CN111514134B - 一种对uva所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药配制品技术领域，公开了一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型，药物为吲哚‑3‑甲醇，对HaCaT细胞最大无作用剂量为10μmol/L。取处于对数生长期的HaCaT细胞，按2×105个/孔接种于6孔培养板中，在细胞培养箱中培养至70～80％的细胞融合度；按如下分组处理：空白对照组用不透光的黑纸片遮住，UVA模型组的照射剂量为1J/cm2，I3C处理组在照射UVA的同时还用10μmol/L的I3C进行处理，每个剂量设2个平行样；照射完后观察细胞在数量和形态上的改变。本发明能够改善由过多UVA照射引起的小鼠皮肤表皮细胞和纤维组织的病变，因此可延缓皮肤光老化的形成。

Description

一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型
技术领域
本发明属于医药配制品技术领域，尤其涉及一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型。
背景技术
人的皮肤老化是一个非常复杂的过程，遗传因素及环境因素同时对其产生影响。目前发现环境因素中的紫外线是引起皮肤老化一个重要诱因，人体的皮肤每天都接受着来自太阳光中紫外线的辐射，研究表明长期的紫外线辐射将导致皮肤光老化，甚至导致皮肤癌的发生。随着人类生活水平的提高以及老龄人口的增长，皮肤老化问题已日益引起人们的重视。由于大气臭氧层的破坏不断加剧以及生活习惯等方面的原因，皮肤光老化也已成为威胁现代人类的重要健康问题之一。皮肤光老化的临床表现主要为：皮肤松弛、结节、皮革样外观、明显干燥和脱屑，光老化部位皮肤呈黄色或灰黄色、较粗糙，久之出现色素斑点或类似老年斑等色素沉着异常。长期日光照射还可诱发一系列增生性病变，如脂溢性角化病、胶样粟丘疹、光线性肉芽肿、日光性角化病等，严重者可能发生皮肤癌等恶性肿瘤。皮肤光老化的组织学表现主要见于表皮和真皮。表皮光老化轻微损伤表现为表皮层轻度修复性增厚，严重损伤时表皮萎缩、基底层细胞发生异质性改变，使皮肤革化、变脆、变硬，甚至出现水泡。光老化可致色素过度沉着，表现为肤色不均、出现雀斑、黑色素过少症等。光老化发生时真皮层明显增厚，形成大量无功能、退化的或功能紊乱、易被降解的弹性纤维，从而使皮肤出现松弛、变皱的表现，过度伸展后可出现皮肤裂纹。
紫外线可通过诱导蛋白激酶信号通路活化、诱导活性氧生成、激活表皮细胞生长因子及诱导金属蛋白酶类表达等途径诱发皮肤光老化。大量实验证据表明，皮肤光老化的发生机理主要包括：(1)氧化应激损伤。皮肤组织在UV辐射作用下发生光化学反应产生大量活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)，其主要机理是细胞表面受体被紫外线激活后与相应配体结合并激发下游信号分子，且激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，从而产生大量过氧化氢及超氧阴离子。ROS对DNA、蛋白质和脂类等细胞大分子物质进行攻击，造成皮肤组织细胞发生氧化应激损伤。(2)紫外线辐射诱导皮肤角质细胞(keratinocyte，KC)和成纤维细胞(fibroblast，FB)的转录因子AP-1异常活化。紫外线辐射引起KC和FB细胞上的生长因子及细胞因子受体如表皮生长因子受体(EGFR)、白介素1受体(IL-1R)等激活，EGFR和IL-1R介导的信号转导通路激活ERK和JNK等蛋白激酶，继而活化AP-1。AP-1一方面增加基质金属蛋白酶(MMPs)的高表达，降解真皮胶原，另一方面下调Ⅰ型和Ⅲ型前胶原(procollagen)mRNA合成，进而导致真皮胶原成分不断减少。此外，紫外线还可改变核因子κB(Nuclear FactorκB，NF-κB)和转化生长因子β(transforming growthfactor，TGF-β)表达。而这些分子的表达与胶原合成、降解及炎性细胞因子产生有关且最终可引发皮肤光老化。具体通路可见下图。
皮肤长期暴露于紫外线(ultraviolet radiation，UVR)可出现多种不良反应包括形态学损害称为光老化(photoaging)。光老化，也称为皮肤过早衰老，临床上常见表现为皮肤粗糙，出现皱纹，皮肤毛细管扩张以及色素异常沉淀等。日常皮肤暴露的地方如面部、颈部、背部和前臂比较容易发生光老化。紫外线是波长为200～400nm的电磁波，其中波长为320～400nm的紫外线称为长波紫外线(UVA)，占有效紫外线辐射的95％左右。其穿透力强，目前已证实UVA照射皮肤可产生多种与皮肤光老化密切相关的生物效应：如产生ROS，引起脂质过氧化，红斑和毛细血管损伤，这在皮肤光老化发生中起到关键性的作用。
紫外线是波长为200～400nm的电磁波，其中波长为200～290nm的紫外线称为短波紫外线(UVC)，波长为290～320nm的紫外线称为中波紫外线(UVB)，波长为320～400nm的紫外线称为长波紫外线(UVA)。对于地球上的生物来说，主要起作用的是UVA和少量UVB，紫外线中UVA、UVB分别占95％、5％左右，UVB主要作用于皮肤的表皮和真皮浅层，过量则主要造成光毒性和光损伤，长期以来，由于UVB生物效应较强而受到广泛研究，目前已发展出多种成熟有效的UVB遮光剂，它们能有效减少UVB对皮肤造成的损伤。然而，目前对UVA所致皮肤光老化的预防仍缺少有效措施。
UVA能够渗透到皮肤乳头层和网状层真皮，可作用于表皮和真皮全层。UVA的生物学活性虽然不如UVB，但其穿透力强，能在真皮成纤维细胞脂质过氧化，使成胶原纤维受到影响而变形、断裂。其一次照射剂量要比UVB大1000倍以上。近年来研究表明UVA照射皮肤可产生多种与皮肤光老化密切相关的生物效应：如UVA辐射可通过内源性或外源性的化学基团产生氧自由基(ROS)，这些ROS会对细胞、组织造成损伤，进而导致氧化应激的发生，最终诱导多种重要的基质金属蛋白酶异常表达；另有研究表明，UVA可引起红斑和毛细血管损伤，这些都为光老化的发生提供了前提条件。Eriko Shimada、Keiichi Hiramoto等人已经成功地利用无毛小鼠动物模型，证实了UVA在皮肤光老化发生中起到关键性的作用，并提出了相应预防或缓解措施。因此，UVA在皮肤光老化性损伤中的作用是不能低估的，探索更多的预防缓解手段变得十分必要。
流行病学和实验室数据提示十字花科蔬菜如花茎甘蓝、大白菜、萝卜、辣根、水田芥菜、花椰菜、西兰花等含有的生物活性植物化学物吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol，I3C)是一种活性较强的肿瘤化学预防物质，在消化道的酸性环境中，I3C转化成包括吲哚-3-甲醇(3，3'-Diindolylmethane，I3C)在内的一系列寡聚物从而在体内发挥生物学作用。I3C是I3C的二聚体，较I3C而言更具有稳定性。体内和体外实验均证明I3C可抑制多种肿瘤的发生和发展且无毒副作用：其表现出抗激素样活性，能够抑制某些激素依赖性的肿瘤；还可通过调节细胞周期、调节某些酶的活性，保护机体免受损伤，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。因此，I3C被认为是一种安全有效的预防和抗肿瘤的天然植物化学物。十字花科蔬菜如西兰花、萝卜、花椰菜等含有的生物活性植物化学物吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol，I3C)是一种活性较强的肿瘤化学预防物质。体内和体外实验均证明I3C可抑制多种肿瘤的发生和发展，是一种安全有效的预防和抗肿瘤的天然植物化学物。最近已经有研究显示I3C可通过抗氧化应激以及抗炎性反应来保护细胞、减少损伤。然而，I3C是否能通过此途径来预防或者延缓光老化目前还不明确。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术主要用来解决各种肿瘤的化学预防效应，尚未意识到其在预防延缓和减弱紫外线导致光老化效应方面的作用；I3C是否能通过抗氧化应激以及抗炎性反应来保护细胞、减少损预防或者延缓光老化目前还不明确。
解决以上问题及缺陷的难度为：构建合适的细胞模型、探索有效的剂量范围，构建也人类皮肤较为接近的动物模型和有效I3C浓度。
解决以上问题及缺陷的意义为：发现一种天然化学物，可以用来抵抗紫外线损伤，并明确其作用机制，为进一步开发抗紫外线等光波辐射导致光老化的药物或医疗器械提供依据。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型。
本发明是这样实现的，一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物，所述对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物为吲哚-3-甲醇，对HaCaT细胞最大无作用剂量为10umol/L。
本发明的另一目的在于提供一种验证所述对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物的动物模型构建方法，所述对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物的动物模型构建方法包括：
第一步，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按2×105个/孔接种于6孔培养板中，在细胞培养箱中培养至70～80％的细胞融合度；
第二步，按如下分组处理：空白对照组用不透光的黑纸片遮住，UVA模型组的照射剂量为1J/cm2，I3C处理组在照射UVA的同时还用10mol/L的I3C进行处理，每个剂量设2个平行样；照射完后观察细胞在数量和形态上的改变。
进一步，所述动物模型构建方法细胞的培养和传代，HaCaT细胞用含10％v/vFBS、1％青霉素100U/ml，链霉素100mg/l的DMEM完全培养基，于37℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内培养；培养至细胞融合度达到80～90％，在培养箱中用0.05％胰蛋白酶消化细胞；消化时间为2min，倒置显微镜下观察细胞开始收缩变圆，脱离皿/瓶底后，加入5ml完全培养基终止消化；用吸管充分吹散并丢弃多余细胞，加入7ml完全培养基传代，传代培养至第10～40代；
待生长状态良好的HaCaT细胞融合度达到80～90％融合度时，消化并转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，用无血清的培养基洗涤一次，再以900μl FBS及100μl DMSO重悬细胞后离心沉淀，将其移至冻存管内细胞的冻存密度为10×106个/ml，每个冻存管存1.5ml，并转入专用冻存盒，-80℃冰箱过夜，最后移入液氮罐内保存；
复苏细胞时，取出冻存管将其立即放入37℃水浴中，振摇至完全融化，转移至15ml离心管中，加入8.5ml完全培养基后1000rpm离心5min，弃去上清液，再加入完全培养基吹打成细胞悬液，将细胞悬液转移入培养瓶，置37℃、5％CO2培养箱培养，贴壁过夜后更换新的培养基。
进一步，所述动物模型构建方法的I3C对HaCaT细胞增殖抑制，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按0.5×104个/孔接种于96孔培养板中，在含有10％FBS、1％P&S的DMEM完全培养基中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜至40～50％细胞融合度；按如下分组给予受试物处理：对照组用等量的DMSO处理，I3C处理组用不同浓度1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L、15μmol/L、17.5μmol/L、20μmol/L的I3C进行处理，处理时间分别为24h、48h、72h，每个剂量设6个平行组；处理完毕后先观察细胞的形态和数量上的变化，之后每孔加入100L无血清的DMEM完全培养基，再加入10L CCK-8试剂，37℃孵育1～2h后，用全自动酶标仪测定各孔的吸光度OD值；以对照孔吸光度值AC为参照，根据各处理组样本孔的吸光度值AT，计算细胞活力抑制率：
(％)以评价细胞毒性：细胞活力抑制率(％)＝(1-AT/AC)×100％。
进一步，所述动物模型构建方法的I3C对UVA照射HaCaT细胞增殖抑制影响，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按0.5×104个/孔接种于96孔培养板中，在含有10％FBS、1％P&S的DMEM完全培养基中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜至40～50％细胞融合度；按如下分组给予受试物处理：空白对照组用不透光的黑纸片遮住，UVA模型组中UVA照射剂量分别为0.25J/cm2、0.5J/cm2、0.75J/cm2、1J/cm2、1.25J/cm2、1.5J/cm2，计算紫外线的照射剂量：照射剂量J/cm2＝照射强度W/cm2×照射时间s，照射强度通过紫外线辐照计测量测定；I3C处理组每孔在照射前24h加入10μg/gI3C，照射剂量和对照组一样，每个剂量设3个平行样；照射后换上培养基，放入培养箱中培养24h后观察细胞数量和形态上的改变，之后将每孔加入100L无血清的DMEM完全培养基，再加入10L CCK-8试剂，孵育1～2h后，用全自动酶标仪测定各孔的吸光度OD值；以对照孔吸光度值AC为参照，根据各处理组样本孔的吸光度值AT，计算细胞活力抑制率(％)以评价细胞毒性：细胞活力抑制率(％)＝(1-AT/AC)×100％。根据UVA对HaCaT细胞增殖的抑制率以及I3C的保护作用，确定UVA在后续实验中的照射剂量。
进一步，所述动物模型构建方法的克隆形成实验，低密度接种50个细胞/皿于10cm皿中，接种24h后，分为对照组和实验组：对照组不做任何处理，实验组分别用5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L的I3C处理，每个剂量设3个平行组，连续培养3周，期间隔1天换一次培养基；处理完毕后，用预冷的PBS洗两遍，甲醛固定15分钟，室温结晶紫染色15分钟；轻柔洗去结晶紫溶液，相差显微镜计数细胞数>50的克隆数，计算克隆形成率CFE，CFE指克隆数除以接种细胞数50，用以评价细胞的克隆形成能力。
进一步，所述动物模型构建方法的流式细胞术检测细胞内ROS含量，取处于对数生长期的HaCaT细胞，按1×105个/孔接种于6孔培养板中，接种24h后，分为UVA模型组和I3C处理组；I3C处理组提前用10mol/L的I3C处理24h，之后去掉培养基，每孔加入1ml PBS，其中DCFH-DA的浓度为10mol/L，用UVA光源进行照射，剂量分别是：0J/cm2、0.25J/cm2、0.5J/cm2、0.75J/cm2、1J/cm2、1.25J/cm2、1.5J/cm2；照射完毕后，37℃温箱孵育30min后，用真空泵抽去PBS，再用PBS洗涤一次。每孔加入300L胰酶进行消化，消化完毕后，加入400LPBS，反复吹打成细胞悬液，由于DCFH-DA与ROS结合后被激光激发时可发出荧光，用流式细胞仪检测细胞内ROS含量。
进一步，所述动物模型构建方法的细胞中蛋白Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-ERK、Phospho-SAPK/JNK表达水平的检测包括：
(1)细胞分组和处理
UVA模型组：取处于对数生长期的HaCaT细胞，按1×105个/孔接种于6孔培养板中，接种24h后，将完全培养基吸出，每孔加入1ml P用UVA光源进行照射，剂量分别是：0J/cm2、0.25J/cm2、0.5J/cm2、0.75J/cm2、1J/cm2；每个剂量设2个平行样；I3C处理组：HaCaT细胞接种于6孔板24h后，除空白对照组外，其余都用I3C处理，剂量分别为0、1、2.5、5、7.5、10μmol/L，培养24h后，除空白对照组外，其余组均用UVA光源照射，剂量为1J/cm2；
(2)蛋白水平的检测
1)总蛋白抽提
弃废液，用预冷的1×PBS洗细胞两次，后加入预冷4ml 1×PBS，用细胞刮板将细胞经一个方向刮下，收集细胞悬液到2ml离心管中，4℃ 1500rpm离心5min，弃上清，将细胞置于冰上，加300μl全细胞裂解液重悬细胞并转移至新1.5ml EP管中；高速漩涡混匀15s，冰浴30min，期间每隔10min用高速涡旋混匀一次；4℃ 14000rpm离心15min，将上清转移至新预冷1.5ml EP管中，用分光光度计进行蛋白定量后分装，-80℃保存；
2)蛋白浓度测定
根据样品数量，按照50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B配制适量BCA工作液，混匀；将标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl依次加入到96孔板的标准孔中，分别用裂解液补齐至20μl，每组设置3个复孔；加2μl样品到96孔板的样品孔中；将样品孔中加入裂解液使每孔总体积达20μl，每孔悬空加入200μl BCA工作液，37℃避光放置30min，在波长450nm处检测OD值，用标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算蛋白浓度；
(3)Western Blotting
1)上样，将NuPAGE Novex 4～12％预制胶组装好，放入电泳槽，加入1×电泳缓冲液至电泳槽内，蛋白加入4×SDS Loading Buffer后，总上样量不足的加细胞裂解液补足，80℃变性10min，混匀并离心后上样，每孔蛋白上样量为60μg，总体积20μl，剩余孔中各加20μl1×SDS Loading Buffer补齐，在最后一个孔中加入8μl蛋白maker；
2)电泳，接通电源后，恒定电压200V，电泳60min；
3)转膜，将跑完电泳的胶转移到PVDF膜上，上面铺两层沾湿的滤纸，小心赶出空气，放入蛋白印迹电泳/转膜系统进行转膜，转膜时间为7min；
4)免疫反应，转膜结束后，用1×PBST洗涤PVDF膜3次，每次5～10min。现配5％脱脂奶粉作为封闭液室温封闭膜1h，于脱色摇床上用1×PBST清洗膜3次，每次5min，用碧云天一抗稀释液按一定比例配制一抗，于4℃孵育过夜，一抗孵育结束后，脱色摇床上用1×PBST清洗膜3次，每次10min，用2.5％脱脂奶粉配制二抗1:2000，室温孵育1h后，脱色摇床上用1×PBST清洗膜3次，每次5min；
5)化学发光、显影、定影，取出PVDF膜小心覆盖上透明保鲜膜，固定于暗盒内，将
Figure GDA0003097222150000041
West Pico Luminol/Enhancer Solution和
Figure GDA0003097222150000042
West Pico StablePeroxide Solution两种试剂在15ml离心管中等体积混合，并取适当的体积滴加到PVDF膜上，反应2min后，于暗室内放入胶片，对胶片曝光、显影，定影后室温下晾干；
6)胶片图象分析，使用扫描仪对胶片中目的条带进行扫描，用Quantity One软件进行灰度扫描和分析。
进一步，所述动物模型构建方法的凝胶酶谱法测MMP-2、MMP-9酶活力包括：
(1)细胞分组和处理；
(2)酶活力的检测
1)样品的收集，处理完毕后，收集培养基至2ml EP管中，用小型离心机1500rpm离心5min，离心后取上清1ml至1.5ml EP中备用，每孔加入1ml胰酶进行消化，消化完毕后，每孔加入1ml含血清的完全培养基停止消化，反复吹打制成细胞悬液，在双目显微镜下数出细胞个数，换算成细胞浓度，再根据细胞浓度将之前收集的培养基的浓度和体积调为一致，放入-80℃保存；
2)制胶与上样，应用Bio-Rad制胶系统制备SDS-PAGE凝胶，3％浓缩胶和10％分离胶；配制10％分离胶和3％浓缩胶，将分离胶用加样枪沿玻璃板匀速注入板内，当液面加至距离玻璃板顶端处1.5cm时，停止加胶，以无水乙醇封口，待胶在室温凝固后，弃去无水乙醇，倒入已配制好的3％浓缩胶，插入10孔梳子，至浓缩胶完全凝固后拔去梳子；装好玻璃板，将其放入电泳槽，加入1×电泳缓冲液，向样品中加入4×上样缓冲液后，每孔加样25L；
3)电泳，接通电源后，恒定电压130V电泳150min，直至目的蛋白快跑出胶时，终止电泳；
4)洗脱与孵育，电泳结束后，撬开玻璃板，沿折线刮去浓缩胶和多余的分离胶；将凝胶从玻璃板中剥离，放入洗脱液中匀速振荡洗脱2次，每次20min。洗脱完之后放入孵育液中匀速振荡孵育30min，最后换上新鲜的孵育液振荡过夜；
5)染色与脱色，孵育结束后用染色液染胶2h，染色结束后依次换上脱色液1、2、3，脱色时间分别是10min、30min和120min；脱色完毕后，应能明显的看到两条透亮带；
6)凝胶图象分析，用保鲜膜小心地将凝胶包裹住，再使用扫描仪对凝胶进行扫描，用Quantity One软件进行灰度扫描和分析。
进一步，所述动物模型构建方法还包括小鼠光老化模型的建立按体重做标记后随机分为5组，每组10只；所有组都适应性喂养一周后，再进行实验；每只小鼠背部每天都剃毛1次，面积为2cm×4cm；饲养条件：室温保持在20～25℃，湿度维持在40～50％；分组处理情况如下，空白对照组：正常饲养，背部剃毛，每日用生理盐水灌胃，其他不做任何处理；UVA模型组：每日用生理盐水灌胃，紫外线光毒仪照射，照射方法：将小鼠放入固定器中，暴露背部受照皮肤，放入紫外线光毒仪中，紫外线灯置于距离小鼠受照皮肤15cm处进行照射，保持仪器内温度在20～25℃之间，每天照射50min，累积UVA剂量为6J/(cm2·d)，连续照射75天；I3C灌胃组：分为低、中、高3个剂量组，I3C灌胃剂量分别为每天0.04mg/g体重、0.2mg/g体重、1mg/g体重，同时进行UVA照射
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明选择人角质形成细胞HaCaT和昆明小鼠建立皮肤光老化模型验证I3C是否具有预防由UVA诱导的光老化能力。另外，通过检测细胞内ROS的产生以及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)、MAPKs、NF-b信号传导通路相关蛋白的水平进一步的了解I3C的作用机制。
本发明确定了I3C对HaCaT细胞的最大无作用剂量；用UVA照射HaCaT细胞和小鼠，建立细胞和动物的皮肤光老化模型；检测细胞光老化模型在I3C处理前后细胞内ROS的含量，氧化应激相关蛋白(Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-ERK、Phospho-SAPK/JNK)的表达水平，基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的酶活力。检查小鼠光老化模型中灌胃(I3C)组和模型组在皮肤外观及病理学上的差异，检测氧化应激相关蛋白的表达水平。
本发明用UVA照射成功建立了HaCaT细胞、昆明小鼠的光老化模型。同时也进一步证实，紫外线照射可以加速皮肤衰老，是造成皮肤光老化模型的有效方法。I3C可有效减少HaCaT细胞中由UVA诱导产生的ROS，以及MAPK、NF-b氧化应激信号通路的激活，最终导致MMPs活力的低表达，减少对细胞的损伤。用I3C灌胃能够显著改善由过多UVA照射引起的小鼠皮肤表皮细胞和纤维组织的病变，因此可延缓皮肤光老化的形成。
附图说明
图1是本发明实施例提供的对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物的动物模型的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的1～20MI3C对HaCaT存活率的影响(％)示意图。
图3是本发明实施例提供的I3C对HaCaT细胞的克隆形成实验示意图；
图中：(a)不同剂量I3C作用后平皿中细胞克隆形成；(b)不同剂量I3C作用后细胞克隆数量。
图4是本发明实施例提供的I3C对UVA辐射HaCaT细胞形态的影响示意图；
图中：A对照组；B模型组；C I3C处理组。
图5是本发明实施例提供的UVA诱导HaCaT细胞中ROS生成示意图。
图6是本发明实施例提供的UVA增加Phospho-NFrb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达示意图；
图中：(a)随着UVA照射剂量的增加，HaCaT细胞中Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的灰度呈现上升趋势；(b)UVA照射后，HaCaT细胞中Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK表达的图像分析结果。
图7是本发明实施例提供的UVA增加MMP-2、MMP-9的活性示意图；
图中：(a)随着UVA照射剂量的增加，HaCaT细胞中被MMP-2、MMP-9降解的明胶也越多(表现为白色条带变宽)；(b)UVA照射后，MMP-2、MMP-9活性的图像分析结果。
图8是本发明实施例提供的I3C对UVA照射HaCaT细胞增殖抑制的影响示意图。
图9是本发明实施例提供的I3C(10M)对UVA诱导的ROS的影响示意图。
图10是本发明实施例提供的I3C对UVA诱导Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK激活的抑制作用示意图；
图中：(a)用I3C(1～10mol/L)预处理细胞24h，再进行UVA(1J/cm2)的照射，发现光老化相关蛋白Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达下降；(b)I3C使UVA照射后光老化蛋白表达下降的图像分析结果。
图11是本发明实施例提供的I3C对UVA诱导的抑制作用MMP-2、MMP-9酶活力增强的抑制作用示意图；
图中：(a)用I3C(1～10mol/L)预处理细胞24h，再进行UVA(1J/cm2)的照射，发现被MMP-2、MMP-9降解的明胶也越少(表现为白色条带变窄)，表明其活性呈明显下降；(b)I3C抑制由UVA诱导的MMP-2、MMP-9酶活力增强的图像分析结果。
图12是本发明实施例提供的UVA小鼠光老化模型示意图；
图中：＝A空白对照组；B UVA模型组；C DIM高剂量灌胃组。
图13是本发明实施例提供的I3C灌胃对UVA辐射小鼠皮肤组织形态的影响(H&E×100)示意图；
图中：A空白对照组；B UVA模型组；C DIM低剂量组；D DIM中剂量组；E DIM高剂量组。
图14是本发明实施例提供的I3C灌胃对UVA辐射小鼠皮肤组织形态的影响(Masson×400)示意图；
图中：A空白对照组；B UVA模型组；C DIM低剂量组；D DIM中剂量组；E DIM高剂量组。
图15是本发明实施例提供的I3C灌胃对UVA辐射小鼠皮肤中Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达水平的影响示意图；
图中：(a)用I3C使各组小鼠皮肤组织中与光老化相关蛋白Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达下降；(b)I3C降低小鼠皮肤组织中与光老化相关蛋白表达的图像分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物、动物模型，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物为吲哚-3-甲醇，对HaCaT细胞最大无作用剂量为10umol/L。
如图1所示，本发明实施例提供的对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物的动物模型构建方法包括：
S101：取处于对数生长期的HaCaT细胞，按2×105个/孔接种于6孔培养板中，在细胞培养箱中培养至70～80％的细胞融合度；
S102：按如下分组处理：空白对照组用不透光的黑纸片(已高压)遮住，UVA模型组的照射剂量为1J/cm2，I3C处理组在照射UVA的同时还用10mol/L的I3C进行处理，每个剂量设2个平行样；照射完后观察细胞在数量和形态上的改变。
下面结合实验对本发明的技术方案作进一步的描述。
一、材料及方法
1.1实验材料
1.1.1细胞&动物
永生化的人角质形成细胞株HaCaT(购自于中国典型培养物保藏中心)。雄性昆明小鼠(购自广东省实验动物中心)。
1.1.2主要试剂
(1)细胞培养相关试剂：DMEM培养基(1×)、胎牛血清、胰蛋白酶(0.25％)均购自美国GIBCO公司，
Figure GDA0003097222150000061
TRYPSIN(0.25％，with EDTA)(HyClone)，吲哚-3-甲醇(I3C)，青霉素&链霉素双联抗生素(Invitrogen)，二甲基亚砜(I3Cethyl Sulfxoside，DMSO)、嘌呤霉素购自美国Sigma公司。
(2)细胞增殖实验相关试剂：CCK-8试剂盒(碧云天)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)。
(3)平板克隆形成实验相关试剂：结晶紫(中国崇明裕西试剂厂)、冰醋酸、甲醇均购自广州化学试剂厂。
(4)流式测ROS含量相关试剂：2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)购自美国Sigma公司。
(5)细胞总蛋白提取试剂：NP40(美国Sigma)、蛋白酶抑制剂cocktail和PMSF(瑞士Roche公司)、广谱磷酸酶抑制剂混合物(武汉博士德生物工程有限公司)、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)。
(6)细胞胞浆胞核蛋白提取试剂：胞浆/胞核蛋白抽提试剂盒(碧云天)。
(7)Western blotting试剂：NuPAGE Novex 4％-12％预制胶(Invitrogen)；蛋白marker(美国ProteinTech Group)；脱脂奶粉(美国Cell signaling technology)；5×LDS(BioRad)；兔抗Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-ERK、Phospho-SAPK/JNK，鼠抗-actin单克隆抗体均购自美国Cellsignal公司；二抗：Goat anti-Mouse lgG和Goat anti-Rabbit lgG均购自美国ProteinTech Group公司。增强型化学发光底物系统、显影液和定影液均购自碧云天。
(8)凝胶酶谱相关试剂：十二烷基磺酸钠、过硫酸铵、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘油、溴酚蓝、甘氨酸、TEMED、明胶、考马斯亮蓝R-250均购自上海生工。冰醋酸、甲醇、NaCl、CaCl2均购自广州化学试剂厂。
(9)动物灌胃实验相关试剂：I3C(美国Sigma公司)、羟苯基甲基纤维素(广州化学试剂厂)。
(10)动物麻醉相关试剂：戊巴比妥钠(美国Sigma公司)。
(11)免疫组化相关试剂：苏木素(广州维格斯)、伊红Y(广州中南化学试剂公司)、灿烂绿(温州东升化工试剂厂)、丽春红S(上海三爱思试剂公司)、酸性品红(天津新精细化工)、橙黄G(国药集团化学试剂公司)。无水乙醇、TO、冰醋酸、浓盐酸、甘油均购自广州化学试剂厂。碘酸钠、硫酸铝钾购自上海生工。
1.1.3溶液配制
(1)I3C储备液配置
细胞实验：将49.26mg I3C粉末加入2ml DMSO中，配制成100mmol/LI3C溶液。混匀，400l/支分装，共5只，-20℃避光保存。
动物实验：将7.5g羟苯基甲基纤维素粉末加入150ml去离子水中，隔水加热煮沸，直至羟苯基甲基纤维素完全溶解，自然冷却至室温后，加入150mg I3C粉末，用枪头(规格为5ml)充分吹打，配制成1g/l的I3C悬浊液。充分混匀，分3管分装，50ml/支。
(2)细胞培养相关试剂
DMEM完全培养基：取450ml DMEM培养基，加入50ml胎牛血清(FBS)和5ml 100×青链霉素，充分混匀后4℃保存，使用之前放入37℃水浴锅中加热。
10×PBS：称取80.0gNaCl、14.2gNa2HPO4、2.0gKCl、2.7gKH2PO4，加入800ml去离子水充分溶解，将调pH值至7.4，加入去离子水将溶液定容至1L。过滤后室温保存备用。
1×PBS：量取100ml 10×PBS储备液，加900ml去离子水，混匀。高压灭菌后室温保存。
(3)结晶紫储备液：将2.5g的结晶紫粉末加入100mlPBS中，混匀后过滤室温储存。用时需稀释25倍。
(4)DCFH-DA储备液：将4.87mg的DCFH-DA粉末加入1ml的DMSO中，配制成10mmol/L的溶液。混匀。放入-20℃避光储存。
(5)Western Blot常用试剂
生理盐水：称取0.9g氯化钠，溶解在少量去离子水中，稀释定容至100ml。
总蛋白抽提试剂：PBS磷酸酶抑制剂溶液：0.9ml 10×PBS，7.6ml去离子水，0.5ml磷酸化酶抑制剂，混合；完全裂解液：10mmol/L DTT 20μl，Lysis Buffer AMI 178.0μl，蛋白酶抑制剂(Cocktail)2μl。
1mol/L Tris·HCl(pH6.8)：称取Tris 30.28g粉末于200ml中去离子水溶解，用适量浓盐酸调pH至6.8，混匀后定容至250ml，0.45μm滤膜过滤后室温保存备用。
1.5mol/L Tris·HCl(pH 8.8)：称取Tris 45.43g于200ml去离子水溶解，用适量浓盐酸调pH至8.8，混匀后定容至250ml，0.45μm滤膜过滤后室温保存。
10％SDS：称取5g SDS于50℃水浴下避光溶解溶于40ml去离子水中，再用去离子水定容至50ml，室温避光保存。
还原型5×SDS上样缓冲液：0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/l二硫代叔糖醇，10％SDS，50％甘油，0.5％溴酚蓝。
10％过硫酸铵溶液(AP)：临用现配，称取0.1g过硫酸铵溶于1ml去离子水中，充分溶解后用锡箔纸包裹避光，4℃保存。
10×电泳缓冲液：甘氨酸144g、Tris 30.3g、SDS 10g溶于900ml去离子水中，充分溶解后定容至1000ml，室温保存。
1×电泳缓冲液：将10×电泳缓冲液按1:9比例加入去离子水，混匀室温保存。
1×转膜缓冲液：Tris 3.03g、甘氨酸14.26g溶于700ml去离子水中，充分溶解后加入200ml甲醇溶液，用浓盐酸调PH值至8.0，定容至1000ml，4℃保存备用。
10×TBS：Tris 24.228g、NaCl 80.06g溶于900ml ddH2O中，调pH至7.6，混匀后定容至1000ml室温保存。
1×TBST：量取100ml 10×TBS，2.5ml 20％Tween20(终浓度为0.5％)，加纯水至1000ml，混匀后室温避光保存。
膜封闭液：临用现配，以1×TBST缓冲液配制5％(w/v)脱脂奶粉(5g脱脂奶粉+100ml 1×TBST缓冲液)，待其完全溶解后4℃保存备用。
(6)0.25％Triton-X 100配制
量取20μl Triton-X 100，加入10ml去离子水中，临用现配。
(7)凝胶酶谱常用试剂
4×分离胶储备液：称取91g Tris base粉末，加入300ml的去离子水中，用盐酸将PH调到8.8，之后加去离子水定容至500ml，用滤膜过滤后，加入2g SDS粉末，充分溶解后，放入4℃保存备用。
4×浓缩胶储备液：称取6.05g Tris base，加入40ml的去离子水中，用盐酸将PH调到6.8，之后加去离子水直至100ml，用滤膜过滤后，加入0.4g SDS粉末，溶解后，放入4℃保存备用。
30％丙烯酰胺单体：称取58g丙烯酰胺、2gN,N’-双丙烯酰胺，加入200ml去离子水中，混匀后放入棕色瓶中4℃保存备用。
1％明胶：称取0.5g明胶粉末假如50ml纯水中，37℃水浴加热，直至完全溶解。过滤后放置4℃保存备用。
10％过硫酰胺溶液：现配现用。取10mg过硫酰胺加入100mol/L去离子水中，混匀后，放置-20℃保存。
10×电泳液：称取29g Tris base粉末、甘氨酸144g、SDS10 g，加入1000ml纯水中，混均后，室温保存备用。
1×电泳液：将10×电泳缓冲液按1:9比例加入去离子水，混匀后室温保存。
4×上样缓冲液：称取0.8g SDS粉末，量取1mol/L的Tris-HCl2.5ml、4ml甘油、1ml0.1％溴酚蓝溶液(称取1g溴酚蓝加入10ml纯水中)，将以上物质混合后，加入去离子水补至10ml，充分混匀，分装到1.5mlEP管中，-20℃保存备用。
洗脱液：称取6.055gTris粉末、0.74gCaCl2，量取2.5％TritonX-20025ml，加入到1000ml的纯水中，充分混匀后，用浓盐酸将pH值调到7.4，放置4℃保存。
孵育液：称取6.055gTris粉末、0.74gCaCl2、11.7gNaCl，量取2.5％TritonX-20025ml，加入到1000ml的纯水中，充分混匀后，用浓盐酸将pH值调到7.4，放置4℃保存。
染色液：将0.5g考马斯亮蓝R-250粉末加入300ml甲醇和100ml冰醋酸的混合溶液中，混匀后，加去离子水定容至1000ml。过滤后放在室温备用。
脱色液1：量取甲醇500ml、冰醋酸100ml、纯水400ml，混合起来，摇匀，室温保存。脱色时间：10min。
脱色液2：量取甲醇300ml、冰醋酸100ml、纯水600ml，混合起来，摇匀，室温保存。脱色时间：30min。
脱色液3：量取甲醇200ml、冰醋酸100ml、纯水700ml，混合起来，摇匀，室温保存。脱色时间：120min。
(8)动物麻醉相关试剂：称取1g戊巴比妥钠粉末，溶于50ml生理盐水中，彻底溶解后，放入-20℃保存备用。麻醉动物事的剂量为40mg/kg。
(9)H&E染色相关试剂(现用现配)
苏木素染液：称取苏木素粉末1g、硫酸铝钾粉末15g、量取无水乙醇10ml、去离子水200ml，混匀过滤后瓶装封存。
伊红Y染液：称取0.5g伊红Y粉末，加入到99ml 90％的乙醇(90ml无水乙醇+10ml去离子水)中，混匀过滤后瓶装封存。
1％盐酸酒精溶液：量取盐酸1ml，乙醇99ml，混匀后瓶装封存。
(10)Masson染色相关试剂(现用现配)
Masson复合染色液：称取酸性品红粉末1g、丽春红S粉末2g、橘黄G粉末2g，量取0.25％冰醋酸(2.5ml冰醋酸+997.5ml去离子水)300ml，混匀过滤后瓶装封存。
亮绿(灿烂绿)染色液：称取灿烂绿粉末0.1g，量取0.2％醋酸(0.4ml冰醋酸+199.6ml去离子水)100ml，混匀过滤后瓶装封存。
5％磷钨酸：称取25g磷钨酸粉末，加入到500ml的去离子水中，混匀过滤后瓶装封存。
1.1.4主要耗材和仪器
Figure GDA0003097222150000091
Figure GDA0003097222150000101
1.2实验方法
1.2.1细胞的培养和传代
HaCaT细胞用含10％(v/v)FBS、1％P&S(青霉素100U/ml，链霉素100mg/l)的DMEM完全培养基，于37℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内培养。培养至细胞融合度达到80～90％，在培养箱中用0.05％胰蛋白酶消化细胞。消化时间为2min，倒置显微镜下观察细胞开始收缩变圆，脱离皿/瓶底后，加入5ml完全培养基终止消化。用吸管充分吹散并丢弃多余细胞，加入7ml完全培养基传代。传代培养至第10～40代，用于实验研究。
1.2.2细胞的冻存和复苏
待生长状态良好的HaCaT细胞融合度达到80～90％融合度时，将其消化并转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，用无血清的培养基洗涤一次，再以900μlFBS及100μl DMSO重悬细胞后离心沉淀，将其移至冻存管内(细胞的冻存密度为10×106个/ml，每个冻存管存1.5ml)，并转入专用冻存盒，-80℃冰箱过夜，最后移入液氮罐内保存。
复苏细胞时，取出冻存管将其立即放入37℃水浴中，快速振摇至其完全融化，转移至15ml离心管中，加入8.5ml完全培养基后1000rpm离心5min，弃去上清液，再加入完全培养基吹打成细胞悬液，将细胞悬液转移入培养瓶，置37℃、5％CO2培养箱培养。贴壁过夜后更换新的培养基。
1.2.3CCK-8法检测细胞增值率
1.2.3.1I3C对HaCaT细胞增殖抑制试验
取处于对数生长期的HaCaT细胞，按0.5×104个/孔接种于96孔培养板中，在含有10％FBS、1％P&S的DMEM完全培养基中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜至40～50％细胞融合度。按如下分组给予受试物处理：对照组用等量的DMSO处理，I3C处理组用不同浓度(1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20mol/L)的I3C进行处理，处理时间分别为24、48、72h，每个剂量设6个平行组。处理完毕后先观察细胞的形态和数量上的变化，之后每孔加入100L无血清的DMEM完全培养基，再加入10L CCK-8试剂，37℃孵育1～2h后，用全自动酶标仪测定各孔的吸光度OD值(实验波长为450nm)。以对照孔吸光度值(AC)为参照，根据各处理组样本孔的吸光度值(AT)，计算细胞活力抑制率
(％)以评价细胞毒性：细胞活力抑制率(％)＝(1-AT/AC)×100％。
1.2.3.2I3C对UVA照射HaCaT细胞增殖抑制影响的实验
取处于对数生长期的HaCaT细胞，按0.5×104个/孔接种于96孔培养板中，在含有10％FBS、1％P&S的DMEM完全培养基中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜至40～50％细胞融合度。按如下分组给予受试物处理：空白对照组用不透光的黑纸片(已高压)遮住，UVA模型组中UVA照射剂量分别为0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5J/cm2。按如下公式计算紫外线的照射剂量：照射剂量(J/cm2)＝照射强度(W/cm2)×照射时间(s)，照射强度通过紫外线辐照计测量来测定。I3C处理组每孔在照射前24h加入10μmol/L I3C，照射剂量和对照组一样，每个剂量设3个平行样。照射后换上新鲜的培养基，放入培养箱中培养24h后观察细胞数量和形态上的改变，之后将每孔加入100L无血清的DMEM完全培养基，再加入10LCCK-8试剂，孵育1～2h后，用全自动酶标仪测定各孔的吸光度OD值(实验波长为450nm)。以对照孔吸光度值(AC)为参照，根据各处理组样本孔的吸光度值(AT)，计算细胞活力抑制率(％)以评价细胞毒性：细胞活力抑制率(％)＝(1-AT/AC)×100％。根据UVA对HaCaT细胞增殖的抑制率以及I3C对其的保护作用，确定UVA在后续实验中的照射剂量。
1.2.4克隆形成实验
低密度接种50个细胞/皿于10cm皿中。接种24h后，分为对照组和实验组：对照组不做任何处理(正常培养)，实验组分别用5、10、15μmol/L的I3C处理，每个剂量设3个平行组，连续培养3周，期间隔1天换一次培养基。处理完毕后，用预冷的PBS洗两遍，甲醛固定15分钟，室温结晶紫染色15分钟。轻柔洗去结晶紫溶液，相差显微镜计数细胞数>50的克隆数，计算克隆形成率(CFE)，CFE指克隆数除以接种细胞数(50)，用以评价细胞的克隆形成能力。
1.2.5HaCaT细胞光老化模型的建立
取处于对数生长期的HaCaT细胞，按2×105个/孔接种于6孔培养板中，在细胞培养箱中培养至70～80％的细胞融合度。按如下分组处理：空白对照组用不透光的黑纸片(已高压)遮住，UVA模型组的照射剂量为1J/cm2，I3C处理组在照射UVA的同时还用10μmol/L的I3C进行处理，每个剂量设2个平行样。照射完后观察细胞在数量和形态上的改变。
1.2.6流式细胞术检测细胞内ROS含量
取处于对数生长期的HaCaT细胞，按1×105个/孔接种于6孔培养板中。接种24h后，分为UVA模型组和I3C处理组。I3C处理组提前用10μmol/L的I3C处理24h，之后去掉培养基，每孔加入1ml PBS(其中DCFH-DA的浓度为10mol/L)，用UVA光源进行照射，剂量分别是：0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5J/cm2。照射完毕后，37℃温箱孵育30min后，用真空泵抽去PBS，再用PBS洗涤一次。每孔加入300L胰酶进行消化，消化完毕后，加入400LPBS，反复吹打成细胞悬液，由于DCFH-DA与ROS结合后被激光激发时可发出荧光，故可用流式细胞仪检测细胞内ROS含量。
1.2.7细胞中蛋白(Phospho-NF-b、Phospho-p38-MAPK、Phospho-ERK、Phospho-SAPK/JNK)表达水平的检测
1.2.7.1细胞分组和处理
UVA模型组：取处于对数生长期的HaCaT细胞，按1×105个/孔接种于6孔培养板中。接种24h后，将完全培养基吸出，每孔加入1ml P用UVA光源进行照射，剂量分别是：0、0.25、0.5、0.75、1J/cm2。每个剂量设2个平行样。I3C处理组：HaCaT细胞接种于6孔板24h后，除空白对照组(正常培养，不做任何处理)外，其余都用I3C处理，剂量分别为0、1、2.5、5、7.5、10μmol/L。培养24h后，除空白对照组外，其余组均用UVA光源照射，剂量为1J/cm2。
1.2.7.2蛋白水平的检测
(1)总蛋白抽提
弃废液，用预冷的1×PBS洗细胞两次。后加入预冷4ml 1×PBS，用细胞刮板将细胞经一个方向轻轻刮下。收集细胞悬液到2ml离心管中，4℃1500rpm离心5min。弃上清，将细胞置于冰上，加300μl全细胞裂解液重悬细胞并转移至新1.5ml EP管中。高速漩涡混匀15s，冰浴30min，期间每隔10min用高速涡旋混匀一次。最后4℃14000rpm离心15min，将上清转移至新预冷1.5ml EP管中，用分光光度计进行蛋白定量后分装，-80℃保存。
(2)蛋白浓度测定
根据样品数量，按照50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl依次加入到96孔板的标准孔中，分别用裂解液补齐至20μl，每组设置3个复孔。加2μl样品到96孔板的样品孔中。将样品孔(各设2个复孔)中加入裂解液使每孔总体积达20μl。每孔悬空加入200μl BCA工作液，37℃避光放置30min。在波长450nm处检测OD值，用标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算蛋白浓度。
(3)Western Blotting
1)上样
将NuPAGE Novex 4～12％预制胶组装好，放入电泳槽，加入1×电泳缓冲液至电泳槽内。蛋白加入4×SDS Loading Buffer后，总上样量不足的加细胞裂解液补足。80℃变性10min，混匀并离心后上样。每孔蛋白上样量为60μg，总体积20μl。剩余孔中各加20μl1×SDSLoading Buffer补齐。在最后一个孔中加入8μl蛋白maker。
2)电泳
接通电源后，恒定电压200V，电泳60min。
3)转膜
将跑完电泳的胶转移到PVDF膜上，上面铺两层沾湿的滤纸，小心赶出空气。放入蛋白印迹电泳/转膜系统进行转膜，转膜时间为7min。
4)免疫反应
转膜结束后，用1×PBST洗涤PVDF膜3次，每次5～10min。现配5％脱脂奶粉作为封闭液室温封闭膜1h。于脱色摇床上用1×PBST清洗膜3次，每次5min。用碧云天一抗稀释液按一定比例配制一抗，于4℃孵育过夜。一抗孵育结束后，脱色摇床上用1×PBST清洗膜3次，每次10min。用2.5％脱脂奶粉配制二抗(1:2000)，室温孵育1h后，脱色摇床上用1×PBST清洗膜3次，每次5min
5)化学发光、显影、定影
取出PVDF膜小心覆盖上透明保鲜膜，固定于暗盒内，将
Figure GDA0003097222150000121
West PicoLuminol/Enhancer Solution和
Figure GDA0003097222150000122
West Pico Stable Peroxide Solution两种试剂在15ml离心管中等体积混合，并取适当的体积滴加到PVDF膜上，反应2min后，于暗室内放入胶片，对胶片曝光、显影，定影后室温下晾干。
6)胶片图象分析
使用扫描仪对胶片中目的条带进行扫描。用Quantity One软件进行灰度扫描和分析。
1.2.8凝胶酶谱法测MMP-2、MMP-9酶活力
1.2.8.1细胞分组和处理
方法同1.2.6.1。
1.2.8.2酶活力的检测
1)样品的收集
处理完毕后，收集培养基至2ml EP管中，用小型离心机1500rpm离心5min，离心后取上清1ml至1.5ml EP中备用。与此同时，每孔加入1ml胰酶进行消化，消化完毕后，每孔加入1ml含血清的完全培养基停止消化，反复吹打制成细胞悬液，在双目显微镜下数出细胞个数，换算成细胞浓度，再根据细胞浓度将之前收集的培养基的浓度和体积调为一致，放入-80℃保存。
2)制胶与上样
应用Bio-Rad制胶系统常规制备SDS-PAGE凝胶(3％浓缩胶和10％分离胶)。按下表方法配制10％分离胶和3％浓缩胶。将分离胶用加样枪沿玻璃板匀速注入板内，当液面加至距离玻璃板顶端处1.5cm时，停止加胶。轻缓以无水乙醇封口，待胶在室温凝固后，弃去无水乙醇，倒入已配制好的3％浓缩胶，立即插入10孔梳子，至浓缩胶完全凝固后拔去梳子。装好玻璃板，将其放入电泳槽，加入1×电泳缓冲液。向样品中加入4×上样缓冲液后，每孔加样25L。
表1
Figure GDA0003097222150000123
3)电泳
接通电源后，恒定电压130V电泳150min左右。直至目的蛋白快跑出胶时，终止电泳。
4)洗脱与孵育
电泳结束后，撬开玻璃板，沿折线轻轻刮去浓缩胶和多余的分离胶。小心将凝胶从玻璃板中剥离，放入洗脱液中匀速振荡洗脱2次，每次20min。洗脱完之后放入孵育液中匀速振荡孵育30min，最后换上新鲜的孵育液振荡过夜。
5)染色与脱色
孵育结束后用染色液染胶2h，染色结束后依次换上脱色液1、2、3，脱色时间分别是10min、30min和120min。脱色完毕后，应能明显的看到两条透亮带。
6)凝胶图象分析
用保鲜膜小心地将凝胶包裹住，再使用扫描仪对凝胶进行扫描。用Quantity One软件进行灰度扫描和分析。
1.2.9小鼠光老化模型的建立
广东省实验动物中心购买SPF级雄性昆明小鼠50只(体重均为18～20g)，称重后，按体重做标记后随机分为5组，每组10只。所有组都适应性喂养一周后，再进行实验。每只小鼠背部每天都剃毛1次，面积为2cm×4cm。饲养条件：室温保持在20～25℃，湿度维持在40～50％，自由摄食，供给清洁饮水。分组处理情况如下，空白对照组：正常饲养，背部剃毛，每日用生理盐水灌胃，其他不做任何处理；UVA模型组：每日用生理盐水灌胃，紫外线光毒仪照射，照射方法：将小鼠放入固定器中，暴露背部受照皮肤，放入紫外线光毒仪中，紫外线灯置于距离小鼠受照皮肤15cm处进行照射，保持仪器内温度在20～25℃之间，每天照射50min，累积UVA剂量为6J/(cm2·d)，连续照射75天。I3C灌胃组：分为低、中、高3个剂量组，I3C灌胃剂量分别为每天0.04mg/g体重、0.2mg/g体重、1mg/g体重，同时进行UVA照射。其中高剂量灌胃组的剂量由I3C最大溶解量以及Alphi P等方法确定。
整个实验期间，每天记录实验室温、湿度。每天照射前观察动物背部皮肤有无红斑、水泡、糜烂，咬伤等情况，如果出现上述任1种情况立即停止照射1～2天，直至其消失为止再继续进行照射。还需观察皮肤粗糙、起皱程度，皮肤有无增厚，有无色素沉着等；并观察小鼠一般情况，做好记录。另外，每周称1次体重以调整灌胃剂量。
1.2.10动物指标检测
1.2.10.1取材
照射结束24h后，剃干净所以小鼠背部的毛，用0.2％的戊巴比妥钠对小鼠腹腔注射(40mg/kg体重)，进行麻醉。待捏小鼠脚趾无反应后放血，常规手术取下背部脱毛区中央处皮肤(2cm×2cm)，尽量去除皮下组织，生理盐水洗净后分别置于10％中性福尔马林和液氮中保存备用。
1.2.10.2皮肤病理切片观察
(1)H&E染色
将组织块从福尔马林里取出，用纯水充分冲洗，按照下面的步骤进行：TO处理10min→100％乙醇2min→95％的乙醇2min→80％乙醇2min→75％乙醇2min→自来水洗2min，苏木素染色10min，自来水冲洗1min，0.5％盐酸酒精分化30s，自来水冲洗1min，氨水返蓝1min，自来水冲洗1min，脱水，透明再用95％乙醇1min→100％乙醇1min→吹干→TO处理4min→中性树脂封片，用倒置光学显微镜观察，拍片。
(2)Masson染色
染色前处理与H&E染色一致。用Masson复合染液染色5min，0.2％醋酸水溶液冲洗2min，5％磷钨酸浸泡10min，0.2％醋酸水溶液冲洗2遍，每次2min，用亮绿染液染色5min，再用0.2％醋酸水溶液冲洗2遍，每次2min，脱水，透明，拍片。
1.2.10.3氧化应激相关蛋白检测
(1)组织匀浆的制备
新鲜皮肤组织用冰冷的生理盐水中漂洗，去除血液后滤纸拭干，称重，所有标本重量均在0.2g左右，放入洗净烧杯中。用吸管量取预冷的匀浆介质(重量为组织9倍)于烧杯中置于冰上，用眼科剪刀尽快将组织剪碎。将剪碎组织用玻璃匀浆器进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入冰浴中，右手将捣杆垂直插入套筒中上下转动研磨数十次，充分研碎。组织匀浆4℃5000rpm离心15min，取适量上清至1.5ml EP管中，在超声仪中超声，放置-80℃保存备用。
(2)蛋白浓度测定
方法同1.2.7.2(2)。
(3)Western Blotting
将准备好的动物蛋白样品由每组10个混合成2个(即随机将5个样品混合起来，这样每组变为2个样)。蛋白加入4×SDS Loading Buffer后，总上样量不足的加细胞裂解液补足。80℃变性10min，混匀并离心后上样。每孔蛋白上样量为60μg，总体积20μl。
其他方法同1.2.7.2(3)。
1.2.11统计学分析
用SPSS13.0软件对数据进行统计分析；数值型指标用
Figure GDA0003097222150000141
表示，组间比较用t检验、或单因素ANOVA和SNK法组间两两比较；计数资料比较用χ2检验，P＜0.05表示有统计学差异。实验结果用Microsoft Excel和Adobe Illustrator进行图表处理。
2、结果
2.1I3C最大无作用剂量的确定
2.1.1I3C对HaCaT细胞增殖抑制试验
为测定I3C对HaCaT细胞增殖的影响，确定其最大无作用剂量。采用不同浓度的I3C(0～20mol/L)处理细胞(0mol/L即空白对照组)，处理时间分别为24、48、72h。如图2中显示：随着I3C浓度的增加，细胞存活率大致呈现下降趋势，即I3C浓度和细胞存活率之间存在剂量反应关系。实验得出：当I3C处理时间在48h之内，且浓度在1～10mol/L时，HaCaT细胞的存活率反而超过了空白对照组，即当I3C浓度≤10mol/L时，对HaCaT细胞无明显毒性作用(与空白组相比，其存活率之间的差异无统计学意义，24、48h相应的F值分别为1.434和2.958，P值均>0.05)，因此，本实验初步选取I3C为10μmol/L左右的浓度(5、10、15mol/L)来进行后续的克隆形成实验。
2.1.2I3C对HaCaT细胞的克隆形成实验
为进一步得出I3C对HaCaT细胞的最大无作用剂量，采用浓度为5、10、15mol/L的I3C进行平板克隆形成实验。结果如下，图3中，当I3C浓度为5、10mol/L时，细胞克隆形成数与对照组相比没有减少，甚至还有略微增加的现象。而当其浓度增至15mol/L时，细胞克隆数明显减少(与对照组相比有统计学意义，P<0.01)，即说明：当I3C浓度>10mol/L时，可能会抑制HaCaT细胞的生长，因此，本实验初步确定I3C对HaCaT细胞的最大无作用剂量为10μmol/L，决定用浓度为10M的I3C来进行后续的实验。
2.2HaCaT细胞光老化模型的建立
2.2.1细胞形态与数量
结果见图4，倒置显微镜可观察到对照组(A)细胞排列整齐，呈长梭形，多为放射状和漩涡状分布，贴壁牢，胞浆透明，状态良好。模型组细胞经UVA(1J/cm2)照射后较对照组细胞数量减少明显，细胞皱缩，变圆，悬浮细胞逐渐增加，状态不佳，见B箭头处。而I3C处理组与模型组相比，HaCaT细胞形态明显好转，基本呈长梭形，无过多漂浮细胞，且细胞数目显著增加，情况与对照组相似，见C。
2.2.2UVA诱导HaCaT细胞中ROS生成
如图5所示，随着UVA照射剂量的增加(0.25～1.5J/cm2)，UVA模型组细胞内产生的ROS也逐步提高，其中，当UVA的剂量为1.5J/cm2时，细胞内ROS水平约为对照组的10倍。Pearson相关分析得出，UVA照射剂量与ROS含量之间的r＝0.985，P<0.01，表示两者之间呈正相关关系。这证实了UVA照射确实可诱导ROS大量生成，而这正是光老化形成的重要条件之一。
2.2.3UVA诱导HaCaT细胞中MAPK和NF-kb信号通路的激活
用UVA光源照射HaCaT细胞，剂量分别是：0、0.25、0.5、0.75、1J/cm2。WesternBlotting检测与光老化相关蛋白Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达水平。结果显示(见图6)，随着UVA照射剂量的增加，Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的灰度值比值呈现上升趋势。Pearson相关分析得出，UVA照射剂量与各相关蛋白表达量之间的r值均>0.918，P<0.01，表示它们之间呈正相关关系，由此可说明UVA可诱导Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK表达水平升高，从而激活氧化应激通路，促使光老化的发生。
2.2.4UVA诱导HaCaT细胞中MMP-2、MMP-9活性增强
用UVA光源照射HaCaT细胞，剂量分别是：0、0.25、0.5、0.75、1J/cm2。用凝胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的活力。实验结果表明(见图7)，随着UVA照射剂量的增加，被MMP-2、MMP-9降解的明胶也越多(表现为白色条带变宽)，即表明MMP-2、MMP-9的活性呈现上升趋势。Pearson相关分析得出，UVA照射剂量与MMP-2、MMP-9活性的之间的r值均>0.816，P<0.01，表示它们之间呈正相关关系，说明UVA可诱导HaCaT细胞中的MMP-2、MMP-9活性增强，而MMPs是光老化机制中的下游蛋白，由此可证实UVA可诱导皮肤细胞光老化的产生。
综上，可得出UVA可诱导HaCaT细胞中ROS大量生成；激活MAPK、NF-b等氧化应激信号通路；增强机制金属蛋白酶的活力。至此，HaCaT细胞光老化模型成功建立。
2.3I3C对UVA照射HaCaT细胞增殖抑制的影响
为了得知UVA对HaCaT细胞增殖的影响以及I3C是否对其有保护作用，UVA模型组采用0.25～1.5J/cm2的UVA进行照射，I3C实验组在UVA照射之前用10μmol/L的I3C预处理24h。CCK-8结果显示：UVA的照射剂量和细胞存活率之间存在剂量反应关系，且低浓度的I3C对UVA引起的细胞增殖的下降有保护作用(与UVA模型组相比，其存活率之间的差异存在统计学意义，即P<0.05)。如图8所示，随着UVA剂量的增加，细胞的增殖率不断下降，其中，当UVA照射剂量为1、1.5J/cm2时，HaCaT细胞增殖率分别下降至(62±1.48)％、(52±2.23)％。若在照射的同时用I3C处理，则细胞增值率会有所上升。其中，当UVA照射剂量为0.5、1J/cm2时，I3C处理可使其增值率分别上升约15.7％、11.2％。综合UVA对细胞增值率的影响以及I3C对其保护作用这两个结果，选择之后实验的UVA照射剂量为1J/cm2。
2.4I3C对UVA诱导产生的ROS的影响
由2.2.2得出，UVA可诱导ROS大量生成，而I3C处理组用I3C(10μmol/L)预处理24h后再接受照射，用流式细胞术检测细胞内ROS水平，发现其与UVA模型组(UVA：0～1.5J/cm2)比较ROS有明显的下降。其中，当UVA照射剂量为1J/cm2时，经I3C处理后，ROS水平下降约12.7％。由方差分析得出，UVA模型组和I3C处理组的ROS含量的F＝68940.237，P<0.01，其差异具有统计学意义。表明I3C可有效抑制HaCaT细胞内由UVA照射诱导产生的ROS，如图9所示。
2.5I3C对UVA诱导的MAPK和NF-kb信号通路的激活的影响
如图10中，除空白对照外，其他均先用I3C(1～10mol/L)预处理细胞24h，再进行UVA(1J/cm2)的照射。用Western Blotting检测与光老化相关蛋白Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达水平。结果显示，经UVA照射后，相关蛋白的表达量均有所增加，但随着I3C浓度的增加(1～10mol/L)，各蛋白的条带相对吸光度比值呈下降趋势。Pearson相关分析显示，I3C浓度与各相关蛋白表达量之间的r值均<-0.912，P<0.01，即表明它们之间呈负相关关系。因此认为，低剂量的I3C能显著抑制由UVA诱导的Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达，进而抑制氧化应激的发生，对光老化的发生有一定的预防作用。
2.6 I3C对UVA诱导的MMP-2、MMP-9酶活力的影响
如图11中，凝胶酶谱结果显示，经UVA(1J/cm2)照射后，MMP-2、MMP-9酶活力明显增加，但随着I3C浓度的增加(1～10mol/L)，被MMP-2、MMP-9降解的明胶也越少(表现为白色条带变窄)，表明其活性呈明显下降趋势。Pearson相关分析显示，I3C浓度与MMP-2、MMP-9酶活力之间的r值均小于-0.989，即它们之间呈负相关关系。因此认为，低剂量的I3C能显著抑制由UVA诱导的MMP-2、MMP-9酶活力的增强。
2.7 I3C灌胃对皮肤光老化模型小鼠的影响
2.7.1小鼠实验期间一般情况及背部皮肤变化
整个试验过程中，各组动物生长状况比较良好，每组进食、饮水量无明显差异。75天之内，对各组体重进行比较，P均>0.05，无统计学意义(详见表2)。
表2小鼠实验期间体重变化情况(g)(
Figure GDA0003097222150000151
n＝10)
Figure GDA0003097222150000152
Figure GDA0003097222150000161
实验过程中，与空白对照组(图12，A)相比，UVA模型组(图12，B)大部分小鼠背侧表皮有早期轻度红斑形成，逐渐发展成颜色加深、脱屑等症状，皮肤变粗糙，出现明显皱纹(见箭头处)，失去弹性及光泽。小鼠背毛生长缓慢，皮肤成斑块状增厚(见箭头处)，多处于暴露UVA最完全处。实验中，模型组背部皮肤无明显红肿、水泡、糜烂现象。与模型组相比，I3C灌胃组(图12，C)的情况要明显好转，皮肤无明显红斑、皱纹，皮肤弹性好肤色正常，尤其是I3C高剂量灌胃组大部分小鼠无明显变化，仅小部分出现轻微红斑，其他情况与空白对照组相似。这说明I3C灌胃给药可在一定程度上能缓解由UVA引起的皮肤光老化。
2.7.2小鼠皮肤组织病理学改变
2.7.2.1H&E染色
图13所示，经H&E染色后，空白对照组(A)小鼠皮肤结构完整，表皮细胞分层(角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层、基底层)较为清晰，细胞成分及数量未出现异常情况，皮肤厚度正常，炎症细胞较少。与空白对照组的小鼠相比，UVA模型组(B)的小鼠皮肤整体厚度明显变薄，表皮细胞分层不清，有较多炎症细胞(染色后呈蓝紫色，见箭头处)。相比之下，I3C灌胃组(C、D、E)的小鼠皮肤有所好转，随着I3C灌胃剂量的增加，皮肤厚度也相应增加，炎症细胞相对减少，表皮细胞分层越来越清晰，尤其是I3C高剂量组(E)的皮肤改善最为明显，与对照组相似。这提示UVA能引起小鼠皮肤发生光老化，产生损伤，而用适量I3C灌胃给药可在一定程度上延缓由光老化带来的皮肤组织细胞的损坏。
2.7.2.2Masson染色
对小鼠皮肤进行Masson染色，主要检查皮肤真皮层中胶原纤维的变化情况。图14中，空白对照组(A)小鼠真皮层可见波浪状纤维组织，呈束状，分布均匀，排列规则，纹理清晰，疏密有致。与空白对照组的小鼠相比，UVA模型组(见B)的小鼠皮肤胶原纤维排列紊乱，分布不均，发生变性或破坏，有明显断裂、卷曲、呈无定形，有些甚至消失(见箭头处)。I3C灌胃组(C、D、E)小鼠的皮肤中的胶原纤维与空白对照组的相比仅有少量的断裂，大部分仍是呈波浪状，破碎、卷曲的程度较轻(见箭头处)，尤其是I3C高剂量组(见E)中的胶原纤维改善最为明显，情况基本与对照组相似。这提示UVA能导致小鼠皮肤发生光老化，而用适量I3C灌胃给药可在一定程度上延缓由光老化引起的皮肤中胶原纤维的病变。
2.8小鼠皮肤组织中与光老化相关蛋白的检测
用Western Blotting检测各组小鼠皮肤组织中与光老化相关蛋白Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达水平。结果如图15所示，相对于空白对照组，UVA模型组的各相关蛋白的表达量均有所增加，但随着I3C灌胃剂量的增加(0.04g/l、0.2g/l、1g/l)，每组各蛋白的条带相对吸光度比值呈下降趋势。Pearson相关分析显示，I3C浓度与各相关蛋白表达量之间的r值均<-0.802，P<0.01，即它们之间呈负相关关系。由此得出低剂量的I3C能显著抑制小鼠皮肤组织中由UVA诱导的Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达。这进一步说明UVA可致小鼠皮肤发生光老化，而用适量I3C灌胃给药可在一定程度上延缓皮肤的光老化。
3.1 I3C对UVA照射后HacaT细胞存活率的影响
由CCK-8法得出：经UVA照射过的HaCaT细胞存活率明显下降，细胞皱缩，变圆，悬浮细胞逐渐增加；然而用适量I3C处理过后的细胞再经照射时细胞存活率明显上升(两组差异具有统计学意义)，细胞状态明显好转。从宏观上得出I3C对UVA照射所致的HaCaT细胞存活率下降具有抑制作用的结论，由此推断I3C对UVA照射所致HaCaT细胞光老化有保护作用。
3.2 I3C对UVA诱导产生的ROS的干预作用
本实验已表明，UVA照射HaCaT细胞可直接增加ROS的产生。ROS包括单线态氧，超氧自由基，羟基自由基，过氧化氢[50]，过量会使机体抗氧化体系遭到严重破坏，影响胶原蛋白的合成能力或加快胶原蛋白的降解速度]；还可造成皮肤组织氧化压力和DNA修复机制的改变，引起细胞和DNA损害进而导致细胞死亡。若不能及时清除，则可能引起光老化和皮肤炎症。本实验也证实I3C可明显减少HaCaT细胞中由UVA诱导的ROS的产生，从而可有效减少ROS给细胞带来的诸多损害，这为I3C能够预防光老化提供了佐证。
3.3 I3C对UVA照射后HaCaT细胞、小鼠皮肤中MAPKs、NF-kb表达水平的影响
丝裂原蛋白活化激酶家族(MAPKs)包括MAPK、ERK和JNK，是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，此家族成员能将细胞外刺激信号转导至胞内从而在众多细胞生物学反应过程中具有至关重要的作用。NF-b是一种诱导转化因子，NF-b信号通路与细胞氧化应激密切相关。目前已知UVA照射可引起ROS升高，ROS不仅可以直接损伤细胞成分，如脂膜，线粒体，蛋白质和DNA等，还可以激活氧化应激通路包括MAPKs和NF-b信号通路，UV辐射产生的ROS被认为是触发MAPK和NF-κb通路的关键。本实验中也证实UVA可诱导HaCaT细胞、小鼠皮肤中MAPK、NF-kb信号通路的激活，同时也观察到I3C能显著抑制HaCaT细胞、小鼠皮肤组织中由UVA诱导的Phospho-NF-kb、Phospho-p38-MAPK、Phospho-SAPK/JNK、Phospho-ERK的表达，再加上之前证实I3C可减少ROS的产生，由此可推测，I3C可能是通过减少ROS的产生来抑制MAPK、NF-kb信号通路的激活。
3.4 I3C对UVA照射后HaCaT细胞中MMP-2、MMP-9酶活力的影响。
基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase)是一个锌依赖性的酶家族，其成员目前包括20种分泌型锌依赖内肽酶和6钟膜型内肽酶，能特异性地降解皮肤组织中的多种蛋白。皮肤光老化最重要的变化，主要是以细胞外基质为底物的MMP增高所致的纤维结缔组织降解。因此，紫外线照射MMPs的表达与皮肤光老化存在密切联系。其中，明胶酶MMP-9、MMP-2的协同作用可以降解皮肤中的基质成分。大量实验证明，紫外线照射皮肤细胞可诱导ROS产生，而ROS中的单线态氧在UVA诱导多种MMPs表达中起重要的介导作用，它可通过细胞膜依赖的ERK激酶信号转导途径刺激相关转录因子表达以促进MMPs表达，也可通过刺激细胞因子自分泌的途径促进MMPs表达；再者，ROS还可以通过MAPK、NF-kb信号传导通路的激活促进MMPs表达，同时导致胶原的降解。在本实验中，由凝胶酶谱结果得知，HaCaT细胞在受到UVA照射后，随着照射剂量的增加，MMP-2和MMP-9酶活力明显增加；但随着I3C浓度的增加，这两种酶的活性明显下降。I3C抑制UVA照射诱导的MMP-2、MMP-9的表达提示I3C对UVA导致的皮肤光老化有拮抗作用。3.2、3.3已经分析得出I3C可能是通过减少ROS的产生来抑制MAPK、NF-kb信号通路的激活，而ROS和MAPK、NF-b信号通路的激活均可导致MMPs的表达增加，因此考虑I3C是通过其抗氧化功能抑制了MMPs基因表达，从而预防了光老化的发生。
3.5 I3C灌胃对UVA照射后各组小鼠皮肤外观、表皮细胞以及真皮中胶原纤维的影响
动物皮肤光老化最显著的临床表现就是出现明显的皱纹和皮肤松驰，在组织学水平上的主要特征为胶原纤维和弹性纤维的损伤。胶原纤维的损伤表现为成熟胶原的减少、胶原纤维变形、断裂、消失等，它们的改变是光老化皮肤改变的最主要原因。
考虑到I3C见光分解的性质以及小鼠日常活动中会发生摩擦把背部药物蹭掉，本实验中没有设置背部涂抹组，而是采用灌胃的方式。涂抹的方式在动物单笼饲养条件下可行。
本次体内试验中，观察到经UVA长期照射后，小鼠皮肤出现明显皱纹，有早期轻度红斑形成，逐渐发展成颜色加深、脱屑等症状，皮肤变粗糙，失去弹性及光泽，其中，红斑是紫外线照射后皮肤毛细血管扩张的结果，表现为肉眼可见的红斑，它常被认为是紫外线照射产生危害的一个标志。而I3C灌胃组在照射的UVA的同时，用低、中、高剂量的I3C进行灌胃，结果表明，这几组小鼠背部皮肤明显状况好转，皮肤无明显红斑、皱纹，尤其是高剂量灌胃组，仅小部分出现轻微红斑，其他情况与空白对照组相似。由此推断抗氧化剂I3C对UVA致皮肤光老化有明显干预作用。
表皮是皮肤最外面的一层，对皮肤起到最基本的保护作用。目前研究表明，表皮是胆固醇和脂肪酸合成的活跃部位，而这些游离脂肪酸在皮肤光老化中起到了重要的作用，如紫外线可以引起表皮中的脂质过氧化，引起表皮细胞细胞膜的损伤，还可引起表皮细胞的炎性反应，加快光老化的进程。本实验结果显示：经H&E染色后在光学显微镜下行组织学观察，发现经UVA照射过的小鼠皮肤厚度明显变薄，表皮细胞分层不清，有较多炎症细胞；而I3C灌胃组的情况明显好转，皮肤厚度增加，炎症细胞减少，表皮细胞分层也越来越清晰。这说明I3C灌胃可以有效减轻UVA照射带来的表皮损伤，从而预防光老化的发生。
在皮肤中，胶原是最重要的结构蛋白，也是含量最丰富的蛋白质，主要由真皮层中的成纤维细胞分泌。胶原具有不同类型，Ⅰ型与Ⅲ型胶原是皮肤层内最主要的胶原成分，其中Ⅰ型胶原约占皮肤胶原干重的85％，在真皮中聚集成与皮面平行的粗大纤维束，相互交织成网，是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分，也是维持皮肤饱满充盈的物质基础。有文献报道，UVA照射在胶原的损伤方面起重要的作用，本实验结果显示：经Masson染色后在光学显微镜下行组织学观察，UVA模型组与空白对照组比较胶原纤维明显有断裂、卷曲、呈无定形，甚至消失。进一步说明长期UVA照射可引起皮肤老化。而I3C灌胃组皮肤中的胶原纤维与对照组比较断裂、卷曲的程度较轻；尤其是高剂量灌胃组仅有轻微的断裂，大部分仍是呈波浪状。说明I3C灌胃能够有效地改善由过多紫外线照射引起的小鼠皮肤纤维组织的病变，延缓皮肤光老化的形成。
3.6本实验成功建立了HaCaT细胞、昆明小鼠的光老化模型，并用I3C对其进行干预。综合体内、体外实验的结果推断出I3C可能是通过抑制ROS的形成，进而抑制了MAPK、NF-kb氧化应激信号通路的激活，最终抑制了MMPs基因表达，减少了皮肤中的胶原纤维由UVA引起的损伤。研究用UVA照射成功建立了HaCaT细胞、昆明小鼠的光老化模型。同时也进一步证实紫外线照射可以加速皮肤衰老，是建立皮肤光老化模型的有效方法。I3C可有效减少HaCaT细胞中由UVA诱导产生的ROS，以及MAPK、NF-b氧化应激信号通路的激活，最终导致MMPs活力的低表达，从而减少对细胞的损伤。用I3C灌胃能够改善由过多UVA照射引起的小鼠皮肤表皮细胞和纤维组织的病变，因此可延缓皮肤光老化的形成。
I3C可通过抑制ROS的产生及NF-b、MAPKs信号通路激活来发挥抗氧化应激的作用，进而减少某些氧化物对细胞损伤。低浓度I3C可通过磷酸化BRCA1(一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因)蛋白的1387和1524位丝氨酸而激活转录因子NrF2，促进其下游抗氧化基因的表达，从而逆转H2O2或其他氧化物诱导的细胞凋亡。说明I3C可通过激活体内的抗氧化信号通路清除体内氧自由基，进而减少氧化损伤。皮肤光老化的发生机制中很重要的一方面就是：在紫外线照射下，细胞会产生ROS，细胞表面受体被紫外线激活后与相应配体结合并激发下游信号分子，且激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶从而产生大量过氧化氢及超氧阴离子。活性氧如过氧化氢可激活表皮生长因子受体，该过程可被抗氧化剂阻断，且抗氧化剂能阻断紫外线辐射后活性氧的产生，而I3C已被证实有抗氧化能力，因此，用I3C来预防皮肤光老化为治疗皮肤光老化提供了新的思路和线索。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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1.一种吲哚-3-甲醇在制备对UVA所致皮肤光老化干预作用的药物用途，其特征在于，所述吲哚-3-甲醇对HaCaT细胞最大无作用剂量为10μmol/L。
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