析物或肽的第一原子之前的原子。在某些情况下，可能发生质子、氢或水等等的损失。
与所述反应部分共价地连接，所述化合物此外包括在质谱仪中碎裂的部分或额外地由其组成。在这方面的重要特征是，在低于使分析物具体是肽碎裂所需能量的能量下发生碎裂。可选地或另外地，部分在质谱仪中以比分析物具体是肽更高的转化率(conversation rate)碎裂。术语“转化率”在下面进一步限定。一般而言，比肽更高的转化率的要求适用于低于完全肽碎裂的所有能量。在优选实施方式中，肽碎裂在约30以上，例如在约23至约30之间的间隔中的归一化高能碰撞解离(HCD)碰撞能(NCE)下发生。根据本发明的部分(b)优选地在低于23的归一化HCD碰撞能(NCE)下碎裂。
尽管碎裂阈值是参照HCD碰撞能定义的，但是本发明化合物的用途不限于具体的解离方法。例如，也可以使用碰撞诱导解离(CID)、SID、ETD、ECD或光解离。
在本领域中已经确立，质谱仪可以以不同的模式操作。可以通过质谱仪中离子获取的能量来区分模式。关于为肽、多肽或蛋白质的分析物，质谱仪可以以碎裂模式和非碎裂模式操作。尽管在非碎裂模式下，分析物基本上保持完整，但这不适用于碎裂模式。由于使用了更高的能量，分析物尤其是肽、多肽和蛋白质会碎裂。还可以操作质谱仪致使其在两种模式之间快速切换，从而以碎裂和非碎裂模式伴随地分析给定的馏分或样品。
尽管现有技术提供了在肽也碎裂的能量下碎裂的同量异序标记，但这不适用于所提及的化合物或同量异序标记。部分(b)以较低的能量和/或以较高的转化率碎裂。结果，化合物提供了一种选项，以在仅使部分(b)碎裂而肽不碎裂的能量下操作质谱仪，和/或操作该质谱仪致使部分(b)以比肽更高的转化率碎裂。根据后一个功能要求，应当理解，在给定的能量下不一定完全不存在肽碎裂。相反，重要的是在给定能量下，部分(b)以较高的转化率碎裂。阈值在下面进一步限定。显然地，在足够高的能量下，部分(b)和肽二者都将以相当且高的程度碎裂。
在优选实施方式中，上述肽的碎裂是肽主链的碎裂。术语“肽主链”具有其本领域已确定的含义。它是指由α氨基的氮原子、α碳原子和直接结合到给定肽的每个组成氨基酸的α碳原子的羰基的碳原子形成的共价链。
术语“更高的转化率”优选地指与肽相比，至少多2倍的碎裂部分(b)，优选地与肽相比至少多3倍、至少多5倍或至少多10倍的碎裂部分(b)。优选地，这些倍数变化值适用于化合物碎裂的最佳能量。优选地，所述用于化合物碎裂的最佳能量为22或以下的归一化碰撞能量(NCE)。
此外要注意的是，部分(b)在单个限定位点处碎裂。碎裂将产生第一和第二部分。尽管现有技术没有描述或暗示具有上述化合物的低能量碎裂和/或高转化性质的化合物，但我们注意到，所提及的第一和第二部分在本领域已确定的同量异序标记的化合物的报告部分和平衡部分中具有相对应部分。
当释放第一部分时，第二部分保持与肽结合。由第二部分和肽组成的分子或离子也称为互补部分、互补分子、互补离子或肽偶联的报告分子/离子(当用作定量的报告分子/离子时)。
化合物的特征在于高转化率，同时允许它们在基本上不接触附连的肽的条件下碎裂。术语“转化”在本文中用作等同于碎裂。化合物的转化比现有技术已确立的串联质量标签(TMT)至少高5倍或至少高10倍。优选地，这些倍数变化值适用于化合物碎裂的最佳能量。优选地，所述用于化合物碎裂的最佳能量为22或以下的归一化碰撞能量(NCE)。
应当理解，化合物的部分(b)碎裂后形成的第一部分和第二部分是不相同的。所述部分(b)既不对称地碎裂，其也不是对称分子。此外，当作为整体考虑化合物时，至少优选地仅存在单个反应部分。所述单个反应部分与部分(b)的为所述第二部分的部分共价地连接。由此在化合物以其肽结合形式碎裂后，仅仅确保形成互补碎片，该互补碎片包括分析物(例如肽)和所述第二部分或优选地由分析物(例如肽)和所述第二部分组成。
此外，应当理解，至少在优选实施方式中，所述化合物包括单个部分(b)。
应当理解，如化合物的定义的第(ii)项中所述的“根据(i)的所述能量”是指低于(显著)肽碎裂的阈值的能量。此外，应当理解，“更高的转化率”是指统计学上显著更高的转化率。优选地，在上至约22的归一化碰撞能量(NCE；参见下文)下，发生统计学上显著更高的转化率。
在优选实施方式中，(a)当所述化合物经由所述反应基与肽偶联时，所述化合物碎裂的能量，在约17、约19、约21或约23的归一化HCD碰撞能量下分别具有约35％、约55％、约75％或约90％的中值转化率；和/或(b)在根据(a)的能量下，在除所述单个位点以外的位点处的碎裂低于20％，优选地低于10％。
在进一步优选实施方式中，(a)当所述化合物经由所述反应基与肽偶联时，所述化合物碎裂的能量，在约12、约14、约16、约18或20以上的归一化HCD碰撞能量下分别具有约30％、约45％、约65％、约75％或超过85％的中值转化率。
如上所述，本文等效地使用“转化”和“碎裂”。例如，30％的转化率意味着30％的化合物会碎裂，而70％的化合物保持完整。化合物碎裂(也称为化合物转化)的百分比是通过将肽偶联的报告离子(偶联至非碎裂的肽的碎裂的化合物)的强度除以具有完整和碎裂的化合物的前体离子(非碎裂的肽)的总强度来计算。
缩写“HCD”是本领域已确定的并且指高能碰撞解离。事实上，使化合物碎裂所需的能量取决于所述化合物的质量和电荷。为了具有碰撞能量(CE)的统一量度，已引入归一化碰撞能量的概念。如下所示，可以从归一化碰撞能量(NCE)计算绝对碰撞能量：
Figure BDA0002549877020000061
其中m是所考虑化合物的质量，和z是其电荷。对于每个离子NCE始终是相同的值，而绝对碰撞能量是可变的并且取决于电荷和质量；参见，例如Neta等，Journal of theAmerican Society for Mass Spectrometry 20，469-476(2009)。
优选地，上述限定的归一化碰撞能量由Thermo Fisher在Q精确质谱仪上确定。在其他仪器上，可以使用类似的归一化能量。
从上面显而易见的是，所述化合物的特征在于它们在比肽主链更低的能量下碎裂。本领域的技术人员将理解，碎裂通常是如此过程，当增加能量时，其特征不是瞬时发生。相反，在给定的NCE下完全碎裂的分子的碎裂也可能在一定程度上在低于给定值的能量下发生。例如，肽主链的显著碎裂在NCE值为27或更高下发生，但也可能以显著较低程度，在较低能量下发生。对于本发明的目的而言重要的是存在这样的条件，其中发生化合物的优先碎裂，同时肽的骨架基本上保持完整。该适用的通常NCE值是在5到22之间的NCE，优选地在10到22之间。这些是当与肽主链的碎裂相比，以统计学上显著更高程度发生化合物碎裂的能量。接受一方面的化合物与另一方面的肽骨架的碎裂率之间的统计学上显著差异的概念，则可以引入参数ΔNCE，其限定如下：在肽主链碎裂至少30％时的NCE减去根据本发明的分子碎裂至少30％时的NCE(参见以上化合物碎裂的定义)。对于根据本发明的分子，该值是正的。对于现有技术的同量异序标签，例如TMT，它是负的或零。
肽主链碎裂(也称为肽主链转化)的百分比是通过将所有碎片离子(具有完整和碎裂的化合物的b和y离子)的总和除以肽碎片离子和肽前体离子的总强度(具有完整和碎裂的化合物的b和y以及前体离子的总强度)。
在进一步优选实施方式中，所述化合物或所述同量异序标记包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个，例如十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个同位素标记的原子，同位素标记的原子优选为13C和/或15N。
同位素标记的质量标签通常以两种或更多种不同的标记形式提供，其中总质量始终相同。
尽管总质量相同，但是以允许第一部分和第二部分的质量变化的方式选择标记方案。在给定的标记方案下具有相同总质量的可能的差异标记的化合物的最大数量限定了通过给定的标记模式可承受的最大多路复用度。举一个简单的例子，可以设计化合物，致使在第一部分中恰好有一个位置可以被标记，而在第二部分中也恰好有一个位置可以被标记。标记可以是例如13C标记。如果在部分(b)中恰好有一个13C标记，则可以以两种方式实施，即通过标记第一部分中提到的位置或通过标记第二部分中提到的位置。这产生了两个质量上相同的同量异序质量标签，但是当部分(b)碎裂时，将产生可区别的信号。
在第一和/或第二部分包含一个以上适合标记的位置的那些情况下，更高程度的多路复用是可能的。
在结构上，优选地，所述化合物包含式(I)的部分
–X–CH2–(Y)n–Z–
(I)
其中X为SCH3、SO或SO2；Y为CH2、NH或O，条件是(Y)n包括选自NH和O中的0或1个基团；n为0、1、2、3、4、5、6、7或8，优选地为0或1；和Z为CHA-Y或CH2-CO，其中A为吸电子基团，优选地为NO2或卤素，例如F，其中优选地，所述部分为-SO-(CH2)2-CO-。还优选地是，所述部分是-SO2-(CH2)2-CO-。
考虑到所述化合物包含式(I)的部分，应当理解在(完全的)化合物中，填充X和Z上的自由价。
在所述式(I)中，(X)与相邻的CH2基团之间的键是如上提及的发生碎裂的单个位点。重要的是，所述键不是肽键。现有技术的同量异序标签经常使用肽键作为碎裂位点。由于该原因，现有技术的同量异序标签在保留分析物完整的同时不能提供标签的选择性碎裂。与此不同，本发明的化合物比肽键更适于碎裂。另一方面，化合物中待碎裂的键也不应太脆弱。为了进一步解释，在非常脆弱的键的情况下，在电离过程期间将已经发生了碎裂，这是不期望的。因此，化合物在一方面认识到使用在比分析物(尤其是肽)更低的能量下碎裂的标签的优点与避免已经在电离阶段中的相关碎裂之间取得平衡。如果在电离阶段期间超过5％的本发明化合物碎裂，则认为发生了相关的碎裂。
式(I)中未描绘的那些部分在比式(I)中的X-CH2键更高的能量下碎裂。
具体优选地是X为SO。还具体优选地是X为SO2。
具体优选地是Y为CH2。
具体优选地是n为0。
具体优选地是Z为CH2-CO。
X不限定本发明化合物的对称中心。
式(I)中的原子，优选地C和N原子，可以被同位素标记。
在进一步优选实施方式中，所述反应性基团选自N-羟基丁二酰亚胺(NHS)；叠氮化物，包括芳香基叠氮化物，例如苯基叠氮化物和硝基苯基叠氮化物；五氟苯基(PFP)酯；补骨脂素；双吖丙啶；膦；乙酰胺，例如碘乙酰胺、溴乙酰胺和氯乙酰胺；碘乙酸；马来酰亚胺；硫代磺酸盐；乙烯砜；吡啶基二硫醇；炔烃；亚氨酸酯；芳基卤，例如二氟芳基；酰肼；烷氧基胺；碳二亚胺；异氰酸酯和乙二醛。
具体优选地为NHS。
进一步的反应基是技术人员可以处理的，并且可以基于待靶向的给定目标肽中的官能团进行选择；参见，例如，Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques(ISBN：978-0-12-382239-0)。可以被靶向的肽中的官能团包括在N末端和碱性氨基酸中的氨基，半胱氨酸的巯基，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧酸盐。
优选地，所述化合物具有式(II)
B1–式(I)–B2–D
(II)
其中B1和B2是适于多路复用的同位素标记的部分，优选地是多路复用的同位素标记的部分，优选地在C原子处；D是如关于第一方面所限定的反应部分；或其盐或溶剂化物，或在适用范围内的互变异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或其混合物。
显然，反应部分D仅与B2连接。至少在优选实施方式中，B1不包括任何反应部分。
上文中已经解释了多路复用的同位素标记的概念。因此，应该理解，部分B1和B2中的二者之一包含至少一个适合于有差异的同位素标记的原子。有差异的同位素标记的实例是在给定位置处以一种同位素标记的形式存在13C，而以另一种同位素标记的形式存在12C(或可选地，自然同位素分布)。
13C是碳原子的优选同位素标记的形式。可选地或此外，氮原子(在它们存在于部分B1和B2的情况下)可以被同位素标记。用于氮的优选同位素标记是15N。
在优选实施方式中，B1由式(III a)或(III b)限定
H3C–(Y)m–E–(Y)p
(III a)
或
K-CH2-(Y)m-E-(Y)p
(III b)
其中E是O-CO、S-CO、O-CS、S-CS、(CH2)2或NH-CO；Y如关于式(I)或CH(CH3)所限定的；m为1、2或3；和p为1、2或3；K是富集部分；其中优选地B1为CH3-CH2-O-CO-CH2、CH3-CH2-NH-CO-CH2、CH3-CH(CH3)-O-CO-CH2或CH3-CH(CH3)-NH-CO-CH2；和/或
B2由式(IV a)、(IV b)或(IV c)限定
NR1–(CH2)q–G
(IV a)
CHR1–(CH2)q–G
(IV b)
OR1-(CH2)q-G
(IV c)
其中R1为H、C1到C4烷基或环烷基，例如环戊基和环己基；G是在一定程度上需要时用于将B2连接至所述反应性基团D的官能团；q为1、2、3、4、5、6、7或8，优选地为1；其中优选地B2为NH-CH2-CO。
任选地，B1可包括富集部分K。这如式(III b)显示。
具体优选地是E为O-CO。
具体优选地是m为1。
具体优选地是p为1。
如上所述，部分B2连接至反应基D，基团D又被设计用于偶联至肽的氨基酸中的官能团。取决于所述反应基D的具体设计，可能有利或必要的是存在连接基团G，其提供用于将反应基D连接至部分B2。举个例子，对于为NHS的反应基D，用于连接的官能团即基团G为CO。当NHS的羟基与所述CO结合时，形成活性酯；参见，例如下面的式(V)。
具体优选地是R1为H。
具体优选地是q为1。
具体优选地是式(IVa)。
这些化合物可以经由现有技术已确立的路线合成可得；参见，例如VirreiraWinter等人，Nature Methods 15，527-530(2018)。
在进一步优选实施方式中，同位素标记存在于B1、式(I)和B2中的一个、多个或全部中。
在进一步优选实施方式中，所述化合物具有式(V a)或(V b)：
Figure BDA0002549877020000101
其中R2是氢或吸电子基团如卤素、NH3 +、NR3R4R5+或NO2，其中R3R4和R5独立地是C1到C6烷基或环烷基、C2到C6链烯基或环烯基或C2到C6炔基(alkinyl)；
J是适于同位素标记的部分，并含有C和任选的N和/或O；优选地取代的或未取代的C1至C6烷基或环烷基、取代的或未取代的C2至C6链烯基或环烯基或取代的或未取代的C2至C6炔基，其中1或2个碳原子可以被选自O、N、S和P的杂原子取代，取代基包括OH、卤素、甲基和甲氧基；J最优选地为H3C-(CH2)r-O、H3C-(CH2)r-NH、H3C-CH(CH3)-O或H3C-CH(CH3)-NH；
n为0至19之间的整数，优选地为1；和
r为0至20之间的整数，优选地为1；
Figure BDA0002549877020000111
其中
R2是吸电子基团，例如卤素、NH3 +、NR3R4R5+或NO2，其中R3、R4和R5独立地是C1到C6烷基或环烷基、C2到C6链烯基或环烯基或C2到C6炔基；
r和t独立地为1到20之间的整数。
与如上所限定的具体优选地为SO或SO2的部分X一致，式(V a)和(V b)以及以下所有式中的SO基团可以被SO2取代。
与此相关的，本发明提供了式(V a)和(V b)的化合物，条件是SO被SO2取代。
在具体优选实施方式中，式(V a)通过式(V a1)实施。
Figure BDA0002549877020000121
其中r为0至20之间的整数；和
其中s为0到19之间的整数。
在具体优选实施方式中，式(V b)通过式(V b1)实施。
Figure BDA0002549877020000122
其中r和t独立地为1-20之间的整数，R3、R4和R5如上所限定。
关于式(V a1)，优选地为s＝r-1。这允许均等数量的C原子适于在碎裂位点的任一侧上标记。
在优选实施方式中，r＝2和s＝1(这适用于式(Va3)的化合物)或r＝4和s＝3(式(Va2)的化合物)。满足此要求的分子在式(V a2)和(V a3)中显示。数字表示适于在碎裂位点的任一侧上标记的C原子。
Figure BDA0002549877020000123
Figure BDA0002549877020000131
式(Va2)化合物允许多路复用的标记，即8路复用，并且式(Va3)的化合物允许6路复用。
进一步优选的实施式(V a)的分子是：
Figure BDA0002549877020000132
类似地，式(Va1)中的r＝1和s＝0允许进行5路复用，r＝2和s＝1用于6路复用，且r＝3和s＝2用于7路复用。
关于式(V b)，优选地是r＝t。这允许均等数量的C原子适于在碎裂位点的任一侧上标记。在优选实施方式中，r＝t＝4。
如上所述，R3、R4和R5独立地是取代的或未取代的C1到C6烷基或环烷基、取代的或未取代的C2到C6链烯基或环烯基或取代的或未取代的C2到C6炔基。优选取代基是OH、卤素、甲基和甲氧基。优选地为R3＝R4＝R5＝甲基。R3、R4和R5中的两个可以一起是O或S。R3、R4和R5中的第三个可以是O或S。例如，NR3R4R5可以是NO2。
式(V b)的优选实施方式如下所示。
Figure BDA0002549877020000141
进一步优选式(V a)的化合物是式(V a7)的化合物：
Figure BDA0002549877020000142
进一步具体优选的式(V a)的化合物是：
Figure BDA0002549877020000151
根据上述式中X为SO2的那些优选实施方式，特别优选以下化合物：
Figure BDA0002549877020000152
与此相关，本发明提供式(V a11)的同量异序标记；和式(V a12)的同量异序标记。还提供了式(V a11)或(V a12)的化合物作为同量异序标记的用途。
含有NHS的式(Va)的化合物与肽偶联，所述带有氨基NH2的肽在用于式(Va7)的化合物的以下方案中图解：
Figure BDA0002549877020000161
在进一步优选实施方式中，所述第一部分不带电荷。换句话说，在将化合物-肽缀合物碎裂以产生第一和第二部分时，发生中性损失，并且最初存在于所述缀合物上的电荷完整地保留在第二部分上，该第二部分是包括分析物的碎片。结果，包括分析物的离子的m/z在碎裂时保持不变。这是有利的，因为分析物的离子将出现在一般地以高分辨率和/或高精度为特征的光谱的一部分中(较低的m/z范围)。特别地，与现有技术相比，提高了灵敏度，这是因为在碎裂时保持了较高的电荷状态。
进一步优选实施方式和进一步方面
关于第一方面，本发明在第二方面中提供了使用质谱仪的分析方法，所述方法包括以与数据非依赖性的方式收集源自不同分析物的前体离子，其中所述前体离子带有如根据第一方面所限定的同量异序标记。
在贯穿本公开内容中，优选的同量异序标记是本文以上的式(II)的那些，注意当以形成分析物-标记缀合物时反应部分D不再存在。
在第一和第二方面的优选实施方式中，收集发生在一个或多个m/z范围内的所有前体离子。
优选地是收集在发生在一个m/z范围内的所有前体离子。在使用一个以上m/z范围的情况下，这些通常是十、二十、三十、四十、五十、六十、七十、八十、九十、一百、两百、三百或更多个m/z范围。由于如上所述的化合物和同量异序标记的有利性质，对于m/z窗口大小的选择没有具体限制。具体地，不需要将m/z窗口定制为单个峰或单个化学种类。相反，根据该优选实施方式，可以在一个或多个m/z范围内包括对应于多种分析物的多个峰或峰簇。m/z范围的通常宽度是五十、四十、三十、二十五、二十、十二、十、九、八、七、六、五、四、三、二和一。
如本公开内容中所使用的术语“收集”是指在质谱仪中汇集和任选地存储一种或多种离子的步骤，其通常在——任选地将它们碎裂——在分析器(或检测器)中分析它们之前。在下面进一步公开优选的收集方式。
应当理解，收集步骤包括分离一种或多种前体离子的步骤，通常在DDA的情况下分离一种前体离子，在DIA的情况下分离其多种。在DIA的情况下，前体没有特别分离而是一起分离，因为它们在一定的m/z范围内作为一个整体分离。所述分离优选地以四极杆执行。因此，优选质谱仪是配备有四极杆的那些质谱仪。
在第三方面，本发明提供了如关于第一方面所限定的同量异序标记在使用数据依赖性采集(DDA)的质谱法分析中的用途。
与此相关，本发明在第四方面中提供了使用质谱仪的分析方法，所述方法包括以数据依赖行的方式收集源自不同分析物的前体离子，其中所述前体离子带有如关于第一方面所限定的同量异序标记。
术语“数据依赖性”和“数据依赖性采集”(缩写为“DDA”)具有其本领域已确定的含义(Hu等人，2016，doi：10.12688/f1000research.7042.1.)。因此，根据第三和第四方面的优选实施方式，基于(a)它们的强度；和/或(b)现有知识，收集前体离子。
换句话说，所述前体离子的强度可以是驱动选择待选择的离子的数据。一般地，选择丰富的峰。结果，为了在数据依赖性采集背景下收集的目的而进行的选择一般而言取决于待分析的一种或多种样品的组成。至少一般来讲，这不适用于数据非依赖性采集。
在上述公开的可选方案(b)中，基于现有知识进行选择和收集。现有知识没有具体限制。它包括实例m/z值并且前体离子的保留时间是从相关样品分析领域的经验或数据库中获知的。例如，如果要测试一系列样品中某种肽的存在，为了数据依赖性采集的目的，可以利用在时间和m/z分辨率上在质谱中所述肽的峰位置的现有知识。因此，在这种情况下，与在常规DDA中一样，m/z范围非常小。即使所有其他峰可能非常强烈，其也不会被选择。这通常在常规应用中执行，例如用于分析临床样品，其中测量了大量非常相似的样品，并且仅选择了很少的肽用于MS2分析。
优选分析物是肽。
在第五方面，本发明提供操作包括检测器的质谱仪的方法，所述检测器优选地是Orbitrap检测器或TOF检测器，所述方法包括在所述检测器中分析碎片离子期间经过的时间中，将一种或多种进一步的前体离子碎裂。
在某些情况下，用于在检测器中分析通过从前体离子碎裂获得的碎片离子的时间超过了收集和碎裂后续的前体离子所需的时间。结果，当使用现有技术配置的光谱仪时，在所述光谱仪中包括的用于前体的分离和碎裂的装置在检测器忙碌时闲置。对于具有Orbitrap分析器的Q Exactive仪器，通常收集105至5x105个离子，以获得MS2扫描，其含有足够的离子以鉴定肽。在Q Exactive仪器中，当Orbitrap分析先前碎裂扫描的m/z时，收集和碎裂前体离子。尽管在Orbitrap中分析碎片离子m/z的时间取决于所需的分辨率，但收集和碎裂足够的前体离子所需的时间取决于前体离子的丰度。因此，尽管Orbitrap仍在忙于分析先前的扫描，通常可以对高丰度的前体收集足够的前体离子。
MS2扫描的分辨率越高，质量精度越高，并且鉴定和定量就越好(因为可以分辨出具有很小质量差的峰，并然后将它们相互区分)。在一次MS2扫描中一起分析的前体数量越多，在复杂肽混合物中鉴定和定量的肽序列的数量就越高。
上述方面有利地利用了所提到的闲置时间(收集和碎裂足够的离子，但是检测器仍然忙碌)。使用现有技术配置，该闲置时间不用于分离和碎裂进一步的离子。在本发明中，闲置时间用于分离和碎裂第二前体离子，如果时间允许，分离和碎裂第三、第四等前体离子。因此，可以在同一MS2(碎裂)扫描中读取多个前体离子。通过收集多个前体，可以以更高的分辨率执行MS2扫描。可选地，通过收集多个前体，可以以相同的分辨率分析更多前体，而无需延长分析时间。这如图1中所图解。
给出在相同分辨率下进行具有更多前体的MS2扫描的实例：在Q Exactive HFOrbitrap仪器上的标准方法中，在55ms内收集105个前体离子，并然后碎裂和在m/z 200下以30,000的分辨率进行分析，导致64ms的过渡时间(transient time)。使用本发明的方法，例如在55ms(例如25ms足以收集每种前体的105个离子)内收集2种不同的前体离子(每种105个离子)，随后碎裂并且在m/z 200下以30,000的分辨率进行分析，导致64ms的过渡时间。
给出以更高的分辨率执行MS2扫描的实例：
在Q Exactive HF Orbitrap仪器上的标准方法中，在55ms内收集105个前体离子，然后碎裂并且在m/z 200下以30,000的分辨率进行分析，导致64ms的过渡时间。使用本发明的方法，例如在110ms(55ms足以收集每种前体的105个离子)内收集2种不同的前体离子(每种105个离子)，随后碎裂并且在m/z 200下以60,000的分辨率进行分析，导致128ms的过渡时间。在这种情况下，可以在同一时间范围内以更高的分辨率分析两种前体。
在第五方面的方法的优选实施方式中，在所述时间期间和在所述碎裂之前，收集所述一种或多种进一步的前体离子。
在进一步优选实施方式中，收集和碎裂多种进一步的前体离子，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、50种或100种进一步的前体离子。
应该理解，“进一步的”前体离子的概念意味着区分一方面已经碎裂并且现在于检测器中分析的前体离子与同时收集和碎裂的那些前体离子。在本发明的第五方面的背景下，后者被称为“进一步的前体离子”。
第五方面的方法优选地与第二方面和第四方面的方法结合。因此，提供了使用质谱仪的分析方法，所述方法包括以数据非依赖性的方式收集源自不同分析物的前体离子，其中所述前体离子带有如上所限定的同量异序标记，所述方法进一步包括在所述质谱仪的检测器中分析碎片离子期间经过的时间中，收集和碎裂一种或多种进一步的前体离子(图2)。还提供了使用质谱仪的分析方法，所述方法包括以数据依赖性的方式收集源自不同分析物的前体离子，其中所述前体离子带有如上所限定的同量异序标记，所述方法进一步包括在所述质谱仪的检测器中分析碎片离子期间经过的时间中，将一种或多种进一步的前体离子碎裂。
在优选实施方式中，所述前体离子带有同量异序标记，优选地如上文所限定的同量异序标记。
在进一步优选实施方式中，在所述检测器中分析的所述碎片离子源自多个前体离子。
根据该优选实施方式，不仅可以收集和碎裂多个前体离子，而且还可以使多个前体离子产生正在检测器中分析的那些碎片离子。
总而言之，具体优选地是，在质谱仪随后的工作周期(duty cycle)中，总是收集并碎裂多个前体离子，而同时分析源自多个前体离子的碎片离子；另请参见图1。
在进一步优选实施方式中，分配进行分析的时间随着所述多个中的前体离子的数量而增加。
该优选实施方式说明了本发明的具体优选特征，即改进了在光谱仪上的时间使用。进一步解释：如本文上面所公开的同量异序标签(在本文中也称为“化合物”)允许源自不同分析物的前体离子的汇集(“收集”)。结果，在给定时间内分析了更多的离子。由检测器分配和花费的用于在质谱仪的一个工作周期内进行分析的时间也称为“过渡时间”。如果在常规方法(使用本领域已确立的同量异序标记)中，需要N个工作周期来分析N个分析物。当使用上述公开的同量异序标记时，这可以减少到单个工作周期。该单个工作周期可以比质谱仪的标准工作周期长N倍。质谱的准确性和分辨率从中显著受益。
也可以例如根据离子电流来动态地调整上述方案。与低丰度前体离子相比，高丰度前体离子需要更少的时间来收集足够数量的离子，通常在0.5x105和5x105个之间。因此，如果在完整(MS1)扫描中检测到多个高丰度前体离子，则可以在同一时间范围内收集更多前体离子。
过渡时间的增加可以多达至N倍。
在不需要或不期望上述公开的过渡时间增加的那些情况下，前体离子的汇集可用于提高通量。这两种选择(分辨率增强和通量增强)在图1中图解。它们也可以组合。
在进一步优选实施方式中，所述方法是数据非依赖性采集(DIA)方法或数据依赖性采集(DDA)方法。
本文上面讨论了数据非依赖性和数据依赖性采集的概念。
在进一步优选实施方式中，所述同量异序标记(a)如关于本发明的第一方面所限定；(b)选自同量异序标记，例如TMT和iTRAQ，该同量异序标记在使为肽的分析物碎裂所需的能量或更高的能量下碎裂。在所述时间内将一种进一步的前体离子碎裂——特别是出于分析物定量的目的——的情况下，这些(一般地是本领域已确立的)标记起作用。
上面的选项(b)使用了本领域已确立的同量异序标记。如上所述，它们的特征在于它们不会优先地在显著低于使肽主链碎裂所需能量的能量下碎裂。当使用这些本领域已确立的同量异序标记进行定量时，必须依靠不带有任何结构分析物特征的报告碎片(低分子量报告分子)。因此，并且为了维持定量信息，在检测器忙碌时，仅可碎裂一种进一步的前体离子，并且随后仅可分析源自一种前体离子种类的碎片离子。
在本发明涉及方法的所有方面的优选实施方式中，所述方法包括至少一个非碎裂扫描(MS1)和至少一个碎裂扫描(MS2)，其中所述非碎裂扫描产生在所述至少一个碎裂扫描中待碎裂的前体离子。
在进一步优选实施方式中，(a)在离子阱，优选地为在C阱中执行收集；(b)前体离子的碎裂是顺序的，或者所有前体离子一起碎裂；和/或(c)在碰撞池中执行碎裂。
总而言之，用于执行本发明的方法和用途的优选质谱仪配备有用于分离前体离子的装置，优选地为四极杆；用于碎裂前体离子和/或同量异序标记的装置，优选地为碰撞池；以及用于确定m/z值的质量分析器或检测器。优选检测器是Orbitrap检测器，尤其结合第五方面的方法。否则，可以使用飞行时间(TOF)检测器。优选地，并且通常结合包括Orbitrap检测器的仪器，质谱仪包括用于收集前体离子的装置，优选地为C阱。
如上所述，待碎裂的多个前体离子可以一起碎裂。在可选方案中，它们可以顺序地碎裂。假如不同的前体离子具有非常不同的碎裂行为，尤其是如果碎裂发生在不同的能量下，这是非常有趣的。在这种情况下，以那些能提供充分转化的碰撞能处理每种前体。两种方法也可以组合，例如，可以将大量的前体分成两个或更多个组，其中每个组的成员共享的性质是，它们在相似的能量下以相似的转化率碎裂。所需的碰撞能量将在组之间显著变化。
图1中图解说明了顺序选项(每个分离的前体的单独碎裂)，以及多个前体一起的并行碎裂。
在可选方案中，可以使用捕获离子迁移率光谱仪-飞行时间(timsTOF)仪器，优选地配备平行/串行碎裂(PASEF)。参见，例如Meier等人2015，doi：10.1021/acs.jproteome.5b00932。这优选地用于第一方面的方法。
在进一步优选实施方式中，所述碎裂包括以下的一种或二种：(i)使前体和所述基团的缀合物在如此能量下碎裂，其中所述缀合物优先地在所述基团内的所述单个位点处碎裂，从而产生前体偶联的报告离子；(ii)在使所述基团和所述前体二者都碎裂的能量下使所述前体和所述基团的缀合物碎裂；其中，在执行(i)和(ii)二者的情况下，它们伴随地或随后以任何顺序执行。
根据(i)的碎裂和根据(ii)的碎裂都可以称为“MS2扫描”。优选地同时执行(i)和(ii)。
优选地，所述前体离子是或包括肽离子。在该情况下，上述的前体偶联的报告离子实际上是肽偶联的报告离子。
根据命名法，并且鉴于以上选项(ii)，应注意，术语“肽偶联的报告离子”优选地包括一组不同的种类。这些种类共享了它们包括同量异序标记的碎片。此外它们共享了它们包括肽。已经说过，应注意，在所述一组种类内，肽组分可以不同。虽然存在包括完整和未碎裂的肽的种类，但也存在一些如此种类(通常是多个)，其中肽也已被碎裂，并且在肽偶联的报告离子中只包括原始肽分析物的碎片，该报告离子与标记直接相邻。这是有利的，并且定量的准确度和精确度随给定的一组肽偶联的报告离子中不同种类的数量而增加。一组内的种类共享了它们源自相同的肽前体。
在进一步优选实施方式中，确定了肽偶联的报告离子的精确质量。为了进一步解释，如果不同同位素标记的同量异序标记之间的质量差小于1Da，例如当标签被中子编码时，则需要高分辨率MS2扫描来解析和定量肽偶联的碎片离子。在同量异序标记中，标签通常通过并入不同数量的重碳原子来区分。因此，分子之间的质量差约为1Da。为了提高多路复用能力，分子中的其他原子也可以被这些原子的较重同位素取代(例如氮，但也可以是其他)。在该情况下，必须将轻质和重质氮之间的质量差与轻质和重质碳之间的质量差区分开。该质量差仅为约6mDa。因此，需要更高的分辨率。
如上文所述，收集多个前体离子，将其碎裂(顺序地或一起)，并且将其一起分析允许显著延长过渡时间。延长的过渡时间又能够确定精确质量差异。通过如相对于第一方面所限定的同量异序标记使这成为可能。在其中报告离子不包括分析物的任何结构特征(即没有其碎片)的情况下，不可能将确定的报告强度分配给具体的前体。由于该原因，在分析报告离子不是分析物偶联的报告离子的情况下，在每种情况下只能分析单个前体离子。
因此，如结合第一方面所限定的同量异序标记提供了重要的前进指引，特别是在数据非依赖性采集的领域。另外，应当注意，较长的过渡时间不会损害(compromise)总采集速度，因为本文上面公开的同量异序标记允许收集多个前体。
在本发明涉及方法的任何方面的进一步优选实施方式中，所述方法包括分离产生所述前体的分析物，优选地通过色谱法，例如液相色谱法(LC)，其中优选地将所述色谱法在线结合至所述质谱仪(在线LC-MS)。
在具体优选实施方式中，在所述色谱法之前汇集多个样品，其中不同样品中的分析物带有具有不同同位素取代的同量异序标记。
如在介绍性部分中提到的，该优选实施方式实施了同量异序标记和样品汇集的组合。样品汇集和同量异序标记技术是本领域已确立的；由此区别于本发明的是上文以及WO2018/087397中公开的新型同量异序标记。如结合第一方面所公开的同量异序标记的用途提供了通量的两倍增加：首先，通过同量异序标记使样品的汇集成为可能，并且本文公开的具体同量异序标记提供了汇集(“收集”)源自不同分析物的前体，然后碎裂和分析。
因此，提供了使用质谱仪的分析方法，所述方法包括：(a)汇集样品，其中不同样品中的分析物带有如上限定、具有不同的同位素取代的同量异序标记；(b)通过色谱法分离所述分析物；(c)在质谱仪中执行非碎裂扫描；(d)以数据非依赖性方式收集源自不同分析物的前体离子；(e)执行碎裂，其中所述碎裂包括(i)将前体和所述标记的缀合物在如此能量下碎裂，其中所述缀合物优先地在所述标记内的所述单个位点处碎裂，从而产生前体偶联的报告离子；和(ii)在使所述标记和所述前体二者碎裂的能量下使所述前体和所述标记物的缀合物碎裂。
还提供了DDA的类似方法。
在进一步优选实施方式中，方法包括超过一次收集相同的前体离子，从而在所述色谱法中获得用于给定峰的多个数据点。这尤其适用于结合DDA。
这增加了通过质谱法鉴定和定量的置信度。MS数据分析的相关计算机实施的方法也是本发明的主题；进一步参见下文。
假如色谱图中的峰重叠(不同分析物的部分重叠)，则这种置信度的增长是特别有价值的。
当根据以上进一步公开的优选实施方式，不仅执行非碎裂扫描，而且还执行至少一个碎裂扫描时，置信度进一步增加。在该情况下，可以通过相关性分析确定哪些碎片离子对应于哪些前体离子。这又允许以高置信度水平进行分析物鉴定。这优选地结合DIA。
当执行数据非依赖性采集时，前体离子洗脱曲线与碎片离子洗脱曲线的相关性尤其有用。术语“洗脱曲线”与色谱图中提到的峰相关。更具体地，色谱图中的单个峰产生两个洗脱曲线，一个洗脱曲线与源自产生该峰的分析物的前体离子相关，和第二洗脱曲线与在MS2扫描过程中从所述前体离子中获得的碎片离子相关。
在进一步优选实施方式中，所述收集超过一次的各个步骤被(a)给定的时间间隔(一个或多个)分开，例如随后的收集步骤之间的1、2、3、4或5秒的间隔。
在具体优选实施方式中，前体离子的洗脱曲线与洗脱曲线或碎片离子相关。
在第六方面，本发明提供了分析MS数据的计算机实施的方法，所述方法包括计算分析物的m/z值，所述计算利用多个分析物偶联的报告离子的观察到的m/z值，所述离子中的分析物部分相同。在优选实施方式中，所述离子中的报告部分彼此相差已知的m/z差异。因为已知同量异序标记的结构和同位素取代，因此已知该差异。
在另一个优选实施方式中，所述报告部分源自如第一方面中所限定的同量异序标记。
在以上公开的计算机实施的方法的进一步优选实施方式中，所述数据利用以上公开的多个汇集样本的分析方法生成。
优选地，在计算机实施的方法的上下文中，分析物是肽或包含肽。
举个例子，如果标记破碎，则每个肽衍生的碎片离子(b和y离子)以及带有碎裂标签的前体离子都会产生离子簇，因为每个通道具有不同的质量，x个通道(例如6个通道)之间具有约1Da的差异。这意味着对于每个碎片离子，通常会有x+1个测量的m/z值(x＝通道数)，这是因为存在来自离子簇的x个离子和带有完整标签的相同碎片离子。与仅可获得一个测量的m/z值(这是任意未标记碎片离子的情况)相比，所有这些测量值都可用于以更高的质量准确度计算碎片离子的m/z。
肽碎片的实例是b离子和y离子。术语“肽碎片”也可以包括未碎裂的肽。
在进一步优选实施方式中，通过对每个前体离子定量多个肽偶联的报告离子来提高定量的准确性和精确度。
给定肽的量可以确定为对在(i)和(ii)中获得的属于或源自给定前体离子的碎片所观察到的峰强度的中值或平均值、或加权中值或平均值。对于使用加权平均值的情况，优选地，对较高的峰给予较高的权重——考虑到这些峰更精确和准确。同样，优选地忽略信噪比小于3的峰。以下是用本发明化合物获得的改善MS数据处理的额外或可选的手段。每个恒定部分，即与肽分析物附接的本发明化合物的碎片限定“通道”。每个b离子和每个y离子在光谱中限定了一个簇，并且在每个通道中有多个簇。如果簇具有与所有其他不同的强度分布，则去除展示所述不同分布的通道。
在优点方面，我们在上文中已经注意到，本发明的化合物允许通过共洗脱肽显著降低干扰。本优选实施方式还是进一步减少干扰的额外手段。该优选实施方式进一步减轻了比率压缩的问题(其在本领域中是众所周知的)。具体地，平均提高了准确性和精确度。变异系数通常至少降低25％。最后，尽管没有这些措施，MS3可能是必需的，但在执行平均时的许多情况下，MS2足够了。MS3甚至不会更准确。肽偶联的报告离子与MS3相比的优势在于，通过Orbitrap检测器m/z测定的分辨率总是高于任何基于四极杆的分离，例如MS3。
多个分析物偶联的报告离子——所述离子中分析物部分是相同的，也可以源自(可选地，或与第六方面的上述公开的优选实施方式组合)在线结合到质谱仪的色谱中的多个峰采样。具体地，并且如上公开的，可以在所述色谱中获得给定峰的多个数据点。注意到，根据通常的理解，术语峰与色谱法结合表示给定分析物的存在为时间的函数，如果在峰洗脱期间将多个样品送入质谱仪，则在质谱仪中对同一分析物进行多次分析。
在具体优选实施方式中，对应于给定分析物的多个数据点源自从色谱图的给定峰中提取的多个样品以及源自多个差异标记的前体离子二者。在本文中，术语“差异标记”是指具有相同结构但具有不同同位素取代模式的同量异序标记。
在进一步方面，本发明提供计算机程序，其包括使计算机执行前述方面中任一项的方法的步骤的指令，所述计算机包括在质谱仪中。
在进一步方面，本发明提供了计算机可读介质(a)，其包括指令，当在计算机上执行该指令时，该指令使所述计算机执行前述方面中任一项的方法的步骤，所述计算机包括在质谱仪中；和/或(b)在其上存储了前述方面的计算机程序。
在进一步方面，本发明提供质谱仪，其包括计算机，所述计算机包括用于执行前述方面中任一项的方法的装置，这样的装置优选地是本发明的计算机程序和/或本发明的计算机可读介质。
关于在本说明书中特别是在权利要求中表征的实施方式，旨在将从属权利要求中提及的每个实施方式与所述从属权利要求从属的每个权利要求(独立或从属权利要求)的每个实施方式组合。例如，在独立权利要求1陈述3个可选方案A、B和C，从属权利要求2陈述3个可选方案D、E和F，并且从属于权利要求1和2的权利要求3陈述3个可选方案G、H和I的情况下，除非另有特别说明，应当理解，说明书明确地公开了对应于组合A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I的实施方式。
类似地，并且在独立权利要求和/或从属权利要求不陈述可选方案的那些情况下，应理解，如果从属权利要求回溯引用多个在先权利要求，则认为所涵盖的主题的任何组合被明确公开。例如，在独立权利要求1，从属权利要求2回溯引用权利要求1并且从属权利要求3回溯引用权利要求2和1的情况下，由此得出清楚且明确地公开了权利要求3和1的主题的组合，如同权利要求3、2和1的主题的组合一样。在存在引用权利要求1至3中的任一项的进一步的从属权利要求4的情况下，由此得出清楚且明确地公开了权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合。
这些图显示：
图1：根据本发明的质谱仪DDA工作周期方案。
标准DDA：通常，在完全(MS1)扫描后，顺序分离5-20个前体离子(仅显示3个前体)，将其碎裂，并在检测器中确定其碎片离子质量(MS2扫描)。通常，这需要0.5-3秒。该图仅显示了用于MS2扫描的工作周期方案。
DDA#1：顺序分离多个前体离子(仅显示6个前体离子)，将其一起碎裂，并一起确定其碎片离子质量。通常，这需要0.5-3秒。该图仅显示了用于MS2扫描的工作周期方案。
DDA#2：顺序分离和碎裂多个前体离子(仅显示6个前体离子)，并且一起确定其碎片离子质量。通常，这需要0.5-3秒。该图仅显示了用于MS2扫描的工作周期方案。
DDA#3：顺序分离多个前体离子(仅显示3个前体离子)，将其一起碎裂，并且以长的过渡时间一起确定其碎片离子质量，以获得更高分辨率的质量分析。通常，这需要0.5-3秒。该图仅显示了用于MS2扫描的工作周期方案。
DDA#4：顺序分离和碎裂多个前体离子(仅显示3个前体离子)，并且以长的过渡时间一起确定其碎片离子质量，以获得更高分辨率的质量分析。通常，这需要0.5-3秒。该图仅显示了用于MS2扫描的工作周期方案。
图2：具有同量异序标记的数据非依赖性采集(DIA)
实施例说明了本发明。
实施例1
具有同量异序标记的DIA
参考图2，描述了本发明的第一和第二方面的示例性实施。
a)标准DIA采集的工作周期方案。全面(MS1)扫描后，通常分离出包含多个前体离子的12.5-50m/z(此处显示50m/z)的质量窗口，将其碎裂，并一起确定其碎片离子质量。窗口在大约1-5秒的周期时间内在整个质量范围(通常为300m/z-1650m/z)上滑动(仅显示300m/z和450m/z之间的窗口)。图2仅显示了用于MS2扫描的工作周期方案。
b)在数据非依赖性采集方案中，每个MS2扫描均包含多个前体离子的碎片离子。现有技术同量异序标记的低分子量报告离子(无肽特异性信息)不能分配给各个前体离子，因为它们对每个前体离子都是相同的。碎片离子(在较高的m/z范围内描绘)用于鉴定前体离子。利用低分子量报告离子，不能在DIA采集方案中对多个前体离子和多重样品进行定量。
c)可以将肽偶联的报告离子分配给各个前体离子，这是因为它们包含肽特异性信息。肽特异性报告离子可以是带有碎裂标签的前体离子，也可以是带有碎裂标签的碎片离子(b和y离子)。从而，可以实现在DIA采集方案中对多个前体离子和多重样品的同时定量。肽偶联的报告离子和碎片离子(不具有标签)用于鉴定和定量前体离子。

Claims (18)

1.同量异序标记在使用数据非依赖性采集(DIA)的质谱法(MS)分析中的用途，其中所述同量异序标记包括在所述质谱仪中碎裂的基团或由其组成，所述基团碎裂
(i)在低于使分析物衍生的前体离子碎裂所需能量的能量下和/或比所述前体离子更高的转化率；和
(ii)在根据(i)所述的能量下，并且当与前体离子偶联时，在所述基团内的单个位点处产生第一部分和第二部分，所述第二部分与所述前体离子偶联。
2.一种使用质谱仪的分析方法，所述方法包括以与数据非依赖性的方式收集源自不同分析物的前体离子，其中所述前体离子带有如权利要求1所限定的同量异序标记。
3.如权利要求1所限定的同量异序标记在使用数据依赖性采集(DDA)的质谱法分析中的用途。
4.一种使用质谱仪的分析方法，所述方法包括以数据依赖性的方式收集源自不同分析物的前体离子，其中所述前体离子带有如权利要求1所限定的同量异序标记。
5.一种操作包括检测器的质谱仪的方法，所述检测器优选地是Orbitrap检测器或TOF检测器，所述方法包括在所述检测器中分析所述碎片离子期间经过的时间中，将一种或多种进一步的前体离子碎裂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在所述时间期间以及在所述碎裂之前，收集所述一种或多种进一步的前体离子，其中优选地，收集和碎裂多种进一步的前体离子，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、20种、50种、100种、200种、300种或更多种进一步的前体离子。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述前体离子带有同量异序标记，其中优选所述同量异序标记
(a)如权利要求1所限定；
(b)选自同量异序标记物，例如TMT和iTRAQ，在所述时间内使一种进一步的前体离子碎裂的情况下，该同量异序标记以使为肽的分析物碎裂所需的能量或更高的能量下碎裂。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中在所述检测器中分析的所述碎片离子源自多个前体离子。
9.根据权利要求8所述的方法，其中分配进行分析的所述时间随着所述多个中的前体离子的数量而增加。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法包括至少一个非碎裂扫描(MS1)和至少一个碎裂扫描(MS2)，其中所述非碎裂扫描产生在所述至少一个碎裂扫描中待碎裂的所述前体离子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述碎裂包括以下一项或两项：
(i)使前体和所述基团的缀合物在如此能量下碎裂，其中所述结合物优先在所述基团内的所述单个位点处碎裂，从而产生前体偶联的报告离子；和
(ii)在使所述基团和所述前体碎裂的能量下使前体和所述基团的缀合物碎裂；
其中，在(i)和(ii)二者都被执行的情况下，它们伴随地或随后以任何顺序执行。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法包括优选地通过例如液相色谱法(LC)的色谱法分离产生所述前体的分析物，其中，优选地所述色谱法在线结合至所述质谱仪(在线LC-MS)，其中优选地在所述色谱法之前汇集多个样品，其中不同样品中的分析物带有具有不同同位素取代的同量异序标记。
13.根据权利要求12所述的方法，其包括超过一次收集相同的前体离子，从而在所述色谱中获得给定峰的多个数据点，优选地包括使前体离子的洗脱曲线与碎片离子的洗脱曲线相关。
14.一种分析MS数据的计算机实施的方法，所述方法包括计算分析物的m/z值，所述计算利用多个分析物偶联的报告离子的观察到的m/z值，所述离子中的分析物部分是相同的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中
(a)所述报告部分源自如权利要求1所限定的同量异序标记；
(b)所述离子中的报告部分彼此相差已知的m/z差异；和/或
(c)所述数据利用权利要求12或13所述的方法生成。
16.根据前述权利要求任一项所述的方法或用途，其中所述同量异序标记包括式(I)的部分
–SO2–(CH2)2–CO–。
(I)
17.根据权利要求16所述的方法或用途，其中所述同量异序标记具有式(V a11)或(Va12)
Figure FDA0002549877010000031
18.式(V a11)或(V a12)的同量异序标记
Figure FDA0002549877010000041
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