WO2022154116A1 - 化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体 - Google Patents

化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体 Download PDF

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紀子 畑田
慧 山田
豊 松田
友博 藤井
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Definitions

  • the present invention relates to a compound or a salt thereof, an antibody obtained by the compound, and the like.
  • ADC antibody-drug conjugates
  • ADC is a drug in which a drug (eg, an anticancer drug) is conjugated to an antibody, and has a direct cell-killing activity against cancer cells and the like.
  • a typical ADC is T-DM1 (trade name: Kadcyla (registered trademark)) jointly developed by Immunogene and Roche.
  • ADCs such as T-DM1
  • DAR Drug Antibody Ratio
  • a C-CAP (Chemical Conjugation by Affinity Peptide) method that enables regioselective modification of an antibody by a chemically synthesized method (Patent Document 1).
  • This method has succeeded in position-selective modification of an antibody by reacting an affinity peptide with a peptide reagent in which an NHS-activated ester and a drug are linked to the antibody.
  • the ADC produced by this method the antibody and the drug are bound via a linker containing a peptide moiety.
  • the peptide moiety has potential immunogenicity and is susceptible to hydrolysis in the blood. Therefore, the ADC produced by this method has room for improvement in that it contains a peptide moiety in the linker.
  • an antibody having a functional substance (eg, a drug) that does not contain a peptide portion as a linker and has a functional substance (eg, a drug) in a position-selective manner is obtained by a chemical synthesis method using a predetermined compound containing an affinity peptide.
  • Techniques that can be prepared have been reported (Patent Documents 2 to 6). Avoiding the use of linkers containing peptide moieties is desirable in clinical applications.
  • An object of the present invention is to regioselectively modify an antibody with a functional substance and control the binding ratio between the antibody and the functional substance within a desired range.
  • the present inventors have selected the lysine residue at position 288/290 of the heavy chain in the immunoglobulin unit as the modification position of the antibody, and made it possible to modify the lysine residue in a position-specific manner.
  • the antibody can be position-selectively modified with a functional substance, and the average ratio of binding between the immunoglobulin unit and the functional substance (number of functional substances / immunoglobulin unit) is desired. It was found that it becomes easy to control highly to the range (1.5 to 2.5) of.
  • the total number of atoms constituting the main chain and the number of atoms constituting the main chain in the second linker are 5 to 7).
  • the present inventors have succeeded in developing a compound represented by the formula (I) or a salt thereof, and a reagent for antibody derivatization containing them.
  • the present inventors also use a compound represented by the formula (I) or a salt thereof to selectively modify a specific antibody, that is, the lysine residue at position 288/290 in the antibody with a modifying group.
  • an antibody antibody intermediate, thiol group introduction
  • an antibody in which the average ratio of binding between immunoglobulin units and modifying groups (number of modifying groups / immunoglobulin units) is highly controlled within a desired range (1.5 to 2.5).
  • [1] A compound represented by the formula (I) or a salt thereof.
  • [2] The compound of [1] or a salt thereof, wherein the leaving group is selected from the following: (A) RS (where R represents a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent. , S represents a sulfur atom.); (B) RO (where R represents a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent.
  • O represents an oxygen atom.
  • RA- ( RB- ) N (where RA and RB each have a hydrogen atom and a substituent independently of each other.) It represents a monovalent hydrocarbon group, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent, where N represents a nitrogen atom.); Or (d) a halogen atom.
  • the compound of [1] or [2] or a salt thereof, wherein the immunoglobulin unit is a human immunoglobulin unit.
  • affinity peptide is as follows: (A) Affinity peptide containing the amino acid sequence of CQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC (SEQ ID NO: 1); An affinity peptide comprising an amino acid sequence containing a variation of selected 1-5 amino acid residues, where the lysine residue at position 27 and the two cysteine residues at positions 1 and 30 are maintained.
  • the affinity peptide of (B) is selected from the group consisting of the following, the compound of [6] or a salt thereof: (A) Affinity peptide containing the amino acid sequence of FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC (SEQ ID NO: 2); (B) Affinity peptide containing the amino acid sequence of FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEDC (SEQ ID NO: 3); (C) Affinity peptide containing the amino acid sequence of FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC (SEQ ID NO: 4); (D) Affinity peptide containing the amino acid sequence of NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC (SEQ ID NO: 5); (E) Affinity peptide comprising the amino acid sequence of MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC (SEQ ID NO: 6);
  • the N-terminal and C-terminal amino acid residues in the affinity peptide may be protected, and the two thiol groups in the side chains of the two cysteine residues (C) in the affinity peptide are disulfide bonds.
  • the compound represented by the formula (I) is the compound represented by the formula (I') or a salt thereof according to any one of [1] to [8].
  • the compound represented by the formula (I') is the compound represented by the formula (I'') or a salt thereof.
  • a reagent for antibody derivatization which comprises a compound represented by the formula (I) or a salt thereof.
  • the reagent of [12], wherein the compound represented by the formula (I') is represented by the formula (I'').
  • the antibody intermediate of [14] or a salt thereof, wherein the antibody intermediate is a human antibody intermediate.
  • the antibody intermediate of [14] or [15] or a salt thereof, wherein the antibody intermediate is a human IgG intermediate.
  • [25] The conjugate of [24] or a salt thereof, wherein a specific amino acid residue other than the lysine residue present at the 288/290 position in the two heavy chains is further modified.
  • [26] The conjugate of [25] or a salt thereof, wherein the specific amino acid residue is a lysine residue present at position 246/248 in two heavy chains.
  • [27] The conjugate of any one of [24] to [26] or a salt thereof, wherein the structural unit represented by the formula (IV) is represented by the formula (IV').
  • [28] The conjugate of [27] or a salt thereof, wherein the structural unit represented by the formula (IV') is represented by the formula (IV ′′).
  • a compound represented by the formula (V) or a salt thereof is the compound represented by the formula (V') or a salt thereof.
  • the compound represented by the formula (V') is the compound represented by the formula (V'') or a salt thereof.
  • the compound of [31] or a salt thereof, wherein the compound represented by the formula (V'') is represented by the formula (V''-1) or (V''-2).
  • the leaving group having a higher ability to eliminate than the leaving group X is a pentafluorophenyloxy group, a tetrafluorophenyloxy group, a paranitrophenyloxy group, or an N-succinimidyloxy group.
  • the compound represented by the formula (VI) is the compound of the formula [33] or [34] or a salt thereof, which is represented by the formula (VI').
  • the compound represented by the formula (VI') is the compound represented by the formula (VI'') or a salt thereof.
  • a method for producing a thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof comprising reacting a compound represented by the formula (I) or a salt thereof with an antibody containing an immunoglobulin unit.
  • the antibody intermediate or a salt thereof is subjected to a cleavage reaction of a thioester to produce a thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof containing a structural unit represented by the formula (III); and (3) thiol.
  • a group-introduced antibody derivative or a salt thereof is reacted with a functional substance to form a conjugate of the antibody and the functional substance or a salt thereof, which comprises a structural unit represented by the formula (IV).
  • a method for producing a conjugate of a functional substance or a salt thereof is reacted with a functional substance to form a conjugate of the antibody and the functional substance or a salt thereof, which comprises a structural unit represented by the formula (IV).
  • the compound represented by the formula (VI) or a salt thereof is reacted with an affinity peptide having a binding region to the CH2 domain in the immunoglobulin unit containing two heavy chains and two light chains to react with the formula (').
  • a method for producing the represented compound or a salt thereof is reacted with an affinity peptide having a binding region to the CH2 domain in the immunoglobulin unit containing two heavy chains and two light chains.
  • a thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof containing a structural unit represented by the formula (II) is subjected to a cleavage reaction of a thioester to contain the structural unit represented by the formula (III).
  • a method for producing a thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof which comprises producing the salt thereof.
  • a method for producing a conjugate of an antibody and a functional substance or a salt thereof which comprises producing a conjugate of the sex substance or a salt thereof.
  • the average ratio of the bonds between the immunoglobulin unit and the affinity peptide-containing group is in a desired range (1.5 to 2).
  • the lysine residue at position 288/290 of the heavy chain in the immunoglobulin unit can be specifically and highly modified so as to be .5). Therefore, the compound represented by the formula (I) or a salt thereof is useful as a reagent for antibody derivatization.
  • the lysine residue at position 288/290 of the heavy chain in the immunoglobulin unit is specifically modified with an affinity peptide-containing group
  • the antibody intermediate represented by the formula (II) or an antibody intermediate thereof in which the average ratio of the bonds between the immunoglobulin unit and the affinity peptide-containing group (affinity peptide-containing group number / immunoglobulin unit) is highly controlled within a desired range. Salt can be provided.
  • an antibody prepared by using the antibody intermediate represented by the formula (II) or a salt thereof as a raw material can inherit the regioselectivity and the average ratio of binding of the antibody intermediate or the salt thereof.
  • a thiol group-introduced antibody derivative represented by the formula (III) or a salt thereof which has the above regioselectivity and an average ratio of binding, and a conjugation of the antibody and the functional substance represented by the formula (IV).
  • a gate or salt thereof can be provided.
  • compounds represented by formulas (V) and (VI) or salts thereof which are synthetic intermediates that enable efficient production of compounds represented by formula (I) or salts thereof.
  • FIG. 1 is a schematic diagram (No. 1) showing the concept of modification of immunoglobulin units with the compound of the present invention represented by the formula (I) or a salt thereof.
  • the compound of the present invention represented by the formula (I) or a salt thereof associates with the CH2 domain in the immunoglobulin unit via the affinity peptide (Y).
  • the compound of the present invention represented by the formula (I) or a salt thereof is a side chain of a specific amino acid residue in the CH2 domain via an activated carbonyl group having a elimination group (X) (Fig.). In it, it reacts with an amino group in the side chain of a lysine residue to produce an antibody intermediate or a salt thereof.
  • FIG. 2 is a schematic diagram (No.
  • FIG. 3 is a schematic diagram (No. 3) showing the concept of modification of immunoglobulin units with the compound of the present invention represented by the formula (I) or a salt thereof.
  • the reaction of a thiol group with a functional substance (Z) in a thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof produces a conjugate of the antibody and the functional substance or a salt thereof.
  • FIG. 4 is a diagram showing an outline of an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing an outline of a more preferable embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (number of introduced binding peptides) of trastuzumab (anti-HER2 IgG antibody) (Example 1).
  • FIG. 8 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 1).
  • FIG. 9 is a diagram showing (1) the amino acid sequence of the heavy chain of trastuzumab (SEQ ID NO: 8) and (2) the amino acid sequence of the light chain of trastuzumab (SEQ ID NO: 9).
  • FNWYVDGVEVHNAKTTKPR SEQ ID NO: 10
  • a peptide consisting of 18 amino acid residues containing a site of modification of trussumab to a lysine residue by trypsin digestion (a thiol-introduced product (+145.09 Da) subjected to carbamidometry with iodoacetamide).
  • MS spectrum measured value: m / z 577.03606, theoretical value: 577.03557, tetravalent
  • FIG. 11 shows the modification of the lysine residue at position 288/290 of the human IgG heavy chain in EU numbering, which is a product ion of m / z 682.13 (theoretical value: 682.01) corresponding to trivalent y16. It is a figure which shows the CID spectrum (Example 1-9-4).
  • FIG. 12 shows the results of searching for a peptide fragment containing a lysine residue-modified thiol-introduced product (+145.09Da) modified to a lysine residue (Carbamidemethylized with iodoacetamide) in a trypsin digested product of trastuzumab using BioPharma Finder.
  • FIG. 13 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 2).
  • FIG. 14 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 2).
  • FNWYVDGVEVHNAKTTKPR SEQ ID NO: 10
  • a peptide consisting of 18 amino acid residues containing a site of modification of trussumab to a lysine residue by trypsin digestion a thiol-introduced product (+145.09 Da) subjected to carbamidometry with iodoacetamide.
  • MS spectrum measured value: m / z 577.03571, theoretical value: 577.03557, tetravalent
  • FIG. 16 shows the modification of the lysine residue at position 288/290 of the human IgG heavy chain in EU numbering, which is a product ion of m / z 682.41 (theoretical value: 682.01) corresponding to trivalent y16. It is a figure which shows the CID spectrum (Example 2-7-4).
  • FIG. 17 shows the results of searching for a peptide fragment containing a lysine residue-modified thiol-introduced product (+145.09Da) modified to a lysine residue by using a BioPharma Finder for a trypsin digest of trastuzumab. It is a figure (Example 2-7-4).
  • FIG. 18 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 3).
  • FIG. 19 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 3).
  • FIG. 20 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 4).
  • FIG. 21 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 4).
  • FIG. 18 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 3).
  • FIG. 19 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example
  • FIG. 22 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 5).
  • FIG. 23 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 5).
  • FIG. 24 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 6).
  • FIG. 25 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 6).
  • FIG. 23 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 5).
  • FIG. 24 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides)
  • FIG. 26 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 7).
  • FIG. 27 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 7).
  • FIG. 28 shows FNWYVDGVEVHNAKTTKPR (SEQ ID NO: 10), a peptide consisting of 18 amino acid residues containing a site of modification of trussumab to a lysine residue by trypsin digestion (a thiol-introduced product (+145.09 Da) subjected to carbamidometry with iodoacetamide).
  • FIG. 29 shows the modification of the lysine residue at position 288/290 of the human IgG heavy chain in EU numbering, showing the modification of the product ion of m / z 1022.21 (theoretical value: 1022.51) corresponding to divalent y16. It is a figure which shows the CID spectrum (Example 7-6-4).
  • FIG. 30 shows the results of searching for a peptide fragment containing a modification to a lysine residue (a thiol-introduced product (+145.09Da) subjected to Carbamidemethylization with iodoacetamide) in a trypsin digested product of trastuzumab using BioPharma Finder. It is a figure (Example 7-6-4). The horizontal axis shows the identified lysine residue, and the vertical axis shows the Integrity.
  • FIG. 31 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 8).
  • FIG. 32 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 8).
  • FIG. 33 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification of trastuzumab (number of introduced binding peptides) (Example 9).
  • FIG. 34 is a diagram showing ESI-TOFMS analysis of specific modification (heavy chain selectivity) of trastuzumab (Example 9).
  • the term "antibody” is as follows.
  • the term "immunoglobulin unit” corresponds to a divalent monomeric unit which is a basic component of such an antibody, and is a unit containing two heavy chains and two light chains. .. Therefore, for immunoglobulin units, definitions, examples, and preferred examples of their origin, type (polyclonal or monoclonal, isotype, and full-length antibody or antibody fragment), antigen, lysine residue position, and regioselectivity are given below. Similar to that of the antibody described.
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and may be derived from an animal such as a mammal, a bird (eg, a chicken), for example.
  • the immunoglobulin unit is derived from a mammal.
  • mammals include, for example, primates (eg, humans, monkeys, chimpanzees), rodents (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits), pet animals (eg, dogs, cats), domestic animals. (Eg, cows, pigs, goats), servants (eg, horses, sheep), preferably primates or rodents, more preferably humans.
  • the type of antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody may also be a divalent antibody (eg, IgG, IgD, IgE) or a tetravalent or higher valent antibody (eg, IgA antibody, IgM antibody).
  • the antibody is a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody is modified so as to have, for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, or an antibody to which a predetermined sugar chain is added (eg, a sugar chain binding consensus sequence such as an N-type sugar chain binding consensus sequence).
  • Antibodies bispecific antibodies, Fc region proteins, Fc fusion proteins.
  • Isotypes of monoclonal antibodies include, for example, IgG (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, and IgY.
  • a full-length antibody or an antibody fragment containing a variable region and CH1 domain and CH2 domain can be used as the monoclonal antibody, but a full-length antibody is preferable.
  • the antibody is preferably a human IgG monoclonal antibody, more preferably a human IgG full-length monoclonal antibody.
  • any antigen can be used as the antigen of the antibody.
  • antigens include proteins [oligopeptides, polypeptides. It may be a protein modified with a biomolecule such as sugar (eg, glycoprotein)], sugar chains, nucleic acids, small molecule compounds.
  • the antibody may be an antibody that uses a protein as an antigen.
  • proteins include cell membrane receptors, cell membrane proteins other than cell membrane receptors (eg, extracellular substrate proteins), ligands, and soluble receptors.
  • the protein that is the antigen of the antibody may be a disease target protein.
  • diseases target proteins include the following.
  • Amyloid AL Hereditary / rare diseases Amyloid AL, SEMA4D (CD100), insulin receptor, ANGPTL3, IL4, IL13, FGF23, corticostimulatory hormone, transthyretin, huntingtin
  • monoclonal antibodies include specific chimeric antibodies (eg, rituximab, baciliximab, infliximab, cetuximab, siltuximab, dinutuximab, altertoximab), specific humanized antibodies (eg, dacrizumab, paribizumab, trastuzumab, allenzumab, allenzumab).
  • specific chimeric antibodies eg, rituximab, baciliximab, infliximab, cetuximab, siltuximab, dinutuximab, altertoximab
  • specific humanized antibodies eg, dacrizumab, paribizumab, trastuzumab, allenzumab, allenzumab.
  • Efarizumab Efarizumab, Bebashizumab, Natarizumab (IgG4), Toshirizumab, Ekurizumab (IgG2), Mogamurizumab, Pertsuzumab, Obinutsuzumab, Bedorizumab, Penproridumab (IgG4), Mepolizumab, Erotsumub Human antibodies (eg, adalimumab (IgG1), panitumumab, golimumab, ustequinumab, canaquinumab, ofatumumab, denosumab (IgG2), ipilimumab, berimumab, rapiximab, lambsilmab, nibolumab, dupilumab (IgG4) Necitumumab, Brodalumab (IgG2), Oralatumab) can be mentioned (if the IgG subtype is
  • the lysine residue at position 288 corresponds to the 58th residue in the human IgG CH2 region
  • the lysine residue at position 290 corresponds to the residue at position 60 in the human IgG CH2 region.
  • the notation at position 288/290 indicates that the lysine residue at position 288 or 290 is the subject.
  • the lysine residue at position 288/290 in the antibody can be regioselectively modified.
  • regioselective or “regioselectivity” refers to binding to a specific amino acid residue in an antibody even though the specific amino acid residue is not unevenly distributed in a specific region in the antibody. It means that a predetermined structural unit that can be formed is unevenly distributed in a specific region in an antibody. Therefore, expressions related to regioselectivity, such as “regioselectively possessed”, “regioselectively bound”, and “regioselectively bound”, are target regions containing one or more specific amino acid residues.
  • the retention or binding rate of a given structural unit in the target region is significantly higher than the retention or binding rate of the structural unit in a non-target region containing a plurality of amino acid residues that are the same species as the specific amino acid residue in the target region. It means that it is high at a high level.
  • Such regioselectivity is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, 95% or more, 96% or more, It may be 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 100%.
  • the lysine residue at position 288/290 can be regioselectively modified without utilizing a linker containing a peptide.
  • the peptide moiety has potential immunogenicity and is susceptible to hydrolysis in the blood. Therefore, avoiding the use of linkers containing peptide moieties is desirable in clinical applications.
  • a specific amino acid residue at another position may be further regioselectively modified.
  • methods for regioselectively modifying a particular amino acid residue at a given position in an antibody are described in WO/2018/199337, WO 2019/240288, WO 2019/240287, and International. It is described in Publication No. 2020/090979.
  • Such specific amino acid residues include amino acid residues (eg, lysine residue, aspartic acid residue) having side chains that are easily modified (eg, amino group, carboxy group, amide group, hydroxy group, thiol group).
  • Glutamic acid residue asparagine residue, glutamine residue, threonine residue, serine residue, tyrosine residue, cysteine residue
  • a lysine residue having a side chain containing an amino group hydroxy A tyrosine residue having a side chain containing a group, a serine residue, and a threonine residue, or a cysteine residue having a side chain containing a thiol group, more preferably a lysine residue, and even more preferably.
  • It is a lysine residue at position 246/248 or a lysine residue at position 317, and is particularly preferably a lysine residue at position 246/248.
  • the notation at position 246/248 indicates that the lysine residue at position 246 or 248 is the subject.
  • salt includes, for example, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, and a salt with an amino acid.
  • the salt with the inorganic acid include salts with hydrogen chloride, hydrogen bromide, phosphoric acid, sulfuric acid, and nitric acid.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, oxalic acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, benzenesulfonic acid, and p-toluenesulfonic acid. Salt is mentioned.
  • Salts with inorganic bases include, for example, alkali metals (eg, sodium, potassium), alkaline earth metals (eg, calcium, magnesium), and other metals such as zinc, aluminum, and salts with ammonium. ..
  • Examples of the salt with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, propylenediamine, ethylenediamine, pyridine, ethanolamine, monoalkylethanolamine, dialkylethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine.
  • salts with amino acids include salts with basic amino acids (eg, arginine, histidine, lysine, ornithine) and acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid).
  • the salt is preferably a salt with an inorganic acid (eg, hydrogen chloride) or a salt with an organic acid (eg, trifluoroacetic acid).
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof.
  • X indicates a leaving group
  • Y represents an affinity peptide having a binding region to the CH2 domain in an immunoglobulin unit containing two heavy chains and two light chains.
  • O indicates an oxygen atom
  • S represents a sulfur atom
  • W represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • La indicates the first linker
  • Lb indicates a second linker
  • the total number of atoms constituting the main chain in the first linker and the number of atoms constituting the main chain in the second linker are 5 to 7.
  • the leaving group represented by X is a group that can be eliminated by a reaction between a carbon atom of a carbonyl group adjacent to X and an amino group.
  • Those skilled in the art can appropriately set such a leaving group.
  • Examples of such leaving groups include: (A) RS (where R represents a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent. , S represents a sulfur atom.); (B) RO (where R represents a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent.
  • O represents an oxygen atom.
  • C RA- ( RB- ) N
  • RA and RB are independent hydrogen atoms, monovalent hydrocarbon groups which may have substituents, or substituents, respectively. Indicates a monovalent heterocyclic group which may have, where N represents a nitrogen atom.
  • the leaving group represented by X may be: (A) RS (where R represents a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent. , S represents a sulfur atom.); (B) RO (where R represents a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent. , O represent an oxygen atom.); Or (c) RA- ( RB- ) N (where RA and RB each independently have a hydrogen atom and a substituent. It may be a monovalent hydrocarbon group, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent.);
  • the leaving group represented by X may be: (A) RS (where R represents a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a monovalent heterocyclic group which may have a substituent. , S represents a sulfur atom.); Or (b) RO (where R has a hydrogen atom, a monovalent hydrocarbon group which may have a substituent, or a substituent. It represents a monovalent heterocyclic group which may be present, and O represents an oxygen atom.)
  • the leaving group represented by X may be: (A) RS (where R is a monovalent aromatic hydrocarbon group which may have a substituent or a monovalent aromatic heterocyclic group which may have a substituent. Shown, S represents a sulfur atom.).
  • the leaving group represented by X may be: (A') RS (where R represents a monovalent aromatic hydrocarbon group (eg, phenyl) which may have a substituent and S represents a sulfur atom).
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • Examples of the monovalent hydrocarbon group include a monovalent chain hydrocarbon group, a monovalent alicyclic hydrocarbon group, and a monovalent aromatic hydrocarbon group.
  • the monovalent chain hydrocarbon group means a hydrocarbon group composed of only a chain structure and does not contain a cyclic structure in the main chain. However, the chain structure may be linear or branched. Examples of the monovalent chain hydrocarbon group include alkyl, alkenyl and alkynyl. Alkyl, alkenyl, and alkynyl may be linear or branched.
  • alkyl an alkyl having 1 to 12 carbon atoms is preferable, an alkyl having 1 to 6 carbon atoms is more preferable, and an alkyl having 1 to 4 carbon atoms is further preferable.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent.
  • alkyl having 1 to 12 carbon atoms include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, and decyl. , Dodecyl.
  • an alkenyl having 2 to 12 carbon atoms is preferable, an alkenyl having 2 to 6 carbon atoms is more preferable, and an alkenyl having 2 to 4 carbon atoms is further preferable.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent. Examples of the alkenyl having 2 to 12 carbon atoms include vinyl, propenyl, and n-butenyl.
  • alkynyl having 2 to 12 carbon atoms is preferable, alkynyl having 2 to 6 carbon atoms is more preferable, and alkynyl having 2 to 4 carbon atoms is even more preferable.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent. Examples of alkynyl having 2 to 12 carbon atoms include ethynyl, propynyl, and n-butynyl.
  • alkyl is preferable.
  • the monovalent alicyclic hydrocarbon group means a hydrocarbon group containing only an alicyclic hydrocarbon as a ring structure and not containing an aromatic ring, and the alicyclic hydrocarbon is either monocyclic or polycyclic. It may be. However, it does not have to be composed only of alicyclic hydrocarbons, and a chain structure may be contained in a part thereof.
  • Examples of the monovalent alicyclic hydrocarbon group include cycloalkyl, cycloalkenyl, and cycloalkynyl, which may be monocyclic or polycyclic.
  • cycloalkyl a cycloalkyl having 3 to 12 carbon atoms is preferable, a cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and a cycloalkyl having 5 to 6 carbon atoms is further preferable.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent.
  • Examples of cycloalkyl having 3 to 12 carbon atoms include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.
  • cycloalkenyl a cycloalkenyl having 3 to 12 carbon atoms is preferable, a cycloalkenyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and a cycloalkenyl having 5 to 6 carbon atoms is further preferable.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent.
  • examples of the cycloalkenyl having 3 to 12 carbon atoms include cyclopropenium, cyclobutenyl, cyclopentenyl, and cyclohexenyl.
  • cycloalkynyl having 3 to 12 carbon atoms is preferable, cycloalkynyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and cycloalkynyl having 5 to 6 carbon atoms is even more preferable.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent.
  • Examples of cycloalkynyl having 3 to 12 carbon atoms include cyclopropynyl, cyclobutynyl, cyclopentinyl, and cyclohexynyl.
  • cycloalkyl is preferable.
  • the monovalent aromatic hydrocarbon group means a hydrocarbon group containing an aromatic ring structure. However, it does not have to be composed of only an aromatic ring, and a chain structure or an alicyclic hydrocarbon may be contained in a part thereof, and the aromatic ring may be either a monocyclic ring or a polycyclic ring. good.
  • the monovalent aromatic hydrocarbon group an aryl having 6 to 12 carbon atoms is preferable, an aryl having 6 to 10 carbon atoms is more preferable, and an aryl having 6 carbon atoms is further preferable.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent. Examples of the aryl having 6 to 12 carbon atoms include phenyl and naphthyl.
  • Phenyl is preferable as the monovalent aromatic hydrocarbon group.
  • alkyl, cycloalkyl, and aryl are preferable as the monovalent hydrocarbon group.
  • a monovalent heterocyclic group is a group obtained by removing one hydrogen atom from the heterocycle of a heterocyclic compound.
  • the monovalent heterocyclic group is a monovalent aromatic heterocyclic group or a monovalent non-aromatic heterocyclic group.
  • the hetero atom constituting the heterocyclic group preferably contains at least one selected from the group consisting of an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a phosphorus atom, a boron atom and a silicon atom, and preferably contains an oxygen atom, a sulfur atom and a nitrogen atom. It is more preferable to include one or more selected from the group consisting of atoms.
  • an aromatic heterocyclic group having 1 to 15 carbon atoms is preferable, an aromatic heterocyclic group having 1 to 9 carbon atoms is more preferable, and an aromatic heterocyclic group having 1 to 6 carbon atoms is more preferable.
  • Group heterocyclic groups are more preferred.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent.
  • Examples of the monovalent aromatic heterocyclic group include pyrrolyl, furanyl, thiophenyl, pyridinyl, pyrariainyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, pyrazolyl, imidazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, triazolyl, tetrazolyl, indolyl, prynyl and anthraquinolyl. , Carbazonyl, fluorenyl, quinolinyl, isoquinolinyl, quinazolinyl, and phthalazinyl.
  • a non-aromatic heterocyclic group having 2 to 15 carbon atoms is preferable, a non-aromatic heterocyclic group having 2 to 9 carbon atoms is more preferable, and a non-aromatic heterocyclic group having 2 to 9 carbon atoms is more preferable.
  • the non-aromatic heterocyclic group of 6 is more preferred.
  • the carbon atom number of the substituent does not include the carbon atom number of the substituent.
  • Examples of the monovalent non-aromatic heterocyclic group include oxylanyl, aziridinyl, azetidinyl, oxetanyl, thietanyl, pyrrolidinyl, dihydrofuranyl, tetrahydrofuranyl, dioxolanyl, tetrahydrothiophenyl, pyrolinyl, imidazolidinyl, oxazolidinyl, piperidinyl and dihydropyranyl.
  • Tetrahydropyranyl Tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, piperazinyl, dihydrooxadinyl, tetrahydrooxadinyl, dihydropyrimidinyl, and tetrahydropyrimidinyl.
  • a 5-membered or 6-membered heterocyclic group is preferable.
  • halogen atoms, monovalent hydrocarbon groups, and monovalent heterocyclic groups in the substituents are the monovalent hydrocarbons described in R , RA , and RB, respectively. It is similar to that of a group and a monovalent heterocyclic group.
  • Arylkill means arylalkyl. Definitions, examples and preferred examples of aryl and alkyl in arylalkyl are as described above.
  • aralkyl aralkyl having 3 to 15 carbon atoms is preferable. Examples of such aralkyl include benzoyl, phenethyl, naphthylmethyl, and naphthylethyl.
  • the affinity peptide indicated by Y has a binding region in the CH2 domain in the immunoglobulin unit containing two heavy chains and two light chains.
  • any peptide having a binding region in the CH2 domain in the immunoglobulin unit can be used.
  • Amino acid residues eg, lysine residues, proline residues, etc.
  • are amino acid residues containing a side chain containing a moiety (eg, amino group, hydroxy group) capable of binding to a carbonyl group (C O) adjacent to Y.
  • affinity peptides include International Publication No. 2016/186206, International Publication No. 2018/199337, International Publication No. 2009240288, International Publication No. 2019/240287, and International Publication No. 2020/090979.
  • affinity peptides disclosed in the literature cited in these international publications can be used.
  • the affinity peptide may be: (A) Affinity peptide containing the amino acid sequence of CQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC (SEQ ID NO: 1); Amino acid sequences containing variations of 1 to 5 selected amino acid residues (ie, 1, 2, 3, 4, or 5) (where the lysine residue at position 27, as well as the 1 and 1 and Affinity peptide containing (the two cysteine residues at position 30 are maintained). Since the affinity peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a suitable peptide having a binding region in the CH2 domain in the immunoglobulin unit, it is preferable to use such an affinity peptide in the present invention.
  • the N-terminal and C-terminal amino acid residues of the affinity peptide may be protected. Further, the thiol groups of the side chains of the two cysteine residues (C) in the affinity peptide may be linked by a disulfide bond or via a linker.
  • the affinity peptide of (B) may be selected from the group consisting of: (A) Affinity peptide containing the amino acid sequence of FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC (SEQ ID NO: 2); (B) Affinity peptide containing the amino acid sequence of FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEDC (SEQ ID NO: 3); (C) Affinity peptide containing the amino acid sequence of FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC (SEQ ID NO: 4); (D) Affinity peptide containing the amino acid sequence of NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC (SEQ ID NO: 5); (E) Affinity peptide comprising the amino acid sequence of MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC (SEQ ID NO: 6); and (f) Affinity peptide containing
  • the N-terminal and C-terminal amino acid residues of the affinity peptide may be protected. Further, the thiol groups of the side chains of the two cysteine residues (C) in the affinity peptide may be linked by a disulfide bond or via a linker.
  • At least two separated cysteine residues in each amino acid sequence of the affinity peptide can form a cyclic peptide by a disulfide bond.
  • the thiol groups in the two cysteine residues may be linked by a carbonyl group-containing linker represented by the following.
  • the broken line portion of the carbonyl group-containing linker represented above means the bonding portion with the thiol group.
  • the linker is more stable to reduction reactions and the like than ordinary disulfide bonds.
  • Such peptides can be prepared, for example, by the methods described in WO 2016/186206.
  • the amino acids constituting the affinity peptide may be either L-form or D-form, but L-form is preferable (in the examples, all the amino acid residues constituting the peptide are L-form).
  • the affinity peptide may be linked to the compound of formula (I) or a salt thereof by modifying a specific amino acid residue with a cross-linking agent. Examples of such a specific amino acid residue include a lysine residue, an aspartic acid residue, and a glutamate residue, but a lysine residue is preferable.
  • cross-linking agent for example, a cross-linking agent containing two or more succinimidyl groups such as DSG (disuccinidily glutarate, disuccinimidyl sulrate) and DSS (disuccinidily sublate), DMA (dimethylate).
  • DSG disuccinidily glutarate, disuccinimidyl sulrate
  • DSS disuccinidily sublate
  • DMA dimethylate
  • Imidic acid moieties such as 2HCl, dimethyl dihydrochloride adipimide), DMP (dimethyl pimelimidate 2 HCl, dimethyl dimethylidate pimellimidate), and DMS (dimethyl suberimide 2 HCl, dimethyl dihydrochloride suberimide) are preferred.
  • Cross-linking agent containing 2 or more and DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimide ⁇ 2HCl, 3,3'-dithiobispropionimide acid dimethyl dihydrochloride) and DSP (dithiobis (succinimimidyl tropionate), dithiobiscus cinmidyl).
  • DTBP dimethyl 3,3'-dithiobispropionimide ⁇ 2HCl, 3,3'-dithiobispropionimide acid dimethyl dihydrochloride
  • DSP dithiobis (succinimimidyl tropionate), dithiobiscus cinmidyl).
  • cross-linking agents having SS bonds such as (acid) (eg, International Publication No. 2016/186206).
  • the affinity peptide may have an amino group and a carboxy group at the ends protected.
  • the protective group for the N-terminal amino group include an alkylcarbonyl group (acyl group) (eg, a butoxycarbonyl group such as an acetyl group, a propoxy group, a tert-butoxycarbonyl group) and an alkyloxycarbonyl group (eg, fluore).
  • Nylmethoxycarbonyl group aryloxycarbonyl group, arylalkyl (aralkyl) oxycarbonyl group (eg, benzyloxycarbonyl group).
  • an acetyl group is preferable.
  • the protected N-terminal glutamic acid may have a cyclic structure of pyroglutamic acid. Further, when the N-terminal amino acid is glutamine, the protected N-terminal glutamine may have a pyroglutamic acid type cyclic structure.
  • Protecting groups for the C-terminal carboxy group include, for example, groups capable of forming esters or amides.
  • Groups capable of forming esters or amides include, for example, alkyloxy groups (eg, methyloxy, ethyloxy, propyloxy, butyloxy, pentyloxy, hexyloxy), aryloxy groups (eg, phenyloxy, naphthyloxy), aralkyl. Examples include an oxy group (eg, benzyloxy) and an amino group. As the protecting group for the C-terminal carboxy group, an amino group is preferable.
  • the first and second linkers are divalent groups, as can be seen from the chemical structure of formula (I).
  • the total number of atoms constituting the main chain in the first linker and the number of atoms constituting the main chain in the second linker are 5 to 7.
  • the lysine residue at the 288/290 position of the heavy chain in the immunoglobulin unit can be position-selectively modified with an affinity peptide-containing group, and the antibody. It becomes easy to highly control the average ratio of the binding between the antibody and the affinity peptide-containing group to a desired range (1.5 to 2.5).
  • the average ratio of the binding between the antibody and a predetermined group eg, affinity peptide-containing group
  • the number of atoms constituting the main chain in the first linker is The number of atoms is 1 to 6, and the number of atoms constituting the main chain in the second linker is 1 to 6. More specifically, the relationship between the number of atoms constituting the main chain in the first linker and the second linker is as follows.
  • the main chains in the first linker and the second linker are composed of a chain structure, a cyclic structure, or a structure containing a combination thereof.
  • the number of atoms in the main chain can be determined by counting the number of atoms in the chain structure.
  • the main chain has a structure including a cyclic structure, it can be determined by counting a predetermined number of atoms constituting the cyclic structure as the number of atoms in the main chain.
  • the number of atoms in the main chain in the cyclic structure can be determined by counting the number of atoms in the shortest path connecting the two bonds in the cyclic structure (for example, (a) to (d) below). ) Bold route).
  • the main chain is a structure containing a combination of a chain structure and a cyclic structure
  • the number of atoms in the main chain communicates the number of atoms in the chain structure not including the cyclic structure with the two bonds in the cyclic structure. It can be determined by adding up with the number of atoms in the shortest path. ⁇ Is a bond.
  • the divalent linear hydrocarbon group is a linear alkylene, a linear alkenylene, or a linear alkynylene.
  • the linear alkylene is a linear alkylene having 1 to 6 carbon atoms, and a linear alkylene having 1 to 4 carbon atoms is preferable.
  • Examples of the linear alkylene include methylene, ethylene, n-propylene, n-butylene, n-pentylene and n-hexylene.
  • the linear alkenylene is a linear alkenylene having 2 to 6 carbon atoms, and a linear alkenylene having 2 to 4 carbon atoms is preferable.
  • linear alkenylene examples include ethyleneylene, n-propinylene, n-butenylene, n-pentenylene, and n-hexenylene.
  • the linear alkynylene is a linear alkynylene having 2 to 6 carbon atoms, and a linear alkynylene having 2 to 4 carbon atoms is preferable.
  • Examples of the linear alkynylene include ethynylene, n-propinylene, n-butynylene, n-pentinylene, and n-hexinylene.
  • divalent linear hydrocarbon group a linear alkylene is preferable.
  • the divalent cyclic hydrocarbon group is an arylene or a divalent non-aromatic cyclic hydrocarbon group.
  • a divalent cyclic hydrocarbon group By appropriately setting two bonds in such a divalent cyclic hydrocarbon group, it is possible to set the number of atoms constituting the main chain as described above to be 1 to 6 (hereinafter, described below). The same applies to groups having a cyclic structure).
  • the arylene an arylene having 6 to 14 carbon atoms is preferable, an arylene having 6 to 10 carbon atoms is more preferable, and an arylene having 6 carbon atoms is particularly preferable.
  • the arylene include phenylene, naphthylene, and anthraceneylene.
  • divalent non-aromatic cyclic hydrocarbon group a monocyclic or polycyclic divalent non-aromatic cyclic hydrocarbon group having 3 to 12 carbon atoms is preferable, and a simple monocyclic hydrocarbon group having 4 to 10 carbon atoms is preferable.
  • a divalent non-aromatic cyclic hydrocarbon group having a cyclic or polycyclic type is more preferable, and a divalent non-aromatic cyclic hydrocarbon group having a monocyclic number of 5 to 8 carbon atoms is particularly preferable.
  • divalent non-aromatic cyclic hydrocarbon group examples include cyclopropylene, cyclobutylene, cyclopentylene, cyclohexylene, cycloheptylene and cyclooctylene.
  • divalent cyclic hydrocarbon group arylene is preferable.
  • the divalent heterocyclic group is a divalent aromatic heterocyclic group or a divalent non-aromatic heterocyclic group.
  • the hetero atom constituting the heterocycle preferably contains at least one selected from the group consisting of an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a phosphorus atom, a boron atom and a silicon atom, and preferably contains an oxygen atom, a sulfur atom and a nitrogen atom. It is more preferable to include one or more selected from the group consisting of.
  • a divalent aromatic heterocyclic group having 3 to 15 carbon atoms is preferable, a divalent aromatic heterocyclic group having 3 to 9 carbon atoms is more preferable, and a carbon atom.
  • a divalent aromatic heterocyclic group having the number 3 to 6 is particularly preferable.
  • the divalent aromatic heterocyclic group include pyrrol diyl, frangyl, thiophene diyl, pyridine diyl, pyridazine diyl, pyrimidine diyl, pyrazine diyl, triazine diyl, pyrazole diyl, imidazole diyl, thiazole diyl, isothiazole diyl, and oxazole diyl.
  • Isoxazole diyl triazole diyl, tetrazole diyl, indole diyl, purine diyl, anthraquinone diyl, carbazole diyl, full orange yl, quinoline diyl, isoquinolin diyl, quinazoline diyl, and phthalazine diyl.
  • a non-aromatic heterocyclic group having 3 to 15 carbon atoms is preferable, a non-aromatic heterocyclic group having 3 to 9 carbon atoms is more preferable, and a non-aromatic heterocyclic group having 3 to 9 carbon atoms is more preferable.
  • the non-aromatic heterocyclic group of 6 is particularly preferred.
  • divalent non-aromatic heterocyclic group examples include pyrroldionediyl, pyrrolinedionediyl, oxylandiyl, aziridinediyl, azetidinediyl, oxetandiyl, thietandiyl, pyrrolidinediyl, dihydrofurandiyl, tetrahydrofurandiyl, dioxorandiyl and tetrahydrothiophene.
  • Diyl Pyrroline Diyl, Imidazolidine Diyl, Oxazolidine Diyl, Piperidine Diyl, Dihydropyran Diyl, Tetrahydropyran Diyl, Tetrahydropyran Diyl, Morpholine Diyl, Thiomorpholindiyl, Piperazine Diyl, Dihydrooxazine Diyl, Tetrahydropyran Diyl, Dihydropyrandiyl, And tetrahydropyrandiyl.
  • a divalent aromatic heterocyclic group is preferable.
  • W represents an oxygen atom or a sulfur atom, preferably an oxygen atom.
  • La and Lb indicate a first linker and a second linker, respectively.
  • the main chain in the first linker and the second linker may be composed of only carbon atoms, or may be composed of a combination of carbon atoms and heteroatoms (eg, oxygen atom, nitrogen atom, sulfur atom). However, from the viewpoint of easiness of organic synthesis and improvement of stability, it may be composed of only carbon atoms.
  • the main chain in the first linker represented by La is preferably set so that the number of atoms constituting the main chain as described above is 2 to 4.
  • the main chain in the second linker represented by Lb is preferably set so that the number of atoms constituting the main chain as described above is 1 to 5.
  • the main chain in the first linker represented by La is preferably set so that the number of atoms constituting the main chain as described above is two.
  • the main chain in the second linker represented by Lb is preferably set so that the number of atoms constituting the main chain as described above is 3 to 5.
  • La is a portion contained in the thiol group-introduced antibody derivative and has a low steric hindrance so as not to interfere with the reaction between the thiol group of the thiol group-introduced antibody derivative and the functional substance, and organic synthesis is carried out.
  • the main chain in the first linker represented by La is composed of a divalent linear hydrocarbon group having 2 to 4 carbon atoms.
  • the main chain in the first linker represented by La is even more preferably an ethylene group, a propylene group, or a butylene group, and particularly preferably an ethylene group.
  • this second linker can be decomposed in the production without any problem. That is, the main chain in the second linker is different from the main chain in the first linker, and its stability is less likely to be a problem.
  • the number of atoms constituting the main chain in the second linker is preferably 1 to 5, and more preferably 3 to 5.
  • the number of atoms constituting the main chain in the second linker is preferably 1 to 5, and more preferably 3 to 5.
  • the number of atoms constituting the main chain in the second linker is preferably 1 to 5, and more preferably 3 to 5.
  • the number of atoms constituting the main chain in the second linker is preferably 1 to 5, and more preferably 3 to 5.
  • the main chain in the second linker represented by Lb may be propylene or m-phenylene.
  • the groups constituting the main chain in the first linker and the second linker may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, and more preferably 1 or 2 substituents. Further, the Rd, which is one of the groups constituting the main chain in the first linker and the second linker, may indicate a substituent as described above.
  • halogen atoms examples, and preferred examples of halogen atoms, monovalent hydrocarbon groups, aralkyl, and monovalent heterocyclic groups in the substituents are R , RA , and RB, respectively, and (i) to (i) above. This is similar to that of the halogen atom, monovalent hydrocarbon group, aralkyl, and monovalent heterocyclic group described in (iv).
  • the compound represented by the formula (I) may be a compound represented by the following formula (I').
  • X, Y, O, S and W are the same as those in formula (I).
  • Lb represents a second linker having 3 to 5 atoms constituting the main chain.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or substituent.
  • examples and preferred examples of substituents represented by R1 , R2 , R3 , and R4 in formula (I') may be possessed by the groups that make up the backbone of the first linker. It is the same as that of the above-mentioned substituent.
  • the compound represented by the formula (I') may be a compound represented by the following formula (I ′′).
  • X, Y, O, S and W are the same as those in formula (I).
  • Lb is the same as that of the formula (I').
  • the compound of the present invention represented by the formulas (I) to (I ′′) or a salt thereof is, for example, the Y portion of the compound represented by the formulas (I) to (I ′′) or a salt thereof is eliminated.
  • Obtained by synthesizing a compound or a salt thereof substituted with a group (a leaving group having a higher leaving ability than X), and then reacting the synthesized compound or a salt thereof with an affinity peptide. can be done.
  • a reaction can be carried out in a suitable reaction system (eg, in an organic solvent or aqueous solution or a mixed solvent thereof) at a suitable temperature (eg, about 15 to 200 ° C.).
  • the reaction system may include a suitable catalyst.
  • the reaction time is, for example, 1 minute to 20 hours, preferably 10 minutes to 15 hours, more preferably 20 minutes to 10 hours, and even more preferably 30 minutes to 8 hours.
  • the Y moiety is replaced with a leaving group (a leaving group having a higher ability to remove than X) or a compound thereof.
  • the salt may be a compound represented by the following formula (VI) or a salt thereof.
  • O indicates an oxygen atom
  • S represents a sulfur atom
  • W represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • La indicates the first linker
  • Lb indicates a second linker
  • the total number of atoms constituting the main chain in the first linker and the number of atoms constituting the main chain in the second linker are 5 to 7.
  • the leaving group represented by X' which has a higher leaving ability than the leaving group X, is not particularly limited as long as it is a leaving group having a higher leaving ability than the leaving group X, for example, pentafluoro. Examples thereof include a phenyloxy group, a tetrafluorophenyloxy group, a paranitrophenyloxy group, and an N-succinimidyloxy group.
  • the compound represented by the formula (VI) or a salt thereof is useful as, for example, a synthetic intermediate for efficiently producing the compound represented by the formula (I) or a salt thereof.
  • the compound represented by the formula (VI) may be a compound represented by the following formula (VI').
  • X, X', O, S and W are the same as those of equation (VI) and Lb represents a second linker having 3 to 5 atoms constituting the main chain.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or substituent.
  • the compound represented by the formula (VI') may be a compound represented by the following formula (VI ′′).
  • X, X', O, S and W are the same as those of equation (VI) and Lb is the same as that of the formula (VI').
  • the compound represented by the formula (VI ′′) may be a compound represented by the following formula (VI ′′ -1) or (VI ′′ -2).
  • O, S and W are the same as those of equation (VI) and F is a fluorine atom.
  • the compound represented by the formula (VI) or a salt thereof can be produced from the compound represented by the following formula (V) or a salt thereof.
  • X indicates a leaving group
  • O indicates an oxygen atom
  • OH indicates a hydroxy group
  • S represents a sulfur atom
  • W represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • La indicates the first linker
  • Lb indicates a second linker
  • the total number of atoms constituting the main chain in the first linker and the number of atoms constituting the main chain in the second linker are 5 to 7.
  • the compound represented by the formula (VI) or a salt thereof can be obtained by reacting the compound represented by the formula (V) or a salt thereof with a carboxyl group modifying reagent.
  • carboxyl group modifying reagent include a pentafluorophenylation reagent (eg, pentafluorophenyl trifluoroacetate), a tetrafluorophenylation reagent (eg, trifluoroacetate tetrafluorophenyl), and a paranitrophenylation reagent (eg, tri).
  • N-succinimidylating reagent eg, trifluoroacetate N-succinimidyl
  • a suitable temperature eg, about
  • a suitable organic solvent system eg, an organic solvent containing an alkyl halide (eg, methyl halide) such as CH 2 Cl 2 and an amine such as triethylamine.
  • the reaction time is, for example, 1 minute to 20 hours, preferably 10 minutes to 15 hours, more preferably 20 minutes to 10 hours, and even more preferably 30 minutes to 8 hours.
  • the compound represented by the formula (V) or a salt thereof is useful as, for example, a synthetic intermediate for efficiently producing the compound represented by the formula (VI) or a salt thereof.
  • the compound represented by the formula (V) may be a compound represented by the following formula (V').
  • V' represents a second linker having 3 to 5 atoms constituting the main chain.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or substituent.
  • the compound represented by the formula (V') may be a compound represented by the following formula (V ′′).
  • V ′′ a compound represented by the following formula (V ′′).
  • the compound represented by the formula (V ′′) may be a compound represented by the following formula (V ′′ -1) or (V ′′ -2). [During the ceremony, O, OH, S and W are the same as those of the formula (V). ]
  • the present invention provides an antibody intermediate or a salt thereof containing a structural unit represented by the following formula (II).
  • Ig represents an immunoglobulin unit containing two heavy chains and two light chains, and is an amino in the side chain of a lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering. An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the group.
  • Y represents an affinity peptide having a binding region to the CH2 domain in the immunoglobulin unit.
  • O indicates an oxygen atom
  • S represents a sulfur atom
  • W represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • La indicates the first linker
  • Lb indicates a second linker
  • the total number of atoms constituting the main chain in the first linker and the number of atoms constituting the main chain in the second linker are 5 to 7.
  • the average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 1.5 to 2.5. ]
  • the immunoglobulin unit indicated by Ig is as described above. Definitions, examples, and preferred examples of symbols, terms and expressions such as Y (affinity peptide), W (oxygen atom or sulfur atom), La (first linker), Lb (second linker) in formula (II) , The same as that of the above formula.
  • the average ratio (r) of the amide bond per two heavy chains is the average ratio of the bonds between the immunoglobulin unit and the affinity peptide-containing group (affinity peptide-containing group number / immunoglobulin unit). Is shown. Such an average ratio is 1.5 to 2.5. Such an average ratio may be preferably 1.6 or more, more preferably 1.7 or more, even more preferably 1.8 or more, and particularly preferably 1.9 or more. Such an average ratio may also be preferably 2.4 or less, more preferably 2.3 or less, even more preferably 2.2 or less, and particularly preferably 2.1 or less. More specifically, such an average ratio is preferably 1.6 to 2.4, more preferably 1.7 to 2.3, even more preferably 1.8 to 2.2, and particularly preferably 1. It may be .9 to 2.1.
  • the structural unit represented by the formula (II) may be the structural unit represented by the following formula (II').
  • Ig, Y, O, S, W and r are the same as those of formula (II).
  • Lb represents a second linker having 3 to 5 atoms constituting the main chain.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or substituent.
  • It may be a structural unit represented by.
  • the structural unit represented by the formula (II') may be a structural unit represented by the following formula (II ′′).
  • Ig, Y, O, S, W and r are the same as those of formula (II).
  • Lb is the same as that of formula (II').
  • the antibody intermediate of the present invention or a salt thereof can be obtained by reacting the compound of the present invention or a salt thereof with an antibody containing the above-mentioned immunoglobulin unit.
  • the compound of the present invention or a salt thereof is mixed with the antibody. This allows the compounds of the invention or salts thereof to associate with the antibody via an affinity peptide that has an affinity for the antibody.
  • the amino group and the carbon atom of the carbonyl group are bonded, and the leaving group (X) is eliminated from the carbonyl group to obtain the antibody intermediate of the present invention or a salt thereof.
  • the molar ratio of the compound of the present invention or a salt thereof (the compound of the present invention or a salt thereof / antibody) to the antibody in the reaction varies depending on factors such as the compound of the present invention or a salt thereof and the type of antibody. Although not particularly limited, for example, it is 1 to 100, preferably 2 to 80, more preferably 4 to 60, even more preferably 5 to 50, and particularly preferably 6 to 30.
  • Such a reaction can be appropriately carried out under conditions (mild conditions) that cannot cause protein denaturation / decomposition (eg, cleavage of amide bond).
  • a reaction can be carried out at room temperature (eg, about 15-30 ° C.) in a suitable reaction system, eg buffer.
  • the pH of the buffer is, for example, 5 to 9, preferably 5.5 to 8.5, and more preferably 6.0 to 8.0.
  • the buffer may contain a suitable catalyst.
  • the reaction time is, for example, 1 minute to 20 hours, preferably 10 minutes to 15 hours, more preferably 20 minutes to 10 hours, and even more preferably 30 minutes to 8 hours.
  • Confirmation of the formation of an antibody intermediate or a salt thereof depends on the specific raw material and the molecular weight of the product, but for example, electrophoresis, chromatography (eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase). It can be done by column chromatography, HPLC), or mass spectrometry. Confirmation of regioselectivity can be performed, for example, by peptide mapping. Peptide mapping can be performed, for example, by protease treatment and mass spectrometry. As the protease, endoprotease is preferable.
  • affinity peptides introduced can be confirmed, for example, by electrophoresis, chromatography, or mass spectrometry, preferably mass spectrometry.
  • the antibody intermediate or a salt thereof can be appropriately purified by any method such as chromatography (eg, chromatography described above, and affinity chromatography).
  • a thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof which comprises a structural unit represented by the following formula (III).
  • Ig represents an immunoglobulin unit containing two heavy chains and two light chains, and is an amino in the side chain of a lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the group.
  • O indicates an oxygen atom
  • SH indicates a thiol group
  • La indicates the first linker
  • the number of atoms constituting the main chain in the first linker is 2 to 4, and the number of atoms is 2 to 4.
  • the average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 1.5 to 2.5.
  • the immunoglobulin unit indicated by Ig is as described above. Definitions, examples, and preferred examples of symbols, terms and expressions such as La (first linker) in formula (III) are the same as those in the above formula.
  • the average ratio (r) of the amide bond per two heavy chains indicates the average ratio of the bonds between the immunoglobulin unit and the thiol-containing group (thiol-containing group number / immunoglobulin unit).
  • Such an average ratio is 1.5 to 2.5.
  • Such an average ratio may be preferably 1.6 or more, more preferably 1.7 or more, even more preferably 1.8 or more, and particularly preferably 1.9 or more.
  • Such an average ratio may also be preferably 2.4 or less, more preferably 2.3 or less, even more preferably 2.2 or less, and particularly preferably 2.1 or less. More specifically, such an average ratio is preferably 1.6 to 2.4, more preferably 1.7 to 2.3, even more preferably 1.8 to 2.2, and particularly preferably 1. It may be .9 to 2.1.
  • the structural unit represented by the formula (III) may be the structural unit represented by the following formula (III').
  • Ig, O, SH and r are the same as those of formula (III).
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or substituent.
  • examples and preferred examples of substituents represented by R1 , R2 , R3, and R4 in formula ( III ') may be possessed by the groups that make up the backbone of the first linker. It is the same as that of the above-mentioned substituent.
  • the structural unit represented by the formula (III') may be the structural unit represented by the following formula (III ′′). [During the ceremony, Ig, O, SH and r are the same as those in formula (III). ]
  • the thiol group-introduced antibody derivative of the present invention or a salt thereof can be obtained by subjecting the antibody intermediate of the present invention or a salt thereof to a thioester cleavage reaction.
  • the thioester cleavage reaction can be carried out under conditions that cannot cause denaturation / degradation of proteins (immunoglobulin / antibody) (eg, cleavage of amide bonds) (mild conditions as described above). More specifically, it can be cleaved by stirring for 1 hour in a hydroxylamine hydrochloride solution in the range of pH 4.0 to pH 8.0, 10 mM to 10 M (eg, Vance, Net al., Bioconjugate Chem. 2019, 30, 148-160.).
  • Confirmation of the formation of a thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof depends on the specific raw material and the molecular weight of the product, and is, for example, electrophoresis, chromatography (eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, etc.). It can be done by reverse phase column chromatography, HPLC), or mass spectrometry, preferably by mass spectrometry.
  • Confirmation of regioselectivity can be performed, for example, by peptide mapping.
  • Peptide mapping can be performed, for example, by protease (eg, trypsin, chymotrypsin) treatment and mass spectrometry. As the protease, endoprotease is preferable.
  • Examples of such an endoprotease include trypsin, chymotrypsin, Glu-C, Lys-N, Lys-C, and Asp-N.
  • the number of thiol groups introduced can be confirmed, for example, by electrophoresis, chromatography, or mass spectrometry, preferably by mass spectrometry.
  • the thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof can be appropriately purified by any method such as chromatography (eg, chromatography described above, and affinity chromatography).
  • conjugates of antibodies and functional substances or salts thereof which contain structural units represented by the following formula (IV).
  • Ig represents an immunoglobulin unit containing two heavy chains and two light chains, and is an amino in the side chain of a lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the group.
  • O indicates an oxygen atom
  • S represents a sulfur atom
  • Z indicates a functional substance
  • La indicates the first linker
  • the number of atoms constituting the main chain in the first linker is 2 to 4, and the number of atoms is 2 to 4.
  • the average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 1.5 to 2.5.
  • the immunoglobulin unit indicated by Ig is as described above. Definitions, examples, and preferred examples of symbols, terms and expressions such as La (first linker) in formula (IV) are similar to those in formula (IV) above.
  • the functional substance is not particularly limited as long as it is a substance that imparts an arbitrary function to the antibody, and examples thereof include a drug, a labeling substance, and a stabilizer, but a drug or a labeling substance is preferable.
  • the functional substance may also be a single functional substance or a substance in which two or more functional substances are linked.
  • the drug may be a drug for any disease.
  • diseases include, for example, cancers (eg, lung cancer, gastric cancer, colon cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, liver cancer, thyroid cancer, prostate cancer, bladder cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bone cancer, skin cancer, etc.
  • Brain tumor, melanoma autoimmune and inflammatory diseases (eg, allergic disease, rheumatoid arthritis, systemic erythematosus), neurological diseases (eg, cerebral infarction, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, muscular atrophic lateral sclerosis), Infectious diseases (eg, bacterial infections, viral infections), hereditary and rare diseases (eg, hereditary globular erythropathy, non-dystrophic myotension), eye diseases (eg, age-related luteal degeneration, diabetic retinopathy, etc.) Retinal pigment degeneration), diseases in the field of bone and orthopedics (eg, osteoarthritis), blood diseases (eg, leukemia, purpura), and other diseases (eg, diabetes, hyperlipidemia, etc.) , Liver disease, kidney disease, lung disease, cardiovascular disease, digestive system disease).
  • the drug may be a prophylactic or therapeutic drug for a disease or a palliative drug for side effects.
  • the drug is an anti-cancer agent.
  • Anti-cancer agents include, for example, chemotherapeutic agents, toxins, radioisotopes or substances containing them.
  • Chemotherapeutic agents include, for example, DNA damaging agents, metabolic antagonists, enzyme inhibitors, DNA intercalating agents, DNA cleavage agents, topoisomerase inhibitors, DNA binding inhibitors, tubulin binding inhibitors, cytotoxic nucleosides, etc. Platinum compounds can be mentioned.
  • Examples of toxins include bacterial toxins (eg, diphtheria toxins) and plant toxins (eg, ricin).
  • Radioisotopes include, for example, a radioisotope of a hydrogen atom (eg, 3H ), a radioisotope of a carbon atom (eg, 14C ), a radioisotope of a phosphorus atom (eg, 32P ), and a sulfur atom.
  • Radioisotopes eg, 35 S
  • yttrium radioisotopes eg 90 Y
  • technetium radioisotopes eg 99 MTc
  • indium radioisotopes eg 111 In
  • iodine atom radioactivity Isotopes eg 123 I, 125 I, 129 I, 131 I
  • samarium radioisotopes eg 153 Sm
  • renium radioisotopes eg 186 Re
  • asstatin radioisotopes eg 156 Re
  • 211 At a radioisotope of bismuth
  • a radioisotope of bismuth eg, 212 Bi
  • auristatin MMAE, MMAF
  • maitansine DM1, DM4
  • PBD pyrrolobenzodiazepine
  • IGN camptothecin analog
  • calicheamicin duocalmycin
  • eribulin anthracycline
  • dmDNA31 tubricin.
  • the labeling substance is a substance that enables detection of a target (eg, tissue, cell, substance).
  • Labeling substances include, for example, enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), affinity substances (eg, streptavidin, biotin, digoxygenin, aptamer), fluorescent substances (eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine).
  • Green fluorescent protein Green fluorescent protein, red fluorescent protein
  • luminescent substances eg, luciferin, equolin, acridinium ester, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium, luminol
  • radioactive isotopes eg, those mentioned above
  • examples include substances containing it.
  • Stabilizer is a substance that enables the stabilization of antibodies.
  • Stabilizers include, for example, diols, glycerin, nonionic surfactants, anionic surfactants, natural surfactants, saccharides, and polyols.
  • Functional substances may also be peptides, proteins, nucleic acids, small molecule organic compounds, sugar chains, lipids, high molecular polymers, metals (eg gold), killer.
  • the peptide include a cell membrane penetrating peptide, a blood-brain barrier penetrating peptide, and a peptide drug.
  • proteins include enzymes, cytokines, fragment antibodies, lectins, interferons, serum albumin, and antibodies.
  • nucleic acids include DNA, RNA, and artificial nucleic acids. Nucleic acids also include, for example, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), aptamers, antisense.
  • small molecule organic compounds include proteolysis-inducing chimeric molecules, dyes, and photodegradable compounds.
  • the functional substance may be derivatized so as to have such a functional group.
  • Derivatization is common technical knowledge in the art (eg, International Publication No. 2004/010957, US Patent Application Publication No. 2006/0074008, US Patent Application Publication No. 2005/02386649).
  • derivatization may be carried out using any cross-linking agent.
  • the derivatization may be carried out using a specific linker having the desired functional group.
  • such a linker may be one in which the functional substance and the antibody can be separated by cleavage of the linker in an appropriate environment (eg, intracellular or extracellular).
  • linkers include, for example, peptidyl linkers that are degraded by specific proteases [eg, intracellular proteases (eg, proteases present in lysosomes, or endosomes), extracellular proteases (eg, secretory proteases)].
  • proteases eg, intracellular proteases (eg, proteases present in lysosomes, or endosomes), extracellular proteases (eg, secretory proteases)
  • a linker that can be cleaved at a locally acidic site present in the living body eg, US Pat. No. 5, US Pat. No. 5).
  • the linker may be self-destructive (eg, WO 02/083180, WO 04/043493, WO 05/1192919).
  • the derivatized functional substance is also simply referred to as "functional substance”.
  • the average ratio (r) of the amide bond per two heavy chains is the average ratio of the bonds between the immunoglobulin unit and the functional substance-containing group (functional substance-containing group number / immunoglobulin unit). Is shown. Such an average ratio is 1.5 to 2.5. Such an average ratio may be preferably 1.6 or more, more preferably 1.7 or more, even more preferably 1.8 or more, and particularly preferably 1.9 or more. Such an average ratio may also be preferably 2.4 or less, more preferably 2.3 or less, even more preferably 2.2 or less, and particularly preferably 2.1 or less. More specifically, such an average ratio is preferably 1.6 to 2.4, more preferably 1.7 to 2.3, even more preferably 1.8 to 2.2, and particularly preferably 1. It may be .9 to 2.1.
  • the structural unit represented by the formula (IV) may be the structural unit represented by the following formula (IV').
  • formula (IV') [During the ceremony, Ig, O, S, Z and r are the same as those of formula (IV).
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or substituent. ]
  • the structural unit represented by the formula (IV') may be the structural unit represented by the following formula (IV ′′). [During the ceremony, Ig, O, S, Z and r are the same as those of formula (IV). ]
  • the conjugate of the present invention or a salt thereof can be obtained by reacting the thiol group-introduced antibody derivative of the present invention or a salt thereof with a functional substance.
  • a reaction can be carried out under conditions that cannot cause denaturation / degradation of a protein (immunoglobulin / antibody) (eg, cleavage of an amide bond) (mild conditions as described above).
  • a functional substance a substance having an arbitrary functional group capable of reacting with a thiol group under mild conditions can be used, but it is preferable to use a functional group that easily reacts with the thiol group.
  • a functional group examples include a maleimide group, a disulfide group, an ⁇ -haloketone, an ⁇ -haloamide, a benzyl bromide, and an iodoalkyl group.
  • the functional substance derivatized as described above can be used.
  • the molar ratio of the functional substance to the thiol group-introduced antibody derivative or its salt is determined by the type of the thiol group-introduced antibody derivative or its salt and the functional substance.
  • reaction time since it varies depending on factors such as reaction time, it is not particularly limited, but is, for example, 2 or more, preferably 3 or more, and more preferably 5 or more.
  • a sufficient amount (eg, excess amount) of the functional substance with respect to the thiol group-introduced antibody derivative or a salt thereof is used. be able to.
  • Confirmation of the formation of a conjugate or salt thereof depends on the specific raw material and the molecular weight of the product, but for example, electrophoresis, chromatography (eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase column). It can be done by chromatography, HPLC), or mass spectrometry, preferably by mass spectrometry.
  • Confirmation of regioselectivity can be performed, for example, by peptide mapping.
  • Peptide mapping can be performed, for example, by protease (eg, trypsin, chymotrypsin) treatment and mass spectrometry. As the protease, endoprotease is preferable.
  • Examples of such an endoprotease include trypsin, chymotrypsin, Glu-C, Lys-N, Lys-C, and Asp-N.
  • the number of functional substances introduced can be confirmed by, for example, electrophoresis, chromatography, or mass spectrometry, preferably mass spectrometry.
  • the conjugate or salt thereof can be appropriately purified by any method such as chromatography (eg, chromatography described above, and affinity chromatography).
  • the compounds of the present invention or salts thereof can, for example, regioselectively modify the lysine residue at position 288/29 of an antibody. Therefore, the present invention provides a reagent for antibody derivatization, which comprises the compound of the present invention or a salt thereof.
  • the reagent of the present invention may be provided in the form of a composition further containing other components.
  • other components include solutions, stabilizers (eg, antioxidants, preservatives).
  • an aqueous solution is preferable.
  • the aqueous solution include water (eg, distilled water, sterile distilled water, purified water, physiological saline), buffer solution (eg, phosphoric acid aqueous solution, Tris-hydrochloride buffer solution, carbonic acid-bicarbonate buffer solution, boric acid aqueous solution). , Glycine-sodium hydroxide buffer, citrate buffer), but a buffer is preferred.
  • the pH of the solution is, for example, 5.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.5.
  • the reagents of the present invention can be provided in liquid or powder form (eg, lyophilized powder).
  • the antibody intermediate of the present invention or a salt thereof, and the thiol group-introduced antibody derivative of the present invention or a salt thereof are useful as, for example, a conjugate of an antibody and a functional substance or an intermediate for preparing a salt thereof.
  • the conjugate of the present invention or a salt thereof is useful as, for example, a drug or a reagent (eg, a diagnostic agent, a reagent for research).
  • the present invention is regioselectively modified with a functional substance, and the average ratio of binding between the antibody and the functional substance is highly controlled within a desired range (1.5 to 2.5).
  • the conjugate or salt thereof is useful as a medicine. It has been reported that changing the number and position of binding of a drug in an antibody-drug conjugate (ADC) changes the pharmacokinetics, the release rate of the drug, and the effect. For these reasons, next-generation ADCs are required to control the number and position of drugs to be conjugated. It is thought that if the number and position are constant, the problems of efficacy, variation of conjugation drug, and lot difference, so-called regulation, as expected will be solved. Therefore, the conjugates of the present invention or salts thereof can solve such regulation problems.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the conjugate of the present invention or a salt thereof may be provided in the form of a pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the conjugate of the present invention or a salt thereof.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, excipients such as sucrose, starch, mannit, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polypropylpyrrolidone.
  • Gelatin gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch and other binders, starch, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl starch, sodium hydrogen carbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants, magnesium stearate, aerodyl, talc, lauryl Lubricants such as sodium sulfate, citric acid, menthol, glycyrrhizin / ammonium salt, glycine, fragrances such as orange powder, preservatives such as sodium benzoate, sodium hydrogen sulfite, methylparaben, propylparaben, citric acid, sodium citrate, acetic acid Stabilizers such as, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, suspending agents such as aluminum stearate, dispersants such as surfactants, diluents such as water, physiological saline, orange juice, cocoa butter, polyethylene glycol, white kerosene, etc.
  • examples include,
  • Suitable formulations for oral administration are solutions in which an effective amount of ligand is dissolved in a diluted solution such as water, physiological saline, or orange juice, capsules containing an effective amount of ligand as solids or granules, sachets, or sachets.
  • a diluted solution such as water, physiological saline, or orange juice
  • capsules containing an effective amount of ligand as solids or granules, sachets, or sachets include tablets, suspensions in which an effective amount of the active ingredient is suspended in an appropriate dispersion medium, and emulsions in which a solution in which an effective amount of the active ingredient is dissolved is dispersed in an appropriate dispersion medium and emulsified.
  • the pharmaceutical composition is suitable for parenteral administration (eg, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, intraperitoneal administration).
  • Pharmaceutical compositions suitable for such parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injectable solutions, which include antioxidants, buffers, antibacterial agents, isotonic agents. Etc. may be included. Examples thereof include aqueous and non-aqueous sterile suspensions, which may include suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • the dose of the pharmaceutical composition varies depending on the type / activity of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, the body weight, the age, etc., but can be appropriately set.
  • Example 1 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis]
  • (1-1) Synthesis of IgG1 Fc-binding peptide
  • As the peptide synthesizer Liberty Blue manufactured by CEM was used.
  • a 2M aqueous trifluoroacetic acid solution was added to the reaction solution to stop the reaction, this was dissolved in a 0.05% aqueous trifluoroacetic acid solution, and subjected to reverse phase high-speed liquid chromatography using octadodecyl group chemically bound silica gel as a filler. , Elution with a mixed solution of water containing 0.05% trifluoroacetic acid and acetonitrile, and each fraction was confirmed by LC-MS. The fraction containing the product was collected and concentrated under reduced pressure to remove acetonitrile, and then freeze-dried to obtain the desired product (20.0 mg, 4.70 ⁇ mol).
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • the average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • the heavy chain VH domain and the number on the light chain are the numbers in the sequence (that is, the N-terminal amino acid is the first; the same applies hereinafter), and the heavy chains CH1, CH2, and CH3 are used. On the domain, it is described using EU numbering.
  • (1) and (2) shown in FIG. 9 were used as the data of the amino acid sequence to be searched for the modification site.
  • Example 2 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis]
  • (2-1) Synthesis of thioester linker (2-1-1)
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • Example 3 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis] (3-1) Synthesis of thioester linker (3-1-1)
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 1.9.
  • Example 4 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis] (4-1) Synthesis of thioester linker (4-1-1)
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 1.8.
  • Example 5 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis]
  • (5-1) Binding of peptide and linker
  • Both of the above two amino acid sequences are the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3.
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • Example 6 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis] (6-1) Binding of peptide and linker Both of the above two amino acid sequences are the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4.
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • Example 7 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis] (7-1) Binding of peptide and linker Both of the above two amino acid sequences are the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5.
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • Example 8 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis] (8-1) Binding of peptide and linker Both of the above two amino acid sequences are the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6.
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • Example 9 Synthesis of a compound having an affinity substance for a soluble protein, a cleaving moiety and a reactive group (peptide thioester linker conjugate-thiophenol activator), and modification of the anti-HER2 antibody trastuzumab using the compound. And its analysis] (9-1) Binding of peptide and linker Both of the above two amino acid sequences are the amino acid sequences of SEQ ID NO: 7.
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • Y represents the affinity peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. The average ratio r of the amide bonds per two heavy chains is 2.0.
  • the total number of atoms constituting the main chain in the first linker and the number of atoms constituting the main chain in the second linker correspond to less than 4 or 9 or more atoms. Showed an average PAR of 0.5 or less.
  • Example 10 Regioselective modification of different target regions of IgG1 Fc with IgG1 Fc-affinity peptide reagent, and synthesis of antibody-drug conjugate] (10-1) Production of thiol group-introduced antibody derivative by cleavage of thioester group following position-selective modification of anti-HER2 antibody trastuzumab The following peptide reagent described in the previous report (WO2019 / 240287A1) was dissolved in dimethylformamide to obtain 10 mM.
  • Anti-HER2 antibody trastuzumab (Chugai Pharmaceutical) 500 ⁇ g is dissolved in 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) 200 ⁇ L (20 ⁇ M), and 10 mM of the above peptide reagent is added 3.38 ⁇ L (10 equivalents to the antibody) at room temperature. The mixture was stirred for 1 hour. Subsequently, a hydroxylamine solution was added according to the previous report (WO2019 / 240287A1), and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. When the mass of the obtained thiol-introduced antibody was measured by ESI-TOFMS, a peak was confirmed at 148760 where the cleavage reaction by hydroxylamine proceeded.
  • the following peptide reagent is a reagent that enables modification of the lysine residue at position 246/248 of the IgG heavy chain
  • the lysine residue at position 246/248 of the IgG heavy chain is modified with the following peptide reagent. It is thought that it was.
  • the amino acid sequence is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • Ig represents an immunoglobulin unit (IgG) containing two heavy chains and two light chains, and the lysine residue present at position 288/290 in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • An amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the group.
  • an amide bond is formed with the carbonyl group adjacent to Ig via the amino group in the side chain of the lysine residue present at the 246/248 position in the two heavy chains according to Eunumbering.
  • the average ratios r (288/290 positions) and n (246/248 positions) of the amide bonds per two heavy chains were 1.9 and 2.0, respectively, as a result of evaluation.

Abstract

本発明は、抗体を機能性物質で位置選択的に修飾し、かつ抗体と機能性物質との結合比率を所望の範囲に制御することを容易にする化合物またはその塩、ならびにそれらを用いて製造することができる抗体を提供する。より具体的には、本発明は、下記式（Ｉ）： 〔式中、　Ｘは、脱離基を示し、　Ｙは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、　Ｏは、酸素原子を示し、　Ｓは、硫黄原子を示し、　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、　Ｌａは、第１リンカーを示し、　Ｌｂは、第２リンカーを示し、　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩、ならびにそれらを用いて製造することができる抗体を提供する。

Description

化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体
　本発明は、化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体などに関する。
　近年、抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）の研究開発が盛んに行われている。ＡＤＣはその名の通り、抗体に薬物（例、抗がん剤）をコンジュゲーションした薬剤であり、がん細胞などに対して直接的な殺細胞活性を有する。代表的なＡＤＣとしては、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ社およびＲｏｃｈｅ社が共同開発したＴ－ＤＭ１（商品名：カドサイラ（登録商標））がある。
　Ｔ－ＤＭ１を始めとするＡＤＣは、開発当初からその不均一性が問題となっている。すなわち、抗体中に７０～８０程度あるリジン残基に対して、低分子薬物をランダムに反応させているため、薬物抗体比（Ｄｒｕｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｒａｔｉｏ：ＤＡＲ）やコンジュゲーション位置が一定ではない。通常このようなランダムコンジュゲーション法になるとＤＡＲが０～８の範囲となり、薬物の結合数が異なる複数の抗体薬剤が生じることが分かっている。近年ＡＤＣの薬物の結合数および結合位置を変化させると、体内動態や薬物の放出速度、効果が変化することが報告されている。これらのことから次世代型ＡＤＣではコンジュゲーションする薬物の個数と位置を制御することが求められている。個数および位置が一定であると、期待通りのｅｆｆｉｃａｃｙ、コンジュゲーション薬剤のバリエーション、ロット差いわゆるレギュレーションの問題が解決すると考えられている。
　抗体の位置選択的修飾法は世界中で研究されているが、そのほとんどが遺伝子工学的手法もしくは酵素を用いた修飾法である。遺伝子工学的修飾法に関しては、位置選択性、個数選択性は制御できるものの、抗体自体の発現効率が低下（ＡＤＣを調製する際の総収率が低下）するなどの問題が指摘されている。また、抗体発現系の構築などに長い年月を要することが問題となっている。
　最近、化学合成的手法により抗体の位置選択的な修飾を可能にするＣ－ＣＡＰ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）法が開発された（特許文献１）。本方法は、親和性ペプチド（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）に対してＮＨＳ活性化エステルおよび薬物が連結されたペプチド試薬を抗体と反応させることにより、抗体の位置選択的な修飾に成功している。しかし、本方法により作製されるＡＤＣは、抗体と薬物がペプチド部分を含むリンカーを介して結合している。ペプチド部分は、潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易い。したがって、本方法により作製されるＡＤＣは、リンカー中にペプチド部分を含む点で改善の余地がある。
　上記Ｃ－ＣＡＰ法の改良方法として、親和性ペプチドを含む所定の化合物を用いる化学合成的手法により、ペプチド部分をリンカーとして含まない、機能性物質（例、薬物）を位置選択的に有する抗体を調製できる技術が報告されている（特許文献２～６）。ペプチド部分を含むリンカーの使用の回避は、臨床応用において望ましいものである。これらの技術では、薬物で位置選択的に修飾され得る抗体中のアミノ酸残基の位置として、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン中の各種アミノ酸残基（例、リジン残基、チロシン残基、セリン残基、およびスレオニン残基）に対応する複数の位置が提案されている。しかしながら、抗体を機能性物質で位置選択的に修飾し、かつ抗体と機能性物質との結合比率を所望の範囲に制御することは必ずしも容易ではない。
国際公開第２０１６／１８６２０６号 国際公開第２０１８／１９９３３７号 国際公開第２０１９／２４０２８７号 国際公開第２０１９／２４０２８８号 国際公開第２０２０／００９１６５号 国際公開第２０２０／０９０９７９号
　本発明の目的は、抗体を機能性物質で位置選択的に修飾し、かつ抗体と機能性物質との結合比率を所望の範囲に制御することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、イムノグロブリン単位中の重鎖の２８８／２９０位のリジン残基を抗体の修飾位置として選択し、かつ当該リジン残基の位置特異的な修飾を可能にする化合物として特定の化合物を用いることで、抗体を機能性物質で位置選択的に修飾でき、しかもイムノグロブリン単位と機能性物質との結合の平均比率（機能性物質数／イムノグロブリン単位）を所望の範囲（１．５～２．５）に高度に制御することが容易になることを見出した。このような特定の化合物は、イムノグロブリン単位中の重鎖の２８８／２９０位のリジン残基との反応性部分〔Ｘ（脱離基）－Ｃ＝Ｏ〕と、親和性ペプチドとの結合部分〔Ｏ＝Ｃ－Ｙ（親和性ペプチド）〕とを連結する主鎖を構成する原子数の合計が７～９個である化合物（すなわち、式（Ｉ）で表われる化合物において、第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が５～７個であるもの）に対応する。本発明者らは、かかる知見に基づき、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩、およびそれらを含む抗体誘導体化用試薬を開発することに成功した。本発明者らはまた、式（Ｉ）で表われる化合物またはそれらの塩の使用により、特定の抗体、すなわち、抗体中の２８８／２９０位のリジン残基が修飾基で位置選択的に修飾され、かつイムノグロブリン単位と修飾基との結合の平均比率（修飾基数／イムノグロブリン単位）が所望の範囲（１．５～２．５）に高度に制御された抗体（抗体中間体、チオール基導入抗体誘導体、ならびに抗体および機能性物質のコンジュゲート）を調製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下である。
〔１〕式（Ｉ）で表される化合物またはその塩。
〔２〕脱離基が以下から選ばれる、〔１〕の化合物またはその塩：
（ａ）Ｒ－Ｓ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｓは、硫黄原子を示す。）；
（ｂ）Ｒ－Ｏ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｏは、酸素原子を示す。）；または
（ｃ）ＲＡ－（ＲＢ－）Ｎ（ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｎは、窒素原子を示す。）；または
（ｄ）ハロゲン原子。
〔３〕イムノグロブリン単位がヒトイムノグロブリン単位である、〔１〕または〔２〕の化合物またはその塩。
〔４〕イムノグロブリン単位がヒトＩｇＧである、〔１〕～〔３〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔５〕親和性ペプチドがリジン残基を含み、かつリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｙに隣接するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）とアミド結合を形成している、〔１〕～〔４〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔６〕親和性ペプチドが以下である、〔１〕～〔５〕のいずれかの化合物またはその塩：
（Ａ）ＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；または
（Ｂ）ＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および付加からなる群より選ばれる１～５個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列（ここで、２７位のリジン残基、ならびに１位および３０位の２つのシステイン残基は維持される）を含む親和性ペプチド。
〔７〕（Ｂ）の親和性ペプチドが、以下からなる群より選ばれる、〔６〕の化合物またはその塩：
（ａ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｂ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＤＣ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｃ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｄ）ＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｅ）ＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；および
（ｆ）ＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド。
〔８〕親和性ペプチドにおけるＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基が、保護されていてもよく、かつ
　親和性ペプチドにおける２つのシステイン残基（Ｃ）の側鎖中の２つのチオール基が、ジスルフィド結合により、またはリンカーを介して連結されていてもよい、〔６〕または〔７〕の化合物またはその塩。
〔９〕式（Ｉ）で表される化合物が、式（Ｉ’）で表される、〔１〕～〔８〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１０〕式（Ｉ’）で表される化合物が、式（Ｉ’’）で表される、〔９〕の化合物またはその塩。
〔１１〕式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含む、抗体誘導体化用試薬。
〔１２〕式（Ｉ）で表される化合物が、式（Ｉ’）で表される、〔１１〕の試薬。
〔１３〕式（Ｉ’）で表される化合物が、式（Ｉ’’）で表される、〔１２〕の試薬。
〔１４〕式（ＩＩ）で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩。
〔１５〕抗体中間体がヒト抗体中間体である、〔１４〕の抗体中間体またはその塩。
〔１６〕抗体中間体がヒトＩｇＧ中間体である、〔１４〕または〔１５〕の抗体中間体またはその塩。
〔１７〕式（ＩＩ）で表される構造単位が、式（ＩＩ’）で表される、〔１４〕～〔１６〕のいずれかの抗体中間体またはその塩。
〔１８〕式（ＩＩ’）で表される構造単位が、式（ＩＩ’’）で表される、〔１７〕の抗体中間体またはその塩。
〔１９〕式（ＩＩＩ）で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩。
〔２０〕前記２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基以外の特定アミノ酸残基がさらに修飾されている、〔１９〕のチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
〔２１〕前記特定アミノ酸残基が、２個の重鎖中の２４６／２４８位に存在するリジン残基である、〔２０〕のチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
〔２２〕式（ＩＩＩ）で表される構造単位が、式（ＩＩＩ’）で表される、〔１９〕～〔２１〕のいずれかのチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
〔２３〕式（ＩＩＩ’）で表される構造単位が、式（ＩＩＩ’’）で表される、〔２２〕のチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
〔２４〕式（ＩＶ）で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩。
〔２５〕前記２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基以外の特定アミノ酸残基がさらに修飾されている、〔２４〕のコンジュゲートまたはその塩。
〔２６〕前記特定アミノ酸残基が、２個の重鎖中の２４６／２４８位に存在するリジン残基である、〔２５〕のコンジュゲートまたはその塩。
〔２７〕式（ＩＶ）で表される構造単位が、式（ＩＶ’）で表される、〔２４〕～〔２６〕のいずれかのコンジュゲートまたはその塩。
〔２８〕式（ＩＶ’）で表される構造単位が、式（ＩＶ’’）で表される、〔２７〕のコンジュゲートまたはその塩。
〔２９〕式（Ｖ）で表される化合物またはその塩。
〔３０〕式（Ｖ）で表される化合物が、式（Ｖ’）で表される、〔２９〕の化合物またはその塩。
〔３１〕式（Ｖ’）で表される化合物が、式（Ｖ’’）で表される、〔３０〕の化合物またはその塩。
〔３２〕式（Ｖ’’）で表される化合物が、式（Ｖ’’－１）または（Ｖ’’－２）で表される、〔３１〕の化合物またはその塩。
〔３３〕式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩。
〔３４〕脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基が、ペンタフルオロフェニルオキシ基、テトラフルオロフェニルオキシ基、パラニトロフェニルオキシ基、またはＮ－スクシンイミジルオキシ基である、〔３３〕の化合物またはその塩。
〔３５〕式（ＶＩ）で表される化合物が、式（ＶＩ’）で表される、〔３３〕または〔３４〕の化合物またはその塩。
〔３６〕式（ＶＩ’）で表される化合物が、式（ＶＩ’’）で表される、〔３５〕の化合物またはその塩。
〔３７〕式（ＶＩ’’）で表される化合物が、式（ＶＩ’’－１）または（ＶＩ’’－２）で表される、〔３６〕の化合物またはその塩。
〔３８〕式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、イムノグロブリン単位を含む抗体と反応させて、式（ＩＩ）で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩を生成することを含む、抗体中間体またはその塩の製造方法。
〔３９〕（１）式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、イムノグロブリン単位を含む抗体と反応させて、式（ＩＩ）で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩を生成すること；ならびに
（２）抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、式（ＩＩＩ）で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成することを含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩の製造方法。
〔４０〕（１）式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、イムノグロブリン単位を含む抗体と反応させて、式（ＩＩ）で表される構造単位を含む、抗体中間体またはその塩を生成すること；
（２）抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、式（ＩＩＩ）で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成すること；ならびに
（３）チオール基導入抗体誘導体またはその塩を、機能性物質と反応させて、式（ＩＶ）で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を生成することを含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩の製造方法。
〔４１〕式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩を、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドと反応させて、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を生成することをさらに含む、〔３８〕～〔４０〕のいずれかの方法。
〔４２〕（１’）式（Ｖ）で表される化合物またはその塩を、カルボキシル基修飾試薬と反応させて、式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩を生成すること；ならびに
（２’）式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩を、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドと反応させて、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を生成することをさらに含む、〔３８〕～〔４０〕のいずれかの方法。
〔４３〕式（Ｖ）で表される化合物またはその塩を、カルボキシル基修飾試薬と反応させて、式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩を生成することを含む、式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩の製造方法。
〔４４〕式（ＩＩ）で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、式（ＩＩＩ）で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成することを含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩の製造方法。
〔４５〕（１）式（ＩＩ）で表される構造単位を含む、抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、式（ＩＩＩ）で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成すること；ならびに
（２）チオール基導入抗体誘導体またはその塩を、機能性物質と反応させて、式（ＩＶ）で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を生成することを含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩の製造方法。
〔４６〕式（ＩＩＩ）で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を、機能性物質と反応させて、式（ＩＶ）で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を生成することを含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩の製造方法。
　式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、イムノグロブリン単位と親和性ペプチド含有基との結合の平均比率（親和性ペプチド含有基数／イムノグロブリン単位）が所望の範囲（１．５～２．５）となるように、イムノグロブリン単位中の重鎖の２８８／２９０位のリジン残基を特異的かつ高度に修飾することができる。したがって、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩は、抗体誘導体化用試薬として有用である。
　また、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩によれば、イムノグロブリン単位中の重鎖の２８８／２９０位のリジン残基が親和性ペプチド含有基で特異的に修飾されており、かつイムノグロブリン単位と親和性ペプチド含有基との結合の平均比率（親和性ペプチド含有基数／イムノグロブリン単位）が所望の範囲に高度に制御された、式（ＩＩ）で表される抗体中間体またはその塩を提供することができる。
　さらに、式（ＩＩ）で表される抗体中間体またはその塩を原料として使用して作製された抗体は、当該抗体中間体またはその塩の位置選択性および結合の平均比率を引き継ぐことができる。したがって、上記のような位置選択性および結合の平均比率を有する、式（ＩＩＩ）で表されるチオール基導入抗体誘導体またはその塩、ならびに式（ＩＶ）で表される抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を提供することができる。
　また、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩の効率的な製造を可能にする合成中間体である式（Ｖ）および（ＶＩ）で表される化合物またはその塩が提供される。
図１は、式（Ｉ）で表される本発明の化合物またはその塩によるイムノグロブリン単位の修飾のコンセプトを示す模式図（その１）である。先ず、式（Ｉ）で表される本発明の化合物またはその塩は、親和性ペプチド（Ｙ）を介して、イムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに会合する。次に、式（Ｉ）で表される本発明の化合物またはその塩は、脱離基（Ｘ）を有する活性化カルボニル基を介して、ＣＨ２ドメイン中の特定のアミノ酸残基の側鎖（図中ではリジン残基の側鎖におけるアミノ基）と反応して、抗体中間体またはその塩を生成する。 図２は、式（Ｉ）で表される本発明の化合物またはその塩によるイムノグロブリン単位の修飾のコンセプトを示す模式図（その２）である。チオエステル基の切断により、チオール基導入抗体誘導体またはその塩が生成する。 図３は、式（Ｉ）で表される本発明の化合物またはその塩によるイムノグロブリン単位の修飾のコンセプトを示す模式図（その３）である。チオール基導入抗体誘導体またはその塩におけるチオール基と機能性物質（Ｚ）との反応により、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩が生成する。 図４は、本発明の一実施形態の概要を示す図である。 図５は、本発明の好ましい実施形態の概要を示す図である。 図６は、本発明のより好ましい実施形態の概要を示す図である。 図７は、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２　ＩｇＧ抗体）の特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例１）。 図８は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例１）。 図９は、（１）トラスツズマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号８）、および（２）トラスツズマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。 図１０は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１０）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　５７７．０３６０６、理論値：５７７．０３５５７、４価）を示す図である（実施例１－９－４）。 図１１は、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧ重鎖の２８８／２９０位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ１６に相当するｍ／ｚ　６８２．１３（理論値：６８２．０１）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例１－９－４）。 図１２は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ）を含むペプチドフラグメントをＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒを用いて検索した結果を示す図である（実施例１－９－４）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＩｎｔｅｎｓｉｔｙを示す。 図１３は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例２）。 図１４は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例２）。 図１５は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１０）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　５７７．０３５７１、理論値：５７７．０３５５７、４価）を示す図である（実施例２－７－４）。 図１６は、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧ重鎖の２８８／２９０位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ１６に相当するｍ／ｚ　６８２．４１（理論値：６８２．０１）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例２－７－４）。 図１７は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ）を含むペプチドフラグメントをＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒを用いて検索した結果を示す図である（実施例２－７－４）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＩｎｔｅｎｓｉｔｙを示す。 図１８は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例３）。 図１９は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例３）。 図２０は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例４）。 図２１は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例４）。 図２２は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例５）。 図２３は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例５）。 図２４は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例６）。 図２５は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例６）。 図２６は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例７）。 図２７は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例７）。 図２８は、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１０）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　７６９．０４５０６、理論値：７６９．０４４８２、３価）を示す図である（実施例７－６－４）。 図２９は、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧ重鎖の２８８／２９０位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ１６に相当するｍ／ｚ　１０２２．７１（理論値：１０２２．５１）のプロダクトイオンのＣＩＤスペクトルを示す図である（実施例７－６－４）。 図３０は、トラスツズマブのトリプシン消化物に対し、リジン残基への修飾（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ）を含むペプチドフラグメントをＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒを用いて検索した結果を示す図である（実施例７－６－４）。横軸は同定されたリジン残基を示し、縦軸はＩｎｔｅｎｓｉｔｙを示す。 図３１は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例８）。 図３２は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例８）。 図３３は、トラスツズマブの特異的修飾（結合性ペプチドの導入数）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例９）。 図３４は、トラスツズマブの特異的修飾（重鎖選択性）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である（実施例９）。
１．一般的な用語の定義
　本発明において、用語「抗体」は、以下のとおりである。また、用語「イムノグロブリン単位」は、このような抗体の基本構成要素である２価の単量体単位に対応するものであり、２個の重鎖および２個の軽鎖を含む単位である。したがって、イムノグロブリン単位について、その由来、種類（ポリクローナルもしくはモノクローナル、アイソタイプ、および全長抗体もしくは抗体断片）、抗原、リジン残基の位置、および位置選択性の定義、例、および好ましい例は、以下に説明する抗体のものと同様である。
　抗体の由来は、特に限定されず、例えば、哺乳動物、鳥類（例、ニワトリ）等の動物に由来するものであってもよい。好ましくは、イムノグロブリン単位は、哺乳動物に由来する。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例、イヌ、ネコ）、家畜（例、ウシ、ブタ、ヤギ）、使役動物（例、ウマ、ヒツジ）が挙げられ、好ましくは霊長類または齧歯類であり、より好ましくはヒトである。
　抗体の種類は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体はまた、２価の抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、または４価以上の抗体（例、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体）であってもよい。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、所定の糖鎖が付加された抗体（例、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列等の糖鎖結合コンセンサス配列を有するように改変された抗体）、二重特異性抗体、Ｆｃ領域タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。モノクローナル抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。本発明では、モノクローナル抗体として、全長抗体、または可変領域ならびにＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインを含む抗体断片を利用できるが、全長抗体が好ましい。抗体は、好ましくはヒトＩｇＧモノクローナル抗体であり、より好ましくはヒトＩｇＧ全長モノクローナル抗体である。
　抗体の抗原としては、任意の抗原を用いることができる。例えば、このような抗原としては、タンパク質〔オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。糖等の生体分子で修飾されたタンパク質（例、糖タンパク質）であってもよい〕、糖鎖、核酸、低分子化合物が挙げられる。好ましくは、抗体は、タンパク質を抗原とする抗体であってもよい。タンパク質としては、例えば、細胞膜受容体、細胞膜受容体以外の細胞膜タンパク質（例、細胞外基質タンパク質）、リガンド、可溶性受容体が挙げられる。
　より具体的には、抗体の抗原であるタンパク質は、疾患標的タンパク質であってもよい。疾患標的タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる。
（１）がん領域
　ＰＤ－Ｌ１、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲα（血小板由来成長因子受容体）、ＣＤ２２、ＨＥＲ２、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＥｐＣＡＭ、フィブロネクチン、ＰＤ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ３３、ＨＧＦ、ｇｐＮＭＢ、ＣＤ２７、ＤＥＣ－２０５、葉酸受容体、ＣＤ３７、ＣＤ１９、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、Ｓ１Ｐ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ－１Ｒ、ＤＬＬ４、ＴＮＴ－１／Ｂ、ＣＰＡＡｓ、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ３０、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３８、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１，２，、ＮＫＧ２Ａ、ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＣＴＬＡ－４、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ１３８、ｃ－Ｍｅｔ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＣＤ７９ｂ、ＥＮＰＤ３、葉酸受容体α、ＴＥＭ－１、ＧＭ２、グリピカン３、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ、ＣＤ７４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＣＤ３７、ＴＬＲ－２、ＣＤ３、ＣＳＦ－１Ｒ、ＦＧＦＲ２ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥｐｈＡ３、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１２３、ｇｐＡ３３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体、ＤＬＬ４、ＶＥＧＦ、ＲＳＰＯ、ＬＩＶ－１、ＳＬＩＴＲＫ６、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、ＣＤ２５、ＭＥＴ、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ、ＩＬ－８、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、ＫＩＲ３ＤＬ２、Ｂｓｔ１（ＣＤ１５７）、Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡ、ＧＩＴＲ、ＴＡＭ（ｔｕｍｏｒ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、Ａｎｇ２、ＣＤ７３、ＦＧＦＲ２、ＣＸＣＲ４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、Ｆｕｃｏｓｙｌ　ＧＭ１、ＩＧＦ－１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ　２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＦＧＦＲ３、ＯＸ４０、ＢＣＭＡ、ＥｒｂＢ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＰＴＫ７、ＥＦＮＡ４、ＦＡＰ、ＤＲ５、ＣＥＡ、Ｌｙ６Ｅ、ＣＡ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＬＡＭＰ１、ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ、ＥＰＨＡ２、ＤＲ５、Ｂ７－Ｈ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ２、α２－ＰＩ、Ａ３３、ＧＤＦ１５、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６６、ＲＯＲ１、ＧＩＴＲ、ＢＣＭＡ、ＴＢＡ、ＬＡＧ－３、ＥｐｈＡ２、ＴＩＭ－３、ＣＤ－２００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＰＩＧＦ、Ａｘｌ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ、ＣＤ３９、ＣＤ３７、ＣＤ７３、ＣＬＥＣ１２Ａ、Ｌｇｒ３、トランスフェリン受容体、ＴＧＦβ、ＩＬ－１７、５Ｔ４、ＲＴＫ、Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮａＰｉ２ｂ、ルイス血液型Ｂ抗原、Ａ３４、Ｌｙｓｉｌ－Ｏｘｉｄａｓｅ、ＤＬＫ－１、ＴＲＯＰ－２、α９インテグリン、ＴＡＧ－７２（ＣＡ７２－４）、ＣＤ７０
（２）自己免疫疾患・炎症性疾患
　ＩＬ－１７、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＮＦ－α、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＡｃｔＲＩＩＢ、β７－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＩＬ－４αＲ、ＨＡＳ、Ｅｏｔａｘｉｎ－１、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１５、ＣＤ３ε、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１α、ＩＬ－１７、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＬＡＭＰ（Ａｌｐｈａ４　Ｂｅｔａ　７　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＴＳＬＰ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＴＬＲ－３、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＭＡｄＣＡＭ、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ－３３、ＣＤ７４、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＤ２８、ＴＬＲ４、ＭＣＡＭ、Ｂ７ＲＰ１、ＣＸＣＲ１，２　Ｌｉｇａｎｄｓ、ＩＬ－２１、Ｃａｄｈｅｒｉｎ－１１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＩＬ－３６Ｒ、ＩＬ－１０Ｒ、ＣＤ８６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－７Ｒ、Ｋｖ１．３、α９インテグリン、ＬＩＦＨＴ
（３）脳神経疾患
　ＣＧＲＰ、ＣＤ２０、βアミロイド、βアミロイドプロトフィブリン、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ　Ｇｅｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＩＮＧＯ（Ｉｇ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１）、αシヌクレイン、細胞外ｔａｕ、ＣＤ５２、インスリン受容体、ｔａｕタンパク、ＴＤＰ－４３、ＳＯＤ１、ＴａｕＣ３、ＪＣウイルス
（４）感染症
　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ｔｏｘｉｎ　Ｂ、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、ＬＰＳ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ　Ａｌｐｈａ－ｔｏｘｉｎ、Ｍ２ｅタンパク、Ｐｓｌ、ＰｃｒＶ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ　ｔｏｘｉｎ、インフルエンザＡ、Ａｌｇｉｎａｔｅ、黄色ブドウ球菌、ＰＤ－Ｌ１、インフルエンザＢ、アシネトバクター、Ｆ－ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｎｖ、ＣＤ３、病原性大腸菌、クレブシエラ、肺炎球菌
（５）遺伝性・希少疾患
　アミロイドＡＬ、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、インスリン受容体、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＦＧＦ２３、副腎皮質刺激ホルモン、トランスサイレチン、ハンチンチン
（６）眼疾患
　Ｆａｃｔｏｒ　Ｄ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＰＧＤＦＲ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＣＤ－１０５（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＩＧＦ－１Ｒ、βアミロイド
（７）骨・整形外科領域
　Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１、ＧＤＦ８、ＲＮＡＫＬ、ＨＡＳ、Ｓｉｇｌｅｃ－１５
（８）血液疾患
　ｖＷＦ、Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸａ、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘ、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＢＭＰ－６、Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ、ＴＦＰＩ
（９）その他の疾患
　ＢＡＦＦ（Ｂ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ－１β、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、ＣＤ４５、ＴＬＲ－２、ＧＬＰ－１、ＴＮＦＲ１、Ｃ５、ＣＤ４０、ＬＰＡ、プロラクチン受容体、ＶＥＧＦＲ－１、ＣＢ１、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＰＴＨ１Ｒ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１β、ＡＴ２－Ｒ、ＩＡＰＰ
　モノクローナル抗体の具体例としては、特定のキメラ抗体（例、リツキシマブ、バシリキシマブ、インフリキシマブ、セツキシマブ、シルツキシマブ、ディヌツキシマブ、オルタトキサシマブ）、特定のヒト化抗体（例、ダクリヅマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、アレンツズマブ、オマリヅマブ、エファリヅマブ、ベバシヅマブ、ナタリヅマブ（ＩｇＧ４）、トシリヅマブ、エクリヅマブ（ＩｇＧ２）、モガムリヅマブ、ペルツヅマブ、オビヌツヅマブ、ベドリヅマブ、ペンプロリヅマブ（ＩｇＧ４）、メポリヅマブ、エロツヅマブ、ダラツムマブ、イケセキヅマブ（ＩｇＧ４）、レスリヅマブ（ＩｇＧ４）、アテゾリヅマブ）、特定のヒト抗体（例、アダリムマブ（ＩｇＧ１）、パニツムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、オファツムマブ、デノスマブ（ＩｇＧ２）、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、デュピルマブ（ＩｇＧ４）、セクキヌマブ、エボロクマブ（ＩｇＧ２）、アリロクマブ、ネシツムマブ、ブロダルマブ（ＩｇＧ２）、オララツマブ）が挙げられる（ＩｇＧサブタイプに言及していない場合、ＩｇＧ１であることを示す）。
　抗体中のリジン残基の位置、および重鎖の定常領域の位置（例、ＣＨ２ドメイン）についてはＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌを参照）。したがって、ヒトＩｇＧを対象とする場合、２８８位のリジン残基は、ヒトＩｇＧ　ＣＨ２領域の５８番目の残基に相当し、２９０位のリジン残基は、ヒトＩｇＧ　ＣＨ２領域の６０番目の残基に相当する。２８８／２９０位の表記は、２８８位または２９０位のリジン残基が対象であることを示す。
　本発明によれば、抗体における２８８／２９０位のリジン残基を位置選択的に修飾することができる。本明細書において、「位置選択的」または「位置選択性」とは、抗体において特定のアミノ酸残基が特定の領域に偏在していないにもかかわらず、抗体中の特定のアミノ酸残基と結合できる所定の構造単位が、抗体中の特定の領域に偏在することをいう。したがって、「位置選択的に有する」、「位置選択的な結合」、「位置選択性での結合」等の位置選択性に関連する表現は、１個以上の特定のアミノ酸残基を含む標的領域における所定の構造単位の保有率または結合率が、標的領域における当該特定のアミノ酸残基と同種である複数個のアミノ酸残基を含む非標的領域における当該構造単位の保有率または結合率よりも有意なレベルで高いことを意味する。このような位置選択性は、５０％以上であり、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％であってもよい。本発明によれば、ペプチドを含有するリンカーを利用せずに、２８８／２９０位のリジン残基を位置選択的に修飾することができる。ペプチド部分は、潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易い。したがって、ペプチド部分を含むリンカーの使用の回避は、臨床応用において望ましいものである。
　本発明では、抗体における２８８／２９０位のリジン残基が位置選択的に修飾されている限り、他の位置の特定のアミノ酸残基がさらに位置選択的に修飾されていてもよい。例えば、抗体における所定の位置の特定のアミノ酸残基を位置選択的に修飾する方法は、国際公開第／２０１８／１９９３３７号、国際公開第２０１９／２４０２８８号、国際公開第２０１９／２４０２８７号、および国際公開第２０２０／０９０９７９号に記載されている。このような特定のアミノ酸残基としては、修飾し易い側鎖（例、アミノ基、カルボキシ基、アミド基、ヒドロキシ基、チオール基）を有するアミノ酸残基（例、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、スレオニン残基、セリン残基、チロシン残基、システイン残基）を利用できるが、好ましくは、アミノ基を含む側鎖を有するリジン残基、ヒドロキシ基を含む側鎖を有するチロシン残基、セリン残基、およびスレオニン残基、またはチオール基を含む側鎖を有するシステイン残基であり、より好ましくは、リジン残基であり、さらにより好ましくは、２４６／２４８位のリジン残基、または３１７位のリジン残基であり、特に好ましくは２４６／２４８位のリジン残基である。２４６／２４８位の表記は、２４６位または２４８位のリジン残基が対象であることを示す。
　本発明において、用語「塩」としては、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、およびアミノ酸との塩が挙げられる。無機酸との塩としては、例えば、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸との塩が挙げられる。有機酸との塩としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、シュウ酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）、および亜鉛、アルミニウム等の他の金属、ならびにアンモニウムとの塩が挙げられる。有機塩基との塩としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、プロピレンジアミン、エチレンジアミン、ピリジン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンとの塩が挙げられる。アミノ酸との塩としては、例えば、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン）、および酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩が挙げられる。塩は、好ましくは、無機酸（例、塩化水素）との塩、または有機酸（例、トリフルオロ酢酸）との塩である。
２．化合物またはその塩
　本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 〔式中、
　Ｘは、脱離基を示し、
　Ｙは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
　Ｏは、酸素原子を示し、
　Ｓは、硫黄原子を示し、
　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
　Ｌａは、第１リンカーを示し、
　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕
　本発明に関連して提示される式（Ｉ）および他の式において、－（ハイフン）は、その両側に存在する２つの単位が共有結合していることを示す。したがって、式（Ｉ）では、Ｘは、カルボニル基を構成する炭素原子と共有結合しており、Ｌａは、カルボニル基を構成する炭素原子、およびＳと共有結合しており、Ｓは、Ｌａ、およびカルボニル基を構成する炭素原子と共有結合しており、Ｌｂは、両隣に存在する２個のカルボニル基を構成する２個の炭素原子と共有結合しており、Ｙは、カルボニル基を構成する炭素原子と共有結合している。
　Ｘにより示される脱離基は、Ｘに隣接するカルボニル基の炭素原子とアミノ基との間の反応により脱離できる基である。当業者であれば、このような脱離基を適宜設定することができる。このような脱離基としては、例えば、以下が挙げられる：
（ａ）Ｒ－Ｓ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｓは、硫黄原子を示す。）；
（ｂ）Ｒ－Ｏ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｏは、酸素原子を示す。）；
（ｃ）ＲＡ－（ＲＢ－）Ｎ（ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｎは、窒素原子を示す。）；または
（ｄ）ハロゲン原子。
　好ましくは、Ｘにより示される脱離基は、下記であってもよい：
（ａ）Ｒ－Ｓ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｓは、硫黄原子を示す。）；
（ｂ）Ｒ－Ｏ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｏは、酸素原子を示す。）；または
（ｃ）ＲＡ－（ＲＢ－）Ｎ（ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示す。）；であってもよい。
　より好ましくは、Ｘにより示される脱離基は、下記であってもよい：
（ａ）Ｒ－Ｓ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｓは、硫黄原子を示す。）；または
（ｂ）Ｒ－Ｏ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｏは、酸素原子を示す。）。
　さらにより好ましくは、Ｘにより示される脱離基は、下記であってもよい：
（ａ）Ｒ－Ｓ（ここで、Ｒは、置換基を有していてもよい１価の芳香族炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の芳香族複素環基を示し、Ｓは、硫黄原子を示す。）。
　特に好ましくは、Ｘにより示される脱離基は、下記であってもよい：
（ａ’）Ｒ－Ｓ（ここで、Ｒは、置換基を有していてもよい１価の芳香族炭化水素基（例、フェニル）を示し、Ｓは、硫黄原子を示す。）。
　ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
　１価の炭化水素基としては、例えば、１価の鎖状炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基、および１価の芳香族炭化水素基が挙げられる。
　１価の鎖状炭化水素基とは、鎖状構造のみで構成された炭化水素基を意味し、主鎖に環状構造を含まない。ただし、鎖状構造は直鎖状であっても分岐状であってもよい。１価の鎖状炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルが挙げられる。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、直鎖状、または分岐状のいずれであってもよい。
　アルキルとしては、炭素原子数１～１２のアルキルが好ましく、炭素原子数１～６のアルキルがより好ましく、炭素原子数１～４のアルキルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数１～１２のアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシルが挙げられる。
　アルケニルとしては、炭素原子数２～１２のアルケニルが好ましく、炭素原子数２～６のアルケニルがより好ましく、炭素原子数２～４のアルケニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２～１２のアルケニルとしては、例えば、ビニル、プロペニル、ｎ－ブテニルが挙げられる。
　アルキニルとしては、炭素原子数２～１２のアルキニルが好ましく、炭素原子数２～６のアルキニルがより好ましく、炭素原子数２～４のアルキニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２～１２のアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ｎ－ブチニルが挙げられる。
　１価の鎖状炭化水素基としては、アルキルが好ましい。
　１価の脂環式炭化水素基とは、環構造として脂環式炭化水素のみを含み、芳香族環を含まない炭化水素基を意味し、脂環式炭化水素は単環、多環のいずれであってもよい。ただし、脂環式炭化水素のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造を含んでいてもよい。１価の脂環式炭化水素基としては、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルが挙げられ、これらは、単環、多環のいずれであってもよい。
　シクロアルキルとしては、炭素原子数３～１２のシクロアルキルが好ましく、炭素原子数３～６のシクロアルキルがより好ましく、炭素原子数５～６のシクロアルキルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３～１２のシクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
　シクロアルケニルとしては、炭素原子数３～１２のシクロアルケニルが好ましく、炭素原子数３～６のシクロアルケニルがより好ましく、炭素原子数５～６のシクロアルケニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３～１２のシクロアルケニルとしては、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルが挙げられる。
　シクロアルキニルとしては、炭素原子数３～１２のシクロアルキニルが好ましく、炭素原子数３～６のシクロアルキニルがより好ましく、炭素原子数５～６のシクロアルキニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３～１２のシクロアルキニルとしては、例えば、シクロプロピニル、シクロブチニル、シクロペンチニル、シクロヘキシニルが挙げられる。
　１価の脂環式炭化水素基としては、シクロアルキルが好ましい。
　１価の芳香族炭化水素基とは、芳香族環構造を含む炭化水素基を意味する。ただし、芳香族環のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造や脂環式炭化水素を含んでいてもよく、芳香族環は単環、多環のいずれであってもよい。１価の芳香族炭化水素基としては、炭素原子数６～１２のアリールが好ましく、炭素原子数６～１０のアリールがより好ましく、炭素原子数６のアリールがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数６～１２のアリールとしては、例えば、フェニル、ナフチルが挙げられる。
　１価の芳香族炭化水素基としては、フェニルが好ましい。
　これらの中でも、１価の炭化水素基としては、アルキル、シクロアルキル、アリールが好ましい。
　１価の複素環基とは、複素環式化合物の複素環から水素原子１個を除いた基をいう。１価の複素環基は、１価の芳香族複素環基、または１価の非芳香族複素環基である。複素環基を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
　１価の芳香族複素環基としては、炭素原子数１～１５の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数１～９の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数１～６の芳香族複素環基がさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インドリル、プリニル、アントラキノリル、カルバゾニル、フルオレニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、及びフタラジニルが挙げられる。
　１価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数２～１５の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数２～９の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数２～６の非芳香族複素環基がさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の非芳香族複素環基としては、例えば、オキシラニル、アジリジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ジヒドロオキサジニル、テトラヒドロオキサジニル、ジヒドロピリミジニル、及びテトラヒドロピリミジニルが挙げられる。
　これらの中でも、１価の複素環基としては、５員または６員の複素環基が好ましい。
　上記Ｒ、ＲＡ、およびＲＢで示される「置換基を有していてもよい１価の炭化水素基」、および「置換基を有していてもよい１価の複素環基」における「置換基」の個数は、例えば１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１もしくは２個であってもよい。このような置換基としては、例えば、以下が挙げられる：
（ｉ）ハロゲン原子；
（ｉｉ）１価の炭化水素基；
（ｉｉｉ）１価の複素環基；
（ｉｖ）アラルキル；
（ｖ）Ｒａ－Ｏ－、Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒａ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒａは、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；または
（ｖｉ）ＮＲｂＲｃ－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｂ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｃ－（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；
（ｖｉｉ）ニトロ基、硫酸基、スルホン酸基、シアノ基、およびカルボキシル基。
　上記置換基におけるハロゲン原子、１価の炭化水素基、および１価の複素環基の定義、例、および好ましい例は、それぞれ、上記Ｒ、ＲＡ、およびＲＢにおいて説明した１価の炭化水素基、および１価の複素環基のものと同様である。
　アラルキルとは、アリールアルキルをいう。アリールアルキルにおけるアリールおよびアルキルの定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。アラルキルとしては、炭素原子数３～１５のアラルキルが好ましい。このようなアラルキルとしては、例えば、ベンゾイル、フェネチル、ナフチルメチル、ナフチルエチルが挙げられる。
　好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ）ハロゲン原子；
（ｉｉ）炭素原子数１～１２のアルキル、フェニル、もしくはナフチル；
（ｉｉｉ）炭素原子数３～１５のアラルキル；
（ｉｖ）５員または６員の複素環；
（ｖ）Ｒａ－Ｏ－、Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒａ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；
（ｖｉ）ＮＲｂＲｃ－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｂ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｃ－（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；または
（ｖｉｉ）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
　より好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ）ハロゲン原子；
（ｉｉ）炭素原子数１～１２のアルキル；
（ｉｉｉ）Ｒａ－Ｏ－、Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒａ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；
（ｉｖ）ＮＲｂＲｃ－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｂ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｃ－（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；または
（ｖ）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
　さらにより好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ）ハロゲン原子；
（ｉｉ）炭素原子数１～６のアルキル；
（ｉｉｉ）Ｒａ－Ｏ－、Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒａ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１～６のアルキルを示す。）；
（ｉｖ）ＮＲｂＲｃ－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｂ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｃ－（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～６のアルキルを示す。）；または
（ｖ）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
　特に好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ）ハロゲン原子；
（ｉｉ）炭素原子数１～４のアルキル；
（ｉｉｉ）Ｒａ－Ｏ－、Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒａ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１～４のアルキルを示す。）；
（ｉｖ）ＮＲｂＲｃ－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｂＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｂ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｃ－（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～４のアルキルを示す。）；または
（ｖ）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
　Ｙにより示される親和性ペプチドは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する。親和性ペプチドとしては、イムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する任意のペプチドを用いることができる。親和性ペプチドは、Ｙに隣接するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）と結合可能な部分（例、アミノ基、ヒドロキシ基）を含む側鎖を含むアミノ酸残基（例、リジン残基、プロリン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基）を含み、かつリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｙに隣接するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）とアミド結合を形成していてもよい。好ましくは、親和性ペプチドは、リジン残基を含み、かつリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｙに隣接するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）とアミド結合を形成していてもよい。このような親和性ペプチドとしては、例えば、国際公開第２０１６／１８６２０６号、国際公開第／２０１８／１９９３３７号、国際公開第２０１９２４０２８８号、国際公開第２０１９／２４０２８７号、および国際公開第２０２０／０９０９７９号、ならびにこれらの国際公開公報中で引用されている文献中に開示される種々の親和性ペプチドを用いることができる。
　好ましくは、親和性ペプチドは、以下であってもよい：
（Ａ）ＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；または
（Ｂ）ＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および付加からなる群より選ばれる１～５個（すなわち、１個、２個、３個、４個、または５個）のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列（ここで、２７位のリジン残基、ならびに１位および３０位の２つのシステイン残基は維持される）を含む親和性ペプチド。
　配列番号１のアミノ酸配列を含む親和性ペプチドは、イムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する好適なペプチドであるため、本発明では、このような親和性ペプチドの使用が好ましい。
　上記親和性ペプチドのＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基は、保護されていてもよい。また、上記親和性ペプチドにおける２つのシステイン残基（Ｃ）の側鎖のチオール基は、ジスルフィド結合により、またはリンカーを介して連結されていてもよい。
　好ましくは、（Ｂ）の親和性ペプチドは、以下からなる群より選ばれるものであってもよい：
（ａ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｂ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＤＣ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｃ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｄ）ＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
（ｅ）ＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；および
（ｆ）ＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド。
　上記親和性ペプチドのＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基は、保護されていてもよい。また、上記親和性ペプチドにおける２つのシステイン残基（Ｃ）の側鎖のチオール基は、ジスルフィド結合により、またはリンカーを介して連結されていてもよい。
　上記親和性ペプチドの各アミノ酸配列中の離間した少なくとも２つのシステイン残基は、ジスルフィド結合により環状ペプチドを形成することができる。あるいは、上記ペプチドにおいて、２つのシステイン残基中のチオール基は、以下で表されるカルボニル基含有リンカーにより連結されていてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　上記で表されるカルボニル基含有リンカーの破線部分は、チオール基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。このようなペプチドは、例えば、国際公開第２０１６／１８６２０６号に記載される方法により、調製することができる。
　上記親和性ペプチドを構成するアミノ酸はＬ体またはＤ体のいずれであってもよいが、Ｌ体が好ましい（実施例ではペプチドを構成するアミノ酸残基は全てＬ体である）。上記親和性ペプチドは、架橋剤により特定のアミノ酸残基が修飾されて、式（Ｉ）の化合物またはその塩と連結されていてもよい。このような特定のアミノ酸残基としては、例えば、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基が挙げられるが、好ましくは、リジン残基である。架橋剤としては、例えば、ＤＳＧ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ、ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｂｅｒａｔｅ、ジスクシンイミジルスベレート）等のスクシンイミジル基を好ましくは２以上含む架橋剤、ＤＭＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ・２　ＨＣｌ、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びＤＭＳ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ・２　ＨＣｌ、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）等のイミド酸部分を好ましくは２以上含む架橋剤、並びにＤＴＢＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　３，３’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ、３，３’－ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）及びＤＳＰ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）等のＳＳ結合を有する架橋剤が挙げられる（例、国際公開第２０１６／１８６２０６号）。
　上記親和性ペプチドは、末端にあるアミノ基およびカルボキシ基が保護されていてもよい。Ｎ－末端アミノ基の保護基としては、例えば、アルキルカルボニル基（アシル基）（例、アセチル基、プロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基等のブトキシカルボニル基）、アルキルオキシカルボニル基（例、フルオレニルメトキシカルボニル基）、アリールオキシカルボニル基、アリールアルキル（アラルキル）オキシカルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル基）が挙げられる。Ｎ－末端アミノ基の保護基としては、アセチル基が好ましい。Ｎ－末端アミノ酸がグルタミン酸である場合、保護されたＮ－末端のグルタミン酸は、ピログルタミン酸の環状構造を有していてもよい。また、Ｎ－末端アミノ酸がグルタミンである場合、保護されたＮ－末端のグルタミンは、ピログルタミン酸型の環状構造を有していてもよい。Ｃ－末端カルボキシ基の保護基としては、例えば、エステルまたはアミドを形成可能な基が挙げられる。エステルまたはアミドを形成可能な基としては、例えば、アルキルオキシ基（例、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ）、アリールオキシ基（例、フェニルオキシ、ナフチルオキシ）、アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、アミノ基が挙げられる。Ｃ－末端カルボキシ基の保護基としては、アミノ基が好ましい。
　ＬａおよびＬｂによりそれぞれ示される第１リンカーおよび第２リンカーは、式（Ｉ）の化学構造から理解されるように２価の基である。第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計は、５～７個である。このような原子数を有する第１リンカーおよび第２リンカーの使用により、イムノグロブリン単位中の重鎖の２８８／２９０位のリジン残基を親和性ペプチド含有基で位置選択的に修飾でき、しかも抗体と親和性ペプチド含有基との結合の平均比率を所望の範囲（１．５～２．５）に高度に制御することが容易になる。本発明では、抗体と所定の基（例、親和性ペプチド含有基）との結合の平均比率は、ＭＳ分析データをＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）により解析することで確認することができる。
　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が５～７個であることに照らすと、第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数は１～６個であり、第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数は１～６個である。より具体的には、第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の関係は、以下である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
　第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖は、鎖状構造、もしくは環状構造、またはこれらの組合せを含む構造から構成される。主鎖が環状構造を含まない鎖状構造である場合、主鎖の原子数は、鎖状構造中の原子数を数えることにより決定することができる。一方、主鎖が環状構造を含む構造である場合、環状構造を構成する所定の原子数を、主鎖の原子数として数えることにより決定することができる。具体的には、環状構造における主鎖の原子数は、環状構造中の２つの結合手を連絡する最短経路の原子数を数えることにより決定することができる（例えば、以下（ａ）～（ｄ）の太字経路を参照）。主鎖が、鎖状構造および環状構造の組合せを含む構造である場合、主鎖の原子数は、環状構造を含まない鎖状構造中の原子数を、環状構造中の２つの結合手を連絡する最短経路の原子数と合算することにより決定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 ・は、結合手である。
（ａ）の場合、最短経路は太字経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環状構造中の原子数は、２である。
（ｂ）の場合、最短経路は太字経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環状構造中の原子数は、３である。
（ｃ）の場合、いずれの経路も最短経路（等距離）であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環状構造中の原子数は、４である。
（ｄ）の場合、縮合部位の経路が最短経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環状構造中の原子数は、４である。
　第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖は、上記のような主鎖を構成する原子数が１～６個となるように設定される。したがって、第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖は、２価の直鎖炭化水素基、２価の環状炭化水素基、２価の複素環基、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－ＮＲｄ－（Ｒｄは水素原子、または置換基を示す。）、－Ｏ－、－Ｓ－、またはこれらの２以上（例、２または３）の組み合わせからなる基から構成されるものであってもよい。
　２価の直鎖炭化水素基は、直鎖アルキレン、直鎖アルケニレン、または直鎖アルキニレンである。
　直鎖アルキレンは、炭素原子数１～６の直鎖アルキレンであり、炭素原子数１～４の直鎖アルキレンが好ましい。直鎖アルキレンとしては、例えば、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、ｎ－ブチレン、ｎ－ペンチレン、ｎ－へキシレンが挙げられる。
　直鎖アルケニレンは、炭素原子２～６の直鎖アルケニレンであり、炭素原子数２～４の直鎖アルケニレンが好ましい。直鎖アルケニレンとしては、例えば、エチレニレン、ｎ－プロピニレン、ｎ－ブテニレン、ｎ－ペンテニレン、ｎ－へキセニレンが挙げられる。
　直鎖アルキニレンは、炭素原子数２～６の直鎖アルキニレンであり、炭素原子数２～４の直鎖アルキニレンが好ましい。直鎖アルキニレンとしては、例えば、エチニレン、ｎ－プロピニレン、ｎ－ブチニレン、ｎ－ペンチニレン、ｎ－へキシニレンが挙げられる。
　２価の直鎖炭化水素基としては、直鎖アルキレンが好ましい。
　２価の環状炭化水素基は、アリーレン、または２価の非芳香族環状炭化水素基である。このような２価の環状炭化水素基において２つの結合手を適宜設定することで、上記のような主鎖を構成する原子数が１～６個となるように設定することができる（以下、環状構造を有する基について同様）。
　アリーレンとしては、炭素原子数６～１４のアリーレンが好ましく、炭素原子数６～１０のアリーレンがより好ましく、炭素原子数６のアリーレンが特に好ましい。アリーレンとしては、例えば、フェニレン、ナフチレン、アントラセニレンが挙げられる。
　２価の非芳香族環状炭化水素基としては、炭素原子数３～１２の単環式または多環式である２価の非芳香族環状炭化水素基が好ましく、炭素原子数４～１０の単環式または多環式である２価の非芳香族環状炭化水素基がより好ましく、炭素原子数５～８の単環式である２価の非芳香族環状炭化水素基が特に好ましい。２価の非芳香族環状炭化水素基としては、例えば、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロへキシレン、シクロへプチレン、シクロオクチレンが挙げられる。
　２価の環状炭化水素基としては、アリーレンが好ましい。
　２価の複素環基は、２価の芳香族複素環基、または２価の非芳香族複素環基である。複素環を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子およびケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
　２価の芳香族複素環基としては、炭素原子数３～１５の２価の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数３～９の２価の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数３～６の２価の芳香族複素環基が特に好ましい。２価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジイル、フランジイル、チオフェンジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアジンジイル、ピラゾールジイル、イミダゾールジイル、チアゾールジイル、イソチアゾールジイル、オキサゾールジイル、イソオキサゾールジイル、トリアゾールジイル、テトラゾールジイル、インドールジイル、プリンジイル、アントラキノンジイル、カルバゾールジイル、フルオレンジイル、キノリンジイル、イソキノリンジイル、キナゾリンジイル、およびフタラジンジイルが挙げられる。
　２価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数３～１５の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数３～９の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数３～６の非芳香族複素環基が特に好ましい。２価の非芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジオンジイル、ピロリンジオンジイル、オキシランジイル、アジリジンジイル、アゼチジンジイル、オキセタンジイル、チエタンジイル、ピロリジンジイル、ジヒドロフランジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキソランジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、ピロリンジイル、イミダゾリジンジイル、オキサゾリジンジイル、ピペリジンジイル、ジヒドロピランジイル、テトラヒドロピランジイル、テトラヒドロチオピランジイル、モルホリンジイル、チオモルホリンジイル、ピペラジンジイル、ジヒドロオキサジンジイル、テトラヒドロオキサジンジイル、ジヒドロピリミジンジイル、およびテトラヒドロピリミジンジイルが挙げられる。
　２価の複素環基としては、２価の芳香族複素環基が好ましい。
　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、好ましくは酸素原子を示す。
　ＬａおよびＬｂは、それぞれ、第１リンカーおよび第２リンカーを示す。第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖は、炭素原子のみから構成されていてもよく、または炭素原子およびヘテロ原子（例、酸素原子、窒素原子、硫黄原子）の組合せから構成されていてもよいが、有機合成の容易さおよび安定性の向上等の観点より、炭素原子のみから構成されていてもよい。特定の場合、第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖は、２価の直鎖炭化水素基、２価の環状炭化水素基、２価の複素環基、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、またはこれらの２以上（例えば２～４、好ましくは２または３）の組み合わせからなる基から構成されていてもよい。
　特定の実施形態では、Ｌａにより示される第１リンカーにおける主鎖は、上記のような主鎖を構成する原子数が２～４個となるように設定されることが好ましい。この場合、Ｌｂにより示される第２リンカーにおける主鎖は、上記のような主鎖を構成する原子数が１～５個となるように設定されることが好ましい。
　別の特定の実施形態では、Ｌａにより示される第１リンカーにおける主鎖は、上記のような主鎖を構成する原子数が２個となるように設定されることが好ましい。この場合、Ｌｂにより示される第２リンカーにおける主鎖は、上記のような主鎖を構成する原子数が３～５個となるように設定されることが好ましい。
　Ｌａにより示される第１リンカーにおける主鎖は、２価の直鎖炭化水素基、２価の環状炭化水素基、または２価の複素環基から構成されることが好ましい。Ｌａがチオール基導入抗体誘導体、ならびに抗体および機能性物質のコンジュゲートに含まれる部分であるため、チオール基導入抗体誘導体およびコンジュゲートは、２価の直鎖炭化水素基、２価の環状炭化水素基、および２価の複素環基に比し相対的に安定性が低い（すなわち、反応性が高い）－Ｃ（＝Ｏ）－および－Ｃ（＝Ｓ）－を含まないことが好ましいためである。Ｌａがチオール基導入抗体誘導体に含まれる部分であり、チオール基導入抗体誘導体のチオール基と機能性物質との反応に干渉しないように立体障害が低い基であることが好ましいこと、および有機合成が容易であることに照らすと、Ｌａにより示される第１リンカーにおける主鎖は、炭素原子数２～４の２価の直鎖炭化水素基から構成されることがより好ましい。Ｌａにより示される第１リンカーにおける主鎖は、エチレン基、プロピレン基、またはブチレン基であることがさらにより好ましく、エチレン基であることが特に好ましい。
　一方、Ｌｂにより示される第２リンカーにおける主鎖は、抗体中間体には含まれるものの、抗体中間体から製造されるチオール基導入抗体誘導体、ならびに抗体および機能性物質のコンジュゲートには含まれない部分であるため、主鎖の安定性は問題となり難い。また、チオール基導入抗体誘導体を抗体中間体から製造する場合、チオカルボニル基（Ｓ－Ｃ＝Ｏ）におけるチオ基とカルボニル基との間で切断されて生じたチオール基は抗体に残存するものの、Ｃ（＝Ｗ）－Ｌｂ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｙで表される第２リンカー含有構造単位は抗体に残存しないため、この第２リンカーは、当該製造において分解されても支障はない。すなわち、第２リンカーにおける主鎖は、第１リンカーにおける主鎖と異なり、その安定性が問題となり難い。したがって、第２リンカーにおける主鎖は、２価の直鎖炭化水素基、２価の環状炭化水素基、２価の複素環基、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－ＮＲｄ－（Ｒｄは水素原子、または置換基を示す。）、－Ｏ－、－Ｓ－、またはこれらの２以上（例、２または３）の組み合わせからなる基から好適に構成することができる。第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数は、好ましくは１～５個であり、より好ましくは３～５個である。
　好ましくは、Ｌｂにより示される第２リンカーにおける主鎖は、合成の容易さ等の観点より、２価の直鎖炭化水素基、２価の環状炭化水素基、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－ＮＲｄ－（Ｒｄは水素原子、または置換基を示す。）、－Ｏ－、－Ｓ－、またはこれらの２以上（例、２または３）の組み合わせからなる基から構成されていてもよい。第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数は、好ましくは１～５個であり、より好ましくは３～５個である。
　より好ましくは、Ｌｂにより示される第２リンカーにおける主鎖は、２価の直鎖炭化水素基、２価の環状炭化水素基、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、またはこれらの２以上（例、２または３）の組み合わせから構成されていてもよい。第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数は、好ましくは１～５個であり、より好ましくは３～５個である。
　さらにより好ましくは、Ｌｂにより示される第２リンカーにおける主鎖は、直鎖アルキレン、アリーレン、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、またはこれらの２以上（例、２または３）の組み合わせから構成されていてもよい。第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数は、好ましくは１～５個であり、より好ましくは３～５個である。
　特に好ましくは、Ｌｂにより示される第２リンカーにおける主鎖は、プロピレン、またはｍ－フェニレンであってもよい。
　第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖を構成する基は、例えば１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していてもよい。また、第１リンカーおよび第２リンカーにおける主鎖を構成する基の一つである上記Ｒｄは、上記のとおり、置換基を示すことがある。このような置換基としては、例えば、以下が挙げられる：
（ｉ’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’）１価の炭化水素基；
（ｉｉｉ’）アラルキル；
（ｉｖ’）１価の複素環基；
（ｖ’）Ｒｅ－Ｏ－、Ｒｅ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒｅ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒｅは、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；または
（ｖｉ’）ＮＲｆＲｇ－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｆ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｇ－（ＲｆおよびＲｇは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；
（ｖｉｉ’）ニトロ基、硫酸基、スルホン酸基、シアノ基、およびカルボキシル基。
　上記置換基におけるハロゲン原子、１価の炭化水素基、アラルキル、および１価の複素環基の定義、例、および好ましい例は、それぞれ、上記Ｒ、ＲＡ、およびＲＢおよび上記（ｉ）～（ｉｖ）において説明したハロゲン原子、１価の炭化水素基、アラルキル、および１価の複素環基のものと同様である。
　好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’）炭素原子数１～１２のアルキル、フェニル、もしくはナフチル；
（ｉｉｉ’）炭素原子数３～１５のアラルキル；
（ｉｖ’）５員または６員の複素環；
（ｖ’）Ｒｅ－Ｏ－、Ｒｅ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒｅ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒｅは、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；
（ｖｉ’）ＮＲｆＲｇ－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｆ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｇ－（ＲｆおよびＲｇは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；または
（ｖｉｉ’）上記（ｖｉｉ’）で列挙したものと同じ基。
　より好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’）炭素原子数１～１２のアルキル；
（ｉｉｉ’）Ｒｅ－Ｏ－、Ｒｅ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒｅ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒｅは、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；
（ｉｖ’）ＮＲｆＲｇ－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｆ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｇ－（ＲｆおよびＲｇは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～１２のアルキルを示す。）；または
（ｖ’）上記（ｖｉｉ’）で列挙したものと同じ基。
　さらにより好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’）炭素原子数１～６のアルキル；
（ｉｉｉ’）Ｒｅ－Ｏ－、Ｒｅ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒｅ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒｅは、水素原子、もしくは炭素原子数１～６のアルキルを示す。）；
（ｉｖ’）ＮＲｆＲｇ－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｆ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｇ－（ＲｆおよびＲｇは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～６のアルキルを示す。）；または
（ｖ’）上記（ｖｉｉ’）で列挙したものと同じ基。
　特に好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’）炭素原子数１～４のアルキル；
（ｉｉｉ’）Ｒｅ－Ｏ－、Ｒｅ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｒｅ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、もしくはＲｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－（Ｒｅは、水素原子、もしくは炭素原子数１～４のアルキルを示す。）；
（ｉｖ’）ＮＲｆＲｇ－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲｆＲｇ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、もしくはＲｆ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｇ－（ＲｆおよびＲｇは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１～４のアルキルを示す。）；または
（ｖ’）上記（ｖｉｉ’）で列挙したものと同じ基。
　好ましくは、式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（Ｉ’）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 〔式中、
　Ｘ、Ｙ、Ｏ、ＳおよびＷは、式（Ｉ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕
　式（Ｉ’）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４により示される置換基の定義、例および好ましい例は、第１リンカーにおける主鎖を構成する基が有していてもよい上記置換基のものと同様である。
　より好ましくは、式（Ｉ’）で表される化合物は、下記式（Ｉ’’）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 〔式中、
　Ｘ、Ｙ、Ｏ、ＳおよびＷは、式（Ｉ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、式（Ｉ’）のものと同じである。〕
　式（Ｉ）～（Ｉ’’）で表される本発明の化合物またはその塩は、例えば、式（Ｉ）～（Ｉ’’）で表される化合物またはその塩においてＹの部分が脱離基（Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基）に置換された化合物またはその塩を合成し、次いで、この合成された化合物またはその塩を、親和性ペプチドと反応させることにより、得ることができる。例えば、このような反応は、適切な反応系（例、有機溶媒もしくは水溶液またはその混合溶媒中）において、適温（例、約１５～２００℃）で行うことができる。反応系は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分～２０時間、好ましくは１０分～１５時間、より好ましくは２０分～１０時間、さらにより好ましくは３０分～８時間である。
　好ましくは、式（Ｉ）～（Ｉ’’）で表される化合物またはその塩においてＹの部分が脱離基（Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基）に置換された化合物またはその塩は、下記式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 〔式中、
　Ｘは、脱離基を示し、
　Ｘ’は、脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基を示し、
　Ｏは、酸素原子を示し、
　Ｓは、硫黄原子を示し、
　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
　Ｌａは、第１リンカーを示し、
　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕
　Ｘ’により示される、脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基は、脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基である限り特に限定されず、例えば、ペンタフルオロフェニルオキシ基、テトラフルオロフェニルオキシ基、パラニトロフェニルオキシ基、およびＮ－スクシンイミジルオキシ基が挙げられる。
　式（ＶＩ）におけるＸ（脱離基）、Ｗ（酸素原子または硫黄原子）、Ｌａ（第１リンカー）、Ｌｂ（第２リンカー）等の記号、用語および表現の定義、例、および好ましい例は、上記式のものと同様である。
　式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩は、例えば、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を効率良く製造するための合成中間体として有用である。
　より好ましくは、式（ＶＩ）で表される化合物は、下記式（ＶＩ’）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 〔式中、
　Ｘ、Ｘ’、Ｏ、ＳおよびＷは、式（ＶＩ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕
　式（ＶＩ’）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４により示される置換基の定義、例および好ましい例は、第１リンカーにおける主鎖を構成する基が有していてもよい上記置換基のものと同様である。
　さらにより好ましくは、式（ＶＩ’）で表される化合物は、下記式（ＶＩ’’）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 〔式中、
　Ｘ、Ｘ’、Ｏ、ＳおよびＷは、式（ＶＩ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、式（ＶＩ’）のものと同じである。〕
　特に好ましくは、式（ＶＩ’’）で表される化合物は、下記式（ＶＩ’’－１）または（ＶＩ’’－２）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 〔式中、
　Ｏ、ＳおよびＷは、式（ＶＩ）のものと同じであり、
　Ｆは、フッ素原子である。〕
　式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩は、下記式（Ｖ）で表される化合物またはその塩から製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 〔式中、
　Ｘは、脱離基を示し、
　Ｏは、酸素原子を示し、
　ＯＨは、ヒドロキシ基を示し、
　Ｓは、硫黄原子を示し、
　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
　Ｌａは、第１リンカーを示し、
　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕
　式（Ｖ）におけるＸ（脱離基）、Ｗ（酸素原子または硫黄原子）、Ｌａ（第１リンカー）、Ｌｂ（第２リンカー）等の記号、用語および表現の定義、例、および好ましい例は、上記式のものと同様である。
　式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩は、式（Ｖ）で表される化合物またはその塩をカルボキシル基修飾試薬と反応させることにより得ることができる。カルボキシル基修飾試薬としては、例えば、ペンタフルオロフェニル化試薬（例、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル）、テトラフルオロフェニル化試薬（例、トリフルオロ酢酸テトラフルオロフェニル）、パラニトロフェニル化試薬（例、トリフルオロ酢酸パラニトロフェニル）、Ｎ－スクシンイミジル化試薬（例、トリフルオロ酢酸Ｎ－スクシンイミジル）が挙げられる。例えば、このような反応は、適切な有機溶媒系（例、ＣＨ２Ｃｌ２等のハロゲン化アルキル（例、ハロゲン化メチル）、およびトリエチルアミン等のアミンを含む有機溶媒）において、適温（例、約－１０～３０℃）で行うことができる。反応時間は、例えば１分～２０時間、好ましくは１０分～１５時間、より好ましくは２０分～１０時間、さらにより好ましくは３０分～８時間である。
　式（Ｖ）で表される化合物またはその塩は、例えば、式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩を効率良く製造するための合成中間体として有用である。
　より好ましくは、式（Ｖ）で表される化合物は、下記式（Ｖ’）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 〔式中、
　Ｘ、Ｏ、ＯＨ、ＳおよびＷは、式（Ｖ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕
　式（Ｖ’）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４により示される置換基の定義、例および好ましい例は、第１リンカーにおける主鎖を構成する基が有していてもよい上記置換基のものと同様である。
　より好ましくは、式（Ｖ’）で表される化合物は、下記式（Ｖ’’）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 〔式中、
　Ｘ、Ｏ、ＯＨ、ＳおよびＷは、式（Ｖ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、式（Ｖ’）のものと同じである。〕
　特に好ましくは、式（Ｖ’’）で表される化合物は、下記式（Ｖ’’－１）または（Ｖ’’－２）で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 〔式中、
　Ｏ、ＯＨ、ＳおよびＷは、式（Ｖ）のものと同じである。〕
　式（Ｖ）で表される化合物は、Ｘ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌａ－ＳＨで表される化合物を、ＨＯ－Ｃ（＝Ｗ）－Ｌｂ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＨで表されるジカルボン酸化合物、または当該ジカルボン酸化合物の分子内縮合反応により生成する環状化合物と反応させることにより得ることができる（例、実施例（１－３）および（２－１）を参照）。例えば、このような反応は、適切な有機溶媒系において、適温（例、約４～６０℃）で行うことができる。反応時間は、例えば１分～２０時間、好ましくは１０分～１５時間、より好ましくは２０分～１０時間、さらにより好ましくは３０分～８時間である。
　上記のような一連の化合物またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、ＮＭＲ、または質量分析により、行うことができる。このような化合物またはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
３．抗体中間体またはその塩
　本発明は、下記式（ＩＩ）で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 〔式中、
　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、イムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
　Ｏは、酸素原子を示し、
　Ｓは、硫黄原子を示し、
　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
　Ｌａは、第１リンカーを示し、
　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個であり、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕
　Ｉｇにより示されるイムノグロブリン単位は、上述のとおりである。式（ＩＩ）におけるＹ（親和性ペプチド）、Ｗ（酸素原子または硫黄原子）、Ｌａ（第１リンカー）、Ｌｂ（第２リンカー）等の記号、用語および表現の定義、例、および好ましい例は、上記式のものと同様である。
　式（ＩＩ）において、２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率（ｒ）は、イムノグロブリン単位と親和性ペプチド含有基との結合の平均比率（親和性ペプチド含有基数／イムノグロブリン単位）を示す。このような平均比率は、１．５～２．５である。このような平均比率は、好ましくは１．６以上、より好ましくは１．７以上、さらにより好ましくは１．８以上、特に好ましくは１．９以上であってもよい。このような平均比率はまた、好ましくは２．４以下、より好ましくは２．３以下、さらにより好ましくは２．２以下、特に好ましくは２．１以下であってもよい。より具体的には、このような平均比率は、好ましくは１．６～２．４、より好ましくは１．７～２．３、さらにより好ましくは１．８～２．２、特に好ましくは１．９～２．１であってもよい。
　好ましくは、式（ＩＩ）で表される構造単位は、下記式（ＩＩ’）で表される構造単位であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 〔式中、
　Ｉｇ、Ｙ、Ｏ、Ｓ、Ｗおよびｒは、式（ＩＩ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される構造単位であってもよい。
　式（ＩＩ’）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４により示される置換基の定義、例および好ましい例は、第１リンカーにおける主鎖を構成する基が有していてもよい上記置換基のものと同様である。
　より好ましくは、式（ＩＩ’）で表される構造単位は、下記式（ＩＩ’’）で表される構造単位であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 〔式中、
　Ｉｇ、Ｙ、Ｏ、Ｓ、Ｗおよびｒは、式（ＩＩ）のものと同じであり、
　Ｌｂは、式（ＩＩ’）のものと同じである。〕
　本発明の抗体中間体またはその塩は、本発明の化合物またはその塩を、上記イムノグロブリン単位を含む抗体と反応させることにより、得ることができる。反応では、先ず、本発明の化合物またはその塩が抗体と混合される。これにより、本発明の化合物またはその塩が、抗体と親和性を有する親和性ペプチドを介して抗体と会合することができる。次に、抗体の会合後に、脱離基（Ｘ）を有するカルボニル基（Ｘ－Ｃ＝Ｏ）が、抗体の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基と位置選択的に反応することができる。このような反応により、当該アミノ基とカルボニル基の炭素原子とが結合し、かつ脱離基（Ｘ）がカルボニル基から脱離して、本発明の抗体中間体またはその塩が得られる。反応における、抗体に対する本発明の化合物またはその塩のモル比率（本発明の化合物またはその塩／抗体）は、本発明の化合物またはその塩、および抗体の種類等の因子に応じて変動することから特に限定されないが、例えば１～１００であり、好ましくは２～８０であり、より好ましくは４～６０であり、さらにより好ましくは５～５０であり、特に好ましくは６～３０である。
　このような反応は、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば緩衝液中において、室温（例、約１５～３０℃）で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば５～９であり、好ましくは５．５～８．５であり、より好ましくは６．０～８．０である。緩衝液は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分～２０時間、好ましくは１０分～１５時間、より好ましくは２０分～１０時間、さらにより好ましくは３０分～８時間である。このような反応の詳細については、例えば、Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１５，２１７４（２０１５）；Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ．Ｊ．，４，６３０（２００９）；Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５，４７４０（２０１４）；Ａ．Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．，２５，８２５（２０１４）を参照のこと。
　抗体中間体またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、行うことができる。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎが挙げられる。親和性ペプチドの導入個数の確認は、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。抗体中間体またはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
４．チオール基導入抗体誘導体またはその塩
　本発明は、下記式（ＩＩＩ）で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 〔式中、
　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｏは、酸素原子を示し、
　ＳＨは、チオール基を示し、
　Ｌａは、第１リンカーを示し、
　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数が２～４個であり、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕
　Ｉｇにより示されるイムノグロブリン単位は、上述のとおりである。式（ＩＩＩ）におけるＬａ（第１リンカー）等の記号、用語および表現の定義、例、および好ましい例は、上記式のものと同様である。
　式（ＩＩＩ）において、２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率（ｒ）は、イムノグロブリン単位とチオール含有基との結合の平均比率（チオール含有基数／イムノグロブリン単位）を示す。このような平均比率は、１．５～２．５である。このような平均比率は、好ましくは１．６以上、より好ましくは１．７以上、さらにより好ましくは１．８以上、特に好ましくは１．９以上であってもよい。このような平均比率はまた、好ましくは２．４以下、より好ましくは２．３以下、さらにより好ましくは２．２以下、特に好ましくは２．１以下であってもよい。より具体的には、このような平均比率は、好ましくは１．６～２．４、より好ましくは１．７～２．３、さらにより好ましくは１．８～２．２、特に好ましくは１．９～２．１であってもよい。
　好ましくは、式（ＩＩＩ）で表される構造単位は、下記式（ＩＩＩ’）で表される構造単位であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 〔式中、
　Ｉｇ、Ｏ、ＳＨおよびｒは、式（ＩＩＩ）のものと同じであり、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕
　式（ＩＩＩ’）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４により示される置換基の定義、例および好ましい例は、第１リンカーにおける主鎖を構成する基が有していてもよい上記置換基のものと同様である。
　より好ましくは、式（ＩＩＩ’）で表される構造単位は、下記式（ＩＩＩ’’）で表される構造単位であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 〔式中、
　Ｉｇ、Ｏ、ＳＨおよびｒは、式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕
　本発明のチオール基導入抗体誘導体またはその塩は、本発明の抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供することにより、得ることができる。チオエステルの切断反応は、タンパク質（イムノグロブリン／抗体）の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（上述したような温和な条件）下で行うことができる。より具体的には、ｐＨ４．０～ｐＨ８．０、１０ｍＭ～１０Ｍの範囲にあるヒドロキシルアミン塩酸塩溶液中で１時間攪拌することで切断できる（例、Ｖａｎｃｅ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．２０１９，３０，１４８－１６０．）。
　チオール基導入抗体誘導体またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎが挙げられる。チオール基の導入個数の確認は、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。チオール基導入抗体誘導体またはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
５．抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩
　本発明は、下記式（ＩＶ）で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 〔式中、
　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｏは、酸素原子を示し、
　Ｓは、硫黄原子を示し、
　Ｚは、機能性物質を示し、
　Ｌａは、第１リンカーを示し、
　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数が２～４個であり、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕
　Ｉｇにより示されるイムノグロブリン単位は、上述のとおりである。式（ＩＶ）におけるＬａ（第１リンカー）等の記号、用語および表現の定義、例、および好ましい例は、上記式のものと同様である。
　機能性物質は、抗体に任意の機能を付与する物質である限り特に限定されず、例えば、薬物、標識物質、安定化剤が挙げられるが、好ましくは薬物または標識物質である。機能性物質はまた、単一の機能性物質であってもよく、または２以上の機能性物質が連結された物質であってもよい。
　薬物としては、任意の疾患に対する薬物であってもよい。このような疾患としては、例えば、癌（例、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、黒色腫）、自己免疫疾患・炎症性疾患（例、アレルギー疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）、脳神経疾患（例、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症）、感染症（例、細菌感染症、ウイルス感染症）、遺伝性・希少疾患（例、遺伝性球状赤血球症、非ジストロフィー筋緊張症）、眼疾患（例、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜色素変性症）、骨・整形外科領域の疾患（例、変形性関節症）、血液疾患（例、白血病、紫斑病）、その他の疾患（例、糖尿病、高脂血症等の代謝異常症、肝臓疾患、腎疾患、肺疾患、循環器系疾患、消化器官系疾患）が挙げられる。薬物は、疾患の予防または治療薬、副作用の緩和薬であってもよい。
　より具体的には、薬物は、抗癌剤である。抗癌剤としては、例えば、化学療法剤、毒素、放射性同位体またはそれを含む物質が挙げられる。化学療法剤としては、例えば、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗薬、酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ結合阻害剤、チューブリン結合阻害剤、細胞傷害性ヌクレオシド、白金化合物が挙げられる。毒素としては、例えば、細菌毒素（例、ジフテリア毒素）、植物毒素（例、リシン）が挙げられる。放射性同位体としては、例えば、水素原子の放射性同位体（例、３Ｈ）、炭素原子の放射性同位体（例、１４Ｃ）、リン原子の放射性同位体（例、３２Ｐ）、硫黄原子の放射性同位体（例、３５Ｓ）、イットリウムの放射性同位体（例、９０Ｙ）、テクネチウムの放射性同位体（例、９９ｍＴｃ）、インジウムの放射性同位体（例、１１１Ｉｎ）、ヨウ素原子の放射性同位体（例、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ)、サマリウムの放射性同位体（例、１５３Ｓｍ）、レニウムの放射性同位体（例、１８６Ｒｅ）、アスタチンの放射性同位体（例、２１１Ａｔ）、ビスマスの放射性同位体（例、２１２Ｂｉ）が挙げられる。更に具体的には、薬物として、オーリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、メイタンシン（ＤＭ１、ＤＭ４）、ＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）、ＩＧＮ、カンプトテシン類縁体、カリケアミシン、デュオカルミシン、エリブリン、アントラサイクリン、ｄｍＤＮＡ３１、ツブリシンが挙げられる。
　標識物質は、標的（例、組織、細胞、物質）の検出を可能にする物質である。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アプタマー）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性同位体（例、上述したもの）、またはそれを含む物質が挙げられる。
　安定化剤は、抗体の安定化を可能にする物質である。安定化剤としては、例えば、ジオール類、グリセリン、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、天然系界面活性剤、サッカリド、およびポリオール類が挙げられる。
　機能性物質はまた、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子有機化合物、糖鎖、脂質、高分子ポリマー、金属（例、金）、キレーターであってもよい。ペプチドとしては、例えば、細胞膜透過ペプチド、血液脳関門透過性ペプチド、ペプチド医薬品が挙げられる。タンパク質としては、例えば、酵素、サイトカイン、フラグメント抗体、レクチン、インターフェロン、血清アルブミン、抗体が挙げられる。核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸が挙げられる。核酸としてはまた、例えば、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、アンチセンスが挙げられる。低分子有機化合物としては、例えば、タンパク質分解誘導キメラ分子、色素、光分解性化合物が挙げられる。
　機能性物質がチオール基と反応し易い官能基を有しない場合、機能性物質は、このような官能基を有するように誘導体化されてもよい。誘導体化は、当該分野における技術常識である（例、国際公開第２００４／０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書）。例えば、誘導体化は、任意の架橋剤を用いて行われてもよい。あるいは、誘導体化は、所望の官能基を有する特定のリンカーを用いて行われてもよい。例えば、このようなリンカーは、適切な環境（例、細胞内または細胞外）において機能性物質と抗体とをリンカーの切断により分離可能なものであってもよい。このようなリンカーとしては、例えば、特定のプロテアーゼ〔例、細胞内プロテアーゼ（例、リソソーム、またはエンドソーム中に存在するプロテアーゼ）、細胞外プロテアーゼ（例、分泌性プロテアーゼ）〕で分解されるペプチジルリンカー（例、米国特許第６，２１４，３４５号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　８３：６７－１２３（１９９９））、生体内に存在する局所酸性部位で切断され得るリンカー（例、米国特許第５，６２２，９２９号、同第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号）が挙げられる。リンカーは、自壊的（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）であってもよい（例、国際公開第０２／０８３１８０号、国際公開第０４／０４３４９３号、国際公開第０５／１１２９１９号）。本発明では、誘導体化された機能性物質も、単に「機能性物質」と呼称される。
　式（ＩＶ）において、２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率（ｒ）は、イムノグロブリン単位と機能性物質含有基との結合の平均比率（機能性物質含有基数／イムノグロブリン単位）を示す。このような平均比率は、１．５～２．５である。このような平均比率は、好ましくは１．６以上、より好ましくは１．７以上、さらにより好ましくは１．８以上、特に好ましくは１．９以上であってもよい。このような平均比率はまた、好ましくは２．４以下、より好ましくは２．３以下、さらにより好ましくは２．２以下、特に好ましくは２．１以下であってもよい。より具体的には、このような平均比率は、好ましくは１．６～２．４、より好ましくは１．７～２．３、さらにより好ましくは１．８～２．２、特に好ましくは１．９～２．１であってもよい。
　好ましくは、式（ＩＶ）で表される構造単位が、下記式（ＩＶ’）で表される構造単位であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 〔式中、
　Ｉｇ、Ｏ、Ｓ、Ｚおよびｒは、式（ＩＶ）のものと同じであり、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕
　式（ＩＶ’）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４により示される置換基の定義、例および好ましい例は、第１リンカーにおける主鎖を構成する基が有していてもよい上記置換基のものと同様である。
　好ましくは、式（ＩＶ’）で表される構造単位が、下記式（ＩＶ’’）で表される構造単位であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 〔式中、
　Ｉｇ、Ｏ、Ｓ、Ｚおよびｒは、式（ＩＶ）のものと同じである。〕
　本発明のコンジュゲートまたはその塩は、本発明のチオール基導入抗体誘導体またはその塩を、機能性物質と反応させることにより、得ることができる。このような反応は、タンパク質（イムノグロブリン／抗体）の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（上述したような温和な条件）下で行うことができる。機能性物質としては、温和な条件下でチオール基と反応できる任意の官能基を有するものを使用することができるが、チオール基と反応し易い官能基の使用が好ましい。このような官能基としては、例えば、マレイミド基、ジスルフィド基、α－ハロケトン、α－ハロアミド、ベンジルブロミド、ヨードアルキルが挙げられる。あるいは、機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有しない場合、機能性物質として、上述のように誘導体化されたものを使用することができる。反応において、チオール基導入抗体誘導体またはその塩に対する機能性物質のモル比率（機能性物質／チオール基導入抗体誘導体またはその塩）は、チオール基導入抗体誘導体またはその塩、および機能性物質の種類、および反応時間等の因子に応じて変動することから特に限定されないが、例えば２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である。チオール基導入抗体誘導体のチオール基に対して機能性物質を短い反応時間で十分に反応させるためには、チオール基導入抗体誘導体またはその塩に対する十分量（例、過剰量）の機能性物質を用いることができる。
　コンジュゲートまたはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎが挙げられる。機能性物質の導入個数の確認は、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。コンジュゲートまたはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
６．用途
　本発明の化合物またはその塩は、例えば、抗体の２８８／２９位のリジン残基を位置選択的に修飾することができる。したがって、本発明は、本発明の化合物またはその塩を含む、抗体誘導体化用試薬を提供する。
　本発明の試薬は、他の成分をさらに含む組成物の形態で提供されてもよい。このような他の成分としては、例えば、溶液、安定化剤（例、酸化防止剤、保存剤）が挙げられる。溶液としては、水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌蒸留水、精製水、生理食塩水）、緩衝液（例、リン酸水溶液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液、ホウ酸水溶液、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液）が挙げられるが、緩衝液が好ましい。溶液のｐＨは、例えば５．０～９．０、好ましくは５．５～８．５である。本発明の試薬は、液状または粉末状（例、凍結乾燥粉末）において提供することができる。
　本発明の抗体中間体またはその塩、および本発明のチオール基導入抗体誘導体またはその塩は、例えば、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩の調製のための中間体として有用である。
　本発明のコンジュゲートまたはその塩は、例えば、医薬、または試薬（例、診断薬、研究用試薬）として有用である。特に、機能性物質で位置選択的に修飾されており、しかも抗体と機能性物質との結合の平均比率が所望の範囲（１．５～２．５）に高度に制御されている本発明のコンジュゲートまたはその塩は、医薬として有用である。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の薬物の結合数および結合位置を変化させると、体内動態や薬物の放出速度、効果が変化することが報告されている。これらのことから次世代型ＡＤＣではコンジュゲーションする薬物の個数と位置を制御することが求められている。個数および位置が一定であると、期待通りのｅｆｆｉｃａｃｙ、コンジュゲーション薬剤のバリエーション、ロット差いわゆるレギュレーションの問題が解決すると考えられている。したがって、本発明のコンジュゲートまたはその塩は、このようなレギュレーションの問題を解決することができる。
　本発明のコンジュゲートまたはその塩は、医薬組成物の形態において提供されてもよい。このような医薬組成物は、本発明のコンジュゲートまたはその塩に加えて、医薬上許容され得る担体を含んでいてもよい。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明のコンジュゲートまたはその塩はまた、安定性を実現する任意の修飾（例、ＰＥＧ化）を有していてもよい。
　経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
　医薬組成物は、非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与）に好適である。このような非経口的な投与に好適な医薬組成物としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
　医薬組成物の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、適宜設定することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（１－１）ＩｇＧ１　Ｆｃ結合性ペプチドの合成
　可溶性タンパク質に対する親和性物質であるＡｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号２）のペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により合成した。ペプチド合成装置はＣＥＭ社製Ｌｉｂｅｒｔｙ　Ｂｌｕｅを使用した。試薬は全て渡辺化学工業製のものを使用した。ＲｅｓｉｎはＦｍｏｃ－ＮＨ－ＳＡＬ－ＰＥＧ　Ｒｅｓｉｎ，ＨＬ、アルギニン（Ｒ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）はダブルカップリングを行った。Ｒｅｓｉｎからの切り出しはトリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール＝９４：２．５：１．０：２．５の溶液中３時間攪拌の条件で行った。切り出し後Ｒｅｓｉｎをフィルトレーションにより除去し、トリフルオロ酢酸を除去した。生成した結晶中にジエチルエーテルを加えエーテル沈殿を行い、生成した白色結晶をフィルトレーションにより回収した。これを０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．１％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ－ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルのみ除去した後、凍結乾燥を行った。
（１－２）Ａｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号２）の５位と３４位のＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
　（１－１）で合成したペプチドをＤＭＳＯに溶解し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ　８．０を加えた。この溶液にグルタチオン酸化型を加えて室温で２０時間攪拌した。反応溶液に２Ｍトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸０．０５％を含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ－ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、目的物（２０．０ｍｇ，４．７０μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１０６３．６５［Ｍ＋４Ｈ］４＋，ｚ＝５　８５１．１５［Ｍ＋５Ｈ］５＋
（１－３）チオエステルリンカーの合成
（１－３－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 　３，３’－ＤｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃＡｃｉｄ　（１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、０℃でＤＭＦ（１００μＬ）、ＯｘａｌｙｌＣｈｌｏｒｉｄｅ（１．５ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を加え０℃で１５分、常温で１時間撹拌した。その後、０℃でＢｅｎｚｅｎｅｔｈｉｏｌ（１．５３ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（４ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を加え常温で３時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応を確認後、結晶を除去し、酢酸エチルと１Ｍ塩酸水溶液で抽出後、有機層を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（１．２ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）得た。
（１－３－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　（１－３－１）で合成した化合物（１．２ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／Ｈ２Ｏ＝５／１の混合溶媒に溶解し、ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（１．７４ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）を加え常温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応を確認後、酢酸エチルと水で抽出後、有機層を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（１．１８ｇ、６．５ｍｍｏｌ）得た。
（１－３－３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 　（１－３－２）で合成した化合物（２００ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．０ｍＬ）に溶解し、Ｇｌｕｔａｒｉｃ　Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（１２５．５ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６．７２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（０．２２ｍＬ）を加え常温で４時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）で反応を確認後、酢酸エチルと０．５ＭＨＣｌで抽出し、有機層を濃縮した。ジクロロメタンとメタノールの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（１３５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）得た。
（１－３－４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　（１－３－３）で合成した化合物（１３４ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）にＣＨ２Ｃｌ２（２．２５ｍＬ）、トリエチルアミン（１５７μＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、溶解した。０℃でペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸（１５４μＬ、０．９０ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で反応を確認後、反応溶液を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（９６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）得た。
１Ｈ　ＮＭＲ　（４００　ＭＨｚ，　Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）　δ　＝　７．４４　（ｓ，　５Ｈ），　３．２３　（ｔ，　Ｊ＝６．９，　２Ｈ），　３．０１　（ｔ，　Ｊ＝６．９，　２Ｈ），　２．７７　（ｄｔ，　Ｊ＝１４．５，　７．３，　４Ｈ），　２．１６　（ｔ，　Ｊ＝７．３，　２Ｈ）．
（１－４）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号２のアミノ酸配列である。
　（１－２）で合成したＡｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号２）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、（１－３）で合成したチオエステルリンカー（９６．０ｍｇ、２０１μｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ－ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（１５．８ｍｇ、３．４８μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１１３６．８０［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（１－５）抗ＨＥＲ２　ＩｇＧ抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（１－４）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇをＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。生成物は結合性ペプチドが１個導入された１５２６６０、結合性ペプチドが２個導入された１５７０９３、３個導入された１６１５２８のピークが確認された（図７）。
（１－６）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（１－５）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測され、生成物は重鎖にリンカーが１個導入された５５０３３、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図８）。
（１－７）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（１－５）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表２に示す。表２のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は２．０となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　２．０）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号２のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
（１－８）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　（１－７）で得られた抗体中間体に対し、既報（ＷＯ２０１９／２４０２８７Ａ１）に従いヒドロキシルアミン溶液を加え、室温で１時間静置した。２時間後、２０ｍＭ　ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、チオール基導入抗体誘導体を得た。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、切断反応が進行した１４８４０９にピークが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
（１－９）トリプシン処理によるペプチドマッピング
　（１－８）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体について、下記工程でペプチドマッピングを行った。
（１－９－１）トラスツズマブ・チオール導入体のトリプシン処理
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブにサンプル溶液を１０μＬ、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、４０％トリフルオロエタノールに溶解した２０ｍＭのジチオトレイトール水溶液１０μＬを加えて６５℃で１時間加温後、５０ｍＭのヨードアセトアミド水溶液１０μＬを添加し、遮光下室温で３０分間反応させた。反応後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を４０μＬ加えて撹拌し、２０ｎｇ／μＬのトリプシン水溶液を１０μＬ添加して３７℃で１６時間酵素消化した。消化後、２０％トリフルオロ酢酸水溶液を２μＬ添加し反応を止め、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定を実施した。
（１－９－２）トラスツズマブのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定
（分析装置）
ナノＨＰＬＣ：ＥＡＳＹ－ｎＬＣ　１０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
質量分析計：トライブリッド質量分析計Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｆｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
（ＨＰＬＣ分析条件）
　トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ　ＰｅｐＭａｐ（登録商標）　１００，７５μｍｘ２ｃｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
分析カラム：ＥＳＩ－ｃｏｌｕｍｎ（ＮＴＣＣ－３６０／７５－３－１２５，７５μｍ×１２．５ｃｍ，３μｍ（日京テクノス社））
　移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
　移動相Ｂ：０．１％ギ酸、アセトニトリル溶液
　ローディング溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
　流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
　サンプル注入量：１μＬ
　グラジエント条件（Ｂ％）：２％（０．０－０．５分）、２％→３０％（０．５－２３．５分）、３０％→７５％（２３．５－２５．５分）、７５％（２５．５－３５.０分）
（質量分析計分析条件）
　イオン化法：ＥＳＩ，　Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
　スキャンタイプ：Ｄａｔａ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ
　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｔｙｐｅ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）
　データの取得は付属ソフトであるＸｃａｌｉｂｕｒ　３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）およびＴｈｅｒｍｏ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｔｕｎｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。
（１－９－３）トラスツズマブの修飾部位の解析
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒ　３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行った。
　ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒでの解析は、Ｓ／Ｎ　Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを１、ＭＳ　Ｎｏｉｓｅ　Ｌｅｖｅｌをピークトップの強度の０．０１％となるように設定して実施した。また、消化酵素をＴｒｙｐｓｉｎに、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙをＨｉｇｈに設定した。Ｓｔａｔｉｃ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにはヨードアセトアミドによるシステイン残基の修飾として、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（＋５７．０２１Ｄａ）を設定した。Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニン残基の酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびリジン残基への修飾体（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を設定した。また、Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ　Ｓｃｏｒｅが８０以上、ペプチド同定時のＭａｓｓ　Ａｃｃｕｒａｃｙが５ｐｐｍ以内、ＭＳ／ＭＳが観測できているもののみとなるようフィルターを設定した。なお、リジン残基の残基番号に関して、重鎖ＶＨドメインおよび軽鎖上については配列中の番号（すなわち、Ｎ末のアミノ酸を１番目とする。以下同様）で、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン上についてはＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを用いて表記した。
　また、修飾部位の検索対象のアミノ酸配列のデータとして、図９に示される（１）および（２）を用いた。
（１－９－４）トラスツズマブのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１０）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　５７７．０３６０６、理論値：５７７．０３５５７、４価）が観測され（図１０）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２８８位もしくは２９０位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ１６に相当するｍ／ｚ　６８２．１３（理論値：６８２．０１）のプロダクトイオンが確認された（図１１）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２８８位もしくは２９０位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図１２）。
　この結果より、上記（１－８）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体では、抗体の重鎖上、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２８８およびＬｙｓ２９０に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
［実施例２：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（２－１）チオエステルリンカーの合成
（２－１－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
　（１－３－２）で合成した化合物（２９５ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１３．５ｍＬ）に溶解し、３－（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ（３００ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（７００μＬ、２．０３ｍｍｏｌ），ＰｙＢＯＰ（８４３ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を加えて常温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応を確認後、反応溶液を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（２５９ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）得た。
（２－１－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
　（２－１－１）で合成した化合物（２５９ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ＝１／１の混合溶液に溶解し、１時間常温で撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で原点に落ちたことを確認後、反応溶液を濃縮後、真空乾燥を行い、上記化合物を（２２７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）得た。
（２－１－３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
　（２－１－２）で合成した化合物（２２７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）にＣＨ２Ｃｌ２（３．３ｍＬ）、トリエチルアミン（２３０μＬ、１．６５ｍｍｏｌ）を加え、溶解した。０℃でペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸（２２５μＬ、１．３２ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で反応を確認後、反応溶液を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（１７５．３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）得た。
１Ｈ　ＮＭＲ　（４００　ＭＨｚ，　Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）　δ　＝　８．７９　（ｔ，　Ｊ＝１．８，　１Ｈ），　８．４３　（ｄｔ，　Ｊ＝７．８，　１．５，　１Ｈ），　８．３０　（ｄｔ，　Ｊ＝７．９，　１．５，　１Ｈ），　７．７０　（ｔ，　Ｊ＝７．８，　１Ｈ），　７．４５　（ｓ，　４Ｈ），　３．４５　（ｔ，　Ｊ＝６．９，　２Ｈ），　３．１４　（ｔ，　Ｊ＝６．９，　２Ｈ）．
（２－２）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号２のアミノ酸配列である。
　（１－２）で合成したＡｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号２）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、リンカー（７２．０ｍｇ、１４１μｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ－ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（１０．０ｍｇ、２．１９μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１１４５．６［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（２－３）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（２－２）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２６９１、結合性ペプチドが２個導入された１５７１６３、３個導入された１６１６３４のピークが確認された（図１３）。
（２－４）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（２－３）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５５０６７、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図１４）。
（２－５）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（２－３）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表３に示す。表３のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は２．０となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　２．０）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号２のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
（２－６）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（２－５）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
（２－７）トリプシン処理によるペプチドマッピング
　（２－６）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体について、下記工程でペプチドマッピングを行った。
（２－７－１）トラスツズマブ・チオール導入体のトリプシン処理
　（１－９－１）と同様にして（２－６）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体のトリプシン処理を行った。
（２－７－２）トラスツズマブのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定
　（１－９－２）と同様の条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
（２－７－３）トラスツズマブの修飾部位の解析
　（１－９－３）と同様に解析を行った。
（２－７－４）トラスツズマブのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１０）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　５７７．０３５７１、理論値：５７７．０３５５７、４価）が観測され（図１５）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２８８位もしくは２９０位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ１６に相当するｍ／ｚ　６８２．４１（理論値：６８２．０１）のプロダクトイオンが確認された（図１６）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２８８位もしくは２９０位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図１７）。
　この結果より、上記（２－６）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体では、抗体の重鎖上、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２８８およびＬｙｓ２９０に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
［実施例３：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（３－１）チオエステルリンカーの合成
（３－１－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
　（１－３－２）で合成した化合物（２２０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１２．０ｍＬ）に溶解し、ＡｄｉｐｉｃＡｃｉｄ（５３０ｍｇ、３．６３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３１４μＬ、１．８２ｍｍｏｌ），ＰｙＢＯＰ（７５５ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えて常温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）で反応を確認後、反応溶液を濃縮した。ジクロロメタンとメタノールの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（２０５ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）得た。
（３－１－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
　（３－１－１）で合成した化合物（２０５ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）にＣＨ２Ｃｌ２（３．１５ｍＬ）、トリエチルアミン（２２０μＬ、１．５８ｍｍｏｌ）を加え、溶解した。０℃でペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸（２１５μＬ、１．２６ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で反応を確認後、反応溶液を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（２００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）得た。
１Ｈ　ＮＭＲ　（４００　ＭＨｚ，　Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）　δ　＝　７．４４　（ｓ，　５Ｈ），　３．２０　（ｔ，　Ｊ＝７．０，　２Ｈ），　３．００　（ｔ，　Ｊ＝６．９，　２Ｈ），　２．６６　（ｄｔ，　Ｊ＝２８．３，　７．４，　５Ｈ），　１．７９　（ｄｄｔ，　Ｊ＝２０．４，　１５．２，　７．５，　５Ｈ），　１．５７　－　１．３８　（ｍ，　３Ｈ）．
（３－２）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号２のアミノ酸配列である。
　（１－２）で合成したＡｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号２）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、リンカー（６９．０ｍｇ，１４１μｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ－ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（７．５ｍｇ，１．６５μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１１４０．５０［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（３－３）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（３－２）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２６７６、結合性ペプチドが２個導入された１５７１２６、３個導入された１６１５７２のピークが確認された（図１８）。
（３－４）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（３－３）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５５０４８、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図１９）。
（３－５）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（３－３）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表４に示す。表４のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は１．９となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　１．９）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号２のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、１．９である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
（３－６）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（３－５）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
［実施例４：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（４－１）チオエステルリンカーの合成
（４－１－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
　ｔＢｕ－３－Ｓｕｌｆａｎｙｌｐｒｏｐａｎｏａｔｅ（５００ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．６４ｍＬ、４．６２ｍｍｏｌ）を加えた後、０℃でマロニルクロリド（０．１５ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応を確認後、反応溶液を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（１０４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）得た。
（４－１－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
　（４－１－１）で合成した化合物（１０４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ＝１／１の混合溶液に溶解し、１時間常温で撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で原点に落ちたことを確認後、反応溶液を濃縮後、真空乾燥を行い、上記化合物を（１０４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）得た。
（４－１－３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
　（４－１－２）で合成した化合物（１０４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）にＣＨ２Ｃｌ２（１．８５ｍＬ）、トリエチルアミン（１３０μＬ、０．９３ｍｍｏｌ）を加え溶解した。０℃でＮ－ＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌＴｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ（１５６ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応を確認後、反応溶液を濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）により確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより有機溶媒を除去後、真空乾燥を行い、上記化合物を（６６．８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）得た。
１Ｈ　ＮＭＲ　（４００　ＭＨｚ，　Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）　δ　＝　３．８４　（ｓ，　２Ｈ），　３．２８　（ｔ，　Ｊ＝６．９，　２Ｈ），　３．１９　（ｔ，　Ｊ＝６．８，　２Ｈ），　３．００　（ｔ，　Ｊ＝６．８，　２Ｈ），　２．７４　（ｔ，　Ｊ＝６．８，　２Ｈ）．
（４－２）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号２のアミノ酸配列である。
　（１－２）で合成したＡｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ－ＮＨ２（配列番号２）（２９．７ｍｇ，７．００μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．００ｍＬ）に溶解し、リンカー（６６．８ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。これを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸を０．０５％含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをＬＣ－ＭＳにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－ＮＨＳ活性化体（１３ｍｇ，２．８２μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１１５３．１０［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（４－３）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（４－２）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２７２２、結合性ペプチドが２個導入された１５７２１５、３個導入された１６１７０８のピークが確認された（図２０）。
（４－４）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（４－３）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９４に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５５０９１、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図２１）。
（４－５）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（４－３）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表５に示す。表５のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は１．８となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　１．８）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号２のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、１．８である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
（４－６）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（４－５）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
［実施例５：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（５－１）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号３のアミノ酸配列である。
　（１－１）に記載の方法で合成したＡｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＤＣ－ＮＨ２（配列番号３）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）に実施例２（２－２）と同様の方法でリンカーを結合し、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（１０．０ｍｇ、２．１９μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１１４５．６［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（５－２）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（５－１）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２７０７、結合性ペプチドが２個導入された１５７１８８、３個導入された１６１６７６のピークが確認された（図２２）。
（５－３）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（５－２）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５５０７７、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図２３）。
（５－４）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（５－２）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表６に示す。表６のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は２．０となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　２．０）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号３のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
（５－５）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（５－４）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
［実施例６：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（６－１）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号４のアミノ酸配列である。
　（１－１）に記載の方法で合成したＡｃ－ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ－ＮＨ２（配列番号４）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）に実施例２（２－２）と同様の方法でリンカーを結合し、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（２２．２ｍｇ、４．８２μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１１５２．４［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（６－２）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（６－１）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２７２０、結合性ペプチドが２個導入された１５７２１６、３個導入された１６１７１６のピークが確認された（図２４）。
（６－３）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（６－２）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５５０９１、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図２５）。
（６－４）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（６－２）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表７に示す。表７のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は２．０となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　２．０）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号４のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
（６－５）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（６－４）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
［実施例７：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（７－１）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号５のアミノ酸配列である。
　（１－１）に記載の方法で合成したＡｃ－ＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ－ＮＨ２（配列番号５）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）に実施例２（２－２）と同様の方法でリンカーを結合し、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（１２．０ｍｇ、２．６９μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１１１５．８［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（７－２）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（７－１）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２５７３、結合性ペプチドが２個導入された１５６９２７のピークが確認された（図２６）。
（７－３）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（７－２）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５４９４２、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図２７）。
（７－４）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（７－２）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表８に示す。表８のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は２．０となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　２．０）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号５のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
（７－５）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（７－４）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
（７－６）トリプシン処理によるペプチドマッピング
　（７－５）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体について、下記工程でペプチドマッピングを行った。
（７－６－１）トラスツズマブ・チオール導入体のトリプシン処理
　（１－９－１）と同様にして（７－５）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体のトリプシン処理を行った。
（７－６－２）トラスツズマブのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定
　（１－９－２）と同様の条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
（７－６－３）トラスツズマブの修飾部位の解析
　（１－９－３）と同様に解析を行った。
（７－６－４）トラスツズマブのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（ヨードアセトアミドによるＣａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ化を受けたチオール導入体（＋１４５．０１９Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１０）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　７６９．０４５０６、理論値：７６９．０４４８２、３価）が観測され（図２８）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２８８位もしくは２９０位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ１６に相当するｍ／ｚ　１０２２．７１（理論値：１０２２．５１）のプロダクトイオンが確認された（図２９）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２８８位もしくは２９０位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図３０）。
　この結果より、上記（７－５）で得られたトラスツズマブ・チオール導入体では、抗体の重鎖上、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２８８およびＬｙｓ２９０に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
［実施例８：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（８－１）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号６のアミノ酸配列である。
　（１－１）に記載の方法で合成したＡｃ－ＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ－ＮＨ２（配列番号６）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）に実施例２（２－２）と同様の方法でリンカーを結合し、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（１６．８ｍｇ、３．８７μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１０８７．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（８－２）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（８－１）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２４５７、結合性ペプチドが２個導入された１５６６９２、３個導入された１６０９２９のピークが確認された（図３１）。
（８－３）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（８－２）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５４８２９、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図３２）。
（８－４）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（８－２）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表９に示す。表９のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は２．０となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　２．０）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号６のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
（８－５）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（８－４）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
［実施例９：可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物（ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体）の合成、ならびに当該化合物を用いた抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの修飾およびその解析］
（９－１）ペプチドとリンカーの結合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 上記２つのアミノ酸配列はいずれも、配列番号７のアミノ酸配列である。
　（９－１）に記載の方法で合成したＡｃ－ＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ－ＮＨ２（配列番号７）（３０．０ｍｇ，７．０６μｍｏｌ、ただし５番目と３４番目の２つのシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成している）に実施例２（２－２）と同様の方法でリンカーを結合し、上記ペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体（１４．１ｍｇ、３．３５μｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝４　１０５４．４［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（９－２）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析
　（９－１）で合成したペプチドリンカー連結物はジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭのペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０等量）加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは１４８２２３にピークが観測された。結合性ペプチドが１個導入された１５２２３６、結合性ペプチドが２個導入された１５６４３０、３個導入された１６０５４１のピークが確認された（図３３）。
（９－３）トラスツズマブの特異的修飾体の還元条件でのＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
　（９－２）で生成した抗体・ペプチド複合体に１００ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（抗体に対して等量）を加えて、室温で１５分攪拌した。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料のトラスツズマブは５０５９６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応物は重鎖にリンカーが１個導入された５４６９８、軽鎖に原料と同じ２３４３９にピークが観測された（図３４）。
（９－４）トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比の確認
　（９－２）で解析したＭＳデータについて、ＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社ソフト）によりペプチド／抗体結合比の確認を行った結果を表１０に示す。表１０のＤＡＲ　ｐｅａｋと％Ａｒｅａから算出された平均のペプチド／抗体結合比は２．０となった。したがって、下記構造式で表される抗体中間体（平均のペプチド／抗体結合比　２．０）の生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
　Ｙは、配列番号７のアミノ酸配列で表される親和性ペプチドを示し、
　２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒは、２．０である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
（９－５）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　チオール基導入抗体誘導体は、（９－４）で得られた抗体中間体を、（１－８）に記載されるチオエステル基の切断反応に供することにより、（１－８）に記載されるチオール基導入抗体誘導体を得た。
（実施例１～９のまとめ）
　実施例化合物におけるリンカー長とペプチド／抗体結合比（ＰＡＲ）の関係を検討した。その結果、イムノグロブリン単位中の重鎖の２８８／２９０位のリジン残基との反応性部分〔Ｘ（脱離基）－Ｃ＝Ｏ〕と、親和性ペプチドとの結合部分〔Ｏ＝Ｃ－Ｙ（親和性ペプチド）〕とを連結する主鎖を構成する原子数であるリンカー長が７～９個である化合物（式（Ｉ）で表される化合物において、第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が５～７個の原子数に相当するもの）は、所望の範囲（１．５～２．０）の平均ＰＡＲを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000108
 １）リンカー長：イムノグロブリン単位中の重鎖の２８８／２９０位のリジン残基との反応性部分〔Ｘ（脱離基）－Ｃ＝Ｏ〕と、親和性ペプチドとの結合部分〔Ｏ＝Ｃ－Ｙ（親和性ペプチド）〕とを連結する主鎖を構成する原子数
２）結合比：ペプチドと抗体との結合比（ペプチド／抗体）
（以下同様）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
［参考例１～５］
　上記実施例を参考に以下のペプチドチオエステルリンカー連結物－ＮＨＳ活性化体もしくはペプチドチオエステルリンカー連結物－チオフェノール活性化体の合成を行い、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの特異的修飾とＥＳＩ－ＴＯＦＭＳによる解析を行った。また、実施例と同様に、トラスツズマブの特異的修飾体のＤＡＲ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによるペプチド／抗体結合比（ＰＡＲ）の確認を行ったところ、リンカー長が６個以下または１１個以上の原子数である化合物（式（Ｉ）で表される化合物において、第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が４個未満または９個以上の原子数に相当するもの）は、０．５以下の平均ＰＡＲを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000110
［実施例１０：ＩｇＧ１　Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１　Ｆｃの異なる複数標的領域の位置選択的修飾、および抗体薬物複合体の合成］
（１０－１）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの位置選択的修飾に続く、チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　既報（ＷＯ２０１９／２４０２８７Ａ１）記載の下記ペプチド試薬をジメチルホルムアミドに溶解し１０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（中外製薬）５００μｇを２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）２００μＬ（２０μＭ）に溶解させ、１０ｍＭの上記ペプチド試薬を３．３８μＬ（抗体に対して１０当量）加えて、室温で１時間攪拌した。続いて既報（ＷＯ２０１９／２４０２８７Ａ１）に従いヒドロキシルアミン溶液を加え、室温で１時間静置した。得られたチオール導入抗体について、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、ヒドロキシルアミンによる切断反応が進行した１４８７６０にピークが確認された。下記ペプチド試薬が、ＩｇＧ重鎖の２４６／２４８位のリジン残基の修飾を可能にする試薬であることを考慮すると、ＩｇＧ重鎖の２４６／２４８位のリジン残基が下記ペプチド試薬で修飾されたと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
 上記アミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸配列である。
（１０－２）抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの異なる複数標的領域の位置選択的修飾
　（１０－１）で合成したチオール導入抗体溶液を５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．２）に置換した。この溶液に対して、（３－２）で合成したペプチドリンカー連結物のジメチルホルムアミド溶液を抗体に対して１０当量加えて、室温で１時間攪拌した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換した。得られた抗体について、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、（３－２）で合成したチオール導入抗体に対して結合性ペプチドが２個導入された１５７５３１のピークが確認された。
（１０－３）チオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　（１０－２）で得られた抗体中間体に対し、既報（ＷＯ２０１９／２４０２８７Ａ１）に従いヒドロキシルアミン溶液を加え、室温で１時間静置した。２時間後、２０ｍＭ　ＰＢＳバッファー、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）へと置換し、チオール基導入抗体誘導体を得た。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、切断反応が進行した１４８７６０にピークが確認された。よって、得られたチオール基導入抗体誘導体は、下記構造を有することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
 〔ここで、Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位（ＩｇＧ）を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成している。また、同様にＥｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２４６／２４８位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成している。２個の重鎖あたりの上記アミド結合の平均比率ｒ（２８８／２９０位）およびｎ（２４６／２４８位）は、評価の結果、それぞれ１．９、および２．０であった。〕
（１０－４）薬物ｍｉｍｉｃチオエステル基の切断によるチオール基導入抗体誘導体の製造
　（１０－３）で得られたチオール基導入抗体のｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４ＰＢＳバッファー）溶液（２０μＭ）に既報（Ｏｒｇ．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２０１９，２３，１２，２６４７－２６５４）のＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥのＤＭＦ溶液（１．２５ｍＭ）を１０当量加え、室温にて２時間静置後、ＮＡＰ－５　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製して、ＡＤＣを得た。ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥが４つ導入された１５４０２９にピークが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113

Claims (46)

  1. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｙは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩。
  2. 　脱離基が以下から選ばれる、請求項１記載の化合物またはその塩：
    （ａ）Ｒ－Ｓ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｓは、硫黄原子を示す。）；
    （ｂ）Ｒ－Ｏ（ここで、Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｏは、酸素原子を示す。）；
    （ｃ）ＲＡ－（ＲＢ－）Ｎ（ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、水素原子、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基、または置換基を有していてもよい１価の複素環基を示し、Ｎは、窒素原子を示す。）；または
    （ｄ）ハロゲン原子。
  3. 　前記イムノグロブリン単位がヒトイムノグロブリン単位である、請求項１または２記載の化合物またはその塩。
  4. 　前記イムノグロブリン単位がヒトＩｇＧである、請求項１～３のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  5. 　前記親和性ペプチドがリジン残基を含み、かつ前記リジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｙに隣接するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）とアミド結合を形成している、請求項１～４のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  6. 　前記親和性ペプチドが以下である、請求項１～５のいずれか一項記載の化合物またはその塩：
    （Ａ）ＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；または
    （Ｂ）ＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号１）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および付加からなる群より選ばれる１～５個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列（ここで、２７位のリジン残基、ならびに１位および３０位の２つのシステイン残基は維持される）を含む親和性ペプチド。
  7. 　前記（Ｂ）の親和性ペプチドが、以下からなる群より選ばれる、請求項６記載の化合物またはその塩：
    （ａ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
    （ｂ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＤＣ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
    （ｃ）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
    （ｄ）ＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；
    （ｅ）ＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド；および
    （ｆ）ＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＥＥＣ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む親和性ペプチド。
  8. 　前記親和性ペプチドにおけるＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基が、保護されていてもよく、かつ
    　前記親和性ペプチドにおける２つのシステイン残基（Ｃ）の側鎖中の２つのチオール基が、ジスルフィド結合により、またはリンカーを介して連結されていてもよい、請求項６または７記載の化合物またはその塩。
  9. 　前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記式（Ｉ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式中、
    　Ｘ、Ｙ、Ｏ、ＳおよびＷは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される、請求項１～８のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  10. 　前記式（Ｉ’）で表される化合物が、下記式（Ｉ’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     〔式中、
    　Ｘ、Ｙ、Ｏ、ＳおよびＷは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、前記式（Ｉ’）のものと同じである。〕で表される、請求項９記載の化合物またはその塩。
  11. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｙは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩を含む、抗体誘導体化用試薬。
  12. 　前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記式（Ｉ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     〔式中、
    　Ｘ、Ｙ、Ｏ、ＳおよびＷは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される、請求項１１記載の試薬。
  13. 　前記式（Ｉ’）で表される化合物が、下記式（Ｉ’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     〔式中、
    　Ｘ、Ｙ、Ｏ、ＳおよびＷは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、前記式（Ｉ’）のものと同じである。〕で表される、請求項１２記載の試薬。
  14. 　下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     〔式中、
    　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｙは、前記イムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個であり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩。
  15. 　抗体中間体がヒト抗体中間体である、請求項１４記載の抗体中間体またはその塩。
  16. 　抗体中間体がヒトＩｇＧ中間体である、請求項１４または１５記載の抗体中間体またはその塩。
  17. 　前記式（ＩＩ）で表される構造単位が、下記式（ＩＩ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     〔式中、
    　Ｉｇ、Ｙ、Ｏ、Ｓ、Ｗおよびｒは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される、請求項１４～１６のいずれか一項記載の抗体中間体またはその塩。
  18. 　前記式（ＩＩ’）で表される構造単位が、下記式（ＩＩ’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     〔式中、
    　Ｉｇ、Ｙ、Ｏ、Ｓ、Ｗおよびｒは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、前記式（ＩＩ’）のものと同じである。〕で表される、請求項１７記載の抗体中間体またはその塩。
  19. 　下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     〔式中、
    　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　ＳＨは、チオール基を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数が２～４個であり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩。
  20. 　前記２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基以外の特定アミノ酸残基がさらに修飾されている、請求項１９記載のチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
  21. 　前記特定アミノ酸残基が、２個の重鎖中の２４６／２４８位に存在するリジン残基である、請求項２０記載のチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
  22. 　前記式（ＩＩＩ）で表される構造単位が、下記式（ＩＩＩ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     〔式中、
    　Ｉｇ、Ｏ、ＳＨおよびｒは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じであり、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される、請求項１９～２１のいずれか一項記載のチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
  23. 　前記式（ＩＩＩ’）で表される構造単位が、下記式（ＩＩＩ’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     〔式中、
    　Ｉｇ、Ｏ、ＳＨおよびｒは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される、請求項２２記載のチオール基導入抗体誘導体またはその塩。
  24. 　下記式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     〔式中、
    　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｚは、機能性物質を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数が２～４個であり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩。
  25. 　前記２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基以外の特定アミノ酸残基がさらに修飾されている、請求項２４記載のコンジュゲートまたはその塩。
  26. 　前記特定アミノ酸残基が、２個の重鎖中の２４６／２４８位に存在するリジン残基である、請求項２５記載のコンジュゲートまたはその塩。
  27. 　前記式（ＩＶ）で表される構造単位が、下記式（ＩＶ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     〔式中、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｓ、Ｚおよびｒは、前記式（ＩＶ）のものと同じであり、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される、請求項２４～２６のいずれか一項記載のコンジュゲートまたはその塩。
  28. 　前記式（ＩＶ’）で表される構造単位が、下記式（ＩＶ’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     〔式中、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｓ、Ｚおよびｒは、前記式（ＩＶ）のものと同じである。〕で表される、請求項２７記載のコンジュゲートまたはその塩。
  29. 　下記式（Ｖ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　ＯＨは、ヒドロキシ基を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩。
  30. 　前記式（Ｖ）で表される化合物が、下記式（Ｖ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     〔式中、
    　Ｘ、Ｏ、ＯＨ、ＳおよびＷは、前記式（Ｖ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される、請求項２９記載の化合物またはその塩。
  31. 　前記式（Ｖ’）で表される化合物が、下記式（Ｖ’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     〔式中、
    　Ｘ、Ｏ、ＯＨ、ＳおよびＷは、前記式（Ｖ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、前記式（Ｖ’）のものと同じである。〕で表される、請求項３０記載の化合物またはその塩。
  32. 　前記式（Ｖ’’）で表される化合物が、下記式（Ｖ’’－１）または（Ｖ’’－２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     〔式中、
    　Ｏ、ＯＨ、ＳおよびＷは、前記式（Ｖ）のものと同じである。〕で表される、請求項３１記載の化合物またはその塩。
  33. 　下記式（ＶＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｘ’は、脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基を示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩。
  34. 　脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基が、ペンタフルオロフェニルオキシ基、テトラフルオロフェニルオキシ基、パラニトロフェニルオキシ基、またはＮ－スクシンイミジルオキシ基である、請求項３３記載の化合物またはその塩。
  35. 　前記式（ＶＩ）で表される化合物が、下記式（ＶＩ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     〔式中、
    　Ｘ、Ｘ’、Ｏ、ＳおよびＷは、前記式（ＶＩ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、主鎖を構成する原子数が３～５個である第２リンカーを示し、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、水素原子、または置換基を示す。〕で表される、請求項３３または３４記載の化合物またはその塩。
  36. 　前記式（ＶＩ’）で表される化合物が、下記式（ＶＩ’’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     〔式中、
    　Ｘ、Ｘ’、Ｏ、ＳおよびＷは、前記式（ＶＩ）のものと同じであり、
    　Ｌｂは、前記式（ＶＩ’）のものと同じである。〕で表される、請求項３５記載の化合物またはその塩。
  37. 　前記式（ＶＩ’’）で表される化合物が、下記式（ＶＩ’’－１）または（ＶＩ’’－２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     〔式中、
    　Ｏ、ＳおよびＷは、前記式（ＶＩ）のものと同じであり、
    　Ｆは、フッ素原子である。〕で表される、請求項３６記載の化合物またはその塩。
  38. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｙは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩を、前記イムノグロブリン単位を含む抗体と反応させて、
    　下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     〔式中、
    　Ｉｇは、前記イムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｙ、Ｏ、Ｓ、Ｗ、Ｌａ、およびＬｂは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩を生成することを含む、抗体中間体またはその塩の製造方法。
  39. 　（１）下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｙは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩を、前記イムノグロブリン単位を含む抗体と反応させて、
    　下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
     〔式中、
    　Ｉｇは、前記イムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｙ、Ｏ、Ｓ、Ｗ、Ｌａ、およびＬｂは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩を生成すること；ならびに
    （２）前記抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、
    　下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
     〔式中、
    　ＳＨは、チオール基を示し、
    　Ｉｇ、Ｌａおよびｒは、前記式（ＩＩ）のものと同じである。〕で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成することを含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩の製造方法。
  40. 　（１）下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｙは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩を、前記イムノグロブリン単位を含む抗体と反応させて、
    　下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
     〔式中、
    　Ｉｇは、前記イムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｙ、Ｏ、Ｓ、Ｗ、Ｌａ、およびＬｂは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む、抗体中間体またはその塩を生成すること；
    （２）前記抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、
    　下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
     〔式中、
    　ＳＨは、チオール基を示し、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｌａおよびｒは、前記式（ＩＩ）のものと同じである。〕で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成すること；ならびに
    （３）前記チオール基導入抗体誘導体またはその塩を、機能性物質と反応させて、
    　下記式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
     〔式中、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｚは、機能性物質を示し、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｌａおよびｒは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を生成することを含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩の製造方法。
  41. 　下記式（ＶＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｘ’は、脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基を示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩を、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドと反応させて、
    　前記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を生成することをさらに含む、請求項３８～４０のいずれか一項記載の方法。
  42. 　（１’）下記式（Ｖ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　ＯＨは、ヒドロキシ基を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩を、カルボキシル基修飾試薬と反応させて、
    　下記式（ＶＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
     〔式中、
    　Ｘ、Ｏ、Ｓ、Ｗ、ＬａおよびＬｂは、前記式（Ｖ）のものと同じであり、
    　Ｘ’は、脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基を示す。〕で表される化合物またはその塩を生成すること；ならびに
    （２’）前記式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩を、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドと反応させて、
    　前記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を生成することをさらに含む、請求項３８～４０のいずれか一項記載の方法。
  43. 　下記式（Ｖ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
     〔式中、
    　Ｘは、脱離基を示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　ＯＨは、ヒドロキシ基を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個である。〕で表される化合物またはその塩を、カルボキシル基修飾試薬と反応させて、
    　下記式（ＶＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
     〔式中、
    　Ｘ、Ｏ、Ｓ、Ｗ、ＬａおよびＬｂは、前記式（Ｖ）のものと同じであり、
    　Ｘ’は、脱離基Ｘよりも脱離する能力が高い脱離基を示す。〕で表される化合物またはその塩を生成することを含む、式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩の製造方法。
  44. 　下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
     〔式中、
    　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｙは、前記イムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個であり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、
    　下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
     〔式中、
    　ＳＨは、チオール基を示し、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｌａおよびｒは、前記式（ＩＩ）のものと同じである。〕で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成することを含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩の製造方法。
  45. 　（１）下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
     〔式中、
    　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｙは、前記イムノグロブリン単位におけるＣＨ２ドメインに結合領域を有する親和性ペプチドを示し、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｗは、酸素原子または硫黄原子を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　Ｌｂは、第２リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数、および第２リンカーにおける主鎖を構成する原子数の合計が、５～７個であり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む、抗体中間体またはその塩を、チオエステルの切断反応に供して、
    　下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
     〔式中、
    　ＳＨは、チオール基を示し、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｌａおよびｒは、前記式（ＩＩ）のものと同じである。〕で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を生成すること；ならびに
    （２）前記チオール基導入抗体誘導体またはその塩を、機能性物質と反応させて、
    　下記式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
     〔式中、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｚは、機能性物質を示し、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｌａおよびｒは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を生成することを含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩の製造方法。
  46. 　下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
     〔式中、
    　Ｉｇは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含むイムノグロブリン単位を示し、かつ、Ｅｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う２個の重鎖中の２８８／２９０位に存在するリジン残基の側鎖中のアミノ基を介して、Ｉｇに隣接するカルボニル基とアミド結合を形成しており、
    　Ｏは、酸素原子を示し、
    　ＳＨは、チオール基を示し、
    　Ｌａは、第１リンカーを示し、
    　第１リンカーにおける主鎖を構成する原子数が２～４個であり、
    　２個の重鎖あたりの前記アミド結合の平均比率ｒは、１．５～２．５である。〕で表される構造単位を含む、チオール基導入抗体誘導体またはその塩を、機能性物質と反応させて、
    　下記式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
     〔式中、
    　Ｓは、硫黄原子を示し、
    　Ｚは、機能性物質を示し、
    　Ｉｇ、Ｏ、Ｌａおよびｒは、前記式（ＩＩＩ）のものと同じである。〕で表される構造単位を含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩を生成することを含む、抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩の製造方法。
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