KR20210092445A - 저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 보습 및 피부 장벽을 개선시키는 방법 - Google Patents

저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 보습 및 피부 장벽을 개선시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 저온 아르곤 플라즈마는 피부장벽을 이루는 각질세포에 포함된 보습인자인 필라그린(FLG), 인볼루클린(IVL) 및 히알루론산의 합성효소인 히알루로난 신타제(HAS) 1 및 2의 발현을 증가시키고, 섬유아세포에서의 콜라겐을 증가 및 탄력섬유 분해효소를 감소시킴으로써, Hippo 경로를 통한 YAP에 의해 매개되는 피부 장벽, 피부 보습 및 피부 노화 개선 효과와 상처 치유 효과를 나타낼 수 있다.

Description

저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 보습 및 피부 장벽을 개선시키는 방법{Method of skin moisturizing and improving skin barrier using low temperature argon plasma}
본 발명은 저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 보습 및 피부 장벽 개선 방법에 관한 것으로, 피부에 저온 아르곤 플라즈마를 처리하는 단계를 포함하는 피부 장벽을 강화 또는 개선, 피부 보습, 피부 건조 개선, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 노화 개선, 피부 재생 또는 피부 상처 치료 방법에 관한 것이다.
히포(Hippo) 경로는, 세포 증식 및 세포 사멸을 조절하고 기관 크기를 결정하는 신호전달 경로이다. 상기 경로는 포유동물에서 종양 억제자로서의 역할을 하는 것으로 여겨지며, 인간 암에서 이러한 경로의 장애가 종종 검출된다. 상기 경로는 줄기 세포 및 전구 세포의 자기-재생 및 분화에 관여하고/거나 이를 조절할 수 있다. 또한, 히포 경로는 상처 치유 및 조직 재생에 관여할 수 있다. 또한, 히포 경로는 다른 신호전달 경로, 예컨대 Wnt, Notch 및 헷지호그와 교차-소통하기 때문에 광범위하게 다양한 생물학적 사건에 영향을 미칠 수 있고, 이의 기능장애는 암 이외에도 피부 질환 등 다수의 인간 질환에 관여할 수 있는 것으로 여겨진다.
포유동물 히포 경로의 핵심 성분 중 2개는 Lats1 및 Lats2이며, 이는 드로소필라 와르츠(Warts) (Wts)에 상동성인 핵 Dbf2-관련 (NDR) 패밀리 단백질 키나제이다. Lats1/2 단백질은 드로소필라 매츠(Mats)에 상동성인 스캐폴드 단백질 Mob1A/B (Mps 원 바인더 키나제 활성화제-유사 1A 및 1B)와의 회합에 의해 활성화된다. 또한, Lats1/2 단백질은 드로소필라 히포에 상동성인 STE20 패밀리 단백질 키나제 Mst1 및 Mst2에 의한 인산화에 의해 활성화된다. Lats1/2 키나제는 드로소필라 요르키(Yorkie)에 상동성인 하류 이펙터 YAP (Yes-연관 단백질) 및 TAZ (PDZ-결합 모티프를 갖는 전사 보조활성화제; WWTR1)를 인산화시킨다. Lats1/2에 의한 YAP 및 TAZ의 인산화는 히포 신호전달 경로 내에서 중요한 사건이다. Lats1/2는 다중 부위에서 YAP를 인산화시키지만, Ser127의 인산화가 YAP 억제에 결정적이다. YAP의 인산화는 14-3-3 패밀리 단백질에 대한 단백질-결합 모티프를 생성시키고, 이는 14-3-3 단백질의 결합에 따라 세포 세포질에서의 YAP의 잔류 및/또는 격리로 이어진다. 마찬가지로, Lats1/2는 다중 부위에서 TAZ를 인산화시키지만, Ser89의 인산화가 TAZ 억제에 결정적이다. TAZ의 인산화는 세포 세포질에서의 TAZ의 잔류 및/또는 격리로 이어진다. YAP와 유사하게, TAZ의 인산화 또한 14-3-3 결합 부위를 생성시킨다. 또한, YAP 및 TAZ의 인산화는 YAP 또는 TAZ 유비퀴틴화에 의해 촉매되는 인산화-의존성 분해를 활성화함으로써 이들 단백질을 탈안정화시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 히포 경로가 "온"인 경우에, YAP 및/또는 TAZ는 인산화되고, 불활성이며, 일반적으로 세포질에서 격리되고; 대조적으로, 히포 경로가 "오프"인 경우에, YAP 및/또는 TAZ는 비-인산화되고, 활성이며, 일반적으로 핵에서 발견된다.
비-인산화되고 활성화된 YAP는 세포 핵 내로 전위되며, 여기서 그의 주요 표적 전사 인자는 TEA-도메인-함유 패밀리의 4종의 단백질(TEAD1-TEAD4, 총괄적으로 "TEAD")이다. YAP는 TEAD(또는 다른 전사 인자, 예컨대 Smad1, RUNX, ErbB4 및 p73)와 함께 결합 조직 성장 인자 (CTGF), Gli2, Birc5, Birc2, 섬유모세포 성장 인자 1 (FGF1) 및 암피레귤린 (AREG)을 비롯한 다양한 유전자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. YAP와 유사하게, 비-인산화된 TAZ도 세포 핵 내로 전위되며, 여기서 이는 다수의 DNA-결합 전사 인자, 예컨대 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 γ (PPARγ), 갑상선 전사 인자-1 (TTF-1), Pax3, TBX5, RUNX, TEAD1 및 Smad2/3/4와 상호작용한다. YAP/TAZ-전사 인자 복합체에 의해 활성화된 다수의 유전자는 세포 생존 및 증식을 매개한다. 따라서, 일부 조건 하에 YAP 및/또는 TAZ는 종양유전자로서 작용하고, 히포 경로는 종양 억제자로서 작용한다. 따라서, 히포 경로를 표적화하는 것은 암, 피부 질환 및 다른 질환에 대한 치료적 개입을 위한 또 다른 영역일 수 있다.
한편, 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 또는 히알루로난(hyaluronan)은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질이다. 거대 분자의 글리코사미노글리칸 패밀리에 속하는 다당류로서, N-아세틸글루코사민 및 β-글루쿠론산의 반복 이당류로 구성되며, 수산화기(-OH)가 많기 때문에 친수성 물질이며, 포유동물 등의 피부에서 보습 작용을 한다. 특히, 표피에 풍부하게 존재하여 조직의 수분을 유지하여 외부환경에 대해 효과적인 피부 장벽을 형성할 수 있도록 하는 중요한 역할을 한다. 히알루로난 신타제(hyaluronan synthase, HAS) 1 내지 3은 이러한 HA를 생산하는 것으로 알려져 있으며, 상기 HAS 1-3은 상처 복구 및 종양 등의 부위에서 차별적으로 발현이 증가된다. HAS 효소는 다수의 막 스패닝 서열을 함유하는 단백질이며, 원형질막에 내장된 글리코실 트랜스퍼라제로 유일하게 공지되어 있다.
본 발명자들은 저온 아르곤 플라즈마 (low-temperature argon plasma, LTAP)가 Hippo 신호 경로에서 세포 증식 및 상처 치유를 촉진하는 주요 전사 인자인 YAP, 피부 보습 및 피부 장벽 관련 인자로 알려진 HAS 및 필라그린 등에 미치는 영향을 확인한 결과, YAP에 의해 매개되는 피부 상태 변화를 개선시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2015-0018604호
본 발명의 목적은 저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 저온 아르곤 플라즈마를 이용한 피부 재생 또는 피부 상처 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 방법을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 재생 또는 피부 상처 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 저온 아르곤 플라즈마는 피부장벽을 이루는 각질세포에 포함된 보습인자인 필라그린(FLG), 인볼루클린(IVL) 및 히알루론산의 합성효소인 히알루로난 신타제(HAS) 1 및 2의 발현을 증가시키고, 섬유아세포에서의 콜라겐을 증가 및 탄력섬유 분해효소를 감소시킴으로써, Hippo 경로를 통한 YAP에 의해 매개되는 피부 장벽, 피부 보습 및 피부 노화 개선 효과와 상처 치유 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 HaCaT(A) 및 NHEK(B) 세포주에서 본 발명의 저온 아르곤 플라즈마(LTAP) 처리 시간에 따른 필라그린(FLG), 인볼루클린(IVL) 및 히알루로난 신타제(HAS) 1 및 2의 발현 수준을 웨스턴 블랏 또는 qRT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HDF 세포에서 본 발명의 저온 아르곤 플라즈마(LTAP) 처리 시간에 따른 콜라겐(collagen) Ⅰ 및 Ⅲ 의 발현 수준 및 탄력섬유 분해효소(MMP-3)의 발현 수준을 웨스턴 블랏(A) 또는 qRT-PCR(B)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HaCaT, NHEK 및 HDF 세포에서 저온 아르곤 플라즈마(LTAP) 처리 시간에 따른 YAP/TAZ의 단백질 발현 수준(A)과 HaCaT 세포에서 베르테포르핀(verteporfin) 처리에 따른 YAP/TAZ의 단백질 발현 수준(B), 필라그린(FLG), 인볼루클린(IVL) 및 히알루로난 신타제(HAS) 1의 발현 수준(C) 및 콜라겐(Collagen) Ⅰ 및 Ⅲ 발현 수준(D)을 웨스턴 블랏 또는 qRT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
피부 장벽, 피부 보습 또는 피부 노화 개선 및 피부 상처 치료 방법
본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마를 처리하는 단계를 포함하는 피부 장벽을 강화 또는 개선, 피부 보습, 피부 건조 개선, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 노화 개선, 피부 재생 또는 피부 상처 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 "저온 아르곤 플라즈마"는 부산대학교에서 제공받은 저온 아르곤 플라즈마 장치를 이용하여 처리되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 아르곤 플라즈마 제트를 생성할 수 있는 시중의 다른 장치를 이용할 수 도 있다. 아르곤가스 유량을 분당 1 내지 3리터(liter per minutes)로 처리하는 것일 수 있고, 바람직하게는 분당 1.5 내지 2.5리터로 처리하는 것일 수 있다. 상기 장치에서 발생되는 아르곤 플라즈마의 온도는 10 내지 40℃일 수 있고, 40℃가 넘는 온도일 경우 열적 손상에 의한 피부 또는 세포의 괴사가 일어날 수 있다.
본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마를 30초 내지 10분 동안 처리하는 것일 수 있다. 바람직하게는 2분 내지 8분 동안 처리하는 것일 수 있고, 저온 아르곤 플라즈마를 상기 범위보다 짧거나 길게 처리할 경우 피부 또는 세포가 손상되거나 피부 장벽 강화 또는 개선 효과가 저하될 수 있다. 보다 바람직하게는, 4분 내지 7분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 장벽 강화 또는 개선 효과가 향상될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 4분 내지 6분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 장벽 강화 또는 개선 효과가 극대화 될 수 있다. 4.5분 내지 5.5분 동안 처리하는 것이 특히 바람직하며, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 때 상기 효과가 가장 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 히포(hippo) 경로를 통해 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있고, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 YAP(yes-연관 단백질)에 의해 매개되는 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 필라그린, 인볼루클린 및 히알루로난 신타제 중 1종 이상의 인자의 발현을 증가시켜 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마를 30초 내지 10분 동안 처리하는 것일 수 있다. 바람직하게는 2분 내지 7분 동안 처리하는 것일 수 있고, 저온 아르곤 플라즈마를 상기 범위보다 짧거나 길게 처리할 경우 피부 또는 세포가 손상되거나 피부 보습 또는 피부 건조 개선 효과가 저하될 수 있다. 보다 바람직하게는, 4분 내지 7분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 보습 또는 피부 건조 개선 효과가 향상될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 4분 내지 6분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 보습 또는 피부 건조 개선 효과가 극대화 될 수 있다. 4.5분 내지 5.5분 동안 처리하는 것이 특히 바람직하며, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 때 상기 효과가 가장 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 히포(hippo) 경로를 통해 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있고, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 YAP(yes-연관 단백질)에 의해 매개되는 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 필라그린, 인볼루클린 및 히알루로난 신타제 중 1종 이상의 인자의 발현을 증가시켜 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마를 30초 내지 10분 동안 처리하는 것일 수 있다. 바람직하게는 2분 내지 7분 동안 처리하는 것일 수 있고, 저온 아르곤 플라즈마를 상기 범위보다 짧거나 길게 처리할 경우 피부 또는 세포가 손상되거나 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화 개선 효과가 저하될 수 있다. 보다 바람직하게는, 4분 내지 7분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화 개선 효과가 향상될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 4분 내지 6분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화 개선 효과가 극대화 될 수 있다. 4.5분 내지 5.5분 동안 처리하는 것이 특히 바람직하며, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 때 상기 효과가 가장 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 히포(hippo) 경로를 통해 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있고, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 YAP(yes-연관 단백질)에 의해 매개되는 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 콜라겐을 증가 또는 탄력섬유 분해효소를 감소시켜 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 재생 또는 피부 상처 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마를 30초 내지 10분 동안 처리하는 것일 수 있다. 바람직하게는 2분 내지 7분 동안 처리하는 것일 수 있고, 저온 아르곤 플라즈마를 상기 범위보다 짧거나 길게 처리할 경우 피부 또는 세포가 손상되거나 피부 재생 또는 피부 상처 치료 효과가 저하될 수 있다. 보다 바람직하게는, 4분 내지 7분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 재생 또는 피부 상처 치료 효과가 향상될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 4분 내지 6분 동안 처리하는 것일 수 있고, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 경우 피부 재생 또는 피부 상처 치료 효과가 극대화 될 수 있다. 4.5분 내지 5.5분 동안 처리하는 것이 특히 바람직하며, 상기 범위의 시간동안 저온 아르곤 플라즈마를 처리할 때 상기 효과가 가장 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 히포(hippo) 경로를 통해 피부 재생 또는 피부 상처 치료 효과를 나타내는 것일 수 있고, 상기 저온 아르곤 플라즈마는 YAP(yes-연관 단백질)에 의해 매개되는 피부 재생 또는 피부 상처 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<준비예 1> 세포배양 및 저온 아르곤 플라즈마의 처리
인간 각질형성 세포 (Human keratinocyte Cell line)인 HaCaT 세포, NHEK (Normal Human Epidermal Keratinocytes) 세포 및 인간 섬유아세포 (Human Dermal Fibroblasts)인 HDF 세포를 35mm 배양접시에 3×105 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아혈청 (FBS, fetal bovine serum)이 10% 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지와 인간 각질 형성세포 성장 보조제 (HKGS, Human Keratinocyte Growth Supplement,Gibco,USA)가 함유된 MEP1500CA (Gibco,USA) 배지에서 24시간 배양하였다.
그 후, 저온 아르곤 플라즈마 (low-temperature argon plasma, LTAP / 부산대학교 제작) 장치로 저온 아르곤 플라즈마를 1분, 3분, 5분 및 7분 동안 처리하고 24시간 후 하기의 실험을 진행하였다.
이 때, 상기 장치의 플라즈마 온도는 40℃ 이하가 되도록하여 열적인 손상에 의한 세포의 괴사를 막아주었으며, 전원모듈에서 900MHz, 2.5W의 마이크로파 전력으로 아르곤 플라즈마 제트를 생성시킬 수 있도록 설계되었다. 입력전원을 측정하기 위해 RF power meter (EPM-441A; HP, Georgia, USA)를 이용하였다. 아르곤가스(KOFLOC, Ar-05) 유량은 분당 2리터(liter per minutes)이며, 플로우 미터기 (Ar-05; KOFLOC, Tokyo, Japan)로 가스 유량을 측정하였다.
<실험예 1> 웨스턴 블랏 및 qRT-PCR 분석 방법
분석 대상 인자들의 단백질 및 유전자 발현을 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏(western blotting) 및 qRT-PCR을 수행하였다.
먼저, 웨스턴 블랏 분석을 위하여, 상기 준비예의 조건으로 처리된 시험그룹의 세포를 2mM EDTA, 137mM NaCl, 20mM PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride), 1% 트리톤 X100, 10%글리세롤 및 프로테아제 억제제 칵테일(aprotease inhibitor cocktail)이 들어있는 RIPA 완충액으로 용해하여 homogenization 을 시켰다. 14,000rpm 에서 20 분간 원심분리 후 상등액을 취하여 정량 및 분석에 사용하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad의 Bradford protein assay solution을 사용하여 측정하였다. 그후 10% 아크릴아마이드 겔 (actylamide gel)을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 이를 나일론 멤브레인에 옮긴 후 FLG (필라그린, Filaggrin), IVL (인볼루클린, Involucrin), HAS (히알루로난 신타제, hyaluronan synthase) 1 및 2, YAP (yes-연관 단백질, yes-associated protein), TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif), MMP-3 (matrix matalloproteinase-3), 콜라겐(Collagen) Ⅰ 및 III, β-actin (abcam, USA) 항체를 이용하여 검출 한 후 영상분석기인 LAS3000 Imaging system (FUJI film, 일본)으로 형상화하였다.
한편, qRT-PCR 분석을 위한 RNA는 모두 TRIzol reagent (Invitrogen)을 이용하여 분리하였다. 총 RNA의 1 microgram이 QuantiTech reverse Transcription kit (Qiagen)에 의해 역전사 되었다. 적어도 3개의 독립적인 RNA 샘플을 이용해 qRT-PCR analysis가 수행되었는데, 이 때 mRNA의 상대적인 양은, 대조군으로서 GAPDH와 함께 ΔCt 방법(delta Ct = Ct (gene) - Ct (control gene, GAPDH))을 사용하여 산출되었다. 실험에 사용된 프라이머들은 Qiagen로부터 구입하거나 코스모진텍에서 제작하였다.
<실험예 2> 저온 아르곤 플라즈마 처리에 따른 피부장벽 및 보습인자 발현 분석
HaCaT, NHEK 세포주에 저온 아르곤 플라즈마(LTAP)를 각각 1분, 3분 및 5분 또는 1분, 3분, 5분 및 7분 동안 처리하여 24시간 후 세포를 수확하여 피부장벽과 피부보습인자에 미치는 영향을 qRT-PCR과 웨스턴 블랏을 통해 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 피부장벽을 이루는 각질세포에 포함된 보습인자인 FLG, IVL 및 히알루론산의 합성효소인 HAS-1 및 2의 발현양이 LTAP의 처리로 인하여 유의하게 증가됐음을 확인하였고, 특히 LTAP를 5분 동안 처리한 경우 가장 많이 증가된 것을 확인하였다.
<실험예 3> 저온 아르곤 플라즈마 처리에 따른 피부 노화 및 피부 탄력 관련 인자 발현 분석
인간 섬유아세포에 저온 아르곤 플라즈마(LTAP)를 처리하였을 때 피부노화 인자들의 발현양을 알아보기 위하여 각각의 조건으로 처리된 군의 단백질과 mRNA 추출물을 각 항체와 프라이머를 이용하여 western blotting과 qRT-PCR로 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, LTAP를 처리한 군에서 collagen Ⅰ 및 Ⅲ 의 발현양이 증가되는 것을 확인하였고, 탄력섬유 분해효소인 MMP-3 에서는 현저하게 감소되는 경향을 보였다. 특히, LTAP를 5분 동안 처리한 경우 LTAP 무처리군 대비 발현 수준 변화가 가장 크게 나타났다.
<실험예 4> 저온 아르곤 플라즈마 처리에 따른 YPA/TAZ 관련 인자 발현 분석
히포(Hippo) 경로의 주요 하위 신호전달자인 YPA/TAZ는 조직 항상성, 세포의 크기조절, 재생, 발암 과정 등에 주요한 인자로 알려져 있다. YAP/TAZ의 발현이 억제되었을 때의 저온 아르곤 플라즈마(LTAP) 처리에 따른 피부보습 및 노화인자의 발현양을 확인함으로써, 이들 간의 상호작용을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3A에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포와 NHEK 및 HDF의 세포 모두 저온 아르곤 플라즈마(LTAP)를 처리하였을 때 YAP/TAZ의 단백질 수준은 증가하였고, LTAP를 5분 동안 처리하였을 때 가장 많은 발현양 증가를 나타냈다.
도 3B에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 YAP/TAZ의 억제제인 베르테포르핀(verteporfin)을 처리하여 YAP/TAZ의 단백질 발현양을 확인한 결과, 가장 낮은 농도인 5μM에서도 YAP/TAZ의 발현이 억제됨을 확인하였다.
마찬가지로 도 3C 및 도 3D에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 verteporfin을 5, 10, 20μM로 처리하여 FLG, IVL 및 HAS1의 mRNA 발현양을 확인한 결과 verteporfin의 농도가 높아질수록 FLG, IVL 및 HAS1의 억제율이 높은 것을 확인하였고, HDF 세포에 동일하게 verteporfin을 5, 10, 20μM로 처리하여 Collagen Ⅰ, Ⅲ를 확인한 결과, HaCaT 세포에서의 결과와 비슷한 양상으로 결과를 얻을 수 있었으며, 특히 Collagen Ⅰ, Ⅲ의 발현양은 가장 낮은 농도인 5μM에서부터 월등하게 억제됨을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 저온 아르곤 플라즈마는 피부장벽을 이루는 각질세포에 포함된 보습인자인 필라그린(FLG), 인볼루클린(IVL) 및 히알루론산의 합성효소인 히알루로난 신타제(HAS) 1 및 2의 발현을 증가시키고, 섬유아세포에서의 콜라겐을 증가 및 탄력섬유 분해효소를 감소시킴으로써, Hippo 경로를 통한 YAP에 의해 매개되는 피부 장벽, 피부 보습, 피부 노화 및 상처 치유 개선 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마를 30초 내지 10분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마를 2분 내지 8분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마를 4분 내지 7분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마는 히포(hippo) 경로를 통해 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마는 YAP(yes-연관 단백질)에 의해 매개되는 피부 장벽을 강화 또는 개선시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마는 필라그린, 인볼루클린 및 히알루로난 신타제 중 1종 이상의 인자의 발현을 증가시켜 피부 보습 또는 피부 건조를 개선시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마는 콜라겐을 증가 또는 탄력섬유 분해효소를 감소시켜 피부 탄력, 피부 주름 또는 피부 노화를 개선시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 피부에 저온 아르곤 플라즈마(low-temperature argon plasma, LTAP)를 처리하는 단계를 포함하는 피부 재생 또는 피부 상처 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 저온 아르곤 플라즈마는 YAP(yes-연관 단백질)에 의해 매개되는 피부 재생 또는 피부 상처 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
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