KR101780804B1 - 치주 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 구강 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계; (b) 단계(a)의 구강 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; (c) 단계(b)의 구강 세포에서 PPARδ의 활성화도, Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 PPARδ의 활성화도 증가를 통한 상기 Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는 치주 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 치주 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법은 치주 질환 치료제의 선별을 효과적으로 수행할 수 있으며, PPARδ의 활성화도를 증가시켜 세포내 Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 치주 질환 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

치주 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{Method for screening compound for preventing or treating periodontal disease and pharmaceutical composition for preventing or treating periodontal disease}
본 발명은 치주 질환 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
아연(Zn)을 함유하는 펩티드내부가수분해효소(endopeptidase)의 일종인 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)군은, 결합조직 단백질의 항상성(homeostasis) 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다(Visse and Nagase 2003). 이와 같은 MMP군은 섬유아세포(fibroblast)와 치주조직(periodontium)의 주요 세포에서 당지질(lipopolysaccharide, LPS), 산화 스트레스(oxidative stress) 및 사이토카인(cytokine)을 포함하는 다양한 자극인자에 의해 반응하여 활성화되고 분비되는 것으로 알려져있다(Uitto et al. 2003; Hajishengallis 2015).
일례로, LPS은 치아를 지지하는 지지조직의 파괴에 연관된 MMP군을 활성화한다고 보고된 바 있으며(Darveau 2010; Hajishengallis 2015), 이것은 특히 치주염(periodontitis)에서 핵심적인 박태리아성 병원체로 알려진 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 유래 LPS의 경우에도 동일하다.
치주 질환을 앓고 있는 환자의 잇몸에 열구전색액(crevicular fluid)과 잇몸 조직에서 MMP군의 농도 증가 및 활성화가 관측되는 것으로 보고된 바 있다(Soell et al. 2002). 포르피로모나스 긴기발리스 유래 당지질(P. gingivalis-derived LPS, Pg-LPS) 또는 배양상층액으로 각각 처리된 인간 치근 섬유 아세포와 치주인대 세포에서 MMP군 중에서도 특히, MMP-2의 활성 증가가 탐지된다고 보고된 바 있다(Kuo et al. 2012; Pattamapun et al. 2003).
Pg-LPS로 자극이 유도된 치주조직에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 기질분해 MMP군의 활성화와 염증전 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 상향 조절(upregulating)에 의해 치주 질환의 발병에 기여한다는 사실이 보고된 바 있다(Golz et al. 2014; Kim et al. 2007). 더욱이, HGF 세포에서 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine, NAC)이 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 및 p38 MAP 인산화효소(p38 mitogen-activated protein kinase)의 신호전달경로를 통해 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성화와 염증전 사이토카인의 발현을 방지하며, Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성화에 MAP 인산화효소의 신호전달계(signal cascade)가 연관되어 있음이 보고된 바 있다(Kim et al. 2007).
현재, 치주 질환을 평가하는 지표로 활용되는 콜라겐을 포함하는 윗잇몸 결합조직의 분해에는 MMP군이 주요한 효소로 작용할 것으로 고려되고 있다(Ejeil et al. 2003). 사실상, Pg-LPS에 의해 유도되는 ROS의 생성은 HGF 세포에서 콜라겐 분해를 촉진하는 MMP-2의 활성화를 유도하는 것으로 알려져있다(Matsui et al. 2011; Aimes and Quigley 1995). 그러므로, 잇몸조직에서 생화학적 반응의 복잡한 신호전달계에 의해 유도되는 Pg-LPS에 의해 개시된 질병을 방지하기 위해 MMP군의 생성을 저해하는 것이 바람직한 전략이 될 것이다.
핵수용체의 상과(superfamily)에 포함되는 전사인자인 페록시솜증식체활성화수용체군(Peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)은 리간드 의존성 전사 활성화 및 억제를 통해 수많은 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져있다 (Kersten et al. 2000). 포유류에서 분리 동정된 세가지 주요한 PPAR 동형 단백질(isoform)인 PPARα(NR1C1), PPARδ(NR1C2) 및 PPARγ(NR1C3)은 각각의 다른 유전자에 의해 암호화되는 것으로 알려져있다(Kersten et al. 2000). PPARα 및 PPARγ와는 대조적으로 PPARδ는 다양한 세포 계통에서 흔하게 발현되며, 생물학적 과정들에서 다양한 형세와 연관되어 있다고 알려져있다(Neels and Grimaldi 2014). 최근, PPARδ는 염증전 사이토카인의 생성과 잇몸 점막 조직의 상처를 완화하여 실험적 치주염에서 항염증인자로서의 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다(Di Paola et al. 2011).
PPARδ의 활성화는 콜라겐 I, 콜라겐 III, 피브로넥틴 또는 엘라스틴과 같은 세포외 기질 단백질(extracellular matrix, ECM)의 발현을 유도하는 것으로 알려져있다(Kim et al. 2009). 게다가, 최근 리간드 활성화된 PPARδ는 JNK 신호전달의 MAP 인산화효소 탈인산가수분해효소 7에 의해 자외선 B에 의해 유도된 MMP-1의 분비를 저해하는 것으로 입증된 바 있다(Ham et al. 2013).
또한, PPARδ는 평활근세포에서 ROS의 생성을 감소시켜 PI3K/Akt 및 p38 MAP 인산화효소의 신호전달을 지연시켜 안지오텐신 II에 의해 유도된 MMP-2의 활성화를 조절하는 것으로 알려져있다(Ham et al. 2014a).
ECM 단백질의 발현 증가(upregulation)와 MMP군의 활성화 방지 및 염증 반응에서의 유용한 특성에 근거해 볼 때(Kim et al. 2009; Di Paola et al. 2011; Ham et al. 2013; Ham et al. 2014a,b), PPARδ는 치주 질환의 치료를 위한 바람직한 표적물질이 될 수 있다.
그러나, 현재까지 알려진 PPARδ와 관련한 MMP-2의 상세한 작용 기전은 알려진 바 없으며, 보다 효과적으로 치주 질환을 치료하기 위하여 PPARδ을 이용한 치주 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법이 요구된다.
1. Aimes RT, Quigley JP. 1995. Matrix metalloproteinase-2 is an interstitial collagenase. Inhibitor-free enzyme catalyzes the cleavage of collagen fibrils and soluble native type I collagen generating the specific 3/4- and 1/4-length fragments. J Biol Chem. 270(11):5872-5876. 2. Darveau RP. 2010. Periodontitis: a polymicrobial disruption of host homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8(7):481-490. 3. Di Paola R, Briguglio F, Paterniti I, Mazzon E, Oteri G, Militi D, Cordasco G, Cuzzocrea S. 2011. Emerging role of PPAR-β/δ in inflammatory process associated to experimental periodontitis. Mediators Inflamm. 2011:787159. 4. Ejeil AL, Gaultier F, Igondjo-Tchen S, Senni K, Pellat B, Godeau G, Gogly B. 2003. Are cytokines linked to collagen breakdown during periodontal disease progression J Periodontol. 74(2):196-201. 5. Golz L, Memmert S, Rath-Deschner B, Jager A, Appel T, Baumgarten G, Gotz W, Frede S. 2014. LPS from P. gingivalis and hypoxia increases oxidative stress in periodontal ligament fibroblasts and contributes to periodontitis. Mediators Inflamm. 2014:986264. 6. Ham SA, Kang ES, Lee H, Hwang JS, Yoo T, Paek KS, Park C, Kim JH, Lim DS, Seo HG. 2013. PPARδ inhibits UVB-induced secretion of MMP-1 through MKP-7-mediated suppression of JNK signaling. J Invest Dermatol. 133(11):2593-2600. 7. Ham, SA, Lee H, Hwang JS, Kang ES, Yoo T, Paek KS, Do JT, Oh JW, Kim JH, et al. 2014a. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor δ inhibits angiotensin II-induced activation of matrix metalloproteinase-2 in vascular smooth muscle cells. J Vasc Res 51(3):221-230. 8. Ham SA, Yoo T, Hwang JS, Kang ES, Paek KS, Park C, Kim JH, Do JT, Seo HG. 2014b. Peroxisome proliferator-activated receptor δ modulates MMP-2 secretion and elastin expression in human dermal fibroblasts exposed to ultraviolet B radiation. J Dermatol Sci. 76(1):44-50. 9. Kersten S, Desvergne B, Wahli W. 2000. Roles of PPARs in health and disease. Nature 405(6785):421-424. 10. Kim do Y, Jun JH, Lee HL, Woo KM, Ryoo HM, Kim GS, Baek JH, Han SB. 2007. N-acetylcysteine prevents LPS-induced pro-inflammatory cytokines and MMP2 production in gingival fibroblasts. Arch Pharm Res. 30(10):1283-1292. 11. Kuo PJ, Tu HP, Chin YT, Lu SH, Chiang CY, Chen RY, Fu E. 2012 Cyclosporine-A inhibits MMP-2 and -9 activities in the presence of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide: an experiment in human gingival fibroblast and U937 macrophage co-culture. J Periodontal Res. 47(4):431-438. 12. Matsui S, Tsujimoto Y, Ozawa T, Matsushima K. 2011. Antioxidant effects of antioxidant biofactor on reactive oxygen species in human gingival fibroblasts. J Clin Biochem Nutr. 48(3):209-213. 13. Neels JG, Grimaldi PA. 2014. Physiological functions of peroxisome proliferator-activated receptor β. Physiol Rev. 94(3):795-858. 14. Pattamapun K, Tiranathanagul S, Yongchaitrakul T, Kuwatanasuchat J, Pavasant P. 2003. Activation of MMP-2 by Porphyromonas gingivalis in human periodontal ligament cells. J Periodontal Res. 38(2):115-121. 15. Soell M, Elkaim R, Tenenbaum H, Cathepsin C. 2002. Matrix metalloproteinases, and their tissue inhibitors in gingiva and gingival crevicular fluid from periodontitis-affected patients. J Dent Res. 81(3):174-178. 16. Uitto VJ, Overall CM, McCulloch C. 2003. Proteolytic host cell enzymes in gingival crevice fluid. Periodontol 2000. 31:77-104. 17. Visse R, Nagase H. 2003. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res. 92(8):827-839.
본 발명의 발명자들은 PPARδ와 관련한 MMP-2의 상세한 작용 기전에 대하여 연구하던 중, 인간 치경 섬유아세포(human gingival fibroblasts, HGF)에서 리간드 활성화된 PPARδ가 Nox4의 발현을 억제(downregulation)하여 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 유래 당지질(Pg-LPS)에 의해 유도되는 MMP-2의 활성화가 조절된다는 사실을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 구강 세포에서 PPARδ의 활성화도, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 치주 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, (a) 구강 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계; (b) 단계(a)의 구강 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; (c) 단계(b)의 구강 세포에서 PPARδ의 활성화도, Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 PPARδ의 활성화도 증가를 통한 상기 Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는 치주 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 단계(a)의 염증 자극 인자는 당지질을 포함할 수 있고, 상기 당지질이 포르피로모나스 진지발리스 유래 당지질일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계(c)의 Nox4 단백질의 발현량은 면역블럿팅법에 의해 확인될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계(c)의 MMP-2 단백질의 활성은 젤라틴 자이모그래피법에 의해 확인될 수 있다.
또한, 본 발명은 PPARδ의 활성화도 증가, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성 감소 효과를 갖는 물질을 포함하는 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 PPARδ의 활성화도 증가, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성 감소 효과를 갖는 물질은 GW501516일 수 있다.
본 발명에 의해, 인간 치경 섬유아세포(human gingival fibroblast, HGF)에서 리간드 활성화된 PPARδ가 Nox4 단백질의 발현을 억제하여 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 유래 당지질(Pg-LPS)에 의해 유도되는 MMP-2 단백질의 활성을 억제함으로써 치주 질환을 상당히 개선하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의, 구강 세포에서 PPARδ의 활성화도, Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 치주 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법은 치주 질환 치료제의 선별을 효과적으로 수행할 수 있으며, PPARδ의 활성화도를 증가시켜 세포내 Nox4 단백질의 발현 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 치주 질환 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HGF 세포에서 리간드 활성화된 PPARδ가 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성화를 저해한다는 사실을 나타내는 결과이다.
(A) 표시된 시간 동안 Pg-LPS를 포함하거나, Pg-LPS를 포함하지 않은 조건에서 세포를 배양하였다.
(B) 다양한 Pg-LPS 농도 조건으로 48시간 동안 세포를 배양하였다.
(C) 다양한 농도(1, 10, 50, 100 또는 200 nM)의 GW501516로 선처리된 세포를 Pg-LPS 존재하에서 48시간 동안 배양하였다.
(D) PPARδ siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질 주입된 세포를 Pg-LPS를 포함하거나, Pg-LPS를 포함하지 않은 조건에서 배양하고, Pg-LPS를 포함하거나, Pg-LPS를 포함하지 않은 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
(E) GSK0660로 30분 동안 선처리된 세포를 GW501516를 포함하는 조건에서 24시간 동안 배양하고, 48시간동안 Pg-LPS에 노출시켰다. 농도가 조절된 배양배지에서 수득한 단백질 표본을 젤라틴을 함유한 SDS-폴리아크릴아마이드겔에서 전기영동하였다. MMP-2 효소 활성화는 쿠마시 브릴리언트블루 R-250(Coomassie brilliant blue R-250)으로 염색하여 측정하였다.
(A-E) 표시되는 블럿과 측정된 농도값을 보여준다.
(F) 표시된 농도의 GW501516의 조건에서 24시간 동안 세포를 배양하고, MTT 에세이(MTT assay) 방법을 이용하여 세포 생존률(cell viability)을 측정하였다. 나타난 결과들은 평균ㅁ표준편차로 나타내었다(n = 3 또는 4). * p < 0.01 비처리 군과 비교, # p < 0.01, ## p < 0.05 Pg-LPS 처리군과 비교, † p < 0.01 Pg-LPS 및 GW501516 처리군과 비교.
도 2는 HGF 세포에서 MMP-2의 활성에 대한 GW501516의 영향은 PPARδ 의존적이라는 사실을 나타낸 결과이다.
도 3은 HGF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도된 ROS의 생성에 GW501516가 영향을 준다는 사실을 나타낸 결과이다.
(A, B) GSK0660로 선처리되거나, 선처리되지 않은 세포를 GW501516를 포함하거나, Pg-LPS를 포함하지 않은 조건에서 24시간 동안 배양하고, Pg-LPS에 노출시켰다. 30분 동안 배양한 후, 세포를 추가적으로 10 μM H2DCF-DA로 처리하였다. 세포내 ROS의 농도를 공초점 레이져 형광현미경으로 탐지하였다.
(A) 탐지된 형광을 정량화하였다.
(B) 현미경의 동일 방출 및 탐지 지표로 모든 형광이미지를 촬영하였다(스케일 바 = 100 μm).
(C) NAC로 30분 동안 선처리된 세포를 GW501516의 포함하거나, 포함하지 않는 조건에서 24시간 동안 배양하고, Pg-LPS에 노출시켰다. 48시간 동안 배양한 후, MMP-2의 효소 활성화를 측정하기 위해서 농도가 조절된 배지로부터 수득한 단백질 표본을 이용하여 젤라틴 자이모그래피를 수행하였다. 3 또는 4의 독립된 실험으로부터 확인된 표시된 이미지 또는 블럿 들을 보여준다. 나타난 결과들은 평균ㅁ표준편차로 나타내었다(n = 3 또는 4). * p < 0.01 비처리 군과 비교, # p < 0.01 Pg-LPS 처리군과 비교 † p < 0.01 Pg-LPS 및 GW501516 처리군과 비교.
도 4는 HGF에서 Nox4 발현에 GW501516가 영향을 미친다는 사실을 나타내는 결과이다.
(A, B) 표시된 시간동안 GW501516를 포함하는 조건에서 세포를 배양하였다.
(C, D) 다양한 농도의 GW501516를 포함하는 조건에서 세포를 배양하였다.
(E) 표시된 siRNA로 형질주입된 세포 또는 GSK0660로 선처리된 세포를 GW501516를 포함하는 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
(A, C, E) Nox4의 mRNA의 농도는 실시간 PCR 방법을 통해 분석하였고, (B, D) Nox4의 단백질의 농도는 웨스턴 블럿을 통해 분석하였다. 이미지 분석기는 Nox4 단백질의 밴드강도를 정량화하기 위해 사용하였고, Nox4 대 β-액틴의 비율을 플롯팅하였다.
(F) Nox4 siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질주입된 세포를 Pg-LPS를 포함하는 조건 또는 Pg-LPS를 포함하지 않는 조건에서 24시간 동안 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후, MMP-2의 효소 활성화를 측정하기 위해서 농도가 조절된 배지로부터 수득한 단백질 표본을 젤라틴 자이모그래피를 수행하였다. 나타난 결과들은 평균ㅁ표준편차로 나타내었다(n = 3). *p < 0.01, ** P < 0.05 비처리 군과 비교, # p < 0.01, ## p < 0.05 GW501516 처리군과 비교, † p < 0.01 Pg-LPS 처리군과 비교.
도 5는 Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 MMP-2의 활성화에서 Nox4의 발현을 억제하는 siRNA의 영향을 분석한 결과이다.
도 6은 Pg-LPS에 의해 유도된 MAP 인산화효소의 활성화에 GW501516가 영향을 미친다는 결과를 나타낸다.
(A) 표시된 시간 동안 HGF 세포를 Pg-LPS로 자극하였다.
(B) GW501516로 24시간동안 선처리하거나, 선처리하지 않은 세포를 Pg-LPS를 포함하는 조건 또는 포함하지 않는 조건에서 15분 동안 배양하였다. 세포의 단백질 표본을 SDS page 방법을 이용하여 분리하였고, 활성화 특이적 항체로 면역블럿하였으며, 병행된 면역 블럿은 전체 인산화효소의 농도를 분석하였다.
(C) SB203580, PD98059 또는 SP600125로 30분 동안 선처리된 세포를 Pg-LPS를 포함하는 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
(D, E) SP600125 또는 SB203580로 30분 동안 선처리된 세포를 GW501516를 포함하는 조건에서 배양하고, Pg-LPS에 48시간 동안 노출시켰다. MMP-2의 효소 활성화를 측정하기 위해서 농도가 조절된 배지로부터 수득한 단백질 표본을 젤라틴 자이모그래피를 수행하였다. 나타난 결과들은 평균 ± 표준편차로 나타내었다(n = 3 또는 4). * p < 0.01, ** p < 0.05 비처리 군과 비교, # p < 0.01 Pg-LPS 처리군과 비교.
도 7은 Pg-LPS에 의해 유도되는 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 파괴에 GW501516가 영향을 미친다는 사실을 나타내는 결과이다.
(A, B) NAC 또는 GW501516로 24시간동안 선처리된 HGF 세포를 Pg-LPS에 노출시켰다. 48시간 동안 배양한 후, 세포용해물 표본을 SDS-페이지 방법을 이용하여 분리하였고, (A) 표시된 항체를 이용하여 면역블럿을 수행하였으며, (B) 정량화하였다. 3 또는 4회의 독립적인 실험을 통해 표시된 블럿을 보여준다. 나타난 결과들은 평균 ± 표준편차로 나타내었다(n = 3 또는 4). *p < 0.01 비처리 군과 비교, # P < 0.01 Pg-LPS 처리군과 비교.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은, (a) 구강 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계; (b) 단계(a)의 구강 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; (c) 단계(b)의 구강 세포에서 PPARδ의 활성화도, Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 PPARδ의 활성화도 증가를 통한 상기 Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는 치주 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 (a)는 구강 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계로서, 본 단계에서는 사람의 치주 조직에 치주 질환이 유도된 것과 같은 환경을 나타내도록 구성하여 후술할 단계에서 치주 질환 치료제로 활용 가능한 물질을 스크리닝할 수 있도록 구강 세포에 염증을 유발한다.
상기 구강 세포는 통상적으로 시험관내 실험에 사용되는 구강 세포주를 배양하여 사용할 수 있으며, 상기 구강 세포주로 인간 치경 섬유아 세포(human gingival fibroblast, HGF)를 대표적인 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염장 자극 인자는 구강 세포에 염증 반응을 유발할 수 있는 다양한 형태의 물질을 사용할 수 있으며, 당지질(lipopolysaccharide)을 대표적인 예로 들 수 있다.
특히, 상기 당지질은 치주 질환의 주요한 원인균으로 보고된 바 있는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas Gingivalis)로부터 생성된 당지질(P. G-derived lipopolysaccharide, Pg-LPS)일 수 있다.
상기와 같이 구강 세포에 염증 반응이 유도되면, 구강 세포내 콜라겐을 파괴하여 구강 세포를 사멸시키는 MMP-2 단백질의 활성이 증가되고, 이와 같은 MMP-2 단백질의 활성을 증가시키는 Nox4 단백질의 발현량 또한 증가하는 양상을 보인다.
상기 단계 (b)는 상기와 같이 염증이 유도된 구강 세포에 치주 질환 예방 및 치료에 효과가 있을 것으로 예상되는 시험 물질을 구강 세포에 접촉시키는 단계로서, 염증 반응의 진행을 억제하거나, 염증 유발 물질을 제거하는 효과가 있을 것으로 예상되는 다양한 형태의 시험 물질을 접촉시키도록 구성할 수 있으며, 특히, 상기 시험 물질이 PPARδ의 활성화도를 증가시켜 PPARδ의 활성화도 증가, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성 감소시키는 물질을 포함할 수 있다.
상기 PPARδ는 상기 Nox4 단백질의 발현을 감소시켜, 구강세포에 콜라겐을 분해하는 상기 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 것에 의해 상기와 같은 치주 질환을 예방할 수 있다.
상기 단계 (c)는 구강 세포에서 PPARδ의 활성화도, Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 측정하는 단계이다.
상기 PPARδ의 활성화도는 통상적인 PPARδ의 활성화도 측정방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 리포터 유전자 에세이(reporter gene assay) 방법을 사용할 수 있다.
상기 리포터 유전자 에세이를 위하여, 상기 구강 세포를 PPARδ 유전자 및 이에 대한 리포터 유전자를 포함하는 재조합 유전자로 형질 주입시킬 수 있다. 상기 리포터 유전자는 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 리포터 유전자, 예를 들어, 루시페라제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 단계에서는 단백질의 발현량을 측정할 수 있는 통상적인 Nox4 단백질의 발현량 측정방법에 의하여 측정될 수 있으며, 예를 들어, 면역블러팅법을 사용할 수 있다.
그리고, 본 단계에서는 단백질 활성을 측정할 수 있는 통상적인 MMP-2 단백질의 활성 측정방법에 의하여 측정될 수 있으며, 예를 들어, 젤라틴 자이모그래피법을 사용할 수 있다.
상기 단계 (d)는 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계이다.
본 단계에서는 상기와 같이 당지질에 의해 유도된 구강 세포의 염증을 치료 및 예방할 수 있도록, PPARδ의 활성화도를 증가시켜 세포내 Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 역할을 하는 시험 물질을 선별하여 이와 같은 시험 물질이 치주 질환의 예방 또는 치료에 활용 가능한 물질인 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 PPARδ의 활성화도 증가, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성 억제 효과를 갖는 물질을 포함하는 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물한다.
일 구현예에서, 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 PPARδ의 활성화도 증가, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성 감소 효과를 갖는 GW501516를 유효성분으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 PPARδ의 활성화도를 증가시켜 구강 세포내 Nox4 단백질 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성 감소 효과를 갖는 다양한 물질을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
<시험>
1. 세포 배양 및 세포 생존률 분석
사이언셀 연구소(ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA)로부터 얻은 1차 배양된 인간 치경 섬유모 세포(human gingival fibroblast, HGF)를 항생제 및 10% 소태아혈청을 포함하는 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에서 37 ℃, 95% 공기 및 5% CO2 대기 하에서 배양하였다. 배양한 HGF 세포를 18시간 동안 무혈청 배지에서 배양하였으며, 세포 생존률 분석 방법(MTT assay)을 통해 배양한 HGF 세포의 세포 생존률을 분석하였다.
2. 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 억제
무혈청 배지에서 웰팩트-Q(Welfect-Q, WelGENE, Daegu, Republic of Korea)를 사용하여 HGF 세포에 특이적인 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 형질주입하였다. 형질주입 후 6시간이 경과한 시점에서 배지를 10% 소태아혈청 및 항생제가 포함된 신선한 배지로 대체하였다. 감염 24시간 경과한 HGF 세포를 18시간 동안 결핍처리(starved)한 후, 표시된 시간 동안 표시된 시약으로 처리하고, 유전자 억제(gene silencing)의 효과를 평가하였다.
3. 세포내 ROS의 분석
과산화물 민감성 염료(peroxide sensitive dye)이고, 형광 탐지 물질인 2′,7′-디클로로하이드로플루오레스신 디아세테이트(2′,7′-dichlorodihydro- fluorescein diacetate, H2DCF-DA)를 사용하여 세포내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 농도를 분석하였다.
간단히 요약하면, HGF 세포를 NAC 또는 GSK0660으로 30분 동안 선처리하였다. 선처리한 HGF 세포와 선처리하지 않은 HGF 세포를 24시간 동안 GW501516로 처리하고 표시된 시간 동안 구강세균(P. gingivalis) 유래 당지질(lipopolysaccharide)인 Pg-LPS에 노출시켰다. 노출이 완료된 세포에 10 μM의 농도로 H2DCF-DA를 첨가하여 10분 동안 배양하고 37 ℃에서 30분 동안 추가적으로 배양하였다. 올림푸스 FV-1000 레이져 형광 현미경 (Tokyo, Japan)의 520 nm의 장파장 투과 필터로 ROS의 농도에 따른 초록색 형광 발광을 탐지하였다.
4. 젤라틴 자이모그래피(Gelatin zymography)
젤라틴 자이모그래피 방법을 이용하여 MMP의 활성을 측정하였다.
요약하면, 동일한 수의 HGF 세포를 무혈청 배지에서 표시된 시약으로 처리하고 표시된 시간 동안 배양하였다. 그리고, 조절된 배양 배지와 동량의 차가운 80% 아세톤(1:4, vol/vol)과 혼합하고 20 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양액을 4 ℃에서 16,000 rpm으로 원심분리하여 단백질 펠릿을 수득하였다. 수득한 펠릿을 80% 아세톤으로 세척한 후 탈이온수에 용해시켰다. 용해된 단백질 펠릿의 시료의 일부를 1 mg/ml 농도의 젤라틴 용액이 포함된 8% SDS-폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동하였다.
사이즈 별로 분리된 단백질을 포함하는 겔을 2.5% 트리톤 X-100으로 2회 재생(renature) 처리하였으며, 처리된 겔을 멸균수로 1회 세척한 후, 37 ℃의 빛이 조절된 환경에서 현상액(50 mM Tris-Cl, 20 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02% Brij35, pH 7.6)을 이용하여 4시간 동안 배양하였다. 시각화(visualization)를 위해서 겔을 염색 용액(0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250, 45% ethanol, 10% acetic acid)에서 배양하고 탈색용액 (25% ethanol, 5% acetic acid)에서 백그라운드가 사라질 때 까지 탈색시켰다.
5. 면역 블럿 분석(Immunoblot analysis)
SDS-폴리아크릴아미드겔로 전기영동하여 세포 용해물 시료를 분리하고, 단백질의 발현량을 측정하기 위해서 특이적 항체를 이용해 면역 블럿 분석하였다.
6. 유전자 정량 진단(Real-time PCR)
하기에 나타낸 바와 같은 프라이머를 이용하여 실시간 PCR 방법을 통해 특이적 mRNA의 농도를 분석하였다.
Primer(Nox4) : 5'-GCAGGAGAACCAGGAGATTG-3'(정방향) 및 5'-CACTGAGAAGTTGAGGGCATT-3'(역방향)
Primer(GAPDH) : 5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'(정방향) 및 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'(역방향)
GAPDH 정상화된 cDNA 농도에서 접힘 변화를 △△CT 방법을 이용하여 분석하였다.
7. 통계 분석
데이터를 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 스튜던트 T 검정(Student's t-test) 또는 다중 검정을 위한 본페로니 교정(Bonferroni correction)을 통한 분산분석(ANOVA)방법을 이용하여 결정하였다. p < 0.05에 해당하는 값을 통계적으로 유의성있는 것으로 간주하였다.
<결과>
1. GW501516가 HGF 세포에서 Pg - LPS에 의해 유도된 MMP -2의 활성을 억제한다.
도 1(A)에 나타난 바와 같이, Pg-LPS로 처리한 HGF 세포는 Pg-LPS로 처리하지 않은 HGF 세포와 비교할 때, MMP-2의 활성이 24시간 경과한 시점에서 명확히 증가하였으며, 48시간 경과한 시점에서 급격히 증가하였다. 또한, 도 1(B)에 나타난 바와 같이, 1~2 ㎍/ml의 Pg-LPS로 처리한 48시간 경과한 시점의 HGF 세포에서 MMP-2의 활성이 최대 수준까지 높아졌다.
HGF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성에 대한 PPARδ의 영향을 더욱 상세히 설명하기 위해서, Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에 PPARδ의 활성 인자인 GW501516의 영향을 분석하였으며, 분석결과를 도 1(C)에 나타내었다.
도 1(C)에 나타낸 바와 같이, Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성은 GW501516의 존재하에서 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. GW501516의 농도별 세포 생존률(cell viability)을 세포 생존률 측정기법(MTT assay)를 통해 분석하였으며, 분석 결과를 도 1(F)에 나타내었다.
2. HGF 세포에서 MMP-2의 활성에 대한 GW501516의 영향은 PPARδ 의존적이다.
Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성에 대한 GW501516의 저해 영향이 PPARδ에 의존적인지 여부를 결정하기 위해서, PPARδ를 억제하는 siRNA의 영향을 분석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, PPARδ를 억제하는 siRNA가 형질주입(transfection)된 HGF 세포에서는 형질주입되지 않은 HGF 세포에서 비해 PPARδ의 농도가 상당히 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 1(D)에 나타난 바와 같이, 예상대로 PPARδ siRNA가 Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 MMP-2의 활성의 GW501516에 의한 저해를 상당히 억제하는 것으로 나타났다. 더욱이, 도 1(E)에 나타난 바와 같이, PPARδ의 저해제(antagonist)인 GSK0660으로 처리된 HGF 세포에서 MMP-2의 활성의 GW501516에 의한 저해를 상당히 억제하는 것으로 나타났으며, 이를 통해 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성 저해에 PPARδ가 관여하는 것을 예측할 수 있었다.
3. HGF 세포에서 PPARδ의 활성화는 Pg-LPS에 의해 유도된 활성산소종의 생성을 저해한다.
Pg-LPS가 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 의존적으로 MMP-2를 활성화시키기 때문에, HGF 세포에서Pg-LPS에 의해 유도된 ROS의 생성에서 GW501516에 의한 영향을 분석하였다.
도 3(A)에 나타낸 바와 같이, Pg-LPS에 노출된 HGF 세포는 30분 노출한 시점에서 ROS의 생성량이 최대로 증가하였다.
반면에, 도 3(A) 및 도 3(B)에 나타난 바와 같이, GW501516로 처리된 HGF 세포는 ROS의 생성이 상당히 억제된 것을 확인할 수 있는 반면에, GSK0660으로 처리된 세포에서는 GW501516에 의해 유도된 ROS 생성의 억제가 유도되지 않아 ROS 생성에서 GW501516에 의한 영향은 PPARδ에 의존적인 것을 확인할 수 있었다.
게다가, 도 3(C)에 나타낸 바와 같이, 티올 항산화제인 NAC와 GW501516로 동시에 처리된 HGF 세포에서는 GW501516 만으로 처리된 HGF 세포와 비교할 때, Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성 저해가 다소 약화되는 것을 확인할 수 있었다.
4. HGF 세포에서 PPARδ의 활성화는 Nox4의 발현을 억제하는 것에 의해 MMP-2의 활성을 저해한다.
Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 ROS 생성의 PPARδ에 의한 저해에 관한 분자수준의 기전을 분석하기 위해서, HGF 세포에서 ROS의 생성을 유도하는 NADPH 산화제의 주요한 동형 단백질인 Nox4의 농도를 분석하였다.
도 4(A) 내지 도 4(D)에 나타난 바와 같이, GW501516로 처리된 HGF 세포에서는 Nox4 mRNA 및 Nox4 단백질의 농도를 상당히 낮아졌으며 이와 같은 Nox4 mRNA 및 Nox4 단백질의 농도 감소는 GSK0660과 PPARδ siRNA가 존재하면 사라지는 것을 확인할 수 있어, Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 PPARδ는 GW501516에 의해 유도된 Nox4의 발현 억제(downregulation)와 연관되어 있다는 사실을 확인할 수 있었다(도 4(E)).
GW501516가 Nox4의 농도를 발현 억제가 가능하기 때문에, 본 발명의 발명자들은 Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 MMP-2의 활성화에서 Nox4의 발현을 억제하는 siRNA의 영향을 분석하였으며 분석결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 대조군 siRNA로 형질주입된 HGF 세포와 비교할 때, Nox4의 발현을 억제하는 Nox4 siRNA로 형질주입된 HGF 세포에서는 Nox4의 발현이 상당히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 예상대로, Nox4 siRNA는 Pg-LPS로 유도된 MMP-2의 활성을 상당히 억제하였으며(도 4(F)), Nox4가 Pg-LPS로 유도된 MMP-2의 활성에 연관되어 있음을 시사하였다.
5. HGF에서 PPARδ의 활성화는 JNK 및 p38 MAP 인산화효소의 신호 전달계의 억제를 통해 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성을 저해한다
ROS가 MAP 인산화효소(mitogen-activated protein kinase, MAP kinase)를 활성화하는 2차 메신저로서의 역할을 하기 때문에, 본 발명의 발명자들은 Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 MAP 인산화효소 경로(MAP kinase pathway)를 분석하였으며, 분석결과를 도 6(a)에 나타내었다.
도 6(a)에 나타난 바와 같이, HGF 세포를 Pg-LPS로 처리하면 세가지 MAP 인산화효소 신호전달계가 즉시 활성화되는 것을 확인하였다. Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에 GW501516를 처리하면 GW501516은 JNK 및 p38 MAP 인산화효소의 인산화를 상당히 저해하였으나, ERK의 인산화는 저해하지 않았다.
HGF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성이 MAP 인산화효소의 신호전달계에 연관되었음을 보다 상세히 확인할 수 있도록, 세가지 MAP 인산화효소의 신호전달계 특이적인 저해제를 처리하여 영향을 분석하였으며, 분석결과를 도 6(c)에 나타내었다.
도 6(c)에 나타난 바와 같이, JNK 신호전달계의 저해제인 SP600125, p38 MAP 인산화효소 신호전달계의 저해제인 SB203580, ERK 신호전달계의 저해제인 PD98059가 존재하면, Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성이 상당히 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는, 이와 같은 MAP 인산화효소 모두가 Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성에 영향을 미치나, p38 MAP 인산화효소 및 JNK에 의해 유도된 신호전달계가 MMP-2의 활성에서 PPARδ에 의해 유도되는 저해와 연관된 것을 시사하는 것이다.
도 6(d) 및 도 6(e)에 나타난 바와 같이, SP600125 및 SB203580은 GW501516와 유사한 범위로 Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성을 감소시켰다. GW501516과 SP600125 또는 GW501516과 SB203580로 동시에 처리된 HGF 세포에서는 GW501516 만으로 처리된 HGF 세포와 다른 결과를 도출하지 못했으며, 이와 같은 결과는 PPARδ가 p38 MAP 인산화효소 및 JNK의 신호전달계를 통해 MMP-2의 활성을 저해한다는 사실을 시사하는 것이다.
6. PPARδ의 활성은 HGF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도되는 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 분해를 방지한다
Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 PPARδ에 의한 MMP-2의 활성화의 저해를 증명하기 위해서, 우리는 HGF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도되는 콜라켄의 파괴에 GW501516에 의한 영향을 분석하였으며, 분석결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서는 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 농도가 감조한 반면에 GW501516로 처리된 HGF 세포에서는 콜라겐의 농도가 크게 감소하지 않았다.
게다가, NAC로 처리된 HGF 세포에서는 GW501516로 처리된 HGF 세포와 비교할 때, 콜라겐 농도가 회복되었으며, 이와 같은 결과는 리간드 활성화된 PPARδ는 Pg-LPS로 처리된 HGF 세포에서 ROS의 생성을 저해하는 것에 의해 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 농도를 예전과 같이 회복한다는 사실을 시사하는 것이다.
<논의>
핵수용체인 PPARδ의 리간드 활성화(ligand activation)는 다양한 병리 생리학적 조건하에서 다중 유전자 들의 발현을 조절하는 것에 의해 넓은 스팩트럼으로 생체 응답을 유도한다. 비록, PPARδ의 활성화에는 다양한 요소가 영향을 미치나, PPARδ의 활성화를 조절할 수 있는 실질적인 유효 분자에 관해 알려진 사실은 거의 없다.
본 발명에서는, 리간드 활성화된 PPARδ가 분자내 ROS의 생성을 저해하는 것에 의해 Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성화를 약화시킨다는 사실을 입증하였다. PPARδ의 이와 같은 영향은 ROS 생성의 주요한 원료인 Nox4의 발현억제에 의해 유도될 수 있다.
MAP 인산화효소의 분석에서는 JNK 및 p38 MAP 인산화효소가 Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성화에서 PPARδ에 의한 저해에 참여한다는 사실을 입증하였다. 게다가, 본 발명의 발명자들은 PPARδ에 특이적인 리간드인 GW501516로 처리하는 것에 의해 HGF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도되는 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 분해를 저해한다는 사실을 확인하였다.
치주 조직(periodontium)에서 증가된 MMP의 활성화는 치주 질환 염증이 진행되는 동안 잇몸(tooth-supporting tissue)의 완전성에 문제를 야기하는 주요 유발 물질로서, 본 발명을 통해 GW501516에 의한 PPARδ에 의한 활성화는 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 농도를 증가시켜 Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성화를 상당히 저해하는 것을 확인하였다.
이와 같은 발견은 PPAR의 패밀리 군인 PPARγ의 경우, 로시글리타존(rosiglitazone)에 의해 활성화되는 PPARγ가 레트를 이용한 실험적인 치주 질환에서 RANKL의 발현 감소에 의한 골 소실(bone loss)을 방지한다는 종래에 보고된 보고서와 일치하는 것이다. 더욱이, PPAR의 패밀리 군인 PPARα의 경우, WY-14643에 의해 활성화된 PPARα이 문헌에서 실험적으로 유도된 잇몸 점막 조직(gingivomucosal tissue)의 상처를 완화하는 것으로 알려져있다. 또한, PPARδ는 치주 질환에서 항염증 역할을 하여 조직 상처를 억제하는데 기능적으로 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다.
이와 같은 연구를 기반으로 하여, 본 발명의 발명자들은 핵수용체인 PPAR 군이 체액성 인자(humoral factor) 및 조직 상처 사이에서 밸런스를 조절하는 것에 의해 치주 조직을 온전히 유지하는 것으로 예측하였다.
본 발명에서 제시된 내용이, 특히, 잇몸질환에서의 조직 손상과 치아이탈 증상에 관련하여, PPARδ의 잠재적인 세포 보호 역할에 대한 새로운 관점을 제공한다.
잇몸의 미세환경(periodontal microenvironment)에서 그람음성균에 의해 유도된 당지질은 구강 질환에서 다양한 세포반응을 개시하는 MAP 인산화효소를 자극할 수 있는 것으로 알려져있다.
인간 치경 섬유아세포에서 LPS에 의해 유도된 MMP-2의 생성은 NADPH 산화제에 의한 ROS의 생성이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, p38 및 JNK 신호전달경로가 이와 같은 셀에서 LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성화와 연관되어 있는 것으로 알려져있다.
UVB 및 안지오텐신 II에 노출된 혈관평활근 세포와 인간 치경 섬유아세포에서 PPARδ의 활성화가 MMP-2의 활성에서 분비 및 활성을 억제하여 ROS의 생성을 상당히 억제한다는 종래의 연구 결과와 일치하는 것이다. 최근 이와 같은 연구에서, NAC의 존재하에서 유사한 결과를 나타나 ROS가 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성의 중요한 중개자임을 시사하였다.
반면에, 세가지의 MAP 인산화효소 모두가 Pg-LPS에 의해 활성화되나, Pg-LPS에 의해 유도된 p38 및 JNK의 활성화가 GW501516의 존재하에서는 상당히 저해되었으며, 이러한 발견은 치근 섬유 아세포에서 p38 및 JNK의 발현억제를 통해 NAC가 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 생성을 저해한다는 종래에 보고와 일치하는 것이다. 본 발명에서 실험적 조건하에서 p38 및 JNK의 신호전달경로가 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성에 주요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
PPARδ에 의해 유도되는 Nox4 발현의 하향조정은 HGF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도되는 MMP-2의 활성을 저해하는데 핵심적인 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
종래에 보고서에서는 Nox4의 전사과정의 조절은 복잡하며, 히스톤 변형 또는 DNA 메틸화와 같은 신호전달경로와 연관된 후생적 변형과 연관된 것으로 보고되었다(Sanders et al. 2014; Bai et al. 2014). AP1, Smads, Nrf2/3, Sp1/3, NF-κB, HIF-1α, ATAT1/3 및 E2F1 등과 같은 전사인자가 Nox4의 전사과정에서의 조절과 연관되어 있다고 알려진 바 있다(Bai et al. 2014; Pendyala et al. 2011; Pepe et al. 2010; Katsuyama et al. 2011; Manea et al. 2010a; Diebold et al. 2010; Manea et al. 2010b; Zhang et al. 2008). 과산화수소 유도성 클론-5에 의해 유도된 유비퀴틴 표지(ubiquitination) 및 분해가 Nox4의 조절에 영향을 미친다고 알려진 바 있다(Desai et al. 2014). 그러나, 발현 억제에 관한 Nox4의 전사적 조절에 관해서는 보고된 바 없다. PPARδ는 전사 인자로서 작용하여 RXR를 포함하는 이질이합체(heterodimer)를 형성하고, 표적 유전자의 포로모터에 위치한 PPAR 반응 요소를 통해 유전자 전사를 유도한다고 알려져있다(Tugwood et al. 1992).
반면에, Nox4 mRNA의 발현 조절에서 PPARδ는 전사인자로서의 역할과 정확히 일치하지 않으나, 이는 종래의 불특정화된 전사후 메커니즘이 Nox4의 발현억제와 연관되었다는 사실을 시사하는 것이다. 때문에, 본 발명의 발명자들은 혈관세포의 성장 인자인 TGF-β1의 발현을 GW501516가 유도한다는 사실을 입증하였으며, TGF-β1에 의해 유도된 Hic-5 단백질의 발현 증가(upregulation)가 GW501516로 처리된 세포에서 PPARδ에 의한 Nox4 전사의 발현 억제에 영향을 미친다고 예측하였다(Desai et al. 2014).
따라서, 본 발명의 발명자들은 PPARδ가 HGF 세포에서 Nox4의 하향조절에 연관되었음을 최초로 밝혔다. Nox4의 하향조절에서 PPARδ 및 Nox4의 하향 조절의 세부사항을 보다 명확히 할 필요가 있으나, 본 발명의 발명자들은 HGF 세포에서 세포의 ROS 생성을 조절하여 Nox4의 발현을 저해하는 것으로 Pg-LPS에 의해 유도된 MMP-2의 활성을 PPARδ의 활성화가 조절함을 입증하였다. Nox4의 발현에서 PPAR 리간드의 효과는 콜라겐단백질의 파괴를 방지하는 것에 수많은 PPAR의 작용에 의해 유도되는 것으로 예측되었다. 이와 같은 발견은 치주 질환의 조절에서 PPARδ 및 MMP-2 사이의 상호관계를 명확히 할 수 있는 분자수준의 메커니즘의 이해를 보다 향상시키고, 치주조직의 항상성에 PPARδ의 세포예방적 효과에 관한 새로운 관점을 제공할 수 있다.

Claims (7)

  1. (a) 구강 세포에 염증 자극 인자를 처리하는 단계;
    (b) 단계(a)의 구강 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
    (c) 단계(b)의 구강 세포에서 PPARδ의 활성화도, Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 PPARδ의 활성화도 증가를 통한 상기 Nox4 단백질의 발현량 및 MMP-2 단백질의 활성을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계
    를 포함하는 치주 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계(a)의 염증 자극 인자가 당지질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 당지질이 포르피로모나스 진지발리스 유래 당지질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계(c)의 Nox4 단백질의 발현량이 면역블럿팅법에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계(c)의 MMP-2 단백질의 활성이 젤라틴 자이모그래피법에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  6. PPARδ의 활성화도 증가, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성 감소 효과를 갖는 물질을 포함하는 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PPARδ의 활성화도 증가, Nox4 단백질의 발현량 감소 및 MMP-2 단백질의 활성 감소 효과를 갖는 물질이 GW501516인 것을 특징으로 하는 치주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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