JP2002520580A

JP2002520580A - 質量分光分析のためのアリールスルフォンリンカー

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Publication number: JP2002520580A
Application number: JP2000559124A
Authority: JP
Inventors: ギュンターシュミット、; アンドリュー、ヒュージントムソン、; ロバート、アレクサンダーウォーカージョンストン、
Original assignee: ブラックスグループリミテッド
Priority date: 1998-07-13
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2002-07-09
Anticipated expiration: 2019-07-13
Also published as: JP3692299B2; AU4921099A; ES2189443T3; NZ509518A; GB9916405D0; AU769966B2; EP1095053A1; ATE229537T1; CA2385987A1; GB2340602A; CA2337761A1; WO2000002895A1; GB9815163D0; PT1095053E; DE69904478D1; EP1095053B1; DE69904478T2; DK1095053T3

Abstract

(57)【要約】分析物を特性評価する方法を提供し、前記分析物の特性評価方法は、（ａ）分析物が、開裂可能なリンカーによって、分析物に結合可能なリポーター基に接着されている化合物を提供する工程、（ｂ）分析物からリポーター基が開裂する工程、（ｃ）リポーター基を同定することにより、分析物の特性評価を行う工程、を有する分析物の特性評価方法である。ただし、（ａ）における化合物は下記式で表される。下記式中、Ｒがリポーター基を含み、Ｒ’が分析物を含む、又はＲが分析物を含み、Ｒ’がリポーター基を含む、のいずれかである。また、ｎは１又は２を表す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、その結合した分析物から開裂可能で検出できる、そして質量分光計
によって検出可能なマーカーによって分析物を標識化する方法に関する。とりわ
け本発明は、その結合したタンパク質、核酸又は他の対象の分子から質量標識を
分離する改善方法に関する。

【０００２】開裂可能質量標識は、標識による分析物の検出の他の方法よりも多くの利点を
持つ。ＤＮＡの分析において、商業的に好まれる系はＤＮＡの蛍光標識化に基づ
いている。蛍光標識化の概略は相対的に少量の分子を同時に標識化することを可
能にし、そこで典型的に４つの、そしておそらく８つまでの標識を同時に使用す
る。しかしながら、検出器具のコスト及び得られた信号の分析での難しさが、蛍
光検出概略での同時に使用可能な標識の数を制限している。使用している質量標
識の利点は多くの数の標識を作製する可能性であり、これらは直接的に質量分光
計中に溶解可能であり、したがって同様の数の異なる分子種を同時に標識するこ
とを可能にする。開示した開裂可能な質量標識の使用の特徴は、質量マーカー
をその相当する核酸間に共有的に連結し、同時に質量マーカーの検出を可能にす
るために検体から分離することが容易であるリンカー群に対する必要性である。

【０００３】第ＰＣＴ／ＧＢ９８／００１２７号は共有結合した核酸プローブの配列を同定
する質量分光計によって検出可能な開裂可能な標識に共有的に連結した核酸プロ
ーブのアレイを記述している。これらの質量標識は、核酸を分析するための他の
方法に対して多くの利点を持つ。この明細書の標識化プローブはＮｕ−Ｌ−Ｍの
構造を持ち、式中Ｎｕは、質量標識Ｍに共有的に連結した開裂可能リンカーであ
るＬに共有的に連結した核酸である。この明細書の好ましい開裂可能リンカーは
質量分光計のイオン源内、とりわけ電子噴霧イオン源内で開裂する。好ましい質
量標識は置換ポリアリールエーテルである。この明細書は種々のイオン化方法及
び質量分光計での質量標識の分析の特異的な方法として四極子質量分析器による
分析、ＴＯＦ分析器及び磁気セクター器具による分析を開示する。

【０００４】第ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１６７５号は、質量タグ分子に共有的に連結している
リガンド、及びとりわけ核酸を開示する。好ましい開裂可能リンカーは光電開裂
可能である。この明細書は、質量分光計による質量標識の分析の特異的な方法と
してマトリックス補助レーザー吸着イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）
型質量分光計を開示する。

【０００５】第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２２６３９号は放出可能不揮発性質量標識分子を開示す
る。好ましい実施様態において、これらの標識はポリマー、典型的には反応基又
はリガンド、すなわちプローブに開裂可能的に結合するバイオポリマーを含む。
好ましい開裂可能リンカーは、化学的又は酵素学的に開裂可能であるように見え
る。この明細書では、質量分光計による質量標識の分析の特異的な方法としてＭ
ＡＬＤＩＴＯＦ質量分光計を開示する。

【０００６】第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０７０号、第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４６号、第
ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１３０４号は、質量タグ分子に開裂可能に連結したリガン
ド及び特に核酸を開示する。好ましい開裂可能リンカーは化学的又は光電開裂可
能であるように見える。これらの明細書は、質量分光計による質量標識を分析す
る特異的分析として種々のイオン化方法及び四極子質量分析器、ＴＯＦ分析器及
び磁気セクター器具による分析を開示する。

【０００７】多くの特徴を持っている改良されたリンカー基への必要性が未だに存在する。よいリンカーは質量マーカーを質量分光計内の検出前に高効率でその核酸より
分離させることを可能にしなければならない。その核酸からの標識の開裂は、好ましくは質量分光計とインラインで行われ、
できるかぎり、キャピラリー電気泳動のようないくつかのインライン前分別工程
の後に行われるべきである。このインライン開裂工程は好ましくはこの工程を起
こすのが可能なように、質量分光計との複合体境界面を必要としない。理論的な
リンカーは、正常の操作パラメータの変化を越えた器具への任意の修飾なしに、
存在している器具内でのいくつかのすでに決められている点で開裂すべきである
。リンカーは、結合する核酸中の開裂又は他の反応を引き起こすこと、したがっ
て核酸断片及びイオン化からの質量スペクトルのノイズを補正することなしに、
穏やかな条件下で開裂すべきである。リンカーはすべての標識が同時かつ定量的に分析されうることを可能にする同
一の条件下ですべて開裂すべきである。リンカーは広い種類の質量標識と和合性であるべきである。リンカーは好ましくは多数の部位で核酸へ結合可能であるべきである。リンカーは従来の自動化オリゴヌクレオチド合成器内の条件下で安定であるべ
きである。

【０００８】質量分光計、とりわけ電子噴霧イオン化質量分光計の存在に適用可能な、上で
開示した望ましい特徴を持つリンカーを提供することが本発明の目的である。し
たがって、分析物、とりわけタンパク質及び核酸以下、へ又はから定義したリポ
ーター基の簡単な結合と分離を可能にする化合物を提供することが本発明の目的
である。

【０００９】したがって、本発明は分析物を特性評価する方法であって、下記（ａ）（ｂ）
及び（ｃ）工程を有することを特徴とする。（ａ）分析物が、開裂可能なリンカーによって、分析物に結合可能なリポータ
ー基に接着されている化合物を提供する工程。ただし、前記化合物は、下記式で表される。

【化９】前記式において、Ｒがリポーター基を含み、Ｒ’が分析物を含む、又はＲが分
析物を含み、Ｒ’がリポーター基を含む、のいずれかである。また、前記式にお
いて、ｎは１又は２を表す。（ｂ）前記分析物から、前記リポーター基が開裂する工程。（ｃ）前記リポーター基を同定することにより、前記分析物の特性評価を行
う工程。

【００１０】本発明で使用した開裂可能なるリンカーは、もしそれが上式で述べたようにＲ
をＲ’に連結している基であれば、特に限定はしない。置換基が開裂可能である
ことを妨げなければ、リンカーは炭素原子上に置換基を含んでよい。リンカーは
たとえばプロトンの欠失と引き続く結果としてリンカー内の共有結合の崩壊とな
る分子内転移によって質量分光計のイオン源内で開裂してよい。このことは本来
温度工程であり、しかしたとえば電子噴霧質量分光計のイオン源内の円錐電圧を
増加することによってプロトン化されうる。したがってリンカーは好ましくは温
度的に開裂可能リンカーであるか又は電子衝撃によって開裂可能なリンカーであ
る。

【００１１】分析物分子は特には限定せず、任意の対象の分子であり得る。本発明では典型
的に、分析物分子は生物学的分子を含む。好ましい生物学的分子はタンパク質、
ポリペプチド、アミノ酸、核酸（たとえばＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、又はオ
リゴヌクレオチド）、核酸塩基及び薬理学的製剤又は薬剤のような有機分子を含
む。

【００１２】本発明の文脈において、語句アミノ酸は、アルファ−アミノ酸の２０標準Ｌ−
アイソマー、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、
スレオニン、チロシン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、システ
イン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、プロリンを広く示すつもりである。これはまた、これ
らのアミノ酸のすべての天然修飾型を示すつもりである。さらに、語句アミノ酸
はこれらのアミノ酸のＤ−アイソマーと単離又は合成又は生物合成ペプチド内に
組み込まれるかどうかの類似体として使用してよい非天然アルファアミノ酸を示
すつもりである。

【００１３】語句ポリペプチドはダイマーを含むアミノ酸のすべてのポリマー、合成又は天
然どちらかの短オリゴ−ペプチド、長ポリペプチド、及び翻訳後修飾される可能
性があるか又はない、生物学的試料からの天然タンパク質を意図するつもりであ
る。語句ヌクレオチドは天然に存在しているヌクレオチド及び類似体の両方を示
すつもりであり、とくに２’、３’ジデオキシヌクレオチド類似体を示すつもり
である。語句ポリヌクレオチドは、合成又は天然のいずれかの短いオリゴヌクレ
オチド、長いポリヌクレオチド、及び生物学的試料からの天然核酸を示すつもり
である。

【００１４】本発明において、対象の他の分析物はまたたとえば炭化水素、脂質、薬物分子
、生存生物体由来の天然産物及びコード化された化学的ライブラリーからの合成
化合物も含んでよい。

【００１５】本発明の文脈において、リポーター基という語は、いくつかの従来の検出方法
によって検出可能な部位を示すつもりである。リポーター基は好ましくは質量マ
ーカーであり、すなわち質量分光計によって検出可能である。適切なレポーター
はまた蛍光発色団、放射標識、化学ルミネセンス標識、電子捕獲標識も含む。

【００１６】本発明の以下の記述において、参考文献は分析物に連結することに使用してよ
い「介在リンカー」又は「リンカー」基又は本発明の化合物を形成するためのレ
ポーターからなる。さまざまなリンカーが本技術分野で公知であり、本発明の温
度的に開裂可能なリンカーとその共有的に接着している分析物又はレポーター分
子間のさらなるリンカーとして導入してよい。オリゴ−又はポリ−エチレングリ
コール又はその誘導体はリンカーとして広く使用され（Maskos, U. & Southern,
E. M. Nucleic Acids Research 20: 1679-1684,1992）、本発明でさらになるリ
ンカーとして使用してよい。一般的に塩基不安定で、したがって多くのオリゴヌ
クレオチド合成器内で使用する脱タンパク質工程を仲介する塩基と不和合性であ
るけれども、コハク酸に基づく結合もまた広く使用される。

【００１７】プロパルギルアルコールは、オリゴヌクレオチド合成の条件下で安定であり、
本発明での使用に対して好ましいさらなるリンカーである二機能性リンカーであ
る。同様に６−アミノヘキサノールは適切な機能化分子に連結するための有用な
二機能性製剤であり、また好ましくいさらなるリンカーである。

【００１８】さまざまな開裂可能リンカー基が本技術分野で公知であり、本発明の化合物と
ともに使用してよい。光電開裂可能リンカーは本技術分野でよく公知である。

【００１９】オルト−ニトロベンジル基、とりわけ２−ニトロベンジルエステル及び２−ニ
トロベンジルアミンは光電開裂可能リンカーとして本技術分野でよく公知であり
、ベンジルアミン結合部分で開裂する。開裂可能なリンカーについては、さまざ
まな光電開裂可能及び化学的に開裂可能なリンカーをカバーするLloyd-Williams
et al., Tetrahedron 49: 11065-11133, 1993を参照のこと。

【００２０】分析物がポリヌクレオチドの場合、本発明の化合物はリンカー基を介したリポ
ーター基の、ポリヌクレオチド内の多くの部分でのオリゴヌクレオチドへの接着
によって形成されうる。従来の固相合成器について、末端リボース又はデオキシ
リボースの５’ヒドロキシルがもっとも容易に近づきやすい。修飾のための他の
望ましい部位はピリミジンヘテロ環中の５’位及びプリンヘテロ環中の７’位及
び８’位である。これらはすべて本発明の化合物に接着するために適切な部位で
あり得る。

【００２１】リボース又はデオキシリボースヘテロ環上の２’位はまたリンカー基の接着に
利用しやすい。この位置は相当な程度まで修飾されえ、質量標識へのリンカーで
の誘導化が含まれる。リン酸基がまた本発明の化合物との反応で利用できる。

【００２２】本発明で使用した化合物は、従来のタンパク質又はＤＮＡ分析物で起こる条件
下、及び自動ペプチド又はオリゴヌクレオチド合成器での条件下で安定である。
提供された化合物はさまざまな質量分光計的分析技術及びマトリックス補助レー
ザー沈着イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）、温度噴霧イオ
ン化又は急速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ）のようなイオン化方法に和合性である
。本発明での使用に対する好ましい質量分光計分析技術はまた熱分解及びガスク
ロマトグラフィー／質量分光計（ＧＣ／ＭＳ）を含む。そのタンパク質又は核酸
からのレポーターの開裂はいくつかの実施様態において質量分光計とインライン
で、できるかぎりキャピラリー電気泳動（ＣＥ）又は高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）のような前分別工程後に行いうる。インライン開裂工程は、こ
の工程が起こりうるように質量分光計との複合体境界を必要とはしない。

【００２３】本方法をここでさらに詳細に記述する。上述したように、本発明は分析物を特
性評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）工程を有することを特
徴とする。（ａ）分析物が、開裂可能なリンカーによって、分析物に結合可能なリポー
ター基に接着されている化合物を提供する工程。ただし、前記化合物は、下記式で表される。

【化１０】前記式において、Ｒがリポーター基を含み、Ｒ’が分析物を含む、又はＲが分
析物を含み、Ｒ’がリポーター基を含む、のいずれかである。また、前記式にお
いて、ｎは１又は２を表す。（ｂ）前記分析物から、前記リポーター基が開裂する工程。（ｃ）前記リポーター基を同定することにより、前記分析物の特性評価を行
う工程。

【００２４】分析物及び／又はリポーター基は直接リンカーに接着してもよいし（たとえば
Ｒ（又はＲ’）は分析物又はリポーター基からなる）、又はさらなる基（たとえ
ばＲ（又はＲ’）は分析物又はリポーター基プラスさらなる基からなる）を介し
て接着してよい。レポーター及び／又は分析物は直接リンカー又はさらなる基に
接着してよく、又は以下に記述したように、共有結合を介して接着してよい。好
ましくはＲ及び／又はＲ’はリポーター基の合成の間、自動合成器内リポーター
基の分析物内への、たとえばオリゴヌクレオチド内への挿入の間安定であるべき
である。好ましくはＲ及び／又はＲ’はまた、リポーター基の検出の間、たとえ
ば質量分光計下で安定であるべきである。広い種類の基がこれらの特性を持って
おり、リンカー内へ挿入してもよかった。リンカーの可溶性を変化させる置換基
を選択するとも望ましい可能性がある。

【００２５】上述のように、好ましくはＲ及び／又はＲ’は、分析物及び／又はリポーター
基の開裂可能リンカーへの接着で形成された共有結合を含む。リポーター基及び
／又は分析物が、リンカー及びレポーター及び／又は分析物へ接着した反応性官
能基を使用した開裂可能リンカーへ容易に接着可能であるならば、共有結合は特
に限定されない。典型的に、いくつかの実施様態ではＲのみ又はＲ’のみが共有
結合を含むけれども、Ｒ及びＲ’は共有結合からなる。

【００２６】以下の表１は、２つの部分存在物間の共有結合を生成するために一緒に反応す
る可能性のあるいくつかの反応性官能基を列挙している。以下に列挙した任意の
官能基は、（たとえば質量分光計による）検出のためにリンカーを（核酸又はタ
ンパク質のような）分析物へ、及び適切なリポーター基へ接着させるために本発
明で使用した化合物を形成するのに使用できた。望むならば、反応官能基はさら
なる反応官能基を持つさらなる結合基を導入するために使用できる。

【表１】

【００２７】いくつかの上記反応性官能基又はその得られる共有結合は、オリゴヌクレオチ
ド合成器内への導入前に保護されなければならない可能性があることに注意すべ
きである。好ましくは非保護エーテル、エステル、チオエーテル及びチオエステ
ル、アミン及びアミド結合は、これらがオリゴヌクレオチド合成器内で安定では
ないので、さけるべきものである。広い種類の保護基が、望ましくない副反応か
ら結合を保護するために本技術分野で公知である。

【００２８】広い種類のリンカーが、質量マーカーをリンカーの第三級アミン基へ連結する
ために使用できるように利用可能であるけれども、短いアルキル結合が質量マー
カーを開裂可能リンカーに連結するために好ましい。

【００２９】したがって、本発明の好ましい実施様態において、開裂可能なリンカーをリポ
ーター基及び／又は分析物へ接着させている共有結合は、−ＣＯ−ＮＨ−基、−
ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ基、−ＣＨ₂−ＮＨ−基、−ＳＯ₂−
ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−基、又はＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ）Ｏ−基から独立
して選択する。

【００３０】もしリポーター基又は分析物を含むならば、本方法で使用した化合物のＲ基は
特に限定しない。したがって、もし望むなら、Ｒ基はさらなる基を含んでもよい
。典型的にＲは、ＳＯｎ基とリポーター基又は分析物の間に、置換又は無置換芳
香環基、脂肪環基又はヘテロ環基を含む。好ましくは、Ｒはフェニル、ピリジル
、ピラニル、ナフチル、アントラシル、ピレニルから選択した置換又は無置換基
、又は上記のものの縮合環誘導体又はヘテロ芳香族類似体を含む。置換基は特に
限定はせず、任意の有機性基又はハロゲン（たとえば塩素又は臭素）、好ましく
はアルキル基又はアルケン又はアルキン官能基を含む基のような炭化水素基、Ｎ
、Ｏ、Ｐ又はＳ原子のようなヘテロ原子を含む炭化水素、又は芳香、脂肪又はヘ
テロ環状基のような環状基を含んでよい。置換基は多数の官能基を含んでよく、
直鎖又は分岐鎖炭化水素基を含んでよい。

【００３１】Ｒがフェニル基を含む場合、フェニル基は好ましくは以下の式を持つ基であり
、

【化１１】式中Ｒ²−Ｒ⁶の一つはリポーター基又は分析物を含み、残基のＲ²−Ｒ⁶基は、水
素及び上で定義したような置換基、好ましくはＤ、Ｆ、メチル、メトキシ、ヒド
ロキシ又はアミノ基から独立して選択する。Ｒ⁴基がリポーター基又は分析物を
含むことがとりわけ好ましい。

【００３２】リポーター基又は分析物を含むならば、本方法で使用した化合物中のＲ’基は
特に限定はしない。したがって、望むならば、Ｒ’基はさらなる基を含む。典型
的にＲ’は、ＳＯ_n基とリポーター基又は分析物の間で、−Ｓ−、−ＳＯ−、−
ＮＲ¹−及びＯ−から選択した基である。Ｒ’基が−ＮＲ¹−基を含む場合、この
ましくはＲ¹基は電子吸引基である。さらに好ましくは、Ｒ¹は水素原子、ハロゲ
ン原子又はカルボニル基及び／又はハロゲン原子を含む置換基を含む。したがっ
て、Ｒ１はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、トリフルオロアセチ
ル基、トリフルオロメチルアセテート基、メシレート基又はトシレート基を含ん
でよい。

【００３３】本方法のとりわけ好ましい実施様態において、本方法の工程（ａ）で提供され
た化合物は以下の式を持つ。

【化１２】式中Ｒ¹は上で定義したようなものであり、Ｘがレポーター遺伝子を含み、Ｘ’
は分析物を含むか、又はＸが分析物を含み、Ｘ’がリポーター基を含み、それぞ
れのハンドルは同一か又は異なり、それぞれ直接Ｘ基をフェニル環に結合してい
る一重結合及びＮ原子のどちらかであり、又は上で記述したような共有結合であ
る。

【００３４】本発明のこの実施様態において、分析物は好ましくはフェニル基を介してリン
カーに接着し、質量マーカーはこのましくは、Ｎ原子を介してリンカーへ接着す
る。しかしながら、分析物がまたＮ原子を介してリンカーに接着し、質量マーカ
ーがまたフェニル基を介してリンカーに接着してもよい。

【００３５】本発明のこの特定の実施様態において、分析物は好ましくは核酸又は核酸塩基
である。したがって、分析物は好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド
又はプラスミドである。本発明のこの実施様態において、核酸（又は他の分析物
）は好ましくはフェニル基を介してリンカーに接着し、質量マーカーは好ましく
はアミン官能基を介してリンカーに接着する。

【００３６】本発明の方法において、調査中の分析物は特に限定はせず、任意の対象分子で
あってよい。典型的には、分析物は生物学的分子を含んでよい。本発明の好まし
い実施様態において、生物学的分子は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、
核酸（たとえばＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド又はオリゴヌクレオチド）、核酸塩
基、薬理学的製剤又は薬剤、炭化水素、脂質、天然産物又はコード化された化学
的ライブラリーからの合成化合物から選択する。分析物がヌクレオチド、オリゴ
ヌクレオチド、又は核酸を含む場合、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核
酸は天然物であってよく、又は塩基、糖、及び／又は、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチドもしくは核酸の骨格を修飾することにより合成されたものでもよい。

【００３７】天然組織標本からのポリペプチドはしばしばその中に、同一のポリペプチド内
の他のシステイン残基と架橋する可能性があり、結果としてジスルフィド架橋又
はシステイン結合となるシステイン残基を持つ。これらのジスルフィド架橋は、
ポリペプチドの標識化の前に遊離チオールに暴露することで破壊されうる。この
工程は、β−メルカプトエタノール又はジチオスレイトールのような適切な製剤
での還元によって影響を受ける可能性がある。分析物がシステイン基を含むアミ
ノ酸又はペプチドである場合、本方法の工程（ａ）で提供された化合物は好まし
くは以下の式を持つ。

【化１３】式中Ｒは上で定義したようなものであり、リポーター基を含み、ｍは０又は１で
あり、Ｒ⁷をリンカーに接着させているＳ原子はシステイン基の硫黄原子であり
、Ｒ⁷はアミノ酸又はポリペプチドの残基である。ｍ＝１の実施様態において、
システインの硫黄は酸化された。この酸化のための適切な製剤は、たとえば過酸
化水素である。この処置は工程（ａ）で提供された化合物をさらに温度的開裂を
受けやすくする。このことは、質量分光計による分析のある型が、化合物が分析
のためにリポーター基を放出するように熱せられる工程を組み込むので、都合が
よい可能性がある。

【００３８】あるいは、分析物がアミノ酸か又はペプチドの場合、工程（ａ）で提供される
化合物は以下の式を持ってよい。

【化１４】式中Ｒは上で定義したようなものであり、リポーター基を持ち、Ｎ原子は分析物
のイプシロンアミノ基の窒素原子であるか、Ｎ−末端アルファアミノ基の窒素原
子であり、Ｒ⁸はＨ、Ｏ又はＮ−保護基から選択し、Ｒ⁹はアミノ酸又はポリペプ
チドの残基である。Ｒ⁸又はＲ⁹の一つが酸素の場合、化合物はとりわけ温度的に
不安定であり、加熱によってコープ脱離が起こるであろう。酸化アミンは、たと
えばアミンの過酸化水素との反応で産生してよい。

【００３９】さらに他には、分析物がセリン、スレオニン及び／又はチロシン基を含むアミ
ノ酸又はペプチドの場合、工程（ａ）で提供される化合物は以下の式を持ってよ
い。

【化１５】式中Ｒは上で定義したようなものであり、リポーター基を含み、Ｏ原子はセリン
、スレオニン又はチロシン基の水酸基からの酸素原子であり、Ｒ¹⁰はアミノ酸又
はポリペプチドの残基である。

【００４０】容易に検出可能であり、分析物を同定するために分析物に関連可能であるなら
ば、本発明で使用したリポーター基はとりわけ限定はせず、任意の基であってよ
い。典型的にリポーター基は質量マーカーであり、すなわち質量分光計によって
分析可能である。他の適切なレポーターには蛍光発色団、放射標識、化学ルミネ
センス標識及び電子捕獲標識が含まれる。

【００４１】本発明の好ましい実施様態において、第ＰＣＴ／ＧＢ９８／００１２７号、第
ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３８４２号、独国特許第９８１５１６６．５号、独国特許
９８２６１５９．７号で開示された質量マーカーが使用できる。これらの明細書
の内容は参考文献として組み込まれる。第ＰＣＴ／ＧＢ９８／００１２７号及び
第ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３８４２号は温度に安定で、化学的に不活性で断片化抵
抗化合物であり、可溶性や電荷のような特性を変更するためにさまざまな基で置
換できうるポリ−エーテル質量マーカーを開示している。これらの質量マーカー
はまた本発明での使用のために望ましく、この明細書の内容は参考文献に組み込
まれる。独国特許第９８２６１５９．７号は２つの化合物を含むマーカーを開示
し、ポリ−エーテルであってよく、選択した反応モニタリングによって分析され
る。これらは本発明での使用のためにとりわけ好ましい質量マーカーである。独
国特許第ＧＢ９８１５１６６．５号は金属イオンに結合する質量マーカーを開示
し、また本発明での使用のための好ましいマーカーである。この明細書の内容は
参考文献に組み込まれる。１つ以上の検出方法によって検出可能なリポーター基
はまた、たとえばそのリンカーに放射性同位体を挿入する、そして質量分光計に
よって検出可能である蛍光マーカーでのように望ましい可能性があり、この種類
のレポーターは「マルチ−モードレポーター」基として呼ぶ。好ましいマルチ−
モードリポーター基は質量分光計によって検出可能である。

【００４２】質量マーカーがオリゴエーテル又はポリエーテルを含む場合、オリゴエーテル
又はポリエーテルは置換又は無置換オリゴ−又はポリ−アリールエーテルであっ
てよい。オリゴエーテル又はポリエーテルは好ましくは１つ以上のフッ素原子又
はメチル基置換物を含み、又は１つ以上の²Ｈ又は¹³Ｃ同位体置換基を含む。

【００４３】質量マーカーが金属イオン−結合部位を含むことがさらに好ましい。典型的に
、金属イオン−結合部位はポルフィリン、クラウンエーテル、ヘキサヒスチジン
又は多座配位リガンドを含む。好ましくは金属イオン−結合部位は多座配位リガ
ンド又はＥＤＴＡである。金属イオン−結合部位は一価、二価又は三価金属イオ
ンと結合してよい。金属イオンは特に限定はしない。好ましい金属イオンには、
遷移金属イオン又は周期表のＩＡ、ＩＩＡもしくはＩＩＩＡ属の金属イオンが含
まれる。とりわけ好ましい金属イオンはＮｉ²⁺、Ｌｉ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ²⁺、
Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｂａ²⁺又はＡｌ³⁺である。質量マーカー上の金属イオンの存在
は検出の感度を増加させる。

【００４４】本発明は上で開示した質量マーカーに限定しないことに注意すべきである。多
くの特徴が、よい質量マーカであるべき分子で望ましい。特に、マーカーが、ＤＮＡのような分析物から容易に分離可能である分子生物学プロトコールに含まれる酵素的工程を干渉しない質量分光計内で断片化抵抗性である質量スペクトルで単一イオンピークを形成する高感度検出が可能であるＤＮＡのような骨格混在から容易に識別可能であり、質量ピークが混在物から
ではなく質量標識からであることを決定するのが可能であるべきである。従来の自動オリゴヌクレオチド合成器に和合性がある多くの数の標識を合成するために必要な化学工程数及び製剤数を最小化するの
に従来の方法で合成するのが簡単である器具の物理的改変の必要なしに、存在する質量分光計器具に和合性であることが好ましい。

【００４５】上で言及したように、本発明のリンカーはこのましくは温度開裂可能リンカー
である。したがって本方法は好ましくはさらに、リポーター基を開裂させるため
にリンカーを加熱する工程を含む。加熱の方法は特に限定しない。好ましくはリ
ンカーをリポーター基の検出用の器具内、たとえば質量分光計内で熱する。本発
明で使用したリンカーは、穏やかな条件下で温度開裂可能であるので都合がよい
。質量マーカーが質量分光計それ自身の中で対象の分子から開裂されうることが
この理由である。

【００４６】しかしながら、開裂は温度開裂に限定はせず、また化学的開裂も含んでよい。
たとえば、本方法のそれらの実施様態において、（ａ）工程で提供される化合物
は以下の式を持つ。

【化１６】式中ｎ＝１又は２であり、Ｒは上で定義したようなものであり、以下の化学的反
応工程が開裂を誘導するために行われてよい。（ｉ）上記化合物をアルキル化剤と反応させ、第４級アンモニウム誘導体を産
出する。（ｉｉ）得られた第四級アンモニウム誘導体を塩基と反応させ、式

【化１７】の化合物を放出させる。式中Ｒ及びｎは上で定義したものである。（ｉｉｉ）この得られた化合物を質量分光計で検出する。適切なメチル化剤には硫酸ジメチル及びヨウ化メチルが含まれる。この工程は
メタノールのような溶媒中で行うことができる。適切な塩基にはジイソプロピル
エチルアミンが含まれ、ジクロロメタンのようなさらなる有機溶媒中に溶解して
もよい。この反応はホフマン脱離であり、本技術分野でよく公知である。

【００４７】上で言及したように、温度開裂は好ましくは質量分光計内で（またこれとイン
ラインで）行う。温度開裂はガスクロマトグラフィーへの入り口内で、又はガス
クロマトグラフィー／質量分光計、熱分解質量分光計、温度噴霧質量分光計又は
電子噴霧質量分光計への入り口内で行ってよい。温度開裂はまた試料をガス相内
へ蒸発させる可能性がある。いくつかの実施様態において、温度開裂はレーザー
によって影響を受け、検出のためにさらにリポーター基を脱着してよい。

【００４８】本発明の第二の観点は、分析物へリポーター基を接着させるための分析物の特
性化でのリンカー基の使用を提供し、ここでリンカー基は開裂可能であり、以下
の式を持つ。

【化１８】式中ｎは１又は２である。

【００４９】リンカーはしたがって開裂可能なリンカーであり、本発明の方法に関連して上
で記述した型のリンカーである。本発明のこの観点において言及された分析物は
特に制限はせず、上で定義したような任意の分析物であってよい。本発明のこの
観点で言及したリポーター基も特に限定はせず、上で定義したような任意のリポ
ーター基であってよい。

【００５０】分析物及び／又はリポーター基が直接リンカーに接着してよく、又は上で記述
したさらなる基のような、さらなる基を介して接着してよい。レポーター及び／
又は分析物は直接リンカー又はさらなる基に接着してよく、又は上記のように共
有結合を介して接着してよい。

【００５１】本発明のこの観点において、リンカーが、電子噴霧イオン源での低円錐電位を持つ電子噴霧又は温度噴霧イオン源での条
件下で温度的に開裂する、及び／又は従来のオリゴヌクレオチド合成器に和合性であることが望ましい。

【００５２】またさらなる観点において、本発明は以下の式を持っている化合物を提供する
。

【化１９】式中Ｒ¹は電子吸引置換基であり、Ｘがリポーター基を含み、Ｘ’が分析物を含
み、又はＸが分析物を含み、Ｘ’がリポーター基を含み、そしてそれぞれのハン
ドルは同一か又は異なり、Ｘ基をフェニル環及びＮ原子にそれぞれ直接接着して
いる一重結合、又はＸ基をそれぞれフェニル基及びＮ原子へ接着させることが可
能な反応基のどちらかである。

【００５３】本発明のこの観点の化合物は、本発明の方法の（ａ）工程で提供された型のと
りわけ好ましい化合物である。したがって、本発明の化合物において、ｎ＝２及
び上で定義した基Ｒはリポーター基又は分析物で置換されたフェニル基を含み、
共有結合でフェニル基に接着している。好ましくはリポーター基はＳＯ₂−基へ
のパラ基の位置でフェニル基へ接着する。上で定義された基Ｒ’はリポーター基
又は分析物へ共有結合を介して接着している−ＮＲ¹−基を含む。

【００５４】本発明の化合物において、分析物は好ましくはフェニル基を通してリンカーに
接着し、質量マーカーは好ましくはＮ原子を通してリンカーに接着する。しかし
ながら、分析物はまたＮ原子を通してリンカーに接着してよく、質量マーカーは
またフェニル基を通してリンカーに接着してよい。

【００５５】本発明のこの特定の実施様態において、分析物はとりわけ限定はせず、上に定
義したようなものである。このましくは、分析物は核酸又は核酸塩基である。し
たがって分析物は好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又はプラスミ
ドである。本発明のこの実施様態において、核酸（又は他の分析物）は好ましく
はフェニル基を通してリンカーに接着し、質量マーカーは好ましくはアミン官能
基を通してリンカーに接着する。

【００５６】本発明の化合物において、Ｒ¹は上で定義したようなものであり、それぞれの
ハンドルは上で定義したようなものであり、リポーター基は上で定義したような
ものである。

【００５７】本発明の好ましい化合物は本質的に質量標識化オリゴヌクレオチドであり、シ
ークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）基礎アッセイ、及び遺伝子発
現プロファイリングのような遺伝的分析で有用である。質量標識のアレイは標識
化すべきオリゴヌクレオチドのアレイを可能にするであろう。これらはシークエ
ンシングプライマー又はＰＣＲのプライマーとして、又はハイブリッド形成アッ
セイのためのプローブとして使用してよく、そこでそれぞれの場合において、多
重試料の分析物を多重化してよい。

【００５８】（工程（ａ）で提供された化合物の合成）さらなる観点において、本発明は本発明の工程（ａ）で提供された化合物の合
成の方法を提供する。

【００５９】本発明のこの観点の方法には以下の式の化合物を反応させることを含む。

【化２０】式中Ｒ及びｎは上で定義されたようなものである。１つ以上のレポーター遺伝子
又は分析物を持つ。

【００６０】上述したように、分析物がシステイン基を含んでいるアミノ酸又はペプチドの
場合、本方法の工程（ａ）で提供された化合物は好ましくは以下の式をもつ。

【化２１】式中、Ｒは上で定義されたようなものであり、リポーター基を含み、ｍは０又は
１であり、Ｒ⁷をリンカーに接着させているＳ原子はシステイン基の硫黄原子で
あり、Ｒ⁷はアミノ酸又はポリペプチドの残基である。これらの化合物は、１つ
以上のアミノ酸又はポリペプチド上の遊離チオールと式（Ｉ）の化合物を反応さ
せることによって本発明のこの観点にしたがって産出してよく、還元する必要が
あってもよい。

【００６１】本発明のこの観点のこの実施様態において、反応を比較的短い時間間隔で、好
ましくは２、３分で行うことが好ましい。アミノ酸又はポリペプチドでの任意の
遊離チオールは容易に化合物（Ｉ）と反応するであろう。いくつかのポリペプチ
ドが上で論議したように遊離チオールを暴露するために還元する必要があってよ
い。

【００６２】分析物がアミノ酸又はペプチドの場合、工程（ａ）で提供された化合物は以下
の式を持ってよい。

【化２２】式中Ｒは上で定義したようなものであり、リポーター基を含み、Ｎ原子はリジン
基のイプシロンアミノ基の窒素原子又はＮ−末端アルファアミノ酸の窒素原子で
あり、Ｒ⁸はＨ、Ｏ又はＮ−保護基から選択し、Ｒ⁹はアミノ酸又はポリペプチド
の残基である。これらの化合物は１つ以上のアミノ酸又はポリペプチドの上の遊
離アミンで式（Ｉ）の化合物を反応することによって本発明のこの観点にしたがって産出してよい。

【００６３】本発明のこの観点のこの実施様態において、アミン接着誘導体の産出は硫黄接
着誘導体の同時産出（上で議論した）と同時に起こってよい。本発明のこの観点
のこの実施様態において、反応を硫黄接着誘導体を形成する反応と比べて、比較
的長い期間で行うことが望ましい。遊離アミンは式（Ｉ）の化合物への遊離チオ
ールよりも反応性はよわい。アミノ酸又はポリペプチドが式（Ｉ）の化合物と反
応する場合、遊離チオールはもっとも早く反応し、一方遊離アミンはよりゆっく
り反応するであろう。反応時間は式（Ｉ）の化合物の本来の特性及び使用した条
件上のいくつかの範囲に依存し、経験的に決定してよい。チオールよりアミンに
選択的に反応するために、チオールは遮断すべき必要があってよい。このことは
遊離チオールの４−ビニルピリジン又はヨード酢酸での反応によって影響を受け
る可能性がある。ジスルフィドは崩壊し、過ギ酸でキャップを形成してよい。こ
れらの技術は本技術分野でよく公知である。

【００６４】分析物がセリン、スレオニン及び／又はチロシン基を含んでいるアミノ酸又は
ペプチドである場合、（ａ）工程で提供された化合物は以下の式を持ってよい。

【化２３】式中Ｒは上で定義したようなものであり、リポーター基を含み、Ｏ原子はセリ
ン、スレオニン又はチロシン基からの酸素原子であり、Ｒ¹⁰はアミノ酸又はポリ
ペプチドの残基である。これらの化合物は式（Ｉ）の化合物を１つ以上のアミノ
酸又はポリペプチド上の遊離水酸基と反応させることによって本発明のこの観点
にしたがって産出してよい。

【００６５】本発明のこの観点のこの実施様態において、酸素接着誘導体の産出が、アミン
接着及び硫黄接着誘導体（上で論議した）の同時産出によって伴ってよい。本発
明のこの観点のこの実施様態において、反応が硫黄接着及びアミン接着誘導体を
形成する反応と比較してより長い期間で行うことが好ましい。遊離チオール及び
アミンは遊離水酸基でよりも式（Ｉ）の化合物ととてもより早く反応するであろ
う。

【００６６】本発明のこの態様のすべての実施態様に基づいた方法は適切な溶媒中で行われ
る可能性がある。適切な溶媒にはアセトニトリル又はジメチルホルムアミドが挙
げられる。基剤が必要な場合、適切な基剤はトリエチルアミンである。

【００６７】（発明で使用される質量マーカーの適用）本発明で使用される質量マーカーは特に限定されない。切断可能なリンカーを
切断した後に生成されるマーカーは幅広い範囲の構造を有する。既に上で述べた
ように、１つの特定の結果生じるマーカーの構造は以下の式のようなものである
。

【化２４】式中Ｒ及びｎは上で定義したとおりである。このような化合物はアミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチ
ド及びその他の関心のある検体を分析するのに極めて有用な試薬である。

【００６８】特にこれらの化合物は、二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動によるアミノ酸及びポ
リペプチドの分析に有用である。２−Ｄゲル電気泳動は、タンパク質発現の概略
を描く技術、言い換えれば、組織で発現しているすべてのタンパク質の同一性と
量を目録にする技術である（R.A. Van Bogelen, E.R. Olson, "Application of
two-dimensional protein gels in biotechnology" Biotechnol. Annu. Rev., 1
: 69-103, 1995）。この技術では、タンパク質混合物は、生物試料から抽出され
て、狭いゲル小片上で分離される。この最初の分離では通常、等電点に基づいて
タンパク質を分離する。次いで、長方形のポリアクリルアミドゲルの１つの縁に
ゲル小片全体を横にしてのせる。小片中で分離されたタンパク質は、ドデシル硫
酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって
サイズに基づき２番目のゲル中で電気泳動的に分離される。いったん分離が完了
するとタンパク質を可視化する。これには典型的には、目で見て、又は蛍光で検
出することができる試薬によってゲルを染色することが挙げられる。放射線標識
とオートラジオグラフィも使用される。他の方法では、分離する前の試料中のタ
ンパク質に蛍光色素を共有結合で結合させてもよい。色素の共有結合付加によっ
てタンパク質の移動℃が変化する可能性があるので、これは、特に二次元ゲル画
像の公共データベースと比較すべき場合、あまり好まれないことがある。ゲルで
タンパク質を可視化すると、通常、ゲル上の特定のスポットでタンパク質を同定
することが必要である。これは典型的にはゲルからスポットを切り出し、ゲル基
質からタンパク質を抽出することによって行われる。次いで、様々な技術によっ
て抽出したタンパク質を同定することができる。好ましい技術にはタンパク質の
消化とそれに続く微量配列決定が挙げられ、又は更に好ましくは、消化したタン
パク質をＭＡＬＤＩＴＰＦで分析し、ペプチド質量フィンガープリントを生成
する（Jungblut P, Thiede B, "Protein identification from 2-D gels by MAL
DI mass spectrometry" Mass Spectrom. Rev. 16: 145-162, 1997）。

【００６９】この方法は自動化するのが極めて困難であり、最も単純な具体化においても相
対的に感度は良くない。今では２−Ｄ分析は相対的に遅い「バッチ」工程である
。それは再現性が特に優れるわけでもなく、ゲルを分析するのは高価である。ゲ
ルを基にした分析のコストの大部分は各ゲルの取り扱いにかかるので、数多くの
試料を１枚の２−Ｄゲル上で同時に多重化できることが望ましい。原理的には、
異なった試料のタンパク質を異なった別々に検出できるタグで標識することが可
能であれば、各試料のタンパク質を同一ゲル上で同時に分析することができる。
このことは、複数の時点で特定の生物における同一タンパク質の挙動を追跡する
ことが望ましい、例えば、事前に決めたスケジュールに従って細菌が薬剤にどの
ように反応するのかをモニターするような研究では、特に有益である。同様に、
同一疾患の複数の患者から得た生検試料を対応する対照と比較する場合、別々の
試料の同じタンパク質がゲル上で同一スポットに収まることを確認するのが望ま
しい。同一ゲル上で試料をすべて泳動することによって、ゲルの分離の再現性に
ついて心配する必要もなく、別々の試料を比較することができる。これを達成す
るには、別々の試料におけるタンパク質の移動度に対する影響が同一で、従って
、各試料において異なったマーカーで標識した特定のタンパク質が標識の如何に
かかわらずゲルの同一場所に収まるような一連の標識が必要となる。ＧＢ９８２
６１５９．７は、関連するタンパク質の移動度を同一程度に変化させる標識のア
レイを開示している。この出願の内容は参考として組み入れる。

【００７０】ＲがＧＢ９８２６１５９．７で開示された型の質量マーカーを含む式（Ｉ）の
化合物は、２−ＤＰＡＧＥ分析の多重化に特に効果的であることが予想される
。上述のように、本発明は、式（Ｉ）の化合物がアミノ酸又はポリペプチドと反
応することによる現在の方法の（ａ）工程で定義されるような化合物を形成する
方法を提供する。質量分析計で直接検出することができるこの化合物の別のしか
し関連した型によって複数の試料を標識することができる。次いで、このように
標識されたアミノ酸又はポリペプチドを２−ＤＰＡＧＥによって分離すること
ができる。泳動後のゲルを分析する１つの方法では、ゲルを目的物上に電気的に
ブロットする。次いで、質量分析計で検出するために、関連したポリペプチドか
らリポーター基を熱によって切断及び脱着できるように目的物をレーザーでラス
ター走査する。この方法ではゲル全体又はゲルのある領域が完全に画像化される
。

【００７１】代わりの実施態様では、式（Ｉ）の化合物も用いて、ＲはＧＢ９８２６１５９
．７で開示された型の質量マーカーを含む複合様式のリポーター基であってもよ
く、放射性同位元素がマーカーに組み込まれる。この化合物で標識された２−Ｄ
ゲル上のポリペプチドは、どこにタンパク質が存在するかを示すゲルの画像を提
供するオートラジオグラフィによって検出することができる。次いで、熱分解質
量分析法による分析のために関心のある領域からゲル中の小さな試料をくり抜く
ことができる。試料の精製が減らされうる又は敬遠されうるという点で熱分解は
有利である。本発明の好ましい実施態様では、放射性標識（例えば¹⁴Ｃ）を切断
可能なリンカーに組み込んで、切断するとき、放射性標識が検体に残るようにす
る。

【００７２】（実施例）ＥＳＩソースにおいて高い効率で切断するモデルリンカー化合物（ＦＴ２８）
の合成図２に示すモデルリンカーを合成した（図４を参照）。この化合物を以下ＦＴ
２７として識別する。ＦＴ２７の合成フェニルビニルスルホン（１．６８ｇ、１０ｍｍｏｌ）と６−アミノヘキサノ
ール（１．１７ｇ、１０ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２０ｍｌ）溶液をトリエ
チルアミン（０．１ｍｌ）で処理し、２時間環流し、室温にて一晩撹拌した。減
圧下で溶液を除いた。油性残留物を酢酸エチルに溶解し、溶媒を蒸発させて結晶
残留物を得た。酢酸エチル／ｎ−ヘキサンからの再結晶によって２．６７ｇ（９
４％）のＦＴ２７を得た。ＦＴ２７産物の同一性の確認融点６０〜６１℃ 計算した原子組成Ｃ５８．９２、Ｈ８．１２、Ｎ４．９１、；測定した組成Ｃ
５８．９１、Ｈ８．１４、Ｎ４．８９ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）１．３０〜１．５５（ｍ、１０Ｈ）、２．５７（ｔ
、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、３．０２（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、３．２９（ｔ、Ｊ
＝７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６３（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５〜７．７１（
ｍ、３Ｈ）７．９０〜７．９６（ｍ、２Ｈ）；¹³ ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）２５．４４，２６．８０，２９．６９，３２．５３
，４３．０３，４９．３３，５６．０２，６２．７１，１２８．０１，１２９．
４０，１３３．８４，１３９．５８

【００７３】ＦＴ２８の合成ＦＴ２７の誘導体を合成し（図４参照）、ＦＴ２８として同定し、図３に示し
た。それはＦＴ２７のアミン基がトリフルオロ酢酸基で保護されたものである。無水ジクロロメタン（１５ｍｌ）中のＦＴ２７（８５５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）溶
液とトリエチルアミン（２．５ｍｌ、１８ｍｍｏｌ）を０℃にて無水トリフルオ
ロ酢酸（０．８５ｍｌ、６ｍｍｏｌ）で処理し、この温度で１０分間撹拌し、室
温にて更に４０分撹拌した。リン酸緩衝液ｐＨ７．０（４０ｍｌ）とメタノール
（８０ｍｌ）の混合物の中に反応混合物を注ぎ、１５分間撹拌した。減圧下で有
機溶媒を除き、残った水性残留物を酢酸エチルで処理した。有機相を分離し、５
％重炭酸ナトリウムと１０％クエン酸と水の水溶液で洗浄した。有機相を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除いた。酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（３：２
）を溶出液としたシリカゲルにおけるフラッシュ・クロマトグラフィにより残留
物を精製し、油性固体として１．０７ｇ（９４％）のＦＴ２８を得た。ＦＴ２８の同一性の確認 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）１．３０〜１．４８（ｍ、４Ｈ）、１．５０〜１．
６８（ｍ、４Ｈ）、３．３０〜３．４８（ｍ、４Ｈ）、３．６５（ｍ、２Ｈ）、
３．７５（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、７．５６〜７．７３（ｍ、３Ｈ）、７．９
０〜７．９４（ｍ、２Ｈ）

【００７４】ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基に連結するための
リンカーの合成新しく蒸留したＴＨＦと共にＦＴ２８（０．３０６ｇ、０．８０３ｍｍｏｌ）
を３回共蒸発し、次いでＴＨＦ（１．５ｍｌ）に溶解した。アルゴンのもとで溶
液を撹拌し、ジイソプロピルエチルアミン（０．４５ｇ、０．６ｍｌ、３．５ｍ
ｍｏｌ）を加えた。その後、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロ
ホスホアミダイト（０．２ｇ、０．２ｍｌ、０．８５ｍｍｏｌ）を一滴ずつ加え
、反応を１時間撹拌し、その後薄層クロマトグラフィにより反応が完了したこと
を示した。混合物を希釈し（ＤＣＭ）、洗浄し（ＫＣｌａｑ）乾燥し（Ｎａ₂Ｓ
Ｏ₄）次いで乾燥するまで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解し、次
いでドライアイス／アセトンで冷却したヘキサン中で沈殿させることにより精製
した。残留物をアセトニトリル（１ｍｌ）に溶解し、ゲルマン空気ディスク（０
．４５ｍｍ）に溶液を通し、次いで、乾燥するまで蒸発させた。Ｐ₂Ｏ₅上の真空
デシケータで乾燥させる前に残留泡をＤＣＭと共に数回共蒸発した。これによっ
て白色の泡としてＣＭＭ２６７Ｂ（０．３５ｇ、７５％）が得られた。Ｒｆ_CMM267B＝０．７９Ｒｆ_FT28＝０．４５，ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ１：１，Ｕ．Ｖ．

【００７５】核酸塩基（ＦＴ４９）に連結するためのリンカーの合成ＦＴ４８として識別される中間生成物を介して図６に示すモデルリンカーを合
成した。モデルリンカーは以後ＦＴ４９として識別する。

【００７６】ＦＴ４８の合成フェニルビニルスルホン（１．６８ｇ、１０ｍｍｏｌ）、プロパギルアミン（
６０５ｍｇ、１１ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（０．１ｍｌ）のメタノー
ル（２０ｍｌ）溶液を２．５時間環流した。減圧下にて溶媒を除き、２．２３ｇ
（１００％）のＦＴ４８を得、更に精製することなく使用した。ＦＴ４８の同一性の確認 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）１．７４（ｂｒ、ｓ、１Ｈ）、２．２０（ｔ、Ｊ＝
３Ｈｚ、１Ｈ）３．０９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、３．３２（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ
、２Ｈ）、３．４０（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５〜７．７１（ｍ、３Ｈ
）、７．９２〜７．９６（ｍ、２Ｈ）

【００７７】ＦＴ４９の合成ＦＴ４８（２．０ｇ、９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３５ｍｌ）溶液をトリ
エチルアミン（２．５ｍｌ）で処理し、０℃に冷却し、続いて無水トリフルオロ
酢酸（２．３ｇ、１１ｍｍｏｌ）で処理した。この温度で１時間４０分間撹拌し
た後、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を止めた。有機相を分離し、水で２回洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。ｎ−ヘ
キサン／酢酸エチル（３：１）によるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフ
ィにより残留物を精製し、無色の油分として２．７７ｇ（９６％）のＦＴ４９を
得た。

【００７８】ＦＴ４８の同一性の確認 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）２．３０〜２．４０（ｍ、１，Ｈ）、３．５０（
ｍ、２Ｈ）、３．９３（ｍ、２Ｈ）４．２８（ｍ、２Ｈ）７．５４〜７．７６（
ｍ、３Ｈ）、７．８５〜７．９６（ｍ、２Ｈ）

【００７９】核酸塩基（ＦＴ５９）へのリンカーの連結５’−（４，４−ジメトキシトリチル）−５−ヨードウリジン（６５６ｍｇ、
１ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液をＦＴ４９（
９５７ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液
、ヨウ化銅（３８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．７ｍｌ、５
ｍｍｏｌ）及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（１．１５ｍｇ、
０．１ｍｍｏｌ）の順で処理した。室温にて６時間反応混合物を撹拌した。減圧
下にてトルエンと共に溶媒を共蒸発によって除いた。残留物をジクロロメタンに
溶解し、５％Ｎａ₂−ＥＤＴＡ、１０％チオ硫酸ナトリウム及び水の水溶液にて
洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムにて乾燥し、減圧下にて蒸発させた。ジクロ
ロメタン／メタノール（９５：５）続いて酢酸エチル／ｎ−ヘキサン／エタノー
ル／トリエチルアミン（６５：３０：５：１）によるフラッシュ・クロマトグラ
フィによって残留物を精製し、浅黄色の泡として６５０ｍｇ（７７％）のＦＴ５
９を得た。

【００８０】ＦＴ５９の同一性の確認計算した原子組成：Ｃ６０．９１、Ｈ４．７５、Ｎ４．９６；測定した組成：
Ｃ６０．７３、Ｈ４．７４、Ｎ４．９３ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）２．３１（ｍ、１Ｈ）、２．５１（ｍ、１Ｈ）、３
．３１〜３．６６（ｍ、６Ｈ）、３．７９（ｓ、６Ｈ）、４．０６〜４．１５（
ｍ、３Ｈ）、４．５２（ｍ、１Ｈ）、６．３１（ｍ、１Ｈ）、６．８４（ｄ、Ｊ
＝１０Ｈｚ、４Ｈ）、７．２０〜７．６７（ｍ、１４Ｈ）、７．８７（ｍ、２Ｈ
）、８．１０〜８．１８（２ｓ、１Ｈ）ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ８４８［Ｍ＋Ｈ］⁺

【００８１】モデルリンカーＦＴ２７及びＦＴ２８の質量分析電気スプレー・イオン化源を備えたプラットホームＬＣ型４極装置（マイクロ
マス社、英国）で全データを獲得した。水とアセトニトリル５０：５０の混合物
中で５ｎｇ／ｍｌのＦＴ２８溶液を調製した。アンモニアも０．２％存在した。
図８はＦＴ２８の陰イオン質量スペクトルを示す。３８０．１に相対的に小さな
ピークがあり、単一陽子を差し引いた分子に相当する。このピークを含有する３
７５〜３８５の領域は図８で２５０倍に拡大されている。ＦＴ２８のイオン化に
よって生じたＦＴ２８の主な切断産物に相当する２番目に大きなピークが２１２
．１にある。図９はＦＴ２８リンカーが切断される推定メカニズムを示す。

【００８２】ＦＴ２８においてアミン結合を保護しているトリフルオロ酢酸基が、オリゴヌ
クレオチド・シンセサイザーの最終脱保護工程で使われる強塩基に対して不安定
であることに気付くべきである。これは、高い効率で切断するリンカーを作成す
るためのオリゴヌクレオチド合成に安定な別の基を見つけ、この基と入れ替えな
ければならないことを意味している。しかも反応できる機能性をフェニル環の中
で置換し、リンカー基として有用であるためにこの物質に必要な第２のハンドル
を提供しなければならない。

【００８３】電気スプレーイオン源において切断可能な８つのモデル質量標識の合成市販の中間生成物から８つのエーテル化合物を合成した。電気スプレーイオン
源において切断するリンカーにこれらの化合物を連結した。そのようなリンカー
を２つ用いた。１つは、アミド基を保護するトリフルオロ酢酸基を含有し、１つ
はリンカーにおいて同じアミド基を保護的に保護するメシラートを含有する。こ
のようなリンカーのそれぞれを４つのエーテル質量標識の同じセットに連結し、
合計８種類の標識を得る。図１０は行った合成の模式図を示す。このような質量
標識を合成して電気スプレーイオン源における標識の切断の原理を立証した。結
果は、保護基の性質は切断可能なリンカーの機能性には必須ではなく、質量マー
カーの性質は切断工程を妨害しないことを示している。従って、このリンカーは
、標識の大きなアレイの作成を可能にするような多種多様なエーテル及びポリエ
ーテルの質量標識に適合すべきである。示したマーカーはモデルマーカーであり
、検体分子のどれにも連結してはいない。切断可能なリンカーのコアはフェニル
ビニルスルホンを含んでいる。フェニル環は、例えば、マーカー基を５’−（４
,４−ジメトキシ）トリチル−５−ヨードウリジンと反応させて塩基に連結した
質量マーカーを持つヌクレオチドを作成するために使用する可能性がある１,７
−オクタジエン（アルドリッチ）に連結することができる、臭素基で置換するこ
とができる。同様に、当該技術で周知の常法を用いてヌクレオチド内の他の位置
に質量標識を連結するために、臭化フェニルビニルスルホンをオルト保護されて
いる可能性があるプロパギルアルコールと反応させて遊離のヒドロキシル基を提
供することができる。このような標識がタンパク質、炭水化物又はその他の生体
分子のようなその他の検体と反応することを可能にするために様々なその他の基
を導入してもよい。

【００８４】ＦＴ１１６の合成Ｎ−ベンジルオキシカルボニル６−アミノカプロン酸（２．６５ｇ、１０ｍｍ
ｏｌ）のテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）溶液を０℃にて１０Ｍボランジメチル
スルフィド錯体のテトラヒドロフラン（２．２ｍｌ、２２ｍｍｏｌ）溶液で処理
し、０℃にて１時間、室温にて２時間撹拌した。メタノール（２ｍｌ）を慎重に
加えることによって反応混合物の反応を止めた。続いて減圧下にて溶媒を除き、
メタノール（３ｘ２０ｍｌ）と共に共蒸発して２．４１６ｇ（９６％）のＦＴ１
１６を得た。非極性の不純物を含有する粗生成物を更に精製することなく次の工
程で使用した。酢酸エチル／ｎ−ヘキサンからの再結晶によって分析用の純粋試料を調製した
。

【００８５】Ｔ１１６産物の同一性の確認融点７９〜８１℃ 計算した原子組成：Ｃ６６．９０，Ｈ８．４２，Ｎ５．５７；測定した組成：
Ｃ６７．１７，Ｈ８．６８，Ｎ５．６７ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３５〜１．６４（９Ｈ、ｍ）、３．１９（２
Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝６．５及び６．５Ｈｚ）、３．６２（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ
）、４．７９（１Ｈ、ｂｒｓ）、５．１０（２Ｈ、ｓ）、７．２６〜７．３７（
５Ｈ、ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２５．３１，２６．３７，２９．９６，３２．５
７，４０．９５，６２．７２，６６．６４，１２８．１４，１２８．５７，１３
６．７６，１５６．５７化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴った質量スペクトルのピークが得られた：２５１（Ｍ⁺、
＜１％）、１６０，１４４，１３０，１０８，９１（１００％）

【００８６】ＦＴ１１７／２の合成ＦＴ１１６（２．３ｇ、９．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４５ｍｌ）と無
水トリエチルアミン（５ｍｌ）溶液を０〜５℃にて塩化メタンスルフォニル（１
．３７５ｇ、１２ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物１５分以内に室温まで暖め
、この温度にて４時間撹拌し、ジクロロメタン（５０ｍｌ）で希釈して、重炭酸
ナトリウムと水の５％水溶液で洗浄した（２ｘ）。有機相は硫酸ナトリウムで乾
燥し、減圧下で溶媒を除いた。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１：１）を溶出液と
して用いたシリカゲル（１００ｇ）におけるフラッシュクロマトグラフィにて残
留物を精製し、２．４１３ｇ（８０％）のＦＴ１１７／２を得た。

【００８７】ＦＴ１１７／２産物の同一性の確認融点２４〜２７℃ 計算した原子組成：Ｃ５４．６９，Ｈ７．０４，Ｎ４．２５；測定した組成Ｃ５
４．８８，Ｈ７．０７，Ｎ４．２１ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３２〜１．６０（６Ｈ、ｍ）、１．７６（２
Ｈ、ｍ）、２．９９（３Ｈ、ｓ）、３．１８（２Ｈ、ｍ）、４．２１（２Ｈ、ｔ
、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、４．７６（１Ｈ、ｂｒｓ）、５．１０（２Ｈ、ｓ）７．２
６〜７．３５（５Ｈ、ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２５．０９，２６．０８，２９．０３，２９．８
２，３７．４２，４０．８９，６６．６６，６９．８４，１２８．１６，１２８
．５８，１３６．７５，１５６．５１化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：３２９（Ｍ⁺、３％）、２２２，
１９４，１２６，１０８，９１（１００％）

【００８８】ＦＴ１２０、ＦＴ１２１、ＦＴ１２２、ＦＴ１２３の合成−基本手順水素化ナトリウム（１２０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の６０％油性懸濁液のＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）懸濁液を相当するフェノール（３ｍｍｏｌ）の
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）溶液で処理した。水素発生の終了後、
ＦＴ１１７／２（４９３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド（２ｍｌ）溶液を加えた。反応混合物を室温にて１８時間撹拌し、ジエチルエ
ーテル／ｎ−ヘキサン（１：１、２５ｍｌ）で希釈した。水（２ｘ）、１Ｍの水
酸化カリウム水溶液（３ｘ１０ｍｌ）、及び水（２ｘ）で溶液を洗浄した。有機
相を硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。ｎ−ヘキサン／酢酸エ
チル（３：１）を溶出液として用いたシリカゲル上でのフラッシュ・クロマトグ
ラフィによって相当するフェノールエーテルを得た。

【００８９】ＦＴ１２０生成物の同一性の確認ＦＴ１２０：収率７５％、融点７９〜８１℃（ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサ
ン）計算した原子組成：Ｃ７４．４４，Ｈ６．９７，Ｎ３．３４；測定した組成：
Ｃ７４．５１，Ｈ６．９８，Ｎ３．３２ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３４〜１．５９（６Ｈ、ｍ）、１．８０（２
Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、３．２１（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝６．５及び６．５Ｈｚ
）、３．９３（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、４．７３（１Ｈ、ｂｒｓ）、５．
１０（２Ｈ、ｓ）、６．８１〜７．０６（７Ｈ、ｍ）、７．１７〜７．３７（７
Ｈ、ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）２５．７６，２６．４８，２９．２２，２９．５４
，４１．０５，６６．６６，６８．３３，１１５．５９，１１７．６８，１２０
．８３，１２２．４６，１２８．１５，１２８．５８，１２９．６５，１３６．
７７，１５０．１８，１５５．５０，１５６．４９，１５８．６５化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以下
の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：４１９（Ｍ⁺、５％）、３１１，
１８６（１００％）、９１，７７

【００９０】ＦＴ１２１生成物の同一性の確認ＦＴ１２１：収率７９％、無色の油分計算した原子組成：Ｃ６９．５４，Ｈ７．００，Ｎ４．０６；測定した組成：
Ｃ６９．３４，Ｈ７．０４，Ｎ３．９９ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３７〜１．５（６Ｈ、ｍ）、１．７６（２Ｈ
、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、３．２０（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝６．５及び６．５Ｈｚ）
、３．８９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、４．７３（１Ｈ、ｂｒｓ）、５．１
０（２Ｈ、ｓ）、６．７８〜６．９８（４Ｈ、ｍ）７．２６〜７．３７（５Ｈ、
ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２５．７２，２６．４６，２９．１７，２９．９
４，４１．０３，６６．６５，６８．４９，１１５．７７，１１５．６２，１１
５．９３，１２８．１５，１２５．５８，１２９．６５，１３６．７７，１５５
．２９，１５６．４９，１５８．８５化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：３４５（Ｍ⁺、５％）、２３４，
２０２，１１２，９１（１００％）

【００９１】ＦＴ１２２生成物の同一性の確認ＦＴ１２２：収率７２％；融点４９〜５１℃（ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサ
ン）計算した原子組成：Ｃ７４．３３，Ｈ８．２２，Ｎ３．９４；測定した組成：
Ｃ７４．６１，Ｈ８．３３，Ｎ３．８８ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．２５〜１．５７（６Ｈ、ｍ）、１．７５（２
Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、２．１８（３Ｈ、ｓ）、２．２２（３Ｈ、ｓ）、３
．１９（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝６．５及び６．５Ｈｚ）、３．９０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝
６．５Ｈｚ）４．７３（１Ｈ、ｂｒｓ）、５．１０（２Ｈ、ｓ）６．６１〜６．
７０（２Ｈ、ｍ）、７．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．２５〜７．３
６（５Ｈ、ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１８．７２，１９．７７，２５．７８，２６．４
９，２９．２５，２９．９５，４１．０６，６６．６３，６７．８１，１１１．
５２，１１６．２７，１２８．１３，１２８．５８，１３０．３３，１３６．７
７，１３７．９２，１５６．４０，１５７．３３）化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：３５５（Ｍ^-、１５％）、２６
４，２４６，２１２，１２２，１２１，１０７，９１（１００％）

【００９２】ＦＴ１２３生成物の同一性の確認ＦＴ１２３：収率８０％；融点４２〜４４℃（ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサ
ン）計算した原子組成：Ｃ７６．３６，Ｈ７．２１，Ｎ３．７１；測定した組成：
Ｃ７６．４８，Ｈ７．２３，Ｎ３．６９ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３０〜１．６３（６Ｈ、ｍ）、１．９３（２
Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、３．２０（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝６．５及び６．５Ｈｚ
）、４．１１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、４．７４（１Ｈ、ｂｒｓ）、５．
１０（２Ｈ、ｓ）、６．７８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．２４〜７．５
０（９Ｈ、ｍ）、７．７２（１Ｈ、ｍ）、８．２６（１Ｈ、ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２６．０１，２６．５５，２９．２３，３０．０
１，４１．０９，６６．６５，６７．９９，１０４．６７，１２０．１１，１２
２．１１，１２５．１５，１２５．８７，１２５．９６，１２６．３９，１２７
．５１，１２８．１５，１２８．５８，１３４．６３，１３６．９７，１３７．
９２，１５４．９４，１５６．５２化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：３７７（Ｍ⁺、１５％）、２６９
，２３４，１６５，１４４，１２７，１１５，９１（１００％）

【００９３】ＦＴ１２６、ＦＴ１２８、ＦＴ１３０、ＦＴ１３２の合成−基本手順相当するＮ−ベンジルオキシカルボニル保護フェノールエーテル（１ｍｍｏｌ
）のメタノール（２０ｍｌ）溶液を蟻酸アンモニウム（２５０ｍｇ、４ｍｍｏｌ
）と１０％パラジウム・チャコール（８０ｍｇ）で処理し、室温にて１５〜６０
分撹拌した。セライトの詰め物で反応混合物を濾過した。濾過物を減圧下で乾燥
するまで濃縮した。残留物を水／酢酸エチルに溶解し、１Ｍの水酸化カリウムを
加えた。有機相を１Ｍの水酸化カリウム、水（２ｘ）で洗浄し、硫酸ナトリウム
で乾燥した。減圧下で溶媒を除いた。相当する粗精製アミンをさらに精製するこ
となく次の工程で使用した。

【００９４】ＦＴ１２７、ＦＴ１２９、ＦＴ１３１、ＦＴ１３３の合成−基本手順相当するアミン、ＦＴ１２６、ＦＴ１２８、ＦＴ１３０、又はＦＴ１３２（１
ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍｌ）溶液をフェニルビニルスルホン（１６８ｍ
ｇ、１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．０５ｍｌ）で処理し、２時間環流
した。減圧下で溶媒を除き、酢酸エチル／トリエチルアミン（１００：１）を溶
出液としたシリカゲル（２０ｇ）のフラッシュ・クロマトグラフィで残留物を精
製し、相当する第２級アミンを得た。

【００９５】ＦＴ１２７生成の同一性の確認ＦＴ１２７：収率８２％；無色の油分計算した原子組成：Ｃ６８．８４，Ｈ６．８９，Ｎ３．０９；測定した組成：
Ｃ６９．１６，Ｈ７．００，Ｎ３．００ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３３〜１．４９（６Ｈ、ｍ）、１．７５（２
Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１６及び７Ｈｚ）、２．５８（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．０
２（Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．２９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．９３（２
Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６．８５〜７．０６（７Ｈ、ｍ）、７．２６〜７．３２
（２Ｈ、ｍ）、７．５５〜７．６９（３Ｈ、ｍ）、７．９１〜７．９４（２Ｈ、
ｍ）化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：４５３（Ｍ⁺、３％）、３１２，
２９８，２８５，２６８，１９８（１００％）、１８６，１６８，１４１，１２
５，１００，７７

【００９６】ＦＴ１２９生成物の同一性の確認ＦＴ１２９：収率７８％；無色の油分計算した原子組成：Ｃ６３．３０，Ｈ６．９１，Ｎ３．６９；測定した組成：
Ｃ６３．５０，Ｈ６．９６，Ｎ３．６５ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１３３〜１４９（６Ｈ、ｍ）、１．７３（２Ｈ、
ｄｔ、Ｊ＝１６及び７Ｈｚ）、２．５７（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．０２（
２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．２９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．９０（２Ｈ
、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６．８０〜６．８５（２Ｈ、ｍ）、６．９２〜７．００（
２Ｈ、ｍ）、７．５５〜７．６９（３Ｈ、ｍ）、７．９１〜７．９４（２Ｈ、ｍ
） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２５．９２，２６．９６，２９．２１，２９．８
７，４３．１６，４９．４６，５６．１６，６８．５６，１１５．４８，１１５
．６１，１１５．９２，１２８．０１，１２９．４０，１３３．８３，１３９．
６１，１５５．３３，１５８．８３化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：３８０［Ｍ＋１］⁺（１％）、３
７８［Ｍ−１］⁺（１％）、２８７，１６８，１９８（１００％）、１４１，１
２５，１２６，１１２

【００９７】ＦＴ１３１生成物の同一性の確認ＦＴ１３１：収率９３％；無色の油分計算した原子組成：Ｃ６７．８３，Ｈ８．０２，Ｎ３．６０；測定した組成：
Ｃ６７．８９，Ｈ８．０６，Ｎ３．５５ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１３１〜１４９（６Ｈ、ｍ）、１．７５（２Ｈ、
ｄｔ、Ｊ＝１６及び７Ｈｚ）、２．１８（３Ｈ、ｓ）、２．２２（３Ｈ、ｓ）、
２．５６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．０１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．
２９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．９１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６．６２
（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９及び２．５Ｈｚ）、６．７０（１ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ）、
７．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．５５〜７．６９（３Ｈ、ｍ）、７．９
０〜７．９４（２Ｈ、ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１８．７２，１９．９７，２５．９７，２６．
９８，２９．２９，２９．８９，４３．１７，４９．４８，５６．１７，６７．
８７，１１１．５２，１１６．２７，１２８．０２，１２８．４８，１２９．４
１，１３０．３２，１３３．８３，１３７．６１，１３９．６１，１５７．３５
化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以下
の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：３８９（Ｍ⁺、２％）、２６８，１
９８（１００％）、１４１，１２６，１２２，１０７

【００９８】ＦＴ１３３生成物の同一性の確認ＦＴ１３３：収率８５％；無色の油分計算した原子組成：Ｃ７０．０４，Ｈ７．１０，Ｎ３．４０；測定した組成：
Ｃ６９．８０，Ｈ７．１３，Ｎ３．３８ ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３５〜１．６２（６Ｈ、ｍ）、１．９２（２
Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１６及び７Ｈｚ）、２．５６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．０
２（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、３．２８（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、４．１３（
２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６．８９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８及び１．３Ｈｚ）７．
３３〜７．６８（７Ｈ、ｍ）、７．７８（１Ｈ、ｍ）、７．９０〜７．９４（２
Ｈ、ｍ）、８．２７（１Ｈ、ｍ） ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２６．１８，２７．００，２９．２３，２９．
９２，４３．１８，４９．４８，５６．１７，６８．０２，１０４．６７，１２
０．０７，１２２．１１，１２５．１１，１２５．９７，１２６．３７，１２７
．４９，１２８．０２，１２９．３９，１３３．８１，１３４．６２，１３９．
６１，１５４．９６化合物をイオン化する電子衝撃イオン化法を用いた化合物の質量分析では、以
下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた：４１１（Ｍ⁺、５％）、２６８，
１９８（１００％）、１４４，１２６，１２５，１１５，１００

【００９９】ＦＴ１３４、ＦＴ１３５、ＦＴ１３６、ＦＴ１３７の合成−基本手順相当する第２級アミンＦＴ１２７、ＦＴ１２９、ＦＴ１３１又はＦＴ１３３（
０．１２ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２ｍｌ）溶液をトリメチルアミン（
０．２５ｍｌ）で処理し、最終的には０℃にて無水トリフルオロ酢酸（０．０５
ｍｌ、０．３７ｍｍｏｌ）で処理した。この温度で反応混合物を２０分間撹拌し
、メタノール（０．２５ｍｌ）で処理する。減圧下で溶媒を蒸発させ、残留物を
ジクロロメタンに溶解し、水で洗浄した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、乾燥するまで蒸発させ、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（２：１）によるシリカ
ゲルのフラッシュクロマトグラフィによって精製して、相当するトリフルオロア
セトアミド、ＦＴ１３４、ＦＴ１３５、ＦＴ１３６、及びＦＴ１３７を得た。

【０１００】ＦＴ１３４生成物の同一性の確認ＦＴ１３４：収率９３％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３４〜１．８４（８Ｈ、ｍ）、３．３０〜３
．４８（４Ｈ、ｍ）、３．７６（２Ｈ、ｍ）、３．９５（２Ｈ、ｍ）、６．８４
〜７．１０（７Ｈ、ｍ）、７．２７〜７．３３（２Ｈ、ｍ）７．５５〜７．７３
（３Ｈ、ｍ）、７．９０〜７．９５（２Ｈ、ｍ）化合物をイオン化するためにアンモニアによる化学反応イオン化法を用いた化
合物の質量分析では、以下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた；５６７［
Ｍ＋ＮＨ₄］⁺（１００％）、５４９［Ｍ］⁺、４７５，４２７，３９９，３８１
，１８６

【０１０１】ＦＴ１３５生成物の同一性の確認ＦＴ１３５：収率８２％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３４〜１．８２（８Ｈ、ｍ）、３．３０〜３
．４８（４Ｈ、ｍ）、３．７６（２Ｈ、ｍ）、３．９０（２Ｈ、ｍ）６．７９〜
６．８５（２Ｈ、ｍ）、６．９２〜７．００（２Ｈ、ｍ）、７．５５〜７．７３
（３Ｈ、ｍ）、７．９０〜７．９５（２Ｈ、ｍ）ＭＳ（Ｃｌ、ＮＨ₃）：４９３［Ｍ＋ＮＨ₄］⁺（１００％）、４７５［Ｍ］⁺、
３８１，３５３，３５１，３２５，１８６

【０１０２】ＦＴ１３６生成物の同一性の確認ＦＴ１３６：収率９８％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３０〜１．８１（８Ｈ、ｍ）、２．１９（３
Ｈ、ｓ）、２．２３（３Ｈ、ｓ）、３．３０〜３．４８（４Ｈ、ｍ）、３．７７
（２Ｈ、ｍ）、３．９２（２Ｈ、ｍ）、６．６４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．５及び
２．５Ｈｚ）、６．７１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ）、７．０２（１Ｈ、ｄ、
Ｊ＝９．５Ｈｚ）、７．５５〜７．７３（３Ｈ、ｍ）、７．９０〜７．９５（２
Ｈ、ｍ）化合物をイオン化するためにアンモニアによる化学反応イオン化法を用いた化
合物の質量分析では、以下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた；５０３［
Ｍ＋ＮＨ₄］⁺、４８５［Ｍ］⁺、３８３，３６３，３３５，３１８，２４１，１
８６，１２２，４３（１００％）

【０１０３】ＦＴ１３７生成物の同一性の確認ＦＴ１３７：収率８０％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３４〜１．４９（２Ｈ、ｍ）、１．５５〜１
．７２（４Ｈ、ｍ）、１．８７〜１．９９（２Ｈ、ｍ）、３．３０〜３．４８（
４Ｈ、ｍ）、３．７２（２Ｈ、ｍ）、４．１５（２Ｈ、ｍ）、６．８０（１Ｈ、
ｄｄ、Ｊ＝８．５及び１．５Ｈｚ）、７．３３〜７．７０（７Ｈ、ｍ）、７．８
０（１Ｈ、ｍ）、７．８９〜７．９４（２Ｈ、ｍ）８．２７（１Ｈ、ｍ）化合物をイオン化するためにアンモニアによる化学反応イオン化法を用いた化合
物の質量分析では、以下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた；５２５［（
Ｍ＋ＮＨ₄）⁺１００％］、［５０５（Ｍ＋１）⁺］、３８５，３８３，３５７，
３４０，１８６，１６０，１４０

【０１０４】ＦＴ１４２、ＦＴ１４３、ＦＴ１４６、ＦＴ１４７の合成−基本手順相当する第２級アミン、ＦＴ１２７、ＦＴ１２９、ＦＴ１３１、又はＦＴ１３
３（０．０６ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２ｍｌ）溶液をトリエチルアミ
ン（０．１ｍｌ）で処理し、最終的には０℃にて塩化メタンスルフォニル（０．
１ｍｌ、０．１３ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物をこの温度で２０分間撹拌
し、メタノール（０．１ｍｌ）で処理した。反応混合物をジクロロメタンで希釈
し、水で洗浄した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥するまで蒸発
させ、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（２：３）によるシリカゲルのフラッシュクロ
マトグラフィによって精製して、相当するスルホンアミンＦＴ１４２、ＦＴ１４
３、ＦＴ１４６、及びＦＴ１４７を得た。

【０１０５】ＦＴ１４２生成物の同一性の確認ＦＴ１４２：収率８６％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３４〜１．８３（８Ｈ、ｍ）、５．８３（３
Ｈ、ｓ）、３．２０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝９Ｈｚ）、３．４１〜３．４７（２Ｈ、ｍ
）、３．５７〜３．６２（２Ｈ、ｍ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６
．８４〜７．０７（７Ｈ、ｍ）、７．２６〜７．３３（２Ｈ、ｍ）、７．５７〜
７．７０（３Ｈ、ｍ）、７．９１〜７．９５（２Ｈ、ｍ）ＭＳ（ＤＣｌ、ＮＨ₃）：５４９［Ｍ＋ＮＨ₄］⁺１００％、５３１Ｍ⁺、４０９
，３８１，２２３，１８６

【０１０６】ＦＴ１４３生成物の同一性の確認ＦＴ１４３：収率８８％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３０〜１．６５（６Ｈ、ｍ）、１．７１〜１
．８１（２Ｈ、ｍ）、２．８３（３Ｈ、ｓ）、３．１９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝９Ｈｚ
）、３．４１〜３．４７（２Ｈ、ｍ）、３．５６〜３．６２（２Ｈ、ｍ）３．９
１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６．７９〜７．０１（４Ｈ、ｍ）、７．５７〜７
．７２（３Ｈ、ｍ）、７．９１〜７．９５（２Ｈ、ｍ）化合物をイオン化するためにアンモニアによる化学反応イオン化法を用いた化
合物の質量分析では、以下の質量対荷電比を伴ったイオンが得られた；４７５［
Ｍ＋ＮＨ₄］⁺、４５８［Ｍ＋Ｈ］⁺、３６３，３０７，２３８，１８６

【０１０７】ＦＴ１４６生成物の同一性の確認ＦＴ１４６：収率８９％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３２〜１．６３（６Ｈ、ｍ）、１．７０〜１
．８０（２Ｈ、ｍ）、２．１９（３Ｈ、ｓ）、２．２３（３Ｈ、ｓ）、２．８２
（３Ｈ、ｓ）、３．１８（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝９Ｈｚ）、３．４１〜３．４７（２Ｈ
、ｍ）、３．５５〜３．６２（２Ｈ、ｍ）、３．９２（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）
、６．６３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．５及び３Ｈｚ）、６．７１（１Ｈ、ｄ、３Ｈ
ｚ）、７．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ）、７．５６〜７．７２（３Ｈ、ｍ
）、７．９１〜７．９５（２Ｈ、ｍ）ＭＳ（ＤＣｌ、ＮＨ₃）：４８５［Ｍ＋ＮＨ₄］⁺（１００％）、４６７［Ｍ］⁺ 、３６３，３４５，３１７，２４８，１８６，１２２

【０１０８】ＦＴ１４７生成物の同一性の確認ＦＴ１４７：収率９９％；非晶性固体 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．３５〜１．４７（２Ｈ、ｍ）、１．５４〜１
．６７（４Ｈ、ｍ）、１．８８〜１．９８（２Ｈ、ｍ）、２．８１（３Ｈ、ｓ）
、３．２０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝９Ｈｚ）、３．４１〜３．４７（２Ｈ、ｍ）３．５
５〜３．６２（２Ｈ、ｍ）、４．１４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６．８０（１
Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．３２〜７．５１（４Ｈ、ｍ）、７．５４〜７．
７（３Ｈ、ｍ）、７．８０（１Ｈ、ｍ）、７．９１〜７．９５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝
８Ｈｚ）、８．２７（１Ｈ、ｍ）ＭＳ（ＤＣｌ、ＮＨ₃）：５０７［Ｍ＋ＮＨ₄］⁺、４９０［Ｍ］⁺、３６５，
３３９，３２２，２０６，１８６（１００％）

【０１０９】ＦＴ１３４、１３５、１３６、１３７及びＦＴ１４２、１４３、１４６、１４
７のＥＳＩ−ＭＳ分析電気スプレーイオン化源を備えたプラットホームＬＣ４極装置（英国；マイク
ロマス社）によって８種の化合物、ＦＴ１３４、１３５、１３６、１３７及びＦ
Ｔ１４２、１４３、１４６、１４７を分析した。水とアセトニトリルの５０：５
０混合液で各マーカーの溶液を準備した。溶媒中には０．２％の濃度でアンモニ
アも存在した。図１１から図１８はそれぞれ、ＦＴ１３４、１３５、１３６、１
３７及びＦＴ１４２、１４３、１４６、１４７の陰イオン質量スペクトルを示し
ている。各例では、検出可能な分子イオンはなく、陰イオン切断産物に相当する
スペクトルの主要なピークを各例で同定する。このようなスペクトルではすべて
多くの余分なピークがある。このようなもので最も重要なのは、それぞれ、荷電
していない、切断されていない質量マーカーを伴った蟻酸及び酢酸に相当する切
断されていないマーカーに４５ダルトン及び５９ダルトンが加わった付加物の分
子質量に相当する質量で生じる。質量分析計のイオン源における以前使用したも
のからの混入もあった。

【０１１０】フェニルビニルスルホンのビニル二重結合へのタンパク質アルブミンのアミノ
基の付加アセトニトリルと水のような有機溶媒の混合物では、アルブミンの溶解性は中
性塩を添加することにより高まる。７ｍｇのタンパク質をアセトニトリル／水（
７５％アセトニトリル（ＡＣＮ））の溶媒混合物１ｍｌに溶解した。濁った溶液
にＮａＣｌの１モル溶液を２滴及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）を２滴加えた。
塩を添加した後、溶液は透明になった。アルブミンの透明な溶液にＡＣＮ１ｍｌ
中の６ｍｇのフェニルビニルスルホン（ＰＶＳ）を加えた。室温にて一晩、反応
混合物を撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させた。固体残留物を少量のメタノール
と極少量の塩に溶解し、沈殿物は濾過して除いた。濾過物を蒸発により減量し、
最終産物をエーテルから結晶化して６．５ｍｇの白色固体を得た。蒸留した酢酸
エチルにて数回、固体を洗浄して過剰なＰＶＳを除いた。最後に洗浄したものを
分析用とし、減圧下で固体を乾燥した。

【０１１１】ＰＶＳ（ＣＨ＝ＣＨ₂ＳＯ₂Ａｒ）の親分子イオン１６８ｍ／ｚに由来するＡｒ
ＳＯ⁺断片に特徴的な１２５ｍ／ｚ比ピークの検出を行うために、ＧＣ−ＭＳ装
置をまず補正し、調整した。ブランクの溶媒（純粋な酢酸エチル）も前にＰＶＳ
を標識したアルブミンを洗浄した酢酸エチルも１２５ｍ／ｚのピークは示さなか
った。このことは、修飾したタンパク質には極微量の遊離のＰＶＳも混入してい
ないことを意味している。

【０１１２】修飾したタンパク質からのフェニルビニルスルホンの切断２ｍｌのＭｅＯＨ中の５ｍｇの付加化合物（アルブミン−フェニルビニルスル
ホン）を室温にて２時間、２滴の硫酸ジメチルと反応させた。２ｍｌのジクロロ
メタン（ＤＣＭ）に溶解した５．２ｍｇの第４級アンモニウム塩を２滴のジイソ
プロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）で処理した。室温にて２時間、反応混合物を
撹拌した。次いで溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチルに入れ、水で洗浄して、
硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒の蒸発後、残留物を１ｍｌの酢酸エチルに
溶解してＧＣ−ＭＳによって分析した。フェニルビニルスルホン断片に特徴的な
ｍ／ｚピーク１２５は容易に検出された。切断された化合物の濃度をモニターし
、既知量で存在する内部標準と比較した；２．５ｘ１０⁶モルのＰＶＳが観察さ
れ、それは修飾の間にタンパク質に結合したＰＶＳの量に近いものである。

【０１１３】アルブミン及びウシ血清アルブミンにおけるシステイン残基のＰＶＳへの付加
アルブミン又はウシ血清アルブミン（シグマ）をアセトニトリル／水の混合物に
溶解した。トリエチルアミンを溶液に加え、窒素のもとに５分間置いた。次いで
ＰＶＳを加え、室温にて１５分間だけ反応混合物を撹拌した。ＰＶＳで標識した
タンパク質は一部がニンヒドリンと反応すると、紫色の生成物となり、遊離のア
ミン基が存在することを示していた。標識反応の後、室温にて溶媒を蒸発させ、
各タンパク質からの残留物はエーテルで沈殿させ、濾過によって回収した。酢酸
エチルで固体を数回洗浄し、減圧下で乾燥した。

【０１１４】チオ標識したアルブミン及びＢＳＡからのＰＶＳの末端脱離両試料（ＰＶＳチオ標識したアルブミン及びＢＳＡ）は、溶液として（水／ア
セトニトリル、７５％ＡＣＮ）ＧＣ−ＭＳに注入した場合、末端で脱離したスル
ホンに相当するｍ／ｚ１２５で独特のピークを持っていた。ポリアクリルアミド
ゲル上でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって電気泳動で分離
し、当該技術で周知の常法を用いて回収するＰＶＳ標識のアルブミン及びＢＳＡ
を用いた実験でも、ＧＣ−ＭＳによって分析するときＰＶＳの特徴であるｍ／ｚ
１２５でピークを生じた。

【０１１５】水酸化ナトリウム水溶液及び水酸化ナトリウムメタノール溶液によるチオ−ス
ルホンの処理ＰＶＳで標識したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件下で安定である。電気
的に維持したｐＨ勾配上でタンパク質を分離する等電点電気泳動法によってタン
パク質を分析できることが望ましい。タンパク質はその実効電荷に従って分離さ
れ、タンパク質の実効電荷がなくなるｐＨに集まってくる。特定のタンパク質は
強い塩基性であり、極めて高いｐＨに集まり、数時間にわたって塩基性条件に曝
される可能性がある。ＰＶＳチオール誘導体が塩基性条件で安定かどうかを評価
するために、１ＭのＮａＯＨ水溶液及び１ＭのＮａＯＨメタノール溶液の存在下
で様々なＰＶＳチオール標識化合物を長時間インキュベートした。

【０１１６】アセトニトリル中のＳ−（フェニル−エチルスルフォニル）オクチルチオール
を１ＭのＮａＯＨ水溶液で２４時間処理し、その後出発物質を完全に回収した。
アセトニトリル中のＳ−（フェニル−エチルスルフォニル）システインメチルエ
ステルは１ＭのＮａＯＨ水溶液で２４時間処理した場合、２時間後、薄層クロマ
トグラフィ（ＴＬＣ）板からのＵＶ刺激の放射によって、スルホンの軽い切断が
観察された。しかし２４時間後、たった９．５％のスルホンしか切断されていな
かった。出発物質の残基は、¹Ｈ−ＮＭＲによって示されるように回収された。
無水酢酸によるＳ−（フェニル−エチルスルフォニル）システインメチルエステ
ルのアセチル化によってＳ−（フェニル−エチルスルフォニル）アセチルシステ
インメチルエステルが合成された。アセトニトリル中のこの化合物も１Ｍ水溶液
によって２４時間処理した。ＴＬＣによってきわめて軽い切断が認められた。し
かし２４時間後、切断されたスルホンの比率は７％にすぎなかった。残基の出発
物質は回収され、¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトルは記録された。ＮａＯＨメタノール
溶液中のこれらの化合物の分析からも同様の結果が得られた。標識されたチオー
ルに極めて近傍の遊離アミン基はＰＶＳ−チオール誘導体の切断を増すと思われ
る。チオール残基の大半は、タンパク質のＮ末端にないので、タンパク質の標識
試薬としてスルホンを使用する場合、この影響は問題とはならないはずである。
さらに、典型的な等電点電気泳動分画では、１ＭのＮａＯＨはｐＨ１４であるの
に対してほとんどの塩基性ｐＨは約１２である。

【図面の簡単な説明】

本発明はここで、付随する図面に関連して、例示のみの方法によってさらに詳
述に記述する。

【図１】本発明での使用のための一般的なリンカーを示す。

【図２】本発明で使用したモデルリンカー、ＦＴ２７を示す。

【図３】本発明で使用したモデルリンカー、ＦＴ２８を示す。

【図４】ＦＴ２７及びＦＴ２８の合成の略図を示す。

【図５】ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの５’水酸基の接着のためのリンカーで
ある、ＣＭＭ２６７Ｂの合成の略図を示す。

【図６】ＦＴ４８及びＦＴ４９の合成の略図を示す。

【図７】ＦＴ５９を形成するためのヌクレオ塩基へのリンカー（ＦＴ４９）の接着につ
いての略図を示す

【図８】ＦＴ２８の陰イオン質量スペクトルを示す。

【図９】それによってＦ２８が開裂する、可能性のある機構を示す。

【図１０】電子噴霧イオン源内で開裂可能な連続する質量標識の合成の概略図を示す。

【図１１】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦＴ１３４の電子噴霧質量スペクトルを示す。

【図１２】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦＴ１３５の電子噴霧質量スペクトルを示す。

【図１３】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦＴ１３６の電子噴霧質量スペクトルを示す。

【図１４】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦ１３７の電子噴霧質量スペクトルを示す。

【図１５】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦ１４２の電子噴霧質量スペクトルを示す。

【図１６】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦ１４３の電子噴霧質量スペクトルを示す。

【図１７】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦ１４６の電子噴霧質量スペクトルを示す。

【図１８】電子噴霧イオン源中で開裂可能なリンカーに接着するエーテル質量マーカーで
あるＦ１４７の電子噴霧質量スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジョンストン、ロバート、アレクサンダーウォーカーイギリス国エル63 ９エルディーベビントンポールトンロード 39 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 DA30 DA35 DA36 DA60 FA11 FA40 FB07 FB11 4B063 QA01 QA05 QQ42 QQ52 QQ62 QQ67 QQ70 QQ79 QQ80 QR41 QR55 QR63 QS36 4C057 BB02 BB05 DD01 LL41 MM04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分析物の特性評価方法であって、下記（ａ），（ｂ）及び（
ｃ）工程を有することを特徴とする分析物の特性評価方法。（ａ）分析物が、開裂可能なリンカーによって、分析物に結合可能なリポー
ター基に接着されている化合物を提供する工程。ただし、前記化合物は、下記式で表される。【化１】前記式において、Ｒがリポーター基を含み、Ｒ’が分析物を含む、又はＲが分
析物を含み、Ｒ’がリポーター基を含む、のいずれかである。また、前記式にお
いて、ｎは１又は２を表す。（ｂ）前記分析物から、前記リポーター基が開裂する工程。（ｃ）前記リポーター基を同定することにより、前記分析物の特性評価を行
う工程。
【請求項２】Ｒ及び／又はＲ’が共有結合を有し、前記分析物及び／又は
リポーター基が、開裂可能なリンカーに該共有結合によって接着している請求項
１に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項３】前記共有結合が、−ＣＯ−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−
基、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ基、−ＣＨ₂−ＮＨ−基、−ＳＯ₂−ＮＨ−基、−ＮＨ−
ＣＨ₂−ＣＨ₂−基、又はＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ）Ｏ−基から、独立して選択される請
求項２に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項４】Ｒが、ＳＯ_n基と、リポーター基又は分析物との間に、置換
もしくは無置換芳香環基、脂肪環基、又はヘテロ環基を含む、請求項１から３の
いずれかに記載の分析物の特性評価方法。
【請求項５】Ｒが、ＳＯ_n基とリポーター基又は分析物との間に、フェニ
ル、ピリジル、ピラニル、ナフチル、アントラシル、ピレニルから選択された置
換もしくは無置換基、前記縮合環誘導体、又はヘテロ芳香族類似体を含む、請求
項４に記載の特性評価方法。
【請求項６】前記フェニル基が、下記式で表される請求項５に記載の分析
物の特性評価方法。【化２】前記式においてＲ²−Ｒ⁶のうち１つがリポーター基又は分析物を含み、残りのＲ ² −Ｒ⁶基は独立して水素、及びＤ、Ｆ、メチル、メトキシ、ヒドロキシ又はアミ
ノ基のような置換基から選択される。
【請求項７】Ｒ’基が、ＳＯｎ基に対してβ位にあるＣ原子と、リポータ
ー基及び／又は分析物との間に、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＮＲ¹−、及び−Ｏ−か
ら選択される基を含む請求項１から６のいずれかに記載の分析物の特性評価方法
。
【請求項８】Ｒ¹基が、電子吸引基である、請求項７に記載の分析物の特
性評価方法。
【請求項９】Ｒ¹が、水素原子、ハロゲン原子、あるいはカルボニル基及
び／又はハロゲン原子を含んでいる置換基である、請求項８に記載の分析物の特
性評価方法。
【請求項１０】Ｒ¹が、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、
トリフルオロアセチル基又はトリフルオロメチル酢酸基である、請求項９に記載
の分析物の特性評価方法。
【請求項１１】前記化合物が下記式で表される請求項１に記載の分析物の
特性評価方法。【化３】前記式において、Ｒ¹は、電子吸引置換基を表す。Ｘがリポーター基を含み、Ｘ
’が分析物を含む、又はＸが分析物を含み、Ｘ’がリポーター基を含む、のいず
れかである。それぞれのハンドルは、同一又は異なるものであり、Ｘ基を、それ
ぞれフェニル環及びＮ原子に直接接着している一重結合、あるいはＸ基を、それ
ぞれフェニル環及びＮ原子へ接着することが可能な反応基である。
【請求項１２】Ｒ¹が水素原子、ハロゲン原子、あるいはカルボニル基及
び／又はハロゲン原子を含んでいる置換基である、請求項１２に記載の分析物の
特性評価方法。
【請求項１３】それぞれのハンドルが、−ＣＯ−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＯ
−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ基、−ＣＨ₂−ＮＨ−基、−ＳＯ₂−ＮＨ−基、
−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−基、又はＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ）Ｏ−基から、独立して選択
される、請求項１２又は請求項１３に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項１４】前記分析物が生物学的分子を含む、請求項１から１４のい
ずれかに記載の分析物の特性評価方法。
【請求項１５】前記生物学的分子が、タンパク質、ポリペプチド、アミノ
酸、核酸、核酸塩基、薬理学的製剤又は薬剤、炭水化物、脂質、天然産物及びコ
ード化された化学的ライブラリーからの合成化合物から選択される、請求項１４
に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項１６】前記生物学的分子であるヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ド、又は核酸が、天然であるか、あるいは塩基、糖、及び／又は、ヌクレオチド
、オリゴヌクレオチドもしくは核酸の骨格を修飾することにより合成された請求
項１５に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項１７】前記分析物がシステイン基を含んでいるアミノ酸又はペプ
チドであり、前記化合物が下記式で表される請求項１５又は１６に記載の分析物
の特性評価方法。【化４】前記式において、ｍは、０又は１を表す。Ｒ⁷をリンカーに接着しているＳ原子
は、システイン基の硫黄原子であり、Ｒ⁷は、アミノ酸又はポリペプチドの残基
である。
【請求項１８】前記分析物がアミノ酸又はペプチドであり、前記化合物が
下記式で表される請求項１５又は１６に記載の分析物の特性評価方法。【化５】前記式において、Ｎ原子はリジン基のイプシロンアミノ基の窒素原子であるか、
Ｎ−末端アルファアミノ基の窒素原子である。Ｒ⁸はＨ、Ｏ又はＮ−保護基から
選択される。Ｒ⁹はアミノ酸又はポリペプチドの残基である。
【請求項１９】前記分析物が、セリン、スレオニン及び／又はチロシン基
を含んでいるアミノ酸又はペプチドであり、前記化合物が下記式で表される請求
項１５又は１６に記載の分析物の特性評価方法。【化６】前記式において、Ｏ原子はセリン、スレオニン又はチロシン基の水酸基の酸素原
子である。Ｒ¹⁰は、アミノ酸又はポリペプチドの残基である。
【請求項２０】前記リポーター基が、質量分光計によって検出可能な質量
マーカーを含む、請求項１から１９のいずれかに記載の分析物の特性評価方法。
【請求項２１】前記質量マーカーが、オリゴエーテル又はポリエーテルを
含む、請求項２０に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項２２】オリゴエーテル又はポリエーテルが、置換もしくは無置換
オリゴ−、又はポリ−アリールエーテルである、請求項２１に記載の分析物の特
性評価方法。
【請求項２３】前記オリゴエーテル又はポリエーテルが１以上のフッ素原
子もしくはメチル基置換基、又は１以上の²Ｈもしくは¹³Ｃ同位体置換基を含む
、請求項２１又は請求項２２に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項２４】前記質量マーカーが金属イオン−結合部位を含む、請求項
２０から２３のいずれかに記載の分析物の特性評価方法。
【請求項２５】前記金属イオン−結合部位が、ポルフィリン、クラウンエ
ーテル、ヘキサヒスチジン又は多座配位リガンドである、請求項２４に記載の分
析物の特性評価方法。
【請求項２６】前記金属イオン−結合部位が、二座配位リガンド又はＥＤ
ＴＡである、請求項２５に記載の分析物の特性評価方法。
【請求項２７】前記金属イオン−結合部位が、一価、二価又は三価金属イ
オンへ結合する、請求項２４から２６のいずれかに記載の分析物の特性評価方法
。
【請求項２８】前記金属イオンが、遷移金属イオン、又は周期表のＩＡ、
ＩＩＡもしくはＩＩＩＡ属の金属イオンである、請求項２７に記載の分析物の特
性評価方法。
【請求項２９】前記金属イオンが、Ｎｉ²⁺、Ｌｉ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ²⁺
、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｂａ²⁺又はＡｌ³⁺である、請求項２８に記載の分析物の特性
評価方法。
【請求項３０】前記リポーター基を開裂させるために、リンカーを加熱す
る工程をさらに含む、請求項１から２９のいずれかに記載の分析物の特性評価方
法。
【請求項３１】リポーター基が、質量マーカーであり、質量分光計内で質
量マーカーを開裂させる工程をさらに含む、請求項１から３０のいずれかに記載
の分析物の特性評価方法。
【請求項３２】分析物の特性評価において、リポーター基を分析物に接着
するために使用されるリンカー基であって、前記リンカー基が開裂可能であり、
下記式で表されることを特徴とするリンカー基。【化７】前記式において、ｎは１又は２を表す。
【請求項３３】前記分析物が、請求項１４から１９のいずれかにおいて定
義された分析物である請求項３２に記載のリンカー基。
【請求項３４】前記リポーター基が、請求項２０から２９のいずれかにお
いて定義されたリポーター基である、請求項３２又は請求項３３に記載のリンカ
ー基。
【請求項３５】分析物の特性評価において使用される化合物であって、下
記式で表されることを特徴とする化合物。【化８】前記式においてＲ¹は、電子吸引基である。Ｘがリポーター基を含み、Ｘ’が分
析物を含む、又は、Ｘが分析物を含み、Ｘ’がリポーター基を含む、のいずれか
である。それぞれのハンドルは、同一又は異なるものであり、Ｘ基をそれぞれフ
ェニル環及びＮ原子に直接接着している一重結合、あるいはＸ基をそれぞれフェ
ニル環及びＮ原子へ接着することが可能な反応基である。
【請求項３６】Ｒ¹が水素原子、ハロゲン原子、あるいはカルボニル基及
び／又はハロゲン原子を含んでいる置換基である、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】それぞれのハンドルが、−ＣＯ−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＯ
−ＮＨ−基、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ基、−ＣＨ₂−ＮＨ−基、−ＳＯ₂−ＮＨ−基、
−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−基、又はＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ）Ｏ−基から独立して選択さ
れる、請求項３５又は請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】前記分析物が、請求項１４から１９のいずれかにおいて定
義された分析物である、請求項３５から３７のいずれかに記載の化合物。
【請求項３９】前記リポーター基が、請求項２０から２９のいずれかにお
いて定義されたリポータ基である、請求項３５から３８のいずれかに記載の化合
物。